CN109790162B - Pad4的共价抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供可用作PAD4抑制剂的式I的化合物、其组合物以及治疗PAD4相关病症的方法。

Description

PAD4的共价抑制剂

发明背景

PAD4是能够在肽序列内催化精氨酸瓜氨酸化为瓜氨酸的酶的肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)家族的成员。PAD4负责各种蛋白在体外和体内的脱亚氨化或瓜氨酸化，其结果为各种疾病中的不同功能反应(Jones J.E.等人, Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 12 (5), (2009),616-627)。除了肿瘤学适应症以外，示例性疾病的实例包含类风湿性关节炎、对发病机理具有嗜中性贡献的疾病(例如血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎)。PAD4抑制剂还具有作为通过表观遗传机制用于人疾病的工具和治疗剂的较宽适用性。

PAD4的抑制剂具有针对类风湿性关节炎(RA)的用途。RA是影响大约1%的群体的自身免疫疾病(Wegner N. 等人, Immunol. Rev., 233(1) (2010), 34-54)。其特征在于导致骨和软骨的衰弱性破坏的关节的炎症。尽管不一致，但已在许多群体研究中表明PAD4多态性和RA易感性之间的弱基因相关性(Kochi Y. 等人, Ann. Rheum. Dis., 70, (2011), 512-515)。已在滑液组织中检测到PAD4 (以及家族成员PAD2)，其中其负责各种关节蛋白的脱亚氨化。该过程被假设为导致对RA关节中的瓜氨酸化底物(诸如纤维蛋白原、波形蛋白和胶原)的耐受性破坏且引发对其的免疫反应。这些抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)有助于疾病发病且也可用作用于RA的诊断测试(例如市售的CCP2或环状瓜氨酸化蛋白2测试)。另外，通过其直接影响几种关节和炎性介体(例如纤维蛋白原、抗凝血酶、多种趋化因子)的功能的能力，增加的瓜氨酸化也可向疾病发病提供额外直接贡献。在较小的RA患者子集中，可测量抗PAD4抗体且可与疾病的较侵蚀性形式关联。

PAD4抑制剂也可用于减小各种疾病中的病理学嗜中性粒细胞活性。研究表明，嗜中性粒细胞细胞外捕集(NET)形成的过程(嗜中性粒细胞能够固定并杀死病原体的先天性防御机制)与组蛋白瓜氨酸化相关并在PAD4敲除小鼠中是缺陷的(Neeli I. 等人, J. Immunol., 180, (2008), 1895-1902和Li P. 等人, J. Exp. Med., 207(9), (2010), 1853-1862)。PAD4抑制剂可因此适用于其中组织中的NET形成有助于局部损伤和疾病病理学的疾病。此类疾病包括，但不限于，小血管炎(Kessenbrock K. 等人, Nat. Med., 15 (6), (2009), 623-625)、全身性红斑狼疮(Hakkim A. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(21), (2010), 9813-9818和Villanueva E. 等人, J. Immunol., 187(1), (2011), 538-52)、溃疡性结肠炎(Savchenko A. 等人, Pathol. Int., 61(5), (2011), 290-7)、囊性纤维化、哮喘(Dworski R. 等人, J. Allergy Clin. Immunol., 127(5), (2011), 1260-6)、深层静脉血栓形成(Fuchs T. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(36), (2010), 15880-5)、牙周炎(Vitkov L. 等人, Ultrastructural Pathol., 34 (1), (2010), 25-30)、败血症(Clark S.R. 等人, Nat. Med., 13(4), (2007), 463-9)、阑尾炎(Brinkmann V. 等人, Science, 303, (2004), 1532-5)和中风。另外，有证据证明，NET可有助于在影响皮肤的疾病(例如皮肤红斑狼疮(Villanueva E. 等人, J. Immunol., 187(1), (2011), 538-52)和牛皮癣(Lin A.M. 等人., J. Immunol., 187 (1), (2011), 490-500))中的病理学，所以PAD4抑制剂在通过全身性或皮肤途径给药时可显示解决NET皮肤病的益处。PAD4抑制剂可影响嗜中性粒细胞内的额外功能并对嗜中性疾病具有较宽适用性。

研究已表明工具PAD抑制剂(例如氯-脒)在许多动物疾病模型(包含胶原诱发的关节炎(Willis V.C. 等人, J. Immunol.,186(7), (2011), 4396-4404)、葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的实验结肠炎(Chumanevich A.A. 等人, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 300(6), (2011), G929-G938)、骨髓修复(Lange S. 等人, Dev. Biol., 355(2), (2011), 205-14)和实验自身免疫性脑脊髓炎(EAE))中的效力。DSS结肠炎报告也表明，氯-脒驱动炎性细胞在体外和体内的细胞凋亡，表明PAD4抑制剂可更通常在广泛的炎性疾病中是有效的。

PAD4抑制剂也可用于治疗癌症(Slack.J.L. 等人, Cell. Mol. Life Sci., 68 (4), (2011), 709-720)。PAD4的过表达已证明于许多癌症中(Chang X.等人，BMC Cancer, 9, (2009), 40)。已从如下观察表明PAD4抑制剂的抗增殖性作用：PAD4使在p53-靶基因(诸如p21)的启动子处的组蛋白中的精氨酸残基瓜氨酸化，其参与细胞周期停滞和细胞凋亡的诱导(Li P. 等人, Mol. Cell Biol., 28(15), (2008), 4745-4758)。

PAD4在使组蛋白中的精氨酸残基脱亚氨化中的上述作用可表明PAD4在基因表达的表观遗传调控中的作用。PAD4是观察存在于细胞核以及细胞质中的主要PAD家族成员。PAD4可充当组蛋白脱甲基亚氨酶以及脱亚氨酶的早期证据不一致且未证实。然而，可经由通过转化为瓜氨酸以消耗可用精氨酸残基来间接减小组蛋白精氨酸甲基化(和因此与该标志相关的表观遗传调控)。PAD4抑制剂可用作影响额外疾病环境中的不同靶基因的表达的表观遗传工具或治疗剂。通过此类机制，PAD4抑制剂也可有效控制干细胞中的瓜氨酸化水平且可因此在治疗上影响不同干细胞(包括，但不限于，胚胎干细胞、神经干细胞、造血干细胞和癌症干细胞)的多能状态和分化潜力。因此，仍然存在鉴定和开发用于治疗PAD4-介导的病症的PAD4抑制剂的未满足的需求。

发明概述

现已发现，式I的化合物或其药学上可接受的盐可用作PAD4的抑制剂：

其中G、R¹、R²、R³和X各自如本文所定义和描述。

在一些实施方案中，所提供的化合物证明了相对于PAD2对PAD4的选择性。本发明还提供了包含所提供的化合物的药学上可接受的组合物。所提供的化合物可用于治疗各种与PAD4相关的病症。此类病症详细描述于本文中且包括，例如，类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮和牛皮癣。

发明详述

1. 本发明的某些方面的一般描述

在一些实施方案中，此类化合物包括具有本文所述的式的化合物或其药学上可接受的盐，其中各变量如本文中所定义且描述于实施方案中。此类化合物具有式I的结构：

或其药学上可接受的盐，其中：

G是

各R⁴独立地选自

R¹是氢或C_1-6脂族基团；

R²是氢或C_1-10脂族基团；

X选自N或CH；

R³是-R或-OR；且

各R独立地是氢或任选被1-3个氟原子取代的C_1-6脂族基团。

2. 定义

本发明的化合物包括本文一般描述的那些，且进一步由本文公开的类别、子类和种类来说明。如本文所用，以下定义应适用，除非另外指明。出于本发明的目的，根据元素周期表，CAS版，Handbook of Chemistry and Physics，第75版来鉴定化学元素。另外，有机化学的一般原则描述于“Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University ScienceBooks, Sausalito：1999，和“March’s Advanced Organic Chemistry”,第5版, 编辑：Smith, M.B.和March, J., John Wiley & Sons, New York：2001，其完整内容都通过引用特此并入。

如本文所用，术语“脂族”或“脂族基团”意指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元的直链(即无支链)或支链、取代或未取代的烃链，或完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不是芳香族的单环烃或双环烃(在本文中也称为“碳环”、“环脂族”或“环烷基”)，其具有至分子的其余部分的单一附接点。除非另外指定，否则脂族基团含有1-6个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-5个脂族碳原子。在其它实施方案中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子。在还有其它实施方案中，脂族基团含有1-3个脂族碳原子，且在还有其它实施方案中，脂族基团含有1-2个脂族碳原子。在一些实施方案中，“环脂族” (或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不是芳香族的单环C₃-C₆烃，其具有至分子的其余部分的单一附接点。合适的脂族基团包括，但不限于，直链或支链、取代或未取代的烷基、烯基、炔基基团和其杂合体，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理医学判断范围内适用于接触人类和低等动物的组织而无过度毒性、刺激、过敏反应等且与合理效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，S. M. Berge等人在J. PharmaceuticalSciences, 1977, 66, 1-19 (其通过引用并入本文)中详细描述了药学上可接受的盐。本发明的化合物的药学上可接受的盐包含衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸)或与有机酸(诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域所用的其它方法(例如离子交换)形成的盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。

衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N⁺(C_1-4烷基)₄盐。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。在适当时，另外的药学上可接受的盐包括无毒铵、季铵和胺阳离子，其使用抗衡离子诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根来形成。

除非另外陈述，否则本文描绘的结构还意欲包括该结构的所有异构体(例如对映异构体、非对映异构体和几何异构体(或构象异构体))形式；例如各不对称中心的R和S构型、Z和E双键异构体以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何异构体(或构象异构体)混合物都在本发明的范围内。除非另外陈述，否则本发明的化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围内。另外，除非另外陈述，否则本文描绘的结构还意欲包括仅在存在一个或多个同位素富集的原子的情况下不同的化合物。例如，具有包括通过氘或氚替代氢或通过¹³C-或¹⁴C-富集的碳替代碳的本发明的结构的化合物在本发明的范围内。根据本发明，此类化合物可用作例如分析工具、作为生物测定中的探针或作为治疗剂。

本文所用的术语“可测量的亲和力”和“可测量地抑制”意指在包含本发明的化合物或其组合物和PAD4的样品以及包含PAD4、缺乏所述化合物或其组合物的等效样品之间的PAD4活性的可测量的变化。

3. 示例性化合物的描述

根据一个方面，本发明提供了式I的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

G是

各R⁴独立地选自

R¹是氢或C_1-6脂族基团；

R²是氢或C_1-10脂族基团；

X选自N或CH；

R³是-R或-OR；且

各R独立地是氢或任选被1-3个氟原子取代的C_1-6脂族基团。

如上文所定义和此处所述，R¹是氢或C_1-6 脂族基团。在一些实施方案中，R¹是氢。在一些实施方案中，R¹是C_1-6脂族基团。在一些实施方案中，R¹是甲基。

如上文所定义和此处所述，R²是氢或C_1-10 脂族基团。在一些实施方案中，R²是氢。在一些实施方案中，R²是C_1-10 脂族基团。在一些实施方案中，R²是-CH₂-环丙基。

在一些实施方案中，R³是-R或-OR。在一些实施方案中，R³是-R。在一些实施方案中，R³是-OR。在一些实施方案中，R³是氢。在一些实施方案中，R³是-OCH₃。

如上文所定义和此处所述，X选自N或CH。在一些实施方案中，X是N。在一些实施方案中，X是CH。

如上文所定义和此处所述，G是

。在一些实施方案中，G是

。在一些实施方案中，G是

。在另一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。在另一些实施方案中，G是

。在某些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。在另一些实施方案中，G是

。在某些实施方案中，G是

。在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G选自

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

在一些实施方案中，G是

。

如上文所定义和此处所述，各R⁴独立地选自

。在一些实施方案中，R⁴ 是

。在一些实施方案中，R⁴是

。在一些实施方案中，R⁴是

。在一些实施方案中，R⁴是

。在一些实施方案中，

。在一些实施方案中，R⁴是

。

在一些实施方案中，式I的化合物选自下表1中描绘的那些。

表1. 式I的示例性化合物

在某些实施方案中，本发明提供了上文和此处所述的任何化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明提供了如上表1中所描绘的化合物或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，本发明提供了包含具有半胱氨酸残基Cys645的PAD4的缀合物，其中所述Cys645共价地且不可逆地键合至上文和此处所述的抑制剂，以便保持PAD4的抑制。

在某些实施方案中，本发明提供了式X的缀合物：

其中：

Cys645是PAD4的半胱氨酸645；

修饰基（Modifier）是由Warhead基团与PAD4的Cys645的共价键合产生的二价基团；且

Warhead基团是G上能够与PAD4的Cys645共价键合的官能团。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-a的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-b的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-c的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-d的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-e的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-f的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-g的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-h的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

在一些实施方案中，本发明提供了式X-i的缀合物：

其中Cys645、修饰基、R¹、R²、R³和X各自如上文所定义和此处所述。

本发明的修饰基是由Warhead基团与PAD4的Cys645的共价键合产生的二价基团。应理解，以下示例性修饰基显示为缀和至PAD4的Cys645的巯基。

表X. 缀和至Cys645的修饰基

。

4. 用途、制剂和给药

药学上可接受的组合物

根据另一个实施方案，本发明提供了组合物，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的衍生物和药学上可接受的载体、助剂或媒介物。本发明的组合物中的化合物的量使得有效可测量地抑制生物样品中或患者中的PAD4。在某些实施方案中，本发明的组合物中的化合物的量使得有效可测量地抑制生物样品中或患者中的PAD4。在某些实施方案中，本发明的组合物被配制用于给药于需要此组合物的患者。在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于经口给药于患者。

本文所用的术语“个体”与术语“患者”可互换使用且意指动物，优选哺乳动物。在一些实施方案中，个体或患者是人类。在其它实施方案中，个体(或患者)是兽类(veterinary)个体(或患者)。在一些实施方案中，兽类个体(或患者)是狗、猫或马个体。

术语“药学上可接受的载体、助剂或媒介物”是指不破坏与其一起配制的化合物的药理学活性的无毒载体、助剂或媒介物。可用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体、助剂或媒介物包括，但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的组合物可经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊(buccally)、阴道或经由植入的储库(implanted reservoir)给药。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，经口、腹膜内或静脉内给药所述组合物。本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。

出于该目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成单-或二-甘油酯。脂肪酸(诸如油酸和其甘油酯衍生物)可用于制备可注射物，如天然药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，其尤其呈其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的类似分散剂。其它常用表面活性剂，诸如Tweens、Spans和通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。

本发明的药学上可接受的组合物可以以任何经口可接受的剂型经口给药，所述剂型包括，但不限于，胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于经口使用的片剂的情况下，常用的载体包含乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊形式经口给药，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水性悬浮液用于经口使用时，可将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，也可加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。

或者，本发明的药学上可接受的组合物可以用于直肠给药的栓剂形式给药。这些可通过将药剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，且因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇类。

本发明的药学上可接受的组合物也可局部给药，尤其当治疗靶标包括可通过局部施用易于接近的区域或器官(包括眼睛、皮肤或下部肠道的疾病)时。可容易地制备用于这些区域或器官中的每一个的合适的局部制剂。

可以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠制剂来实现对于下部肠道的局部施用。也可使用局部经皮贴片。

对于局部施用，可将所提供的药学上可接受的组合物配制于含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分的合适软膏中。用于局部给药本发明的化合物的载体包括，但不限于，矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将所提供的药学上可接受的组合物配制于含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适洗剂或乳霜中。合适的载体包括，但不限于，矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。

对于眼部使用，可将所提供的药学上可接受的组合物配制为在等渗、pH调节的无菌盐水中的微粒化悬浮液，或优选地配制为在等渗、pH调节的无菌盐水中的溶液，其含有或不含防腐剂，诸如氯苄烷铵(benzylalkonium chloride)。或者，对于眼部使用，可将药学上可接受的组合物配制于软膏(诸如矿脂)中。

也可通过经鼻气溶胶或吸入来给药本发明的药学上可接受的组合物。根据药物制剂领域众所周知的技术来制备此类组合物且可将其制备为盐水溶液，其采用苯甲醇或其它合适防腐剂、吸收促进剂(以增强生物利用度)、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂。

最优选地，本发明的药学上可接受的组合物被配制用于经口给药。此类制剂可与食物一起或不与食物一起给药。在一些实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物不与食物一起给药。在其它实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物与食物一起给药。

本发明的药学上可接受的组合物可经口、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏或滴剂)、经颊、作为经口或经鼻喷雾等给药于人类和其它动物，这取决于所治疗的感染的严重程度。在某些实施方案中，本发明的化合物可以约0.01 mg/kg个体体重/天至约50 mg/kg个体体重/天且优选约1 mg/kg个体体重/天至约25 mg/kg个体体重/天的剂量水平每天一或多次经口或肠胃外给药，以获得期望治疗效应。

用于经口给药的液体剂型包括，但不限于，药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂(诸如例如水或其它溶剂)、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特定而言棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇类和山梨醇酐的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀释剂以外，经口组合物也可包括助剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。

可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于该目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。另外，在可注射制剂中使用脂肪酸，诸如油酸。

可注射制剂可例如通过如下灭菌：过滤通过细菌截留过滤器或通过并入灭菌剂，所述灭菌剂呈可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物的形式。

为了延长本发明的化合物的效应，通常期望从皮下或肌内注射来减缓化合物的吸收。这可通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。化合物的吸收速率然后则取决于其溶解速率，其进而可取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将化合物溶解或悬浮于油性媒介物中来实现肠胃外给药的化合物形式的延迟吸收。通过在生物可降解聚合物(诸如聚乳酸-聚乙交酯)中形成化合物的微囊基质来制备可注射的储库形式。取决于化合物与聚合物的比率和采用的特定聚合物的性质，可控制化合物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可通过将化合物捕集于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库可注射制剂。

用于直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明的化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体(诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，所述赋形剂或载体在环境温度下为固体但在体温下为液体且因此其可在直肠或阴道腔内熔化并释放活性化合物。

用于经口给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒。在此类固体剂型中，所述活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，诸如甘油，d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，诸如石蜡，f)吸收促进剂，诸如季铵化合物，g)润湿剂，诸如例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土粘土，和i)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇类、月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情形下，剂型也可包含缓冲剂。

也可采用类似类型的固体组合物作为在使用赋形剂诸如乳糖(lactose或milksugar)以及高分子量聚乙二醇类等的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可用包衣和包壳(诸如肠溶包衣和药学配制领域中众所周知的其它包衣)来制备。其可任选地含有遮光剂且也可以是其任选地以延迟方式仅或优先在肠道的特定部分中释放活性成分(一种或多种)的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。也可采用类型类型的固体组合物作为在使用赋形剂诸如乳糖(lactose或milksugar)以及高分子量聚乙二醇类等的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。

活性化合物也可与一种或多种如上文所示的赋形剂呈微囊化形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可用包衣和包壳(诸如肠溶包衣、释放控制包衣和药学配制领域中众所周知的其它包衣)来制备。在此类固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂(诸如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。此类剂型也可如同通常实践一样包含除了惰性稀释剂以外的额外物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂(诸如硬脂酸镁和微晶纤维素)。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可包含缓冲剂。其可任选地含有遮光剂且也可以是其任选地以延迟方式仅或优先在肠道的特定部分中释放活性成分(一种或多种)的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

用于局部或经皮给药本发明的化合物的剂型包括软膏、糊剂、乳霜、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。如果需要，可在无菌条件下将活性组分与药学上可接受的载体和任何所需防腐剂或缓冲剂混合。眼部制剂、滴耳剂和滴眼剂也涵盖于本发明的范围内。另外，本发明涵盖使用透皮贴片，其具有提供化合物至身体的受控递送的额外优点。此类剂型可通过将化合物溶解或分配于适当介质中来制备。也可使用吸收增强剂来增加所述化合物穿过皮肤的通量。速率可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。

可与载体材料组合以产生呈单一剂型的组合物的本发明的化合物的量将取决于所治疗的宿主、特定给药模式而变化。优选地，应当配制所提供的组合物，以便可将剂量为0.01-100 mg/kg体重/天的抑制剂给药于接受这些组合物的患者。

本发明的化合物可单独或与一种或多种其它治疗化合物组合给药，可能的组合疗法采用以下形式：本发明的化合物和一种或多种其它治疗化合物的固定组合或本发明的化合物和一种或多种其它治疗化合物的给药交错或彼此独立地给予，或固定组合和一种或多种其它治疗化合物的组合给药。本发明的化合物可此外或另外与化学疗法、放射疗法、免疫疗法、光疗法、手术干预或这些的组合联合给药以尤其用于肿瘤疗法。长期疗法在其它治疗策略的情况下与辅助疗法同样是可能的，如上文所述。其它可能治疗是肿瘤消退后用于维持患者状态的疗法或甚至化学预防疗法，例如在处于风险下的患者中。

那些额外药剂可作为多剂量方案的一部分与含有本发明化合物的组合物分开给药。或者，那些药剂可以是单一剂型的一部分，其与本发明的化合物一起混合于单一组合物中。如果作为多剂量方案的一部分给药，则两种活性剂可同时、依次或彼此在一定时间期间内、通常彼此在5小时内递送。

如本文所用，术语“组合”、“组合的”和相关术语是指同时或依次给药本发明的治疗剂。例如，本发明的化合物可与另一治疗剂同时或依次以分开的单位剂型或一起在单一单位剂型中进行给药。因此，本发明提供包含本发明的化合物、额外治疗剂和药学上可接受的载体、助剂或媒介物的单一单位剂型。

可与载体物质组合以产生单一剂型的本发明化合物和额外治疗剂两者(在如上文所述包含额外治疗剂的那些组合物中)的量将取决于所治疗的宿主和特定给药方式而变化。优选地，本发明的组合物应当被配制，使得可给药剂量为0.01-100 mg/kg体重/天的本发明化合物。

在包含额外治疗剂的那些组合物中，该额外治疗剂和本发明的化合物可协同起作用。因此，额外治疗剂在此类组合物中的量将小于仅利用该治疗剂的单一疗法中所需的量。

存在于本发明的组合物中的额外治疗剂的量将不超过在包含该治疗剂作为唯一活性剂的组合物中正常给药的量。优选地，本文公开的组合物中的额外治疗剂的量的范围将为包含该药剂作为唯一治疗活性剂的组合物中正常存在的量的约50％至100％。

还应理解，用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括采用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合和治疗医师的判断以及所治疗的具体疾病的严重程度。本发明的化合物在组合物中的量还将取决于组合物中的特定化合物。

化合物和药学上可接受的组合物的用途

本文所述的化合物和组合物通常可用于抑制PAD4。

可在体外、在体内或在细胞系中测定在本发明中用作PAD4的抑制剂的化合物的活性。体外测定包括确定PAD4抑制的测定。用于测定本发明中用作PAD4的抑制剂的化合物的详细条件记载于下文诸实施例中。在一些实施方案中，所提供的化合物与PAD2相比选择性抑制PAD4。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指逆转、减轻疾病或病症或其一种或多种症状、延迟其发作或抑制其进展，如本文所述的。在一些实施方案中，治疗可在已发生一种或多种症状之后给予。在其它实施方案中，治疗剂可在无症状的情况下给予。例如，可在症状发作之前将治疗剂给予敏感个体(例如根据症状历史和/或根据遗传或其它敏感因子)。也可在症状已消退之后继续治疗，例如以防止或延迟其复发。

所提供的化合物是PAD4的抑制剂且因此可用于治疗一种或多种与PAD4的活性相关的病症。因此，在某些实施方案中，本发明提供了治疗PAD4-介导的病症的方法，其包括向有此需要的患者给药本发明的化合物或其药学上可接受的组合物的步骤。

在一个实施方案中，PAD4-介导的病症是由不适当的PAD4活性介导的疾病、病况或病症。在一些实施方案中，PAD4-介导的病症选自类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮和牛皮癣。在一个进一步实施方案中，由不适当的PAD4活性介导的病症是类风湿性关节炎。在一个进一步实施方案中，由不适当的PAD4活性介导的病症是全身性狼疮。在一个进一步实施方案中，由不适当的PAD4活性介导的病症是血管炎。在一个进一步实施方案中，由不适当的PAD4活性介导的病症是皮肤红斑狼疮。在一个进一步实施方案中，由不适当的PAD4活性介导的病症是牛皮癣。

在一个实施方案中，提供了治疗类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮或牛皮癣的方法，所述方法包括向有此需要的人个体给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，提供了治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向有此需要的人个体给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供了治疗全身性狼疮的方法，所述方法包括向有此需要的人个体给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供了治疗血管炎的方法，所述方法包括向有此需要的人个体给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供了治疗皮肤红斑狼疮的方法，所述方法包括向有此需要的人个体给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供了治疗牛皮癣的方法，所述方法包括向有此需要的人个体给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，PAD4-介导的病症选自：酸诱发的肺损伤、痤疮(PAPA)、急性淋巴细胞性白血病、急性呼吸窘迫综合征、阿狄森氏病(Addison’s disease)、肾上腺增生、肾上腺皮质功能不全、老化、AIDS、酒精性肝炎、酒精性肝炎、酒精性肝病、过敏原诱发的哮喘、过敏支气管肺、曲菌病(aspergillosis)、过敏性结膜炎、脱发、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌肉萎缩性侧索硬化和重量损失、心绞痛、血管性水肿、无汗外胚层发育不全-ID、强直性脊柱炎、前段炎症、抗磷脂综合征、口疮口炎、阑尾炎、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、自身免疫疾病、自身免疫性肝炎、蜂螫伤诱发的炎症、贝切特氏病(behcet’sdisease)、贝切特氏综合征(Behcet’s syndrome)、贝尔氏麻痹症(Bells Palsey)、铍中毒、布劳综合征(Blau syndrome)、骨疼痛、细支气管炎、烧伤、粘液囊炎、癌症、心脏肥大、腕隧道综合征、分解代谢病症、白内障、脑动脉瘤、化学刺激物诱发的炎症、脉络膜视网膜炎、慢性心脏衰竭、早产儿的慢性肺病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性阻塞性肺病、结肠炎、复杂性区域疼痛综合征、结缔组织疾病、角膜溃疡、克罗恩氏病(crohn’s disease)、隐热蛋白(cryopyrin)相关的周期性综合征、隐球菌病、囊性纤维化、白介素-1-受体拮抗剂(DIRA)的缺陷、皮炎、皮炎内毒素血症、皮肌炎、弥漫型内因性脑桥神经胶质瘤、子宫内膜异位症、内毒素血症、上髁炎、成红细胞减少症、家族性淀粉样多发性神经病变、家族性冷性荨麻疹、家族性地中海热、胎儿生长迟滞、青光眼、肾小球疾病、肾小球肾炎、痛风、痛风性关节炎、移植物抗宿主病、肠病、头部损伤、头痛、听力损失、心脏病、溶血性贫血、亨舍二氏紫癜(Henoch-Scholein purpura)、肝炎、遗传性周期性发热综合征、带状疱疹和单纯疱疹、HIV-1、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、透明膜病、高氨血症、高钙血症、高胆固醇血症、高免疫球蛋白血症D伴随反复发热(HIDS)、发育不全和其它贫血、发育不全性贫血、特发性血小板减少性紫癜、色素失调症、感染性单核细胞增多症、炎性肠病、炎性肺病、炎性神经病变、炎性疼痛、昆虫咬伤诱发的炎症、虹膜炎、刺激物诱发的炎症、缺血/再灌注、幼年性类风湿性关节炎、角膜炎、肾病、由寄生虫感染引起的肾损伤、由寄生虫感染引起的肾损伤、肾移植排斥预防、钩端螺旋体病、白血病、吕弗勒氏综合征(Loeffler’ssyndrome)、肺损伤、肺损伤、狼疮、狼疮、狼疮性肾炎、淋巴瘤、脑膜炎、间皮瘤、混合结缔组织疾病、Muckle-Wells综合征(Muckle-Wells syndrome) (荨麻疹耳聋淀粉样变性)、多发性硬化、肌肉萎缩、肌肉营养不良症、重症肌无力、心肌炎、蕈样真菌病、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、肌炎、鼻窦炎、坏死性小肠结肠炎、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)、肾病综合征、神经炎、神经病理学疾病、非过敏原诱发的哮喘、肥胖症、眼睛过敏、视神经炎、器官移植、骨关节炎、中耳炎、佩吉特氏病(paget’s disease)、疼痛、胰腺炎、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、天疱疮、心包炎、周期性发热、牙周炎、腹膜的子宫内膜异位症、百日咳、咽炎和腺炎(PFAPA综合征)、植物刺激物诱发的炎症、肺炎(pneumonia)、肺炎(pneumonitis)、肺囊虫感染、毒葛(poison ivy)/漆酚油诱发的炎症、结节性多动脉炎、多软骨炎、多囊性肾病、多肌炎、牛皮癣、牛皮癣、牛皮癣、牛皮癣、心理社会应激疾病、肺病、肺高血压、肺纤维化、坏疽性脓皮病、化脓性无菌关节炎、肾病、视网膜疾病、风湿性心脏炎、风湿性疾病、类风湿性关节炎、肉状瘤病、皮脂溢、败血症、严重疼痛、镰状细胞、镰状细胞贫血、二氧化硅诱发的疾病、Sjogren氏综合征(Sjogren’s syndrome)、皮肤病、睡眠呼吸暂停、实体瘤、骨髓损伤、Stevens-Johnson综合征(Stevens-Johnson syndrome)、中风、蛛网膜下出血、晒伤、颞动脉炎、腱鞘炎、血小板减少症、甲状腺炎、组织移植、TNF受体相关的周期性综合征(TRAPS)、弓形体病、移植、创伤性脑损伤、肺结核、1型糖尿病、2型糖尿病、溃疡性结肠炎、荨麻疹、葡萄膜炎和韦格纳氏肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)。

在一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于疗法中。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗由不适当的PAD4活性介导的病症。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮或牛皮癣。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗全身性狼疮。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗血管炎。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗皮肤红斑狼疮。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗牛皮癣。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由不适当的PAD4活性介导的病症的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮或牛皮癣的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗全身性狼疮的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗血管炎的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗皮肤红斑狼疮的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗牛皮癣的药物中的用途。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防由不适当的PAD4活性介导的病症的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮或牛皮癣的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防全身性狼疮的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防血管炎的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防皮肤红斑狼疮的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防牛皮癣的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的各个方面的所有特征加上必要的变更适用于所有其它方面。

为了可更全面地理解本文所描述的本发明，记载以下实施例。应理解，这些实施例仅用于说明性目的且不应解释为以任何方式限制本发明。

实施例

如以下实施例中所描绘的那样，在某些示例性实施方案中，根据以下一般程序制备化合物。应理解，尽管一般方法描绘本发明的某些化合物的合成，但以下一般方法和本领域普通技术人员已知的其它方法可适用于本文所描述的所有化合物和这些化合物各自的亚类和种类。

实验部分所用的常见缩写列表

AcOH: 乙酸

(Boc)₂O: 二碳酸二叔丁酯

手性HPLC: 手性高效液相色谱

DCM: 二氯甲烷

戴斯马丁氧化剂: 1,1,1-三(乙酰氧基)-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3-(1H)-酮

DIAD: 偶氮二甲酸二异丙酯

DIPEA: N,N-二异丙基乙胺

DMAP: 4-二甲基氨基吡啶

DMF: N,N-二甲基甲酰胺

DMSO: 二甲亚砜

EtOAc: 乙酸乙酯

EtOH: 乙醇

HATU: N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐 N-氧化物

H-Cube: 连续流氢化反应器

HPLC: 高效液相色谱

HCl: 盐酸

Kieselguhr: 硅藻土

LCMS: 液相色谱-质谱

M: 摩尔浓度

Me: 甲基

MeCN: 乙腈

MeI: 碘甲烷

min: 分钟

mL: 毫升

MeOH: 甲醇

MsCl: 甲磺酰氯

NaHMDS: 双(三甲基甲硅烷基)氨基钠

NMR: 核磁共振

℃: 摄氏度

Pd/C: 碳载钯

Pd(OH)₂/C: 碳载氢氧化钯

制备型HPLC: 制备型高效液相色谱

STAB: 三乙酰氧基硼氢化钠

TBAF: 四丁基氟化铵

TBDMSCl: 叔丁基二甲基氯硅烷

TBTU: O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐

TEA: 三乙胺

TFA: 三氟乙酸

THF: 四氢呋喃

T_ret: 保留时间。

制备型HPLC方法

碱性HPLC制备方法

柱: XBridgeTM Prep. C18 10 um OBDTM, 30 x 100 mm

流动相: 5 - 95 %乙腈(0. 2 %氢氧化铵)/水(0. 2 %氢氧化铵)经14分钟

流速: 40 mL/min

UV检测: 215和254 nm。

酸性HPLC制备方法

柱: SunfireTM Prep. C18 10 um OBDTM, 30 x 100 mm

流动相: 5 - 95 %乙腈 (0. 1 %甲酸)/水(0. 1 %甲酸)经14分钟

流速: 40 mL/min

UV检测: 215和254 nm。

分析型LCMS方法：

方法A

MET/u-HPLC (MSQ1低pH 7 min方法)

柱: Phenomenex Kinetex-XB C18, 2.1 mm x 100 mm, 1.7 µm

流速: 0.6 ml/min

流动相: A, 甲酸 (水溶液) 0.1%和B, 甲酸 (MeCN) 0.1%

进样量: 3 μL

温度: 40 ℃

检测: 215 nm (标称)

梯度时间 (分钟) - % B

0.00 - 5

5.30 - 100

5.80 - 100

5.82 - 5。

方法B

MET/CR/1600 (MS10高pH 7 min方法)

柱: Phenomenex Gemini C18, 2.0mmx100mm, 3µm

流速: 0.5mL/min

流动相: A, 2mM碳酸氢铵/HPLC级水pH10

B HPLC级MeCN

进样量: 3 μL

温度: 50 ℃

检测: 215nm

梯度时间: (分钟) - %B

0.0 -5

5.50 -100

5.90 -100

5.92 -5

9.00 -5。

方法C

METCR 1416 (低pH Shimadzu 7min方法)

柱: Waters Atlantis dC18, 2.1mmx100mm, 3µm柱

流速: 0.6 mL/min

流动相: A, 甲酸 (水溶液) 0.1%和B, 甲酸(乙腈) 0.1%

进样量: 3 μL

温度: 40 ℃

检测: 215 nm (标称)

梯度时间 (分钟) - % B

0.00 - 5

5.00 - 100

5.40 - 100

5.42 - 5。

方法D

METCR 1410 (低pH Shimadzu 2min方法)

柱: Kinetex Core-Shell C18, 2.1mmx50mm, 5µm柱

流速: 1.2 mL/min

流动相: A, 甲酸 (水溶液) 0.1%和B, 甲酸 (乙腈) 0.1%

进样量: 3 μL

温度: 40 ℃

检测: 215 nm (标称)

梯度时间(分钟) - % B

0.00 - 5

1.20 - 100

1.30 - 100

1.31 - 5。

方法H

MET/u-HPLC (高pH MS16 7 min方法)

柱: Waters UPLC CSH C18, 2.1mmx100mm 5µm柱

流速: 0.6 mL/min

流动相: A, 用氢氧化铵(水溶液)改性至pH 10的2mM碳酸氢铵和B,乙腈

进样量: 3 μL

温度: 40 ℃

检测: 215 nm (标称)

梯度时间(分钟) - % B

0.00 - 5

5.30 - 100

5.80 - 100

5.82 - 5。

方法J

MET/CR/0990 (高pH 3min方法)

柱: Phenomenex Gemini C18, 2.0mmx100mm, 3µm

流速: 1mL/min

流动相: A, 2mM碳酸氢铵/HPLC级水 pH10

B HPLC级MeCN

进样量: 3 μL

温度: 60 ℃

检测: 215nm

梯度时间: (分钟) - %B

0.0 - 1

1.80 - 100

2.10 - 100

2.30 - 1。

分析型和制备型手性HPLC方法:

方法E:

手性HPLC制备方法

柱: Lux C1 (21.2mm x 250mm, 5µm)

流速: 50 mL/min

流动相: 40:60 MeOH:CO2 (0.1% v/v NH3)

进样量: 500 µL (2.5 mg)

温度: 40℃

检测: 220 nm。

方法F:

手性纯度分析方法

柱: Lux C1 (4.6mm x 250mm, 5um)

流速: 4 mL/min

进样量: 1.0 µL

温度: 40 C

UV检测: 210-400 nm

等度条件 40:60 MeOH:CO2 (0.1% v/v NH₃)。

根据以下方案1的步骤1至9制备本发明的某些化合物。

实施例1. 反式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺 EV-AE3989-001 (EOAI3442248, I-9)的合成

。

方案1步骤1

1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸 EV-AR3164-001 - 步骤1

向1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯(CAS 221675-35-0, 4.40 g, 23.1 mmol)于DMF(50 ml)中的搅拌溶液中加入氢化钠(60%, 1.05 g, 26.3 mmol)。将混合物在氮气下在室温下搅拌45分钟并加入(溴甲基)环丙烷(CAS 7051-34-5, 2.70 ml，27.8 mmol)。将混合物在室温下搅拌2.5小时，真空除去溶剂。将残余物悬浮在THF(40 ml)中并加入5M氢氧化钠水溶液(22 ml, 110 mmol)。将混合物在50℃下搅拌3.5小时。加入另外的THF(20 ml)和5M氢氧化钠水溶液(22 ml, 110 mmol)，将反应在50℃下搅拌16小时。将反应粗产物真空浓缩，加入水(10 ml)和5M盐酸水溶液(100 ml)。将固体滤出，用水(2×100 ml)洗涤并干燥，得到3.46 g(69.2％)的1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸EV- AR3164-001，为白色粉末。LCMS (方法D): 保留时间1.03min, M/z = 217 (M + 1)。

方案1步骤2

4-(甲基氨基)-3-硝基苯甲酸甲酯 EV-AR3152-001 - 步骤2

向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(CAS 329-59-9, 5.00 g, 25.1 mmol)于DMF(50 ml)中的搅拌溶液中加入甲胺盐酸盐(1:1) (2.00 g, 29.6 mmol)和碳酸钾(4.50 g, 32.6mmol)。将混合物在室温下在氮气下搅拌18小时。将反应粗产物真空浓缩，将残余物在EtOAc(350 ml)和1N盐酸水溶液(250 ml)之间分配。用1N盐酸水溶液(150 ml)和饱和氯化钠水溶液(100 ml)进一步洗涤有机层。用硫酸镁干燥有机层，过滤并真空浓缩，得到5.30 g(定量)的4-(甲基氨基)-3-硝基苯甲酸甲酯EV-AR3152-001，为黄色粉末。LCMS (方法D): 保留时间1.07min, M/z = 211 (M + 1)。

方案1步骤3

3-氨基-4-(甲基氨基)苯甲酸甲酯 EV-AR3155-001 -步骤3

在氮气下向4-(甲基氨基)-3-硝基苯甲酸甲酯(EV-AR3152-001, 5.30 g, 25.2mmol)于乙醇(100 ml)中的搅拌溶液中加入10％Pd/C (1.30 g, 0.05 mmol)。然后将反应置于氢气氛下并在室温下搅拌4小时。用甲醇(100 ml)稀释反应混合物，并加入硅藻土。将混合物在室温下搅拌10分钟并在真空下过滤。用甲醇(3×50 ml)洗涤过滤器，真空浓缩滤液，得到4.39g(96.6％)的3-氨基-4-(甲基氨基)苯甲酸甲酯EV-AR3155-001，为棕色粉末。LCMS (方法D): 保留时间0.75min, M/z = 181 (M + 1)。

方案1步骤4

2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸甲酯EV-AR3167-001 -步骤4

向1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(EV-AR3164-001, 2.20 g,10.2 mmol)于无水DMF(40 ml)中的溶液中加入HATU(4.95 g, 12.8 mmol)和DIPEA(2.25ml, 12.8 mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时，然后加入3-氨基-4-(甲基氨基)苯甲酸甲酯(EV-AR3155-001, 2.02 g, 11.2 mmol)。将混合物在室温下搅拌16小时。真空除去溶剂，将残余物溶于乙酸(40 ml)中，在80℃下搅拌2小时，然后在85℃下搅拌30分钟，然后在90℃下搅拌1小时。真空除去溶剂，通过快速柱色谱(12-100％EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到3.08g(83.2％)的2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸甲酯EV-AR3167-001，为粉红色粉末。LCMS (方法D): 保留时间1.20min, M/z = 361 (M + 1)。

方案1步骤5

2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸EV-AR3168-002 -步骤5

向2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸甲酯(EV-AR3167-001, 3.08 g, 8.46 mmol)于甲醇(60 ml)中的悬浮液中加入2M氢氧化钠水溶液(30 ml, 60.0 mmol)。然后将混合物在50℃下搅拌2小时。使反应冷却至室温，真空除去溶剂。加入水(50 ml)，然后加入2M HCl水溶液直至达到pH 3。将混合物搅拌15分钟并通过烧结物过滤。将固体用水(2×50 ml)洗涤并空气干燥64小时，得到1.81g(61.2％)的2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸 EV-AR3168-001，为米色固体。LCMS(方法D)：保留时间1.05min，M/z = 347 (M +1)。通过加入2M HCl水溶液进一步酸化滤液直至开始形成沉淀。将混合物静置1小时并通过烧结物过滤。将固体用水(2×20 ml)洗涤并在真空下空气干燥3小时，得到460mg(15.7％)的2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸EV-AR3168-002，为灰白色粉末。LCMS (方法D): 保留时间1.06min, M/z = 347 (M + 1)。

方案1步骤6

反式-rac-(3R,4R)-3-氨基-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯- EV-AE3986-001 -步骤6

在室温下用DIPEA(55 µL, 0.32 mmol)处理2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸(EV-AQ1914-001, 100 mg, 0.29 mmol)和HATU(121 mg, 0.32 mmol)于无水DMF(2 ml)中的溶液。将混合物搅拌1小时，然后加入反式-rac-(3R, 4R)-3,4-二氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(CAS 1020571-45-2, 58mg, 0.29mmol)并将反应混合物在室温搅拌l小时。将反应混合物用EtOAc(10 ml)稀释，用水(5 ml)洗涤，然后用饱和氯化钠水溶液(3 ml)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过柱色谱(1-9％MeOH/DCM)纯化残余物，得到40 mg(25％)的反式-rac-(3R, 4R)-3-氨基-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AE3986-001，为无色结晶固体。LCMS (方法D): 保留时间0.98min, M/z = 530 (M + 1)。

方案1步骤7

反式-rac-甲酸; (3R,4R)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 - EV-AE3988-001 -步骤7

在室温下用DIPEA(29 μl, 0.16 mmol)处理反式-rac-(3R, 4R)-3-氨基-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AE3986-001, 40 mg, 0.08 mmol)、(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(15 mg, 0.091 mmol)和HATU(34 mg, 0.091 mmol)于无水DMF(1 ml)中的溶液，并将混合物搅拌20分钟。将反应混合物用EtOAc(10 ml)稀释，并用水(5 ml)洗涤。用EtOAc(5 ml)再萃取水层。将EtOAc层合并，用饱和氯化钠水溶液(5 ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过制备型HPLC(酸性方法)纯化残余物，得到18mg(34.7％)的反式-rac-甲酸; (3R, 4R)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AE3988-001，为无色结晶固体。LCMS (方法D): 保留时间1.00min, M/z = 641 (M + 1)。

方案1步骤8

反式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺二盐酸盐 - EV-AE3989-001 -步骤8

向反式-rac-甲酸; (3R, 4R)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AE3988-001, 17 mg, 0.03 mmol)中加入2M HCl/乙醚(0.13 ml,0.25 mmol)并将该混合物在室温下静置1小时。加入另一份2M HCl/乙醚(0.13 ml)并在反应瓶周围涡旋，然后静置30分钟。将反应混合物浓缩至干并真空干燥，得到15mg(97％)的反式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R, 4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺二盐酸盐EV-AE3989-001，为灰白色结晶固体。LCMS (方法C): 保留时间 2.80min, M/z = 541 (M +1)。

实施例2. 手性HPLC得到反式-(3S,4S)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯和反式-(3R,4R)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 - EV-AU3235-001和EV-AU3235-002 -步骤9。

方案1步骤9

115mg的反式-rac-(3R,4R)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯通过手性HPLC(方法E)纯化，得到35mg的反式-(3S, 4S)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3235-001(任意指定的绝对立体化学)和39mg的反式-(3R, 4R)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3235- 002(任意指定的绝对立体化学)。

EV-AU3235-001 手性纯度 (UV, 254nm): 100%, 保留时间: 1.89min (方法F)

EV-AU3235-002 手性纯度 (UV, 254nm): 99%, 保留时间: 2.27min (方法F)。

实施例3. 2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3S,4S)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺三盐酸盐- I-5, EV-AU3253-001的合成 -步骤8。

方案1步骤8

如方案1步骤8所述处理(3S,4S)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 (EV-AU3253-001, 35 mg, 0.054 mmol)，得到35 mg (99%)的

2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3S,4S)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺 I-5, EV-AU3253-001，为白色粉末。LCMS (方法A): 保留时间 1.43min, M/z = 541 (M + 1)。

实施例4. 2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺三盐酸盐- I-4, EV-AU3254-001的合成 -步骤8。

方案1步骤8

如方案1步骤8所述处理(3R,4R)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 (EV-AU3254-001, 39 mg, 0.06 mmol)，得到39 mg (98%)的

2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺三盐酸盐I-4, EV-AU3254-001, 为灰白色粉末。LCMS (方法A): 保留时间 1.44min, M/z =541 (M+ 1)。

方案1的特殊情况 (方案1.1 - 1.9)

实施例5. Rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吲哚-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺,I-2的合成

Rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吲哚-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺 EV-AU9306-001 (EOAI3449033, I-2)根据方案1中所述的程序经由如方案1.1中所述合成3-氨基-5-甲氧基-4-(甲基氨基)苯甲酸甲酯 EV-AR0068-002来合成：

方案1.1

3-甲氧基-4-(甲基氨基)-5-硝基苯甲酸甲酯 EV-AR0065-002 -步骤1

向4-氯-3-甲氧基-5-硝基苯甲酸甲酯(CAS 63603-09-8, 2.00 g, 8.14 mmol)于DMF(10 ml)中的搅拌溶液中加入K₂CO₃ (99%, 1.37 g, 9.81 mmol)。向该溶液中加入甲胺盐酸盐(1:1) (0.62 g, 9.18 mmol)，将混合物在氮气下在密封管中于80℃搅拌16小时。将反应粗产物真空浓缩，并在DCM(100 ml)和水(10 ml)之间分配。进一步用水(2×10 ml)和饱和氯化钠水溶液(10 ml)洗涤有机层。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到橙色粉末，将其通过快速柱色谱(15-40％EtOAc/庚烷)纯化，得到1.49g(76％)的3-甲氧基-4-(甲基氨基)-5-硝基苯甲酸甲酯EV-AR0065-002，为橙色粉末。LCMS (方法D): 保留时间1.13min, M/z = 241 (M + 1)。

3-氨基-5-甲氧基-4-(甲基氨基)苯甲酸甲酯EV-AR0068-002 -步骤2

在氮气下向3-甲氧基-4-(甲基氨基)-5-硝基苯甲酸甲酯(EV-AR0065-002, 1.49g, 6.20 mmol)于乙醇(100 ml)中的搅拌溶液中加入10％Pd/C(0.18 g, 0.17 mmol)并将所得混合物在室温下在氢气氛下搅拌16小时。将反应混合物通过硅藻土过滤，并将过滤器用甲醇(150 ml)洗涤。将滤液真空浓缩，得到1.21g(89％)的3-氨基-5-甲氧基-4-(甲基氨基)苯甲酸甲酯EV-AR0068-002，为浅紫色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 0.63min, M/z =211 (M + 1)。

实施例6. Rac-(3R,4S)-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-3-基丙-2-烯酸酯, I-11的合成

Rac-(3R,4S)-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-3-基丙-2-烯酸酯EV-AE3981-002 (EOAI3441779, I-11)是根据方案1.2步骤1至3中所述的程序由如方案1中所述合成的2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸EV-AR3168-002来合成的：

顺式-rac-(3R,4S)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 EV-AE3975-001 -步骤1。

方案1.2步骤1

向2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸(EV-AR3168-002, 100 mg, 0.29 mmol)和HATU (131 mg, 0.35 mmol)于DMF (3ml)中的搅拌溶液中加入DIPEA(60 µl, 0.35 mmol)。将所得混合物在室温下搅拌1小时，然后加入顺式-rac-(3S, 4R)-3-氨基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(CAS 138026-97-8, 70mg, 0.35 mmol)并继续反应2小时。将反应用EtOAc(5 ml)稀释并用水(5 ml)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(0-5％MeOH/DCM)纯化粗物质，得到135mg(84％)的顺式-rac-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AE3975-001，为棕褐色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.14min, M/z = 531 (M + 1)。

顺式-rac-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-(丙-2-烯酰氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 EV-AE3979-001 -步骤2。

方案1.2步骤2

向顺式-rac-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AE3975-001, 50 mg, 0.094mmol)于DCM(1 ml)中的搅拌溶液中加入丙-2-烯酰氯(CAS 814-68-6, 0.011 ml, 0.14mmol)和DIPEA(0.025 ml, 0.14 mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物用DCM(5 ml)稀释，并用水(2 ml)和盐水(2 ml)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(0-3％MeOH/DCM)纯化粗物质，得到32mg(58％)的顺式-rac-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-(丙-2-烯酰氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AE3979-001，为无色油状物。LCMS (方法D): 保留时间 1.31 min, M/z = 585 (M + 1)。

顺式-rac-(3R,4S)-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-3-基丙-2-烯酸酯盐酸盐EV-AE3981-002 -步骤3。

方案1.2步骤3

将2M HCl/乙醚(0.23 ml, 0.57 mmol)加入到顺式-rac-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-(丙-2-烯酰氧基)吡咯烷甲酸叔丁酯(EV-AE3979-001, 30 mg, 0.057 mmol)中并将所得混合物在室温下静置2小时。真空除去溶剂，将固体与DCM(1 ml)共沸。真空除去溶剂，干燥固体，得到25mg(83％)的顺式-rac-(3R,4S)-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-3-基丙-2-烯酸酯盐酸盐EV-AE3981-002，为灰白色粉末。LCMS (方法A): 保留时间 1.96min, M/z = 485 (M + 1)。

实施例7. 顺式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-N,1-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺, I-1的合成

顺式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-N,1-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺 EV-AU3282-001 (EOAI3449646, I-1)是根据方案1.3步骤1至8中所述的程序由如方案1.2中所述合成的3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 EV-AU3248-001来合成的。

顺式-rac-(3R,4S)-3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 EV-AU3250-001 -步骤1。

方案1.3步骤1

向顺式-rac-(3R,4S)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 (EV-AU3248-001, 820mg, 1.55 mmol)于DMF (7.5 ml)中的搅拌溶液中加入咪唑(158 mg, 2.32 mmol)和TBDMSCl (280 mg, 1.85 mmol)。将反应在室温下搅拌16小时。将反应用水(20 ml)稀释，并用EtOAc(3×10 ml)萃取。将合并的有机物用水(2×20 ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(50-100％EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到638mg(61％)的顺式-rac-(3R, 4S)-3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3250-001，为无色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.55min, M/z = 645 (M + 1)。

顺式-rac-(3R,4S)-3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3257-001 -步骤2。

方案1.3步骤2

在-78℃下向顺式-rac-(3R,4S)-3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-4-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯 (EV-AU3250-001, 630 mg, 0.98 mmol)于THF(12 ml)中的搅拌溶液中加入2M NaHMDS/THF(1.47 ml)，将反应搅拌10分钟。然后加入碘甲烷(0.36 ml, 5.86mmol)，将反应温热至室温，同时搅拌3小时。将反应混合物用乙醚(20 ml)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(10 ml)洗涤，然后用饱和氯化钠水溶液(10 ml)洗涤。然后将有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(40-100％EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到470mg(67％)的顺式-rac-(3R, 4S)-3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-4-{N-甲基-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-l-甲酸叔丁酯EV-AU3257-001，为无色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.60min, M/z =659 (M + 1)。

顺式-rac-(3R,4S)-3-羟基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3260-001 -步骤3

方案1.3步骤3

在0℃下向顺式-rac-(3R,4S)-3-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-4-{N-甲基-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AU3257-001, 420 mg, 0.64 mmol)于THF(7 ml)中的搅拌溶液中加入1M TBAF/THF(1.27 ml)。使反应温热至室温并搅拌1小时。将反应混合物用EtOAc(10ml)稀释，用水(3×10 ml)和饱和氯化钠水溶液(10 ml)洗涤。将有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(0-10％MeOH/EtOAc)纯化粗物质，得到379mg(98％)的顺式-rac-(3R, 4S)-3-羟基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3260- 001，为无色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.18min, M/z = 545 (M + 1)。

顺式-rac-(3R,4S)-3-(甲磺酰基氧基)-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3262-001 -步骤4。

方案1.3步骤4

在0℃下向rac-(3R,4S)-3-羟基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AU3260-001, 379 mg, 0.7 mmol)于DCM(10 ml)中的搅拌溶液中加入Et₃N (145 µl, 1.04 mmol)和MsCl (65 µl, 0.84 mmol)。使反应达到室温，同时搅拌2小时。将反应混合物用水(5 ml)洗涤，将有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到410mg(95％)的顺式-rac-(3R,4S)-3-(甲磺酰基氧基)-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3262-001，为无色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.24min, M/z = 623 (M + 1)。

反式-rac-(3R,4R)-3-叠氮基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3263-001 -步骤5。

方案1.3步骤5

向顺式-rac-(3R,4S)-3-(甲磺酰基氧基)-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AU3262-001, 410 mg, 0.66 mmol)于DMSO(2 ml)中的搅拌溶液中加入叠氮化钠(128mg, 1.98 mmol)并将反应在90℃下搅拌14小时。然后将反应冷却至室温并用EtOAc(10 ml)稀释。将溶液用水(3×10 ml)、饱和氯化钠水溶液(2×10 ml)洗涤，将有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(用50-100％EtOAc/庚烷洗脱)纯化粗产物，得到272mg(72％)的反式-rac-(3R,4R)-3-叠氮基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3263-001，为无色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.32min, M/z = 570 (M + 1)。

反式-rac-(3R,4R)-3-氨基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3267-001 -步骤6。

方案1.3步骤6

将反式-rac-(3R,4R)-3-叠氮基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AU3263-001, 272 mg, 0.48 mmol)于EtOAc(8 ml)中的溶液在氢气氛下在室温下搅拌12小时。将反应混合物通过滤纸过滤，将过滤器用MeOH洗涤，将滤液真空浓缩，得到230mg(80％)的反式-rac-(3R,4R)-3-氨基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3267-001，为灰白色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.07min, M/z = 544 (M + 1)。

反式-rac-(3R,4R)-3-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3279-001 -步骤7。

方案1.3步骤7

向反式-rac-(3R,4R)-3-氨基-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-l-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AU3267-001,70 mg, 0.13 mmol)和(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(26 mg, 0.15 mmol)于DMF(1 ml)中的搅拌溶液中加入HATU(59 mg, 0.15 mmol)和DIPEA(49 µl, 0.28 mmol)，将反应在室温下搅拌2小时。然后在真空下除去溶剂，并通过制备型HPLC(酸性方法)纯化粗产物，得到20mg(24％)的反式-rac-(3R,4R)-3-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯EV-AU3279-001，为灰白色固体。LCMS (方法D): 保留时间1.14min, M/z = 655 (M + 1)。

反式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-N,1-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺盐酸盐, I-1 (EV-AU3282-001) -步骤8。

方案1.3步骤8

将2M HCl/乙醚(0.76 ml) 加入到反式-rac-(3R,4R)-3-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]-4-{N-甲基2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(EV-AU3279-001, 20 mg, 0.03 mmol)中并将所得混合物在室温下搅拌2小时。真空浓缩反应混合物，得到17 mg (78%)的rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,4R)-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]吡咯烷-3-基]-N,1-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺盐酸盐 I-1 (EV-AU3282-001)，为灰白色固体。LCMS (方法A): 保留时间 1.43min, M/z = 555 (M + 1)。

实施例8. 顺式-rac-(2E)-N-[(3R,4S)-3-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-4-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺, I-3的合成

顺式-rac-(2E)-N-[(3R,4S)-3-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-4-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺EV-AU3261-001 (EOAI3449030, I-3)是根据方案1.4步骤1至10中所述的程序使用如方案1中所述合成的中间体2-[1- (环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸甲酯 EV-AR6658-001合成的。

反式-rac-(3R,4R)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯EV-AU3233-001 -步骤1。

方案1.4步骤1

在0℃下向反式-rac-(3R,4R)-3-氨基-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(250 mg, 1.16mmol)于DCM(5 ml)中的溶液中加入三乙胺(484 µl, 3.47 mmol)和氯甲酸苄酯(198 µl,1.39 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟。将溶液温热至室温并再搅拌12小时。将反应用水(10 ml)淬灭，并用DCM(3×10 ml)萃取。将合并的有机级分用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过柱色谱(20-80％EtOAc/庚烷)纯化粗产物，得到0.21g(52％)的反式-rac-(3R,4R)-3 -{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯EV-AU3233-001，为无色粘性油状物。LCMS (方法D): 保留时间 1.12min, M/z = 373 (M + Na)。

反式-rac-N-[(3R,4R)-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸苄酯盐酸盐EV-AU3238-001 -步骤2。

方案1.4步骤2

将反式-rac-(3R,4R)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(EV-AU3233-001和EV-AU3236-001混合, 390 mg, 1.11 mmol)溶于4M HCl/二氧杂环己烷(5.56 ml)并在室温搅拌1小时。真空除去溶剂，得到0.27 g (86%)的反式-rac-N-[(3R,4R)-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸苄酯盐酸盐EV-AU3238-001，为白色固体。LCMS (方法D):保留时间 0.64min, M/z = 251 (M + 1)。

反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸苄酯EV-AU3240-001 -步骤3。

方案1.4步骤3

向2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸甲酯(EV-AR6658-001, 330 mg, 0.95 mmol)于DMF(5 ml)中的溶液中加入DIPEA(0.55 ml, 3.33 mmol)和HATU (435 mg, 1.14 mmol)，并将反应在室温下在氮气下搅拌1小时。加入N-[(3R,4R)-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸苄酯盐酸盐(273 mg, 0.95 mmol)并将反应在室温下再搅拌2小时。将反应用水(5 ml)淬灭，并用乙酸乙酯(5 ml×3)萃取。将合并的有机萃取物用水(5 ml)和饱和氯化钠水溶液(2×5 ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过柱色谱(50-100％EtOAc/庚烷，然后0-20％MeOH/EtOAc)纯化粗产物，得到0.48g(70％)的反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸苄酯 EV-AU3240-001，为无色粘性油状物。LCMS (方法D): 保留时间 1.11min, M/z = 579 (M + 1)。

反式-rac-(3R,4R)-3-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-4-醇EV-AU3242-001 -步骤4。

方案1.4步骤4

将反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸苄酯 (EV-AU3240-001, 480 mg, 0.83 mmol)于乙醇(10 ml)中的溶液在室温下在氢气氛下在Pd/C(5%,176.55 mg, 0.08 mmol)存在下搅拌12小时。将反应通过Kieselguhr垫过滤，将过滤器用MeOH洗涤并在真空下浓缩，得到0.38g(90％)的反式-rac-(3R,4R)-3-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-4-醇EV-AU3242-001，为白色固体。LCMS (方法D): 保留时间 0.90min, M/z = 445 (M + 1)。

反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3245-001 -步骤5。

方案1.4步骤5

向反式-rac-(3R,4R)-3-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-4-醇 (EV-AU3242-001, 87%, 380 mg,0.74 mmol)于DCM (5 ml)中的溶液中加入三乙胺 (114 µl, 0.82 mmol)和二碳酸二叔丁酯 (178 mg, 0.82 mmol)并将反应在室温下搅拌1小时。将反应用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭，并用DCM(10ml)萃取。将水层用DCM(10 ml)洗涤，将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到0.27g(63％)的反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3245-001，为白色固体。LCMS (方法D): 保留时间 1.09 min, M/z = 545 (M+ 1)。

反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-(甲磺酰基氧基)哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AU3251-001 -步骤6。

方案1.4步骤6

在0℃下向反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-羟基哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AU3245-001, 269 mg, 0.49 mmol)于DCM (8 ml)中的溶液中加入三乙胺(103 µl, 0.74mmol)和甲磺酰氯 (46 µl, 0.59 mmol)。将反应搅拌并经2小时达到室温。将反应混合物用水(5 ml)洗涤，将有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到0.31g(81％) 的反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-(甲磺酰基氧基)哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3251-001，为无色粘性油状物。LCMS (方法D): 保留时间 1.18min, M/z = 623 (M + 1)。

顺式-rac-N-[(3R,4S)-4-叠氮基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3252-001-步骤7。

方案1.4步骤7

向反式-rac-N-[(3R,4R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-(甲磺酰基氧基)哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯(EV-AU3251-001, 313 mg, 0.5 mmol)于DMSO (1.5 ml)中的溶液中加入叠氮化钠(98 mg,1.51 mmol)，将反应在90℃下搅拌14小时。将反应冷却至室温并用EtOAc(10 ml)稀释。用水(3×10 ml)和饱和氯化钠水溶液(2×10 ml)洗涤有机层。将有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过柱色谱(50-100％EtOAc/庚烷)纯化粗产物，得到0.12g(43％)的顺式-rac-N-[(3R,4S)-4-叠氮基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3252-001，为白色固体。LCMS (方法D): 保留时间 1.25min, M/z = 570 (M + 1)。

顺式-rac-N-[(3R,4S)-4-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3256-001 -步骤8。

方案1.4步骤8

将顺式-rac-N-[(3R,4S)-4-叠氮基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AU3252-001, 125 mg, 0.22 mmol)于EtOAc (4 ml)中的溶液用Pd/C (5% w/w, 47 mg, 0.02mmol)处理并在一个大气压的氢气下搅拌12小时。通过玻璃纤维滤纸过滤粗混合物，用MeOH洗涤过滤器，浓缩滤液，得到0.10g(85％)的顺式-rac-N-[(3R,4S)-4-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3256-001，为灰白色固体。LCMS (方法D): 保留时间 0.98min, M/z =544 (M + 1)。

顺式-rac-N-[(3R,4S)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AU3258-001 -步骤9

方案1.4步骤9

向(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(18 mg, 0.11 mmol)和顺式-rac-N-[(3R,4S)-4-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AU3256-001, 50 mg, 0.09 mmol)于DMF (1 ml)中的溶液中加入HATU (42 mg, 0.11 mmol)和DIPEA (35 µl, 0.2 mmol)，将反应在室温下搅拌2小时。真空除去溶剂，通过制备型HPLC(酸性方法)纯化粗产物，得到25mg(37％)的顺式-rac-N-[(3R,4S)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AU3258-001，为灰白色固体。LCMS (方法D): 保留时间 2.12min,M/z = 655 (M + 1)。

顺式-rac-(2E)-N-[(3R,4S)-3-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-4-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺, I-3 (EV-AU3261-001) -步骤10 。

方案1.4步骤10

将顺式-rac-N-[(3R,4S)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-4-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AU3258-001, 25 mg, 0.04 mmol)溶于2M HCl/乙醚 (1.93ml)中并在室温搅拌2小时。真空除去溶剂，得到18 mg (75%)的顺式-rac-(2E)-N-[(3R,4S)-3-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-4-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺 I-3 (EV-AU3261-001)，为灰白色固体。LCMS (方法A): 保留时间 1.48min, M/z = 555 (M + 1)。

实施例9. 顺式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,5S)-5-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺, I-8的合成

顺式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,5S)-5-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺EV-AE3994-001 (EOAI3447033, I-8)是根据方案1.5步骤1至3中所述的程序由如方案1中所述合成的2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸EV-AR6658-001合成的：

顺式-rac-(3R,5S)-3-氨基-5-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}哌啶-1-甲酸叔丁酯 EV-AE3991-001 -步骤1。

方案1.5步骤1

向2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸(EV-AR6658-001, 如方案1中制备, 100 mg, 0.14 mmol)于DMF(1 ml)中的溶液中加入DIPEA(167 µl, 1.01mmol)和HATU(132 mg, 0.35mmol)并将反应在氮气下在室温搅拌20分钟。加入顺式-rac-(3R,5S)-3,5-二氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯 (EV-AU3202-001，如J. Org. Chem., 2013, 78(23), p 12236-12242中所述制备, 155 mg, 0.72 mmol)/DMF(1ml)，并将反应在室温下再搅拌2小时。用水(5 ml)淬灭反应，并用乙酸乙酯(5 ml×3)萃取。将合并的有机萃取物用饱和氯化钠水溶液(5 ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过制备型HPLC(酸性方法)纯化粗产物，得到22mg(14％)的顺式-rac-(3R,5S)-3-氨基-5-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}哌啶-1-甲酸叔丁酯EV-AE3991-001，为白色固体。LCMS (方法D): 保留时间 1.00min,M/z = 544 (M + 1)。

顺式-rac-(3R,5S)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-5-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-1-甲酸叔丁酯 EV-AE3993-001 -步骤2。

方案1.5步骤2

在室温下用DIPEA (16 µl, 0.089 mmol)处理顺式-rac-(3R,5S)-3-氨基-5-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}哌啶-1-甲酸叔丁酯 (EV-AE3991-001, 22 mg, 0.04 mmol)、(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(8 mg, 0.049 mmol)和HATU (18 mg, 0.049 mmol)于无水DMF (0.5ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌20分钟。将反应混合物用EtOAc(5 ml)稀释，并用水(2 ml)洗涤。用EtOAc(5 ml)再萃取水层。将EtOAc层合并，用饱和氯化钠水溶液(5 ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过制备型HPLC(酸性方法)纯化粗产物，得到6 mg (22%)的顺式-rac-(3R,5S)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-5-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-1-甲酸叔丁酯EV-AE3993-001，为无色结晶固体。LCMS (方法D): 保留时间 1.03min, M/z = 655 (M + 1)。

顺式-rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,5S)-5-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺二盐酸盐, I-8 (EV-AE3994-001) -步骤3。

方案1.5步骤3

向顺式-rac-(3R,5S)-3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-酰胺基}-5-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(EV-AE3993-001, 6 mg, 0.009 mmol)中加入2M HCl/乙醚(0.05 ml, 0.092mmol)。使悬浮液混合物在室温下静置1小时。加入另一份2M HCl/乙醚(0.05 ml)，将反应混合物短暂搅拌，然后静置30分钟。将反应混合物浓缩至干，得到5 mg (92%)的rac-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[(3R,5S)-5-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-3-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺二盐酸盐I-8 (EV-AE3994-001)，为白色粉末。LCMS (方法C): 保留时间 2.90min, M/z = 555 (M + 1)。

实施例10. 顺式-rac-(2E)-N-[(3R,5S)-5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺, I-10的合成

顺式-rac-(2E)-N-[(3R,5S)-5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺EV-AU3215-001 (EOAI3442261, I-10)是根据方案1.6步骤1至5中所述的程序由2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸 (如方案1中所述合成)合成的。

3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-3,6,7-三氮杂二环[3.2.1]辛烷-6,7-二甲酸6,7-二苄酯 EV-AT0494-001 -步骤1。

方案1.6步骤1

向2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸 (EV-AT0481-001, 410 mg, 1.18 mmol)于DMF (8 ml)中的溶液中加入DIPEA(235 µl, 1.42 mmol)和HATU (540 mg, 1.42 mmol)并将反应在室温下在氮气下搅拌1小时。加入3,6,7-三氮杂二环[3.2.1]辛烷-6,7-二甲酸6,7-二苄酯(EV-AT0491-001，如J. Org. Chem., 2013, 78(23), p 12236-12242中所述制备, 497 mg, 1.3 mmol)/DMF (2ml)，将反应再搅拌2小时。将混合物用饱和氯化铵水溶液(5 ml)淬灭并用乙酸乙酯(5 ml×3)萃取。将合并的有机萃取物用水(5 ml)、饱和氯化钠水溶液(5 ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过柱色谱(80:100 EtOAc/庚烷，然后 0:5% MeOH/EtOAc)纯化粗产物，得到0.82 g (96%)的3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-3,6,7-三氮杂二环[3.2.1]辛烷-6,7-二甲酸6,7-二苄酯 EV-AT0494-001，为橙色固体。LCMS (方法D): 保留时间 1.28min, M/z = 710 (M + 1)。

顺式-rac-(3R,5S)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3,5-二胺EV-AT0497-001 -步骤2。

方案1.6步骤2

使3-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-3,6,7-三氮杂二环[3.2.1]辛烷-6,7-二甲酸6,7-二苄酯(EV-AT0494-001,22 ml)于EtOH中的0.05M溶液经受Pd/C (10%)催化剂筒上的H-Cube条件(1ml/min, 1巴,80℃, 全氢模式)。真空除去溶剂，得到0.41 g (82%)的顺式-rac-(3R,5S)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3,5-二胺EV-AT0497-001，为橙色油状物。LCMS (方法D): 保留时间 0.76min, M/z = 444 (M +1)。

甲酸; 顺式-N-(5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯EV-AT0498-001 -步骤3。

方案1.6步骤3

向顺式-rac-(3R,5S)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3,5-二胺 (EV-AT0497-001, 415 mg, 0.94 mmol)于DCM (7.5 ml)中的溶液中加入三乙胺(144 µl, 1.03 mmol)和二碳酸二叔丁酯(184 mg,0.84 mmol)并将反应在室温下搅拌1小时。将反应用饱和碳酸氢钠水溶液(10 ml)淬灭，并用DCM(10 ml)萃取。将水层用DCM(10 ml)洗涤，将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过反相柱色谱(10-90％MeCN/水，两种溶剂均含有0.1％甲酸)纯化粗物质，得到0.17 g (30%)的甲酸; 顺式-N-(5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯EV-AT0498-001，为灰白色固体。LCMS (方法A): 保留时间 2.17min, M/z = 544 (M + 1)。

顺式-N-(1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-5-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基]哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯EV-AU3206-001 -步骤4。

方案1.6步骤4

向(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(20 mg, 0.12 mmol)于DMF (0.5 ml)中的溶液中加入HATU (55 mg, 0.14 mmol)和DIPEA (60 µl, 0.36 mmol)并将溶液在室温下搅拌1小时。加入甲酸; 顺式-N-(5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯 (EV-AT0498-001, 52.52 mg, 0.1 mmol)/DMF (0.5 ml)并将反应再搅拌3小时。真空除去溶剂，用制备型HPLC(酸性方法)纯化粗物质，得到 14 mg (18%)的甲酸; 顺式-N-(5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯EV-AU3206-001，为白色固体。LCMS (方法A): 保留时间 2.24min, M/z =655 (M + 1)。

顺式-rac-(2E)-N-[(3R,5S)-5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺, I-10 (EV-AU3215-001) -步骤5。

方案1.6步骤5

将甲酸; 顺式-N-(5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯 (EV-AU3206-001, 14mg, 0.02 mmol)溶于2M HCl/乙醚(1.08 ml)并在室温下搅拌 2小时。真空浓缩反应混合物，得到19 mg (91%)的顺式-rac-(2E)-N-[(3R,5S)-5-氨基-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺I-10, (EV-AU3215-001)，为灰白色固体。LCMS (方法A): 保留时间1.33min, M/z = 555 (M + 1)。

实施例11. (2E)-N-[2-(1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基}-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]甲酰胺基)乙基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺, I-7的合成

(2E)-N-[2-(1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基}-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]甲酰胺基)乙基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺EV-AE3995-001 (EOAI3447034, I-7)是根据方案1.7步骤1至4中所述的程序由如方案1中所述合成的2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸EV-AR3168-002合成的：

N-(2-{[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3211-001 -步骤1。

方案1.7步骤1

向N-(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯 (CAS 89711-08-0, 649 mg, 4.07 mmol)和2-(1H-咪唑-5-基)乙-1-胺二盐酸盐(CAS 56-92-8, 500 mg, 2.72 mmol)于MeOH (15 ml)中的搅拌溶液中加入乙酸(0.16 ml, 2.72 mmol)，接着逐份加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.0 g, 9.42 mmol)。将反应在室温下搅拌16小时。真空除去溶剂，通过反相快速柱色谱(10-100％ MeCN/水，两种溶剂均含有0.1％NH₃)纯化残余物，得到80 mg (9%) 的N-(2-{[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯 EV-AU3211-001，为黄色油状物。LCMS (方法J): 保留时间 1.28min, M/z = 255 (M + 1)。

N-[2-(1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基}-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]甲酰胺基)乙基]氨基甲酸叔丁酯EV-AU3217-001 -步骤2。

方案1.7步骤2

向2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸(EV-AR3168-002, 109 mg, 0.31 mmol)于DMF (2 ml)中的搅拌溶液中加入HATU(132 mg, 0.35 mmol)和DIPEA (110 µl, 0.63 mmol)并将反应在室温下搅拌2小时。使反应混合物直接进行制备型HPLC(碱性方法)，得到25 mg (14%)的N-[2-(1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基}-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]甲酰胺基)乙基]氨基甲酸叔丁酯EV-AU3217-001，为无色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 0.99min, M/Z = 583 (M + 1)。

N-(2-氨基乙基)-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺二盐酸盐EV-AE3992-001 -步骤3。

方案1.7步骤3

将2M HCl/乙醚(0.22 ml, 0.43 mmol)加入到N-[2-(1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基}-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]甲酰胺基)乙基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AU3217-001, 25 mg, 0.043 mmol)中并将所得混合物在室温下搅拌2小时。真空除去溶剂，将残余物与DCM(2 ml)共沸。将得到的固体干燥，得到27 mg (定量)的N-(2-氨基乙基)-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺二盐酸盐 EV-AE3992-001，为白色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 0.78min, M/z = 483 (M + 1)。

(2E)-N-[2-(1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基}-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]甲酰胺基)乙基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺甲酸盐, I-7 (EV-AE3995-001) -步骤4。

方案1.7步骤4

向N-(2-氨基乙基)-2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酰胺二盐酸盐 (EV-AE3992-001,27 mg, 0.049 mmol)、HATU (22 mg, 0.058 mmol)和(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐 (10 mg, 0.058 mmol)于无水DMF (1 ml)中的搅拌溶液中加入DIPEA (30 µl, 0.17mmol)。将反应在室温下搅拌20分钟。真空除去溶剂，使残余物进行制备型HPLC(酸性方法)，得到2.6 mg (8%)的(2E)-N-[2-(1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基}-N-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基]甲酰胺基)乙基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺甲酸盐EV-AE3995-001，为无色固体。LCMS (方法C): 保留时间2.72min, M/z = 594 (M + 1)。

实施例12. (2E)-N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺, I-12的合成

(2E)-N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺EV-AQ1925-001(EOAI3426752, I-12)是根据方案1.8步骤1至3中所述的程序由如方案1中所述合成的2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸EV-AR3168-002合成的：

N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AP0493-002 -步骤1。

方案1.8步骤1

向2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸 (EV-AR3168-002, 300 mg, 0.87 mmol)和HATU (362 mg, 0.95 mmol)于无水DMF (9 ml)中的搅拌溶液中加入DIPEA (166 µl, 0.95 mmol)。将反应在室温下搅拌1小时，并加入N-[(3R)-哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 (CAS 309956-78-3, 208 mg, 1.04mmol)。将反应在室温下搅拌16小时并真空浓缩。将残余物在DCM(30 ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(30 ml)之间分配。将水层用DCM(20 ml)萃取，将合并的有机物用水(20 ml)和饱和氯化钠水溶液(20 ml)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱(1-10％MeOH/DCM)纯化粗物质，得到352 mg (76%)的N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AP0493-002，为黄色结晶固体。LCMS (方法D): 保留时间 1.34min, M/z = 529 (M + 1)。

(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-胺盐酸盐EV-AP4097-001 -步骤2。

方案1.8步骤2

向N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AP0493-002, 352 mg, 0.66mmol)于甲醇(3 ml)中的搅拌溶液中加入4M HCl/二氧杂环己烷(7 ml)。将反应在室温下搅拌3小时。将反应混合物真空浓缩，干燥得到的固体，得到299 mg (96%)的(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-胺盐酸盐EV-AP4097-001，为黄色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.00min, M/z = 429 (M+ 1)。

(2E)-N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺, I-12 (EV-AQ1925-001) -步骤3。

方案1.8步骤3

向(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-胺盐酸盐(EV-AP4097-001, 50 mg, 0.11 mmol)于DMF (1 ml)中的搅拌溶液中加入(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐 (21 mg, 0.13 mmol)、DIPEA(62 mg, 0.54 mmol)和TBTU (45 mg, 0.14 mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。过滤反应混合物，使滤液进行制备型HPLC(碱性方法)，得到25 mg (43%)的(2E)-N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺I-12 (EV-AQ1925-001)，为白色固体。LCMS (方法A): 保留时间 1.88min, M/z = 540 (M + 1)。

实施例13. N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]丙-2-烯酰胺, I-13的合成

N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]丙-2-烯酰胺EV-AO7886-002 (EOAI3426521, I-13)是根据方案1.9中所述的程序由如方案1.8中所述合成的3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-胺盐酸盐EV-AP4097-001合成的：

方案1.9

N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]丙-2-烯酰胺, I-13 (EV-AO7886-002) -步骤1

在0℃下向DIPEA (178 µl, 1.02 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)和(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-胺盐酸盐 (EV-AP4097-001, 50 mg, 0.11 mmol)于DCM (5 ml)中的搅拌溶液中逐滴加入丙-2-烯酰氯 (26 µl, 0.32 mmol)于DCM (3 ml)中的溶液。将反应在0℃下搅拌1小时。加入水(1 ml)，用疏水过滤器分离各层。将有机相真空浓缩，并将粗物质通过制备型HPLC(酸性方法)纯化，得到21 mg (41%)的N-[(3R)-1-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}哌啶-3-基]丙-2-烯酰胺 I-13 (EV-AO7886-002)，为无色结晶固体。LCMS (方法A): 保留时间 2.61min, M/z = 483 (M + 1)。

根据上述程序合成以下化合物：

实施例14. N-[(1S,4R,6R,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]-N-甲基丙-2-烯酰胺, I-16和N-[(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]-N-甲基丙-2-烯酰胺, I-17的合成

N-[(1S,4R,6R,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]-N-甲基丙-2-烯酰胺I-16 (EV-AZ4416-001) (EOAI3478697) (LCMS (方法A): 保留时间 1.93min, M/z = 554.4 (M+1))和N-[(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]-N-甲基丙-2-烯酰胺I-17 (EV-AZ4417-001) (EOAI3478698) (LCMS (方法A):保留时间 2.10 min, M/z = 554.4 (M+1))是根据方案1.10步骤1-10中所述的程序由根据方案1中所述的程序合成的2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸 EV-AV3032-001合成的。

方案1.10步骤1

(1R,4R,6S,7R)-7-溴-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-醇EV-AY4949-001 -步骤1

将(4R,6R)-3-溴-1-[(1S)-1-苯基乙基]-1-氮杂三环[2.2.1.0]庚-1-鎓溴化物(EV-AW8588-001, 8.70 g, 19.4 mmol) (如Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1242 -1246中所述合成)于乙腈: 水 (1:1, 100 ml)中的溶液在65℃搅拌20小时。将反应混合物真空浓缩，并通过快速柱色谱(20-80％EtOAc/庚烷)纯化残余物，得到4.29 g (73%)的(1R,4R,6S,7R)-7-溴-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-醇EV-AY4949-001，为灰白色固体。¹H NMR (250 MHz, 氯仿-d) δ 7.38 - 7.14 (m, 5H), 4.10 (s, 2H), 3.58(q, J = 6.1 Hz, 1H), 3.36 - 3.23 (m, 1H), 2.65 (dt, J = 9.0, 3.1 Hz, 1H),2.58 - 2.46 (m, 1H), 2.28 - 1.91 (m, 4H), 1.32 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 无LCMS数据。

方案1.10步骤2

(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-醇氢溴酸盐 EV-AY4952-001 -步骤2

将(1R,4R,6S,7R)-7-溴-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-醇(EV-AY4949-001, 4.29 g, 14.2 mmol)溶于7N氨/甲醇(15 ml)并将得到的混合物在65℃加热2小时。真空除去溶剂，得到4.62 g (定量)的(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-醇氢溴酸盐EV-AY4952-001，为黄色固体。LCMS (方法D): 保留时间 0.20min, M/z = 233 (M + 1)。

方案1.10步骤3

N-[(1S,4R,6S,7R)-6-羟基-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AY4953-001 -步骤3

将二碳酸二叔丁酯 (3.41 g, 15.6 mmol) 加入到(1R,4R,6S,7R)-7-氨基-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-醇氢溴酸盐(EV-AY4952-001, 4.62 g,14.2 mmol)和三乙胺(2.97 ml, 21.28 mmol)于DCM (50 ml)中的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌2.5小时，用饱和碳酸氢钠水溶液(35 ml)、水(2×30 ml)和饱和氯化钠水溶液(35 ml)洗涤，用硫酸钠干燥并真空浓缩。将得到的固体用DCM:乙醚(1:4, 20 ml)研磨，过滤并干燥，得到3.24 g (65%)的N-[(1S,4R,6S,7R)-6-羟基-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AY4953-001，为灰白色固体。LCMS (方法D): 保留时间 1.02min, M/z = 333 (M + 1)。

方案1.10步骤4

N-[(1S,4R,6S,7R)-6-羟基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AW5569-001 -步骤4

用氮气吹扫N-[(1S,4R,6S,7R)-6-羟基-2-[(1S)-1-苯基乙基]-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AY4953-001, 350 mg, 1.05 mmol)于乙醇(10 ml)中的溶液。加入Pd/C (5%, 224 mg, 0.11 mmol)，将反应混合物用氮气吹扫并在氢气氛下搅拌12小时。将反应混合物通过滤纸过滤(用甲醇洗涤)。将滤液真空浓缩，得到170 mg(71%)的N-[(1S,4R,6S,7R)-6-羟基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AW5569-001，为白色固体。¹H NMR (500 MHz, 氯仿-d) δ 5.84 (s, 1H), 3.99 (d, J =40.5 Hz, 2H), 3.12 (s, 1H), 2.98 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 2.53 - 2.41 (m, 2H),1.98 (dd, J = 13.7, 6.9 Hz, 1H), 1.75 (d, J = 13.1 Hz, 1H), 1.44 (s, 9H). 无LCMS数据。

方案1.10步骤5

N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-羟基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AY5029-001 -步骤5

向2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸 (EV-AV3032-001, 0.969 g, 2.58 mmol)于DMF (12 ml)中的溶液中加入HATU (1.08 g, 2.83 mmol)和DIPEA (1.12 ml, 6.44 mmol)，接着加入N-[(1S,4R,6S,7R)-6-羟基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯(EV-AW5569-001, 98%,0.60 g, 2.58 mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌30分钟。用EtOAc(100 ml)和水(100ml)稀释反应。收集有机相，用EtOAc(100 ml)萃取水相。将合并的有机物用饱和氯化钠水溶液(100 ml)洗涤，用硫酸镁干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(50-100％EtOAc/庚烷，然后5％甲醇/EtOAc)纯化粗产物，得到736 mg (48%)的N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-羟基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AY5029-001，为灰白色固体。LCMS (方法D) 保留时间 1.19min, M/z = 587 (M + 1)。

方案1.10步骤6

N-[(1S,4R,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-氧代-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AZ4415-001 -步骤6

在0℃下向N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-羟基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯(EV-AY5029-001, 490 mg, 0.84 mmol)于DCM (10 ml)中的溶液中加入戴斯-马丁氧化剂(710 mg, 1.67 mmol)并将反应温热至室温。将反应混合物搅拌24小时，用饱和硫代硫酸钠水溶液(10 ml)淬灭并用DCM(3×20 ml)萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过制备型HPLC(酸性方法)纯化剩余的残余物，得到471 mg(89%)的N-[(1S,4R,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-氧代-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AZ4415-001，为白色固体。LCMS (方法D): 保留时间 1.25min, M/z = 585 (M +1)。

方案1.10步骤7

N-[(1S,4R,7R)-6-[苄基(甲基)氨基]-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AZ4411-003 -步骤7

将N-[(1S,4R,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-氧代-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯(EV-AZ4415-001, 86%, 109 mg, 0.16 mmol)于DCE (1.5 ml) 中的溶液在室温下与活化的3A分子筛一起搅拌。加入N-甲基-1-苯基甲胺(41 µl, 0.32 mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(STAB, 51 mg, 0.24 mmol)和乙酸(10 µl, 0.17 mmol)，将反应在室温下搅拌72小时。过滤反应混合物，用DCM(20 ml)洗涤分子筛。将DCM溶液用饱和碳酸氢钠水溶液(15 ml)洗涤，并将水层用DCM(3×15 ml)再萃取。将合并的有机物用饱和氯化钠水溶液(15 ml)洗涤，用硫酸镁干燥并真空浓缩。将粗物质溶于甲醇(5 ml)中并加载到2g SCX-II筒上。将筒用甲醇和2.8M氨/甲醇冲洗。将相关级分真空浓缩，得到71 mg (52%)的N-[(1S,4R,7R)-6-[苄基(甲基)氨基]-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AZ4411-003，为无色油状物。LCMS (方法H): 保留时间 4.43min和4.83min, M/z = 690 (M+ 1)。

方案1.10步骤8

N-[(1R,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(甲基氨基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AZ4413-002 -步骤8

使0.05M的N-[(1S,4R,6S,7R)-6-[苄基(甲基)氨基]-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AZ4411-003, 81%, 71 mg, 0.08 mmol) 于甲醇(2.1 ml)中的溶液经受Pearlman's催化剂(20 % Pd(OH)₂/C)筒上的 H-Cube条件(1 ml/min, 60巴, 60℃, 2次)。真空浓缩所得溶液，得到45 mg (60 %)的N-[(1R,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(甲基氨基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AZ4413-002，为黄色油状物。LCMS (方法D): 保留时间 1.08min, M/z = 600 (M + 1)。

方案1.10步骤9

N-[(1S,4R,6R,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(N-甲基丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AZ4414-002和N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(N-甲基丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AZ4414-003 -步骤9

向N-[(1R,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(甲基氨基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AZ4413-002, 67%, 45 mg, 0.05 mmol)于二氧杂环己烷(0.5 ml)中的溶液中加入三乙胺 (14 µl, 0.1 mmol)，接着加入丙-2-烯酰氯(9 µl, 0.11 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌50分钟。向反应中加入另外的丙-2-烯酰氯(5 μl)并继续搅拌另外1.5小时。将所得反应混合物真空浓缩，并通过制备型HPLC(酸性方法)纯化，得到14 mg(37%)的N-[(1S,4R,6R,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(N-甲基丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AZ4414-002 (任意指定的手性)，为白色固体。LCMS (方法A): 保留时间 3.19min, M/z = 654 (M + 1)。还分离出4.4 mg (12%)的N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(N-甲基丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AZ4414-003 (任意指定的手性)，为白色固体。LCMS (方法A): 保留时间 3.29min,M/z = 654 (M + 1)。

方案1.10步骤10

N-[(1S,4R,6R,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]-N-甲基丙-2-烯酰胺; 三氟乙酸I-16 (EV-AZ4416-001) (EOAI3478697) -步骤10

向N-[(1S,4R,6R,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(N-甲基丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AZ4414-002, 14 mg, 0.02 mmol)于DCM (0.5 ml)中的搅拌溶液中加入TFA (20 µl, 0.26 mmol)。将反应在室温下搅拌0.5小时。加入另外的TFA(80 µl, 1.04 mmol)并继续反应1小时。将反应混合物真空浓缩，再溶于水中并通过冷冻干燥干燥，得到12 mg (78 %)的N-[(1S,4R,6R,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]-N-甲基丙-2-烯酰胺; 三氟乙酸I-16 (EV-AZ4416-001)(EOAI3478697)，为白色固体。LCMS (方法H): 保留时间 1.93min, M/z = 554 (M + 1)。

N-[(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]-N-甲基丙-2-烯酰胺; 三氟乙酸 I-17 (EV-AZ4417-001) (EOAI3478698) -步骤10

向N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(N-甲基丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AZ4414-003, 92%, 4.4 mg, 0.01 mmol)于DCM(0.4 ml)中的搅拌溶液中加入TFA (29 µl, 0.38 mmol)。将反应在室温下搅拌2小时。加入另外的TFA(20 µl, 0.26 mmol)并继续反应30分钟。将反应混合物真空浓缩，再溶于水中并通过冷冻干燥干燥，得到5 mg (定量)的N-[(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]-N-甲基丙-2-烯酰胺; 三氟乙酸 I-17 (EV-AZ4417-001)(EOAI3478698)，为粘性白色固体。LCMS (方法A): 保留时间 2.10min, M/z = 554 (M +1)。

实施例15. (1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基丙-2-烯酸酯, I-15的合成

(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基丙-2-烯酸酯I-15 (EV-AY5035-001) (EOAI3470264)(LCMS (方法A): 保留时间 2.23 min, M/z = 541.3(M+1))是根据方案1中所述的程序经由如方案1.10步骤11中所述合成(1S,4R,6S,7R)-7-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基丙-2-烯酸酯EV-AY5034-002来合成的。

方案1.10步骤11

(1S,4R,6S,7R)-7-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基丙-2-烯酸酯 (EV-AY5034-001) -步骤11

向N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-羟基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AY5029-001, 120 mg, 0.20 mmol)于DCM (2 ml)中的冷溶液(0℃)中加入三乙胺(70 µl, 0.51 mmol)，接着加入丙-2-烯酰氯 (20 µl, 0.25 mmol)。使反应混合物温热至室温并搅拌1小时。加入三乙胺(70 µl, 0.51 mmol)，然后加入丙-2-烯酰氯(40 µl,0.50 mmol)。将混合物在室温下搅拌30分钟。将反应使用饱和氯化铵水溶液(25 ml)淬灭，并使用DCM(3×25 ml)萃取。将有机萃取物合并，用硫酸镁干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(20-100％EtOAc/庚烷)和通过制备型HPLC(酸性方法)纯化粗产物，得到6 mg (18%)的(1S,4R,6S,7R)-7-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基丙-2-烯酸酯EV-AY5034-002，为白色粉末。LCMS (方法D): 保留时间 1.25min, M/z = 641(M + 1)。

实施例16. N-[(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]丙-2-烯酰胺, I-14的合成

N-[(1S,4R,6S,7R)-7-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-6-基]丙-2-烯酰胺I-14 (EV-AY4929-001) (EOAI3470263)(LCMS (方法A): 保留时间 2.07 min, M/z =540.3 (M+1))是根据方案1中所述的程序经由如方案1.10步骤12-14中所述合成N-[(1R,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AW8586-002来合成的。

方案1.10步骤12

N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AW8584-001 -步骤12

在氮气氛下，在0℃下，将DIAD(107 µl, 0.51 mmol)加入到三苯基膦(134 mg,0.51 mmol)于无水THF(5 ml)中的搅拌溶液中。将反应在0℃下搅拌5分钟，然后加入N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-羟基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯(EV-AY5029-001, 200 mg, 0.34 mmol)于无水THF(5 ml)中的溶液，然后加入1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮(41 µl, 0.34 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时，真空浓缩并通过快速柱色谱(0-100％EtOAc/庚烷)纯化，得到138 mg (48%)的N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 EV-AW8584-001，为白色泡沫状物。LCMS (方法D): 保留时间 1.28min, M/z = 716(M + 1)。

方案1.10步骤13

N-[(1R,4R,6S,7R)-6-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AW8585-005 -步骤13

向N-[(1S,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AW8584-001, 134 mg, 0.19 mmol)于DCM (3 ml)中的溶液中加入水合肼(1:1) (27 µl, 0.56 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌45分钟并在50℃下搅拌18小时，过滤并将滤液真空浓缩。将EtOAc(10 ml)加入到残余物中，将混合物搅拌5分钟，然后过滤。将滤液真空浓缩，并通过快速柱色谱(20-100％EtOAc/庚烷)纯化，得到75 mg (63%)的N-[(1R,4R,6S,7R)-6-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AW8585-005，为白色泡沫状物。LCMS (方法D): 保留时间 1.05min, M/z = 586 (M + 1)。

方案1.10步骤14

N-[(1R,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AW8586-002 -步骤14

向N-[(1R,4R,6S,7R)-6-氨基-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯 (EV-AW8585-005, 92%, 75 mg, 0.12 mmol)于二氧杂环己烷(2 ml)中的溶液中加入三乙胺 (18 µl, 0.13 mmol)，接着加入丙-2-烯酰氯(10 µl, 0.13 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，真空浓缩，得到的残余物通过制备型HPLC(酸性方法)纯化，得到44 mg (59%)的N-[(1R,4R,6S,7R)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-7-甲氧基-1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-羰基}-6-(丙-2-烯酰胺基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-7-基]氨基甲酸叔丁酯EV-AW8586-002，为白色固体。LCMS (方法A): 保留时间3.13min, M/z = 640 (M + 1)。

生物测定

实施例17. PAD4 RapidFire质谱(RFMS)活性测定

使用下文所描述的测定方案来测定作为PAD4抑制剂的本发明的化合物。

将化合物溶解于100% DMSO中以实现100 mM最终化合物浓度。将化合物储备溶液储存在室温下。在DMSO中制备一系列稀释液并以20 μL混合体积混合8次。最终测定条件如下：

反应体积: 20 µl

测定缓冲液 (如上所述): 100 mM Tris-HCl (pH 7.6), 2 mM DTT, 1 mM CaCl₂

最终浓度：

-100 nM hPAD4酶

-50 µM (8倍sub-K_m)底物肽

-0.5% DMSO

总孵育时间: 37℃，65分钟

终止溶液: 40 µl 5% TCA/ACN。

将0.25 µL化合物溶液加入至10 µL 200 nM PAD4/测定缓冲液(100 mM Tris-HClpH 7.6, 2 mM DTT)中。在5 min之后，加入10 µL 100 µM底物/缓冲液(100 mM Tris-HClpH 7.6, 2 mM DTT, 2 mM CaCl₂)并将反应在37℃下孵育60 min。通过加入40 µl 5% TCA/ACN (1.7% TCA最终浓度)终止溶液来淬灭酶促反应。将含精氨酸的底物和含瓜氨酸的产物(+1 Da质量位移)在Agilent RapidFire (RF) 300系统上进行固相萃取并在用于定量的耦合的三重四极杆Agilent 6460 QQQ质谱(MS)装置上在应用多反应监测(MRM)下检测。

下表2显示本发明的所选化合物在上述PAD4测定中的活性。化合物编号对应于表1中的化合物编号。具有指定为“A”的活性的化合物提供0.1-1 μM的IC₅₀；具有指定为“B”的活性的化合物提供1-5 μM的IC₅₀；具有指定为“C”的活性的化合物提供5-10 μM的IC₅₀；且具有指定为“D”的活性的化合物提供> 10 μM的IC₅₀。术语pIC₅₀ = -log(IC₅₀)。具有指定为“E”的活性的化合物提供1-4的pIC₅₀；具有指定为“F”的活性的化合物提供4-5的pIC₅₀；具有指定为“G”的活性的化合物提供>5的pIC₅₀。“NA”代表“未测定”。

实施例18. 使用MS (质谱)的共价修饰研究

使用质谱分析所选择的抑制剂对蛋白质的共价修饰。重组人PAD4以4 mg/ml用于20 mM Tris pH7.6、400 mM NaCl、5 mM TCEP中。在适用的情况下，缓冲液补充有5mM CaCl₂以确定钙的修饰敏感性。将抑制剂以0.2mM至5mM的终浓度溶解在DMSO中，并在分析前与蛋白质在27℃孵育16小时。在不存在抑制剂的情况下用蛋白质和DMSO进行对照实验。在临用Waters LCT-Premier TOF质谱仪使用5％至80％乙腈/水(补充有0.1％甲酸)的流动相分析之前，在室温下以10000rpm离心样品15秒。

实施例19. 失活动力学

活性化合物与靶标酶的共价结合导致酶活性的时间依赖性损失。失活速率取决于抑制剂浓度([I])并且可以在准一级条件([I]>>[hPAD4])下定量。

在384孔聚苯乙烯板中在37℃下进行失活动力学实验。将化合物(10-200 μM)和hPAD4(4 μM)溶液在含有10 mM CaCl₂和2 mM DTT的测定缓冲液(100 mM Tris-HCl, pH7.6)中预孵育10分钟以达到37℃的温度。在0至70分钟的不同时间点混合等体积(10 μl)的化合物和hPAD4溶液。在70分钟时间点，将失活溶液在含有166.7 μM肽底物(H-TSTGGRQGSHH-CONH₂)、1.1 mM CaCl₂和2 mM DTT的酶促反应缓冲液(100 mM Tris-HCl, pH7.6)中稀释10倍。在37℃孵育30分钟后，通过在ACN中的5％TCA溶液中3倍稀释来淬灭酶促反应。通过固相萃取质谱(SPE-MS)确定底物肽精氨酸瓜氨酸化。配备有HILIC(HI)筒的Agilent RapidFire 300用于取样，对于P1溶剂为含0.1％TFA的H₂O/ACN (20/80)，对于P2和P3溶剂为含0.1％TFA的H₂O/ACN (50/50)。在正离子模式下，使用耦合的Agilent 6460QQQ和多反应监测(MRM)分别针对转换562.3/969.4和562.8/541来检测底物和产物肽。失活反应的DMSO含量为1％。Cl-脒(100 mM，酶失活反应期间的最终浓度)和1％DMSO分别用作失活反应的阳性和阴性对照。

通过用公式

=

拟合残余hPAD4活性的时间依赖性损失A_res，确定失活反应的准一级速率常数k_obs。准一级速率常数相对于抑制剂的摩尔浓度的绘图允许确定动力学反应常数：k_inact - 无限[I]时的最大失活速率; K_I - 抑制剂浓度，在该浓度失活速率等于1/2k_inact; k_inact/K_I。

根据上述程序测定本发明的某些化合物，发现它们共价修饰PAD4。

下表3显示了本发明所选化合物在上述共价修饰测定中的活性。化合物编号对应于表1中的化合物编号。

表2.PAD4活性

表3.共价修饰研究: 失活动力学*

*hPAD4同种型; Ca⁺⁺ 浓度 = 10 mM。

Claims (17)

1.式I的化合物

或其药学上可接受的盐，其中：

G是

各R⁴独立地选自

R¹是氢或C_1-6脂族基团；

R²是氢或C_1-10脂族基团；

X选自N或CH；

R³是-R或-OR；且

各R独立地是氢或任选被1-3个氟原子取代的C_1-6脂族基团。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中G是

。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中G是

。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中G选自

。

5.根据权利要求1至4任一项所述的化合物，其中R¹是甲基。

6.根据权利要求1至4任一项所述的化合物，其中R²是C_1-10脂族基团。

7.根据权利要求6所述的化合物，其中R²是-CH₂-环丙基。

8.根据权利要求1至4任一项所述的化合物，其中X是N。

9.根据权利要求1至4任一项所述的化合物，其中X是CH。

10.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：

。

11.药学上可接受的组合物，其包含根据权利要求1至10任一项所述的化合物和药学上可接受的载体、助剂或媒介物。

12.根据权利要求11所述的组合物，其与额外的治疗剂组合。

13.根据权利要求1至10任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求11或12所述的组合物在制备药物中的用途。

14.根据权利要求1至10任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求11或12所述的组合物在制备治疗有此需要的个体中的PAD4-介导的疾病、病症或病况的药物中的用途，其中所述PAD4-介导的疾病、病症或病况选自痤疮、急性呼吸窘迫综合征、阿狄森氏病、肾上腺增生、肾上腺皮质功能不全、老化、AIDS、酒精性肝病、曲菌病、过敏性结膜炎、脱发、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌肉萎缩性侧索硬化和重量损失、血管性水肿、无汗外胚层发育不全-ID、前段炎症、抗磷脂综合征、口疮口炎、阑尾炎、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫疾病、贝切特氏病、贝尔氏麻痹症、铍中毒、布劳综合征、细支气管炎、烧伤、粘液囊炎、癌症、心脏肥大、腕隧道综合征、分解代谢病症、白内障、脉络膜视网膜炎、慢性心脏衰竭、结肠炎、结缔组织疾病、角膜溃疡、隐热蛋白相关的周期性综合征、隐球菌病、囊性纤维化、白介素-1-受体拮抗剂的缺陷、皮炎、皮炎内毒素血症、皮肌炎、弥漫型内因性脑桥神经胶质瘤、子宫内膜异位症、内毒素血症、上髁炎、成红细胞减少症、家族性淀粉样多发性神经病变、家族性冷性荨麻疹、家族性地中海热、胎儿生长迟滞、青光眼、痛风、移植物抗宿主病、肠病、头部损伤、听力损失、心脏病、亨舍二氏紫癜、肝炎、遗传性周期性发热综合征、带状疱疹和单纯疱疹、HIV-1、霍奇金氏病、亨廷顿氏病、透明膜病、高氨血症、高钙血症、高胆固醇血症、高免疫球蛋白血症D伴随反复发热、发育不全和其它贫血、特发性血小板减少性紫癜、色素失调症、感染性单核细胞增多症、炎性神经病变、虹膜炎、缺血/再灌注、角膜炎、肾病、钩端螺旋体病、吕弗勒氏综合征、肺损伤、脑膜炎、间皮瘤、混合结缔组织疾病、Muckle-Wells综合征、多发性硬化、肌肉萎缩、肌肉营养不良症、重症肌无力、心肌炎、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、肌炎、鼻窦炎、新生儿发作多系统炎性疾病、神经炎、神经病理学疾病、肥胖症、眼睛过敏、视神经炎、器官移植、中耳炎、佩吉特氏病、疼痛、胰腺炎、帕金森氏病、天疱疮、心包炎、周期性发热、牙周炎、腹膜的子宫内膜异位症、百日咳、咽炎和腺炎、肺炎、肺囊虫感染、结节性多动脉炎、多软骨炎、多肌炎、牛皮癣、心理社会应激疾病、肺病、肺高血压、肺纤维化、坏疽性脓皮病、视网膜疾病、风湿性心脏炎、风湿性疾病、肉状瘤病、皮脂溢、败血症、镰状细胞、二氧化硅诱发的疾病、Sjogren氏综合征、皮肤病、睡眠呼吸暂停、实体瘤、骨髓损伤、Stevens-Johnson综合征、中风、蛛网膜下出血、晒伤、颞动脉炎、腱鞘炎、血小板减少症、甲状腺炎、组织移植、TNF受体相关的周期性综合征、弓形体病、移植、创伤性脑损伤、肺结核、1型糖尿病、2型糖尿病、荨麻疹、葡萄膜炎和韦格纳氏肉芽肿。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述PAD4-介导的疾病、病症或病况选自过敏支气管肺、早产儿的慢性肺病、慢性阻塞性肺病、炎性肺病、昆虫咬伤诱发的炎症、刺激物诱发的炎症、心绞痛、骨疼痛、复杂性区域疼痛综合征、头痛、炎性疼痛、严重疼痛、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、过敏原诱发的哮喘、非过敏原诱发的哮喘、坏死性小肠结肠炎、溃疡性结肠炎、特应性皮炎、炎性肠病、溶血性贫血、发育不全性贫血、镰状细胞贫血、由寄生虫感染引起的肾损伤、肾移植排斥预防、狼疮性肾炎、肾病综合征、多囊性肾病、肾小球疾病、肾小球肾炎、狼疮、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、酸诱发的肺损伤、痛风性关节炎、幼年性类风湿性关节炎、骨关节炎、化脓性无菌关节炎、淋巴瘤、白血病和脑动脉瘤。

16.根据权利要求14所述的用途，其中所述PAD4-介导的疾病、病症或病况选自急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、蜂螫伤诱发的炎症和毒葛/漆酚油诱发的炎症。

17.根据权利要求14所述的用途，其中所述PAD4-介导的疾病、病症或病况选自类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮和牛皮癣。