DE69931929T2

DE69931929T2 - Peptidantagonisten von zonulin und methoden zu deren verwendung

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Publication number: DE69931929T2
Application number: DE69931929T
Authority: DE
Inventors: Alessio West Friendship FASANO
Original assignee: University of Maryland at Baltimore
Current assignee: University of Maryland at Baltimore
Priority date: 1998-08-03
Filing date: 1999-07-28
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2019-07-29
Also published as: ZA200100829B; CN1679915A; CN100348266C; DE69931929D1; US20080051349A1; US20110183923A1; EP1698345A2; NZ509579A; WO2000007609A1; US6458925B1; ATE480252T1; EP1102596B1; US20060276399A1; DE69942753D1; US20140128328A1; US20040082512A1; CA2338005C; HK1082210A1; US20020115825A1; CN1313772A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidantagonisten von Zonulin sowie Verfahren für deren Verwendung. Die Peptidantagonisten binden an einen Zonula occludens-Rezeptor, modulieren aber das Öffnen von tight junctions bei einem Säuger physiologisch nicht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
I. Funktion und Regulation intestinaler tight junctions
Die tight junctions („tj") oder die Zonula occludens (nachfolgend "ZO") sind eines der Kennzeichen absorptiver und sekretorischer Epithelien (Madara, J. Clin. Invest., 83:1089-1094 (1989); und Madara, Textbook of Secretory Diarrhea, Hrsg. Lebenthal et al, Kapitel 11, Seiten 125–138 (1990). Als Barriere zwischen apikalen und basolateralen Kompartimenten regulieren sie selektiv die passive Diffusion von Ionen und wasserlöslichen gelösten Stoffen über den parazellulären Weg (Gumbiner, Am. J. Physiol., 253 (Cell Physiol. 22):C749-C758 (1987)). Über diese Barriere wird jeder Gradient aufrecht erhalten, der durch die Aktivität von Wegen erzeugt wurde, die mit der transzellulären Route in Zusammenhang stehen (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)).
Variationen bei der transepithelialen Leitfähigkeit können normalerweise auf Veränderungen bei der Permeabilität des parazellulären Wegs zurückgeführt werden, da die Widerstände der Plasmamembranen von Enterocyten relativ hoch sind (Madara, supra). Die ZO stellt die Hauptbarriere in diesem parazellulären Weg dar, und der elektrische Widerstand von Epithelgeweben scheint von der Anzahl von Transmembran-Proteinsträngen, und von deren Komplexität in der ZO abzuhängen, wie durch Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie beobachtet wurde (Madara et al, J. Cell Biol., 101:2124-2133 (1985)).
Es gibt vielfältige Beweise dafür, dass die ZO, die einst für eine statische Struktur gehalten wurde, in Wirklichkeit dynamisch ist und sich leicht an eine Vielzahl entwicklungsbedingter (Magnuson et al, Dev. Biol., 67:214-224 (1978); Revel et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 40:443-455 (1976); und Schneeberger et al, J. Cell Sci., 32:307-324 (1978)), physiologischer (Gilula et al, Dev. Biol., 50:142-168 (1976); Madara et al, J. Membr. Biol., 100:149-164 ((1984); Mazariegos et al, J. Cell Biol., 98:1865-1877 (1984); und Sardet et al, J. Cell Biol., 80:96-117 (1979)), und pathologischer (Milks et al, J. Cell Biol., 103:2729-2738 (1986); Nash et al, Lab. Invest., 59:531-537 (1988); und Shasby et al, Am. J. Physiol., 255 (Cell Physiol., 24):C781-C788 (1988) Gegebenheiten anpasst. Die regulatorischen Mechanismen, die dieser Anpassung zugrunde liegen, werden noch nicht vollständig verstanden. Es ist jedoch klar, dass in Gegenwart von Ca²+ der Zusammenbau der ZO das Ergebnis zellulärer Interaktionen ist, die eine komplexe Kaskade biochemischer Ereignisse auslösen, welche schließlich zur Bildung und Modulierung eines organisierten Netzwerkes von ZO-Elementen führen, deren Zusammensetzung bisher nur zum Teil charakterisiert wurde (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)). Ein Kandidat für die Transmembran-Stränge, Occludin, wurde vor kurzem identifiziert (Furuse et al, J. Membr. Biol., 87:141-150 (1985)).
Bisher wurden sechs Proteine in einem cytoplasmatischen, unter der Membran liegenden Plaque identifiziert, der unter Membrankontakten liegt, aber ihre Funktion muss noch bestimmt werden (Diamond, supra). ZO-1 und ZO-2 liegen als Heterodimer (Gumbiner et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3460-3464 (1991)) in einem Detergens-stabilen Komplex mit einem nicht charakterisierten 130 kD-Protein (ZO-3) vor. Die meisten immunelektronenmikroskopischen Untersuchungen lokalisierten ZO-1 genau unter den Membrankontakten (Stevenson et al, Molec. Cell Biochem., 83:129-145 (1988)). Zwei weitere Proteine, Cingulin (Citi et al, Nature (London), 333:272-275 (1988)) und das 7H6-Antigen (Zhong et al, J. Cell Biol., 120:477-483 (1993)) sind weiter entfernt von der Membran und wurden bisher noch nicht kloniert. Rab 13, ein kleines GTP bindendes Protein, wurde vor kurzem ebenfalls als an der junction-Region befindlich lokalisiert (Zahraoui et al, J. Cell Biol., 124:101-115 (1994)). Es ist bekannt, das weitere kleine GTP bindende Protein das cortikale Zytoskelett regulieren, d.h., rho reguliert die Aktin-Membran-Anheftung in fokalen Kontakten (Ridley et al, Cell, 70:389-399 (1992), und rac reguliert die durch Wachstumsfaktor induzierte Membranauffaltung (Ridley et al, Cell, 70:401-410 (1992)). Auf der Grundlage der Analogie mit den bekannten Funktionen von Plaque-Proteinen in den besser charakterisierten Zelljunctions, fokalen Kontakten (Guan et al, Nature, 358:690-692 (1992)), und Adhärenzjunctions (Tsukita et al, J. Cell Biol., 123:1049-1053 (1993)) wurde die Hypothese formuliert, dass tj-assoziierte Plaque-Proteine an der Signalübertragung in beiden Richtungen über die Zellmembran, und an der Regulierung von Verknüpfungen mit dem cortikalen Aktin-Zytoskelett beteiligt sind.
Um dem vielen unterschiedlichen physiologischen und pathologischen Herausforderungen gerecht zu werden, denen Epithelien ausgesetzt sind, muss die ZO zu schnellen und koordinierten Antworten in der Lage sein, die das Vorhandensein eines komplexen regulatorischen Systems erfordern. Die genaue Charakterisierung der Mechanismen, die am Zusammenbau und der Regulation der ZO beteiligt sind, ist ein Gebiet gegenwärtiger aktiver Untersuchungen.
Es gibt mittlerweile eine Vielzahl von Beweisen, dass strukturelle und funktionale tj-Verknüpfungen zwischen dem Aktin-Zytoskelett und dem tj-Komplex absorptiver Zellen existieren (Gumbiner et al, supra; Madara et al, supra; und Drenchahn et al, J. Cell Biol., 107:1037-1048 (1988)). Das Aktin-Zytoskelett besteht aus einem komplizierten Netzwerk von Mikrofilamenten, deren genaue Geometrie von einem großen Kader Aktin bindender Proteine reguliert wird. Ein Beispiel dafür, wie der Phosphorylierungszustand eines Aktin bindenden Proteins die Zytoskelett-Verknüpfung mit der Zellplasmamembran regulieren könnte, ist das myristoylierte Alanin-reiche C-Kinase-Substrat (nachfolgend „MARCKS"). MARCKS ist ein spezifisches Substrat für Proteinkinase C (nachfolgend „PKC"), das mit der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran assoziiert ist (Aderem, Elesevier Sci. Pub. (UK), Seiten 438–443 (1992)). In seiner nicht phosphorylierten Form ist MARCKS mit dem Aktin der Membran vernetzt. Es ist somit wahrscheinlich, dass das über MARCKS mit der Membran assoziierte Aktin-Netzwerk relativ starr ist (Hartwig et al, Nature, 356:618-622 (1992)). Aktivierte PKC phosphoryliert MARCKS, welches von der Membran freigesetzt wird (Rosen et al, J. Exp. Med., 172:1211-1215 (1990)); und Thelen et al, Nature, 351:320-322 (1991)). Das mit MARCKS verknüpfte Aktin wird wahrscheinlich von der Membran räumlich getrennt und plastischer. Wenn MARCKS dephosphoryliert ist, kehrt es zur Membran zurück, wo es erneut mit Aktin vernetzt wird (Hartwig et al, supra; und Thelen et al, supra). Diese Daten legen nahe, dass das F-Aktin-Netzwerk über einen PKC-abhängigen Phosphorylierungsprozess umarrangiert werden kann, der Aktin bindende Proteine umfasst (wobei MARCKS eines davon ist).
Für eine Vielzahl von intrazellulären Mediatoren wurde gezeigt, dass sie die Funktion und/oder Struktur von tj verändern. Tight junctions der Gallenblase von Amphibien (Duffey et al, Nature, 204:451-452 (1981)) und des Intestinums sowohl des Goldfisches (Bakker et al, Am. J.. Physiol., 246:G213-G217 (1984)) als auch der Flunder (Krasney et al, Fed. Proc., 42:1100 (1983)) zeigen bei erhöhtem intrazellulärem cAMP einen erhöhten Widerstand gegenüber passivem Ionenfluss. Weiterhin scheint die Exposition einer Amphibien-Gallenblase gegenüber einem Ca²⁺-Ionophor den tj-Widerstand zu erhöhen und Veränderungen der tj-Struktur zu induzieren (Palant et al, Am. J. Physiol., 245:C203-C212 (1983)). Darüber hinaus erhöht die Aktivierung von PKC durch Phorbolester die parazelluläre Permeabilität sowohl in Nieren-Epithelzelllinien (Ellis et al, C. Am. J. Physiol., 263 (Renal Fluid Electrolyte Physiol. 32):F293-F300 (1992)) als auch in Intestinum-Epithelzelllinien (Stenson et al., C. Am. J. Physiol., 265 (Gastrointest. Liver Physiol., 28):G955-G962 (1993)).
II. Die Blut-Hirn-Schranke
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine extrem dünne membranartige Barriere, die der freien Diffusion gelöster Stoffe einen hohen Widerstand entgegensetzt, und das Blut und das Gehirn voneinander trennt. In molekularen Dimensionen ist die Wanderung von Wirkstoffen oder gelösten Stoffen durch diese Membran im Wesentlichen gleich Null, sofern die Verbindung nicht Zugang zu einem der mehreren spezialisierten enzymartigen Transportmechanismen hat, die in der BBB-Membran eingebettet sind. Statt aus einer einzelnen Schicht aus Epithelzellen besteht die BBB vielmehr aus mehreren Zellen. Von den vier verschiedenen Zellarten, aus denen die BBB besteht (Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten und Neuronen), stellt der Endothelzellen-Bestandteil der Kapillaren den limitierenden Faktor für die Permeabilität der BBB dar. Das Kapillarendothel im Gehirn und Rückenmark von Vertebraten ist mit tj ausgestattet, welche die interendothelialen Poren schließen, die normalerweise in den mikrovaskulären endothelialen Barrieren in peripheren Geweben vorliegen. Letztendlich sind endotheliale tj für die begrenzte Permeabilität der BBB verantwortlich.
III. Zonula occludens-Toxin
Die meisten Vibrio cholerae-Vakzin-Kandidaten, die durch Deletion des für das Cholera-Toxin (CT) kodierenden ctxA-Gens konstruiert wurden, sind in der Lage, starke Antikörperantworten auszulösen, aber bei mehr als die Hälfte der geimpften Personen tritt noch leichter Durchfall auf (Levine et al, Infect. Immun., 56(1):161-167 (1988)). Angesichts der Stärke des bei Fehlen von CT induzierten Durchfalls wurde die Hypothese aufgestellt, dass V. cholerae weitere enterotoxigene Faktoren produziert, die in Stämmen, bei denen die ctxA-Sequenz deletiert ist, noch vorhanden sind (Levine et al., supra). Als Ergebnis davon wurde ein zweites Toxin, Zonula occludens-Toxin (nachfolgend „ZOT") entdeckt, dass von V. cholerae produziert wird und zu dem verbleibenden Durchfall beiträgt (Fasano et al, Proc. Natl, Acad. Sci., USA, 8:5242-5246 (1991)). Das zot-Gen befindet sich unmittelbar benachbart zu den ctx-Genen. Der hohe Prozentsatz des gemeinsamen Vorkommens des zot-Gens zusammen mit den ctx-Genen bei V. cholerae-Stämmen (Johnson et al, J. Clin. Microb., 31/3:732-733 (1993); und Karasawa et al, FEBS Microbiology Letters, 106:143-146 (1993)) legt eine mögliche synergistische Rolle von ZOT beim Auslösen akuten dehydrierenden Durchfalls nahe, der für Cholera typisch ist. Vor kurzem wurde das zot-Gen auch bei anderen Darmpathogenen identifiziert (Tschape, 2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and other Salomellosis, 47 (Zusammenf.) (1994)).
Man hatte zuvor herausgefunden, dass ZOT bei Testen auf Kaninchen-Ileum-Mucosa die intestinale Permeabilität durch Modulieren der Struktur der interzellulären tj steigert (Fasano et al, supra). Weiterhin fand man heraus, dass als Ergebnis einer Modifizierung des parazellulären Wegs die intestinale Mucosa durchlässiger wird. Man fand weiterhin heraus, dass ZOT den Na⁺-Glucose-gekoppelten aktiven Transport nicht beeinflusst, nicht zytotoxisch ist, und nicht in der Lage ist, den transepithelialen Widerstand vollständig zu beseitigen (Fasano et al, supra).
In noch jüngerer Zeit fand man heraus, dass ZOT in der Lage ist, die tj in der intestinalen Mucosa reversibel zu öffnen, und ZOT somit bei Verbabreichung zusammen mit einem therapeutischen Agens den intestinalen Transport des therapeutischen Agens zu bewirken vermag, wenn es in einer oralen Dosierungszusammensetzung für intestinalen Wirkstofftransport verwendet wird (WO 96/37196; US-Patentanmeldung Nr. 08/443,864, am 24. Mai 1995 eingereicht; und US-Patent 5,665,389; und Fasano et al, J. Clin. Invest., 99:1158-1164 (1997). Man fand weiterhin heraus, dass ZOT in der Lage ist, tj in der Nasalmucosa reversibel zu öffnen, und ZOT somit bei Verabreichung zusammen mit einem therapeutischen Agens die nasale Absorption eines therapeutischen Agens zu erhöhen vermag (US-Patentanmeldung Nr. 08/781,057, eingereicht am 9. Januar 1997).
In der US-Patentanmeldung Nr. 08/803,364, eingereicht am 20 Februar 1997, wurde ein ZOT-Rezeptor identifiziert und aus einer intestinalen Zelllinie, d.h. CaCo2-Zellen, isoliert. Weiterhin wurden in der am 17 Februar 1998 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 09/024,198 ZOT-Rezeptoren aus menschlichem intestinalem, Herz- und Gehirngewebe identifiziert und aufgereinigt. Die ZOT-Rezeptoren stellen den ersten Schritt des parazellulären Wegs dar, der an der Regulation der intestinalen und nasalen Permeabilität beteiligt ist.
IV. Zonulin
In der anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 098/859,931, die am 21. Mai 1997 eingereicht wurde, wurden Säugerproteine identifiziert und aufgereinigt, die immunologisch und funktional mit ZOT verwandt sind, und die als der physiologische Modulator der tight junctions von Säugern fungieren. Diese Säugerproteine, die als „Zonulin" bezeichnet werden, sind brauchbar zur Erhöhung der Absorption therapeutischer Agentien über die tj intestinaler und nasaler Mucosa, wie auch über die tj der Blut-Hirn-Schranke.
In der vorliegenden Erfindung wurden zum ersten Mal Peptidantagonisten von Zonulin identifiziert. Die Peptidantagonisten binden an den ZOT-Rezeptor, wirken jedoch nicht so, dass sie das Öffnen vom tight junctions bei einem Säuger physiologisch modulieren. Die Peptidantagonisten inhibieren kompetitiv die Bindung von ZOT und Zonulin an den ZOT-Rezeptor, wodurch sie die Fähigkeit von ZOT und Zonulin inhibieren, das Öffnen von tight junctions bei Säugern physiologisch zu modulieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Identifizierung von Peptidantagonisten von Zonulin.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Synthese und Aufreinigung der Peptidantagonisten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung der Peptidantagonisten als anti-inflammatorische Agentien bei der Behandlung von gastrointestinaler Entzündung.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung der Peptidantagonisten bei der Inhibierung des Zusammenbruchs der Blut-Him-Schranke.
Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, die aus der nachfolgend gegebenen, ausführlichen Beschreibung der Erfindung ersichtlich werden, wurden in einer Ausführungsform gelöst durch einen Peptidantagonisten von Zonulin, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 und SEQ ID NO: 23, wobei der Peptidantagonist an einen ZOT-Rezeptor bindet, aber nicht das Öffnen von tight junctions bei einem Säuger physiologisch moduliert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Wirkung von Zonulin, das aus Kaninchen-Intestinum aufgereinigt wurde (∎) auf den Gewebe-Widerstand (Rt) von CaCo2-Zell-Monolayern im Vergleich mit verschiedenen Negativkontrollen (Fraktion 2
Fraktion 3 (•); Fraktion 4
und Fraktion 5 (☐) einer Q-Sepharose-Säule).
2 zeigt die Wirkung von Zonulin, das aus Kaninchen-Intestinum aufgereinigt wurde (∎), auf den Gewebe-Widerstand (Rt) eines auf Ussing-Kammern aufgetragenen Kaninchen-Ileums im Vergleich mit der Negativkontrolle (☐).
3 zeigt die Wirkung von Zonulin, das aus Kaninchen-Intestinum aufgereinigt wurde (∎), auf den Gewebe-Widerstand (Rt) eines auf Ussing-Kammern aufgetragenen Kaninchen-Ileums im Vergleich mit den Negativkontrollen (Zonulin + anti-ZOT-Antikörper (☐); Zonulin + anti-Tau-Antikörper (Δ); und Tau
Die 4A und 4B zeigen die Wirkung von Zonulin, das entweder aus menschlichem Gehirn
menschlichem Intestinum (•) oder menschlichem Herz (o) aufgereinigt wurde, auf den Gewebe-Widerstand (Rt) von auf Ussing-Kammern aufgetragenem Rhesusaffen-Jejunum (4A) und Rhesusaffen-Ileum (4B) im Vergleich zur Negativkontrolle (☐).
Die 5A und 5B zeigen die Wirkung von Zonulin, das entweder aus menschlichem Herz
oder menschlichem Gehirn (☐) aufgereinigt wurde, auf den Gewebe-Widerstand (Rt) von auf Ussing-Kammern aufgetragenem Kaninchen-Jejunum (5A) und Kaninchen-Ileum (5B) im Vergleich zur Negativkontrolle (∎).
Die 6 zeigt einen Vergleich der N-terminalen Sequenz von Zonulin, das aus Kaninchen- und verschiedenen menschlichen Geweben aufgereinigt wurde.
7 zeigt einen Vergleich der N-terminalen Sequenzen von Zonulin, das aus verschiedenen menschlichen Geweben aufgereinigt wurde, und der schweren Kette von IgM mit der N-terminalen Sequenz des biologisch aktiven Fragments (Aminosäuren 288-399) von ZOT.
8 zeigt die Wirkung von ZOT, Zonulin_i, Zonulin_h, entweder alleine (geschlossene Balken), oder in Kombination mit dem Peptidantagonisten FZI/0 (offene Balken), oder in Kombination mit FZI/1 (schraffierte Balken), im Vergleich mit der Negativkontrolle, auf den Gewebe-Widerstand (Rt) von auf Ussing-Kammern aufgetragenem Kaninchen-Ileum. N entspricht 3-5; und * entspricht p < 0,01.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben besprochen wurde die oben beschriebene Aufgabe der Erfindung in einer Ausführungsform durch einen Peptidantagonisten von Zonulin gelöst, der aus einer Aminosäuresequenz besteht, ausgewählt unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 und SEQ ID NO: 24, wobei der Peptidantagonist an einen ZOT-Rezeptor bindet, aber nicht das Öffnen von tight junctions bei einem Säuger physiologisch moduliert.
Die Größe des Peptidantagonisten beträgt 8 Aminosäuren.
Die Peptidantagonisten können unter Verwendung allgemein bekannter Techniken, wie sie beispielsweise in High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins: Separation Analysis and Conformation, Hrsg. Mant et al, C.R.C. Press (1991), beschrieben sind, und eines Peptidsynthesizers, wie beispielsweise dem Symphony (Protein Technologies, Inc.), chemisch synthetisiert und aufgereinigt werden; oder unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, d.h. wobei die für das Peptid kodierende Nukleotidsequenz in einen geeigneten Expressionsvektor, z.B. einen E. coli- oder Hefeexpressionsvektor insertiert, in der jeweiligen Wirtszelle exprimiert wird und daraus unter Verwendung allgemein bekannter Techniken eine Aufreinigung erfolgt.
Die Peptidantagonisten können verwendet werden als anti-inflammatorische Agenzien für die Behandlung von gastrointestinaler Entzündung, die zu erhöhter intestinaler Permeabilität führt. Die erfindungsgemäßen Peptidantagonisten sind somit beispielsweise brauchbar bei der Behandlung von intestinalen Zuständen, die Enteropathie mit Proteinverlust bewirken. Eine Enteropathie mit Proteinverlust kann auftreten aufgrund von:
Infektion, z.B. C. difficile-Infektion, Enterocolitis, Shigellose, viraler Gastroenteritis, Parasiteninfestation, bakterieller Überwucherung, Whipple Krankheit;
Krankheiten mit Erosion oder Ulceration der Mucosa, z.B. Gastritis, Magenkrebs, kollagenöser Colitis, inflammatorischer Darmerkrankung;
durch lymphatische Obstruktion gekennzeichneter Krankheiten, z.B. kongenitaler intestinaler Lymphangiectasie, Sarkoidose Lymphom, mesenterischer Tuberkulose, postoperativer Korrektur kongenitaler Herzerkrankung mit Fontan'scher Operation;
Erkrankungen der Mucosa ohne Ulceration, z.B. Menetrier-Krankheit, Zöliakie, eosinophiler Gastroenteritis; und
Immunerkrankungen, z.B. systemischem Lupus erythematosus oder Lebensmittelallergien, vorwiegend Milchallergie (siehe auch Tabelle 40-2 in Pediatric Gastrointestinal Disease Pathophysiology Diagnosis Management, Hrsg. Wyllie et al, Saunder Co. (1993), Seiten 536-543).
Dementsprechend betrifft eine weitere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Behandlung gastrointestinaler Entzündung, welches die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Peptidantagonisten von Zonulin an ein Individuum umfasst, welches einer solchen Behandlung bedarf, wobei der Peptidantagonist aus einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt ist unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 und SEQ ID NO:24, wobei der Peptidantagonist an den ZOT-Rezeptor im Intestinum des Individuums bindet, aber nicht das Öffnen von tight junctions in dem Intestinum physiologisch moduliert.
Für diesen Zweck können die Peptidantagonisten als orale Dosierungszusammensetzungen für den Transport in den Dünndarm verabreicht werden. Solche oralen Dosierungszusammensetzungen für den Transport in den Dünndarm sind dem Fachmann allgemein bekannt, und umfassen im Allgemeinen gastroresistente Tabletten oder Kapseln (Remington's Phamaceutical Sciences, 16. Aufl., Hrsg. Osol, Mack Publishing Co., Kapitel 89 (1980); Digenis et al, J. Pharm. Sci., 83:915-921 (1994); Vantini et al, Clinica Terapeutica, 145:445-451 (1993); Yoshitomi et al, Chem. Pharm. Bull., 40:1902-1905 (1992); Thoma et al, Pharmazie, 46:331-336 (1991); Morishita et al, Drug Design and Delivery, 7:309-319 (1991); und Lin et al, Pharmaceutical Res., 8:919-924 (1991)).
Tabletten werden durch Zugabe von z.B. entweder Celluloseacetatphthalat oder Celluloseacetatterephthalat gastroresistent gemacht.
Kapseln sind feste Dosierungsformen, bei denen der Peptidantagonist (die Peptidantagonisten) in entweder einem harten oder einer weichen Behältnis oder einer harten oder weichen Schale aus Gelatine eingeschlossen ist (sind). Die für die Herstellung von Kapseln verwendete Gelatine wird aus kollagenösem Material durch Hydrolyse gewonnen. Es gibt zwei Arten von Gelatine, Typ A, der durch Säurebehandlung aus Schweinehäuten gewonnen wird, und Typ B, der durch alkalische Behandlung aus Knochen und Tierhäuten gewonnen wird. Die Verwendung von Hartgelatinekapseln ermöglicht die Wahl, einen einzigen Peptidantagonisten oder eine Kombination davon in genau dem Dosierungsgrad zu verschreiben, der für das jeweilige Individuum für optimal gehalten wird. Die Hartgelantinekapsel besteht aus zwei Abschnitten, von denen einer sich über den anderen schiebt, wodurch der Peptidantagonist vollständig umhüllt wird. Diese Kapseln werden befüllt, indem der Peptidantagonist, oder den Peptidantagonisten enthaltende gastroresistente Kügelchen, in das längere Ende der Kapsel eingeführt werden und anschließend die Kappe aufgesteckt wird. Hartgelantinekapseln bestehen weitgehend aus Gelatine, FD&C-Farbstoffen, und manchmal einem Trübungsmittel, wie beispielsweise Titandioxid. Das USP lässt für diesen Zweck einen Gehalt von 0,15% (Gew./Vol.) Schwefeldioxid in der Gelatine zu, um eine Zersetzung während der Herstellung zu verhindern.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhalten orale Dosierungszusammensetzungen für den Transport in den Dünndarm auch flüssige Zusammensetzungen, die wässrige, puffernde Agenzien enthalten, welche verhindern, das der Peptidantagonist durch die Magensäfte im Magen wesentlich inaktiviert wird, wodurch es ermöglicht wird, dass der Peptidantagonist den Dünndarm in aktiver Form erreicht. Beispiele für solche wässrigen, puffernden Agenzien, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, umfassen Bicarbonatpuffer (pH 5,5 bis 8,7, vorzugsweise etwa pH 7,4).
Wenn die orale Dosierungszusammensetzung eine flüssige Zusammensetzung ist, wird die Zusammensetzung vorzugsweise unmittelbar vor der Verabreichung zubereitet, um Stabilitätsprobleme zu minimieren. In diesem Fall kann die flüssige Zusammensetzung durch Lösen von lyophilisiertem Peptidantagonisten in dem wässrigen, puffernden Agens zubereitet werden.
Die Peptidantagonisten können verwendet werden, um einen Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke zu inhibieren Die erfindungsgemäßen Peptidantagonisten sind somit brauchbar, z.B. bei der Behandlung von Zuständen, die mit einem Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke in Zusammenhang stehen. Beispiele für solche Zustände umfassen osmotische Verletzungen, z.B. cerebrale Ischämie, Schlaganfall oder cerebrales Ödem; Hypertension; Kohlendioxid; Krampfanfall; chemische Toxine; Urämie (Niereninsuffizienz); Meningitis, Encephalitis, Encephalomyelitis, z.B. infektiöse (virale (SRV, HIV, usw.) oder bakterielle (TB, H. influenzae, Meningococcus, usw.) oder allergische; Tumore; traumatische Hirnverletzungen; strahlungsbedingte Hirnverletzungen; Unreife und Kernikterus; demyelinisierende Erkrankungen, z.B. Multiple Sklerose oder Guillain-Barré-Syndrom.
Für diesen Zweck können die Peptidantagonisten als intravenöse Dosierungszusammensetzungen für den Transport in das Gehirn verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen sind dem Fachmann allgemein bekannt, und die Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen ein physiologisches Verdünnungsmittel, z.B. destilliertes Wasser, oder 0,9% (Gew./Vol.) NaCl.
Die pharmazeutisch wirksame Menge des verwendeten Peptidantagonisten ist für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich und hängt von der behandelten Krankheit oder dem behandelten Zustand ab, ebenso wie vom Alter, Gewicht und dem Geschlecht des behandelten Individuums. Im Allgemeinen liegt die Menge an Peptidantagonist, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um gastrointestinale Entzündung oder den Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke zu inhibieren, z.B. um die biologische Aktivität von Zonulin zu inhibieren, in einem Bereich von etwa 7,5 × 10^–6 M bis 7,5 × 10^–3 M, vorzugsweise bei etwa 7,5 × 10^–6 M bis 7,5 × 10^–4 M. Um eine solche Endkonzentration zu erzielen, z.B. im Intestinum oder im Blut, beträgt die Menge an Peptidantagonist in einer einzigen oralen Dosierungsform im Allgemeinen etwa 1,0 μg bis 1000 μg, vorzugsweise etwa 1,0 μg bis 100 μg.
Der Peptidantagonist kann weiterhin als Immunogen verwendet werden, um unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Techniken (Abrams, Methods Enzymol., 121:107-119 (1986)) Antikörper, entweder polyklonale oder monoklonale Antiköper, mit Bindungsspezifität für Zonulin zu erhalten. Diese Antikörper können wiederum für einen Assay auf Zonulin in Körpergeweben oder Körperflüssigkeiten verwendet werden, oder für die Affinitätsreinigung von Zonulin, oder alternativ für die Bindung an Zonulin und dadurch die Inhibierung der Zonulinaktivität, z.B. zur Inhibierung gastrointestinaler Entzündung oder zur Inhibierung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen in keiner Weise den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung beschränken.
BEISPIEL 1
Aufreinigung von ZOT
5000 ml der Überstandsfraktion, die nach Kultivieren des V.choloerae-Stammes CVD110 (Michalski et al, Infect. Immun., G1:4462-4468 (1993)) gewonnen wurde, der mit dem Plasmid pZ14 transformiert worden war, wurden unter Verwendung eines Laminarflussfilters mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze von 10 kDa aufkonzentriert. Die Konstruktion von pZ14, welches das Vibrio cholerae zot-Gen enthält, ist detailliert, inter alia, in der WO 96/37196 beschrieben. Mit dem erhaltenen Überstand wurde anschließend eine 8,0% (Gew./Vol.) SDS-PAGE durchgeführt. Proteinbanden wurden durch Färben des SDS-PAGE-Gels mit Coomassie Blau nachgewiesen. Bei Vergleich mit einem Kontrollüberstand des Stammes CVD110, der mit dem Plasmid pTTQ181 (Amersham, Arlington Heigths, IL) transformiert war und auf die gleiche Weise behandelt worden war, war keine Proteinbande nachweisbar, die ZOT entsprach. Daher war die Konzentration des Proteins in dem 1000fach angereicherten pZ14-Überstand mit einem Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gel immer noch nicht nachweisbar, obwohl das zot-Gen hinter dem hochinduzierbaren und starken tac-Promotor in pZ14 angeordnet war.
A. MBP-ZOT
Zur Erhöhung der produzierten Menge an ZOT wurde das zot-Gen im Leserahmen mit dem Maltose-Bindungsprotein (nachfolgend hier als „MBP" bezeichnet) fusioniert, um ein MBP-ZOT Fusionsprotein zu erzeugen.
Der MBP-Vektor pMAL-c2 (Biolab) wurde für die Expression und Aufreinigung von ZOT durch Fusionieren des zot-Gens mit dem malE-Gen von E.coli verwendet. Dieses Konstrukt verwendet den starken, induzierbaren tac-Promotor und die malE-Translationsinitiierungssignale für eine starke Expression des klonierten zot-Gens. Der Vektor pMAL-c2 weist eine genaue Deletion der malE-Signalsequenz auf, die zu zytoplasmatischer Expression des Fusionsproteins führt. Um die Isolierung des Fusionsproteins zu erleichtern, wurde eine Affinitätschromatographieaufreinigung für MBP verwendet (Biolab).
Genauer gesagt wurde der Vektor pMAL-c2 mit EcoRI (das am 3'-Ende des malE-Gens schneidet) linearisiert, mit Klenow-Fragment aufgefüllt, und mit XbaI (für das es eine einzige Schnittstelle im pMAL-c2-Polylinker gibt) verdaut. Der für ZOT kodierende ORF wurde aus dem Plasmid pBB241 (Baudry et al, Infect. Immun., 60:428-434 (1992)) subkloniert. Das Plasmid pBB241 wurde mit BssHII verdaut, mit Klenow-Fragment aufgefüllt, und mit XbaI verdaut. Anschließend wurde das stumpfendige XbaI-Fragment in pMAL-c2 subkloniert, wodurch man pLC10-c erhielt. Da sowohl das Insert als auch der Vektor stumpfe und klebrige Enden aufwiesen, erhielt man die korrekte Orientierung mit dem 3'-Ende von malE, das mit dem 5'-Terminus des Inserts fusioniert war. Anschließend wurde pLC10-c durch Elektroporation in den E.coli-Stamm DH5α eingeführt. In pBB241 liegt die BssHII-Schnittstelle innerhalb des ORF von zot. Aus diesem Grund fehlen die Aminosäuren 1-8 von ZOT im MBP-ZOT-Fusionsprotein.
Zur Aufreinigung des MBP-ZOT-Fusionsproteins wurden 10 ml Luria-Bertani-Medium, welches 0,2% (Gew./Vol.) Glucose und 100 μg/ml Ampicillin enthielt, mit einer einzelnen, pLC10-c enthaltenden Kolonie inokuliert und über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Das Medium wurde 1:100 in 1,0 ml des gleichen frischen Mediums verdünnt und unter Schütteln bei 37°C bis zu einer Zelldichte von etwa 1.0 × 10⁸ Zellen/ml kultiviert. Dann wurden 0,2 mM IPTG zugegeben, um die Expression von MBP-ZOT zu induzieren, und die Kultur wurde zusätzliche 3 h bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden anschließend pelletiert und in 20 ml eiskaltem „Säulenpuffer" resuspendiert, der 20 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 1,0 mM EDTA, 10 mM 2-ME und 1,0 mM NaN₃ enthielt. Die Bakteriensuspension wurde durch Behandlung mit einer French Press lysiert und 30 min mit 13.000 × g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, 1:5 mit Säulenpuffer verdünnt und auf eine 1 × 10-Säule mit Amylose-Harz (Biolabs, MBP-Fusionsaufreinigungssystem) aufgetragen, die mit Säulen puffer prä-äquilibiert war. Nach Waschen der Säule mit 5 Volumina Säulenpuffer wurde das MBP-ZOT-Fusionsprotein durch Auftragen von 10 ml 10 mM Maltose in Säulenpuffer eluiert. Die typische Ausbeute von 1,0 ml Kultur betrug 2-3 mg Protein.
Der MBP-Fusionspartner des aufgereinigten MBP-ZOT-Fusionsproteins wurde anschließend mit 1,0 μg Faktor Xa-Protease (Biolabs) pro 20 μg MBP-ZOT abgespalten. Faktor Xa-Protease schneidet unmittelbar vor dem Amino-Terminus von ZOT. Mit dem auf diese Weise erhaltenen ZOT-Protein wurde ein Lauf auf einem 8,0% (Gew./Vol.) SDS-PAGE-Gel und eine Elektroelution aus dem Gel unter Verwendung einer Elektroseparationskammer (Schleicher & Schuell, Kenne, NH) durchgeführt.
Bei Testen in Ussing-Kammern induzierte das erhaltene, aufgereinigte ZOT eine dosisabhängige Abnahme von Rt mit einer ED₅₀ von 7,5 × 10^–8 M.
B. 6 × His-ZOT
Das zot-Gen wurde unter Verwendung von pBB241-Plasmid-DNA (Baudry et al, supra) als Template über PCR mit Deep Vent-Polymerase amplifiziert. Die verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Primer waren: 5'-CGGGATCCCGTATGAGTATCTTT-3' (SEQ ID NO:39) beziehungsweise 5'-CCCAAGCTTGGGTCAAAATATACT-3' (SEQ ID NO:40). Die 5'-Enden dieser Oligonukleotide enthalten eine BamHI- beziehungsweise eine HindIII-Restriktionsschnittstelle. Das erhaltene Amplikon (1,2 kb) wurde über 8,0% (Gew./Vol.) Agarosegelelektrophorese untersucht und unter Verwendung einer Xtreme Spin Column (Pierce) von Salzen und freien Nukleotiden gereinigt. Anschließend wurden die oben angegebenen beiden Restriktionsenzyme verwendet, um das aufgereinigte Amplikon zu verdauen, und das erhaltene verdaute Amplikon wurde anschließend in den Vektor pQE30 (Quiagen) insertiert, der zuvor mit BamHI und HindIII verdaut worden war, wodurch man das Plasmid pSU113 erhielt. pQE30 ist ein Expressionsvektor, der zu einer hohen Expression eines rekombinanten Proteins mit einem 6-Polyhistidin-Tag (6×His) führt. Das Expressionsprodukt des Plasmids pSU113 ist daher ein 6 × His-ZOT-Fusionsprotein. pSU113 wurde anschließend in E.coli DH5α transformiert.
Zur Aufreinigung des 6 × His-ZOT-Fusionsproteins ließ man die erhaltenen transformierten E.coli über Nacht bei 37°C in 150 ml Luria-Bertani-Medium, das 2,0% (Gew./Vol.) Glucose, 25 μg/ml Kanamycin und 200 μg/ml Ampicillin enthielt, wachsen, bis der A₆₀₀-Wert etwa 1,10 betrug. Danach wurden 75 ml der Übernacht-Kulturen zu 1000 ml Luria-Bertani-Medium gegeben, das 2,0% (Gew./Vol.) Glucose, 25 μg/ml Kanamycin und 200 μg/ml Ampicillin enthielt, und etwa 3 h bei 37°C unter heftigem Schütteln inkubiert, bis der A₆₀₀-Wert etwa 0,7–0,9 betrug. Anschließend gab man IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2,0 mM zu und ließ weitere 5 h bei 37°C wachsen. Danach wurden die Zellen durch 20-minütige Zentrifugation mit 4.000 × g geerntet, die Zellen in 5,0 ml/g Nassgewicht Puffer A, der 6,0 M GuHCl, 0,1 M Natriumphosphat und 0,01 M Tris-HCl (pH 8,0) enthielt, resuspendiert und 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend zentrifugierte man die Mischung 30 min mit 10.000 × g bei 4°C, gab dem erhaltenen Überstand 4,0–5,0 ml/g Nassgewicht einer 50%igen Aufschlämmung von SUPERFLOW-Harz (Quiagen) zu und rührte 1 h bei Raumtemperatur. Mit dem erhaltenen Harz wurde auf eine 1,6 × 8,0-Säule befüllt, die anschließend nacheinander mit Puffer A, 8,0 M Harnstoff, 0,1 M Natriumphosphat und 0,01 M Tris-HCl (pH 8,0) enthaltendem Puffer B und 8,0 M Harnstoff, 0,1 M Natriumphosphat und 0,01 M Tris-HCl (pH 6,3) enthaltendem Puffer C gewaschen wurde. Jeder Waschschritt wurde solange durchgeführt, bis der A₆₀₀-Wert des Durchlaufs weniger als 0,01 betrug. Das 6 × His-ZOT-Fusionsprotein wurde mit 20 ml Puffer C, der 250 mM Imidazol enthielt, aus der Säule eluiert. Anschließend wurden die das 6 × His-ZOT-Fusionsprotein enthaltenden Fraktionen unter Anwendung der von Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci., 121:404 (1964) beschriebenen Vorgehensweise über SDS-PAGE überprüft und das Gel mit Coomassie Blau gefärbt. Die 6 × His-ZOT-Fusionsprotein enthaltenden Fraktionen wurden gegen 8,0 M Harnstoff dialysiert, vereinigt und anschließend 100fach mit PBS verdünnt. Anschließend gab man 4,0 ml einer 50%igen Aufschlämmung von SUPERFLOW-Harz zu, rührte 2 h bei Raumtemperatur und befüllte mit dem erhaltenen Harz eine 1,6 × 8,0-Säule, die anschließend mit 50 ml PBS gewaschen wurde. Das 6 × His-ZOT-Fusionsprotein wurde mit 10 ml 250 mM Imidazol enthaltendem PBS aus der Säule eluiert. Das erhaltene Eluat wurde gegen PBS dialysiert, und das 6 × His-ZOT-Fusionsprotein wie oben beschrieben mit SDS-PAGE überprüft.
BEISPIEL 2
Produktion affinitätsgereinigter anti-ZOT-Antikörper
Um ein spezifisches Antiserum zu erhalten, wurde ein chimäres Glutathion S-Transferase (GST)-ZOT-Protein exprimiert und aufgereinigt.
Genauer gesagt wurden Oligonukleotid-Primer für die Amplifizierung des zot-ORF über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Plasmids pBB241 (Baudry et al, supra) als Template-DNA verwendet. Der Vorwärts-Primer (TCATCACGGC GCGCCAGG, SEQ ID NO:25) entsprach den Nukleotiden 15-32 des zot-ORF, und der Rückwärts-Primer (GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT, SEQ ID NO:26) entsprach dem 5'-Ende des ctxA-ORF. Aus diesem Grund fehlten die Aminosäuren 1-5 von ZOT im erhaltenen Fusionsprotein. Das Amplifizierungsprodukt wurde in den Polylinker (Smal-Schnittstelle) insertiert, der sich am Ende des GST-Gens in pGEX-2T (Pharmacia, Milwaukee, WI) befindet. pGEX-2T ist ein Fusionsprotein-Expressionsvektor, der ein kloniertes Gen als Fusionsprotein mit GST von Schistosoma japonicum exprimiert. Das Fusionsgen steht unter der Kontrolle des tac-Promotors. Nach Induktion mit IPTG erfolgt eine Derepression und das GST-Fusionsprotein wird exprimiert.
Das erhaltene rekombinante Plasmid, das als pLC11 bezeichnet wurde, wurde über Elektroporation in E.coli DH5α übertragen. Zur Aufreinigung von GST-ZOT-Fusionsprotein wurden 10 ml Luria-Bertani-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, mit einer einzelnen, pLC11 enthaltenden Kolonie inokuliert und über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Man verdünnte die Kultur 1:100 in 1,0 ml des gleichen frischen Mediums und ließ unter Schütteln bei 37°C bis zu einer Zelldichte von etwa 1,0 × 10⁸ Zellen/ml wachsen. Anschließend gab man 0,2 mM IPTG zu, um die GST-ZOT-Expression zu induzieren, und inkubierte die Kultur weitere 3 h bei 37°C. Dann wurden die Bakterien pelletiert, in 20 ml eiskaltem PBS (pH7,4) resuspendiert und über die French Press-Methode lysiert. Unter diesen Bedingungen war das GST-ZOT-Fusionsprotein nicht löslich, da es zusammen mit der Fraktion des Bakterienpellets sedimentierte. Daher resuspendierte man das Pellet in Laemli-Lysepuffer, der 0,00625 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,2 M 2-ME, 2,0% (Gew./Vol.) SDS, 0,025% (Gew./Vol.) Bromphenolblau und 10% (Vol./Vol.) Glycerin enthielt, und führte damit eine Elektrophorese auf einem 8,0% (Gew./Vol.) SDS-PAGE-Gel durch, und färbte mit Coomassie Brilliant Blau. Unter Verwendung einer Elektroseparationskammer (Schleicher & Schuell, Keene, NH) wurde eine Bande von etwa 70 kDa (26 kDa von GST + 44 kDa von ZOT) aus dem Gel eluiert.
10 μg des erhaltenen eluierten Proteins (10-20 μg) wurden vermischt mit einem gleichen Volumen Freund's vollständigem Adjuvans in ein Kaninchen injiziert. Zwei Booster-Dosierungen mit Freund's unvollständigem Adjuvans wurden 4 und 8 Wochen später verabreicht. Einen Monat später entnahm man Blut des Kaninchens.
Zur Bestimmung der Produktion spezifischer Antikörper wurden 10^–10 M ZOT, zusammen mit den beiden Fusionsproteinen MBP-ZOT und GST-ZOT, auf eine Nylonmembran transferiert und über Nacht bei 4°C und bei mäßigem Schütteln mit einer 1:5000-Verdünnung des Kaninchen-Antiserums inkubiert. Der Filter wurde anschließend 15 min 4 Mal mit 0,05% (Vol./Vol.) Tween 20 enthaltendem PBS (nachfolgend hier als „PBS-T" bezeichnet) gewaschen und 2 h bei Raumtemperatur mit einer 1:30.000-Verdünnung von Ziege-anti-Kaninchen-IgG, das mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war, inkubiert. Der Filter wurde erneut 15 min 4 Mal mit 0,1% (Vol./Vol.) Tween enthaltendem PBS gewaschen, und immunoreaktive Banden wurden über verstärkte Chemilumineszenz (Amersham) nachgewiesen.
Es erwies sich auf dem Immunoblot, dass das Kaninchen-Antiserum ZOT ebenso wie die MBP-ZOT- und GST-ZOT-Fusionsproteine erkannte, nicht aber die MBP-Negativkontrolle.
Um die Produktion geeigneter anti-ZOT-Antikörper zu bestätigen, wurden darüber hinaus Neutralisierungsexperimente in Ussing-Kammern durchgeführt. Bei 60minütiger Präinkubation mit pZ14-Überstand bei 37°C vermochte das ZOT-spezifische Antiserum (1:100-Verdünnung) die durch ZOT induzierte Abnahme von Rt bei Kaninchen-Ileum, das in Ussing-Kammern aufgetragen war, vollständig zu neutralisieren.
Anschließend wurden die anti-ZOT-Antikörper über eine MBP-ZOT-Affinitätssäule affinitätsgereinigt. Genauer gesagt wurde eine MBP-ZOT-Affinitätssäule hergestellt, in dem 1,0 mg aufgereinigtes MBP-ZOT, das wie in Beispiel 1 oben beschrieben gewonnen worden war, über Nacht bei Raumtemperatur an ein prä-aktiviertes Gel (Aminolink, Pierce) immobilisiert wurde. Die Säule wurde mit PBS gewaschen und dann mit 2,0 ml anti-ZOT-Kaninchen-Antiserum beladen. Nach 90minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Säule mit 14 ml PBS gewaschen und die spezifischen anti-ZOT-Antikörper mit 4,0 ml einer 50 mM Glycin (pH 2,5), 150 mM NaCl und 0,1% (Vol./Vol.) Triton X-100 enthaltenden Lösung aus der Säule eluiert. Der pH-Wert der eluierten 1,0 ml-Fraktionen wurde sofort mit 1,0 N NaOH neutralisiert.
BEISPIEL 3
Aufreinigung von Zonulin
Auf der Grundlage der in der am 20. Februar 1997 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 08/803,364 gemachten Beobachtung, dass ZOT mit einem spezifischen Rezeptor der Epitheloberfläche unter anschließender Aktivierung einer komplexen intrazellulären Kaskade von Vorgängen, welche die tj-Permeabilität regeln, interagiert, wurde in der vorliegenden Erfindung postuliert, dass ZOT die Wirkung eines physiologischen Modulators von Säuger-tj nachahmen könnte. In der am 21. Mai 1997 eingereichten US-Patentanmeldung 08/859,931 wurde postuliert, dass ZOT, und dessen physiologisches Analogon (Zonulin), funktional und physiologisch verwandt sein würden. Aus diesem Grund wurden, wie hier beschrieben, affinitätsgereinigte anti-ZOT-Antikörper und der Ussing-Kammer-Assay in Kombination verwendet, um in verschiedenen Geweben des Kaninchens und des Menschen nach Zonulin zu suchen.
A. Kaninchen-Gewebe
Anfänglich wurde Zonulin aus Kaninchen-Intestinum aufgereinigt. Das Gewebe wurde durch Homogenisierung in PBS aufgebrochen. Anschließend wurden die erhaltenen Zellpräparationen 30 min mit 40.000 × g zentrifugiert, der Überstand gesammelt und lyophilisiert. Das erhaltene lyophilisierte Produkt wurde nachfolgend in PBS (10:1 (Vol./Vol.)) rekonstituiert, durch einen 0,45 mm Membranfilter filtriert, auf eine Sephadex G-50-Chromatographie-Säule geladen und mit PBS eluiert. Anschließend wurde mit von der Säule gewonnenen 2,0 ml-Fraktionen ein übliches Western-Immunoblotting unter Verwendung der wie in Beispiel 2 oben beschrieben gewonnenen affinitätsgereinigten anti-ZOT-Antikörper durchgeführt.
Positive Fraktionen, d.h. solche Fraktionen, an die anti-ZOT-Antikörper banden, wurden vereinigt, lyophilisiert, in PBS (1:1 (Vol./Vol.)) rekonstituiert, und man führte eine Salzgradienten-Chromatographie über eine Q-Sepharose-Säule damit durch. Der Salzgradient betrug 0-100% (Gew./Vol.) NaCl in 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0). Fünf 20 ml- Fraktionen wurden gesammelt und damit ein übliches Western-Immunoblotting unter Verwendung der wie oben in Beispiel 2 beschrieben gewonnenen affinitätsgereinigten anti-ZOT-Antikörper durchgeführt. Die Fraktion 1 (20% (Gew./Vol.) NaCl) war die einzige Fraktion, die sich im Western-Immunoblot-Assay als positiv erwies.
Die von der Q-Sepharose-Säule erhaltenen Fraktionen wurden anschließend sowohl auf CaCo2-Monolayern als auch auf Kaninchen-Dünndarm in Ussing-Kammern auf ihre Wirkung hinsichtlich des Gewebe-Widerstands untersucht.
Genauer gesagt ließ man CaCo2-Zellen in Zellkulturgefäßen (Falcon) in einer feuchten Atmosphäre von 95% O₂/5% CO₂ bei 37°C in Dulbecco's Modifiziertem Eagle's Medium wachsen, das 10% (Vol./Vol.) fötales Kälberserum, 40 μg/l Penicillin und 90 μg/l Streptomycin enthielt. Alle 5 Tage wurden die Zellen in einem Oberflächenverhältnis von 1:5 nach Trypsinbehandlung subkultiviert, wenn sie 70-80% Konfluenz erreicht hatten. Die Anzahl der Passagen der bei dieser Untersuchung verwendeten Zellen variierte zwischen 15 und 30.
Die CaCo2-Monolayer ließ man bis zur Konfluenz (12-14 Tage nach Ausplattieren mit bei einem 1:2,5-Oberflächenverhältnis) auf Zellkultur-behandelten Polycarbonat-Filtern wachsen, die fest an einem Polystyrol-Ring (6,4 mm Durchmesser, Transwell Costar) befestigt waren. Die Filter wurden in ein genau passendes Insert gegeben, welches das Serosa-Kompartiment vom Mucosa-Kompartiment einer modifizierten Ussing-Kammer trennte, und die Experimente wurden wie von Fasano et al, Proc. Natl., Acad. Sci.; USA, 8:5242-5246 (1991) für Kaninchen-Intestinum in Ussing-Kammern beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie in 1 gezeigt induzierte die Zonulin enthaltende Fraktion im Vergleich mit Zonulin-negativen Fraktionen eine signifikante Verringerung des Widerstandes von CaCo2-Monolayern.
Danach wurden Ussing-Kammer-Assays unter Verwendung von Ileum erwachsener, männlicher, weißer Neuseeländer-Kaninchen mit einem Gewicht von 2-3 kg durchgeführt, die durch Genickbruch getötet worden waren. Ein Segment des Ileums mit einer Länge von 20 cm wurde entnommen, von Intestinum-Inhalt freigespült, entlang der Mesenterium-Grenze geöffnet und von Muskel- und Serosa-Schichten befreit. Acht Bahnen der auf diese Weise präparierten Mucosa wurden auf Acrylglas-Ussing-Kammern (1,12 cm² Öffnung) aufgetragen, mit einer Voltage Clamp-Vorrichtung verbunden (EVC 4000 WPI, Saratosa, FL) und in frisch hergestellte Ringer-Lösung, die 53 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 30,5 mM Mannitol, 1,69 mM Na₂HPO₄, 0,3 mM NaH₂PO₄, 1,25 mM CaCl₂, 1,1 mM MgCl₂ und 25 mM NaHCO₃ enthielt, eingetaucht. Die Badelösung wurde mit wasserummantelten Reservoirs, die mit einer Konstanttemperatur-Umlaufpumpe verbunden waren, auf 37°C gehalten und mit 95% O₂/5% CO₂ begast.
Auf der Mucosa-Seite wurden 100 μl Zonulin zugegeben, das aus Kaninchen-Intestinum aufgereinigt worden war. Die Potentialdifferenz (PD) wurde alle 10 min gemessen, und der Kurzschlussstrom (Isc) und der Gewebe-Widerstand (Rt) wurden wie von Fasano et al, supra, beschrieben berechnet. Wegen der Gewebe-Variabilität wurden die Daten als ΔRt (Rt zum Zeitpunkt x)-(Rt zum Zeitpunkt 0) berechnet. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Wie in 2 gezeigt, induzierte die Zonulin enthaltende Fraktion im Vergleich mit einer Zonulin-negativen Fraktion eine signifikante Verringerung des Widerstandes von Kaninchen-Dünndarm. Sobald Zonulin aus dem Reservoir entfernt wurde, war dieser Effekt vollständig reversibel.
Mit der Zonulin-positiven Fraktion wurde auch eine 8,0% (Gew./Vol.) SDS-PAGE und anschließend Western-Immunoblotting unter Verwendung der anti-ZOT-Antikörper durchgeführt. Die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteinbanden wurden anschließend unter Verwendung vom CAPS-Puffer, der 100 ml (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure) 10x, 100 ml Methanol, 800 ml destilliertes Wasser enthielt, auf einen PVDF-Filter übertragen. Das Protein, das sich auf einer Linie mit einer einzelnen Bande befand, welche über Western-Immunoblotting nachgewiesen worden war, wies ein scheinbares Molekulargewicht von 47 kDa auf. Diese Bande wurde aus dem PVDF-Filter ausgeschnitten und damit unter Verwendung eines Perkin-Elmer Applied Biosystems Apparatus Model 494 eine N-terminale Sequenzierung wie von Hunkapiller, in: Methods of Protein Microcharacterisation, Hrsg. Shibley, Kapitel 11-12, Human Press, Seiten 315–334 (1985) beschrieben durchgeführt. Die N-terminale Sequenz des aus Kaninchen-Intestinum aufgereinigten Zonulins ist in SEQ ID NO:27 gezeigt.
Über eine BLAST-Suchanalyse wurde die N-terminale Sequenz von Kaninchen-Zonulin mit anderen Proteinsequenzen verglichen. Das Ergebnis dieser Analyse zeigte, dass die N-terminale Sequenz von Kaninchen-Zonulin der N-terminalen Sequenz des Tau-Proteins von Homo sapiens zu 85% identisch und zu 100% ähnlich ist.
Um zu bestimmen, ob Kaninchen-Zonulin und Tau dieselbe Einheit darstellen, wurden daraufhin Kreuz-Neutralisierungsexperimente in Ussing-Kammern durchgeführt. Genauer gesagt wurden 10 μl/ml Kaninchen-Zonulin entweder unbehandelt oder 60 min bei 37°C mit anti-Tau-Antikörpern (Verdünnung 1:10) (Sigma) prä-inkubiert zur Mucosa-Seite von Kaninchen-Ileum gegeben. Sowohl 10 μl/ml Kaninchen-Zonulin, das mit anti-ZOT-Antikörpern (Verdünnung 1:10) (Beispiel 2) prä-inkubiert worden war, als auch 0,4 μg/ml aufgereinigtes Tau (Sigma) wurden als Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Wie in 3 gezeigt induzierte Kaninchen-Zonulin die typische Verringerung des Gewebe-Widerstandes, die leicht reversibel war, sobald das Protein aus den Ussing- Kammern entfernt wurde. Diese Aktivität wurde durch Vorbehandlung mit anti-ZOT-Antikörpern vollständig neutralisiert, nicht dagegen durch Vorbehandlung mit anti-Tau-Antikörpern. Andererseits gab es keine signifikante Wirkung hinsichtlich des Gewebe-Widerstands bei Geweben, die dem Tau-Protein ausgesetzt waren.
Kaninchen-Zonulin wurde weiterhin in verschiedenen anderen Kaninchengeweben nachgewiesen, d.h. im Herz, Gehirn, Muskel, Magen, der Milz, Lunge und Niere des Kaninchens wie auch in verschiedenen Teilen des Kaninchen-Intestinums, d.h. dem distalen Jejunum, dem proximalen Jejunum, dem Ileum, dem Caecum und dem Colon. Dies bedeutet, dass bei Behandlung dieser Kaninchengewebe auf die gleiche Weise wie oben für den Kaninchen-Intestinum beschrieben, und Durchführung einer 8,0% (Gew./Vol.) SDS-PAGE und anschließendes Western Immunoblotting unter Verwendung von affinitätsgereinigten anti-ZOT-Antikörpern, die wie oben in Beispiel 2 beschrieben gewonnen worden waren, eine einzelne Bande mit einer Größe von ungefähr 47 kDa in allen untersuchten Geweben nachgewiesen wurde.
B. Menschliche Gewebe
Zonulin wurde weiterhin aus verschiedenen menschlichen Geweben, einschließlich Intestinum, Herz und Gehirn aufgereinigt. Es wurden Gewebe sowohl von Föten als auch von Erwachsenen verwendet. Die Gewebe wurden durch Homogenisierung in PBS aufgebrochen. Die erhaltenen Zellpräparationen wurden anschließend 30 min mit 40.000 U/min zentrifugiert, der Überstand gesammelt und lyophilisiert. Das erhaltene lyophilisierte Produkt wurde nachfolgend in PBS (10:1 (Vol./Vol.)) rekonstituiert, durch einen 0,45 mm Membranfilter filtriert, auf eine Sephadex G-50-Chromatographie-Säule geladen und mit PBS eluiert. Anschließend wurde mit von der Säule gewonnenen 2,0 ml-Fraktionen ein übliches Western-Immunoblotting unter Verwendung der wie in Beispiel 2 oben beschrieben gewonnenen affinitätsgereinigten anti-ZOT-Antikörper durchgeführt.
Positive Fraktionen, d.h. solche Fraktionen, an die anti-ZOT-Antikörper banden, wurden vereinigt, lyophilisiert, in PBS (1:1 (Vol./Vol.)) rekonstituiert, und man führte eine Salzgradienten-Chromatographie über eine Q-Sepharose-Säule damit durch. Der Salzgradient betrug 0-100% (Gew./Vol.) NaCl in 50 mM Tris-Puffer (pH 7,4). Fünf 20 ml-Fraktionen wurden gesammelt und damit ein übliches Western-Immunoblotting unter Verwendung der wie oben in Beispiel 2 beschrieben gewonnenen affinitätsgereinigten anti-ZOT-Antikörper durchgeführt. Die Fraktion 1 (20% (Gew./Vol.) NaCl) zeigte im Western-Immunoblot-Assay eine einzelne Bande mit einer Größe von 47 kDa. Die Fraktion 2 (40% (Gew./ Vol.) NaCl zeigte im Western-Immunoblot-Assay zwei zusätzliche Banden mit einer Größe von 35 kDa und 15 kDa. Die Fraktion 3 (60% (Gew./Vol.) NaCl) und die Fraktion 4 (80% (Gew./Vol.) zeigten nur die 35 kDa- und die 15 kDa-Banden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Zonulin möglicherweise einem Abbau durch Proteasen unterliegt, die wahrscheinlich in den verwendeten menschlichen Geweben vorkommen, und dass die Abbauprodukte verglichen mit dem Holoprotein bei einer höheren Salzkonzentration von der Säule eluiert werden.
Die Fraktion 1 (aus menschlichen Herz-, Intestinum- und Hirngeweben) und die Fraktion 4 (aus Herzgewebe), die von der Q-Sepharose-Säule erhalten wurden, wurden anschließend sowohl auf Kaninchen-Intestinum als auch auf Rhesusaffen-Intestinum in Ussing-Kammern auf ihre Wirkungen hinsichtlich des Gewebe-Widerstandes untersucht.
Ussing-Kammer-Assays wurden unter Verwendung verschiedener Abschnitte des Intestinums, einschließlich Jejunum, Ileum oder Colon, entweder von erwachsenen, männlichen weißen Neuseeländer-Kaninchen mit einem Gewicht von 2-3 kg oder von erwachsenen männlichen Rhesusaffen mit einem Gewicht von 5-6 kg durchgeführt. Nach Tötung der Tiere wurden verschiedene Abschnitte des Intestinums, einschließlich Jejunum, Ileum und Colon, entnommen, von Intestinum-Inhalt freigespült, entlang der Mesenterium-Grenze geöffnet und von Muskel- und Serosa-Schichten befreit. Acht Bahnen der auf diese Weise präparierten Mucosa (dreimal Jejunum, dreimal Ileum und zweimal Colon) wurden dann auf Acrylglas-Ussing-Kammern (1,12 cm² Öffnung) aufgetragen, mit einer Voltage Clamp-Vorrichtung verbunden (EVC 4000 WPI, Saratosa, FL) und in frisch hergestellte Ringer-Lösung, die 53 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 30,5 mM Mannitol, 1,69 mM Na₂HPO₄, 0,3 mM NaH₂PO₄, 1,25 mM CaCl₂, 1,1 mM MgCl₂ und 25 mM NaHCO₃ enthielt, eingetaucht. Die Badelösung wurde mit wasserummantelten Reservoirs, die mit einer Konstanttemperatur-Umlaufpumpe verbunden waren, auf 37°C gehalten und mit 95% O₂/5% CO₂ begast.
Zur Mucosa-Seite wurden 100 μl der Fraktion 1 von aus menschlichem Herz aufgereinigtem Zonulin, oder der Fraktion 1 von aus menschlichem Gehirn aufgereinigtem Zonulin, das worden war, oder der Fraktion 1 von aus menschlichem Intestinum aufgereinigtem Zonulin, oder der Fraktion 4, aufgereinigt aus menschlichem Herz, zugegeben. Die Potentialdifferenz (PD) wurde alle 10 min gemessen, und der Kurzschlussstrom (Isc) und der Gewebe-Widerstand (Rt) wurden wie von Fasano et al, supra, beschrieben berechnet. Für die 4A und 4B wurden die Daten als Rt berechnet; aber wegen der Gewebe-Variabilität wurden die Daten für die 5A und 5B als ΔRt (Rt zum Zeitpunkt x)-(Rt zum Zeitpunkt 0) berechnet. Die Ergebnisse sind in den 4A und 4B (Affen-Intestinum) und den 5A und 5B (Kaninchen-Intestinum) gezeigt.
Wie in den 4A und 4B gezeigt, induzierte aus menschlichem Herz und Intestinum aufgereinigtes Zonulin (Fraktion 1) im Vergleich mit der PBS-Negativkontrolle eine signifikanten Verringerung des intestinalen Widerstandes beim Affen (sowohl im Jejunum (4A) als auch im Ileum (4B)). Es wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet, wenn entweder aus menschlichem Herz oder aus menschlichem Intestinum aufgereinigtes Zonulin mit dem Colon getestet wurden. Die 4A und 4B zeigen weiterhin, dass keine signifikante Wirkung auf sowohl Affen-Jejunum (4A) als auch auf Affen-Ileum (4B) beobachtet wurde, wenn aus menschlichem Gehirn aufgereinigtes Zonulin (Fraktion 1) getestet wurde. Die Fraktion 4 von Zonulin, das aus menschlichem Herz aufgereinigt wurde, induzierte ebenfalls eine signifikante Verringerung des Gewebe-Widerstandes von Dünndarmgewebe des Affen.
Wie in den 5A und 5B gezeigt, führte die Verwendung von Kaninchen-Intestinum zu ähnlichen Ergebnissen. Somit zeigte aus menschlichem Herz aufgereinigtes Zonulin (Fraktion 1) eine signifikante Wirkung auf den Gewebe-Widerstand sowohl bei Kaninchen-Jejunum (5A) als auch bei Kaninchen-Ileum (5B), aber nicht beim Colon. Die 5A und 5B zeigen weiterhin, dass keine signifikante Wirkung auf Kaninchen-Jejunum (5A) und auf Kaninchen-Ileum (5B) beobachtet wurde, wenn aus menschlichem Gehirn aufgereinigtes Zonulin (Fraktion 1) getestet wurde.
Um zu ermitteln, ob Zonulin den oralen Transport von Insulin steigert, wurden Experimente mit in vitro-Modellen unter Verwendung von Kaninchen-Intestinum durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurden erwachsene, männliche weiße Neuseeländer-Kaninchen (2-3 kg) durch Genickbruch getötet. Abschnitte des Kaninchen-Dünndarms (entweder Jejunum oder Ileum) wurden entnommen, von intestinalem Inhalt freigespült, entlang der Mesenterium-Grenze geöffnet und von Muskel- und Serosa-Schichten befreit. Acht Bahnen der auf diese Weise präparierten Mucosa wurden dann auf Lucite-Ussing-Kammern (1,12 cm² Öffnung) aufgetragen, mit einer Voltage Clamp-Vorrichtung verbunden (EVC 4000 WPI, Saratosa, FL) und in frisch hergestellte Ringer-Lösung, die 53 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 30,5 mM Mannitol, 1,69 mM Na₂HPO₄, 0,3 mM NaH₂PO₄, 1,25 mM CaCl₂, 1,1 mM MgCl₂ und 25 mM NaHCO₃ enthielt, eingetaucht. Die Badelösung wurde mit wasserummantelten Reservoirs, die mit einer Konstanttemperatur-Umlaufpumpe verbunden waren, auf 37°C gehalten und mit 95% O₂/5% CO₂ begast. Die Potentialdifferenz (PD) wurde gemessen, und der Kurzschlussstrom (Isc) und der Gewebe-Widerstand (Rt) wurden berechnet. Sobald die Gewebe einen Gleichgewichtszustand erreichten, wurden Gewebe, die auf der Grundlage ihres Widerstands zusammengestellt waren, paarweise luminal 10^–11 M ¹²⁵I-Insulin (Amersham, Arlington Heights, IL; 2,0 μCi = 10^–12 M) ausgesetzt, entweder allein oder in Gegenwart von 100 μl Herz-Zonulin aus Fraktion 1. Ein 1,0 ml-Aliquot von der Serosa-Seite und ein 50 μl-Aliquot von der Mucosa-Seite wurden unverzüglich gewonnen, um die Basiswerte festzulegen. Anschließend wurden über die folgenden 100 min in Intervallen von 20 min Proben von der Serosa-Seite gesammelt.
Es erwies sich, dass das Herz-Zonulin die intestinale Absorption von Insulin sowohl im Jejunum (0,058 ± 0,003 fmol/cm².min im Vergleich mit 0,12 ± 0,005 fmol/cm².min, unbehandelte im Vergleich zu mit Zonulin behandelten Geweben, p = 0,001) als auch im Ileum (0,006 ± 0,0002 fmol/cm².min im Vergleich mit 0,018 ± 0,005 fmol/cm².min, unbehandelte im Vergleich zu mit Zonulin behandelten Geweben, p = 0,05) in zeitabhängiger Weise steigerte.
Mit Fraktion 1 von aus menschlichem Herz aufgereinigtem Zonulin, Fraktion 1 von aus menschlichem Intestinum aufgereinigten Zonulin, und Fraktion 1 von aus menschlichem Gehirn aufgereinigtem Zonulin wurden weiterhin eine 8,0% (Gew./Vol.) SDS-PAGE und anschließend unter Verwendung der wie in Beispiel 2 oben beschrieben erhaltenen anti-ZOT-Antikörper ein Western-Immunoblotting durchgeführt. Die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteinbanden wurden anschließend unter Verwendung vom CAPS-Puffer, der 100 ml (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure) 10×, 100 ml Methanol, 800 ml destilliertes Wasser enthielt, auf einen PVDF-Filter übertragen. Das Protein, das sich auf einer Linie mit einer einzelnen Bande befand, welche über Western-Immunoblotting nachgewiesen worden war, wies ein scheinbares Molekulargewicht von 47 kDa auf. Diese Bande wurde aus dem PVDF-Filter ausgeschnitten und damit unter Verwendung eines Perkin-Elmer Applied Biosystems Apparatus Model 494 eine N-terminale Sequenzierung wie von Hunkapiller, in: Methods of Protein Microcharacterisation, Hrsg. Shibley, Kapitel 11-12, Human Press, Seiten 315-334 (1985) beschrieben, durchgeführt. Die N-terminale Sequenz des aus adultem menschlichem Herz aufgereinigten Zonulins ist in SEQ ID NO:28 gezeigt, die N-terminale Sequenz des aus adultem menschlichem Gehirn aufgereinigten Zonulins ist in SEQ ID NO:29 gezeigt, und die N-terminale Sequenz des aus fötalem menschlichem Gehirn aufgereinigten Zonulins ist in SEQ ID NO:36 gezeigt.
Die ersten neun Aminosäuren der N-terminalen Sequenz von Zonulin, das aus adultem menschlichem Intestinum aufgereinigt worden war (SEQ ID NO:31), wurden ebenfalls sequenziert und erwiesen sich als identisch zu den ersten neun, in SEQ ID NO:28 (siehe 6) gezeigten Aminosäuren von Zonulin, das aus menschlichem Herz aufgereinigt worden war. Die ersten zwanzig Aminosäuren der N-terminalen Sequenz von Zonulin, das aus menschlichem fötalen Intestinum aufgereinigt worden war, wurden ebenfalls sequenziert: Met Leu Gln Lys Ala Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Xaa Ser Asn Arg Leu (SEQ ID NO:30), und erwiesen sich als fast identisch zu der in SEQ ID NO:28 gezeigten Aminosäuresequenz von Zonulin, das aus menschlichem Herz aufgereinigt worden war (siehe 6).
Die N-terminale Sequenz von aus adultem menschlichem Gehirn (SEQ ID NO:29) und fötalem menschlichem Gehirn (SEQ ID NO:36) aufgereinigtem Zonulin war vollkommen verschieden von der N-terminalen Sequenz von Zonulin, das jeweils aus Herz (SEQ ID NO:28), fötalem Intestinum (SEQ ID NO:30) und adultem Intestinum (SEQ ID NO:31) aufgereingt worden war (siehe 6–7). Man nimmt an, dass dieser Unterschied die oben gezeigte Gewebespezifität von Zonulin bei der Bestimmung der Permeabilität von Geweben, wie beispielsweise dem Intestinum, erklärt.
Die N-terminale Sequenzen von menschlichem, aus dem Herz, dem Intestinum und dem Gehirn aufgereinigten Zonulin unterscheiden sich alle von der N-terminalen Sequenz von Zonulin, das aus Kaninchen-Intestinum aufgereinigt wurde (6). Um zu bestimmen, ob diese Proteine verschiedene Isoformen einer mit Tau verwandten Familie von Proteinen repräsentieren, wurde mit Geweben sowohl des Menschen als auch des Kaninchens eine 8,0% (Gew./Vol.) SDS-PAGE und anschließend Western-Immunoblotting unter Verwendung von entweder anti-ZOT- oder anti-Tau-Antikörpern durchgeführt. Es erwies sich, dass die 47 kDa-Zonulin-Banden, die sowohl aus Kaninchengeweben als auch aus menschlichen Geweben (einschließlich Gehirn, Intestinum und Herz) aufgereinigt worden waren und für die eine Erkennung durch die anti-ZOT-Antikörper gezeigt worden war, auch mit anti-Tau-Antikörpern kreuzreagierten. Mit den unterschiedlichen Fraktionen von Zonulin, das aus menschlichem Gehirn aufgereinigt und durch Salzchromatographie erhalten worden war, wurde ebenfalls Western-Immunoblotting unter Verwendung von entweder anti-ZOT- oder anti-Tau-Antikörpern durchgeführt. Während anti-ZOT-Antikörper das intakte 47 kDa-Protein und sowohl das 35 kDa- als auch das 15 kDa-Abbaufragment erkannten, erkannten die anti-Tau-Antikörper nur das intakte 47 kDa-Protein und das 35 kDa-Fragment, jedoch nicht das 15 kDa-Fragment. Um zu ermitteln, ob das 35 kDa-Fragment den N-Terminus oder den C-Terminus von Zonulin umfasst, wurde die N-terminale Sequenz der 35 kDa-Bande bestimmt, die sich als folgende Sequenz herausstellte: Xaa Xaa Asp Gly Thr Gly Lys Val Gly Asp Leu (SEQ ID NO:32). Diese Sequenz unterscheidet sich von der N-terminalen Sequenz des intakten Zonulins aus menschlichem Gehirn (SEQ ID NO:29). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das 15 kDa-Fragment den N-terminalen Teil von Zonulin darstellt, während das 35 kDa-Fragment den C-terminalen Teil von Zonulin darstellt.
Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die von den anti-Tau-Antikörpern erkannte Zonulin-Domäne eher am C-Terminus des Proteins liegt, den verschiedenen Isoformen von Zonulin aus entweder menschlichen Geweben oder Kaninchen-Geweben gemeinsam ist (während der N-terminale Teil variieren kann), und vermutlich an der permeabilisierenden Wirkung des Proteins beteiligt ist (basierend auf der Beobachtung, dass Tau unter anschließender Umordnung des Zellzytoskeletts an β-Tubulin bindet, und auf der Wirkung der Fraktion 4 auf den Gewebe-Widerstand von Affen-Dünndarmgewebe).
Über eine BLAST-Suchanalyse wurde die N-terminale Sequenz menschlichem, aus Herz und Intestinum aufgereinigtem Zonulin mit anderen Proteinsequenzen verglichen. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigten, dass die N-terminale Sequenz von menschlichem Zonulin zu 95% identisch ist zu der N-terminalen Sequenz der schweren, variablen Kette von IgM von Homo sapiens (SEQ ID NO:37).
Als Folge davon wurde zur Bestimmung, ob menschliches, aus Herz aufgereinigtes Zonulin und menschliches IgM die gleiche Einheit darstellen, ein Partialverdau mit menschli chem Zonulin durchgeführt, um ein internes Fragment zu erhalten, welches anschließend sequenziert wurde.
Genauer gesagt wurden 1,0 mm des PVDF-Filters, der aus menschlichem Herz aufgereinigtes Zonulin enthielt, in ein Plastikröhrchen gegeben, das zuvor mit 0,1% (Gew./Vol.) Trifluoressigsäure (TFA) gewaschen worden war, und mit Methanol gespült. 75 μl einer Pufferlösung, die 100 mM Tris (pH 8,2), 10% (Vol./Vol.) CH₃CN und 1,0% (Vol./Vol.) dehydrogeniertes Triton X-100 enthielt, wurden zugegeben und 60 min bei 37°C mit der Membran inkubiert. Anschließend wurden 150 ng Trypsin zugegeben und eine zusätzliche Inkubation von 24 h bei 37°C durchgeführt. Die erhaltene Lösung wurde 10 min sonifiziert und der Überstand dekantiert. Anschließend wurden 75 μl 0,1 % (Gew./Vol.) TFA zugegeben und die Lösung weitere 10 min sonifiziert, und der Überstand wurde dekantiert. Beide Aliquots wurden auf eine 0,5 mm × 250 mm C₁₈-Säule, Partikelgröße 5,0 μm, Porengröße 300 A, aufgetragen. Ein Gradient von 0,1% (Gew./Vol.) TFA bis 45% CH₃CN + 0,1% (Gew./Vol.) TFA wurde über 2 h und 15 min aufgebaut. Die Peaks wurden schließlich gesammelt und sequenziert.
Die interne Sequenz von menschlichem Zonulin, das aus adultem menschlichem Herz aufgereinigt worden war, erwies sich als: Leu Ser Glu Val Thr Ala Val Pro Ser Leu Asn Gly Gly (SEQ ID NO:33).
Die interne Sequenz von menschlichem Zonulin wurde über BLAST-Suchanalyse mit anderen Proteinsequenzen verglichen. Das Ergebnis dieser Analyse zeigte, dass die interne Sequenz von menschlichem Zonulin 0% Identität zur irgendeiner internen Sequenz der schweren variablen Kette von IgM von Homo sapiens aufweist.
Die Ergebnisse des obigen Beispiels 3 zeigen, dass (1) Zonulin einen physiologischen Modulator des parazellulären Wegs darstellt; (2) die N-terminate Sequenz von Kaninchen-Zonulin in hohem Maße homolog ist zur N-terminalen Sequenz des Tau-Proteins; (3) Zonulin und Tau zwei unterschiedliche Einheiten sind, die immunologisch verwandt, jedoch funktional verschieden sind; (4) die N-terminale Sequenz von aus Herz und Intestinum gewonnenem menschlichem Zonulin in hohem Maße homolog ist zur N-terminalen Sequenz der schweren Kette der variablen Region von IgM; (5) menschliches Zonulin und IgM zwei unterschiedliche Einheiten sind, die strukturell verwandt, jedoch funktional verschieden sind; und (6) Zonulin eine Familie Tau-verwandter Proteine mit gemeinsamen, aktiven C-terminalen Sequenzen und variablen N-terminalen Sequenzen darstellt.
BEISPIEL 4
Peptidantagonisten von Zonulin
Angesichts der Tatsache, dass ZOT, menschliches intestinales Zonulin (Zonulin;) und menschliches Herz-Zonulin (Zonulin_h) alle auf intestinale (Fasano et al., Gastroenterology, 112:839 (1997); Fasano et al, J. Clin. Invest., 96:710 (1995); und 1–5) und endo theliale tj einwirken und alle drei eine ähnliche regionale Wirkung ausüben (Fasano et al (1997), supra; und 1–5), die mit der Verteilung von ZOT-Rezeptor im Intestinum übereinstimmt (Fasano et al (1997), supra; und Fasano et al (1995), supra), wurde in der vorliegenden Erfindung postuliert, dass diese drei Moleküle mit der gleichen Rezeptorbindungsstelle interagieren. Dementsprechend wurde ein Vergleich der Aminosäure-Primärstruktur von ZOT und der menschlichen Zonuline durchgeführt, um Einblicke in die absoluten Strukturerfordernisse der an der Regulation intestinaler tj beteiligten Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu liefern. Die Analyse der N-Termini dieser Moleküle offenbarte das folgende gemeinsame Motiv (Aminosäurereste 8-15, eingerahmt in 7): unpolar (Gly bei Intestinum, Val bei Gehirn), variabel, unpolar, variabel, unpolar, polar, variabel, polar (Gly). Gly in Position 8, Val in Position 12 und Gln in Position 13 sind in ZOT, Zonulin; und Zonulin_h alle in hohem Maße konserviert (siehe 7), was für die Rezeptorbindungsfunktion im Intestinum für wesentlich gehalten wird. Um dies zu verifizieren wurde das synthetische Octapeptid Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly (SEQ ID NO:15) (als FZI/0 bezeichnet und den Aminosäureresten 8-15 von menschlichem, fötalem Zonulin_i entsprechend) chemisch synthetisiert.
Danach wurde wie oben beschrieben in Ussing-Kammer aufgetragenes Kaninchen-Ileum 100 μg FZI/0 (SEQ ID NO:15), 100 μg FZI/1 (SEQ ID NO:34), 1,0 μg 6 × His-ZOT (wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten), 1,0 μg Zonulin; (wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten) oder 1,0 μg Zonulin_h (wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten) allein ausgesetzt; oder zuvor 20 min 100 μg FZI/0 oder FZI/1 ausgesetzt, wonach 1,0 μg 6 × His-ZOT, 1,0 μg Zonulin; oder 1,0 μg Zonulin_h zugegeben wurden. Anschließend wurde wie oben beschrieben ΔRt berechnet. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
Wie in 8 gezeigt, induzierte FZI/0 keine signifikante Veränderung von Rt (0,5% im Vergleich mit der Negativkontrolle) (siehe geschlossenen Balken). Im Gegensatz dazu verringerte eine 20minütige Vorbehandlung mit FZI/0 die Wirkung von ZOT, Zonulin_i und Zonulin_h auf Rt um 75%, 97% beziehungsweise 100% (siehe offenen Balken). Wie weiterhin in 8 gezeigt ist, wurde diese inhibitorische Wirkung vollständig aufgehoben, wenn ein zweites synthetisches Peptid (FZI/1) durch Austauschen von Gly in Position 8, Val in Position 12 und Gln in Position 13 (bezogen auf Zonulin;) durch die entsprechenden Aminosäurereste von Zonulin_b (Val, Gly beziehungsweise Arg) chemisch synthetisiert und verwendet wurde (siehe schraffierten Balken).
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass es eine sich zwischen dem Rest 8 und 15 des N-terminalen Endes von ZOT und der Zonulin-Familie erstreckende Region gibt, die für die Bindung an den Zielrezeptor wesentlich ist, und dass die Aminosäurereste in Position 8, 12 und 13 die Gewebespezifität dieser Bindung bestimmen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptidantagonist von Zonulin, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24, wobei der Peptidantagonist an einen Zonula occludens-Toxinrezeptor bindet, aber nicht das Öffnen von tight junctions bei einem Säuger physiologisch moduliert.
Peptidantagonist von Zonulin, bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24, wobei der Peptidantagonist an einen Zonula occludens-Toxinrezeptor bindet, aber nicht das Öffnen von tight junctions bei einem Säuger physiologisch moduliert, zur Verwendung als Medikament.
Peptidantagonist von Zonulin, bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24, wobei der Peptidantagonist an einen Zonula occludens-Toxinrezeptor im Intestinum eines Individuums bindet, aber nicht das Öffnen von tight junctions bei einem Säuger physiologisch in dem Intestinum moduliert, zur Verwendung bei der Behandlung gastrointestinaler Entzündung.
Peptidantagonist nach Anspruch 3 zur Verwendung bei der Behandlung von C. difficile-Infektion, Enterocolitis, Shigellose, viraler Gastroeneteritis, Parasiteninfestation, bakterieller Überwucherung, Whipple Krankheit, Gastritis, Magenkrebs, kollagenöser Colitis, inflammatorischer Darmerkrankung, kongenitaler intestinaler Lymphangiectasie, Sarkoidose Lymphom, mesenterischer Tuberkulose, post-operativer Korrektur kongenitaler Herzerkrankung mit Fontan'scher Operation, Ménétrier Krankheit, Zöliakie, eosinophiler Gastroenteritis, systemischem Lupus erythematosus oder Milchallergie.
Peptidantagonist von Zonulin, bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, wobei der Peptidantagonist an einen Zonula occludens-Toxinrezeptor im Intestinum eines Individuums bindet, aber nicht das Öffnen von tight junctions bei einem Säuger physiologisch in dem Intestinum moduliert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung gastrointestinaler Entzündung.
Verwendung eines Peptidantagonisten nach Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von C. difficile-Infektion, Enterocolitis, Shigellose, viraler Gastroeneteritis, Parasiteninfestation, bakterieller Überwucherung, Whipple Krankheit, Gastritis, Magenkrebs, kollagenöser Colitis, inflammatorischer Darmerkrankung, kongenitaler intestinaler Lymphangiectasie, Sarkoidose Lymphom, mesenterischer Tuberkulose, postoperativer Korrektur kongenitaler Herzerkrankung mit Fontan'scher Operation, Ménétrier Krankheit, Zöliakie, eosinophiler Gastroenteritis, systemischem Lupus erythematosus oder Milchallergie.