CN1914168A - 肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供如下述通式(I)所示的化合物或其盐。(式中，R1、R2和R3分别独立地表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，其中，R1、R2和R3中的至少1个不是氢原子，R4为取代的氨基，R5为取代或非取代的羧基)。此外，本发明还提供一种肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂。通过使用该抑制剂，可以预防和/或治疗与肽基精氨酸脱亚胺酶相关的疾病(例如类风湿性关节炎、多发性硬化症等)。

Description

肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂
技术领域
本发明涉及肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4)抑制剂。
背景技术
肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD)是一种广泛分布于动物组织内的蛋白质修饰酶，对依托钙离子(即在钙离子存在下)将蛋白质中的精氨酸残基脱亚氨基化，变换为瓜氨酸残基的反应进行催化。由于蛋白质的脱亚氨基化改变了蛋白质分子内正电荷分布，因而立体结构改变，对蛋白质生理功能产生很大的影响。
PAD最早被确认存在于啮齿类动物中，发现在其组织中存在3种类的PAD(非专利文献1，2，3，4)。然后中岛等人用视黄酸、DMSO或1，25-二羟基维生素D3处理人类骨髓性白血病HL-60细胞，在分化为粒细胞的细胞中检测到PAD的活性，并克隆其cDNA进行分析(非专利文献5)。结果发现，其cDNA由2238bp形成，对663氨基酸残基进行编码。以及和已知的人类的PAD的氨基酸序列约50～55％一致，将人类HL-60细胞的PAD命名为PAD4(起初命名为PAD V，后来改名为PAD4)。然后，在人类末消血粒细胞中也证实发现了PAD4(非专利文献6)。
迄今为止，在人体中鉴别出PAD 1，2，3，4，6型的5种异构体(非专利文献7，8，9，10，11，12，13，14，25，26)。PAD1与皮肤的分化有关(非专利文献15，16，17)，PAD2与髓磷脂碱性蛋白质的脱亚氨基化有关(非专利文献18，19)，PAD3与毛囊的角蛋白化有关(非专利文献14，20，21)。若进行钙离子预处理使细胞内的钙浓度升高，则人体HL-60细胞和存在于人体末端梢血中的PAD4(旧名：肽基精氨酸脱亚胺酶V，PAD V)使核仁磷蛋白(nuleophosmin)B/23和组蛋白H2A、H3、H4脱亚氨基化(非专利文献22，23)。此外，由于PAD4具有称作56PPAKKKST63的核转移信号，因而它是4种异构体PAD中唯一分布在核内的。由此认为，PAD4是一种依托钙离子作用于染色质，以控制核的机能的新型组蛋白修饰酶(非专利文献23)。此外，比较人体PAD的异构体之间的氨基酸序列，由于C末端的3分之2的区域的同源性较高，C末端3分之2的区域的结构在PAD的异构体之间是共通的，因而认为该区域内具有活性部位。还有，有报道指出，最近PAD4基因的单核苷酸多态性(SNPs)使mRNA的分解减少，生成过量的瓜氨酸残基，在风湿性关节炎患者的血液中发现针对该瓜氨酸化的蛋白质的自身抗体，显示PAD4与风湿性关节炎具有很强的关联性(非专利文献24)。
[非专利文献1]
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[非专利文献2]
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[非专利文献3]
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[非专利文献4]
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[非专利文献6]
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[非专利文献22]
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发明内容
本发明旨在设计抑制PAD4的酶活性的新型物质，并开发出针对风湿性关节炎的新药。
本发明的发明者们通过X射线结晶结构分析法，对在钙离子不存在的情况下的PAD4(以下有时也记作Ca2+-free PAD4。)的立体结构、在将作为活性残基之一的Cys645置换为Ala而失活的变异体(C645A)中结合钙离子的物质(以下有时也记作Ca2+-bound PAD4(C645A))以及将作为活性残基之一的Cys645置换为Ala而失活的变异体(C645A)中结合钙离子和基质(苯甲酰基-L-精氨酸酰胺(benzoyl-L-arginineamide)：BA，苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(benzoyl-L-arginineethylester)：BAEE，苯甲酰基-甘氨酰-L-精氨酸(benzol-glycyl-L-arginine)：BGA，KQTARKSTGG：H3肽1，KAPRKQLATK：H3肽2和SGRGKGGKGL：H4肽)的复合体(以下有时分别记作Ca2+-bound PAD4(C645A)-BA复合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-BAEE复合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-BGA复合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-H3肽1复合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-H3肽2复合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-H4肽复合物。)的立体结构进行分析，确定了其分解能分别为2.80埃、2.60埃、2.30埃、2.20埃、2.25埃、2.10埃、2.10埃和2.25埃(特愿2003-358459号和特愿2004-259125号)。经过结构分析的上述8个立体结构除了含有钙离子结合部位的活性部位附近以外基本相同。PAD4具有近似靴型的细长形态，形成与晶格内的最接近分子在晶体学上成二重对称轴关系的功能性二聚体。PAD4分子可以分为N末端区域和C末端区域2部分，N末端区域可以进一步分出2个子区域(亚区)，2个子区域合并的结构与具有免疫球蛋白式结构的T-细胞表面糖蛋白CD4(T-cell surface glycoprotein CD4)类似，而且1个子区域结构还和p53的DNA结合区域类似。另一方面，C末端区域由5个ββαβ螺旋结构组成，在其中心部存在带负电的大沟。沟的内部存在2个作为活性残基的Asp350、His471、Asp473、Cys645和钙离子，活性残基部位附近的结构与脒基转移酶(amidinotransferase，AT))和N(G)，N(G)-dimethyl-L-arginine amidinohydrorase类似。若与不存在钙离子的PAD4比较活性残基附近的结构，发现通过2个钙离子与带负电的大沟结合，C645(A645)和Asp350附近的结构大幅变化形成裂口，基质结合于此处。此外，还与每个钙离子的结合方式均已知的Ef hand结构(hand motif)明显不同。根据以上的结果可知，PAD4虽然是属于精氨酸修饰酶总科的蛋白质，活性部位的2个钙离子控制催化活性，但由于其结合方式与具有已知的EF hand结构(作为钙离子结合结构的一种)的蛋白质不同，因而是一种具有迄今为止全新的依托钙离子的酶活化结构的蛋白质。
另外，白井等人通过程序PSI-BLAST、FUGUE推测精氨酸加工酶(processing enzyme)具有共通的折叠，提出了精氨酸脱亚氨基化的反应机理(Shirai，H.，Blundell，T.L.and Mizuguchi，K.(2001)A novelsuperfamily of enzymes that catalyze the modification of guanidino groups.TIBS，26，465-468)。进而，Das等人对来源于Mycoplasma arginini的精氨酸脱亚胺酶与反应中间体的复合体的X射线结晶结构进行了分析，提出了L-精氨酸的脱亚氨基化的反应机理(Das et al.(2004)Crystalstructures of arginine deiminase with covalent reaction intermediates：Implication for catalytic mechanism)。根据本发明者们对BA-Ca2+PAD4(C645A)的结构分析，显示肽基精氨酸(PAD4的反应基质)的脱亚氨基化反应机理中的基质识别机理与Das等人提出的模型一致，因而认为通过PAD4的蛋白质的脱亚氨基化反应为由Das等人提出的2阶段反应机理，即，在第1阶段，Cys645硫醇基对肽基精氨酸的胍基的碳Cζ进行亲核攻击，形成tetrahedral adduct，然后，Asp350和Asp473通过形成基质、氢键和盐桥，使胍基的炭素Cζ的亲核性提高，胍基的Cζ和Nh2之间的健被切断而生成氨。接着，在第2阶段，通过His471活化的水分子对Cζ进行亲核攻击，再次形成tetrahedral adduct后，Cζ和Cys645的硫原子Sγ之间的键断裂生成肽基瓜氨酸残基(PAD4的反应产物)。本发明者们提出的PAD4的脱氨基化反应机理如图1所示。
基于以上事实，本发明者们设计和制备了抑制PAD4的酶活性的新型的化合物，测定了PAD4抑制活性。结果发现这些化合物具有PAD4抑制活性，从而完成了本发明。
本发明的内容如下所述。
(1)、下述通式(I)所示的化合物或其盐。
(式中，R1、R2和R3分别独立地表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，其中，R1、R2和R3中的至少1个不是氢原子，R4为取代的氨基，R5为可被取代的羧基)
(2)、如(1)所示的化合物或其盐，其中R4为如下式
Figure A20058000378900141
(式中，R41为R401CO-〔式中，R401为氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基〕所示的基团、R402S(O)m-〔式中，R402为氢原子，可被取代的烃基或可被取代的杂环基，m为1或2的整数〕所示的基团、R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-〔式中，R403、R404、R405和R406分别独立地表示氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基，n为1～50的任一整数〕所示的基团或可被取代的肽基，R42为氢原子或碳原子数1～3的烷基)所示的基团。
(3)、(2)所示的化合物或其盐，其中R41为可被取代的苯甲酰基、可被取代的苯甲酰基肽基、可被取代的丹磺酰(dansyl)基或可被取代的丹磺酰基肽基，R42为氢原子。
(4)、(1)～(3)中任一项所述的化合物或其盐，其中R1，R2和R3分别独立地表示氢原子或甲基，其中，R1，R2和R3中的至少1个为甲基。
(5)、(4)所述的化合物或其盐，其为下述(Ia)、(Ib)或(Ic)所示的化合物或其盐。
Figure A20058000378900151
Figure A20058000378900161
(6)、一种含有下述物质作为有效成分的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，所述物质能够抑制如下图所示在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤。
Figure A20058000378900171
(图中，Asp350、His471、Asp473和Cys645分别表示序号1的氨基酸序列中350位的天冬氨酸残基、471位的组氨酸残基、473位的天冬氨酸残基和645位的半胱氨酸残基)
(7)、(6)所述的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，所述能够抑制在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中任一步的物质为精氨酸衍生物。
(8)、一种含有精氨酸衍生物作为有效成分的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，其中精氨酸的氨基和胍基被取代，精氨酸的羧基可被取代。
(9)、(7)或(8)所示的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，其中精氨酸衍生物为(1)～(5)中任一项所述的化合物或其盐。
(10)、(6)～(9)中任一项所述的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，用于预防和/或治疗与肽基精氨酸脱亚胺酶相关的疾病。
(11)、(10)所述的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，其中与肽基精氨酸脱亚胺酶相关的疾病选自类风湿性关节炎，牛皮癣和多发性硬化症。
本说明书中，“肽基精氨酸脱亚胺酶4”是指具有序号1的氨基酸序列的野生型肽基精氨酸脱亚胺酶4，也包括具有同等生物活性(即，在钙离子存在下对蛋白质中的精氨酸残基脱氨基化而变换为瓜氨酸残基的反应进行催化的酶活性)，且具有与序号1的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4。
另外，本说明书中，Boc表示叔丁氧基，Arg表示精氨酸，Tos表示对苯磺酰基，Me表示甲基，ADMA表示NG，NG-二甲基-L-精氨酸，SDMA表示NG，N’G-二甲基-L-精氨酸，Bz表示苯甲酰基。
另外，本说明书中，“～”表示将在其前后记载的数值分别作为最小值和最大值包含的范围的意思。
以下，详细地说明本发明。
1.通式(I)所示的化合物或其盐
本发明提供通式(I)所示的化合物或其盐。
通式(I)所示的化合物或其盐可以是L型、D型或DL型，L型更为有效。
通式(I)中，R1，R2和R3分别独立地是氢原子或碳原子数l～3烷基，其中，R1，R2和R3中至少1个不为氢原子。作为碳原子数1～3的烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基。
R1，R2和R3优选分别独立地是氢原子或甲基，其中，R1，R2和R3中至少1个为甲基。
通式(I)中，R4为被取代的氨基。关于R4的氨基上付加的取代基，只要具有该取代基的化合物能够被PAD4识别(即和PAD4相互作用)，则可以是任何的基团，与R4氨基的氮直接结合的原子优选与氧基(＝O)结合。作为R4的一个例子，可以列举下式所示的基。
Figure A20058000378900191
式中，R41为R401CO-〔式中，R401为氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基〕所示的基团、R402S(O)m-〔式中，R402为氢原子，可被取代的烃基或可被取代的杂环基，m为1或2的整数〕所示的基团、R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-〔式中，R403、R404、R405和R406分别独立地表示氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基，n为1～50的任一整数〕所示的基团或可被取代的肽基，R42为氢原子或碳原子数1～3的烷基。作为R405N(R406)-CHR404-CO-所示的基团和-NH-CHR403-CO-所示的基团，可以列举天然蛋白质和肽中存在的氨基酸残基。作为R41的肽基的取代基，可以列举苯甲酰基、丹磺酰基等，该苯甲酰基、丹磺酰基等还可被进一步取代。作为苯甲酰基、丹磺酰基等的取代基，可以列举卤原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羟基、碳原子数1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、杂环基(作为杂环基的杂环，可以列举含1个硫原子、氮原子或氧原子的5～7元环、含2～4个氮原子的5～6元环、含1～2个氮原子和1个硫原子或氧原子的5～6元环等，这些杂环可以和含1～2个氮原子的6元环、苯环或含1个硫原子的5元环缩合，作为杂环基具体的例子，可以列举，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、吗啉基、吗啉代等)等。氨基可被碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子数1～6的烷基取代。
作为R401、R402、R403、R404、R405和R406的烃基可以列举，饱和链烃基(例如，碳原子数1～6直链状和支链状烷基等)、不饱和链烃基(例如，碳原子数1～6的直链状和支链状烯基、碳原子数1～6的直链状和支链状炔基等)、脂环式烃基(例如，碳原子数1～6的环烷基、碳原子数1～6的环烯基、碳原子数1～6的环炔基等)、芳烃基(例如，苯基、萘基、蒽基、菲基等)。
作为当R401、R402、R403、R404、R405和R406为可被取代的烃基时的取代基，可以列举卤原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羟基、碳原子数1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、杂环基(作为杂环基的杂环，可以列举含1个硫原子、氮原子或氧原子的5～7元环、含2～4个氮原子的5～6元环、含1～2个氮原子和1个硫原子或氧原子的5～6元环等，这些杂环可以和含1～2个氮原子的6元环、苯环或含1个硫原子的5元环缩合，作为杂环基具体的例子，可以列举，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、吗啉基、吗啉代等)等。氨基可被碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子数1～6的烷基取代。
R401、R402、R403、R404、R405和R406的杂环基中的杂环，可以列举含1个硫原子、氮原子或氧原子的5～7元环、含2～4个氮原子的5～6元环、含1～2个氮原子和1个硫原子或氧原子的5～6元环等，这些杂环可以和含1～2个氮原子的6元环、苯环或含1个硫原子的5元环缩合。作为杂环基具体的例子，可以列举，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、吗啉基、吗啉代等。
作为当R401、R402、R403、R404、R405和R406为可被取代的杂环基时的取代基，可以列举卤原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羟基、碳原子数1～6的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等)、碳原子数1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、上述杂环基等。氨基可被碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子数1～6的烷基取代。
作为R42的碳原子数1～3的烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基。
R41为可被取代的苯甲酰基、可被取代的苯甲酰基肽基、可被取代的丹磺酰基或可被取代的丹磺酰基肽基，R42优选为氢原子。
通式(I)中，R5为可被取代的羧基。R5为被取代的羧基时，取代基可以是任意的基团。例如，为了提高对PAD4的抑制活性，R5为-COOR51(式中，R51为碳原子数1～20的烷基)所示的基团、-COO-{R54N(R55)-CHR53-CO-[NH-CHR52-CO]p-}〔式中，R52、R53、R54和R55分别独立地表示氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基，p为1～50的任一整数〕所示的基团等。作为R54N(R55)-CHR53-CO-所示的基团和-NH-CHR52-CO-所示的基团，可以列举天然蛋白质和肽中存在的氨基酸残基。
R51的烷基可以是任一种碳原子数1～20的直链状和支链状烷基，具体可以列举，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。
作为R52、R53、R54和R55的烃基，可以列举饱和链烃基(例如，碳原子数1～6直链状和支链状烷基等)、不饱和链烃基(例如，碳原子数1～6的直链状和支链状烯基、碳原子数1～6的直链状和支链状炔基等)、脂环式烃基(例如，碳原子数1～6的环烷基、碳原子数1～6的环烯基、碳原子数1～6的环炔基等)、芳烃基(例如，苯基、萘基、蒽基、菲基等)。
作为当R52、R53、R54和R55为可被取代的烃基时的取代基，可以列举卤原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羟基、碳原子数1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、杂环基(作为杂环基的杂环，可以列举含1个硫原子、氮原子或氧原子的5～7元环、含2～4个氮原子的5～6元环、含1～2个氮原子和1个硫原子或氧原子的5～6元环等，这些杂环可以和含1～2个氮原子的6元环、苯环或含1个硫原子的5元环缩合，作为杂环基具体的例子，可以列举，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、吗啉基、吗啉代等)等。氨基可被碳原子数1～6的烷基和碳原子数1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子数1～6的烷基取代。
作为R52、R53、R54和R55的杂环基中的杂环，可以列举含1个硫原子、氮原子或氧原子的5～7元环、含2～4个氮原子的5～6元环、含1～2个氮原子和1个硫原子或氧原子的5～6元环等，这些杂环可以和含1～2个氮原子的6元环、苯环或含1个硫原子的5元环缩合。作为杂环基具体的例子，可以列举，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、吗啉基、吗啉代等。
作为当R52、R53、R54和R55为可被取代的杂环基时的取代基，可以列举卤原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羟基、碳原子数1～6的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等)、碳原子数1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子数1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、上述杂环基等。氨基可被碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子数1～6的烷基取代。
作为通式(I)所示化合物的具体例子，可以列举如下(Ia)、(Ib)或(Ic)所示的化合物。
式(Ia)所示的化合物为Bz-Arg(mono-methyl)。式(Ib)所示的化合物为Bz-ADMA。式(Ic)所示的化合物为Bz-SDMA。
通式(I)所示的化合物可以用市售的精氨酸或如下述结构式所示的精氨酸衍生物作为起始物合成。
Figure A20058000378900251
(式中，R1，R2和R3分别独立地表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，其中，R1，R2和R3中至少1个不为氢原子)
通式(I)中，R4为R401-CO-NH-(式中，R401为氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基)所示的基团、R5为羧基的化合物可以用如R401CO-O-COR401所示的对称酸酐酰基化或用Bz2O(安息香酸酐，benzoic anhydride)苯甲酰基化作为起始物的上述精氨酸或精氨酸衍生物而制备。苯甲酰基化反应可以通过公知的方法进行。例如，可以在惰性溶媒中，在碱的存在下，进行苯甲酰基化反应。作为该反应中使用的惰性溶媒，可以列举例如，二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)等与水的混合物或它们的混合物等。此外，作为碱，使用碳酸氢钠或碳酸氢钾，考虑到精氨酸侧链的胍结构pKa为约12，调整反应溶液的pH为约10以下。反应温度优选为约0～37℃，反应时间优选约10分钟～约24小时。Bz2O的用量优选为，相对于1摩尔精氨酸或精氨酸衍生物(起始物)为约1～1.2摩尔。
通式(I)中，R4为R402-S(O)m-NH-(式中，R402为氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基，m为1或2的整数)所示的基团、R5为羧基的化合物(例如当m＝2时)可以通过用DNS-Cl(丹磺酰基氯)丹磺酰基化作为起始物的上述精氨酸或精氨酸衍生物而制备。丹磺酰基化反应可以通过公知的方法进行(B.S.Hartley，V.Massey，Biochim.Biophys.Acta，21，58(1956))。例如，可以在惰性溶剂中，在碱存在下，进行丹磺酰基化反应。作为该反应中使用的惰性溶媒，可以列举例如，丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)等与水的混合物或它们的混合物等。此外，作为碱，使用碳酸氢钠或碳酸氢钾，考虑到精氨酸侧链的胍结构pKa为约12，调整反应溶液的pH为约10以下。反应温度优选为约0～37℃，反应时间优选约10分钟～约24小时。DNS-Cl的用量优选为，相对于1摩尔精氨酸或精氨酸衍生物(起始物)为约1～1.2摩尔，浓度优选5mM左右。
通式(I)中，R4为R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-NH-〔式中，R403、R404、R405和R406分别独立地表示氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基，n为1～50的任一整数〕所示的基团、R5为羧基的化合物例如可通过以下的方法合成。首先，与苯甲酰基化同样地，对作为起始物的上述精氨酸或精氨酸衍生物，用Boc2O(叔丁氧基羰基对称酸酐)Boc化。可以采用公知的方法(J.Ramachandran，C.H.Li，J.Org.Chem.，27，4006(1962))，通过用对甲苯磺酰氯使得到的Boc-Arg或其衍生物侧链的胍基甲苯磺酰化。使用该衍生物，通过作为公知方法(获得诺贝尔化学奖)的肽固相合成法(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))，可制得上述的肽。
通式(I)中，R4为R41-NH-〔式中，R41为可被取代的苯甲酰基肽基〕，R5为羧基的化合物例如可以通过下述方法合成。
首先，采用作为公知方法的Fmoc固相合成法(Atherton，E.andSheppard，R.C.，989，Solid Phase Peptide Synthesis.A Practical Approach.，IPF Press，Oxford，UK)合成肽链。但是，此时使用没有用TFA切断侧链羧基，而是用HF进行切断的Asp、Glu以及Lys、Arg，即Asp、Glu是Fmoc-Asp(OcHex)、Fmoc-Glu(OcHex)，Lys、Arg是Fmoc-Lys(Cl-Z)、Fmoc-Arg(Tos)。除去最后的N末端氨基酸的Fmoc基后，如前所述，用Bz2O(安息香酸酐)通过公知的方法进行苯甲酰基化。然后，在乙二硫(ethanedithiol)、茴香硫醚(thioanisole)等灭活剂的存在下用TFA处理目标肽树脂，用HPLC等对游离的目标肽进行精制。然后，用DMF等溶剂溶解该游离肽，在冰冷却下，加入1当量的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二酰亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)，生成肽的酐后，加入Arg或Arg衍生物。此外，作为此时加入的碱，使用碳酸氢钠或碳酸氢钾，考虑到精氨酸侧链的胍结构pKa为约12，调整反应溶液的pH为约10以下。反应温度优选为约0～37℃，反应时间优选约10分钟～约24小时。最后，用HF(无水氟化氢)处理生成的肽，除去苯甲酰基以外的所有保护基，进行精制。
通式(I)中，R4为R41-NH-〔式中，R41为可被取代的丹磺酰基肽基〕、R5为羧基的化合物，可以通过上述反应，在除去Fmoc基后加入丹磺酰氯进行丹磺酰基化，而后通过与上述同样的方法合成。
通式(I)中，R4为R401-CO-NR42-(式中，R401为氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基)所示的基团、R5为羧基的化合物(例如当R42为甲基(CH3-)时)，可以将上述精氨酸或精氨酸衍生物的Nα-methyl体作为起始物，用R401CO-O-COR401所示的对称酸酐进行制备。例如，可在惰性溶剂中，在碱的存在下进行反应。作为该反应中使用的惰性溶媒，可以列举例如，二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)等与水的混合物或它们的混合物等。此外，作为碱，使用碳酸氢钠或碳酸氢钾，考虑到精氨酸侧链的胍结构pKa为约12，调整反应溶液的pH为约10以下。反应温度优选为约0～37℃，反应时间优选约10分钟～约24小时。对称酸酐的用量优选为，相对于1摩尔精氨酸或精氨酸衍生物的Nα-methyl体(起始物)为约1～1.2摩尔。
作为R42为甲基(CH3-)的化合物的起始物Boc-N-Me-Arg(Tos)-OH，由BACHEM公司销售。可以用三氟乙酸对其处理进行脱Boc反应，可得到N-Me-Arg(Tos)-OH(生物化学试验讲座1，蛋白质的化学IV-化学修饰和肽合成一，p234，日本生化学编，东京化学同人)。用对称酸酐或Bz2O，可以对其methyl体的α-氨基进行各种的修饰。
侧链胍基被甲基化、进而α-氨基被甲基化的物质可如下制备，首先对市售的Arg(mono-methyl)、ADMA、SDMA进行Boc化(T.Nagasawa，K.Kuroiwa，K.Narita，Y.Isowa，Bull.Chem.Soc.Jpn.，46，1269(1973))，合成Boc-Arg(mono-methyl)、Boc-ADMA、Boc-SDMA。然后，将甲基化的侧链胍基基进一步甲苯磺酰化(J.Ramachandran，C.H.Li，J.Org.Chem.，27，4006(1962))，制成各自的甲苯磺酰体Boc-Arg(mono-methyl，Tos)、Boc-ADMA(Tos)、Boc-SDMA(Tos)。用三氟乙酸处理进行脱Boc反应，制成Arg(mono-methyl，Tos)、ADMA(Tos)、SDMA(Tos)。将其作为起始物，还原为N-苯亚甲基氨基酸得到N-苄基化物，用福尔马林和甲酸甲基化后接触还原除去苄基，得到N-Me-Arg(mono-methyl，Tos)、N-Me-ADMA(Tos)、N-Me-SDMA(Tos)(P.Quitt，J.Hellerbach，K.Volger，Helv.Chim.Acta，46，327(1963))。如前所述，通过用HF处理(S.Sakakibara，Y.Shimonishi，Y.Kishida，M.Okada，H.Sugihara，Bull.Chem.Soc.Jpn，40，2164(1967))，可制得N-Me-Arg(mono-methyl)、N-Me-ADMA、N-Me-SDMA。将其作为起始物质，用对称酸酐或Bz2O可以对methyl体的α-氨基进行各种修饰。
通式(I)中，R4为R402-S(O)m-NR42-(式中，R402为氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基，m为1或2的整数)所示的基团、R5为羧基的化合物(例如当m＝2且R42为甲基(CH3-)时)，可以用DNS-Cl(丹磺酰基氯)对作为起始物质的上述精氨酸或精氨酸衍生物的Na-methyl体进行丹磺酰基化而制备。丹磺酰基化反应可以通过公知的方法进行(B.S.Hartley，V.Massey，Biochim.Biophys.Acta，21，58(1956))。例如，可以在惰性溶剂中，在碱存在下，进行丹磺酰基化反应。作为该反应中使用的惰性溶媒，可以列举例如，丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)等与水的混合物或它们的混合物等。此外，作为碱，使用碳酸氢钠或碳酸氢钾，考虑到精氨酸侧链的胍结构pKa为约12，调整反应溶液的pH为约10以下。反应温度优选为约0～37℃，反应时间优选约10分钟～约24小时。DNS-Cl的用量优选为，相对于1摩尔精氨酸或精氨酸衍生物的Na-methyl体(起始物)为约1～1.2摩尔，浓度优选5mM左右。
通式(I)中，R4为R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-NR42-〔式中，R403、R404、R405和R406分别独立地表示氢原子、可被取代的烃基或可被取代的杂环基，n为1～50的任一整数〕所示的基团、R5为羧基的化合物(例如R42为甲基(CH3-)时)，可与作为起始物的上述精氨酸或精氨酸衍生物的Na-methyl体的苯甲酰基化同样地，用Boc2O(叔丁氧基羰基对称酸酐)Boc化。得到的Boc-Arg或其衍生物的Na-methyl体采用公知的方法(J.Ramachandran，C.H.Li，J.Org.Chem.，27，4006(1962))，通过对甲苯磺酰氯使侧链的胍基甲苯磺酰化。使用该衍生物，通过作为公知方法(获得诺贝尔化学奖)的肽固相合成法(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))，可制得上述的肽。
通式(I)中，R4为R41-NR42-〔式中，R41为可被取代的苯甲酰基肽基〕，R5为羧基的化合物(例如R42为甲基(CH3-)时)的合成方法的一例如下所述。
首先，采用作为公知方法的Fmoc固相合成法(Atherton，E.andSheppard，R.C.，1989，Solid Phase Peptide Synthesis.A Practical Approach.，IPF Press，Oxford，UK)合成肽链。但是，此时使用没有用TFA切断侧链羧基，而是用HF进行切断的Asp、Glu以及Lys、Arg，即Asp、Glu是Fmoc-Asp(OcHex)、Fmoc-Glu(OcHex)，Lys、Arg是Fmoc-Lys(Cl-Z)、Fmoc-Arg(Tos)。除去最后的N末端氨基酸的Fmoc基后，如前所述，用Bz2O(安息香酸酐)通过公知的方法进行苯甲酰基化。然后，在乙二硫(ethanedithiol)、茴香硫醚(thioanisole)等清除剂(scavenger)的存在下用TFA处理目标肽树脂，用HPLC等对游离的目标肽进行精制。然后，用DMF等溶剂溶解该游离肽，在冰冷却下，加入1当量的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二酰亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)，生成肽的酐后，加入Na-methyl化的Arg或Na-methyl化的Arg衍生物。此外，作为此时加入的碱，使用碳酸氢钠或碳酸氢钾，考虑到精氨酸侧链的胍结构pKa为约12，调整反应溶液的pH为约10以下。反应温度优选为约0～37℃，反应时间优选约10分钟～约24小时。最后，用HF(无水氟化氢)处理生成的肽，除去苯甲酰基以外的所有保护基，进行精制。
通式(I)中，R4为R41-NR42-〔式中，R41为可被取代的丹磺酰基肽基〕，R5为羧基的化合物(例如R42为甲基(CH3-)时)，可通过上述反应，在除去Fmoc基后加入丹磺酰氯进行丹磺酰基化，然后通过与上述同样的方法合成。
下面简单地说明在R5的羧基上引入取代基的方法。例如，当在R5的羧基上引入烷基(例如甲基、乙基)或苄基时，通过公知的方法(H.Yajima，Y.Kiso，K.Kitagawa，Chem.Pharm.Bull.，22，1079(1974)以及M.Brenner，W.Huber，Helv.Chim.Acta，36，1109(1953))，进行Arg或其衍生物的酯化。将制得的物质作为起始物，与上述Bz化反应等同样地进行Bz化等反应，可以合成各种化合物。
下面再对R5为-COO-[NR54-CHR53-CO-(NH-CHR52CO-)p]时的化合物合成方法进行简单的说明。当R54为氢时，首先，通过Gisin法(B.F.Gisin，Helv.Chem.Acta，56，1476(1973))制备在Merrifield树脂(聚苯乙烯树脂)中C末端结合氨基酸的保护氨基酸树脂。将该保护氨基酸树脂作为起始物，重复p-1次的肽固相合成(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))，再缩合Boc-NR54-CHR53-COOH。然后将用对甲苯磺酰氯使Boc-Arg(Tos)(肽研究所，大阪箕面)或Arg衍生物侧链的胍基Tos化后的产物(J.Ramachandran，C.H.Li，J.Org.Chem.，27，4006(1962))通过肽固相合成连接。用氟化氢(HF)处理(S.Sakakibara，Y.Shimonishi，Y.Kishida，M.Okada，H.Sugihara，Bull.Chem.Soc.Jpn，40，2164(1967))得到目标产物。
此外，R5为-COO-[NR54-CHR53-CO-(NH-CHR52CO-)p]、R54为甲基的化合物可以通过Boc化前述的N-Me-Arg(mono-methyl，Tos)、N-Me-ADMA(Tos)、N-Me-SDMA(Tos)，制备Boc-N-Me-Arg(mono-methyl，Tos)、Boc-N-Me-ADMA(Tos)、Boc-N-Me-SDMA(Tos)，将其通过上述的肽固相合成引入目标位置，制备目标产物。
当通式(I)所示的化合物具有酸性官能团(例如羧基等)时，可以用通常的方法与碱(例如药学上允许的碱)形成盐。作为所述的盐，可以列举例如，钠盐、钾盐、铝盐、钙盐等。当通式(I)所示的化合物含有碱性官能团(例如氨基、单取代的氨基等)时，可以用通常的方法与酸(例如药学上允许的酸)形成盐。作为所述的盐，可以列举例如，盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、富马酸盐等。
通式(I)所示的化合物及其盐可以用作肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂。
2.肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)抑制剂
本发明提供一种含有下述物质作为有效成分的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，所述物质能够抑制如下图所示在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤。
(图中，Asp350、His471、Asp473和Cys645分别表示序号1的氨基酸序列中350位的天冬氨酸残基、471位的组氨酸残基、473位的天冬氨酸残基和645位的半胱氨酸残基)
作为能够抑制在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤的物质，可以列举精氨酸衍生物等。作为精氨酸衍生物，可以列举精氨酸的氨基和胍基可被取代、精氨酸的羧基可被取代的精氨酸衍生物，更具体地，可以列举通式(I)所示的化合物及其盐。
此外，对于在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中能够抑制步骤1～5中的任一步骤的物质，还可以利用肽基精氨酸脱亚胺酶4或其变异体蛋白质的全部或部分3维结构座标进行探索。例如，利用全部或部分的在Protein Data Bank注册的Ca2+-free PAD4的3维结构座标(accession code 1WD8)或根据其均方平方根偏差(根平均二乗偏差)得出的键长为0.019埃、键角为1.894°的座标，全部或部分的Ca2+-bound PAD4(C645A)的3维结构座标(accession code1WD9)或根据其均方根偏差得出的键长为0.017埃、键角为1.662°的座标，或全部或部分的PAD4(C645A)·钙离子·基质(benzoly-L-arginine-amide：BA)的复合体的3次元结构座标(accession code 1WDA)或根据其均方根偏差得出的键长为0.014埃、键角为1.595°的座标，通过计算机，探索被具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4识别的物质(例如，鉴定、检索、评价或设计)，然后，通过在该物质适当的位置上加合或取代适当种类的原子或原子团，可以设计出能够抑制在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤的物质。用于物质探索的计算机没有特别的限制，只要能运行用于物质探索的程序即可。作为所述程序，可以列举DOCK(Science，1992，257，1078)、Gold4、Glide、FlexX(J.Mol.Biol.，1996，261，470)、AutoDock(J.Comput.Chem.，1998，19，1639)，ICM(J.Comput.Chem.，1994，15，488)、Ludi等。
在设计能够抑制步骤1～5中的任一步骤或所有步骤的物质时，可以用烷基(例如，甲基和乙基等)取代精氨酸的＝NH2(+)基的氢原子和/或-NH2基的氢原子，和/或用-CH2-取代-NH-。
能够抑制在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤的物质，可以是天然物质或合成产物，也可以是高分子化合物或低分子化合物。
对于能够抑制在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤的物质，可以根据该物质的种类，用公知的手法制备。
然后，研究能够抑制在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤的物质与肽基精氨酸脱亚胺酶4的相互作用(例如，对于肽基精氨酸脱亚胺酶4的解离常数)、以及在所述能够抑制在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤的物质的存在下肽基精氨酸脱亚胺酶4的酶活性即可。肽基精氨酸脱亚胺酶4可以通过公知的方法(例如，The Journal of Biological Chemistry，Vol.277，No.51，pp.49562-49568，2002以及其中所引用的文献记载的方法)制备。对于肽基精氨酸脱亚胺酶4的解离常数用BIACORE3000(PharamaciaBiosensor AB)通过表面胞质团共振实验测定。简单地说，将肽基精氨酸脱亚胺酶4固定在传感芯片(sensor chip)表面后，将被检物质注入到传感芯片上，到达平衡状态后，通过斯卡查德图(Scatchard plot)测定解离常数。肽基精氨酸脱亚胺酶4的酶活性可以通过Nakashima，K.，Hagiwara，T.，Ishigami，A.，Nagata，S.，Asaga，H.，Kuramoto，M.，Senshu，T.and Yamada，M.(1999)Molecular characterization of peptidylarginine deiminase in HL-60 cells induced by retinoic acid and 1α，25-dihydroxyvitamin D3.J.Biol.Chem.，274，27786-27792中记载的方法测定。使肽基精氨酸脱亚胺酶4的酶活性降低的物质可以用作肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂。
本发明的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂可以以药物或试验用试药的形式对人和其它动物进行给药。本发明的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂可以单独使用，或者也可以与其它药剂(例如，其它类风湿性关节炎预防·治疗药)组合使用。
当本发明的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂对人给药时，可以是例如换算为有效成分量，以每天为约0.1～9000mg/kg(体重)，优选每天为约1～900mg/kg(体重)的给药量，分1次或几次通过口服给药，其给药量和给药次数可以根据症状、年龄和给药方法等适当地变化。
本发明的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂可以制成片剂、胶囊剂、顆粒剂、粉剂、糖浆等剂型而通过口服给药，也可以制成注射剂、栓剂等剂型，通过注射到腹腔内或静胍内的非口服方式给药。制剂中的有效成分含量可以在1～90重量％的范围内变化。例如，当为片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂等形态时，优选含有5～80重量％的有效成分。当为糖浆等液剂时，优选含有1～30重量％的有效成分。进而，当为通过非口服方式给药的注射剂时，优选含有1～10重量％的有效成分。
本发明的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂的制剂化，可以通过使用赋形剂(乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇等糖类，马铃薯、小麦、玉米等淀粉，碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钠等无机物，结晶纤维素等)、粘合剂(脱水淀粉、阿拉伯胶、明胶、藻酸钠、甲基溶纤剂、乙基溶纤剂、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素等)，润滑剂(硬脂酸镁、滑石、加氢植物油、聚乙烯醇、硅油)，崩解剂(淀粉、琼脂、明胶末、结晶纤维素、CMC·Na、CMC·Ca、碳酸钙、碳酸氢钠、藻酸钠等)、调味剂(乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、芳香性精油类等)，溶剂(注射用水、灭菌纯水、芝麻油、豆油、玉米油、橄榄油、棉籽油等)，稳定剂(氮气、二氧化碳等惰性气体、EDTA、硫代二醇等螯合剂、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、L-抗坏血酸、雕白粉等还原物质等)，防腐剂(对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、苯酚、氯化苄烷铵等)，表面活性剂(氢化蓖麻油、聚山梨酸酯80、20等)，缓冲剂(柠檬酸、醋酸、磷酸的钠盐、硼酸等)，稀释剂等制剂添加物，通过公知的方法进行。
本发明的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂可用于预防和/或治疗肽基精氨酸脱亚胺酶相关疾病。作为肽基精氨酸脱亚胺酶相关疾病，已知的有类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化症等，本发明的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂可以有效地预防和/或治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症等。此外，本发明的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂可用于肽基精氨酸脱亚胺酶4的研究。
本申请要求基于日本专利申请的特愿2004-28467号的申请的优先权，并将其说明书和/或附图中记载的内容全文并入本说明书中。
根据本发明，提供了一种肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂。通过使用该抑制剂，可以预防和/或治疗与肽基精氨酸脱亚胺酶相关的疾病(例如类风湿性关节炎、多发性硬化症等)。
附图说明
图1是本发明者们提出的PAD4的脱亚氨基化反应机理。
图2是制备例中最终精制物的HPLC谱图。
1是Bz-Arg的峰，2是Bz-Arg(mono-methyl)的峰，3是Bz-ADMA的峰，4是Bz-SDMA的峰。
图3是显示了制备例中制备的Bz-Arg衍生物在PAD4消化中的抑制反应(反应时间40分钟)的结果。
图4是显示了制备例中制备的Bz-Arg衍生物在PAD4消化中的抑制反应(反应时间60分钟)的结果。
具体实施方式
以下，通过实施例更具体地说明本发明。另外，这些实施例仅用于对本发明进行说明，而不是对本发明范围的限定。
[实施例]
〔制备例〕Bz-Arg衍生物的合成
将Arg衍生物(Arg：ナカライテスク(京都)、瓜氨酸：Sigma(Stlouis，USA)、NG-Monomethyl-L-arginine：和光純药(大阪)、ADMA(NG，NG-Dimethyl-L-Argnine)：ALEXIS Biochemicals(Lausen，Switzerland)、SDMA(NG，N’G-Dimethyl-L-Argnine)：ALEXISBiochemicals(Lausen，Switzerland))(10μmol)在0.1M NaHCO3(200μl)中溶解，加入Bz2O(10μmol)/DMF(200μl)搅拌后，在室温下放置1小时。向反应液中加入水(200μl)稀释后，用醋酸乙酯(500μl)清洗3次。在得到的水溶液中加入6M HCl(100μl)，用醋酸乙酯(500μl)清洗4次。然后用反相HPLC，从得到的反应溶液中精制目标Bz-Arg衍生物(1.Bz-Arg，2.Bz-Arg(mono-methyl)，3.Bz-ADMA，4.Bz-SDMA)。任一种Bz-Arg衍生物精制后的收率均为40％左右。HPLC条件
Waters M600 multi-solvent delivery system
UV：220nm
柱：Develosil ODS-UG-5(4.6×150mm)
温度：30度
溶剂：0.05％TFA水溶液中，从5％乙腈开始以1％/min的速度提高乙腈浓度。
最终精制物的HPLC谱如图2所示。图2中的1是Bz-Arg的峰，2是Bz-Arg(mono-methyl)的峰，3是Bz-ADMA的峰，4是Bz-SDMA的峰。
化合物的鉴定通过MALDI-TOFMS(质量分析)进行。
装置Applied Biosystems Voyager System 6178
[表1]
      原子             精密质量数
      原子             精密质量数
      C                12
      H                1.00783
      N                14.0031
      O                15.9949
                                                     MALDI-TOF Mass
                       精密质量数(M)     计算值M+H   实测值M+H
Bz    Bz-Arg           278.1             279.1       279.5
      Bz-Arg(monoMe)   292.2             293.2       293.6
      Bz-ADMA          306.2             307.2       307.6
      Bz-SDMA          306.2             307.2       307.6
      Bz-citrulline    279.1             280.1       280.3
〔试验例〕Bz-Arg衍生物在PAD4消化中的抑制反应
在冰冷却下混合缓冲液B(0.1M Tris/HCl，10mM CaCl2，2mM DTT，pH7.6，125μl)、Bz-Arg(0.1M Tris/HCl，10mM CaCl2，pH7.6，25μl(浓度1nmol/μl))、PAD4(1μl)。PAD4根据The Journal of BiologicalChemistry，Vol.277，No.51，pp.49562-49568，2002及其中所引用的论文记载的方法制备。分别取20μl(浓度1nmol/μl)的Bz-Arg(mono-methyl)、Bz-ADMA、Bz-SDMA、缓冲液A(0.1M Tris/HCl，10mM CaCl2，pH7.6)与上述Bz-Arg溶液(30μl)混合，在37度下反应40或60分钟。加入1M HCl(50μl)中止反应后，用反相HPLC分离反应混合物。结果发现，Bz-ADMA的抑制作用最强，Bz-Arg(mono-methyl)次之。另外，在本次使用的浓度下Bz-SDMA未发现抑制作用。反应时间40分钟的结果如图3所示，反应时间60分钟的结果如图4所示。在图3和4中，1为未使用抑制剂的结果，2为Bz-Arg(mono-methyl)，3为Bz-ADMA，4为Bz-SDMA的结果。此外，纵轴表示样品序号，横轴表示脱亚氨基化反应收率(Bz-citrulline的生成收率)。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请的内容均引入本说明书作为参考。
通过本发明，提供一种肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂。通过使用所述抑制剂，可以预防和/或治疗与肽基精氨酸脱亚胺酶相关的疾病(例如类风湿性关节炎、多发性硬化症等)。
[序列表free-text]
序号1表示人体肽基精氨酸脱亚胺酶4的氨基酸序列。
序列表
<110>横滨市
<120>肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂
<130>FP-036PCT
<140>
<141>
<150>JP P2004-028467
<151>2004-02-04
<160>1
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>663
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Met Ala Gln Gly Thr Leu Ile Arg Val Thr Pro Glu Gln Pro Thr His
  1               5                  10                  15
Ala Val Cys Val Leu Gly Thr Leu Thr Gln Leu Asp Ile Cys Ser Ser
             20                  25                  30
Ala Pro Glu Asp Cys Thr Ser Phe Ser Ile Asn Ala Ser Pro Gly Val
         35                  40                  45
Val Val Asp Ile Ala His Ser Pro Pro Ala Lys Lys Lys Ser Thr Gly
     50                  55                  60
Ser Ser Thr Trp Pro Leu Asp Pro Gly Val Glu Val Thr Leu Thr Met
65                   70                  75                  80
Lys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly Asp Gln Lys Val Gln Ile Ser Tyr
                 85                  90                  95
Tyr Gly Pro Lys Thr Pro Pro Val Lys Ala Leu Leu Tyr Leu Thr Ala
            100                 105                 110
Val Glu Ile Ser Leu Cys Ala Asp Ile Thr Arg Thr Gly Lys Val Lys
        115                 120                 125
Pro Thr Arg Ala Val Lys Asp Gln Arg Thr Trp Thr Trp Gly Pro Cys
    130                 135                 140
Gly Gln Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Asp Arg Asp Asn Leu Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ala Met Asp Cys Glu Asp Asp Glu Val Leu Asp Ser Glu Asp
                165                 170                 175
Leu Gln Asp Met Ser Leu Met Thr Leu Ser Thr Lys Thr Pro Lys Asp
            180                 185                 190
Phe Phe Thr Asn His Thr Leu Val Leu His Val Ala Arg Ser Glu Met
        195                 200                 205
Asp Lys Val Arg Val Phe Gln Ala Thr Arg Gly Lys Leu Ser Ser Lys
    210                 215                 220
Cys Ser Val Val Leu Gly Pro Lys Trp Pro Ser His Tyr Leu Met Val
225                 230                 235                 240
Pro Gly Gly Lys His Asn Met Asp Phe Tyr Val Glu Ala Leu Ala Phe
                245                 250                 255
Pro Asp Thr Asp Phe Pro Gly Leu Ile Thr Leu Thr Ile Ser Leu Leu
            260                 265                 270
Asp Thr Ser Asn Leu Glu Leu Pro Glu Ala Val Val Phe Gln Asp Ser
        275                 280                 285
Val Val Phe Arg Val Ala Pro Trp Ile Met Thr Pro Asn Thr Gln Pro
    290                 295                 300
Pro Gln Glu Val Tyr Ala Cys Ser Ile Phe Glu Asn Glu Asp Phe Leu
305                 310                 315                 320
Lys Ser Val Thr Thr Leu Ala Met Lys Ala Lys Cys Lys Leu Thr Ile
                325                 330                 335
Cys Pro Glu Glu Glu Asn Met Asp Asp Gln Trp Met Gln Asp Glu Met
            340                 345                 350
Glu Ile Gly Tyr Ile Gln Ala Pro His Lys Thr Leu Pro Val Val Phe
        355                 360                 365
Asp Ser Pro Arg Asn Arg Gly Leu Lys Glu Phe Pro Ile Lys Arg Val
    370                 375                 380
Met Gly Pro Asp Phe Gly Tyr Val Thr Arg Gly Pro Gln Thr Gly Gly
385                 390                 395                 400
Ile Ser Gly Leu Asp Ser Phe Gly Asn Leu Glu Val Ser Pro Pro Val
                405                 410                 415
Thr Val Arg Gly Lys Glu Tyr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Phe Gly Asp
            420                 425                 430
Ser Cys Tyr Pro Ser Asn Asp Ser Arg Gln Met His Gln Ala Leu Gln
        435                 440                 445
Asp Phe Leu Ser Ala Gln Gln Val Gln Ala Pro Val Lys Leu Tyr Ser
    450                 455                 460
Asp Trp Leu Ser Val Gly His Val Asp Glu Phe Leu Ser Phe Val Pro
465                 470                 475                 480
Ala Pro Asp Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Leu Ala Ser Pro Arg Ser
                485                 490                 495
Cys Tyr Lys Leu Phe Gln Glu Gln Gln Asn Glu Gly His Gly Glu Ala
            500                 505                 510
Leu Leu Phe Glu Gly Ile Lys Lys Lys Lys Gln Gln Lys Ile Lys Asn
        515                 520                 525
Ile Leu Ser Asn Lys Thr Leu Arg Glu His Asn Ser Phe Val Glu Arg
    530                 535                 540
Cys Ile Asp Trp Asn Arg Glu Leu Leu Lys Arg Glu Leu Gly Leu Ala
545                 550                 555                 560
Glu Ser Asp Ile Ile Asp Ile Pro Gln Leu Phe Lys Leu Lys Glu Phe
                565                 570                 575
Ser Lys Ala Glu Ala Phe Phe Pro Asn Met Val Asn Met Leu Val Leu
            580                 585                 590
Gly Lys His Leu Gly Ile Pro Lys Pro Phe Gly Pro Val Ile Asn Gly
        595                 600                 605
Arg Cys Cys Leu Glu Glu Lys Val Cys Ser Leu Leu Glu Pro Leu Gly
    610                 615                 620
Leu Gln Cys Thr Phe Ile Asn Asp Phe Phe Thr Tyr His Ile Arg His
625                 630                 635                 640
Gly Glu Val His Cys Gly Thr Asn Val Arg Arg Lys Pro Phe Ser Phe
                645                 650                 655
Lys Trp Trp Asn Met Val Pro
            660

Claims (11)

1.一种下述通式(I)所示的化合物或其盐，
Figure A2005800037890002C1
式中，R1、R2和R3分别独立地表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，其中，R1、R2和R3中的至少1个不是氢原子，R4为取代的氨基，R5为取代或非取代的羧基。
2.如权利要求1所述的化合物或其盐，其中R4为下式所示的基团，
式中：R41为R401CO-所示的基团，其中R401为氢原子、取代或非取代的烃基或取代或非取代的杂环基；R402S(O)m-所示的基团，其中R402为氢原子、取代或非取代的烃基或取代或非取代的杂环基、m为1或2的整数；R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-所示的基团，其中R403、R404、R405和R406分别独立地表示氢原子、取代或非取代的烃基或取代或非取代的杂环基、n为1～50的任一整数；或者取代或非取代的肽基，
R42为氢原子或碳原子数1～3的烷基。
3.如权利要求2所述的化合物或其盐，其中R41为取代或非取代的苯甲酰基、取代或非取代的苯甲酰基肽基、取代或非取代的丹磺酰基或取代或非取代的丹磺酰基肽基，R42为氢原子。
4.如权利要求1～3中任一项所述的化合物或其盐，其中R1、R2和R3分别独立地表示氢原子或甲基，其中，R1、R2和R3中的至少1个为甲基。
5.如权利要求4所述的化合物或其盐，其为下述(Ia)、(Ib)或(Ic)所示的化合物或其盐，
Figure A2005800037890004C1
6.一种肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，作为有效成分含有下述物质，，的，所述物质能够抑制如下图所示在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中的任一步骤，
Figure A2005800037890005C1
图中，Asp350、His471、Asp473和Cys645分别表示序号1的氨基酸序列中350位的天冬氨酸残基、471位的组氨酸残基、473位的天冬氨酸残基和645位的半胱氨酸残基。
7.如权利要求6所述的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，所述能够抑制在具有序号1的氨基酸序列的肽基精氨酸脱亚胺酶4与其反应基质的反应机理中步骤1～5中任一步的物质为精氨酸衍生物。
8.一种肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，作为有效成分含有精氨酸衍生物，其中精氨酸的氨基和胍基被取代或非取代，精氨酸的羧基被取代或非取代。
9.如权利要求7或8所述的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，其中精氨酸衍生物为权利要求1～5中任一项所述的化合物或其盐。
10.如权利要求6～9中任一项所述的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，用于预防和/或治疗与肽基精氨酸脱亚胺酶相关的疾病。
11.如权利要求10所述的肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂，其中与肽基精氨酸脱亚胺酶相关的疾病选自类风湿性关节炎，牛皮癣和多发性硬化症。
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