NO326552B1 - Peptidantagonist av zonulin, anvendelse av et peptid som motvirker apning av tette celle-celleforbindelser ved fremstilling av et medikament for behandling av inflammasjon i mage-tarmkanalen, peptid samt anvendelse av peptidet for fremstilling av et medikament. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse omfatter peptidantagonist av zonulin, anvendelse av et peptid som motvirker åpning av tette celle - celleforbindelser ved fremstilling av et medikament for behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen, peptid samt anvendelse av peptidet for fremstilling av et medikament. Peptidantagonistene bindes til zonula occludens-reseptoren, men modulerer likevel ikke fysiologisk åpning av tette celle

- celleforbindelser hos pattedyr.

O ppfinnelsens bakgrunn

I. Funksjon og regulering av tette celle - celleforbindelser i tarm

Tette celle - celleforbindelser ("tight junctions", "tj") eller zonula occludens i det (påfølgende betegnet "ZO") er et av kjennetegnene på absorberende og sekretorisk epitel (Madara, J. Clin. Invest., 83:1089-1094 (1989); og Madara, Textbook of Secretory Diarrhea Red. Lebenthal et al, kapittel 11, s 125 - 138 (1990). Som barriere mellom apikale og basolaterale seksjoner regulerer de selektivt passiv diffusjon av ioner og vannløselige forbindelser via den paracellulære vei (Gumbiner, Am. J. Physiol., 253 (Cell Physiol. 22): C749-C758 (1987)). Denne barriere opprettholder enhver gradient som dannes ved aktiviteten av reaksjonsveier forbundet med den transcellulære transportvei. (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)).

Variasjoner i den transepiteliale ledningsevne kan vanligvis tilskrives endringer i permeabiliteten av den paracellulære vei, siden motstanden i plasmamembranen hos enterocytter er relativt høy (Madara, supra). ZO representerer den viktigste barriere i denne paracellulære vei, og den elektriske motstand i epitelvev ser ut til å avhenge av antall transmembran-proteintråder og deres kompleksitet i ZO, som observert ved frysesnitt-elektronmikroskopi (Madara et al, J. Cell Biol., 101:2124-2133 (1985)).

Det foreligger et omfattende bevismateriale for at ZO, som tidligere ble betraktet som statiske strukturer, faktisk er dynamiske og lett tilpasses en rekke utviklingsmessige (Magnuson et al, Dev. Biol., 67:214-224 (1978); Revel et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 40:443-455 (1976); og Schneeberger et al, J. Cell Sei., 32:307-324 (1978)), fysiologiske (Gilula et al, Dev. Biol., 50:142-168 (1976); Madara et al, J. Membr. Biol.

100:149-164 (1987); Mazariegos et al, J. Cell Biol., 98:1865-1877(1984); og Sardet et al, J. Cell Biol., 80:96-117 (1979)) og patologiske (Milks et al, J. Cell Biol., 103:2729-2738

(1986); Nash et al, Lab. Invest., 59:531-537 (1988); og Shasby et al, Am. J. Physiol, 255 (Cell Physiol, 24):C781.C788 (1988))omstendigheter. De regulatoriske mekanismer som ligger til grunn for denne tilpasning er fortsatt ikke fullstendig forstått. Det er imidlertid klart at oppbygging av ZO i nærvær av Ca<2+> er en følge av cellulære interaksjoner som utløser en komplisert kaskade av biokjemiske begivenheter som til syvende og sist fører til dannelse og modulering av et organisert nettverk av ZO-elementer, hvis sammensetning kun delvis er karakterisert. (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)). En kandidat for transmembran-proteintrådene, occludin, har nylig blitt identifisert. (Furuse et al, J. Membr. Biol, 87 :141-150 (1985)).

Seks proteiner har blitt identifisert i en cytoplasmatisk submembran plakk som ligger under membrankontaktene, men disses funksjon er fortsatt ikke fastslått.

(Diamond, supra). ZO-1 og ZO-2 foreligger som en heterodimer (Gumbiner et al, Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 88:3460-3464 (1991)) i et detergent stabilt kompleks med et ikke karakterisert protein på 130 kD. (ZO-3). De fleste immunelektronmikroskopiske undersøkelser har lokalisert ZO-1 til nøyaktig under membrankontraktene. (Stevenson et al, Molec. Cell Biochem, 83:129-145 (1988)). To andre proteiner, cingulin (Citi et al, Nature (London), 333:272-275 (1988)) og 7H6-antigen (Zhong et al, J. Cell Biol, 120:477-483 (1993)) ligger lengre fra membranen og har ennå ikke blitt klonet. Rab 13,et lite GTP-bindende protein, har også nylig blitt lokalisert til koblingsområdet. (Zahraoui et al, J. Cell Biol, 124:101-115 (1994)). Andre små GTP-bindende proteiner vites å regulere det kortikale cytoskjelett, det vil si at rho regulerer actin-membrankoblingen i fokale kontakter (Ridley et al, Cell, 70:389-399 (1992)), og rac regulerer yekstfaktorindusert membranrynking (Ridley et al, Cell, 70:401-410 (1992)). Basert på analogi med de kjente funksjoner av plakk-proteiner i de bedre karakteriserte celle - celleforbindelser, fokale kontakter (Guan et al, Nature, 358:690-692 (1992)), og adherensforbindelser (Tsukita et al, J. Cell Biol, 123:1049-1053 (1993)), har det blitt foreslått at tj-assosierte plakkproteiner deltar i overføring av signaler i begge retninger over cellemembranen og i regulering av koblinger til det kortikale actincytoskjelett.

For å møte de mange forskjellige fysiologiske og patologiske utfordringer som epitel utsettes for må ZO være i stand til hurtige og koordinerte responser som krever nærvær av et komplisert regulatorisk system. Den nøyaktige karakterisering av mekanismene som inngår i oppbygning og regulering av ZO er et område som for tiden blir aktivt undersøkt.

Det foreligger nå omfattende bevismateriale for at strukturelle og funksjonelle tj-koblinger foreligger mellom actin-cytoskjelettet og tj-komplekset i absorberende celler (Gumbiner et al, supra; Madara et al, supra; og Drenchahn et al, J. Cell Biol, 107:1037-1048 (1988)). Actin-cytoskjelettet består av et komplisert nettverk av mikrofilamenter hvis nøyaktige geometri reguleres av en stor samling av actinbindende proteiner. Et eksempel på hvordan fosforyleringstilstanden til et actin-bindende protein kan regulere koblingen av cytoskjelettet til cellens plasmamembran er det myristoylerte alaninrike C-kinasesubstrat (i det påfølgende betegnet "MARCKS"). MARCKS er et spesifikt protein kinase C (i det påfølgende betegnet "PKC") substrat som er forbundet med den cytoplasmatiske side av plasmamembranen (Aderem, Elsevier Sei. Pub. (UK), s. 438-443

(1992)). I sin ikke-fosfyrolerte form er er MARCKS kryssbundet til actin i membranen. Således er det sannsynlig at actinnettverket som er forbundet med membranen via MARCKS er relativt stivt. (Hartwig et al, Nature, 356:618-622 (1992)). Aktivert PKC fosforylerer MARCKS, som frigis fra membranen. (Rosen et al, J. Exp. Med, 172:1211-1215 (1990); og Thelen et al, Nature, 351:320-322 (1991)). Actin bundet til MARCKS vil sannsynligvis bli rommelig atskilt fra membranen og vil være mer plastisk. Ved defosforylering av MARCKS vender proteinet tilbake til membranen hvor det igjen kryssbinder actin (Hartwig et al, supra; og Thelen et al, supra). Disse resultater tyder på at F-actinnettverket kan rearrangeres ved en PKC-avhengig fosforyleringsprosess som omfatter actinbindende proteiner (av hvilke ett er MARCKS).

En rekke intracellulære mediatorer har blitt vist å endre funksjon og/eller struktur av tj. tette celle - celleforbindelser i gallebære hos amfibier (Duffey et al, Nature, 204:451-452 (1981)), og tarm fra både gullfisk (Bakker et al, Am. J. Physiol, 246:G213-G217 (1984)) og flyndre (Krasney et al, Fred. Proe, 42:1100 (1983)) viser forhøyet motstand mot passiv ioneflyt når konsentrasjonen av intracellulær cAMP forhøyes. Videre synes forhandling av galleblære fra amfibier med Ca -ionofor å forhøye tj-motstanden og indusere endringer i tj-strukturen (Palant et al, Am. J. Physiol, 245:C203-C212 (1983)). Videre gir aktivering av PKC ved forbolestere forhøyet paracellulær permabilitet i epitelcellelinjer både fra nyre (Ellis et al, C. Am. J. Physiol, 263 (Renal Fluid Electrolyte Physiol. 32:F293-F300 (1992)), og tarm (Stenson et al, C. Am. J. Physiol, 265 (Gastrointest. Liver Physiol, 28): G955-G962 (1993)).

II. Blod - hjerne barrieren

Blod - hjerne barrieren (BBB) er en ekstremt tynn membranbarriere som er svært motstandsdyktig mot fri diffusjon av oppløste stoffer og som skiller blod fra hjerne. I molekulære dimensjoner er bevegelse av medikamenter eller oppløste stoffer gjennom denne membranen praktisk talt null, med mindre forbindelsen har tilgang på en av flere spesialiserte, enzymlignende transportmekanismer som er innbakt i BBB-membranen. BBB består av flere celler, snarere enn av et enkelt lag av epitelceller. Av de fire forskjellige celletyper som utgjør BBB (endotelceller, perycytter, astrocytter og neuroner) representerer endotelcelledelen av kapillærene den begrensende faktor for pereabiliteten av BBB. Kapillærendotel i vertebrathjerne og -ryggmarg besitter tj som stenger interendotelporene som normalt foreligger i mikrovaskulære endotelbarrierer i perifere vev. Til syvende og sist er endotel-tj ansvarlig for den begrensede permiabilitet av BBB.

III. Zonula Occludens- toksin

De fleste vibrio cholerae vaksinekandidater konstruert ved å delere ctxA-genet, som koder for koleratoksin (CT), er i stand til å utløse kraftige antistoffresponser, men mer enn halvparten av vaksinene gir fortsatt en mild diaré (Levine et al, Infect. Immun, 56(1): 161-167 (1988)). Ut fra omfanget av diaré indusert i fravær av CT ble det foreslått at V. cholerae produserer andre enterotoksigene faktorer som fortsatt foreligger i stammer hvor ctxA-sekvensen er delert (Levine et al, supra). Som en følge av dette ble et annet toksin, zonula occludens-toksin (i det påfølgende betegnet "ZOT", som produseres av V. cholerae og som bidrar til gjenværende diaré, oppdaget. (Fasano et al, Proc.Natl. Acad. Sei, USA 8:5242-5246 (1991)). Zot-genet ligger like ved siden av ctx-genene. Den høye prosent av samtidig forekomst av zot-genet og ctx-genene blant V. cholerae-stammer (Johnson et al, J. Clin. Microb, 31/3:732-733 (1993); og Karasawa et al, FEBS Microbiology Letters, 106:143-146 (1993)) tyder på en mulig synergistisk rolle for ZOT i utløsningen av den akutte dehydrerende diaré som er typisk for kolera. Nylig har zot-genet også blitt identifisert i andre enteriske patogene organismer (Tschape, 2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and other Salomellosis, 47 (Abstr.) (1994)).

Det har tidligere blitt vist at ZOT, ved analyse på slimvev fra ileum hos kanin, øker tarmens permeabilitet ved å modulere strukturen av intracellulær tj (Fasano et al, supra). Det har blitt funnet at tarmens slimvev blir mer permeabelt som en følge av modifikasjon av den paracellulære vei. Det ble også funnet at ZOT ikke påvirker Na<+->glukosekoblet aktiv transport, ikke er cytotoksisk og ikke fullstendig fjerner transepitelmotstanden (Fasano et al, supra).

Senere har det blitt funnet at ZOT reversibelt kan åpne tj i slimvev fra tarm og at ZOT således, ved tilførsel sammen med et terapeutisk middel, kan tillate tilførsel av tarmen av det terapeutiske middel ved benyttelse i et preparat for oral tilførsel for levering av medikamenter til tarm (WO 96/37196; U.S. patentsøknad nr 08/443 864, innlevert 24 mai 1995, og U.S. patentskrift nr. 5 665 389; samt Fasano et al, J. Clin. Invest, 99:1158-1164 (1997); som alle inkorporeres heri ved referanse i sin helhet). Det har også blitt funnet at ZOT kan gi reversibel åpning av tj i slimvev i nese og at ZOT således, ved samtidig tilførsel med et terapeutisk middel, kan gi forhøyet nasal absorpsjon av et terapeutisk middel (U.S. patentsøknad nr 08/781 057, innlevert 9. januar 1997, som inkorporeres heri i sin helhet ved referanse).

I U.S. patentsøknad nr 08/803 364, innlevert 20. februar 1997, som inkorporeres heri i sin helhet ved referanse, har en ZOT-reseptor blitt identifisert og renset fra en tarmcellelinje, det vil si CaCo2-celler. Videre har i U.S. patentsøknad nr 09/024 198, innlevert 17. februar 1998, som inkorporeres heri i sin helhet ved referanse, ZOT-reseptorer fra tarmvev, hjertevev og hjernevev fra menneske blitt identifisert og renset. ZOT-reseptorene representerer det første trinn i den paracellulære vei som inngår i regulering av permeabilitet i tarm og nese.

IV. Zonulin

I den ennå ikke avgjorte U.S. patentsøknad nr 098/859 931, innlevert 21. mai 1997, som inkorporeres heri i sin helhet ved referanse, har pattedyrsproteiner som er

immunologisk og funksjonelt beslektet med ZOT, og som fungerer som den fysiologiske modulator av tette celle - celleforbindelser hos pattedyr, blitt identifisert og renset. Disse pattedyrsproteiner, som betegnes "zonulin", er anvendbare for å forhøye absorpsjonen av terapeutiske midler over tj i slimvev i tarm og nese, så vel som over tj i blod - hjerne barrieren.

I foreliggende oppfinnelse har for første gang peptidantagonister av zonulin blitt identifisert. Disse peptidantagonistene bindes til ZOT-reseptoren, men vil likevel ikke gi fysiologisk modulering av åpningen av tette celle - celleforbindelser hos pattedyr. Peptidantagonistene inhiberer kompetitivt binding ZOT og zonulin til ZOT-reseptoren og vil derved inhibere evnen ZOT og zonulin til fysiologisk modulering av åpning av tette celle - celleforbindelser hos pattedyr.

Det kan videre henvises til W09852415, Baudry et al, Infection and Immunity vol. 60,1992, s. 428-434, EP 557897 og WO 9733909.

O ppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter peptidantagonist av zonulin,

kjennetegnet ved at den omfatter en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av

SEQ.ID.NO: 1, SEQ.ID.NO: 2, SEQ.ID.NO:3, SEQ.ID.NO: 4, SEQ.ID.

NO: 5, SEQ.ID.NO: 6, SEQ.ID.NO: 7, SEQ.ID.NO: 8, SEQ.ID.NO: 9, SEQ.ID.

NO: 10, SEQ.ID.NO: 11, SEQ.ID.NO: 12, SEQ.ID.NO: 13, SEQ.ID.NO: 14, SEQ.ID.NO: 15, SEQ.ID.NO: 16, SEQ.ID.NO: 17, SEQ.ID.NO: 18, SEQ.ID.NO: 19, SEQ.ID.NO: 20, SEQ.ID.NO: 21, SEQ.ID.NO: 22, SEQ.ID.NO: 23, SEQ.ID.NO: 24 og SEQ.ID.NO: 35, hvori peptidantagonisten bindes til en zonula occludens-toksinreseptor, men likevel ikke fysiologisk modulerer åpningen av tette celle - celleforbindelser hos pattedyr.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av et peptid som motvirker åpning av tette celle - celleforbindelser ved femstilling av et medicament for behandling av inflammasjon I mage - tarmkanalen, hvori peptidet består av en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ.ID.NO: 1, SEQ.ID.NO: 2, SEQ.ID.NO: 3,

SEQ.ID.NO: 4, SEQ.ID.NO: 5, SEQ.ID.NO: 6, SEQ.ID.NO: 7, SEQ.ID.NO: 8,

SEQ.ID.NO: 9, SEQ.ID.NO: 10, SEQ.ID.NO: 11, SEQ.ID.NO: 12, SEQ.ID.NO: 13, SEQ.ID.NO: 14, SEQ.ID.NO: 15, SEQ.ID.NO: 16, SEQ.ID.NO: 17, SEQ.ID.NO: 18, SEQ.ID.NO: 19, SEQ.ID.NO: 20, SEQ.ID.NO: 21, SEQ.ID.NO: 21, SEQ.ID.NO: 22, SEQ.ID.NO: 23 og SEQ.ID.NO: 24.

Også omfattet av oppfinnelsen er et peptid, kjennetegnet ved at det består av aminosyresekvensen som angitt i SEQ.ID.NO: 15.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av et peptid som består av aminosyresekvensen som angitt i SEQ.ID.NO: 15 for fremstilling av et medikament for behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen.

Et formål med foreliggende oppfinnelse er å identifisere peptidantagonister av zonulin.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å syntetisere og rense disse peptidantagonistene.

Ytterligere et formål med foreliggende oppfinnelse er å anvende peptidantagonistene som antiinflammatoriske midler i behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen.

Nok et formål med foreliggende oppfinnelse er å anvende peptidantagonistene for å inhibere nedbrytning av blod - hjernebarrieren.

Disse og andre formål med foreliggende oppfinnelse, som vil være åpenbare ut fra den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen som gis i det påfølgende, har i én utførelse blitt oppfylt ved en peptidantagonist av zonulin som omfatter en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ.ID.NO: 1, SEQ.ID.NO: 2,

SEQ.ID.NO: 3, SEQ.ID.NO: 4, SEQ.ID.NO: 5, SEQ.ID.NO: 6, SEQ.ID.NO: 7,

SEQ.ID.NO: 8, SEQ.ID.NO: 9, SEQ.ID.NO: 10, SEQ.ID.NO: 11, SEQ.ID.NO: 12,

SEQ.ID.NO: 13, SEQ.ID.NO: 14, SEQ.ID.NO: 15, SEQ.ID.NO: 16, SEQ.ID.NO: 17, SEQ.ID.NO: 18, SEQ.ID.NO: 19, SEQ.ID.NO: 20, SEQ.ID.NO: 21, SEQ.ID.NO: 22, SEQ.ID.NO: 23, SEQ.ID.NO: 24 og SEQ.ID.NO: 35, hvori peptidantagonisten bindes til en ZOT-reseptor uten å fysiologisk modulere åpning av tette celle - celleforbindelser hos pattedyr.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser virkningen av zonulin renset fra kanintarm (v), sammenlignet med forskjellig negative kontroller (fraksjon 2 (0); fraksjon 3 ( X) ; fraksjon 4 (a); og fraksjon 5 (□) fra en Q-sefarose-kolonne) på vevsmotstanden (Rt) i encellelag av CaCo2. Figur 2 viser virkningen av zonulin renset fra kanintarm (v), sammenlignet med den negative kontroll (□), på vevsmotstanden (Rt) for ileum fra kanin montert i Ussing-kammere. Figur 3 viser virkningen av zonulin renset fra kanintarm (v), sammenlignet med de negative kontroller (zonulin + anti-ZOT-antistoff (□); zonulin + anti-tau-antistoff (A); og tau ( a)), på vevsmotstanden (Rt) i ileum fra kanin montert i Ussing-kammere. Figurene 4A og 4B viser effekten av renset zonulin enten fra human hjerne(a), human tarm ( X), eller humant hjerte (O), sammenlignet med den negative kontroll (□), på vevsmotstanden (Rt) i jejunum fra Rhesus-ape (figur 4A) og ileum fra Rhesus-ape (figur 4B) montert i Using-kammere. Figurene 5A og 5B viser virkningen av zonulin renset fra enten humant hjerte (a) eller human hjerne (□), sammenlignet med den negative kontroll (v), på vevsmotstanden (Rt) i jejunum fra kanin (figur 5 A) og ileum fra kanin (figur 5B) montert i Ussing-kammere. Figur 6 viser en sammenligning mellom den N-terminale sekvens av zonulin renset fra kanin og forskjellige humane vev. Figur 7 viser en sammenligning av den N-terminale sekvens av zonulin renset fra forskjellige humane vev og IgM-tungkjede med den N-terminale sekvens av det biologisk aktive fragment (aminosyrene 288-399) av ZOT. Figur 8 viser virkningen av ZOT, zonulin; og zonulinh, enten alene (fylte søyler) eller i kombinasjon med peptidantagonisten FZI/0 (åpne søyler), eller i kombinasjon med FZI/1 (skraverte søyler), sammenlignet med den negative kontroll, på vevsmotstanden (Rt) i ileum fra kanin montert i Ussing-kammere. N er lik 3- 5, og <*> angir p<0,01.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som diskutert ovenfor har det ovenfor beskrevne formål blitt oppfylt ved en peptidantagonist av zonulin som omfatter en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ.ID.NO: 1, SEQ.ID.NO: 2, SEQ.ID.NO: 3, SEQ.ID.NO: 4, SEQ.ID.NO: 5, SEQ.ID.NO: 6, SEQ.ID.NO: 7, SEQ.ID.NO: 8, SEQ.ID.NO: 9, SEQ.ID.NO: 10, SEQ.ID.NO: 11, SEQ.ID.NO: 12, SEQ.ID.NO: 13, SEQ.ID.NO: 14, SEQ.ID.NO: 15, SEQ.ID.NO: 16, SEQ.ID.NO: 17, SEQ.ID.NO: 18, SEQ.ID.NO: 19, SEQ.ID.NO: 20, SEQ.ID.NO: 21, SEQ.ID.NO: 22, SEQ.ID.NO: 23, SEQ.ID.NO: 24 og SEQ.ID.NO: 35, hvori peptidantagonisten bindes til ZOT-reseptoren, men likevel ikke gir fysiologisk modulering av åpning av tette celle - celleforbindelser hos pattedyr.

Peptidantagonistens størrelse er ikke vesentlig ifølge foreliggende oppfinnelse. Generelt vil peptidantagonistens størrelse variere fra 8 til 110 aminosyrer, fortrinnsvis fra 8 til 40 aminosyrer, og vil mer foretrukket være 8 aminosyrer.

Peptidantagonistene kan syntetiseres kjemisk og renses ved anvendelse av velkjente teknikker, for eksempel som beskrevet i High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins:Separation Analysis and Conformation, Red. Mant et al, C.R.C. Press (1991), og et peptidsynteseinstrument, for eksempel Symphony (Protein Technologies, Inc); eller ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikker, det vil si hvor nukleotidsekvensen som koder for peptidet innsettes i en egnet ekspresjonsvektor, for eksempel en ekspresjonsvektor for E. coli eller gjær, uttrykkes i den angjeldende vertscelle og renses derfra ved anvendelse av velkjente teknikker.

Peptidantagonistene kan anvendes som antiinflammatoriske midler for behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen, som forårsaker forhøyet tarmpermeabilitet. Således er peptidantagonistene som beskrevet heri for eksempel anvendbare ved behandling av tarmtilstander som gir enteropati med proteintap. Enteropati med proteintap kan oppstå grunnet: Infeksjon, for eksempel c. difficile- infeksjon, enterokolitt, shigellose, viral

gastrenteritt, parasittinfeksjon, bakteriell overvekst, Whipples sykdom,

sykdommer med erosjon av, eller sårdannelse i slimvevet, for eksempel

gastritt, magecancer, kollagenøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom,

sykdommer som særpreges ved lymfatisk obstruksjon, for eksempel medfødt lymfangiektasia intestinalis, sarcoidosis lymphoma, mesenterisk tuberkulose og etter kirurgisk korreksjon av medfødt hjertesykdom ved Fontans operasjon,

slimhinnesykdommer uten sårdannelse, for eksempel Ménétriers sykdom,

cøliaki, eosinofil gasroenteritt, og

immusykdommer, for eksempel systemisk lupus erythematosus eller matallergier, primært overfor melk (se også tabell 40-2 i Pediatric Gastrointestinal Disease Pathophysiology Diagnosis Management, Red. Wyllie et al, Saunders Co.

(1993), s. 536-543; som inkorporeres heri i sin helhet ved referanse).

I en annen utførelse er det beskrevet en fremgangsmåte for behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen, som omfatter tilførsel til et individ med behov for slik behandling av en farmasøytisk effektiv mengde av en peptidantagonist av zonulin, hvori peptidantagonisten omfatter en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ.ID.NO: 1, SEQ.ID.NO: 2, SEQ.ID.NO: 3, SEQ.ID. NO: 4, SEQ.ID.NO: 5,

SEQ.ID.NO: 6, SEQ.ID.NO: 7, SEQ.ID.NO:8, SEQ.ID.NO: 9, SEQ.ID.NO: 10,

SEQ.ID .NO: 11, SEQ.ID.NO: 12, SEQ.ID.NO: 13, SEQ.ID.NO: 14, SEQ.ID.NO: 15, SEQ.ID.NO: 16, SEQ.ID.NO: 17, SEQ.ID.NO: 18, SEQ.ID.NO: 19, SEQ.ID.NO: 20, SEQ.ID.NO: 21, SEQ.ID.NO: 22, SEQ.ID.NO: 23 og SEQ. ID.

NO: 24, hvori peptidantagonisten bindes til ZOT-reseptoren i individets tarm uten å gi fysiologisk modulasjon av åpning av tette celle - celleforbindelser i tarmen.

For dette formål kan peptidantagonistene tilføres som preparater for oral dosering for tilførsel til tynntarmen. Slike preparater for oral dosering for tilførsel til tynntarmen er velkjente innen faget og omfatter generelt gastroresistente tabletter eller kapsler (Remintons Pharmaceutical Sciences, 16. utgave. Red. Osol, Mack Publishing Co, Kapittel 89 (1980); Digenis et al J. Pharm. Sei, 83:915-921 (1994); Vantini et al, Clinica Terapeutica, 145:445-451 (1993); Yoshitomi et al, Chem. Pharm. Bull, 40:1902-1905 (1992); Thoma et al, Pharmazie, 46:331-336 (1991); Morishita et al, Drug Design and Delivery, 7:309-319 (1991); og Lin et al, Pharmaceutical Res, 8:919-924 (1991)); som alle inkorporeres heri i sin helhet ved referanse).

Tabletter gjøres gastroresistente ved tilsetning av for eksempel enten celluloseacetat-ftalat eller celluloseacetat-tereftalat.

Kapsler er faste doseringsformer i hvilke peptidantagonisten eller -antagonistene er innelukket i enten en hard eller myk, løselig beholder eller et skall av gelatin. Gelatinet som anvendes ved fremstilling av kapsler erholdes fra kollagenøst materiale ved hydrolyse. Det finnes to typer gelatin. Type A, avledet fra svinehud ved syrebehandling og type B, erholdt fra bein og dyrehud ved alkalisk behandling. Anvendelse av kapsler av hard gelatin tillater at en enkel peptidantagonist eller en kombinasjon av slike forordnes i det nøyaktige doseringsnivå som anses best for enkeltpasienten. Den harde gelatinkapsel består av to deler, en som strekker seg over den andre, slik at peptidantagonisten er fullstendig innelukket. Disse kapsler fylles ved å innføre peptidantagonisten eller gastroresistente kuler som inneholder peptidantagonisten i kapselens lengste ende og deretter sette på lokkdelen. Harde gelatinkapsler fremstilles hovedsakelig av gelatin, FD&C-fargestoffer og, noen ganger, et dekkmiddel som titandioksid. USP tillater at gelatin anvendt for dette formål inneholder 0,15 %, (vekt/vol) svoveldioksid for å hindre nedbrytning under fremstillingen.

I forbindelse med foreliggende beskrivelse omfatter preparater for oral dosering for tilførsel til tynntarmen også flytende preparater som inneholder vandige buffringsmidler som forhindrer at peptidantagonisten i vesentlig grad inaktiveres av magesaften i magen, noe som tillater at peptidantagonisten når tynntarmen i aktiv form. Eksempler på slike vandige buffringsmidler som kan benyttes ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter bikarbonatbuffer (pH 5,5 til 8,7, fortrinnsvis tilnærmet pH 7,4).

Dersom preparatet for oral dosering er et flytende preparat, foretrekkes det at preparatet fremstilles like før tilførsel, slik at stabilitetsproblemene minimaliseres. I dette tilfelle kan det flytende preparat fremstilles ved å løse frysetørket peptidantagonist i det vandige bufifringsmiddel.

Peptidantagonistene kan anvendes for å inhibere nedbrytning av blod - hjerne barrieren. Således er peptidantagonistene som beskrevet heri anvendbare ved for eksempel behandling av tilstander forbundet med nedbrytning av blod - hjerne barrieren. Eksempler på slike tilstander omfatter osmotiske skader, for eksempel cerebral ischemi, slag eller cerebral ødem, hypertensjon, karbondioksid, kramper, kjemiske toksiner, uremi (nyresvikt), meningitt, encefalitt, encofalomyelitt, for eksempel infeksiøs (viral (SRV, HIV osv) eller bakteriell (TB, H. influenzae, meningokokker, osv) eller allergisk, tumorer, traumatiske hjerneskader, hjerneskade grunnet stråling, umodenhet og Kernicterus; demyelinerende sykdommer, for eksempel multippel sklerose eller Guillian-Barre-syndrom.

I en annen utførelse gjelder således foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for behandling av tilstander forbundet med nedbrytning av blod - hjerne barrieren som omfatter tilførsel til et individ med behov for slik behandling av en farmasøytisk effektiv mengde av en peptidantagonist av zonulin, hvori peptidantagonisten omfatter aminosyresekvensen SEQ.ID.NO. 35, hvori peptidantagonisten bindes til ZOT-reseptoren i individets hjerne uten å gi fysiologisk modulering av åpning av tette celle - celleforbindelser i hjernen.

For dette formål kan peptidantagonistene tilføres som preparater for intravenøs dosering for tilførsel til hjernen. Slike preparater er velkjente innen faget, og de omfatter generelt et fysiologisk fortynningsmiddel, for eksempel destillert vann eller 0,9 (vekt/vol) NaCl.

Den farmasøytisk effektive mengde av peptidantagonisten som benyttes er ikke kritisk ifølge foreliggende oppfinnelse, og vil variere avhengig av sykdommen eller tilstanden som behandles så vel som alder, vekt og kjønn av individet som behandles. Generelt ligger mengden av peptidantagonist som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse for inhibering av inflammasjon i mage - tarmkanalen eller inhibering av nedbrytning av blod - hjerne barrieren, for eksempel for å inhibere den biologiske aktivitet av zonulin, i området fra tilnærmet 7,5 x 10 "6 M til 7,5 x 10"3M, fortrinnsvis tilnærmet 7,5 x 10 "6 M til 7,5 x lO^M. For å oppnå en slik sluttkonsentrasjon i for eksempel tarm eller blod vil mengden peptidantagonist i en enkel oral dose av preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse generelt være fra tilnærmet 1,0 ug til 1 000 ug, fortrinnsvis fra 1,0 ug til 100 ug.

Peptidantagonistene kan også anvendes som et immunogen for erholdelse av antistoffer, enten polyklonale eller monoklonale, med bindingsspesifisitet for zonulin, ved anvendelse av teknikker som er velkjente innen faget (Abrams, Methods Ezymol, 121:107-119 (1986)). Disse antistoffer kan i sin tur anvendes for analyse av zonulin i kroppsvev eller kroppsvæsker eller ved affinitetsrensing av zonulin eller alternativt for binding til zonulin og derved inhibering av zonulinaktiviteten, for eksempel for å inhibere inflammasjon i mage - tarmkanalen eller inhibere nedbrytning av blod - hjerne barrieren.

De påfølgende eksempler gis kun for å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

Rensing av ZOT

5 000 ml av supematantfraksjonen erholdt etter dyrking av V. c/zø/erøe-stamme CVD110 (Michalski et al, Infect. Immun, Gl .4462-4468 (1993), transformert med plasmid pZ14, ble konsentrert 1 000 ganger ved anvendelse av et filter med laminær gjennomstrømming med en molekylvekstsgrenseverdi på 10 kDa. Konstruksjon av pZ14, som inneholder ZOT-genet fra Vibrio cholera er beskrevet i detalj i blant annet WO 96/37196. Den resulterende supernatant ble så fraksjonert ved 8,0 % (vekt/vol) SDS-PAGE. Proteinbåndene ble påvist med farging med Coomassie blue av SDS-PAGE-gelen. Ingen proteinbånd som tilsvarte ZOT kunne påvises ved sammenligning med kontrollsupernatant fra stamme CVD110 transormert med plasmid (pTTQ 181 (Amersham, Arlington Heights, IL), og behandlet på samme måte. Selv om ZOT-genet var plassert bak den sært induserbare og kraftige tac-promoter i pZ14, var således proteinnivået i 1 000 ganger konsentrert pZ14-supernantant fortsatt ikke påvisbart ved Coomassie-farging av SDS-PAGE-gelen.

A. MBP- ZOT

For å øke den produserte mengde ZOT ble ZOT-genet fusjonert med opprettholdelse av leserammen til maltosebindende protein (i det påfølgende betegnet "MBP")-genet for dannelse av et MBP-ZOT-fusjonsprotein.

MBP-vektoren pMAL-c2 (Biolab) ble anvendt for ekspresjon og rensing av ZOT ved å fusjonere ZOT-genet til malE-genet fra E. coli. Denne konstruksjon anvender den kraftige, induserbare tac-promoteren og malE-translasjonsinitieringssignalene for å oppnå ekspresjon i høyt nivå av det klonede ZOT-gen. Vektoren pMAL-c2 har en nøyaktig delesjon av malE-signalsekvensen, noe som fører til cytoplasmatisk ekspresjon av fusjonsproteinet. Affinitetskromatografirensing av MBP ble benyttet for å lette rensingen av fusjonsproteinet (Biolab).

Nærmere bestemt ble vektor pMAL-c2 linearisert med EcoRI (som kutter i den 3' ende av malE-genet), endene ble utfylt med Klenow-fragment, og plasmidet kuttet med Xbal (som har et enkelt sete i polylinkeren i pMAL-c2). orf som koder for ZOT ble subklonet fra plasmid pBB241 (Baudry et al, Infect. Immun, 60:428-434 (1992)). Plasmid pBB241 ble kuttet med BssHII, endene ble utfylt med Klenow-fragment, og plasmidet kuttet med Xbal. Deretter ble buttendede Xbal-fragment subklonet i pMAL-c2 for erholdelse av plasmid pLC10-c. Siden både innskudd og vektor hadde butte og klebrige ender, ble den korrekte orientering erholdt, med 3' ende av malE koblet til innskuddets 5' ende. pLC10-c ble så elektroporert inn i E. co//-stamme DH5a. I pBB241 ligger BssHII-restriksjonssetet i orf for ZOT. Således mangler aminosyrene 1 - 8 fra ZOT i MBP-ZOT-fusjonsproteinet.

For rensing av MBP-ZOT-fusjonsproteinet ble 10 ml Luria-Bertani-medium tilsatt 0,2 % (vekt/vol) glukose og 100 ug/ml aplicillin inokkulert med en enkelt koloni som inneholdt pLC10-c og inkubert over natten ved 37 °C under omrysting. Kulturen gle fortynnet 1:100 i 1,0 ml av det samme medium og dyrket ved 37 °C under omrysting til tilnærmet 1,0 x IO<8> celler/ml. 0.2 mM IPTG ble så tilsatt for induksjon av MBP-ZOT-ekspresjonen, og kulturen ble inkubert ved 37 °C i ytterligere 3 timer. Bakteriene ble så nedsentrifugert og resuspendert i 20 ml iskald "kolonnebuffer" som inneholdt 20 mM Tris HC1,0,2 M NaCL, 1,0 mM EDTA, 10 mM 2-ME, 1,0 mM NaN3. Bakteriesuspensjonen ble lysert ved behandling i en "french"-presse og sentrifugert i 30 minutter ved 13 000 x g ved 4 °C. Supernatanten ble oppsamlet, fortynnet 1:5 med kolonnebuffer og påsatt en 1 x 10 kolonne med amyloseresin (Biolabs, MBP-fusjonsrensingssystem) pre-ekvillibrert med kolonnebuffer. Etter vask av denne kolonne med 5 volumer kolonnebuffer ble MBP-ZOT-fusjonsproteinet eluert ved å påsette 10 ml 10 mM maltose i kolonnebuffer. Typisk utbytte fra 1,0 ml kultur var 2-3 mg protein.

MBP-fusjonspartnere i det rensede MBP-ZOT-fusjonsprotein ble så frakløyvet ved anvendelse av 1,0 ug faktor Xa-protease (Biolabs) pr 20 ug MBP-ZOT. Faktor Xa-protease kløyver like før aminoenden av ZOT. Det således erholdte ZOT-protein ble fraksjonert i en 8,0 % (vekt/vol) SDS-PAGE-gel og elektroeluert fra gelen ved anvendelse av et elektroseparasjonskammer (Schleicher & Schuell, Keene, NH).

Ved analyse i Ussing-kammere induserte det resulterende rensede ZOT en doseavhengig reduksjon av Rt med en ED50 på 7,5 x 10"<8> M.

B. 6xHis- ZOT

ZOT-genet ble amplifisert ved PCR med Deep Vent polymerase (New England Biolabs) og PBB241-plasmid (Baudry et al, supra)-DNA som templat. Den benyttede forlengs og revers primer var 5*-CGGGATCCCGTATGAGTATCTTT-3* SEQ.ID.NO.

39);henholdsvis 5-CCCAAGCTTGGGTCAAAATATACT-3 (SEQ.ID.NO.40). 5'-enden av disse oligonukleotider inneholder et BamHI- henholdsvis et Hindlll-restriksjonssete. Det resulterende amplikon (1,2 kb) ble analysert ved 8,0 % (vekt/vol) agarosegelelektroforese og renset fra salter og frie nukleotider ved anvendelse av Xtreme

sentrifugeringskolonne (Pierce). De to ovenfor angitte restriksjonsenzymene ble så anvendt for kutting av det rensede amplikon og det resulterende, kuttede amplikon ble så

innsatt i vektoren PQE30 (Quiagen), som på forhånd var kuttet BamHI og Hindlll, for erholdelse av plasmid pSUl 13. pQE30 er en ekspresjonsvektor som gir ekspresjon i høyt nivå av et rekombinant protein med en 6-polyhistidin-merkelapp (6xHis). Ekspresjons-produktet fra plasmid pSUl 13 er således et 6xHis-ZOT-fusjonsprotein. pSUl 13 ble så transformert inn i E. coli DH5a.

For rensing av 6xHis-ZOT ble den resulterende transformerte E. coli dyrket over natten ved 37 °C i 150 ml Luria-Bertani-medium tilsatt 2,0 % (vekt/vol) glukose, 25 ug/ml kanamycin og 200 ug/ml ampicillin inntil A60o var tilnærmet 1,10. Deretter ble 75 ml av over natten-kulturene tilsatt til 1 000 ml Luria-Bertani-medium tilsatt 2,0 %

(vekt/vol) glukose, 25 ug/ml kanamycin og 200 ug/ml ampicillin, og inkubert i tilnærmet

3 timer ved 37 °C under kraftig omrysting inntil A60o var tilnærmet 0,7-0,9. Deretter ble

IPTG tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 2,0 mM, og celleveksten fikk fortsette i 5 timer ved 37 °C. Så ble cellene høstet ved sentrifugering ved 4 000 x g i 20 minutter, resuspendert i 5,0 ml/g våtvekt av buffer A inneholdende 6,0 M GuHCl, 0,1 M natriumfosfat og 0,01 M Tris-HCl (pH 8,0), og omrørt i 1 time ved romtemperatur. Blandingen ble så sentrifugert ved 10 000 x g i 30 minutter ved 4 °C, og den resulterende supernatant ble tilsatt 4,0 - 5,0 ml/g våtvekt av en 50 % suspensjon av SUPERFLOW-resin (QIAGEN), og blandingen ble omrørt i 1 time ved romtemperatur. Den resulterende resin ble fylt i en 1,6 x 8,0 kolonne som så ble vasket, først med buffer A, så med buffer B inneholdende 8,0 M urea, 0,1 M natriumfosfat og 0,01 M Tris HC1 (pH 8,0) og buffer C inneholdende 8,0 M urea, 0,1 M natriumfosfat og 0,01 M Tris-HCl (pH 6,3). Hver vask ble utført inntil A60o av eluatet var mindre enn 0,01. 6xHis-ZOT-fusjonsproteinet ble eluert fra kolonnen med 20 ml buffer C tilsatt 250 mM imidazol. Deretter ble fraksjoner som inneholdt 6xHis-ZOT-fusjonsproteinet identifisert ved SDS-PAGE ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av Davis, Ann. N.Y. Acad. Sei, 121:404 (1964) og gelen farget med Coomassie blue. Fraksjonene som inneholdt 6xHis-ZOT-fusjonsprotein ble dialysert mot 8,0 M urea, slått sammen og så fortynnet 100 ganger med PBS. Deretter ble 4,0 ml av en 50 % suspensjon av SUPERFLOW-resin tilsatt, blandingen ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur, og den resulterende resin ble fylt i en 1,6 x 8,0 kolonne som så ble vasket med 50 ml PBS. 6xHis-ZOT-fusjonsprotein ble eluert fra kolonnen med 10 ml PBS tilsatt 250 mM imidazol. Det resulterende eluat ble dialysert mot PBS og 6xHis-ZOT-fusjonsproteinet kontrollert ved SDS-PAGE som beskrevet ovenfor.

Eksempel 2

Fremstilling av affinitetsrensede anti- ZOT- antistoffer

For erholdelse av spesifikt antiserum ble et kimært glutation S-transferase (GST)-ZOT-protein uttrykt og renset.

Nærmere bestemt ble oligonukleotidprimere anvendt for amplifisering av den åpne leseramme for zot ved polymerase-kjedereaksjonen (PCR) med plasmid pBB241 (Baudry et al, supra som templat-DNA. Forlengs-primeren (TCATCACGGC GCGCCAGG, SEQ.ID.NO. 25) tilsvarte nukleotidene 15-32 i den åpne leseramme for zot, og revers-primeren (GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT, SEQ.ID.NO.26) tilsvarte den 5' ende av den åpne leseramme for ctxA. Følgelig mangler aminosyrene 1-5 i ZOT i det resulterende fusjonsprotein. Amplifikasjonsproduktet ble innsatt i polylinkeren (Smal-setet) som ligger nær enden GST-genet i pGEX-2T (Pharmacia, Milwaukee, WI). pGEX-2T er et fusjonsprotein-ekspresjonsvektor som uttrykker et klonet gen som et fusjonsprotein med GST fra Schistosoma japonicum. Fusjonsgenet er under kontroll av tac-promoteren. Ved induksjon med IPTG skjer en derepresjon, og GST-fusjonsprotein uttrykkes.

Det resulterende rekombinante plasmid, betegnet pLCl 1, ble elektroporert inn i E. coli DH5a. For rensing av GST-ZOT-fusjonsprotein ble 10 ml Luria-Bertani-medium tilsatt 100 ug/ml ampicillin inokkulert med en enkelt koloni som inneholdt pLCl 1 og inkubert over natten ved 37 °C under omrysting. Kulturen ble fortynnet 1:100 med 1,0 ml av det samme, friske medium og dyrket ved 37 °C under omrysting til tilnærmet 1,0 x 10<8> celler/ml. 0,2 mM IPTG ble så tilsatt for induksjon av GST-ZOT-ekspresjonen, og kulturen ble inkubert ved 37 °C i ytterligere 3 timer. Bakteriene ble så nedsentrifugert, resuspendert i 20 ml iskald PBS (pH 7,4), og lysert ved french-presse-rfemgangsmåten. GST.ZOT-fusjonsproteinet var ikke løselig under disse betingelser, siden det sedimenterte sammen med bakterierestene. Pelleten ble følgelig resuspendert i Laemli-lyseringsbuffer som inneholdt 0,00625 M Tis-HCl (pH 6,8), 0,2 M 2-ME, 2,0 %

(vekt/vol) SDS, 0,025% (vekt/vol) bromfenolblått og 10 % (vekt/vol) glyserol, fraksjonert ved elektroforese i en 8,0 % (vekt/vol) PAGE-SDS-gel og farget med Coomassie brilliant blue. Et bånd på 70 kDa (26 kDa GST + 44 kDa ZOT), som tilsvarte fusjonsproteinet, ble elektroeluert fra gelen ved anvendelse av et elektroseparasjonskammer (Schleicher & Schuell, Keene, NH). 10 ug av det resulterende eluerte protein (10-20 ug) ble injisert i en kanin blandet med et likt volum Freunds fullstendige adjuvans. To forsterkerdoser ble tilført med Freund ufullstendige adjuvans fire henholdsvis åtte uker senere. En måned senere ble blod tappet fra kaninen.

For å bestemme produksjonen av spesifikke antistoffer ble 10"<10> M og ZOT, sammen med de to fusjonsproteinene MBP-ZOT og GST-ZOT, overført til en nylonmembran og inkubert med en 1:5 000 fortynning av kaninantiserumet over natten ved 4 °C under moderat omrysting. Filteret ble så vasket 4 ganger i 15 minutter med PBS tilsatt 0,05 % (vekt/vol) Tween 20 (i det påfølgende "PBS-T" og inkubert med en 1:30 000 fortynning av anti-kanin-IgG fra geit konjugert til pepperrotperoksidase i 2 timer ved romtemperatur. Filteret ble igjen vasket 4 ganger i 15 minutter med PBS tilsatt 0,1 % (vekt/vol) Tween, og immunreaktive bånd ble påvist ved anvendelse av forsterket kjemiluminescens (Amersham).

På immunblot ble kaninantiserumet funnet å gjenkjenne ZOT så vel som fusjonsproteinene MBP-ZOT og GST-ZOT, men ikke den negative kontroll MBP.

For videre å bekrefte produksjon av egnede anti-ZOT-antistoffer ble nøytraliseringseksperimenter utført i Ussing-kammere. Ved bred inkubering med pZ14-supernantant ved 37 °C i 60 minutter var det ZOT-spesifikke antiserum (1:100 fortynning) i stand til fullstendig å nøytralisere reduksjonen i Rt som induseres av ZOT i kanin-ileum montert i Ussing-kammere.

Deretter ble anti-ZOT-antistoffene affinitetsrenset ved anvendelse av en MBP-ZOT-affinitetskolonne. Nærmere bestemt ble en MBP-ZOT-affinitetskolonne fremstilt ved å immobilisere 1,0 mg renset MBP-ZOT, erholdt som beskrevet i eksempel 1 ovenfor, til en preaktivert gel (Aminolink, Pierce) over natten ved romtemperatur. Kolonnen ble vasket med PBS og så påsatt 2,0 ml anti-ZOT-antiserum fra kanin. Etter inkubering i 90 minutter ved romtemperatur ble kolonnen vasket med 14 ml PBS, og de spesifikke anti-ZOT-antistoffene ble eluert fra kolonnen 4,0 ml av en løsning som inneholdt 50 mM glysin (pH 2,5), 150 mM NaCl og 0,1 % (vekt/vol) Triton X-100. pH i de eluerte fraksjoner på 1,0 ml ble umiddelbart nøytralisert med 1,0 N NaOH.

Eksempel 3

Rensing av zonulin

Basert på observasjonen i U.S. patentsøknad nr 08/803 364, innlevert

20. februar 1997, om at ZOT interagerer med en spesifikk epiteloverflatereseptor med påfølgende aktivering av en komplisert intracellulær kaskade av begivenheter som regulerer permiabiliteten av tj, ble det i foreliggende oppfinnelse postulert at ZOT kan etterligne virkningen av en fysiologisk modulator av tj hos pattedyr. Det ble i U.S. patentsøknad nr 08/859 931, innlevert 21. mai 1997, postulert at ZOT og den fysiologiske analog (zonulin) vil være funksjonelt og immunologisk beslektede. Følgelig ble, som beskrevet deri, affinitetsrensede anti-ZOT-antistoffer og Ussing-kammeranalysen anvendt sammen for å søke etter zonulin i forskjellige vev fra kanin og menneske.

A. Kaninvev

I utgangspunktet ble zonulin renset fra kanintarm. Vevet ble oppbrutt ved homogenisering i PBS. De resulterende cellepreparater ble så sentrifugert ved 40 000 rpm i 30 minutter, og supernatanten oppsamlet frysetørket. Det resulterende frysetørkede produkt ble deretter løst i PBS (10:1 (vekt/vol)), filtrert gjennom et 0,45 mm membranfilter, påsatt en Sephadex G-50 kromatografikolonne og eluert med PBS. Deretter ble fraksjoner på 2,0 ml erholdt fra kolonnen analysert ved standard Western-immunblotting ved anvendelse av de affinitetsrensede anti-ZOT-antistoffene, erholdt som beskrevet i eksempel 2 ovenfor.

Positive fraksjoner, det vil si fraksjoner som anti-ZOT-antistoffene ble bundet til, ble slått sammen, frysetørket, løst i PBS (1:1 (vekt/vol)) og fraksjonert ved saltgradientkromatografi gjennom en Q-sefarosekolonne. Saltgradienten var 0 - 100 % (vekt/vol) NaCl i 50 mM Tris-buffer (pH (8,0). Fem fraksjoner på 20 ml ble oppsamlet og analysert ved standard Western-immunblotting ved anvendelse av de affinitetsrensede anti-ZOT-antistoffene, erholdt som beskrevet i eksempel 2 ovenfor. Fraksjon 1 (20 % (vekt/vol) NaCl) var den eneste fraksjon som ble funnet å være positiv i Western-immunblotanalysen.

Fraksjonene erholdt fra Q-sefarosekolonnen ble så analysert for virkning på vevsmotstanden både i CaCo2-encellelag og tynntarm fra kanin i Ussing-kammere.

Nærmere bestemt ble CaCo2-celler dyrket i cellekulturflasker (Falcon) i en fuktgjort atmosfære med 95 % 02/5 % C02 ved 37 °C i Dulbeccos modifiserte Eagles medium tilsatt 10 % (vekt/vol) fetalt kalveserum, 40 ug/l penicillin og 90 ug/l streptomycin. Cellene ble omsådd ved et overflateforhold på 1:5 etter trypsinbehandling hver 5. dag, etter at de hadde nådd 70 - 80 % konfluens. Antall passasjer for cellene anvendt i denne undersøkelse varierte mellom 15 og 30.

CaCo2-encellelagene ble dyrket til konfluens (12-14 dager etter utsåing ved et overflateforhold på 1:2,5) på vevskulturbehandlede polykarbonatfiltere godt festet til en polysterenring (6,4 mm diameter, Transwell Costar). Filterene ble plassert i en tettsittende pakning som skilte den serosale avdeling fra den mukosale avdeling i et modifisert Ussing-kammer, og eksperimentene ble utført som beskrevet av Fasano et al, Proc.Natl. Acad. Sei, USA, 8:5242-5246 (1991) for kanintarmer i Ussing-kammere. Resultatene er vist i figur 1.

Som vist i figur 1, induserte den zonulinholdige fraksjon en signifikant reduksjon av motstanden i CaCo2-encellelag, sammenlignet med zonulinnegative fraksjoner.

Deretter ble Ussing-kammeranalyser utført ved anvendelse av ileum fra voksne New Zealand white-hannkaniner på 2 - 3 kg som ble avlivet ved halsforskyvning. Et 20 cm ileumsegment ble tatt ut, vasket fritt for tarminnhold, åpnet langs mesenteriums-grensen og befridd for muskellag og hinner. Åtte mukosa flak fremstilt på denne måte ble så montert i Ussing-kammere av pleksiglass (1,12 cm2 åpning), koblet til et spenningsklampapparat (EVC 4 000 WPI, Saratosa, FL), og badet med nyfremstilt Ringers løsning inneholdende 53 mM NaCl, 5,0 mM KC1, 30,5 mM mannitol, 1,69 mM Na2HP04,0,3 mM NaH2P04' 1,25 mM CaCl2,1,1 mM MgCl2, og 25 mM NaHC03. Badløsningen ble holdt ved 37 °C med kammere forsynt med kappe koblet til en sirkulasjonspumpe med konstant temperatur og gjennomboblet med 95 % 02/5 % C02.

100 ul renset fra kanintarm ble tilsatt på den mukosale side. Potensialforskjellen (PD) ble målt hvert 10. minutt, og kortslutningstrømmen (Ise) og vevsmotstanden (Rt) ble beregnet som beskrevet av Fasano et al, supra. Grunnet variasjon mellom vevene ble resultatene beregnet som ARt (Rt ved tid x)-(Rt ved tid 0). Resultatene er vist i figur 2.

Som vist i figur 2 induserte den zonulinholdige fraksjon en signifikant reduksjon i motstanden i tynntarm hos kanin, sammenlignet med en zonulinnegativ fraksjon. Denne virkningen var fullstendig reversibel ved fjerning av zonulin fra reservoaret.

Den zonulinpositive fraksjon ble også analysert ved 8,0 5 (vekt/vol) SDS-PAGE, fulgt av Western-immunblotting med anti-ZOT-antistoffene. Proteinbåndene som var fraksjonert ved SDS-PAGE ble så overført til PVDS-filtere (Millipore) ved anvendelse av 100 ml CAPS-buffer inneholdene (3-[sykloheksylamino )-lpropansulfonsyre) 10x, 100 ml metanol, 800 ml desillert vann. Proteinet som tilsvarte et enkelt bånd som ble påvist ved Western-immunbloting hadde en tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 47 kDa. Dette bånd ble utkuttet fra PVDF-filteret og analysert ved N-terminasekvensering som beskrevet av Hunkapiller, i: Methods of Protein Microcharacterization, red. Shibley, kap. 11-12, Humana Press, s. 315 - 334 (1985), ved anvendelse av et Perkin-Elmer Applied Biosystems-instrument, modell 494. Den N-terminale sekvens av zonulin renset fra kanintarm er vist SEQ.ID.NO. 27.

Den N-terminale sekvens av zonulin fra kanin ble sammenlignet med andre proteinsekvenser ved BLAST-søkanalyse. Resultatet av denne analyse viste at den N-terminale sekvens av kanin-zonulin er 85 % identisk med og 100 % lik den N-terminale sekvens av tau-protein fra Homo sapiens.

For å fastslå hvorvidt kanin-zonulin og tau er samme molekyl, ble følgelig kryssnøytraliseringseksperimenter utført Ussing-kammere. Nærmere bestemt ble 10 ul/ml kanin-zonulin tilsatt på den mukosale side av kanin-ileum, enten ubehandlet eller på forhånd inkubert i 60 minutter ved 37 °C med anti-tau-antistoffer (fortynning 1:10)

(Sigma). Både 10 jil/ml av kanin-zonulin preinkubert med anti-ZOT-antistoffer (fortynning 1:10) (eksempel 2) og 0,4 ug/ml renset tau (Sigma) ble anvendt som kontroller. Resultatene er vist i figur 3.

Som vist i figur 3 induserte kanin-zonulin den typiske reduksjon av vevsmotstanden som lett kunne reverseres ved fjerning av proteinet fra Ussing-kammerene. Denne aktivitet ble fullstendig nøytralisert ved forbehandling med anti-ZOT-antistoffer, men ikke ved forbehandling med anti-tau-antistoffer. På den annen side har det ingen signifikant virkning på vevsmotstanden i vev behandlet med tau-protein.

Kanin-zonulin ble også påvist i forskjellige andre kaninvev, det vil si hjerte, hjerne, muskel, mage, milt, lunge, nyre, så vel som i forskjellige deler av kanintarm, det vil si den distale jejunum, den proksimale jejunum, ileum, caecum og kolon. Det vil si at når disse kaninvev ble behandlet på samme måte som kanintarm, diskutert ovenfor, og fraksjonert ved 8,0 % (vekt/vol) SDS-PAGE, etterfulgt av Western immunblotting med affinitetsrensede anti-ZOT-antistoffer, erholdt som beskrevet i eksempel 2 ovenfor, ble et enkelt bånd på tilnærmet 47 kDa påvist i alle de analyserte vev.

B. Humane vev

Zonulin ble også renset fra forskjellige humane vev, innbefattet tarm, hjerte og hjerne. Både fetale og voksne vev ble anvendt. Vevene ble oppbrutt ved homogenisering i PBS. De resulterende cellepreparater ble så sentrifugert ved 40 000 rpm i 30 minutter og supernatanten oppsamlet og frysetørket. Det resulterende frysetørkede produkt ble deretter løst i PBS (10:1 (vekt/vol), filtrert gjennom et 0,45 mm membranfilter, påsatt en Sephadec G-50-kromatografikolonne og eluert med PBS. Deretter ble fraksjoner på

2,0 ml erholdt fra kolonnen analysert ved standard Western-immunblotting ved anvendelse av de affinitetsrensede anti-ZOT-antistoffene, erholdt som beskrevet i eksempel 2 ovenfor.

Positive fraksjoner, det vil si fraksjoner til hvilke anti-ZOT-antistoffene ble bundet, ble slått sammen, frysetørket, løst i PBS (1:1 (vekt/vol)) og fraksjonert ved saltgradientkromatografi gjennom en Q-sefarosekolonne. Saltgradienten var 0 -100 %

(vekt/vol) NaCl i 50 mM Tris-buffer (pH 7,4). Fem fraksjoner på 20 ml ble oppsamlet og analysert ved standard Western-immunblotting ved anvendelse av de affinitetsrensede

anti-ZOT-antistoffene, erholdt som beskrevet i eksempel 2 ovenfor. Fraksjon 1 (20 %

(vekt/vol) NaCl) viste et enkelt bånd med størrelse 47 kDa i Wester-immunblotanalysen. Fraksjon 2 (40 % (vekt/vol) NaCl) viste to tilleggsband med størrelse 35 kDa og 15 kDa i Western-immunblotanalysen. Fraksjon 3 (60 % (vekt/vol) NaCl) og fraksjon 4 (80%

(vekt/vol)) viste kun båndene på 35 kDa og 15 kDa. Disse resultater viser at zonulin kan utsettes for degradering ved proteaser som sannsynligvis foreligger i de anvendte humane vev, og at nedbrytningsproduktene elueres fra kolonnen ved høyere saltkonsentrasjon enn holoproteinet.

Fraksjon 1 (fra vev fra humant hjerte, tarm og hjerne) og fraksjon 4 (fra hjertevev) erholdt fra Q-sefarosekolonnen ble så analysert for virkning på vevsmotstand, både i kanintarm og tarm fra rhesusape i Ussing-kammere.

Ussing-kammeranalysene ble utført ved anvendelse av forskjellige deler av tarmen, innbefattet jejunum, ileum og kolon, fra enten voksne New Zealand white hannkaniner på 2 - 3 kg eller voksne rhesus-hannaper på 5 - 6 kg. Etter avlivning av dyrene ble forskjellige deler av tarmen, innbefattet jejunum, ileum og kolon, fjernet, befridd for tarminnhold, åpnet langs mesenteriumgrensen og befdridd for muskellag og hinner. Åtte således fremstilte lag med slimvev (tre fra jejunum, tre fra ileum og to fra kolon) ble montert i Ussing-kammere av pleksiglass (1,12 cm åpning), koblet til et spenningsklampapparat (EVC 4 000 WPI, Saratosa, FL), og badet med nyfremstilt Ringers løsning som inneholdt 53 mM NaCl, 5,0 mM KC1, 30,5 mM mannitol, 1,69 mM Na2HP04,0,3 mM NaH2P04,1,25 mM CaCl2,1,1 mM MgCl2, og 25 mM NaHC03. Badløsningen ble holdt ved 37 °C med reservoarer utstyrt med vanntermostaterte kapper koblet til en sirkulasjonspumpe med konstant temperatur og gjennomboblet med 95 % 02/5 % C02.

100 ul fraksjon 1 av zonulin renset fra humant hjerte, fraksjon 1 av zonulin renset fra human hjerne, fraksjon 1 av zonulin renset fra human tarm eller fraksjon 4 renset fra humant hjerte ble tilsatt på den mukosale side. Potensialforskjellen (PD) ble målt hvert 10. minutt, og kortslutningsstrømmen (Ise) og vevsmotstanden (Rt) ble beregnet som

beskrevet av Fasano et al, supra. Resultatene ble beregnet som Rt for figurene 4A og 4B, men grunnet variabilitet mellom vevene ble resultatene beregnet som ARt (Rt ved tid x)-(Rt ved tid 0) for figurene 5 A og 5B. Resultatene er vist i figurene 4A og 4B (apetarm) og figurene 5A og 5B (kanintarm).

Som vist i figurene 4A og 4B induserte zonulin renset av humant hjerte og human tarm (fraksjon 1) en signifikant reduksjon i motstanden i apetarm (både jejunum (figur 4A) og ileum (figur 4B) sammenlignet med den negative PBS-kontroll. Ingen signifikante endringer ble observert ved analyse av zonulin renset fra enten humant hjerte eller human tarm i kolon. Figurene 4A og 4B viser også åt ingen signifikant virkning, verken på ape-jejunum (figur 4Å) eller ape-ileum (figur 4B) kunne observeres ved analyse av zonulin renset fra human hjerne (fraksjon 1). Fraksjon 4 av zonulin renset fra humant hjerte induserte også en signifikant reduksjon i vevsmotstanden i tynntarm fra ape.

Som vist i figurene 5A og 5B ble tilsvarende resultater erholdt ved anvendelse av kanintarm. Det vil si at zonulin renset fra humant hjerte (fraksjon 1) viste en signifikant virkning på vevsmotstanden, både i kanin-jejunum (figur 5A) og kanin-ileum (figur 5B), men ikke i kolon. Figurene 5A og 5B viser også at ingen signifikant virkning, verken på kanin-jejunum (figur 5A) eller kanin-ileum (figur 5B) kunne observeres ved analyse av zonulin renset fra human hjerne (fraksjon 1).

For å fastslå hvorvidt zonulin forhøyer det orale opptak av insulin ble in vitro-modellforsøk ved anvendelse av kanintarm utført. Kort beskrevet ble voksne New Zealand white hannkaniner (2-3 kg) avlivet ved halsdislokasjon. Segmenter av tynntarm fra kanin (enten jejunum eller ileum) ble tatt ut, renset for tarminnhold, åpnet langs mesenteriumgrensen og befridd for muskellag og hinner. Åtte således fremstilte lag med slimvev ble så montert i Ussing-kammere av pleksiglass (1,12 cm åpning), koblet til et spenningsklampapparat (EVC 4 000 WPI, Sarasota, FL), og badet med nyfremstilt buffer inneholdende 53 mM NaCl, 5,0 mM KC1,30,5 mM mannitol, 1,69 mM Na2HP04,

0. 3 mM NaH2P04, 1,25 mM CaCl2,1,1 mMMgCl2, og 25 mMNaHC03. Badløsningen ble holdt ved 37 °C med reservoarer utstyrt med vanntermostaterte kapper koblet til en sirkulasjonspumpe med konstant temperatur og gjennomboblet med 95 % 02/5 % C02. Potensialforskjellen (PD) ble målt, og kortslutningsstrømmen (Ise) og vevsmotstanden (Rt) ble beregnet. Etter at vevene hadde nådd en stabil tilstand ble vevspar, utvalgt basert på motstanden, eksponert luminalt overfor 10"<11> M ,25I-insulin (Amersham, Arlington Heights, IL; 2,0 uCi = IO'<12> M), alene eller i nærvær av 100 ul hjerte-zonulin fra fraksjon 1. Et uttak på 1,0 ml alikvot fra den serosale side og et uttak på 50 ul alikvot fra den mukusale side ble umiddelbart uttatt for å bestemme utgangsverdiene. Prøver fra den serosale side ble så oppsamlet med 20 minutters mellomrom i de påfølgende 100 minutter.

Det ble funnet at hjerte-zonulin forhøyet tarmabsorpsjonen av insulin, både i

jejunum (0,058 ± 0,003 fmol/cm<2> min og 0,12 ± 0,005 fmol/cm2 min, ubehandlet versus zonulinbehandlet vev, p=0 001 og i ileum (0,006 ± 0,0002 fmol/cm<2> min og 0,18 ± 0,005 fmol/cm min ubehandlet henholdsvis zonulinbehandlet vev, p=0,05) på en tidsavhengig måte.

Fraksjon 1 av zonulin renset fra humant hjerte, fraksjon 1 av zonulin renset fra human tarm og fraksjon 1 av zonulin renset fra human hjerne ble også analysert ved 8,0 % (vekt/vol) SDS-PAGE, fulgt av Western-immunblotting ved anvendelse av anti-ZOT-affinitetene erholdt som beskrevet i eksempel 2 ovenfor. Proteinbåndene som ble separert ved SDS-PAGE ble så overført til PVDF-filtere ved anvendelse av CAPS-bufffer som inneholdt 100 ml (3-[sykloheksylamino]-l propansulfonsyre) 10x, 100 ml metanol 800 ml destillert vann. Proteinet som tilsvarte et enkelt bånd som ble påvist ved Western-immunblotting hadde en tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 47 kDa. Dette bånd ble kuttet ut fra PVDF-filteret og analysert ved N-terminal sekvensering som beskrevet av Hunkapiller, i: Methods of Protein Microcharacterization, Ed. Shibley, kap. 11 -12, Humana Press, s 315 - 334 (1985), ved anvendelse av et Perkin-Elmer Applied Biosystems instrument modell 494. Den N-terminale sekvens av zonulin renset fra voksent humant hjerte er vist i SEQ.ID.NO.28, den N-terminale sekvens av zonulin renset fra voksen human hjerne er vist i SEQ.ID.NO. 29, og den N-terminale sekvens av zonulin renset fra voksen fetal hjerne er vist i SEQ.ID.NO. 36.

De ni første aminosyrene fra den N-terminale sekvens av zonulin renset fra voksen human tarm (SEQ.ID.NO.31) ble også sekvensert og funnet å være identisk med de ni første aminosyrer i zonulin renset fra humant hjerte, vist SEQ.ID.NO» 28 (se figur 6). De første tyve aminosyrer fra den N-terminale sekvens av zonulin renset fra human fetal tarm ble også sekvensert: Met Leu Gin Lys Ala Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly Xaa Ser Asn Arg Leu (SEQ.ID.NO.30) og funnet å være nesten identisk med aminosyresekvensen av zonulin renset fra humant hjerte, vist i SEQ.ID.NO.28 (se figur 6).

Den N-terminale sekvens av zonulin renset fra voksen human hjerne (SEQ.ID.NO.29) og fetal human hjerne (SEQ.ID.NO.36) var fullstendig forskjellig fra den N-terminale sekvens av zonulin renset fra enten hjerte (SEQ.ID.NO.28), fetal tarm (SEQ.ID.NO.30) eller voksen tarm (SEQ.ID.NO.31) (se figurene 6 - 7). Denne forskjell antas å forklare vevsspesifisiteten av zonulin når det gjelder å bestemme permeabiliteten av vev, for eksempel tarm, vist ovenfor.

Den N-terminale sekvens av humant zonulin renset fra hjerte, tarm og hjerne avvek alle fra den N-terminale sekvens av zonulin renset fra kanintarm (figur 6). For å fastslå hvorvidt disse proteiner representerer forskjellige isoformer av en tau-beslektet proteinfamilie ble vev fra både kanin og menneske fraksjonert ved 8,0 % (vekt/vol) SDS-PAGE, fulgt av Western-immunblotting med enten anti-ZOT- eller anti-tau-antistoffer. Zonulinbåndene på 47 kDa renset fra både kaninvev og humane vev (innbefattet hjerne, tarm og hjerte), som ble vist og gjenkjennes av anti-ZOT-antistoffene, kryssreagerte også med anti-tau-antistoffer. De forskjellige zonulinfraksjoner renset fra human hjerne, erholdt ved saltkromatografi, ble også analysert ved Western-immunbloting med enten anti-ZOT- eller anti-tau-antistoffer. Mens anti-ZOT-antistoffene gjenkjente det inntakte protein på 47 kDa og de to nedbrytningsfragmentene på 35 kDa og 15 kDa, gjenkjente anti-tau-antistoffet kun det intakte protein på 47 kDa og fragmentet på 35 kDa, mens anti-tau-antistoffene ikke gjenkjente fragmentet på 15 kDa. For å fastslå hvorvidt fragmentet på 35 kDa omfatter aminoenden eller karboksyenden av zonulin ble den N-terminale sekvens av båndet på på 35 kDa erholdt og funnet å være: Xaa Xaa Asp Gly Thr Gly Lys Val Gly Asp Leu (SEQ.ID.NO.32). Denne sekvens er forskjellig fra den N-terminale sekvens av intakt zonulin fra human hjerne (SEQ.ID.NO.29). Disse resultater tyder på at fragmentet på 15 kDa representerer den N-terminale del av zonulin mens fragmentet på 35 kDa representerer den C-terminale del av zonulin.

Sett under ett tyder disse resultater på at zonulin-domenet, som gjenkjennes av anti-tau-antistoffene ligger i den C-terminale del av proteinet, er felles for de forskjellige zonulin-isoformer fra både humane vev og kaninvev (mens den N-terminale del kan variere), og sannsynligvis deltar i den permeabiliserende virkning av proteinet (basert på den observasjon at tau bindes til P-tubulin med påfølgende rearrangering av cellens cytoskjelett, og virkningen av fraksjon 4 på vevsmotstanden i tynntarm fra ape).

Den N-terminale sekvens av humant zonulin renset fra både hjerte og tarm ble sammenlignet med andre proteinsekvenser ved BLAST-søkanalyse. Resultatene av denne analyse viste at den N-terminale sekvens av humant zonulin er 95 % identisk med den N-terminale sekvens av den tunge variable kjede i IgM fra Homo Sapiens (SEQ.ID.NO.37).

For å fastslå hvorvidt humant zonulin ble renset fra hjertet er det samme molekyl som humant IgM ble følgelig en delvis kløyving av humant zonulin utført for erholdelse av et internt fragment, som så ble sekvensert.

Nærmere bestemt ble 1,0 mm av PVDF-filteret som inneholdt zonulin renset fra humant hjerte plassert i et plastrør som på forhånd var vasket med 0,1 % (vekt/vol)

trifluoreddiksyre (TFA) og vasket med metanol. 75 ul av en bufferløsning som inneholdt 100 mM Tris (pH 8,2), 10 % (vekt/vol). CH3CN og 1,0 % (vekt/vol) dehydrogenert Triton X-100 ble tilsatt og inkubert med membranen ved 37 °C i 60 minutter. 150 ng trypsin ble så tilsatt, og prøven ble inkubert i ytterligere 24 timer ved 37 °C. Den resulterende løsning ble ultralydbehandlet i 10 minutter og supernatanten avhelt. 75 ul 0,1 %

(vekt/vol) TFA ble så tilsatt, løsningen ble ultralydbehandlet i ytterligere 10 minutter og supernatanten avhelt. Begge prøver ble påsatt en 0,5 mm x 250 mm Cjg-kolonne med 5,0 um partikkelstørrelse og 300 Å porestørrelse. En gradient fra 0,1 % (vekt/vol) TFA til 45 % CH3CN/vann + 0,1 % (vekt/vol) TFA ble kjørt over et tidsrom på 2 timer og 15 minutter. Toppene ble oppsamlet og sekvensert.

Den interne sekvens fra humant zonulin renset fra voksent humant hjerte ble funnet å være: Leu Ser Glu Val Thr Ala Val Pro Ser Leu Asn Gly Gly (SEQ.ID.NO.33)

Den interne sekvens fra humant zonulin ble sammenlignet med andre proteinsekvenser ved BLAST-søkanalyse. Resultatet av denne analyse viste at den interne sekvens fra humant zonulin har 0 % identitet med interne sekvenser fra den tunge variable kjede fra IgM fra Homo sapiens.

Resultatene i eksempel 3 ovenfor viser at (1) zonulin representerer den fysiologiske modulator av den paracellulære reaksjonsvei, (2) den N-terminale sekvens av kanin-zonulin er svært homolog med den N-terminale sekvens av tau-proteinet,

(3) zonulin og tau er to forskjellige molekyler som er immunologisk beslektet, men likevel funksjonelt forskjellige, (4) den N-terminale sekvens av humant zonulin erholdt fra hjerte og tarm er svært homolog med den N-terminale sekvens av tungkjeden fra det variable område i IgM, (5) humant zonulin og IgM er to forskjellige molekyler som er strukturelt beslektede, men likevel funksjonelt forskjellige, og (6) zonulin representerer en familie av tau-beslektede proteiner med felles, aktive C-termainale sekvenser og variable N-terminale sekvenser.

Eksempel 4

Peptidantagonister av zonulin

Siden ZOT, humant zonulin fra tarm (zonulin;) og humant zonulin fra hjerte (zonulinh) alle virker på tj i tarm (Fasano et al, Gastroenterology, 112:839 (1997); Fasano et al, J.Clin. Invest, 96:710 (1995); og figurene 1-5) og endotel tj og at alle tre har en lignende regional virkning (Fasano et al (1997), supra; og figurene 1-5) som faller sammen med ZOT-reseptorfordelingen i tarm (Fasano et al (1997), supra; og Fasano et al

(1995), supra), ble det postulert i foreliggende oppfinnelse at de tre molekyler interagerer med det samme reseptorbindingssete. En sammenligning av den primære aminosyre-struktur av ZOT og de humane zonuliner ble således utført for å gi informasjon vedrørende de absolutte strukturelle krav for reseptor-ligandinteraksjonen som inngår i regulering av tj i tarm. Analyse av disse molekyler aminoender viste følgende felles motiv (aminosyrerestene 8-15 innrammet i figur 7): ikke-polar (Gly for tarm, Val for hjerne), variabel, ikke-polar, variabel, ikke-polar, polar, variabel, polar (Gly). Gly i posisjon 8, Val i posisjon 12 og Gin i posisjon 13 er alle svært konserverte i ZOT, zonulinj og zonulinh (se figur 7) og antas å være avgjørende for reseptorbindings-funksjonen i tarm. For å bekrefte dette, ble det syntetiske octapeptid Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ.ID.NO. 15) (betegnet FZI/0, og tilsvarende aminosyrerestene 8 -15 i humant fetalt zonulin;) syntetisert kjemisk.

Deretter ble kanin-ileum, montert i Ussing-kammere som beskrevet ovenfor, behandlet med 100 ug FZI/0 (SEQ.ID.NO. 15), 100 ug FZI/1 (SEQ.ID.NO.34), 1,0 ug 6xHis-ZOT (erholdt som beskrevet i eksempel 1), 1,0 ug zonulin; (erholdt som beskrevet i eksempel 3), eller 1,0 ug zonulinh (erholdt som beskrevet i eksempel 3) alene, eller på forhånd behandlet i 20 minutter med 100 ug FZI/0 eller FZI/1, hvoretter 1,0 ug 6xHis-ZOT, 1,0 ug zonulin;, eller 1,0 ug zonulinh ble tilsatt. A Rt ble så beregnet som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i figur 8.

Som vist i figur 8 induserte FZI/o ingen signifikant endring i Rt (0,5 % relativt til den negative kontroll) (se fylt søyle). Derimot reduserte forbehandling i 20 minutter med FZI/0 virkningen av ZOT, zonulin, og zonulinh på Rt med 75 %, 97 %, henholdsvis 100 % (se åpen søyle). Som også vist i figur 8, forsvant denne inhiberende virkning fullstendig dersom et annet syntetisk peptid (FZI/1) ble kjemisk syntetisert ved å endre Gly i posisjon 8, Val i posisjon 12 og Gin i posisjon 13 (relativt til zonulin;) til de tilsvarende aminosyrereseter i zonulhib (Val, Gly, henholdsvis Arg) ble anvendt (se skravert søyle).

Resultatene ovenfor viser at det er et område mellom aminosyrerest 8 og aminosyrerest 15 i den N-terminale ende av ZOT og zonulin-familien som er avgjørende for binding til målreseptoren, og at aminosyrerestene i posisjon 8,12 og 13 bestemmer vevsspesifisiteten av denne binding.

Selv om oppfinnelsen er blitt beskrevet i detalj og med henvisning til spesifikke utførelser av den, vil det være åpenbart for en gjennomsnittsfagmann at forskjellige endringer og modifikasjoner kan utføres i oppfinnelsen uten å avvike fra dens ånd og område.

Claims (19)

1. Peptidantagonist av zonulin, karakterisert ved at den består av en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ.ID.NO: 1, SEQ.ID.NO: 2, SEQ.ID.NO:3, SEQ.ID.NO: 4, SEQ.ID.NO:

5, SEQ.ID .NO: 6, SEQ.ID.NO: 7, SEQ.ID.NO: 8, SEQ.ID.NO: 9, SEQ.ID.NO: 10, SEQ.ID.NO: 11, SEQ.ID.NO: 12, SEQ.ID.NO: 13, SEQ.ID.NO: 14, SEQ.ID.NO: 15, SEQ.ID.NO: 16, SEQ.ID.NO: 17, SEQ.ID.NO: 18, SEQ.ID.NO: 19, SEQ.ID.NO: 20, SEQ.ID.NO: 21, SEQ.ID.NO: 22, SEQ.ID.NO: 23 og SEQ.ID.NO: 24, hvori peptidantagonisten bindes til en zonula occludens-toksinreseptor, men likevel ikke fysiologisk modulerer åpningen av tette celle - celleforbindelser hos pattedyr.

2. Peptidantagonist ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidet består av aminosyresekvensen som angitt i SEQ.ID.NO: 15.

3. Peptidantagonist ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidet anvendes som medikament.

4. Peptidantagonist ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidet anvendes for behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen.

5. Peptidantagonist ifølge krav 4, karakterisert ved at inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med C. rf/^c/fe-infeksjon, enterokolitt, shigellose, viral gastrenteritt, parasittinfeksjon, bakteriell overvekst, Whipples sykdom, gastritt, magecancer, kollagenøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, medfødt lymfangiektasia intestinalis, sarcoidosis lymphoma, mesenterisk tuberkulose, Ménétriers sykdom, cøliaki, eosinofil gasroenteritt, systemisk lupus erythematosus, matallergier og etter-kirurgisk korreksjon av medfødt hjertesykdom ved Fontans operasjon.

6. Anvendelse av et peptid som motvirker åpning av tette celle - celleforbindelser ved fremstilling av et medikament for behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen, hvori peptidet består av en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ.ID.NO: 1, SEQ.ID.NO: 2, SEQ.ID.NO: 3, SEQ.ID.NO: 4, SEQ.ID.NO: 5, SEQ.ID.NO: 6, SEQ.ID.NO: 7, SEQ.ID.NO: 8, SEQ.ID.NO: 9, SEQ.ID.NO: 10, SEQ.ID.NO: 11, SEQ.ID.NO: 12, SEQ.ID.NO: 13, SEQ.ID.NO: 14, SEQ.ID.NO: 15, SEQ.ID.NO: 16, SEQ.ID.NO: 17, SEQ.ID.NO: 18, SEQ.ID.NO: 19, SEQ.ID.NO: 20, SEQ.ID.NO: 21, SEQ.ID.NO: 22, SEQ.ID.NO: 23 og SEQ.ID.NO: 24.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvori inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med C. dfficile- inféksjon, enterokolitt, shigellose, viral gastrenteritt, parasittinfeksjon, bakteriell overvekst, Whipples sykdom, gastritt, magecancer, kollagenøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, medfødt lymfangiektasia intestinalis, sarcoidosis lymphoma, mesenterisk tuberkulose, Ménétriers sykdom, cøliaki, eosinofil gasroenteritt, systemisk lupus erythematosus, matallergier og etter-kirurgisk korreksjon av medfødt hjertesykdom ved Fontans operasjon.

8. Anvendelse ifølge krav 6, hvori inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med cøliaki.

9. Anvendelse ifølge krav 6, hvori inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med inflammatorisk tarmsykdom.

10. Anvendelse ifølge krav 6, hvori peptidet består av SEQ.ID.NO: 15.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvori inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med C. cfr^czVe-infeksjon, enterokolitt, shigellose, viral gastrenteritt, parasittinfeksjon, bakteriell overvekst, Whipples sykdom, gastritt, magecancer, kollagenøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, medfødt lymfangiektasia intestinalis, sarcoidosis lymphoma, mesenterisk tuberkulose, Ménétriers sykdom, cøliaki, eosinofil gasroenteritt, systemisk lupus erythematosus, matallergier og etter-kirurgisk korreksjon av medfødt hjertesykdom ved Fontans operasjon.

12. Anvendelse ifølge krav 10, hvori inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med cøliaki.

13. Anvendelse ifølge krav 10, hvori inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med inflammatorisk tarmsykdom.

14. Peptid, karakterisert ved at det består av aminosyresekvensen som angitt i SEQ.ID.NO: 15.

15. Peptid ifølge krav 14, karakterisert ved at peptidet anvendes som medikament.

16. Peptid ifølge krav 14, karakterisert ved at peptidet anvendes for behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen.

17. Peptid ifølge krav 16, karakterisert ved at inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med C. (ij^czVe-infeksjon, enterokolitt, shigellose, viral gastrenteritt, parasittinfeksjon, bakteriell overvekst, Whipples sykdom, gastritt, magecancer, kollagenøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, medfødt lymfangiektasia intestinalis, sarcoidosis lymphoma, mesenterisk tuberkulose, Ménétriers sykdom, cøliaki, eosinofil gasroenteritt, systemisk lupus erythematosus, matallergier og etter-kirurgisk korreksjon av medfødt hjertesykdom ved Fontans operasjon.

18. Anvendelse av et peptid som består av aminosyresekvensen som angitt i SEQ.ID.NO: 15 for fremstilling av et medikament for behandling av inflammasjon i mage - tarmkanalen.

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvori inflammasjonen i mage - tarmkanalen er forbundet med C. difficile- infeksjon, enterokolitt, shigellose, viral gastrenteritt, parasittinfeksjon, bakteriell overvekst, Whipples sykdom, gastritt, magecancer, kollagenøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, medfødt lymfangiektasia intestinalis, sarcoidosis lymphoma, mesenterisk tuberkulose, Ménétriers sykdom, cøliaki, eosinofil gasroenteritt, systemisk lupus erythematosus, matallergier og etter-kirurgisk korreksjon av medfødt hjertesykdom ved Fontans operasjon.