KR100615442B1

KR100615442B1 - 항원-특이적 방식으로 림프구 증식을 저해하기 위한 조트또는 조눌린의 사용방법

Info

Publication number: KR100615442B1
Application number: KR1020017003317A
Authority: KR
Inventors: 파사노알레시오; 스테인마셀로비.; 루루일리앙; 타너마이클케이.
Original assignee: 유니버시티 오브 메릴랜드, 볼티모어
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2006-08-25
Also published as: NO20011253D0; EP1113813A1; DE69925496D1; NO20011253L; MXPA01002600A; EP1113813A4; HUP0103965A3; AU6019099A; HUP0103965A2; DE69925496T2; ES2239480T3; NZ521410A; ZA200102071B; IL141563A; CN1228084C; WO2000015252A1; AU754142B2; KR20010075114A; NZ510150A; ATE296110T1

Abstract

주로 면역조절 및 면역요법의 분야에 유용한, APC 활성 및 림프구 증식의 항원 특이적 저해인자로서의 조트(Zot) 또는 조눌린(zonulin)의 사용방법이 기술되어 있다. 구체적으로, 조트 및 조눌린은 투여량 의존 방식으로 항원 제시 세포-매개된 항원-특이적 림프구 증식을 저해한다. 이 효과는 조트가 특이적이고 포화적인 방식으로 결합하는 대식세포 표면 수용체의 존재와 연관된다. 면역 응답의 이러한 하향-조절은 적어도 일부분 항원의 흡수 감소와 연관된다.

Description

항원-특이적 방식으로 림프구 증식을 저해하기 위한 조트 또는 조눌린의 사용 방법{Method of using Zot or zonulin to inhibit lymphocyte proliferation in an antigen-specific manner}

본 발명의 개발은 유니버시티 오브 마릴랜드, 발티모어에 의해 수행되었으며, 어떤 연구들은 내셔널 인스티튜트 오브 핼스, NIH Grant No. DK-48373에 의해 수행되었다. 정부가 어떤 권리를 가질 수 있다.

이 출원은 35 U.S.C. 제111조(b)에 의거 1998년 9월 14일에 출원된 가출원 No. 60/100,266의 출원일자의 이익을 35 U.S.C. 제119조(e)(i)에 따라 주장하면서 35 U.S.C. 제111조(a)에 의거 출원된 특허출원이다.

본 발명은 조트(Zot) 또는 조눌린(zonulin)을 이용한 면역 응답의 항원-특이적 하향-조절에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 유효량의 조트 또는 조눌린을 투여함으로써 투여량-의존 방식으로 항원 제시 세포-매개된 항원-특이적 림프구 증식을 저해하는 방법을 제공한다.

I. 긴밀 접합(Tight Junction) 및 액틴 세포골격

긴밀 접합(이하 "tj") 또는 조눌라 오클루덴(이하 "ZO")은 흡수성 및 분비성 상피의 표지들 중의 하나이다(Madara, J. Clin. Invest., 83:1089-1094 (1989); 및 Madara, Textbook of Secretory Diarrhea Eds. Lebenthal et al, Chapter 11, pages 125-138 (1990)). 정점(apical) 및 기저측(basolateral) 구획들 사이의 장애물(barrier)로서, 그들은 파라세포(paracellular) 경로를 통한 이온 및 수용성 용질의 수동 확산을 선택적으로 조절한다 (Gumbiner, Am. J. Physiol., 253(Cell Physiol. 22):C749-C758 (1987)). 이 장애물은 트랜스세포(transcellular) 루트와 연관된 경로들의 활성에 의해 발생되는 어떤 구배(gradient)도 유지한다 (Diamond, Physiologist, 20: 10-18 (1977)).

한때 정적 구조로 알려졌던 ZO가 실제로 동적이고 다양한 분화적(Magnuson et al, Dev. Biol., 67:214-224 (1978); Revel et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 40:443-455 (1976); 및 Schneeberger et al, J. Cell Sci., 32:307-324 (1978)), 생리학적(Gilula et al, Dev. Biol., 50:142-168 (1976); Madara et al, J. Membr. Biol., 100:149-164 (1987); Mazariegos et al, J. Cell Biol. 98:1865-1877 (1984); 및 Sardet et al, J. Cell Biol., 80:96-117 (1979)), 및 병리학적(Milks et al, J. Cell Biol., 103:2729-2738 (1986); Nash et al, Lab. Invest., 59:531-537 (1988); 및 Shasby et al, Am. J. Physiol., 255(Cell Physiol., 24):C781-C788 (1988)) 환경에 쉽게 적응한다는 많은 증거들이 있다.

이 적응의 바탕이 되는 조절 메카니즘은 아직도 완전히 이해되고 있지 않다. 그러나, Ca²⁺의 존재하에, ZO의 회합은 세포간 상호작용의 결과로서, 그 상호작용은 생화학적 사건들의 복잡한 캐스케이드(cascade)를 유발하고, 그 사건들은 궁극적으 로 ZO 구성요소들의 유기적인 네트워크의 형성 및 조절을 이끌며, 그들의 조성은 단지 부분적으로 특성화(characterize)되어 있다(Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)). 경막(transmembrane) 단백질 사슬의 후보인 오클루딩(occluding)이 동정되었다(Furuse et al, J. Membr. Biol., 87:141-150 (1985)).

막 접촉(membrane contacts)아래의 세포질 막하(submembranous) 플라크에서 6개의 단백질이 동정되었으나, 그들의 기능은 확립되지 않고 있다(Diamond, 상동). ZO-1 및 ZO-2는 비특성화된 130 kD 단백질(ZO-3)과 세제-안정성 복합체에서 헤테로다이머(heterodimer)로서 존재한다(Gumbiner et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3460-3464 (1991)). 대부분의 면역전자현미경 연구는 ZO-1을 정확하게 막 접촉의 아래로 위치지었다(Stevenson et al, Molec. Cell Biochem., 83:129-145 (1988)). 두 개의 다른 단백질, 싱굴린(Citi et al, Nature (London), 333:272-275 (1988)) 및 7H6 항원(Zhong et al, J. Cell Bio., 120:477-483 (1993))은 막으로부터 더 떨어져 위치지어졌고, 아직 클로닝되지 않았다. Rab 13, 작은 GTP 결합 단백질도 또한 최근에 접합 영역으로 위치지어졌다(Zahraoui et al, J. Cell Biol., 124:101-115 (1994)). 다른 작은 GTP-결합 단백질들은 피질 세포골격을 조절한다고 알려져 있는데, 즉, rho는 국소(focal) 접촉에서 액틴-막 부착을 조절하고(Ridley et al, Cell, 70:389-399 (1992)), rac은 성장인자-유도된 막 파동을 조절한다(Ridley et al, Cell, 70:401-410 (1992)). 더 잘 특성화된 세포 접합, 국소 접촉(Guan et al, Nature, 358:690-692 (1992)), 및 애드헤렌 접합(Tsukita et al, J. Cell Biol., 123:1049-1053 (1993))에 있는 플라크 단백질들의 알려진 기능 으로 분석에 기초하여, tj-연관 플라크 단백질이 세포막을 통해 양쪽 방향으로 신호를 전달(transduce)하고, 피질 액틴 세포골격에의 연결을 조절하는데 관여한다고 가정되었다.

상피가 겪는 많은 다양한 생리학적 및 병리학적 도전을 만족하기 위해, ZO는 신속하고 조화롭게 응답할 수 있어야 하며, 그것은 복잡한 조절 시스템의 존재를 필요로 한다. ZO의 회합 및 조절에 관여하는 정확한 메카니즘의 특성화는 현재 활발한 연구 분야이다.

이제 tj 구조적 및 기능적 연결이 흡수 세포의 액틴 세포골격과 tj 복합체사이에 존재한다는 증거가 있다(Gumbiner et al, 상동; Madara et al, 상동; 및 Drenchahn et al, J. Cell Biol., 107:1037-1048 (1988)). 액틴 세포골격은 미세필라멘트의 복잡한 그물망으로 구성되며, 그 정확한 기하학은 액틴-결합 단백질의 큰 뼈대(cadre)에 의해 조절된다. 액틴-결합 단백질의 인산화 상태가 세포 원형질막에의 세포골격 연결(linking)을 조절하는 한 예는 미리스토일화 알라닌-리치 C 카이나제 기질(이하 "MARCKS")이다. MARCKS는 원형질막의 세포질면에 연합하는 특이적 단백질 카이나제 C(이하 "PKC") 기질이다(Aderem, Elsevier Sci. Pub. (UK), 페이지 438-443 (1992)). 그 비-인산화 형태에서, MARCKS는 막 액틴에 가교결합한다. 따라서, MARCKS를 통해 막과 연합된 액틴 그물망은 비교적 딱딱하기 쉽다(Hartwig et al, Nature, 356:618-622 (1992)). 활성화된 PKC는 MARCKS를 인산화하고, 그것은 막으로부터 해리된다(Rosen et al, J. Exp. Med., 172:1211-1215 (1990); 및 Thelen et al, Nature, 351:320-322 (1991)). MARCKS에 연결된 액틴은 막에서 공간적으로 떨어져서 더 가동적(plastic)이기 쉽다. MARCKS가 탈인산화될 때, 그것은 막에 되돌아가 다시 한번 액틴과 가교결합한다(Hartwig et al, 상동; 및 Thelen et al, 상동). 이들 데이터는 F-액틴 네트워크가 액틴-결합 단백질(MARCKS가 그중 하나)을 관여하는 PKC-의존성 인산화 과정에 의해 재정렬될 수 있다는 것을 제시한다.

II. 조눌라 오클루덴 독소("Zot") 및 조눌린

콜레라 독소(CT)를 코딩하는 ctxA 유전자를 결실시켜 구성된 대부분의 Vibrio 콜레라 백신 후보는 높은 항체 응답을 제거할 수 있으나, 백신접종자의 1/2 이상은 여전히 가벼운 설사가 발생한다(Levine et al, Infect. Immun., 56(1):161-167 (1988)). CT가 없이도 상당한 설사가 유발된 경우, V. 콜레라가 ctxA 서열이 결실된 균주에 여전히 존재하는 다른 장관독소(enterotoxigenic) 인자를 생성하는 것으로 가정된다(Levine et al, 상동). 결과적으로, V. 콜레라에 의해 만들어지고 잔류 설사의 원인이 되는 두 번째 독소, 조눌라 오클루덴 독소(이하 "Zot")가 개발되었다(Fasano et al, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 8:5242-5246 (1991)). zot 유전자는 ctx 유전자에 바로 인접하여 위치한다. V. 콜레라 균주사이의 ctx 유전자와 zot 유전자의 높은 퍼센트 병발(Johnson et al, J. Clin. Microb., 31/3:732-733 (1993); 및 Karasawa et al, FEBS Microbiology Letters, 106:143-146 (1993))은 콜레라에 전형적인 급성 탈수성 설사의 원인에서 Zot의 상승적 기능의 기능성을 제시한다. 최근에, zot 유전자는 또한 다른 장관 병원체로도 확인되었다(Tschape, 2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and other Salmonellosis, 47(요 약) (1994)).

토끼 회장 점막상에 시험시 Zot가 세포간 긴밀 접합의 구조를 조절하여 장관(intestinal) 투과성을 증가시킨다는 것이 이미 밝혀졌다(Fasano et al, 상동). 페리세포(pericellular) 경로의 변화의 결과로서 장관 점막이 더 투과적으로 된다고 밝혀졌다. 또한 Zot는 Na⁺-글루코스 커플된 활성 수송에 영향을 주지 않고, 세포독성이 아니며, 경피(transepithelial) 내성을 완전히 폐지하지 못한다고 밝혀졌다(Fasano et al, 상동).

더 최근에, Zot는 장관 점막에서 긴밀 접합을 가역적으로 개방시킬 수 있으며, 따라서 Zot는 치료제에 공동-투여시 장관 약물 전달의 경구 투여 조성물로 사용시 치료제의 장관 전달 효과를 줄 수 있다고 밝혀졌다(WO 96/37196, U.S.P 5,827,534 및 U.S.P 5,665,389; 이들은 여기에 전체로 참고문헌으로서 포함됨). 또한 Zot는 코 점막에서 긴밀 접합을 가역적으로 개방할 수 있으며, 따라서 Zot는 치료제와 공동-투여시 치료제의 경비(nasal) 흡수를 향상시킬 수 있다(WO 98/30211 및 U.S.P 5,908,825; 이들은 여기에 전체로 참고문헌으로서 포함됨).

여기에 전체로 참고문헌으로서 포함된, U.S.P 5,864,014 및 U.S.P 5,912,323에서, CaCo2 세포, 심장, 장관 및 뇌 조직으로부터의 Zot 수용체가 동정되고 분리되었다. Zot 수용체는 상피 장관 및 경비 투과성의 조절에 관여하는 페리세포 경로의 제1단계를 나타낸다.

여기에 전체로 참고문헌으로서 포함된, U.S.P 5,945,510에서, Zot에 면역학 적으로 기능적으로 관련되고, 포유동물 긴밀 접합의 생리적 조절인자로서 기능하는 포유동물 단백질이 동정되고 정제되었다. 이들 포유동물 단백질은 "조눌린"이라 불리어지며, 장관 및 경비 점막의 긴밀 접합뿐만 아니라, 혈뇌장벽의 긴밀 접합을 통한 치료제의 흡수를 향상시키는데 유용하다. 이들 단백질은 Zot 수용체에 결합하는 능력에 의해 더욱 특성화된다.

여기에 전체로 참고문헌으로서 포함된, "조눌린의 펩티드 길항제 및 그의 사용방법"에 관한, 1998. 8. 3. 출원된 U.S. 특허출원번호 09/127,815에서, 조눌린의 펩티드 길항제가 동정되었다. 상기 펩티드 길항제는 Zot 수용체에 결합하나, 포유동물 긴밀 접합의 개방을 생리적으로 조절하는 기능을 하지는 않는다. 이 펩티드 길항제는 Zot 수용체에 대한 Zot와 조눌린의 결합을 경쟁적으로 저해함으로써, 포유동물 긴밀 접합의 개방을 생리적으로 조절하는 Zot 및 조눌린의 능력을 저해한다.

III. 항원 제시 세포 및 면역 응답

면역 응답 및 면역조절의 완전한 논의를 위해, 그 기술이 여기에 참고문헌으로 포함된, Sztein et al, New Generation of Vaccines, 페이지 99-125, Eds. Levine et al (1997)의 제10장 "Recent Advances in Immunology"를 참조한다.

감염체(infectious agent)에 대한 방어의 1차 메카니즘중 하나는 특이적 또는 후천성 면역을 포함한다. 선천성 면역과 대조적으로, 다른 것들중 항체, 세포독성 림프구(이하 "CTL"), T 림프구-유래 사이토킨(IFN-γ, IL-4 등)을 포함하는 후천성 면역의 이펙터 메카니즘은 항원 또는 감염체에 노출 후 유도되며 특이적 항 원에 연속적 노출로 크게 증가한다. 항원에 대한 노출 경험을 "회상(recall)"하고 증가된 규모의 면역학적 이펙터 응답으로 신속히 응답하는(면역학적 기억) 이러한 능력은 감염체에 대한 면역예방적 백신접종의 기초를 이룬다. 특이적 면역 응답에 관여하는 주된 세포 유형은 T 및 B 림프구이다.

B 림프구 또는 B 세포는 골수에서 유래하며 항체 분비 세포(원형질 세포)의 전구체이다. B 세포는 세포막상의 면역글루불린 수용체를 통해 항원(단백질, 탄수화물 또는 단순한 화학기)을 인식한다(Fearon et al, Science, 272: 50-53 (1996); Ziegler-Heitbroack et al, Immunol. Today, 14:121-152 (1993); 및 Banchereau et al, Adv. Immunol., 52; 125-262 (1992)). 항원에 의해 시발(trigger)된 후, 그들은 T 세포, 대식세포 및 다른 세포 유형에서 유래된 사이토킨의 영향하에 클론적으로 팽창하고 항체 동종형(예컨대 IgM 내지 IgG, IgE 또는 IgA)의 그들의 발현을 바꾼다. 체세포적으로-돌연변이된, 고 친화성 B 세포를 림프절, 비장, 파이어판 및 말초 림프계의 더욱 붕괴된 림프 응집괴에 형성된 배중심(germinal centers)내 및 주변에서 항원에 의해 발생시키고 선택한다(Banchereau et al, (1996) 상동; Clark et al, Ann. Rev. Immunol., 9:97-127 (1991); 및 MacLennan et al, Immunol. Today, 14:29-34 (1993)). 그들은 B 세포 기억의 기초이다.

T 림프구 또는 T 세포는, B 세포와 대조적으로, 클래스 I 또는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 결합되어 항원제시세포(이하 "APC")의 표면상에 제시되는 단백질 항원에서 유래된 펩티드를 인식한다. 적당한 친화성의 T 세포 수용체(이하 "TCR")를 발현하는 T 림프구의 클론은 항원에 의해 증식하고 이펙터 세 포로 발전하도록 유발된다(Fearon, (1996) 상동; Sprent et al, Cell, 76:315-322 (1994); 및 Hendrick et al, Germain, Fundamental Immunology, 3판, 페이지 629-676 (1993)). 감염체를 제거한 후, 항원-특이적 클론은 기억 T 세포로 남아 있어, 나중에 항원에 노출시 더 강하고 더 신속하며 때때로 질적으로 다른 특이적 면역 응답을 제공한다.

두 종류의 주된 T 세포 집단, CD4 분자를 발현하는 것들과 CD8 분자를 발현하는 것들이 있다. CD4 및 CD8 분자는 클래스 II 및 클래스 I MHC 분자에 각각 결합하여 항원 제시동안 중요한 보조분자(공동-수용체)로서 작용하는 T 세포 표면 당단백질이다(Hendrick et al, 상동 (1993)). 따라서, CD4 및 CD8 분자는 MHC 분자와 연합하여 제시된 항원 펩티드에의 TCR 복합체의 특이적 결합에 의해 개시된 T 세포와 APC의 상호작용을 안정화하는데 중요한 역할을 한다. 결과적으로, 원래 서로 다른 기능적 특성을 갖는 T 세포 집단을 동정하는 마커로 주로 사용되던 CD4 및 Cd8 분자는 클래스 II MHC-제한 및 클래스 I MHC-제한 T 세포 활성화에서 주요 역할을 한다. CD4+ 세포(T 헬퍼 또는 Th)는 주로 염증성 응답에 관여되며 B 세포에 의한 항체 생산에 도움을 주는 반면, CD8+ 세포(T 세포독성 또는 Tc)는 박테리아, 비루스 및 기생충을 포함하는 생원체에 의해 감염된 표적 세포의 클래스 I MHC-제한 사멸에 주로 관여하는 CTL의 대부분을 구성한다(Sztein et al, J. Immunol., 155:3987-3993 (1995); Kaufman, Ann. Rev. Immunol., 11:129-163 (1993) 및 Immunol. Today, 9:168-174 (1988); Townsend et al, Cell, 44:959-968 (1986); Malik et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3300-3304 (1991); Sedegah et al, J. Immunol., 149:966-971 (1992); 및 Shearer et al, Immunol. Today, 17:21-24 (1996)).

T 세포 팽창 및 분화 (또는 림프구 증식)를 초래하는 T 세포의 성공적인 항원 특이적 활성화는 APC상의 MHC-항원 복합체와 T 세포 표면상의 TCR의 상호작용에 의해 제공되는 제1 신호와, APC상의 B7 패밀리중 일원(예컨대, CD80 (B7-1) 또는 CD86 (B7-2))에 대한 CD28 (공동-자극 분자)의 결합, 또는 IL-2와 같은 가용성 인자에 의해 제공되는 보충적인 제2 신호를 필요로 한다(Lenschow, Ann. Rev. Immunol., 14:233-258(1996); 및 Linsley et al, Ann. Rev. Immunol., 11:191-212(1993)). CD28/B7 공동-자극 경로와 T 세포-APC 상호작용의 안정화를 도와주는(또한 림프구 호밍(homing)에 중요한 역할을 하는 것으로 나타난) 다른 부착 분자들에 대한 연구는 근년에 상당한 진전이 있는 중요 분야중 하나이다.

T 세포에 항원의 제시는 APC내의 일련의 세포내 사건들이 관여하며, 이들은 항원 펩티드 단편을 발생시키고, MHC 분자에 이들 펩티드를 결합시켜 안정한 펩티드-MHC 복합체를 형성하고, 이들 복합체를 그들이 T 세포의 표면에서 TCR에 의해 인식될 수 있는 세포 표면으로 수송하는 것을 포함한다. 항원 가공 및 제시의 두가지 주요 경로("고전적 경로")의 존재에 대한 증거가 쌓여 있다. 이들 경로중 하나인, "사이토졸 경로"는 클래스 I MHC 분자와 연합된, 바이러스 분자, 종양 항원 및 자가-펩티드와 같은, APC에서 내생적으로 생성되는 펩티드의 제시에 우선적으로 사용된다(Hendrick et al, 상동; 및 Germain, 상동 (1993)). 클래스 I MHC 분자에 복합된 다량의 자가-펩티드의 제시는 APC가 자가 및 비-자가를 구별할 수 없는 것 에 기인한다. 정상 조건에서, 자가-펩티드를 인식하도록 선택된 대부분의 T 세포는 T 세포 분화도중 제거되거나, 활성적으로 하향-조절되며, 결국 자가-펩티드-클래스 I MHC 복합체에 의해 활성화될 수 없다. 클래스 II MHC 분자에 결합된 가용성 외생적 항원의 제시에 우선적으로 사용되는, 항원 가공(processing) 및 제시(presentation)의 제2 "고전적 경로"인, "엔도좀 경로(endosomal pathway)"는 APC에 의한, 또는 특이적 수용체에의 결합에 의하거나 마크로피노사이토시스에 의한 유상 흡수에 의한 항원의 포획을 포함한다(Lanzavecchia, Curr. Opin. Immunol., 8:348-354 (1996)). TCR을 통한 T 세포의 시발은 인플루엔자 핵단백질의 경우에 200-600 펩티드/MHC 복합체 만큼 적게 보여진다(Falk et al, Semin. Immunol., 5:81-94 (1993)). 대부분의 면역 응답에서, 클래스 I MHC분자와 연합된 항원 에피토프는 CD8+ CRL 응답의 활성화를 시발하는 반면, 클래스 II MHC 분자에 복합된 가용성 단백질에서 유래된 항원 단편(에피토프)은 CD4+ Th 세포에 의해 인식된다. 이들 발견은 면역 활성화의 초기 단계에 관련된 메카니즘에 대한 지난 수년간의 가장 중요한 업적에 속하며, 성공적인 백신의 개발에 결정적이다.

상기한 바와 같이, 항원 가공 및 제시의 두가지 "고전적 경로"가 있다. 클래스 I MHC 경로는 세포질, 핵 및 미토콘드리아를 포함하여 전부는 아니지만 대부분의 세포 구역에 존재하는 세포 단백질의, CD8+ CTL에 의한 인식을 위한 가공에 가장 자주 사용되는 것이다(Falk et al, 상동 (1993)).

클래스 II MHC 경로는 CD4+ Th 세포에 제시될 수 있는 세포외 박테리아 및 기타 감염성 미생물에 의해 생성되는 단백질과 같은 외생적 항원의 가공 및 제시에 우선적으로 사용된다. 클래스 I 및 II MHC 분자 둘다는 표면 "수용체" 또는 "결합 클레프트"의 사용하여 펩티드 항원을 결합한다. 그러나, 항원 가공 및 제조의 루트는 둘사이에 현격히 다르다. 클래스 I 항원은 "세포질 경로(cytosolic pathway)"에 의해 가공 및 제조된다. 구체적으로, 세포내 합성된 펩티드는 작은 단백질 단편들로 분해된 후, 소포체(endoplasmic reticulum: ER)의 막을 거쳐 운반된다. ER 내에서, 항원 단편은 클래스 I MHC 분자에 결합하여 복합체를 형성한 후, 골지체(Golgi apparatus) 및 최종적으로는 세포 표면으로 수송되고, 거기서 그들은 TCR에 의해 인식되어, 항원-특이적 CTL 팽창 및 분화를 신호(signalling)하는데, 이는 면역 응답의 제1 단계이다. 구체적으로, 천연 항원은 순환하는 APC에 의해 포획되며, 그 항원은 특이적 또는 비특이적 수용체에 결합한다. 그 다음 항원은 수용체-매개 엔도사이토시스 또는 피노사이토시스의 메카니즘을 통해 APC에 의해 내부로 안내된다. 내부로 들어온 항원은 다음 항원의 세포내 수송 및 분해에 관여하는 막 결합 운반체인, 엔도좀(endosome)에 위치한다. 절단된 펩티드 단편은 다음 클래스 II MHC 분자에 결합하여 복합체를 형성하고, 그 복합체는 골지체를 통해 엔도좀 구획내로 그리고 세포 표면으로 수송되어 TCR에 의해 인식되고, 다시 항원-특이적 Th 세포 팽창 및 분화를 신호한다.

APC는 면역 응답의 발생에 매우 중요한 역할을 한다. 클래스 I-제한 형식에서 CTL에 가공된 항원의 제시를 위해, APC는 클래스 I MHC 분자를 발현해야 하고, 클래스 I MHC 분자에 복합된 내생적으로 생성된 단백질을 세포 표면상에 발현하는 능력을 가져야만 한다. 세포질에 접근한 비루스, 기생충 또는 박테리아 단백질 또 는 종양 항원을 내생적으로 생성하는 거의 모든 세포는 APC로서 기능할 수 있다. 클래스 II 제한 형식에서 Th 세포에 가공된 항원을 제시를 위해, APC는 특정 항원에 대한 특이적 또는 비특이적 수용체를 통해 항원을 인식하고 결합할 수 있어야 한다. Th 림프구에 항원을 가장 효율적으로 제시하는 세포, 소위 직업적인 APC는 수상 세포(DE), 대식세포, B 림프구, 랑게르한스 세포, 및 특정 예에서, 인간 내피 세포(Lanzavecchia, 상동 (1996))를 포함한다.

골수에서 유래한 DC는 가용성 항원의 제시에 가장 효율적인 APC라고 여겨진다. DC는 말초에서 항원을 포획하고 비장 또는 림프절로 이주하여, 거기서 그들은 Th 세포, 특히 원시적 T 세포를 효율적으로 활성화한다(Lanzavecchia, 상동 (1996); 및 Peters et al, Immunol. Today, 17:273-278 (1996)). 몇몇 독특한 특성들이 DC가 항원 제시자로서 효율적으로 기능할 수 있도록 해준다. 구체적으로, 그들은 구조적 마크로피노사이토시스, CD32 수용체 결합을 통한 항원-항체 복합체의 내부화(internalization), 및 만노스 수용체 결합을 통한 만노실화 또는 푸코실화 항원의 내부화를 포함하는, 여러 메카니즘에 의해 가용성 항원을 내부로 도입하는 능력을 가진다. 이것은 DC가 짧은 시간내에 다량의 유체를 샘플링하여, 그들을 클래스 II MHC 분자 및 프로테아제를 함유하는 라이소좀 구획에 축적시키게 해준다. DC는 또한 IL-1α, IL-1β, 및 TNF-α와 같은 면역향성 사이토킨에 의해 상향조절되는 다수의 공동자극 및 기타 부착 분자들을 구조적으로(constitutively) 발현함으로써, 클래스 II MHC 제한된 Th 면역 응답을 위한 APC로서 작용할 수 있는 그들의 능력을 향상시킨다.

대식세포 및 다른 단핵 식세포는 아마도 그들의 박테리아 및 기생충과 같은 큰 입자들을 식작용할 수 있는 능력을 통해, 비루스보다는 대부분의 병원성 미생물에서 유래된 항원을 위한 가장 효과적인 APC일 것이다. 전형적인 조건에서, 식작용된 미생물은 그 다음 파고라이소좀내에서 죽고 분해되어, Th 세포에 제시를 위한 클래스 II MHC 분자에의 결합에 사용할 수 있는 항원 단편의 생성을 초래한다. 대식세포가 효과적인 APC로 작용하도록 하는 다른 중요한 메카니즘은 CD16, CD32 및 CD64 수용체에의 항원-항체 복합체의 결합을 통해 가용성 항원을 내부화할 수 있는 그들을 능력을 포함한다. 대식세포는 또한 C3 및 기타 C'를 위한 수용체를 통해, 그리고 성장인자에 의해 자극시 마크로피노사이토시스에 의해 보체 피복된 단백질을 내부화한다. 더욱이, 대식세포는 만노스를 위한 수용체를 발현하고, T 세포 응답에 대한 강력한 면역조절 활성을 발휘하는 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α 및 TNF-β를 포함하는 프로(pro)-염증성 사이토킨의 주요한 공급원이 된다(Sztein et al, 상동 (1997)).

B 림프구는 Th 세포에의 제시를 위한 가용성 항원에 대한 매우 효과적인 APC이다. 이것은 특이적 막 면역글로빈(mIg) 및 Igα(CD79α)-Igβ(CD79β) 헤테로다이머로 구성된, B-세포 수용체 복합체(BCR)를 통해 특이적 가용성 항원을 매우 효율적으로 결합하고 내부화할 수 있는 그들의 능력에 크게 기초한다(Falk et al, 상동 (1993)).

골수 선조세포에서 유래된, 랑게르한스 세포(LC)는 APC 능력을 갖는 상피내에 존재하는 유일한 세포로 여겨진다. LC는 림파틱을 통해 상피밖으로 이주하여 지역적 림프절로 가서, 거기서 그들은 DC로 발전한다. 흥미롭게도, LC는 제한된 형식에서 미생물 지질 및 당지질 항원과 같은 비단백질 항원을 T 세포에 제시할 수 있는 비전형적 MHC 분자인, CD1을 발현한다.

본 발명은 여기서 APC-매개된 면역 응답의 항원 특이적 하향-조절에 중점을 둔다. 본 발명은 Zot가 특이적이고 포화적인 방식으로 결합하는 대식세포 표면 수용체의 발견에 기초한다. 본 발명은 Zot 또는 조눌린을 항원-특이적 면역조절인자로서 그리고 면역요법에 사용하는 방법을 기술한다. 구체적으로, Zot 및 조눌린 둘다는 미토겐 유도 응답에 영향을 주지않고 투여량 의존 방식으로 APC-매개된 항원-특이적 림프구 증식을 저해한다. 면역 응답의 이러한 하향-조절은 적어도 일부 항원 흡수의 감소와 관련되어 있다.

현재 구입가능한 면역 응답의 조절인자들, 예컨대 사이클로스포린 및 스테로이달 화합물은 면역 시스템의 항원 및 미토겐 자극에 일반화된 효과를 준다(Reed et al, J. Immunol., 137:150-154 (1986)). 여기 기술된 본 발명은 종래의 면역조절인자에 전형적인, 증가된 감염 감수성 및 일반화된 면역 억제와 같은 음성적인 부작용을 유도하지 않고, 특정 항원에 대한 면역 응답의 하향-조절을 가능케 한다는 이점을 제공한다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 특정 항원에 대한 동물 숙주의 면역 응답을 하향-조절하는 방법을 제공하며, 그에 의해 면역 기초 용법을 촉진시킨다. 구체적으로, 본 발명 의 목적은 림프구에 항원을 가공 및 제시하는 항원제시세포(APC)의 능력을 저해하는 것으로서, 그에 의해 소정 항원에 대한 응답에서 림프구 증식 및 후속 면역 시스템 반응을 억제한다.

본 발명의 또 다른 목적은 Zot-관련 면역조절인자의 유효량을 투여함으로써, 다발성 경화증, 류마티스양 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 복부 질병, 스조그렌스 신드롬, 전신성 홍반성 루푸스, 자기면역 갑상선염, 특발성 혈소판감소성 자반병, 용혈성 빈혈, 그레이브스 질병, 애디슨스 질병, 자기면역 고환염, 악성 빈혈, 혈관염, 자기면역 응고병증, 중증 근무력증, 다발신경염, 천포창, 류마티스성 심염, 다발성근염, 피부근염 및 경피증과 같은 자기면역 또는 면역 관련 질환 또는 질병을 겪는 동물의 치료를 제공한다. 다른 구체예에서, 자기면역 또는 면역 관련 질환 또는 질병을 겪는 동물의 치료는 특이적 자기-면역 관련 항원(들)과 조합하여 Zot-관련 면역조절인자의 유효량의 투여를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Zot-관련 면역조절인자의 유효량을 투여함으로써 조직 또는 기관 이식후의 면역 거부를 겪고 있는 동물의 치료를 제공한다. 다른 구체예에서, 조직 또는 기관 이식후의 면역 거부를 겪고 있는 동물의 치료는 특이적 이식 항원(들)과 조합하여 Zot-관련 면역조절인자의 유효량의 투여를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Zot-관련 면역조절인자의 치료적 유효량을 투여함으로써, 천식, 건선, 습진성 피부염, 카포시스 육종, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 평활근 세포의 증식성 질병, 및 진균, 비루스, 기생충 또는 박테리아 감염과 관련된 염증성 증상과 같은 염증성 또는 알레르기성 질환 또는 질병을 겪는 동물의 치료를 제공한다. 다른 구체예에서, 염증성 또는 알레르기성 질환 또는 질병을 겪는 동물의 치료는 특이적 염증 관련된 항원(들) 또는 알레르기원(들)과 조합하여 Z0t-관련된 면역조절인자의 유효량의 투여를 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명
이전의 연구들은 다양한 조직의 상피의 포유동물 긴밀 접합(또는 조눌라 오클루덴)의 개방을 생리학적으로 조절하는 Zot 및 조눌린의 능력에 초점을 맞추었으며, 그러한 조절은 특히 이들 막을 통한 약물 전달을 촉진하는데 유용하다. 이 연구의 과정에서, Zot 및 조눌린에 대한 수용체가 CaCo2 세포, 심장, 장관 및 뇌 조직으로부터 동정되고 분리되었다. Zot 수용체의 발견에 더하여, 조눌린의 펩티드 길항제가 동정되었는데, 상기 펩티드 길항제는 Zot 수용체에 결합하지만, 포유동물 긴밀 접합의 개방을 생리학적으로 조절하는 기능을 하지는 않는다(즉, 생물학적 활성 결여). 그 펩티드 길항제는 Zot 수용체에 대한 Zot 및 조눌린의 결합을 경쟁적으로 저해함으로써, Zot 및 조눌린이 긴밀 접합을 조절하는 능력을 저해한다.
파라세포 경로에 대한 Zot 및 조눌린의 알려진 효과에 비추어, 혈액에서 분리된 완전 분화 대식세포상의 Zot에 대한 수용체를 발견한 것은 정말 놀란만한 것이었다. 처음에는 왜 대식세포와 같은 순환 세포가 조직 세포 조절과 관련된 분자에 대한 수용체를 가졌는지 불명확하였다. 이 질문에 대한 해답을 추구하다가, Zot 및 조눌린은 또한 대식세포의 활성을 생리학적으로 조절하는 능력을 가진다는 것이 발견되었다. 비록 이론에 의해 묶이기를 바라지 않지만, Zot는 대식세포 표면 수용체에 특이적이고 포화적인 방식으로 결합하여, 대식세포상의 수용체를 봉쇄하고 있다. 대식세포에 결합함으로써, Zot는 림프구에 항원을 가공하고 제시할 수 있는 대식세포의 능력을 바꾸고, 궁극적으로 투여량 의존 및 항원-특이적 방식으로 항원에 대한 응답에서 림프구의 증식을 억제한다. 달리 말하면, Zot는 면역 응답의 항원-특이적 하향-조절을 허용한다. 이하 상세히 설명될 그 결과는 면역 응답의 이 하향-조절이 적어도 일부 항원의 흡수 감소와 연관되어 있다는 것을 나타낸다. Zot는 다기능성 단백질로, 항원의 흡수 및 수송을 조절하는 이중 메카니즘에 의해 면역 응답을 제어한다고 밝혀졌다.
조눌라 오클루덴 독소 또는 "Zot"는 V. 콜레라에 의해 생성된다. Zot가 유래되는 V. 콜레라의 특정 균주는 본 발명에서 중요한 사항이 아니다. 그러한 V. 콜레라 균주의 예들은 균주 569B, 395 및 E7946을 포함한다(Levine et al, 상동; Johnson et al, 상동; 및 Karasawa et al, 상동).
여기 사용된, "Zot"는 399 아미노산의 성숙 단백질 뿐만 아니라 tj를 조절하는 능력을 보유한 그 돌연변이체를 의미한다. 예컨대, 아미노산 1-8의 N-말단 결실은 Zot 활성에 영향을 주지 않으면서 만들어 질 수 있으며, Zot의 N-말단 융합 단백질이 Zot 활성에 영향을 주지 않으면서 만들어 질 수 있다. 그러한 돌연변이체는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 쉽게 제조될 수 있으며, 여기 기술된 Zot 활성에 대해 스크린할 수 있다.
Zot는 예컨대, 말토스 결합 단백질(하기 실시예 1 참조), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(하기 실시예 2 참조) 또는 6 폴리-히스티딘(하기 실시예 2 참조)과 같은 다른 유전자와 융합하거나 단독으로 zot 유전자를 과도-발현하는 유전공학적으로 조작된 E. coli 균주(Baudry et al, Infect. Immun., 60:428-434 (1992))에 의해 수득디고 정제될 수 있다.
여기 사용된, 용어 "조눌린(zonulin)"은 다음 N-말단 아미노산 서열: Asn Asp Gln Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val Ile Gln (서열번호: 1), 또는 다음 N-말단 아미노산 서열: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu (서열번호: 2)를 가지며, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결정시 약 47 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 실질적으로 순수한 생물학적 활성 단백질뿐만 아니라, Zot에 대한 수용체에 결합하여 tj를 조절할 수 있는 능력을 보유한 그 돌연변이체를 의미한다.
조눌린은 예컨대 토끼 또는 인간 세포/조직과 같은 다양한 포유동물 세포 및 조직에서 제조되거나 발견된다. 조눌린이 유래되는 특정 포유동물 세포/조직 유형은 본 발명에서 중요한 사항이 아니다. 그러한 포유동물 조직 유형의 예들은 심장, 폐, 장관, 간, 뇌, 신장 및 췌장을 포함한다.
조눌린은 예컨대 여기 참고문헌으로 포함된 U.S.P. 5,945,510 의 실시예 3에 기술된 바와 같이, 항-ZOT 항체를 이용한 친화성-정제 크로마토그라피에 의해 수득되고 정제될 수 있다.
여기 사용된, 용어 "Zot-관련 면역조절인자" 또는 "Zot-관련 면역조절분자"는 상기 Zot 또는 조눌린을 의미한다. 또한, 여기 사용된, 용어 "저해"는 림프구 증식의 실질적 감소를 초래하는 APC 활성의 어떤 측면의 하향-조절을 의미한다. 활성의 예는 항원 흡수, 항원 가공 및 항원 제시를 포함한다. 여기 사용된 용어 "저해"는 완전한 기능 또는 결과의 억제를 암시할 필요는 없다. 오히려 부분적 저해를 생각할 수 있다.
다발성 경화증, 류마티스양 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 복부 질병, 스조그렌스 신드롬, 전신성 홍반성 루푸스, 자기면역 갑상선염, 특발성 혈소판감소성 자반병, 용혈성 빈혈, 그레이브스 질병, 애디슨스 질병, 자기면역 고환염, 악성 빈혈, 혈관염, 자기면역 응고병증, 중증 근무력증, 다발신경염, 천포창, 류마티스성 심염, 다발성근염, 피부근염 및 경피증과 같은 자기면역 또는 면역 관련 질환 또는 질병을 겪는 동물 숙주의 치료를 제공하기 위해, Zot-관련 면역조절인자를 단독으로 또는 특이적 자기-면역 관련 항원과 조합하여 투여한다. 자기-면역 질환 또는 질병과 관련된 특이적 자기-면역 항원의 예들은 글리아딘(복부 질병에 관련 항원) 및 미엘린 베이스 단백질(다발성 경화증에 관련)이다.
조직 또는 기관 이식 후의 면역 거부를 겪는 동물 숙주의 치료를 제공하기 위하여, Zot-관련 면역조절인자를 단독으로 또는 특이적 이식 항원과 조합하여 투여한다. 이식 항원은 이식 조직 또는 기관의 HLA에 대해 측정함으로써 수득할 수 있다.
천식, 건선, 습진성 피부염, 카포시스 육종, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 평활근 세포의 증식성 질병, 및 진균, 비루스, 기생충 또는 박테리아 감염과 관련된 염증성 증상과 같은 염증성 또는 알레르기성 질환 또는 질병을 겪는 동물 숙주의 치료를 제공하기 위해, Zot-관련 면역조절인자를 단독으로 또는 특이적 염증 관련 항원 또는 알레르기원과 조합하여 투여한다. 염증성 또는 알레르기성 질환 또는 질병와 관련된 특이적 염증 관련 항원의 예들은 화분 및 먼지(천식과 관련), 우유에서 발견되는 단백질 또는 그 단편(습진성 피부염과 관련), 미엘린 베이스 단백질(다발성 경화증과 관련) 및 염증성 질환에 관련된 특정 비루스, 기생충 또는 박테리아에 대한 백신 항원을 포함한다.
본 발명은 면역 응답의 항원-특이적 하향-조절을 허용한다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 한 구체예는 특이적 항원과 조합하거나 단독으로 Zot-관련 면역조절인자(Zot 또는 조눌린)의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 상기 항원에 대한 림프구의 응답은 투여량-의존 방식으로 특이적으로 억제된다. 여기 상세히 설명된 결과로부터 본 발명은 대식세포 매개를 필요로 하고 항원 제시 세포(APC)에 의해 가공 및 제시되는 항원들에 한정된다는 것이 분명하다. 본 발명은 대식세포 및 다른 단핵 식세포, 수상 세포, B 림프구, 랑게르한스 세포 및 인간 내피 세포를 포함하는 모든 APC에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, APC는 대식세포이다.
본 발명은 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro) 환경 둘다에서 사용될 수 있다. 오직 하나의 임계점은 생 숙주 또는 세포 배양물에서 동물 세포에의 투여이다. 동물세포는 그 분류학적 위치가 동물계에 위치하는 다세포 생물, 1차 세포 배양물, 외식체 배양물 또는 형질전환 세포주에 존재하거나 그로부터 유래된 핵이 있고 염록체가 없는 세포로서 정의된다.
본 발명에 사용된 수용자(recipient) 또는 숙주 동물은 임계적이지 않으며, 동물계내의 모든 생물에 존재하거나 그로부터 유래된 세포를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 동물은 포유동물과내에 있다. 바람직한 동물 또는 동물 세포는 인간, 소, 양, 돼지, 고양이, 버팔로, 개, 염소, 말, 당나귀, 사슴 및 유인원과 같은 포유동물 세포이다. 가장 바람직한 동물 또는 동물 세포는 인간 또는 인간 세포이다.
투여의 특정 모드 및 방법은 본 발명에 임계적 사항이 아니다. 오직 하나의 임계성은 Zot-관련 면역조절분자 및 항원이 둘다 손상되지 않고 대식세포에 도달하는 것이다. 본 발명의 명세서에서, Zot-관련 면역조절분자는 항원과 공동-투여될 수 있다. 이와 달리, 두 개가 순차적으로 투여될 수도 있다. 편의를 위해, 투여 및 의약 제조의 방법에 대한 논의는 항원의 투여 및 제조에 한하기로 한다. 그러나, 동일한 방법이 Zot-관련 면역조절 분자의 투여에 적용될 수 있다는 것은 명백하다. 더욱이, 논의는 단일 항원에 제한되지만, 하나 이상의 항원이 투여될 수 있으며, 하나 이상의 항원에 대한 면역 응답이 동시에 후속적으로 하향-조절된다는 것은 명백하다.
성공적인 투여는 APC 풍부한 환경으로의 전달을 필요로 한다. 바람직한 투여 루트는 점막 또는 림프 조직과 같은, 면역 시스템의 부위를 표적으로 하는 것들을 포함한다. 따라서, 비내(intranasal), 안내(intraocular), 장내(intraintestinal) 및 질내(intravaginal)가 바람직한 투여 루트이다. 이것은 피내(intradermal), 근내(intramuscular), 피하(subcutaneous) 및 정맥내(intravenous)와 같은 장외 투여가 Zot 또는 조눌린 단독 또는 항원(들)과 조합하여 투여하는 효과적인 루트일 수 있다는 것을 배제하지 않는다.
특정 투여 루트에 따라, 투여 형태는 고체, 반고체, 또는 액체 제제일 수 있다. 투여 형태는 약학적 제제의 업계에 표준인, 첨가제, 윤활제, 안정화제, 완충제, 피복제, 및 부형제를 포함할 수도 있다.
투여 모드에 관하여, 항원은 소장 전달을 위한 경구 투여 조성물로서 투여될 수 있다. 소장 전달을 위한 그러한 경구 투여 조성물은 당업계에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 내위산성 정제 또는 캡슐을 포함한다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16판, Eds. Osol, Mack Publishing Co., Chapter 89 (1980); Digenis et al, J. Pharm. Sci., 83:915-921 (1994); Vantini et al, Clinica Terapeutica, 145:445-451 (1993); Yoshitomi et al, Chem. Pharm. Bull., 40:1902-1905 (1992); Thoma et al, Pharmazie, 46:331-336 (1991); Morishita et al, Drug Design and Delivery, 7:309-319 (1991); 및 Lin et al, Pharmaceutical Res., 8:919-924 (1991); 이들 각각은 여기에 전제로 참고문헌으로서 포함됨)
정제는, 예컨대 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 또는 셀룰로스 아세테이트 테레프탈레이트의 첨가에 의해 내위산성이 될 수 있다.
캡슐은 항원이 경질 또는 연질 가용성 용기 또는 젤라틴 껍질내에 밀봉한 고체 투여 형태이다. 캡슐 제작에 사용되는 젤라틴은 콜라겐성 물질의 가수분해에 의해 수득된다. 두가지 유형의 젤라틴이 있다. 산성 프로세싱에 의해 돼지 피부에서 유래된 유형 A, 및 알칼리성 프로세싱에 의해 뼈 및 동물 피부에서 유래된 유형 B가 있다. 경질 젤라틴 캡슐의 사용은 개별 대상에 대해 최적으로 간주되는 정확한 투여 레벨로 항원 단독 또는 그 조합을 처방함에 있어 선택을 허용한다. 경질 젤라틴 캡슐은 두 개의 섹션으로 구성되며, 하나가 다른 하나를 덮고 있어서, 면역조절분자와 조합 또는 단독의 항원을 완전히 둘러싸고 있다. 이들 캡슐은 항원 또는 항원 함유 내위산성 비드를 캡슐의 한쪽 끝에 도입하고 뚜껑을 씌움으로써 충전된다. 경질 젤라틴 캡슐은 대부분 젤라틴, FD&C 색소, 및 때때로 이산화티타늄과 같은 불투명제로 제조된다. USP는 이 목적을 위한 젤라틴이 제조동안 붕괴를 방지하기 위해 0.15% (w/v) 이산화황을 함유할 수 있도록 허용한다.
본 발명의 명세서에서, 소장 전달을 위한 경구 투여 조성물은 또한 항원이 위액에 의해 심각하게 불활성화되는 것을 방지하기 위한 수성 완충제를 함유하는 액체 조성물을 포함할 수 있으며, 그럼으로써 항원이 활성 형태로 소장에 도달할 수 있도록 한다. 본 발명에 사용될 수 있는 그러한 수성 완충제의 예들은 중탄산염 완충제(pH 5.5 내지 8.7, 바람직하게는 약 pH 7.4)를 포함한다.
경구 투여 조성물이 액체 조성물일 때, 안정성 문제를 최소화하기 위해 조성물은 투여 직전에 제조되는 것이 바람직하다. 이 경우에, 액체 조성물은 동결건조된 펩티드 길항제를 수성 완충제에 용해시킴으로써 제조될 수 있다.
유사하게, 리포솜, 코킬레이트(cochleates), 수용성 중합체 및 마이크로스피어(microspheres)를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 투여 전달 운반체를 본 발명에서 고려할 수 있다. 투여 조성물은 또한 1인산(monophosphoryl) 리피드 A, QS-21, ISCOM 및 사이토킨과 같은 보조제를 더 포함할 수도 있다.
항원은 또한 면역계의 전신성(systemic) 요소에로의 전달을 위한 정맥내 투여 조성물로서 투여될 수도 있다. 그러한 조성물은 당업계에 잘 알려져 있으며, 조성물은 일반적으로 생리적 희석제, 예컨대, 증류수 또는 0.9%(w/v) NaCl을 함유한다. 유사하게, 투여방법은 장외적, 피내적, 근내적, 또는 피하적 및 상기와 같을 수 있다. 그러한 투여 형태는 생리적 완충제, 희석제 등을 포함하는 제약학적 허용 형태를 포함한다.
여기 사용된, Zot 또는 조눌린과 같은 Zot-관련 면역조절인자의 유효량이란 상기 항원 제시 세포의 활성을 하향-조절함으로써 항원 제시 세포-매개 림프구 증식을 하향-조절하는 효과를 낼 수 있는 효과적인 량을 의미한다. 사용된 항원 및 Zot-관련 면역조절인자 분자의 특정 양은 본 발명에서 중요하지 않으며, 치료될 질병 또는 증상 뿐만 아니라 치료 대상의 나이, 중량 및 성별에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 예컨대 장관 또는 혈관에서의 그러한 최종 농도를 달성하기 위해서는, 본 발명의 단일 경구 투여 조성물에서의 Zot-관련 면역조절분자의 양은 일반적으로 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 바람직하게는 약 2.0 ㎍ 내지 약 60 ㎍, 더 바람직하게는 약 20 ㎍ 내지 약 50 ㎍일 것이다. 마찬가지로, 본 발명의 단일 경구 투여 조성물에서 항원의 양은 일반적으로 약 0.01 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 더 바람직하게는 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 사이일 것이다. 명백하게, 항원의 정확한 투여량은 치료될 질환 또는 질병에 따라 변할 것이며, 바람직한 범위는 일상적인 실험과 최적화 과정을 통해 쉽게 결정될 수 있다.

도 1은 림프구 및 대식세포에 대한 Zot-FITC 포화 결합 곡선을 도시한다. 그 데이터는 Zot가 인간 단핵구/대식세포에 우선적으로 결합한다는 것을 증명한다.

도 2는 비표지된 Zot에 의한 Zot-FITC 결합의 봉쇄를 도시한다. 비표지된 Zot와 함께 PBMC의 예비배양은 단핵구/대식세포 및 T 림프구 둘다에 대한 Zot-FITC의 결합을 약 33%정도 감소시켰으며, 이는 이들 세포에 대한 Zot 결합이 수용체-매개적이라는 것을 제안한다. 정제된 MBP와 함께 세포의 예비배양은 Zot-FITC 결합을 봉쇄하는데 아무런 효과를 나타내지 못했으며, 이는 비표지된 Zot에 의한 봉쇄가 특이적 현상이라는 것을 가리킨다.

도 3은 PHA 및 테타너스 톡소이드에 의해 유도된 인간 PBMC의 증식에 대한 Zot의 효과를 도시한다. 그 데이터는 Zot가 PHA 유도된 증식에는 아무런 영향을 주지 않으면서도 투여량 의존 방식으로 테타너스 톡소이드-유도된 증식을 현저히 억제한다는 것을 증명한다.

도 4는 테타너스 톡소이드에 의해 유도된 인간 PBMC의 증식의 Zot-유도된 억제에 대한 항-Zot 항혈청의 효과를 도시한다. 항-Zot의 첨가는 테타너스 톡신-유도된 증식의 Zot-매개된 억제를 50% 이상 역전시킨다.

도 5A-5D는 정상 인간 CD14+HLA-DR+대식세포에 의한 FITC-덱스트란 흡수에 대한 Zot의 효과를 도시한다. 도 5A는 0℃에서 배지중 FITC-덱스트란 흡수율(2.9%)을 도시하며, 항원 흡수의 온도 의존성을 나타낸다. 도 5B는 37℃에서 배지중 FITC-덱스트란 흡수율(46.0%)을 도시하며, 항원 흡수에 대한 제어를 나타낸다. 도 5C는 37℃에서 BSA에서 FITC-덱스트란 흡수율(39.0%)을 도시하며, 항원 흡수의 음성적 제어를 나타낸다. 도 5D는 37℃에서 Zot에서 FITC-덱스트란 흡수율(19.3%)을 도시한다. 그 데이터는 Zot가 항원의 흡수율을 증가시킨다는 것을 보여준다.

도 6은 인간 대식세포 및 림프구에서 FITC-Zot 결합 부위/세포의 개수를 도시한다. PBMC를 Zot-FITC의 증가 농도와 함께 배양하고 유동 세포측정법에 의해 분석했다. Zot-FITC와 배양한 후 각 집단의 평균 형광 강도를 Quantum 26 MESF 키트를 사용하여 구축된 표준 곡선을 이용하여 Zot 결합 부위/세포의 개수로 변환하였다. 이들 데이터는 Zot의 결합이 약 0.5 pM에서 포화에 도달하는 포화성 현상이며, Zot 결합 부위/세포의 평균개수는 림프구(~9,000)에서 보다 대식세포(~106,000)에서 약 10배 더 높다는 것을 보여준다.

도 7A-7C는 인간 대식세포 및 림프구에 대한 Zot 결합의 동력학을 도시한다. 인간 세포에 대한 Zot 결합의 동력학 결정은 Zot-FITC 접합체를 이용한 유동 세포측정법에 의해 실시하였다. 항-CD3-ECD 및 항-CD14-PE mAb로 표지된 PBMC를 실험동안(12분) 37℃에서 유지하면서, 유동 세포측정기에 부착된 생존 샘플 핸들러(동력학 모듈)를 이용하여 데이터를 수집하였다. 기저 FITC 형광 레벨을 90-150 초( 화살표로 표시) 동안 수집하고, Zot-FITC를 주사하기 위해 데이터 수집을 약 10-15 초 동안 중지하였다(도 7A 및 7B). 도 7C는 비표지된 인간 단핵구/대식세포에 대한 항-CD14-FITC의 결합의 동력학을 보여준다. 데이터는 CD3 (림프구) 또는 CD14 (대식세포)상에 게이트된(gated) 세포에 대해 Zot-FITC 강도(y 축) 대 시간(x 축) 대 세포수(z 축)의 등적(isometric) 디스플레이로 나타내어진다. 그 결과는 인간 대식세포(도 7A) 및 림프구(도 7B)에 대한 Zot 결합이 매우 신속히 일어나며, Zot-FITC의 첨가 후 2분이내에 평형에 도달한다는 것을 가리킨다.

도 8은 인간 T 및 B 림프구에 대한 FITC-Zot의 결합을 도시한다. PBMC를 Zot-FITC와 T(CD3⁺) 및 B(CD19⁺) 림프구에 존재하는 분자에 대한 mAb와 함께 배앙하고, 유동 세포측정법으로 분석하였다. 전방 대 측방 스캐터 림프구 영역상에 게이트된 세포에 대응하는 동위원소 FITC-표지된 콘트롤 mAb (mIg)는 또한 비특이적 결합의 한 지시자로서 보여진다. 그 결과는 Zot가 T 및 B 림프구 둘다에 결합한다는 것을 가리킨다.

도 9는 Zot-FITC 결합을 봉쇄하는 Zot 길항제의 무능력을 도시한다. CD14-PC 및 CD3-ECD로 염색된 PBMC를 세척하고 AIM-V 배지 단독 또는 100배 초과의 FZI/0 (서열번호:7), FZI/1 (서열번호:8), BSA (음성 대조군) 또는 4배 초과의 비표지된 Zot (양성 대조군)의 첨가와 함께 15분간 4℃에서 배양하였다. 다음 세포를 Zot-FITC와 함께 배양하고 유동 세포측정법으로 분석하였다. 그 결과는 배지 단독에서 배양된 세포의 평균 형광 강도(임의로 100% 값을 줌)에 비교하여, Zot 길 항제, 비표지된 Zot 또는 BSA의 존재하여 Zot-FITC와 함게 배양된 세포의 평균 형광 강도의 억제율(%)로서 표현하였다. 그 결과는 FZI/0 또는 FZI/1 Zot 길항제의 첨가가 CD14⁺ 게이트된 대식세포에 대한 Zot-FITC의 결합을 크게 봉쇄시키지 못했다는 것을 보여준다. 대조적으로, 비표지된 Zot와의 예비배양은 Zot-FITC의 결합을 24-43% 만큼 봉쇄시켰다.

도 10A-10B는 인간 단핵구/대식세포에 대한 CD14 발현의 Zot 억제를 도시한다. PBMC를 CD14-FITC로 염색된 정제된 Zot 또는 BSA와 함께 또는 없이 TT의 존재 또는 부재하에 18시간동안 배양하고, 유동 세포측정법으로 분석하였다. 그 결과는 인간 대식세포의 전방 스캐터 대 측방 스캐터 특성에 기초하여 정의된, "단핵구 영역"상에 게이트된 세포에 대한 CD14 형광도의 칼라 막대그래프로서 보여진다. Zot의 첨가는 TT의 부재(도 10A) 또는 존재(도 10B)하에 CD14의 현저한 발현 억제를 유발하였다.

도 11은 인간 단핵구/대식세포 및 림프구 생존율에 대한 Zot의 효과를 도시한다. PBMC를 정제된 Zot 또는 BSA의 부재 또는 존재하에 다양한 시간동안 배양하였다. 세포 생존율을 프로피듐 요다이드 배제 시험 및 유동 세포측정법을 이용하여 측정하였다. 그 결과는 이들 세포 집단의 전방 스캐터 대 측방 스캐터 특성에 기초하여 정의된, "단핵구 영역" 또는 "림프구 영역"상에 게이트된 생존 세포(%)로서 보여진다. 그 결과는 Zot의 첨가가 비교적 초기에 대식세포 생존율에 영향을 주는 반면, 림프구에 대한 효과는 적어도 배양후 4일까지 드러나지 않았다.

도 12A-12C는 인간 단핵구/대식세포에 의한 사이토킨 생성의 Zot-매개 유도를 도시한다. PBMC를 정제된 Zot 또는 BSA의 부재 또는 존재하에 6시간 내지 4일간 배양하였다. 지시된 시간에 상청액을 수집하고, 화학발광 ELISA에 의해 사이토킨 레벨을 측정하였다. Zot의 첨가는 6시간 만에 TNF-α(도 12A) 및 IL-10 (도 12C)의 고 레벨 생성과, 24시간에 피크 레벨에 이르도록 하였다. IL-1β 생성의 약한 유도도 또한 관찰되었다(도 12B).

도 13A-13B는 인간 림프구에 의한 사이토킨 생성의 Zot-매개된 유도를 도시한다. PBMC를 정제된 Zot 또는 BSA의 부재 또는 존재하에 TT와 함께 또는 없이 3일간 배양하고, 상청액에서의 사이토킨 레벨을 화학발광 ELISA에 의해 측정하였다. Zot의 첨가는 TT와의 배양에 의해 유도된 IL-2 생성의 억제를 초래하는 반면, TT의 부재시 Zot에 의해 아무런 측정가능한 IL-2 레벨도 유도되지 않았다(도 13A). 대조적으로, Zot의 첨가는 TT에 의해 유도된 레벨과 유사한 TT 부재시의 IFN-γ의 생성을 시종일관 유도하고, TT에 의해 유도된 IFN-γ의 레벨을 현저히 증가시켰다(도 13B).

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다음 실시예들은 단지를 본 발명의 예시를 위해 제공되며, 결코 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.

[실시예 1]

림프구 및 대식세포에의 FITC-표지된 Zot의 결합

A. 재료 및 방법

건강한 지원자들로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

PBMC를 건강한 지원자들로부터 림프구 분리 배지(LSM, Organon-Teknika, Durham, NC)상에서 농도구배 원심분리에 의해 분리하였다. 공여자(Donors)는 성인이었고 채혈에 대한 동의를 얻었다. 사용된 PBMC는 신선한 것이거나 또는 세포 생존율을 보존하고 세포 회수율을 최대화하기 위해 콘트롤된 선형 속도 냉동기(1℃/분, Planner Biomed, Salisbury, England)를 사용하여 10%(v/v) FCS 및 10%(v/v) DMSO를 함유하는 RPMI에서 분액화(aliquoted)하고 냉동시켰다. 세포를 사용전까지 액체 질소에서 저장하였다. 몇몇 시험에서는 세포를 분리직후 사용하였다.

정제된 ZOT-MBP의 제조

플라스미드 pZ14로 형질전환된, V. 콜레라 균주 CVD110 (Michalski et al, Infect. Immun., G1:4462-4468 (1993))를 배양한 후 수득된 상청 분액 5000 ml를 10 kDA의 MW 컷어프(cutoff)를 갖는 라미나 플로우 필터를 사용하여 1000 배 농축하였다. Vibrio 콜레라 Zot 유전자를 함유하는, pZ14의 구조물은 특히 WO96/37196에 상세히 기술되어 있다. 결과의 상청액을 다음 8.0% (w/v) SDS-PAGE 시켰다. SDS-PAGE 겔의 쿠마시(Coomassie) 블루 염색에 의해 단백질 밴드를 검출하였다. 플라스미드 pTTQ181로 형질전환된 균주 CVD110 (Amersham, Arlington Heights, IL)에서 나오고 동일한 방법으로 처리된 대조 상청액과 비교시 Zot에 해당하는 아무런 단백질도 검출되지 않았다. 따라서, 비록 zot 유전자가 pZ14에서 고 유도성의 강한 tac 프로모터 뒤에 위치하더라도, 1000 배 농축된 pZ14 상청액에서 단백질의 레벨은 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 여전히 검출불가능하였다.

따라서, Zot 생성량을 증가시키기 위해, zot 유전자를 말토스 결합 단백질(이하 "MBP")과 프레임상에 융합시켜 MBP-ZOT 융합 단백질을 생성하였다.

MBP 벡터 pMAL-c2 (Biolab)를 사용하여 zot 유전자를 E. coli의 malE 유전자에 융합시킴으로써 Zot를 발현하고 정제하였다. 이 구조물은 클론된 zot 유전자의 고 레벨 발현을 주기 위해 강한 유도성 tac 프로모터, 및 malE 번역개시신호를 사용한다. 벡터 pMAL-c2는 융합 단백질의 세포질 발현을 이끄는, malE 신호 서열의 정확한 결실을 가진다. MBP에 대한 친화성 크로마토그라피 정제법을 사용하여 융 합 단백질(Biolab)의 분리를 촉진하였다.

더 상세하게는, 벡터 pMAL-c2를 EcoRI(malE 유전자의 3'말단을 절단)으로 선형화하고, Klenow 단편으로 채우고, XbaI(pMAL-c2 폴리링커에 단일 부위를 가짐)으로 분해하였다. ZOT를 코딩하는 orf를 플라스미드 pBB241(Baudry et al, Infect. Immun., 60:428-434 (1992))에서 서브클로닝하였다. 플라스미드 pBB241을 BssHII로 분해하고, Klenow 단편으로 채우고, XbaI으로 분해하였다. 다음, 블런트-XbaI 단편을 pMAL-c2내로 서브클로닝하여 플라스미드 pLC10-c를 생성하였다. 삽입체 및 벡터 둘다 블런트(blunt) 및 점착성(sticky) 말단을 가지므로, 올바른 방향이 MalE의 3'말단이 삽입체의 5'말단과 융합시 수득되었다. 다음 pLC10-c를 E. coli 균주 DH5a내로 일렉트로포레이션시켰다. pBB241에서, BssHII 제한 부위는 zot orf내에 있다. 따라서, MBP-ZOT 융합 단백질에서 ZOT의 아미노산 1-8이 결실되어 있다.

MBP-Zot 융합 단백질을 정제하기 위해, 0.2% (w/v) 글루코스 및 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 Luria Bertani 브로스 10 ml를 pLC10-c를 함유하는 단일 콜로니로 접종하고, 진탕과 함께 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양액을 동일한 신선 배지 1.0 ml에 1:100로 희석하고, 진탕하면서 37℃에서 성장시켜 약 1.0×10⁸ 세포/ml이 되게 하였다. 다음 0.2 mM IPTG를 첨가하여 MBP-Zot 발현을 유도하고, 배양물을 3시간 더 37℃에서 배양하였다. 다음 박테리아를 펠렛화하고 20 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 1.0 mM EDTA, 10 mM 2-ME, 1.0 mM NaN₃을 함유하는 빙냉 "컬럼 완충액" 20 ml에 재현탁하였다. 박테리아 현탁액을 프렌치 프레스 처리에 의해 용해시키고 4℃에서 13,000 ×g 로 회전시켰다. 상청액을 수집하고, 컬럼 완충액으로 1:5 희석하고, 컬럼 완충액으로 예비-평형화된 아밀로스 레진의 1 ×10 컬럼(Biolabs, MBP-융합 정제 시스템)에 로딩하였다. 컬럼을 5 부피의 컬럼 완충액으로 세척한 후, MBP-ZOT 융합 단백질을 컬럼 완충액중 10 mM 말토스 10 ml를 로딩함으로써 용출하였다. 1.0 ml의 배양물으로부터의 전형적인 수율은 2-3 mg의 단백질이었다.

정제된 MBP-Zot 융합 단백질의 MBP 융합 파트너를 다음 20 ㎍의 MBP-Zot 당 1.0 ㎍의 팩터 Xa 프로테아제(Biolabs)를 사용하여 절단해 내었다. 팩터 Xa 프로테아제는 Zot의 아미노 말단 직전을 절단한다. 그렇게 수득된 Zot 단백질을 8.0%(w/v) SDS-PAGE 겔상에 전개시키고, 전기분리 챔버(Schleicher & Schuell, Keene, NH)를 사용하여 겔로부터 전기용출하였다. Ussing 챔버에서 시험시, 결과의 정제된 Zot는 7.5 ×10^-8 M의 ED₅₀ 값으로 투여량-의존성 Rt 감소를 유도하였다.

플루오레세인 이소티오시아네이트에 대한 ZOT-MBP의 콘쥬게이션(ZOT-FITC)

FITC에 대한 Zot-MBP의 콘쥬게이션을 표준 기술에 따라 수행하였다.요약하면, Zot-MBP를 0.1 M 중탄산염 완충액(예컨대, 0.09 M NaHCO₃ + 0.0085 M Na₂CO₃)을 함유하는 FITC 라벨링 완충액 500 ml에 대해 투석하고, 농축 NaOH로 pH 9.0으로 조정하고, 8시간동안 4℃에서 저장하여 pH를 9.0으로 올렸다. 다음 각 밀리그램의 MBP-ZOT에 대해 DMSO중의 5.0 mg/ml FITC 10 ㎕를 첨가한 후, 4℃에서 PBS에서 하룻밤 배양하였다. 다음 비결합된 FITC를 PBS(pH 7.4)를 함유하는 500 ml 투석 완 충액에서 투석하여 제거하고, 2일에 걸쳐 2-3번 변화로 4℃에서 저장하였다. 이 제제를 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.

인간 PBMC에로의 FITC-ZOT의 결합 및 유동세포측정분석

상기한 대로 분리된 PBMC를 피코에리트린(PE)에 콘쥬게이트된 CD14 및 ECD(에너지 커플링된 다이, PE-Texas-Red 콘쥬게이트)에 콘쥬게이트된 CD3에 대한 단클론성 항체의 존재하에 실리콘된 튜브(대식세포가 시험관 벽에 결합하는 것을 방지하기 위해)에서 37℃에서 60분간 Zot-FITC의 농도를 증가시키면서 배양하였다. CD14는 인간 단핵구/대식세포의 마커이고, CD3은 T 림프구의 마커이다. 이러한 플루오로크롬(예컨대, FITC, PE 및 ECD)의 사용은 3색 유동 세포측정법에 의해 혼합 PBMC 집단에서 단핵구/대식세포 및 T 림프구에 대한 ZOT의 결합에 대한 동시적인 연구를 가능케 하였다. 다음 세포를 1.0% (w/v) BSA 및 0.1% (w/v) NaAzide를 함유하는 PBS (pH 7.2)로 2회 세척하고, Epics Elite 유동세포측정기/ 세포분류시스템을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 즉시 분석하였다.

이들 실험에서, 동일한 이소타입이지만 무관한 특이성을 갖는 플루오로크롬-표지된 mAbs를 대조군으로서 사용하였다. 혈소판, 적혈구(만약 있다면) 및 세포 조각들을 전방 대 90% 광 스캐터 파라미터상에 적당한 게이트를 세팅함으로써 분석으로부터 배제하였다. 데이터 분석은 Epics Elite 분석 패키지 (Coulter) 또는 WinList 리스트-모드 분석 패키지 (Verity Software House, Topsham, ME)를 사용하여 수행하였다.

B. 결과

인간 T 림프구 (CD3⁺) 및 단핵구/대식세포 (CD14⁺)에 대한 Zot-FITC 결합의 유동 세포측정 분석을 보여주는 대표적인 실험예가 도 1에 도시된다. 그 결과는 평균 형광 강도 레벨에 의해 증명되듯이, Zot-FITC의 결합이 T 림프구보다 단핵구/대식세포에서 여러 배 더 높다는 것을 보여준다. 더욱이, Zot-FITC의 증가하는 양의 첨가는 40-60 ㎕의 Zot-FITC의 첨가후 레벨 오프하기 시작하는 결합의 증가를 초래한다. 이들 결과는 Zot가 인간 단핵구/대식세포에 우선적으로 결합한다는 것을 가리킨다.

다음, 비표지된 Zot의 존재하에 인간 단핵구/대식세포 및 림프구에 대한 Zot-FITC의 결합을 시험하여, 비표지된 Zot가 결합을 봉쇄할 수 있는지 결정하였다. 도 2에서 보여지듯이, 비표지된 Zot 100 ㎕로 37℃에서 30분간 PBMC를 예비배양한 후 37℃에서 30분간 ZOT-FITC(10 ㎕)를 첨가하였더니, 단핵구/대식세포 및 T 림프구 둘다에 대한 Zot-FITC의 결합을 약 33% 감소시켰으며, 이는 이들 세포에 대한 Zot 결합이 수용체-매개된다는 것을 제안한다. 정제된 MBP 100 ㎕로 세포를 예비배양한 후 37℃에서 30분간 ZOT-FITC(10㎕)를 첨가하였더니, Zot-FITC 결합의 봉쇄에 효과가 없었으며, 이는 비표지된 Zot에 의한 봉쇄가 특이적 현상이라는 것을 가리킨다.

[실시예 2]

인간 단핵세포에 의한 미토겐 및 항원에 대한 증식성 응답

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

PBMC를 건강한 지원자들로부터 림프구 분리 배지(LSM, Organon-Teknika, Durham, NC)상에서 농도구배 원심분리에 의해 분리하였다. Maryland 대학의 기관 리뷰 보드에 따라 공여자(Donors)는 성인이었고 채혈에 대한 동의를 얻었다. 사용된 PBMC는 신선한 것이거나 또는 세포 생존율을 보존하고 세포 회수율을 최대화하기 위해 콘트롤된 선형 속도 냉동기(1℃/분, Planner Biomed, Salisbury, England)를 사용하여 10%(v/v) FCS 및 10%(v/v) DMSO를 함유하는 RPMI에서 분액화(aliquoted)하고 냉동시켰다. 세포를 사용전까지 액체 질소에서 저장하였다. 몇몇 시험에서는 세포를 분리직후 사용하였다.

정제된 Zot의 제조

pBB241 플라스미드(Baudry et al, 상동) DNA를 주형으로 사용하여, Deep Vent 폴리머라제(New England Biolabs)로 PCR에 의해 zot 유전자를 증폭시켰다. 사용된 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머는 각각 5'-CGGGATCCCGTATGAGTATCTTT-'3' (서열번호: 3) 및 5'-CCCAAGCTTGGGTCAAAATATACT-'3' (서열번호: 4)이었다. 이들 올리고뉴클레오티드의 5' 꼬리는 각각 BamHI 및 HindIII 제한부위를 함유한다. 결과의 앰플리콘(1.2 kb)을 8.0% (w/v) 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고, Xtreme 스핀 컬럼(Pierce)을 사용하여 염 및 유리 뉴클레오티드로부터 정제하였다. 다음 상기 두 개의 제한효소를 사용하여 정제된 앰플리콘을 분해하고, 결과의 분해된-앰플리콘을 다음 미리 BamHI 및 HindIII로 분해된 벡터 pQE30 (Quiagen)에 삽입하여 플라스미드 pSU113을 수득하였다. pQE30은 6 폴리-히드티딘 태그(6×His)를 갖는 재조합 단백질의 고 레벨 발현을 제공하는 발현벡터이다. 따라서 플라스미드 pSU113의 발현 생성물은 6×His-Zot 융합 단백질이다. pSU113을 다음 E. coli DH5aso로 형질전환시켰다.

6×His-Zot 융합 단백질을 정제하기 위해, 결과의 형질전환된 E. coli를 A₆₀₀이 약 1.10이 될 때까지 2.0% (w/v) 글루코스, 25 ㎍/ml의 카나마이신 및 200 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 Luria Bertani 브로스 150 ml에서 37℃에서 하룻밤 성장시켰다. 다음, 75 ml의 하룻밤 배양물을 2.0% (w/v) 글루코스, 25 ㎍/ml의 카나마이신 및 200 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 Luria Bertani 브로스 1000 ml에 첨가하고, A₆₀₀ 이 약 0.7-0.9가 될 때까지 강력한 진탕과 함께 37℃에서 약 3시간동안 배양하였다. 다음, IPTG를 2.0 mM의 최종 농도에 첨가하고, 37℃에서 5시간동안 성장을 계속시켰다. 다음, 세포를 20분간 4000 ×g으로 원심분리하여 수확하고, 6.0 M GuHCl, 0.1 M 인산나트륨 및 0.01 M Tris-HCl (pH 8.0)을 함유하는 5.0 ml/g 습윤 중량의 완충액 A에 재현탁하고, 실온에서 1시간동안 교반하였다. 다음, 혼합물을 4℃에서 30분간 10,000 ×g 으로 원심분리하고, 결과의 상청액에 4.0-5.0 ml/g 습윤 중량의 50% SUPERFLOW 레진 슬러리(QIAGEN)를 첨가하고, 실온에서 1시간동안 교반을 수행하였다. 결과의 레진을 1.6 ×8.0 컬럼에 로딩한 다음, 완충액 A; 8.0 M 요소, 0.1 M 인산나트륨 및 0.01 M Tris-HCl(pH 8.0)을 함유하는 완충액 B; 및 8.0 M 요소, 0.1 M 인산나트륨 및 0.01 M Tris-HCl(pH 6.3)을 함유하는 완충액 C로 순차적으로 세척하였다. 통과-플로우(flow-through)의 A₆₀₀이 0.01 미만이 될 때까지 각각 세척을 실시하였다. 6×His-ZOT 융합 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액 C 20 ml를 사용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 다음, 6×His-ZOT 융합 단백질을 함유하는 분액을 Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci., 121:404 (1964)에 의해 기술된 방법을 이용하여 SDS-PAGE에 의해 체크하고, 겔을 코마시 블루로 염색하였다. 6×His-ZOT 융합 단백질을 함유하는 분액을 8.0 M 요소에 대해 투석하고, 모은 다음, PBS에 100배 희석하였다. 다음, 4.0 ml의 50% SUPERFLOW 레진 슬러리를 첨가하고, 실온에서 2시간동안 교반을 실시하고, 결과의 레진을 1.6 ×8.0 컬럼에 로딩한 다음, 50 ml의 PBS로 세척하였다. 6×His-Zot 융합 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 10 ml의 PBS로 컬럼으로부터 용출시켰다. 결과의 용출액을 PBS에 대해 투석하고, 6×His-ZOT 융합 단백질을 상기한 바대로 SDS-PAGE에 의해 체크하였다.

토끼 항-Zot 항혈청의 제조 및 정제

특이적 항혈청을 얻기 위해, 키메릭 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)-Zot 단백질을 발현하고 정제하였다.

더 상세하게는, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하고 플라스미드 pBB241(Baudry et al, 상동)을 주형 DNA로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 zot orf를 증폭하였다. 정방향 프라이머(TCATCACGGC GCGCCAGG, 서열번호: 5)는 zot orf의 뉴클레오티드 15-32에 해당하고, 역방향 프라이머(GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT, 서열번호: 6)는 ctxA orf의 5'말단에 해당한다. 따라서, ZOT의 아미노산 1-5는 결과의 융합 단백질에서 결실되었다. 증폭 생성물을 pGEX- 2T(Pharmacia, Milwaukee, WI)에 있는 GST 유전자의 말단에 위치한 폴리링커(SmaI 부위)에 삽입시켰다. pGEX-2T는 Schistosoma japonicum의 GST와의 융합 단백질로서 클론된 유전자를 발현하는 융합-단백질 발현 벡터이다. 융합 유전자는 tac 프로모터의 제어하에 있다. IPTG의 도입시, 탈억제가 일어나며, GST 융합 단백질이 발현된다.

pLC11이라 칭한 결과의 재조합 플라스미드를 E. coli DH5α에 일렉트로포레이션시켰다. GST-Zot 융합 단백질을 정제하기 위해, 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 10 ml의 Luria Bertani 브로스를 pLC11을 함유하는 단일 콜로니로 접종하고, 진탕과 함께 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양물을 동일한 신선 배지 1.0 ml에 1:100 희석하고, 진탕하면서 37℃에서 성장시켜 약 1.0 ×10⁸ 세포/ml이 되게 하였다. 다음 0.2 mM IPTG를 첨가하여 GST-Zot 발현을 유도하고, 배양물을 3시간 더 37℃에서 배양하였다. 다음 박테리아를 펠렛화하고, 20 ml의 빙냉 PBS (pH 7.4)에 재현탁하고, 프렌치 프레스 방법에 의해 용해시켰다. GST-Zot 융합 단백질은 박테리아 펠렛 분액으로 침전하므로 이들 조건에서 가용성이 아니었다. 따라서, 펠렛을 0.00625 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.2 M 2-ME, 2.0% (w/v) SDS, 0.025% (w/v) 브로모페놀 블루 및 10% (v/v) 글리세롤을 함유하는 Laemli 용해 완충액에 재현탁시키고, 8.0% (w/v) PAGE-SDS 겔상에 전기영동시키고, 쿠마시 브릴리안트 블루로 염색하였다. 융합 단백질에 해당하는, 약 70 kDa(26 kDa의 GST + 44 kDa의 Zot)의 밴드를 전기분리 챔버(Schleicher & Schuell, Keene, NH)를 사용하여 겔로부터 전기 용출시켰다.

결과의 용출된 단백질(10-20 ㎍)의 10 ㎍을 동일 부피의 Freund's 완전 보조제와 혼합하여 토끼에 주사하였다. 4 및 8주 후에 두 개의 부스터(booster) 투여량을 Freund's 불완전 보조제와 함께 투여하였다. 한달 후에 토끼의 혈액을 채취하였다.

특이적 항체의 생성을 결정하기 위해, 두 개의 융합 단백질 MBP-Zot 및 GST-Zot와 함께 10^-10 M의 Zot를 나일론 막상에 전달하고, 온화한 진탕과 함께 4℃에서 하룻밤 토끼 항혈청의 1:5000 희석액으로 배양하였다. 다음 필터를 0.05% (v/v) Tween 20를 함유하는 PBS(이하 "PBS-T")로 15분간 4회 세척하고, 실온에서 2시간동안 호스라디시 퍼옥시다제에 콘쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG의 1:30,000 희석액으로 배양하였다. 필터를 0.1%(v/v) Tween을 함유하는 PBS로 15분간 4회 다시 세척하고, 면역반응성 밴드를 향상된 화학발광법(Amersham)을 사용하여 검출하였다.

면역블롯(immunoblot)에서, 토끼 항혈청은 Zot뿐만 아니라 MBP-Zot 및 GST-Zot 융합 단백질도 인식한다고 밝혀졌으나, MBP 음성 대조군은 인식하지 못했다.

더욱이, 적당한 항-Zot 항체의 생성을 확인하기 위해, Ussing 챔버에서 중화 실험을 실시하였다. 60분간 37℃에서 pZ14 상청액으로 예비-배양시, Zot-특이적 항혈청(1:100 희석)은 Ussing 챔버에 장착된 토끼 회장상에 Zot에 의해 유도된 Rt의 감소를 완전히 중화할 수 있었다.

다음, 항-Zot 항체를 MBP-Zot 친환성 컬럼을 사용하여 친화성-정제하였다. 더 상세하게는, 상기 실시예1에서 수득된 1.0 mg의 정제된 MBP-Zot를 예비-활성화된 겔(Aminolink, Pierce)에 실온에서 하룻밤 고정시킴으로써 MBP-Zot 친화성 컬럼을 제조하였다. 컬럼을 PBS로 세척하고, 2.0 ml의 항-ZOT 토끼 항혈청으로 로딩하였다. 실온에서 90분 배양후에, 컬럼을 14 ml의 PBS로 세척하고, 50 mM 글리신(pH 2.5), 150 mM NaCl 및 0.1% (v/v) Triton X-100을 함유하는 4.0 ml 용액으로 컬럼으로부터 특이적 항-Zot 항체를 용출하였다. 1.0 ml 용출된 분액의 pH를 1.0 N NaOH로 즉시 중화시켰다.

배양 조건 및 림프증식(lymphoproliferation) 측정

PBMC (1.5 ×10⁶ 세포/ml)를 10% (v/v) 우태아 혈청 및 50 ㎍/ml 겐타마이신을 가지는 RPMI 1640을 함유하는 1.0 ml의 완전 배지(cRPMI)에서 배양하였다. 세포를 정제된 ZOT(20 또는 60 ㎍/ml로 사용) 또는 소 혈청 알부민(BSA; 대조 단백질, 20 또는 60 ㎍/ml로 사용; Fraction V, Sigma, St. Louis, MO)과 함께 또는 없이 피토헤마글루티닌(PHA, 비특이적 미토겐, 2.0 ㎍/ml로 사용) 또는 테타너스 톡소이드(TT; 특이적 항원, 2.0 ㎍/ml로 사용; Connaught, Swift Water, PA)의 부재 또는 존재하에 96-웰 플레이트에 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 몇몇 실험에서, 항-ZOT 토끼 항혈청 또는 정상 토끼 혈청을 또한 초기에 배양물에 첨가하였다. 세포를 2일간(PHA의 경우) 또는 6일간(TT의 경우) 배양하고, 1.0 μCi/웰의 삼중수소 티미딘을 첨가하였다. 플레이트를 20시간 후 Wallac 세포 수확기(Gaithersburg, MD)상에서 수확하고, Wallac Trilux Microbeta 계수기(Gaithersgurg, MD)상에서 통 합된 티미딘을 측정하였다.

B. 결과

PHA 및 테타너스 톡소이드에 의해 유도된 인간 PBMC의 증식에 대한 정제 Zot의 효과를 나타내는 대표적 실험이 도 3에 도시된다. 그 결과는 Zot와의 배양이 테타너스 톡소이드-유도된 증식을 현저히 억제하는 반면 (60 ㎍/ml에서 약 85%), PHA-유도된 증식에는 아무런 영향이 없다는 것을 명백히 가리킨다. 더욱이, Zot에 의한 TT-유도된 증식의 억제는 투여량-의존적으로 나타난다. Zot가 60 ㎍/ml로 첨가되었을때(약 85% 억제) 20 ㎍/ml Zot가 사용되었을때(약 56% 억제)보다 매우 더 높은 레벨의 억제가 관찰되었다. 대조 단백질로 사용된 BSA의 첨가는 TT 또는 PHA-유도된 림프구 증식에 아무런 효과를 가지지 않으며, 이는 Zot 생물학적 활성의 특이성을 증명한다.

TT-유도된 증식의 Zot-유도된 억제의 특이성을 더욱 시험하기 위해, PBMC를 ZOT 단독, ZOT + 항-ZOT 토끼 항혈청(1:10 희석으로 사용) 또는 Zot + 정상 토끼 혈청(1:10 희석으로 사용)과 함께 TT의 부재 또는 존재하에 배양하였다. 도 4에서 관찰되듯이, 항-Zot 토끼 항혈청의 첨가는 TT-유도된 증식의 Zot-매개 억제를 50% 이상 역전시켰다. 정상 토끼 혈청의 첨가는 효과가 없으며, 이는 Zot-매개 효과의 특이성을 확인시켜준다. 유사하게, BSA의 첨가는 이 시스템에 어떤 효과도 없었다.

[실시예 3]

인간 단핵구 및 대식세포에 의한 FITC-덱스트란 흡수에 대한 Zot의 효과

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에 기술된 방법에 의해 6×His-Zot 융합 단백질을 제조하고 정제하였다.

가용성 항원 흡수

플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-콘쥬게이트된 덱스트란(MW 50,700; Sigma)을 사용하여 가용성 항원의 흡수 능력을 측정하였다. 신선하게 분리된 PBMC(10% (v/v) 가열-불활성화된 FCS 및 50 ㎍/ml 겐타마이신을 함유하는 cRPMI 0.5 ml중 500,000 세포)를 0.5 ml/50 ml 튜브의 최종 부피에서 37℃에서 3시간동안 정제된 Zot(40 ㎍/ml) 또는 BSA(40 ㎍/ml)의 부재 또는 존재하에 배양하였다. 이 배양은 단핵구/대식세포가 시험관 벽에 부착하는 것을 방지하기 우해 실리콘된 튜 브에서 교반하에 수행하였다. 이 배양후에, FITC-덱스트란(최종농도 300 ㎍/ml) 뿐만 아니라 항-CD14 알로피코시아닌 (APC)-표지된 및 항-HLA-DR 페리디닌 클로로필 단백질(PerCP)-표지된 단클론성 항체를 세척없이 각 배양물에 첨가하고, 세포를 37℃ 또는 빙상에서 30분간 배양시켰다. FITC-덱스트란 및 일반적으로 가용성 항원의 흡수는 온도-의존성 현상인 피노사이토시스에 의존하기 때문에, 0℃에서의 배양을 수행하여 세포에 대한 FITC-덱스트란의 비특이적 결합의 레벨을 확립하였다.

이들 실험에서, CD14 및 HLA-DR(그 발현 레벨이 세포 활성화로 증가하는 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 항원)을 사용하여 단핵구/대식세포를 동정하였다.

다음 세포를 빙냉 PBS로 한번 세척하고, Coulter Epics Elite 유동 세포측정기/세포 분류 시스템(Coulter Corp., Miami, FL)상에서 즉시 전개하였다. WinList 소프트웨어 패키지(Verity Software House, Topham, ME)를 사용하여 분석을 수행하였다. FITC-덱스트란을 통합한 세포의 퍼센트는 37℃에서 FITC-덱스트란을 통합한 세포의 퍼센트에서 0℃(빙상)에서 FITC-덱스트란을 통합한 세포의 퍼센트를 공제함으로써 얻었다.

B. 결과

정상 인간 CD14⁺ HLA-DR⁺ 단핵구/대식세포에 의한 FITC-덱스트란 흡수에 대한 Zot의 효과를 나타내는 대표적인 실험이 도 5A-5D에 도시된다. 그 결과는 Zot(도 5D)가 배지 단독 또는 BSA로 배양된 세포에서 관찰된 것에 비교하여 인간 단핵구/대식세포에 의한 FITC-덱스트란 흡수를 현저히 억제하였다(약 51-58%)는 것을 보여 준다. 배지 또는 BSA의 존재하에 FITC-덱스트란을 통합한 세포의 퍼센트사이에는 큰 차이를 발견하지 못했다. 더욱이, 예상된 대로, 0℃에서의 배양은 FITC-덱스트란 흡수를 완전히 폐기하였고, 이는 이 현상이 온도-의존성이라는 것을 확인시킨다.

단핵구/대식세포와 같은 APC에 의한 항원 흡수가 림프구 활성화 및 증식을 이끄는 중요한 사건이라는 것은 잘 확립되어있다(Sztein et al, 상동 (1997)). Zot가 FITC-덱스트란 흡수를 방해한다는 것을 보여주는 결과는 TT-유도된 증식에 대한 Zot의 면역조절 효과가 적어도 부분적으로 항원을 흡수하는 단핵구/대식세포의 능력을 감소시켜 항원 가공 및 제시의 변화를 이끔으로써 매개된다는 것을 증명한다. 이는 또한 Zot가 항원 가공 및 제시를 필요로 하지 않는 현상인, PHA-유도된 증식에 영향을 주지 않는다는 사실에 의해서도 뒷받침된다.

[실시예 4]

인간 단핵구/대식세포 및 림프구에서 FITC-Zot 결합 부위의 개수의 측정

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

PBMC를 건강한 지원자들로부터 림프구 분리 배지(LSM, Organon-Teknika, Durham, NC)상에서 농도구배 원심분리에 의해 분리하였다. Maryland 대학의 기관 리뷰 보드에 따라 공여자(Donors)는 성인이었고 채혈에 대한 동의를 얻었다. 사용된 PBMC는 신선한 것이거나 또는 세포 생존율을 보존하고 세포 회수율을 최대화하기 위해 콘트롤된 선형 속도 냉동기(1℃/분, Planner Biomed, Salisbury, England) 를 사용하여 10%(v/v) FCS 및 10%(v/v) DMSO를 함유하는 RPMI에서 분액화(aliquoted)하고 냉동시켰다. 세포를 사용전까지 액체 질소에서 저장하였다. 몇몇 시험에서는 세포를 분리직후 사용하였다.

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에서 기술된 대로 6×His-Zot를 제조하였다.

플루오레세인 이소티오시아네이트에 대한 Zot의 콘쥬게이션(Zot-FITC)

FITC와 Zot의 콘쥬게이션은 표준기술에 따라 수행하였다. 요약하면, Zot를 0.05 M 붕산, 0.2 M NaCl을 함유하는 500 ml FITC 라벨링 완충액에 대해 투석하고, 농축 NaOH로 pH 9.2로 조정하고, 4℃에서 하룻밤 저장하여 유리 NH₄ ⁺ 이온을 제거하고, pH를 9.2로 높혔다. 다음 Zot의 각 밀리그램에 대해 DMSO중 5.0 mg/ml FITC 20 ㎕를 첨가한 후, 실온에서 2시간동안 배양하였다. 다음 비결합된 FITC를 0.1 M Tris-HCl(pH 7.4), 0.1%(w/v) NaN₃, 0.2 M NaCl을 함유하는 500 ml 투석 완충액에서 투석에 의해 제거하고, 농축 NaOH로 pH를 7.4로 조정하고, 2일에 걸쳐 2 내지 3 변화를 가지고 4℃에서 저장하였다. 이 제제를 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.

인간 PBMC에 대한 FITC-Zot의 결합 및 유동 세포측정분석

상기와 같이 분리된 PBMC를 피코에리트린(PE)에 콘쥬게이트된 CD14 및 ECD(에너지 커플된 다이, PE-Texas-Red 콘쥬게이트)에 콘쥬게이트된 CD3에 대한 단클론성 항체(mAb)의 존재하에 실리콘된 튜브(대식세포가 시험관 벽에 결합하는 것을 방지하기 위해)에서 37℃에서 30분간 Zot-FITC의 증가하는 농도와 함께 배양하였다. CD14는 인간 대식세포의 마커로서 사용되는 반면, CD3은 T 림프구의 마커로서 사용된다. 이들 플루오로크롬(예컨대, FITC, PE 및 ECD)의 사용은 3색 유동 세포측정법에 의해 혼합된 PBMC 집단에서 대식세포 및 T 림프구에 대한 Zot의 결합을 동시에 연구할 수 있도록 해준다. 염색후에, 세포를 1.0%(w/v) BSA 및 0.1%(w/v) NaAzide를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 2회 세척하고, Epics Elite 유동 세포측정기/세포 분류 시스템(Beckman-Coulter, Miami, FL)을 사용하는 유동 세포측정법에 의해 즉시 분석하였다. 이들 실험에서, 동일한 이소타입이나 무관한 특이성을 갖는 플루오로크롬-표지된 mAbs를 대조군으로 사용하였다. 혈소판, 적혈구(만약 있다면) 및 세포 조각을 전방 대 90% 광 스캐터 파라미터상에 적당한 게이트를 세팅함으로써 분석에서 배재하였다. 각 샘플에 대해 10,000 이상의 세포에 대한 데이터를 수집하였다. 데이터 분석은 Epics Elite 분석 패키지(Coulter) 또는 WinList 리스트-모드 분석 패키지(Verity Software House, Topsham, ME)를 사용하여 수행하였다. 각 튜브에 첨가된 Zot-FITC의 양(pM)은 첨가된 최종 농도(㎍/ml) 및 알려진 Zot의 MW(44,900)에서부터 유추하였다.

Zot 결합 부위/세포의 계산

Zot-FITC와 함께 배양한 후 각 집단이 평균 형광 강도를 제조자 지시(Flow Cytometry Standards Corporation, San Juan, Puerto Rico)에 따라 Quantum 26 MESF 키트(10,000 내지 500,000 MESF 범위) 및 QuickCal 보정 소프트웨어를 사용하여 구축된 표준 곡선을 사용하여 Zot 결합 부위/세포의 개수로 변환하였다. Quantum 키트에서의 형광 표준을 정제된 형광 다이의 용액에 대한 등가 가용성 플 루오로크롬 분자(MESF) 단위로 보정하였다. 세포(대식세포 또는 림프구)당 결합부위의 개수는 사용된 다양한 FITC-Zot 배치의 플루오레세인/단백질 비율(F/P)에 대해 조정된 Zot-FITC 배양된 샘플(비특이적 결합을 갖는, 즉 FITC-표지된 마우스 IgG 대조군의 MESF, 공제된)의 MESF 단위로부터 유도하였다.

B. 결과

인간 T 림프구 (CD3⁺) 및 대식세포 (CD14⁺)에 결합하는 Zot-FITC의 유동세포측정 분석을 보여주는 대표적인 실험이 도 6에 도시된다. 그 결과는 Zot 결합부위/세포이 증가된 개수에서 증명되듯이, Zot-FITC의 결합이 CD3⁺ T 림프구에서 보다 대식세포에서 몇배 더 높다는 것을 보여준다. 더욱이, 이들 데이터는 Zot의 결합이 약 0.5 pM(약 40 g/ml)에서 포화에 도달하는 포화적 현상이라는 것을 보여준다. 또한, 포화 조건하에서 인간 대식세포 및 림프구 각각에서 약 106,000 Zot-결합부위/세포 및 약 9,000 Zot-결합부위/세포가 있다는 것이 관찰되었다.

인간 대식세포 및 림프구에서 Zot 결합부위의 분포를 연구하기 위해, 상기 방법을 이용하여 여러 지원자에서의 Zot 결합부위/세포의 개수를 결정하였다. 그 결과는 Zot 결합부위/세포의 평균개수가 림프구(평균=10,684; 범위=4,802-18,662)에서 보다 대식세포(평균=104,649; 범위=56,781-142,840)에서 평균적으로 약 10배 더 높다는 것을 가리켰다.

[실시예 5]

인간 단핵구/대식세포 및 림프구에 대한 Zot의 결합의 동력학

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

상기 실시예 4에 기술된 대로 건강한 지원자로부터 PBMC를 분리하였다.

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에 기술된 대로 6×His-Zot를 제조하였다.

플루오레세인 이소티오시아네이트에의 Zot의 콘쥬게이션(Zot-FITC)

상기 실시예 4에 기술된 대로 Zot와 FITC의 콘쥬게이션을 수행하였다.

결합 동력학 측정법

인간 세포에 대한 Zot의 결합 동력학의 결정은 Zot-FITC 콘쥬게이트 및 유동세포측정기을 이용한 유동 세포측정법에 의해 실시하였다. 샘플을 EPIC ELITE 유동세포측정기/세포 분류 시스템(Beckman-Coulter, Miami, FL)을 이용하여 실시간으로 전개시켰다. PBMC를 ECD(에너지-커플된 다이)로 태그된 항-CD3 mAb 및 PE(피코에리트린)으로 태그된 항 CD-14 mAb로 염색하였다. 백그라운드 형광을 위한 대조군으로서 실험 mAb에 대한 대응 형광 다이에 콘쥬게이트된, 동일 이소타입의 무관한 mAb로 치환한 각 세포 현탁액의 추가적 분액을 제조하였다. 항-CD3 및 항-CD14로 표지된 PBMC를 세척하고 분석전까지(1시간 이내) 빙욕에서 유지하여 항원 조절을 최소화하였다. 분석전에, 세포를 수욕에서 15-20 분간 37℃에서 평형화시키고, 실험 동안(12분) 유동세포측정기에 부착된 생존 샘플 핸들러(kinetics module, Cyt다, Fremont, CA)을 사용하여 37℃에서 유지하였으며, 그 동안 계속 데이터를 수집하였다. 기저 FITC 형광 레벨을 90-150초간 수집하고, Zot-FITC(최종농도 40 ㎍/ml)을 주사하기 위해 약 10-15초간 데이터 수집을 멈추었다. 총 12분간 약 300-600 세포/초의 속도로 Zot-FITC을 첨가한 후 데이터 수집을 즉시 재개하였다. FITC, PE 및 ECD-플루오로크롬을 공냉 아르곤 레이저(488 nm 방사)를 이용하여 여기시켰다. 결과를 계산하고 WinList 및 Isocontour 분석 패키지(Verity Software House, Topsham, ME)을 사용하여 나타내었다. 데이터는 CD3(T 림프구) 또는 CD14(대식세포)상에 게이트된 세포에 대해 Zot-FITC 강도(y 축) 대 시간(x 축) 대 세포 개수(z 축)의 등적 디스플레이로서 제시된다.

B. 결과

인간 T 림프구(CD3⁺) 및 대식세포(CD14⁺)에 대한 Zot-FITC 결합의 동력학을 보여주는 대표적인 실험이 도 7A-7C에 도시된다. 그 결과는 인간 대식세포(도 7A) 및 림프구(도 7B)에 대한 Zot 결합이 매우 신속히 일어나서, Zot-FITC의 첨가후 2분이내에 평형에 도달한다는 것을 가리킨다. 최대 결합에 도달하는 Zot 및 항-CD14 mAb에 필요한 시간을 비교하기 위해, 유사한 실험을 비표지된 세포를 이용하여 수행하였다. 이들 실험에서, 기저 FITC 형광 레벨을 상기와 같이 수집하고, FITC-항-CD14 mAb를 주사하기 약 10-15 초간 데이터 수집을 멈추고, 총 12분간 즉시 데이터 수집을 재개하였다. 그 결과(도 7C)는 평형에 도달하는 항-CD14 mAb에 필요한 시간(약 5분)보다 Zot 결합의 최대 레벨에 도달하는데 걸리는 시간(약 2 분)이 더 짧다는 것을 가리킨다.

[실시예 6]

인간 B 및 T 림프구에 대한 FITC-Zot의 결합

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에 기술된 대로 6×His-Zot를 제조하였다.

인간 PBMC에 대한 FITC-Zot의 결합 및 유동 세포측정분석

상기와 같이 분리된 PBMC를 PE에 콘쥬게이트된 CD14, Tricolor(PE-Cy5 콘쥬게이트)에 콘쥬게이트된 CD3 및 ECD(에너지 커플된 다이, PE-Texas-Red 콘쥬게이트)에 콘쥬게이트된 항-CD19에 대한 mAb의 존재하에 37℃에서 30분간 Zot-FITC 40 ㎍/ml과 함께 배양하였다. CD14는 인간 대식세포의 마커이고, CD3은 T 림프구의 마커이고, CD19는 B 림프구의 마커이다. 이들 플루오로크롬(예컨대, FITC, PE, TC 및 ECD)의 사용은 4색 유동세포측정법에 의해 혼합 PBMC 집단에서 대식세포, T 및 B 림프구에 대한 Zot의 결합을 동시에 연구할 수 있도록 해준다. 세포를 염색한 후 1.0% (w/v) BSA 및 0.1% (w/v) NaAzide을 함유하는 PBS(pH 7.2)로 2회 세척하고, Epics Elite 유동세포측정기/세포 분류 시스템(Beckman-Coulter, Miami, FL)을 사용한 유동 세포측정법에 의해 즉시 분석하였다. 이들 실험에서, 동일한 이소타입이나 무관한 특이성을 갖는 플루오로크롬-표지된 mAbs를 대조군으로서 사용하였 다. 혈소판, 적혈구(만약 있다면) 및 세포 조각을 전방 대 90% 광 스캐터 파라미터상에 적당한 게이트를 세팅함으로써 분석에서 배제시켰다. 각 실험에서, 10,000 이상의 세포에 대한 데이터를 수집하였다. 데이터 분석을 Epics Elite 분석 패키지(Coulter) 또는 WinList 리스트-모드 분석 패키지(Verity Software House, Topsham, ME)을 사용하여 수행하였다. 그 결과는 T(CD3⁺) 및 B(CD19⁺) 림프구-게이트된 집단에서 Zot-FITC 형광 강도의 단색 막대그래프로서 표현된다.

B. 결과

인간 T (CD3⁺) 및 B (CD19⁺)에 대한 Zot-FITC의 결합을 보여주는 실험이 도 8에 도시된다. 그 결과는 Zot가 T 및 B 림프구 둘다에 유사하게 결합한다는 것을 가리킨다. 이 실험에서 대식세포에 대한 Zot-FITC 결합은 T 또는 B 림프구에 대한 결합보다 5-8 배 더 높았다.

[실시예 7]

Zot-FITC 결합을 봉쇄하는 Zot 길항제의 무능력

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에 기술된 대로 6×His-Zot를 제조하였다.

FZI/0 및 FZI/1 Zot 길항제의 제조

High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins: Separation Analysis and Conformation, Eds. Mant et al, C.R.C. Press 91991)에 기술된 바와 같은 주지 기술과 Symphony(Protein Technologies, Inc)와 같은 펩티드 합성기를 사용하여 펩티드 길항제 FZI/0 (Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly) (서열번호: 7) 및 FZI/1 (Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly) (서열번호: 8)를 화학적으로 합성하고 정제하였다.

플루오레세인 이소티아시아네이트에의 Zot의 콘쥬게이션(Zot-FITC)

상기 실시예 6에 기술된 대로 Zot와 FITC의 콘쥬게이션을 수행하였다.

인간 PBMC에 대한 FITC-Zot 결합의 봉쇄를 위한 배양 조건 및 유동 세포측정 분석

상기 분리된 PBMC를 PE에 콘쥬게이트된 CD14 및 ECD(에너지 커플된 다이, PE-Texas-Red 콘쥬게이트)에 콘쥬게이트된 CD3에 대한 mAbs로 염색하였다. 세포를 다음 세척하고, 배지 단독으로 또는 FZI/0(4.0 mg/ml), FZI/1(4.0 mg/ml), BSA(4.0 mg/ml; 음성 대조군) 또는 비표지된 Zot(160 ㎍/ml; 양성 대조군)의 첨가와 함께, 0.2% (w/v) NaAzide(내부화/재순환을 봉쇄하기 위해)을 갖는 400 ㎕의 AIM-V 배지(GIBCO BRL, 인간 림프구 배양에 일상적으로 사용되는 한정 무혈청 배지)에서 4℃에서 15분간 배양하였다. 다음 Zot-FITC를 각 튜브에 첨가하여 40 ㎍/ml의 최종농도에 도달하게 하고, 5분간(평형에 도달하는데 필요한 시간) 배양하고, 세척하고, 유동 세포측정기에서 즉시 전개하였다. 따라서, 첨가된 Zot-FITC의 농도에 비해 FZI/0, FZI/1 및 BSA를 100배 초과하여 비표지된 Zot를 4배 초과하여 첨가하였 다. 불행하게도, 정제된 비표지된 Zot 제제의 많은 양을 얻는데 있어서의 기술적 어려움은 4배 이상 초과로 Zot-FITC 결합을 봉쇄하는 능력을 평가하지 못하게 한다. 혈소판, 적혈구(만약 있다면) 및 세포 조각을 전방 대 90% 광 스캐터 파라미터상에 적당한 게이트를 세팅함으로써 분석에서 배제하였다. 각 샘플에 대해 10,000 이상의 세포에 대한 데이터를 수집하였다. 데이터 분석은 Epics Elite 분석 패키지(Coulter) 또는 WinList 리스트-모드 분석 패키지(Verity Software House, Topsham, ME)를 사용하여 수행하였다. 그 결과는 배지 단독으로 배양한 세포의 평균 형광 강도(임의로 100% 값으로 할당)에 비해 Zot 길항제, 비표지된 Zot 또는 BSA의 존재하에 Zot-FITC로 배양된 세포의 평균 형광 강도의 % 억제율로서 나타낸다.

B. 결과

Zot 길항제, 비표지된 Zot 또는 BSA와 함께 3명의 다른 지원자로부터의 PBMC의 배양의 효과를 보여주는 대표적 실험이 도 9에 도시된다. 100 배 초과로 FZI/0 또는 FZI/1 Zot 길항제를 첨가해도 CD14⁺ 게이트된 대식세포에 대한 Zot-FITC의 결합을 크게 봉쇄하지는 못했다. 대조적으로, 단지 4배 초과의 비표지된 Zot와의 예비-배양은 Zot-FITC의 결합을 24-43% 만큼 봉쇄하였다. 이들 결과는 인간 대식세포에 대한 Zot의 결합이 뇌 및 장관 조직에서 동정된 Zot/조눌린 수용체의 것들과 다른 결합 부위를 갖는 수용체를 관여한다는 것을 제안한다.

[실시예 8]

테타너스 톡소이드(TT)-유도된 증식의 Zot 억제는 혈청에 존재하는 인자(들)에 의존성이다

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에 기술된 대로 6×His-Zot를 제조하였다.

배양 조건 및 림프증식 측정법

PBMC(1.5 ×10⁶ 세포/ml)를 (a) AIM-V 배지, (b) 10% (v/v) 가열-불활성화된 우태 혈청 및 50 ㎍/ml 겐타미아신을 함유하는 RPMI 1640 또는 (c) 10% (v/v) 가열-불활성화된 인간 AB 혈청 및 50 ㎍/ml 겐타마이신을 함유하는 RPMI 1640의 1.0 ml에서 배양하였다. 세포를 정제된 Zot(60 ㎍/ml) 또는 우태 알부민(BSA; 대조 단백질, 60 ㎍/ml; 분획 V, Sigma, St. Louis, MO)과 함께 또는 없이 테타너스 톡소이드(TT; 특이적 항원, 2.0 ㎍/ml로 사용; Wyeth, Marietta, PA)의 부재 또는 존재하에 96-웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 로 배양하였다. 세포를 6일간 배양하고, 1.0 Ci/웰의 삼중수소 티미딘을 첨가하였다. 플레이트를 Wallac 세포 수확기(Gaithersburg, MD)상에서 20 시간 후 수확하고, 통합된 티미딘을 Wallac Trilux Microbeta 계수기(Gaithersburg, MD)상에서 측정하였다.

B. 결과

3개의 독립된 실험으로부터의 결과는 PBMC가 혈청의 부재하에 배양되었을 때, 예컨대 AIM-V 한정 배지가 배양에 사용되었을 때 TT-유도된 증식의 아무런 저해도 관찰되지 않는 다는 것을 보여주었다. 사실 대부분의 경우에 그 반대가 관찰되었는데, 즉 혈청의 부재하의 Zot로의 배양은 TT에 대한 증가된 증식성 응답을 이끌었다. 대조적으로, Zot로의 배양은 배양이 FCS 또는 인간 AB 혈청의 존재하에 수행시 TT-유도된 증식의 현저한 억제를 초래하였다. 사실, 인간 AB 혈청의 존재는 FCS의 존재 하에 관찰된 것보다 더 높은 레벨(최고 90%)의 TT-유도된 증식의 억제를 매개한다고 밝혀졌다.

[실시예 9]

인간 단핵구/대식세포에 대한 CD14 발현의 Zot 억제

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에 기술된 대로 6×His-Zot를 제조하였다.

배양 조건 및 유동 세포측정 분석

상기와 같이 분리된 PBMC를 정제된 Zot(60 ㎍/ml) 또는 우태 알부민(BSA; 대조 단백질, 60 ㎍/ml; 분획 V, Sigma, St. Louis, MO)과 함께 또는 없이 테타너스 톡소이드(TT; 특이적 항원, 2.0 ㎍/ml로 사용; Wyeth, Marietta, PA)의 부재 또는 존재하에 다양한 시간(4 시간 내지 7일)동안 24-웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 로 배양하였다. 다음 세포를 FITC에 콘쥬게이트된 CD14에 대한 mAb로 염색하고 유동세포측정법으로 분석하였다. 혈소판, 적혈구(만약 있다면) 및 세포 조각을 전방 대 90% 광 스캐터 파라미터상에 적당한 게이트를 세팅함으로써 분석에서 배제하였다. 각 샘플에 대해, 10,000 이상의 세포에 대한 데이터를 수집하였다. 데이터 분석은 Epics Elite 분석 패키지(Coulter) 또는 WinList 리스트-모드 분석 패키지(Verity Software House, Topsham, ME)를 사용하여 수행하였다. 그 결과는 인간 대식세포의 전방 스캐터 대 측방 스캐터 특성에 기초하여 정의된, "단핵구 영역"상에 게이트된 세포에 대한 CD14 형광의 단색 막대 그래프으로서 표시된다.

B. 결과

인간 대식세포에서 CD14의 발현에 대한 Zot와 함께 PBMC의 배양의 효과를 보여주는 대표적인 실험이 도 10A-10B에 포함된다. Zot의 첨가는 18 시간의 배양 후의 CD14의 발현의 현저한 억제를 유발하였다. 그 효과는 테타너스 톡소이드의 부재(도 10A) 또는 존재(도 10B)하에 모두 매우 뚜렷하였다. 동력학 실험은 CD14 발현의 Zot-유도된 억제가 Zot에 노출후 4-6 시간의 약 반 정도 일찍 관찰된다는 것과 CD14 발현이 배양 7일(마지막 평가시점) 후에도 현저히 저하된채 남아있다는 것을 보여주었다. CD14는 LPS-LPS-결합 단백질 복합체에 대한 고친화성 수용체로서 작용하는 대식세포 표면에 있는 분자이다. 따라서, Zot에 의한 CD14 발현의 하향-조절은 대식세포 활성화 및 T 세포-매개된 면역 응답을 효과적으로 개시하는 그 능 력에 명백한 효과를 가지는 것으로 생각된다.

[실시예 10]

인간 림프구 및 단핵구/대식세포의 생존율에 대한 Zot의 효과

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에 기술된 대로 6×His-Zot를 제조하였다.

배양 조건 및 유동 세포측정 분석

상기와 같이 분리된 PBMC를 정제된 Zot(40 ㎍/ml) 또는 우태 알부민(BSA; 대조 단백질, 40 ㎍/ml; 분획 V, Sigma, St. Louis, MO)과 함께 또는 없이 테타너스 톡소이드(TT; 특이적 항원, 2.0 ㎍/ml로 사용; Wyeth, Marietta, PA)의 부재 또는 존재하에 다양한 시간(6 시간 내지 7일)동안 24-웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 로 배양하였다. 다음 세포를 FITC에 콘쥬게이트된 CD14에 대한 투석된 mAb로 염색하고 세척하였다. 세포 생존율을 측정하기 위해, 프로피듐 요다이드(PI; 50 g/ml; 사멸 세포내로 쉽게 통합되지만 생존 세포에서는 배제되는 다이)를 세포 현탁액에 첨가하고 샘플을 유동세포측정법으로 즉시 분석하였다. 혈소판, 적혈구(만약 있다면) 및 세포 조각을 전방 대 90% 광 스캐터 파라미터상에 적당한 게이트를 세팅함으로써 분석에서 배제하였다. 각 샘플에 대해, 10,000 이상의 세포에 대한 데이터 를 수집하였다. 데이터 분석은 Epics Elite 분석 패키지(Coulter) 또는 WinList 리스트-모드 분석 패키지(Verity Software House, Topsham, ME)를 사용하여 수행하였다. 그 결과는 인간 대식세포의 전방 스캐터 대 측방 스캐터 특성에 기초하여 정의된, "단핵구 영역" 또는 "림프구 영역"상에 게이트된 % 생존 세포로서 표시된다.

B. 결과

인간 대식세포 및 림프구의 생존율에 대한 Zot와 함께 PBMC 배양의 효과를 보여주는 대표적인 실험이 도 11에 포함된다. Zot의 첨가는 배양에서의 1일만큼 일찍 대조군에 비교시 대식세포의 생존율에 온화한 감소를 유발하였다. 이들 감소는 4일째 매우 뚜렷해졌으며, 사실상 모든 대식세포가 배양에서 7일 후에 사멸하였다. 대조적으로, Zot로 배양된 배양물과 배지 또는 BSA로 배양된 배양물간에는 4일까지 아무런 림프구 생존율의 차이가 발견되지 않았다. 그러나, 림프구 생존율은 Zot의 존재하에 후기에 현저히 감소되었다. 유사한 결과가 TT가 Zot의 부재 또는 존재하에 배양물에 첨가시 관찰되었다. 이들 결과는 Zot가 비교적 초기에 대식세포의 생존율에 영향을 주는 반면, 림프구에 대한 효과는 배양후 적어도 4일까지 드러나지 않는 다는 것을 증명한다. 이들 관찰은 대식세포에 대한 초기 효과를 지적하며, 항원 가공 및 제시의 Zot-매개 억제의 바탕에 있는 메카니즘에 관한 추가적인 정보를 제공한다.

[실시예 11]

인간 단핵구/대식세포 및 림프구에 의한 사이토킨 생성의 Zot-매개된 유도

A. 재료 및 방법

건강한 지원자로부터 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)의 분리

정제된 6×His-Zot의 제조

상기 실시예 2에 기술된 대로 6×His-Zot를 제조하였다.

배양 조건

상기와 같이 분리된 PBMC를 정제된 Zot(60 ㎍/ml) 또는 우태 알부민(BSA; 대조 단백질, 60 ㎍/ml; 분획 V, Sigma, St. Louis, MO)과 함께 또는 없이 테타너스 톡소이드(TT; 특이적 항원, 2.0 ㎍/ml로 사용; Wyeth, Marietta, PA)의 부재 또는 존재하에 다양한 시간(6 시간 내지 4일)동안 24-웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 로 배양하였다. TNF-α, IL-1β 및 IL-10의 생성에 관련된 연구를 위해, 웰의 내용물을 6시간 및 1, 2 및 4일째에 1.5 ml 에펜도프 튜브로 수집하고 냉동 에펜도프 원심분리기에서 2,700 ×g 로 10분간 4℃에서 원심분리하여 세포 및 조각들을 제거하였다. 다음 상청액을 새로운 에펜도프 튜브로 옮기고 분석전까지 -70℃에서 냉동시킨다. 정제된 Zot 또는 BSA와 함께 또는 없이 TT로 자극한 후 T 림프구-유래된 사이토킨(예컨대, IL-2, IL-4 및 IFN-γ)의 측정을 위해 상청액을 3일 후 수집하였다.

화학발광 ELISA에 의한 사이토킨 측정

표준 화학발광 캡처 ELISA를 사용하여 세포 배양 상청액중 사이토킨의 존재 를 검출하였다. 요약하면, 1.0-2.0 ㎍/ml의 항-인간 사이토킨 항체를 하룻밤 4℃에서 PBS(pH 7.4) (Biofluids) 또는 0.1 M 중탄산나트륨(pH 8.1)에서 96-웰 블랙 불투명 ELISA 플레이트(Corning-Costar, Cambridge, MA)상에 코팅하였다. 플레이트를 0.5% (v/v) Tween-20 (Sigma)를 함유하는 PBS(pH 7.4)로 세척하고, 10% (v/v) FCS 또는 4.0% (w/v) BSA를 함유하는 PBS(pH 7.4)로 2시간동안 차단하였다. 세척후에, 100 ㎕의 세포 배양 상청액 또는 재조합 인간 사이토킨(표준)을 웰에 첨가하고 실온에서 2시간동안 배양하였다. 세척후에, 바이오틴에 콘쥬게이트된 해당 항-사이토킨 mAbs를 웰에 첨가하고(실온에서 45분), 세척하고, 실온에서 30분간 아비딘-퍼옥시다제로 배양하였다. 다음 BM 화학발광 ELISA 시약(Boehringer Mannheim, Gaithersburg, MD)을 첨가하고, 1450 Microbeta Trilux 플레이트 판독기(Wallac, Gaithersburg, MD)상에서 화학발광을 검출하였다. 항-IL-1β 항체는 Endogen(Woburn, MA)에서 얻어지며, 다른 모든 것들은 Pharminger(San Diego, CA)에서 얻어졌다.

B. 결과

인간 대식세포에 의한 사이토킨 생성을 유도하는 Zot의 능력을 보여주는 대표적인 실험이 도 12A - 12C에 도시된다. Zot의 첨가(TT의 부재하)는 6시간만큼 일찍 TNF-α의 상당량의 생성을 유도하였으며, 24시간에 피크 레벨에 도달하였고(3,400-3,800 pg/ml), 나중에 4일만에 기저 레벨 가까이 도달하도록 감소하였다(도 12A). 더 낮은 레벨의 TNF-α가 배지 또는 BSA 배양물에서 관찰되었으며(약 1,000-1,100 pg/ml), 이는 아마도 플라스틱 흡착후의 대식세포의 비특이적 활성화의 결과일 것이다. Zot에 의한 IL-1β의 약한 유도(약 40-60 pg/ml)가 또한 관찰되었으며, 2일후에 피크 레벨에 도달하고 4일만에 상당히 감소하였다(약 20 pg/ml) (도 12B). 배지 또는 BSA 배양물에서는 아무런 상당한 레벨의 IL-1β도 관찰되지 않았다. 최종적으로, Zot에 의한 배양은 6시간후 고 레벨의 IL-10의 생성을 초래하였으며(약 1,000 pg/ml), 1일만에 피크 레벨에 도달하고(약 1,500 pg/ml) 4일까지 동일 농도를 유지하였다(도 12C). TNF-α에 대해 상기에서 발견된 바와 유사하게, 상당히 낮은 레벨의 IL-10가 배지 또는 BSA 배양물에서 관찰되었고, 이는 아마도 플라스틱에 부착후 대식세포 비-특이적 활성화의 결과일 것이다. TT의 존재는 Zot 첨가후에 관찰된 사이토킨 응답의 동력학 또는 크기를 변화시키지 못했다. Zot에 노출후 강력한 프로염증성 사이토킨의 고 레벨 유도는 대식세포의 초기 효과를 다시 지적하며, 항원 가공 및 제시의 Zot-매개된 억제의 바탕을 이루는 메카니즘에 대한 추가적인 정보를 제공한다. 예컨대, IL-2와 같은 사이토킨의 생성의 저해를 통한 Th1 타입 응답의 주요 억제인자로 알려진 사이토킨인, IL-10 생성의 Zot-매개된 유도는 Zot를 배양물에 첨가시 관찰되는 항원-유도된 림포증식성 응답의 억제에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.

T 세포-유래된 사이토킨의 생성에 대한 Zot의 효과를 보여주는 대표적인 실험이 도 13A - 13B에 도시된다. Zot의 첨가가 TT와 함께 배양에 의해 유도된 IL-2 생성을 억제하는 반면, BSA는 어떤 효과도 없다는 것이 관찰되었다(도 13A). TT의 부재시 Zot에 의해 아무런 측정가능한 레벨의 IL-2도 유도되지 않았다. 대조적으로, Zot의 첨가는 TT에 의해 유도된 베레과 유사하게, TT의 부재시 저 내지 중 레 벨의 IFN-γ의 생성을 지속적으로 유도하였다(도 13B). 더욱이, Zot는 TT에 의해 유도된 IFN의 레벨을 현저히 증가시키는 반면, BSA는 아무런 효과도 없었다(도 13B). 최종적으로, Zot의 첨가가 IL-4 생성을 유도하지 않는다는 것이 관찰되었다. IL-2가 림프구 증식에서 중요한 역할을 하는 사이토킨이기 때문에, 항원성 자극후에 IL-2 생성의 억제는 TT 유도된 증식의 Zot-매개된 억제의 방탕을 이루는 키이 메카니즘중 하나라고 여겨진다. 또한 Zot가 TT 의 부재 또는 존재하에 IFN-γ 생성뿐만 아니라 많은 프로-염증성 사이토킨의 생성을 유도한다는 것은 Zot가 항원-특이적 면역 응답의 발생을 이끄는 항원 가공 및 제시의 복합 공정도중 다양한 레벨의 그 면역조절 효과를 발휘한다는 것을 가리킨다.

여기 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고문헌으로서 포함된다.

본 발명이 특정 구체예를 참조로 상세히 기술되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 가능하다는 것은 당업계의 기술자에게 자명할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> FASANO, Alessio Sztein, Marcelo B. LU, Ruiliang TANNER, Michael K. <120> METHOD OF USING ZOT OR ZONULIN TO INHBIT LYMPHOCYTE PROLIFERATION IN AN ANTIGEN-SPECIFIC MANNER <130> P7574 <140> 09/000,000 <141> 1999-09-09 <150> 60/100,266 <151> 1998-09-10 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Human <400> 1 Asn Asp Gln Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val 1 5 10 15 Ile Gln <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Human <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> X at position 10 is an amino acid. <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 3 cgggatcccg tatgagtatc ttt 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 4 cccaagcttg ggtcaaaata tact 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 5 tcatcacggc gcgccagg 18 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 6 ggaggtctag aatctgcccg at 22 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 7 Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 8 Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly 1 5

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특정 항원에 예비-노출된 세포의 배양물에서 항원제시세포-매개된 림프구 증식을 억제하는 방법에 있어서, Zot(Zonula Occludens Toxin)의 일정량을 상기 배양물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 양은 상기 항원제시세포의 활성을 하향-조절하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
특정 항원에 반응한 세포의 배양물에서 항원제시세포-매개된 림프구 증식을 억제하는 방법에 있어서, Zot(Zonula Occludens Toxin)의 일정량을 상기 항원과 조합하여 상기 배양물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 양은 상기 항원제시세포의 활성을 하향-조절하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.