CN117597137A - 用于治疗儿童（mis-c）和成人（mis-a）多系统炎症综合征的连蛋白拮抗剂 - Google Patents
用于治疗儿童（mis-c）和成人（mis-a）多系统炎症综合征的连蛋白拮抗剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及连蛋白拮抗剂以及包含连蛋白拮抗剂的药物组合物，其用于预防和/或治疗儿童(MIS‑C)和/或成人(MIS‑A)多系统炎症综合征。
Description
技术领域
本发明涉及连蛋白(Zonulin)拮抗剂以及包含连蛋白拮抗剂的药物组合物，其用于预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征。
背景技术
大多数急性感染SARS-CoV-2的儿童会出现轻微的上呼吸道症状或出现无症状感染。相反，成年人更常见的症状包括从轻微的上呼吸道症状到继发于需要辅助通气的间质性肺炎的严重呼吸窘迫。在初次感染消退后几天到几周，其中一些感染了COVID-19的患者(儿童和成人)将出现严重的危及生命的疾病，称为多系统炎症综合征(MIS)，这是一种与既往感染或接触过SARS-CoV-2相关的免疫激活综合征。MIS-C和MIS-A患者均表现为持续发热、明显的胃肠道症状、细胞因子风暴、心肌功能障碍以及多系统炎症背景下心源性休克伴心室功能障碍，类似于中毒性休克综合征或川崎病，但又有所不同。这些住院患者中百分之八十出现心脏病理，包括冠状动脉扩张、心肌功能障碍或伴有低血压休克的心室衰竭。这些患者出现这种晚期严重疾病的原因此前尚未确定，导致治疗选择和预防策略模糊不清。
MIS-C和MIS-A患者表现出单核细胞募集和吞噬作用增加，伴有细胞因子风暴、T细胞激活和免疫球蛋白炎症性扩张。最近在SARS-CoV-2刺突蛋白上的S1/S2切割位点附近发现了一个类似超抗原的基序，推测该基序可以驱使MIS-C中的这种超炎症反应(Cheng,M.H.et al.Superantigenic character of an insert unique to SARS-CoV-2spikesupported by skewed TCR repertoire in patients with hyperinflammation.ProcNatl Acad Sci U S A 117,25254-25262,2020；Porritt,R.A.et al.Identification ofa unique TCR repertoire,consistent with a superantigen selection process inChildren with Multi-system Inflammatory Syndrome,2020)。
然而，大多数MIS-C和MIS-A患者的鼻咽拭子逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)并未检测到SARS-CoV-2，因此这种高炎症反应的病因和发生时间尚待阐明(Feldstein,L.R.etal.Multisystem Inflammatory Syndrome in U.S.Children and Adolescents.N Engl JMed 383,334-346；Yonker,L.M.et al.Pediatric SARS-CoV-2:Clinical Presentation,Infectivity,and Immune Responses.J Pediatr)。在受MIS-A影响的成年人中，人们越来越认识到肠道是SARS-CoV-2的病灶(Gaebler,C.et al.Evolution of antibody immunityto SARS-CoV-2.Nature)，并且在严重的情况下肠道是SARS-CoV-2的病灶。COVID-19、胃肠道(GI)屏障的生态失调和破坏导致炎症激活(Giron,L.B.et al.Severe COVID-19IsFueled by Disrupted Gut Barrier Integrity.medRxiv,2020.2011.2013.20231209,2020；Trottein,F.&Sokol,H.Potential Causes and Consequences ofGastrointestinal Disorders during a SARS-CoV-2Infection.Cell Rep 32,1079152020)。尽管胃肠道症状在MIS-C症状中占主导地位，但胃肠道在MIS-C发病机制中的作用尚未得到评估。
随着儿童和青少年中SARS-CoV-2感染的患病率不断增加，一度被报道为危及生命但罕见的晚期表现的MIS-C病例也在增加。
因此，迫切需要更好地了解这种危及生命的疾病。
在儿童和成人中，在心脏并发症发生之前识别MIS-C和MIS-A病程早期至关重要；在此背景下，迫切需要了解推动MIS的发病机制以治疗和预防在儿童和成人中日益流行的疾病。
发明内容
本发明基于这样的发现：病毒抗原血症的胃肠道(GI)来源可能引发并驱动儿童(MIS-C)和成人(MIS-A)多系统炎症综合征。发明人特别发现，在初次感染后几周，SARS-CoV-2抗原仍保留在胃肠道中，同时发生连蛋白引起的粘膜屏障通透性过高和SARS-CoV-2抗原血症。目前的治疗策略旨在抑制炎症反应，但不解决粘膜通透性或抗原血症。
发明人发现，虽然类固醇和IVIG不能阻止SARS-CoV-2抗原的渗漏穿过粘膜屏障，但针对胃肠道粘膜通透性的治疗可以潜在地减少或预防抗原血症。
因此，本发明提出并解决的技术问题是提供预防和/或治疗MIS-C的有效治疗方法。本发明提供的解决方案以权利要求1所述的连蛋白拮抗剂为代表，例如拉瑞唑来。
拉瑞唑来是一种已在临床前研究中得到充分表征的新疗法(Gopalakrishnan,S.,Tripathi,A.,Tamiz,A.P.,Alkan,S.S.&Pandey,N.B.Larazotide acetate promotestight junction assembly in epithelial cells.Peptides 35,95-101,(2012)；Gopalakrishnan,S.et al.Larazotide acetate regulates epithelial tightjunctions in vitro and in vivo.Peptides 35,86-94,(2012))并在多项临床试验中具有出色的安全性。拉瑞唑来目前正处于治疗无反应性乳糜泻的3期试验中(Leffler,D.A.etal.Larazotide acetate for persistent symptoms of celiac disease despite agluten-free diet:a randomized controlled trial.Gastroenterology 148,1311-1319e1316,(2015))。
如本说明书实验部分中报道的临床测试结果清楚地显示的那样，连蛋白拮抗作用直接减少SARS-CoV-2抗原血症，并减轻受MIS影响的患者中的细胞因子风暴和随后的临床改善。发明人进行的研究强调了以下概念的证据：连蛋白拮抗作用可减少SARS-CoV-2抗原血症，从而改善炎症标志物水平，并且在开始治疗后使患者退烧并临床稳定。
根据这些发现，针对肠道通透性的诊断和治疗策略为识别、治疗和/或预防MIS-C和MIS-A提供了新途径。
因此，本发明的目的是：
-连蛋白拮抗剂，用于预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)的多系统炎症综合征。
-包含连蛋白拮抗剂和至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物，用于预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征。
-一种预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征的方法，包括以下步骤：
i.向有需要的患者施用有效量的根据本说明书和权利要求中公开的任何实施方案的连蛋白拮抗剂和/或药物组合物；
-一种用于诊断和/或预后和/或鉴定处于发生儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征风险的那些患者的体外方法，包括：(a)通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白和/或刺突蛋白的水平。
-一种用于监测儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征进展的体外方法，包括：(a)在第一时间点，通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白和/或病毒抗原的水平；(b)在随后的时间点重复步骤(a)；以及(c)比较步骤(a)和(b)中检测到的水平，从而监测MIS-C和/或MIS-A的进展。
-一种用于评估用于治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征的治疗剂的疗效的体外方法，包括：(a)在第一时间点，通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白和/或病毒抗原的水平；(b)在用所述治疗剂治疗所述患者后的随后的时间点重复步骤(a)；以及(c)比较步骤(a)和(b)中检测到的水平，从而评估所述治疗剂的疗效。
本发明的附加优点和/或实施例将从以下详细描述中变得显而易见。
简要附图说明
参照以下附图可以更好地理解本发明及其优选实施例的以下详细描述：
图1：A)通过Mann-Whitney t检验对MIS-C儿童和健康对照儿童中通过质谱定量的连蛋白进行评估。通过单因素方差分析和多重比较，对MIS-C儿童、急性COVID-19儿童和健康对照儿童的血浆中的B)SARS-CoV-2刺突、C)S1和D)核衣壳蛋白进行了定量。****P<0.0001,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05。
图2：通过单因素方差分析和多重比较，对MIS-C儿童、急性COVID-19儿童和健康对照儿童的血浆中的A)抗刺突IgM、B)抗刺突IgG和C)抗刺突IgA的峰值进行定量。对于MIS-C，在症状出现后随时间绘制D)抗刺突IgM、E)抗刺突IgG和F)抗刺突IgA的时间进程。G)通过Mann-Whitney t检验比较MIS-C儿童和急性COVID-19儿童抗体中和的半数最大抑制浓度(IC50)。****P<0.0001,**P<0.01,*P<0.05。
图3：在使用类固醇和/或免疫球蛋白替代疗法治疗前，以及14天治疗的整个过程，对MIS-C儿童血浆中A)SARS-CoV-2刺突、B)S1和C)核衣壳水平进行量化。阴影区域表示每个特定抗原测试的检测限。B)详细描述了患有MIS-C的儿童在整个病程中的刺突以及抗刺突IgM、IgG和IgA的水平。值得注意的是，在213天的随访时间点，刺突蛋白仍然高于刺突抗原测试的检测限。
图4：所提出的驱动MIS-C的假设概览。儿童接触或感染SARS-CoV-2。SARS-CoV-2进入胃肠道。生态失调导致连蛋白释放增加并导致紧密连接丧失。SARS-CoV-2抗原，尤其是刺突蛋白，突破粘膜屏障，进入血流。刺突蛋白的超抗原基序刺激致病性高炎症反应。
图5：患有COVID-19的儿童的细胞因子和炎症介质水平以及MISC发展的概览。重点介绍了IVIG、类固醇和拉瑞唑来的治疗。
图6：接受拉瑞唑来治疗的儿童的时间线。医院病程由急性COVID-19以及随后的MIS-C描述，并随时间进程确定关键临床事件和治疗过程。显示了整个住院过程中的CRP和SARS-CoV-2刺突抗原的水平。
图7：从患有MIS-C、急性COVID-19或健康对照的儿童中测量的细胞因子峰值：A)IL1β、B)IL6、C)IL10、D)TNFα、E)IFNγ、F)IL12p70、G)IL22H)IL8，I)IL5。使用单因素方差分析和Tukey多重比较对数值进行比较。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。
图8：在患有MIS-C、急性COVID-19或健康对照的儿童中，对A)抗S1IgM、IgG和IgA，B)抗RBDIgM、IgG、IgA和C)抗核衣壳IgM、IgG和IgA进行比较。使用单因素方差分析和Tukey多重比较对数值进行比较。
图9：从症状出现到随访4-6个月，MIS-C儿童血浆中的A)SARS-CoV-2刺突、B)S1和C)核衣壳水平在整个病程中进行定量。阴影区域表示每个特定抗原检测的检测限。
图10：四名MIS-C儿童在急性发作后接受拉瑞唑来作为辅助治疗。CRP(mg/L)、D-二聚体(ng/mL)、发热曲线和胃肠道症状通过治疗过程中的多次评估来呈现。
图11：四名MIS-C儿童的S1和刺突抗原水平、抗刺突IgG和IgA以及细胞因子水平，这些儿童除了标准MIS-C治疗外还接受了拉瑞唑来治疗。
具体描述
下面将描述本发明的几个实施例。旨在在兼容的情况下可以组合各个实施例的特征。一般而言，随后的实施例将仅针对与前述实施例的差异进行公开。
如前所述，本发明的第一目的在于用于预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征的连蛋白拮抗剂。
如本文所用，术语“连蛋白(zonulin)”，也称为触珠蛋白2前体，是指结构和功能相关的哺乳动物蛋白家族，其通过调节细胞间紧密连接来可逆地调节肠通透性。连蛋白特异性地调节消化道壁细胞之间紧密连接的通透性。作为霍乱病原体霍乱弧菌分泌的闭合小带毒素(以下简称“Zot”)的哺乳动物类似物，连蛋白与乳糜泻和1型糖尿病的发病机制有关。连蛋白与肠道上皮细胞表面的特定受体特异性结合并触发一系列生化事件，诱导紧密连接分解以及随后肠上皮细胞通透性的增加，从而允许一些物质通过并激活免疫反应。
在本发明一优选例中，上述连蛋白为具有SEQ ID N.5所示氨基酸序列的蛋白质。
在本发明的上下文中，术语“连蛋白拮抗剂”旨在涵盖能够抑制连蛋白生物活性，即抑制连蛋白生理上调节哺乳动物紧密连接打开的能力的所有那些化合物或活性剂。连蛋白拮抗剂的这种抑制活性可以通过肠通透性测定来测定，包括乳果糖/甘露醇测试，例如Khaleghi et al.2016,Therap.Adv.Gastroenterol.Jan 9(1):37-49中描述的，通过引用并入本文。
术语“连蛋白拮抗剂”还可以旨在涵盖所有那些能够通过阻断连蛋白受体来特异性地降低紧密连接通透性的化合物或活性剂，例如Paterson et al.2007AlimentPharmacol Ther.2007Sep 1；26(5):757-66或者Gopalakrishnan etal.2012Peptides.2012May；35(1):86-94中所示，其通过引用并入本文。
根据本发明，合适的连蛋白拮抗剂可以选自拉瑞唑来、其盐、类似物和/或衍生物。
在一个优选的实施方案中，所述连蛋白拮抗剂是药物拉瑞唑来或其衍生物。在本发明的上下文中，术语“拉瑞唑来”用于表示八肽，其结构衍生自霍乱弧菌分泌的蛋白质(闭塞小带毒素)。它具有氨基酸序列GGVLVQPG、其为H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH的IUPAC缩合描述符(SEQ ID N 1)，以及系统名称glyylglycyl-L-valyl-L-亮氨酰-L-缬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-脯氨酰-甘氨酸。
具有以下序列的八肽：H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)已由Fasano在WO 0007609中和由WANG,et al.Human Zonulin,a Potential Modulator ofIntestinal Tight Junctions.Journal of Cell Science.2000,113:4435-4440(2000)描述作为连蛋白的肽拮抗剂。
根据本发明可以使用的拉瑞唑来衍生物的示例包括拉瑞唑来盐，例如盐酸盐或乙酸盐，或者具有一种或多种氨基酸修饰，例如氨基酸取代、缺失和/或插入的衍生物。例如，衍生物可以具有1、2、3或4个氨基酸修饰，其独立地选自相对于SEQ ID NO:1的氨基酸缺失、插入和/或取代。
根据本发明的拉瑞唑来类似物的可能的示例是结构特征为以下的化合物：由天然和非天然氨基酸构建的八肽；具有天然和非天然氨基酸的不同序列长度的肽；环状和线性肽模拟物；环肽。
在一个优选的实施方案中，根据本发明所述的该用途的连蛋白拮抗剂是乙酸拉瑞唑来，也称为AT-1001。
根据本发明所述的该用途的连蛋白拮抗剂的其他非限制性示例包括欧洲专利EP1698345B1中定义的肽拮抗剂。为了本发明的目的，术语“肽”是指其中单体是通过酰胺键共价连接在一起的氨基酸的聚合物。
本说明书中描述的连蛋白肽拮抗剂可以使用众所周知的技术，例如HighPerformance Liquid Chroncitography of Peptides and proteins:separationanalysis and conformation,Eds.Mant et al.C.R.C.press(1991)中所描述的那样，以及肽合成仪，例如Symphony(Protein Technologies,Inc.)来化学合成和纯化；或通过使用重组DNA技术，即将编码肽的核苷酸序列插入到合适的诸如大肠杆菌或酵母表达载体的表达载体中，在相应的宿主细胞中表达，并使用标准技术从中纯化。
本发明的另一个目的涉及一种药物组合物，其包含根据前述任一实施方案的连蛋白拮抗剂和至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体，用于预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含拉瑞唑来，特别是乙酸拉瑞唑来，和至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体。
根据组合物的最终形式，技术人员将容易地选择合适的载体和/或赋形剂。可用于制备根据本发明的组合物的合适的赋形剂和/或载体可选自本领域常用的那些，例如稳定剂、防腐剂、溶剂、pH调节剂、等渗调节剂、螯合剂、冷冻保护剂、稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、表面活性剂。
根据本发明的组合物还可包含保护性化合物，其可促进所述连蛋白拮抗剂在感兴趣的细胞和/或身体区室中的特异性转运和/或释放。此类化合物可包括本领域已知的任何药理学转运系统，例如生物相容性聚合物、可生物降解或可侵蚀的聚合物基质、微粒系统、脂质体、纳米结构材料、光敏胶囊、纳米颗粒、阳离子脂质。
本发明的药物组合物可以是例如溶液、悬浮液、粉末、胶囊、片剂、锭剂、颗粒剂的形式。
如前所述，根据本文公开的任何实施方案的连蛋白拮抗剂和/或包含所述连蛋白拮抗剂的药物组合物可用于MIS-C的预防和/或治疗以及引起MIS-C和/或与MIS-C相关的肠道病症。
阻断连蛋白途径的能力可以显著改善胃肠道症状以及幼儿MIS的总体临床结果，如下例所示，这支持了本发明的连蛋白拮抗剂和药物组合物的预防作用以及治疗作用。
在本发明的上下文中，术语“MIS-C”和“MIS-A”分别指儿童或成人的不同身体部位可能发炎的病理状况，包括心脏、肺、肾、脑、皮肤、眼睛和/或胃肠器官。在示例性实施例中，MIS-C和MIS-A可能由病毒感染引起或与病毒感染相关。在特别优选的实施方案中，所述病毒感染是病毒呼吸道感染，例如SARS、MERS或特别是SARS-CoV-2感染。
儿童和/或成人甚至在首次接触/感染病毒病原体几周后也可能发生MIS。例如，本发明的作者发现，虽然大多数患有MIS-C的儿童和患有MIS-A的成人的鼻咽病毒拭子呈阴性，但在最初的感染/暴露几周后的大多数MIS-C粪便样本中可以检测到SARS-CoV-2。
本文所用的术语“儿童”包括1岁至21岁年龄组的人类。本发明的化合物和组合物还可用于青少年(15-17岁)或成人(18岁或以上)。
在一些实施方案中，患有根据本发明的MIS的儿童可以基于由疾病控制中心(CDC)(https://www.cdc.gov/mis-c/hcp/)定义的一项或多项标准来鉴定、诊断或确认。
根据CDC，MIS-C的病例定义为：
-年龄<21岁的个体，出现发烧i、炎症实验室证据ii、以及需要住院治疗的临床严重疾病证据，且多系统(>2)器官受累(心脏、肾脏、呼吸系统、血液系统、胃肠道、皮肤科或神经系统)；和
-没有其他合理的诊断；和
-通过RT-PCR、血清学或抗原检测，当前或近期SARS-CoV-2感染呈阳性；或在症状出现前4周内接触过COVID-19。
i发烧>38.0℃持续≥24小时，或报告自觉发热持续≥24小时
ii包括但不限于以下一种或多种：C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、纤维蛋白原、降钙素原、d-二聚体、铁蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)或白细胞介素6(IL-6)升高，中性粒细胞升高，淋巴细胞减少，白蛋白降低。
与儿童一样，感染了导致COVID-19的病毒的成年人可能会在患病几天到几周后出现MIS-A症状。MIS-A是一种身体不同部位(如心脏、胃肠道、皮肤或大脑)都可能出现问题的病症。患有MIS-A的成年人可能有各种体征和症状，包括：
-发烧
-低血压
-腹部(肠道)疼痛
-呕吐
-腹泻
-颈部疼痛
-皮疹
-胸闷/疼痛
-感觉很累
在一些实施方案中，受MIS影响的患者可能经历一种或多种以下表现：粘膜屏障通透性过高、病毒抗原血症、连蛋白血液水平升高以及一种或多种以下症状：腹痛、呕吐、腹泻、心肌功能障碍和/或心源性休克。
如下文将进一步公开的，因此也可以例如通过测量连蛋白的血液水平来鉴定、诊断或确认患有根据本发明的MIS的儿童和/或成人。
在一种优选的实施方式中，患有MIS的患者特别是患有粘膜屏障通透性过高和/或病毒抗原血症的患者。本说明书中使用的术语“病毒抗原血症”特别是指以所述患者的血液中存在病毒抗原为特征的病症。在一个特别优选的实施方案中，所述病毒抗原血症是SARS-CoV-2抗原血症。
在根据本发明的一些实施方案中，所述患者表现出与健康对照(例如健康儿童和/或成人)相比连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种以下细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8、IL-5的血液水平增加。发明人发现，MIS-C和/或MIS-A中连蛋白水平升高表明在检测粪便中病毒抗原的情况下通透性增加；这可能允许病毒抗原从肠道进入血流，引发严重的细胞因子释放和高炎症反应。
如本文所用，表述“病毒抗原”包括引发针对病毒的免疫应答的任何物质。优选的示例包括SARS-CoV-2病毒或其衍生物的刺突蛋白，例如SARS-CoV-2刺突蛋白亚基S1和S2，或特别是SARS-CoV-2刺突蛋白的超抗原样基序。
如本文所用，表述“增加的血液水平”旨在表示通过从待测试的患者获得的全血和/或血液成分样本中的定性和/或定量分析确定的任何上述生物分子，相对于在健康患者中测定(或预先测定)的相同生物分子的水平，的增加的量和/或增加的表达水平。根据本发明的血液或血液成分样本的示例包括血清和/或血浆样本。
有利地，本发明的连蛋白拮抗剂或组合物可以有效地用于预防、减轻和/或消除由MIS-C和/或MIS-A引起的或与MIS-C和/或MIS-A相关的任何症状，例如来自MIS-C和/或MIS-A的血流中的抗原渗漏。肠道(即抗原血症)、高细胞因子血症和/或炎症反应。
在一个优选的实施方案中，本发明的连蛋白拮抗剂或组合物可用于特异性阻断肠通透性，从而限制和/或避免抗原从肠渗漏到血流中。
在一些实施方案中，本发明的连蛋白拮抗剂或组合物可有效用于降低患有MIS的患者中本说明书中提到的任何生物分子或其他炎症介质的血液水平。在一个优选的实施方案中，本发明的连蛋白拮抗剂或组合物可以有效地用于将患者中SARS-CoV-2刺突蛋白的血液水平降低至少90％，从而减轻炎症并改善一种或多种上述MIS-C和/或MIS-A相关症状。
用于预防和/或治疗儿童和/或成人MIS的连蛋白拮抗剂的药学有效量可以根据所治疗患者的确切年龄以及体重和性别而变化。一般而言，本发明中用于抑制连蛋白生物活性的连蛋白拮抗剂的量在约0.1μM至1000μM的范围内，优选约5μM至500μM。
为了达到这样的最终浓度，例如在需要其的患者的肠或血液中，可以以0.1μg至1000μg、优选约1.0μg至100μg的量施用根据本发明的连蛋白拮抗剂。
因此，在一些实施方案中，连蛋白拮抗剂可以每单位剂量0.1至1000μg/kg、优选0.1至10μg/kg的量存在于本发明的药物组合物中，优选等于每单位剂量10μg/kg，最高500μg/剂量。
根据某些实施方案，本发明的连蛋白拮抗剂或药物组合物可以每天向有需要的儿童和/或成人施用一次或多次。例如，根据本发明任何实施方案的连蛋白拮抗剂或药物组合物可以每天一次、每天两次、或大约每天三次或更多次施用。优选地，根据本文公开的任何实施方案的连蛋白拮抗剂或药物组合物每天施用四次。在某些实施方案中，本发明的连蛋白拮抗剂或组合物的方案可以在有需要的儿童和/或成人中长期施用。
优选地，连蛋白拮抗剂或药物组合物每4-8小时、更优选每6小时向有需要的儿童施用。
在一些优选的实施方案中，用于根据本发明所述的该用途的连蛋白拮抗剂可以以每4-6小时1-10μg/kg之间的剂量方案，优选以每6小时10μg/kg的剂量方案，施用给有需要的儿童和/或成人。
根据本文描述的任何实施方案的连蛋白拮抗剂或药物组合物可以全身性施用，或优选地口服施用。
在一个实施方案中，本发明的连蛋白拮抗剂可以以适合肠递送的形式口服施用。用于肠递送的口服剂量组合物是本领域众所周知的并且通常包含胃耐受片剂或胶囊。适合肠递送的片剂可通过添加例如邻苯二甲酸乙酸纤维素、对苯二甲酸乙酸纤维素或基本上抵抗在模拟胃液中溶解的不同肠溶聚合物包衣而制成耐胃液的。
在一些实施方案中，此类片剂或胶囊可包含pH依赖性肠溶衣，例如延迟释放包衣；延迟释放包衣优选在酸性环境(例如pH约5.5或更低)中基本上稳定，而在接近中性至碱性环境(例如pH大于约6.0)中基本上不稳定。仅举例来说，可用于制备包含根据本发明的连蛋白拮抗剂的片剂的合适的肠溶衣是能够在接近中性至碱性环境(例如已在小肠中发现的那些环境)中崩解或溶解的包衣。
或者，作为固体剂型的胶囊可以将本发明的连蛋白拮抗剂封装在硬的或软的、可溶的明胶容器或壳中，例如由胶原材料通过水解产生的明胶。
根据本发明的用于肠递送的合适的药物组合物还可以包括含有水性缓冲剂的液体组合物，所述水性缓冲剂防止连蛋白拮抗剂被胃中的胃液显著失活，从而允许所述连蛋白拮抗剂以活性形式到达小肠。所述水性缓冲剂的非限制性示例包括碳酸氢盐缓冲剂(pH5.5至8.7，优选约pH7.4)。
当本发明的药物组合物为液体形式时，优选在其给药前不久、优选恰好在给药前制备，以便使可能的稳定性问题最小化。此类液体组合物可以例如通过将适量的连蛋白拮抗剂溶解在本文公开的水性缓冲剂中来制备。
本文描述的所有药物组合物可以通过采用药物领域已知的标准制备技术来制备。组合物还可以以单剂量或单剂量部分的等分形式提供。
根据本发明的连蛋白拮抗剂或包含所述连蛋白拮抗剂的药物组合物可以用于治疗儿童和/或成人MIS的方法。在一些实施方案中，所述治疗方法包括向有需要的患者施用有效量的所述连蛋白拮抗剂或所述药物组合物。
在允许的情况下，本发明还涵盖医学治疗，其包括向需要其的患者施用治疗有效量的本说明书中提供的任何实施方案中的本发明的连蛋白拮抗剂或组合物。
因此公开了一种预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征的方法，包括以下步骤：
i.向有需要的患者施用有效量的根据本说明书中描述的任一实施方案的连蛋白拮抗剂和/或药物组合物。
如前所述，可给予所述患者的连蛋白拮抗剂的有效量将根据所述儿童的年龄、体重、性别以及MIS表现的严重程度而变化。
优选地，所述连蛋白拮抗剂将以10μg/kg的剂量方案施用。
根据一个优选实施例，上述方法的步骤i.每6小时进行一次，优选持续至少21天。
如上所述，本发明方法的步骤i可以通过全身性施用的方式进行，优选通过口服施用，更优选通过以适合肠递送所述连蛋白拮抗剂的形式口服施用。
根据本说明书的方法可以包括另外的步骤，其中，从所述患者获得的全血和/或血液成分样本已经通过定性和/或定量分析来测定连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种所述细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5相比参考值所增加的水平。
在一些实施方案中，相比来自一名或多名健康患者的对照样本的参考值以及相比所述连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5中的每一者的预定截止值，来评估所述增加的水平。
根据本文公开的任一实施例的方法，在所述步骤i之后还可以包括以下步骤：
ii.通过定性和/或定量分析测定从所述患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种所述细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5中的水平；
iii.根据步骤ii中所测定的所述连蛋白的水平和/或所述病毒抗原的水平和/或所述一种或多种所述细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平来调整所述连蛋白拮抗剂的所述剂量方案。
有利地，通过根据本发明的方法从所述患者获得的全血和/或血液成分样本中测定连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平可能有助于医生监测疾病的进展，并根据所述进展改变连蛋白拮抗剂的剂量方案。
仅举例来说，在从所述患者获得的全血和/或血液成分样本中测定连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平似乎在疾病过程中减少的情况下，医生可能会减少给予所述儿童连蛋白拮抗剂的量。
如前所述，根据本发明的MIS-C和/或MIS-A患者可以基于疾病控制中心(CDC)定义的一项或多项标准来被鉴定、诊断或确认(https://www.cdc.gov/mis-c/hcp/，https://www.cdc.gov/mis-c/mis-a.html)。
MIS患者还可以例如通过测量连蛋白的血液水平来被识别、诊断或确认。
因此，用于诊断和/或预后和/或用于鉴定处于发生儿童(MIS-C)或成人(MIS-A)多系统炎症综合征的风险的那些患者的体外方法也构成本发明的一部分，该方法包括：(a)通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中连蛋白的水平。
在一些实施方案中，上述体外方法的步骤(a)还包括通过定性和/或定量分析测定从所述患者获得的所述全血和/或血液成分样本中的病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平。
根据另一个实施例，上述体外方法还可以包括以下步骤：
(b)将(a)中确定的水平与至少一个参考值进行比较；以及
(c)当(a)中测定的所述水平相对于所述至少一个参考值较高时，诊断MIS-C和/或MIS-A。
合适的参考值可以从一名或多名健康患者的对照样本中获得。
在一个优选的实施方案中，相对于健康患者，根据本发明的任一种方法从最近发生病毒感染、特别是SARS-CoV-2感染的患者获得的血液样本中测定连蛋白的水平增加，可以提供所述感染患者发生MIS的高风险的指示。
在一种实施方式中，上述体外方法还可以包括确定所述儿童是否表现出如本说明书先前所定义的MIS症状和/或表现之一。
本发明的另一个目的是用于监测儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征进展的体外方法，包括：(a)在第一时间点，通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白的水平；(b)在一个或多个随后的时间点重复步骤(a)；以及(c)比较步骤(a)和(b)中检测到的水平，从而监测MIS的进展。
上述方法的步骤(a)还可以包括通过定性和/或定量分析测定从所述患者获得的所述全血和/或血液成分样本中的病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平。
在实施本发明的用于监测MIS进展的体外方法时，“第一时间点”可以是例如时刻ti，其中i＝0表示开始监测的时间点。因此，“第一时间点”是开始监测并且任何上述生物分子(例如，连蛋白)的水平可以被当做是能评估所述MIS随时间的进展的起始值的时刻。
根据上述方法的“一个或多个后续时间点”可以指示连续的时刻ti，其中i是从1增加到n的整数值，表示彼此连续的时刻，它们的时间连续性由i值的增加所表示。因此，任何上述生物分子的水平的测定和/或定量可以在i＝0的ti之后的时刻重复，并且从i＝1到n依次进行，使得该时刻t1在时刻t2之前，t2在时刻t3之前，依此类推。
根据上述方法对每个后续ti确定的任何上述生物分子的水平的比较可以提供MIS监测的指示。
根据本发明的用于监测MIS进展的体外方法，步骤(b)中测定的所述水平相对于步骤(a)中测定的所述水平的显著降低代表MIS改善的指示。
另一方面，步骤(b)中测定的任何生物分子的水平相对于所述方法的步骤(a)中测定的所述水平的显著增加代表MIS进行性恶化的指示。
本发明的另一个目的是用于评估用于治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征(MIS-A)的治疗剂的疗效的体外方法，包括：(a)在第一时间点，通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白的水平；(b)在用所述治疗剂治疗所述患者后的一个或多个随后的时间点重复步骤(a)；以及(c)比较步骤(a)和(b)中检测到的水平，从而评估所述治疗剂的疗效。
在一个优选的实施方案中，合适的治疗剂是根据本说明书中公开的任一实施方案的连蛋白拮抗剂或包含所述连蛋白拮抗剂的药物组合物。
上述方法的步骤(a)还可以包括通过定性和/或定量分析测定从所述患者获得的所述全血和/或血液成分样本中的病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平
在实施上述方法时，合适的“第一时间点”可以是时刻ti，其中i＝0，代表开始评估所述疗效的时间点，并且优选地对应于开始用治疗剂治疗之前的时刻。
根据上述方法，“一个或多个后续时间点”在这种情况下可以指示连续的时刻ti，其中i是从1增加到n的整数值，表示彼此连续并且在开始用所述治疗剂治疗所述患者之后的时刻，其时间顺序由i值的增加指示。
任何上述生物分子的水平的测定和/或定量可以在i＝0的ti之后的时刻重复，并且从i＝1到n依次进行，使得时刻t1在时间点t2之前，t2在时间点t3之前，依此类推；根据上述方法对每个后续ti确定的任何上述生物分子的水平的比较可以提供所用治疗剂的疗效的指示。
值得注意的是，上述方法的步骤(b)中测定的任何上述生物分子的水平相对于步骤(a)中测定的所述水平的显著降低代表了所述治疗剂的疗效的指示。另一方面，相对于所述方法的步骤(a)中测定的所述水平，步骤(b)中测定的上述生物分子的水平显著增加，代表所述试剂的疗效较差的指示。
根据本说明书中公开的任何方法从患者获得的所述全血和/或血液成分样本中的连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5或其他炎症介质的水平可以通过执行以下体外测试方法来测定和/或定量。
适合于测定和/或定量任何上述生物分子的表达水平的体外测试的非限制性示例包括免疫学测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定、RNA表达水平测定或其组合。上述所有测试对于本领域技术人员来说是已知的，他们知道必须测定和/或定量哪种生物分子以及所使用的生物样本的类型，并能够选择最合适的方案。
在一个优选的实施方案中，可以使用能够选择性靶向任何上述生物分子的试剂，例如抗体，通过免疫组织化学具体地进行测定和/或定量任何上述生物分子的水平的测定和/或定量。
在本发明的一些实施方案中，患者可以接受辅助治疗，其在一些实施方案中与拉瑞唑来治疗具有协同作用。
本发明的另一个目的是生物样本中、特别是在血液样本中的连蛋白作为MIS生物标志物，或者用于体外检测患者生物样本中，特别是血液样本中，的连蛋白水平的试剂盒用于诊断所述患者的MIS。
在本说明书和权利要求书的任何部分中，术语“包括”可以由术语“由......组成”替代。
下面报道的示例的目的是更好地说明本说明书中公开的方法，这些示例决不被认为是对先前的描述和随后的权利要求的限制。
示例
该研究纳入了72名儿童，其中19名儿童根据疾病控制中心(CDC)标准被临床诊断为MIS-C(https://www.cdc.gov/mis-c/hcp/)(表1)，21名儿童经RT-PCR确诊患有COVID-19，以及32名大流行前的健康对照者。患有MIS-C的儿童的平均年龄比患有COVID-19的儿童更小，与全国平均水平一致(https://www.cdc.gov/mis-c/hcp/以及Feldstein,L.R.etal.Multisystem Inflammatory Syndrome in U.S.Children and Adolescents.N Engl JMed 383,334-346,2020)。之前接触过COVID-19或在出现MIS-C(范围13-62天)之前的26天发生感染后，MIS-C患者出现中位数为3天(范围1-28天)的与MIS-C相关的急性症状。值得注意的是，胃肠道症状在MIS-C队列中占主导地位，影响了94％的患者，而急性COVID-19儿童的这一比例为29％(Fisher精确检验，P<0.0001)(表2)。
表1：诊断为MIS-C的19名儿童的年龄、性别和临床标准。
示例1-MIS-C儿童胃肠道中的SARS-CoV-2与肠上皮屏障功能丧失同时发生。
鉴于MIS-C是在SARS-CoV-2感染/暴露后几周出现的(表2)，并且已知呼吸道分泌物中的病毒载量在感染后7-10天内会减少，因此MIS-C不太可能与最初的呼吸道感染有关。大多数MIS-C儿童的鼻咽病毒拭子呈阴性(Yonker,L.M.et al.Pediatric SARS-CoV-2:Clinical Presentation,Infectivity,and Immune Responses.J Pediatr,(2020))。相比之下，在初次感染/暴露几周后，大多数MIS-C粪便样本中都可以检测到SARS-CoV-2，可检测到的病毒载量范围为1.5x102-2.5x107RNA拷贝/mL。除了MIS-C患者严重胃肠道症状占主导地位外，粪便中检测到SARS-CoV-2病毒表明MIS-C出现时的病毒或病毒抗原来源来自胃肠道系统。
表2：除了急性COVID-19和MIS-C疾病的临床特征外，还描述了所有儿科患者和健康对照的年龄和性别。使用单因素方差分析和Tukey多重比较(年龄)；卡方检验(性别)；Mann-Whitney t检验(自接触COVID-19以来的天数)；费舍尔精确检验(呼吸道和胃肠道症状的报告)评估组之间的显著差异。
完整、功能性的肠粘膜屏障应防止大抗原(包括源自胃肠道中SARS-CoV-2的病毒抗原)从肠腔进入血液。连蛋白是一个结构和功能相关的蛋白质家族，通过调节细胞间紧密连接来可逆地调节肠道通透性。据报道，在包括自身免疫性疾病和高炎症性疾病，如乳糜泻、炎症性肠病和川崎病在内的多种疾病中，血液中连蛋白水平升高表明肠道通透性增加。上皮细胞释放连蛋白导致大炎症抗原从肠腔进入血流的细胞旁运输。在这项研究中，通过质谱分析检测发现，与健康对照组相比，MIS-C儿童的释放到血液循环的连蛋白显著增加(P<0.0001)(图1A)，表明粘膜屏障功能被破坏。这种紧密连接能力的丧失，加上粪便中SARS-CoV-2的识别，支持了这样的假设：SARS-CoV-2病毒成分的胃肠道来源突破了粘膜屏障并进入血液循环。
示例2—MIS-C儿童患有SARS-CoV-2抗原血症。
尽管病毒血症和抗原血症已被证明与成人严重急性COVID-19相关，但MIS-C中尚未检测到病毒血症，之前也未在儿童中评估过抗原血症。尽管在最初的SARS-CoV-2感染或暴露几周后，单分子阵列(Simoa)检测(Ogata,A.F.et al.Ultra-sensitive SerialProfiling of SARS-CoV-2Antigens and Antibodies in Plasma to UnderstandDisease Progression in COVID-19Patients with Severe Disease.Clin Chem,(2020))仍在MIS-C儿童的血浆中鉴定出了SARS-CoV-2刺突S1和核衣壳抗原。与健康对照(P<0.0001)和急性COVID-19儿童(P<0.001)相比，MIS-C患者的SARS-CoV-2刺突蛋白显著升高(图1B)。与健康对照(P＝0.004)和急性COVID-19儿童(P＝0.02)相比，MIS-C患者中的SARS-CoV-2S1蛋白水平也显著升高(图1C)。MIS-C患者中的SARS-CoV-2核衣壳蛋白有所增加，但水平并未达到显著水平(图1D)。与健康对照相比，急性COVID-19儿童的SARS-CoV-2抗原血症没有显著增加。
MIS-C免疫图谱反映了粘膜持续暴露于SARS-CoV-2。
MIS-C儿童的IL-1β、IL-6、IL-10和TNFα水平显著升高(图7A-D)。值得注意的是，与健康对照和急性COVID-19儿童相比，MIS-C患者的抗病毒细胞因子IFNγ也显著增加(图7E)。IFNγ的增加是病毒暴露的典型表现，但在严重急性COVID-19中却相反地受到了抑制。还评估了IL-12p70、IL-8、IL-5和IL-22，但在MIS-C或急性儿科COVID-19中未发生改变(图7F-I)。在MIS-C患者中，靶向SARS-CoV-2抗原的免疫球蛋白IgM、IgG和IgA亚群在对抗抗刺突和S1蛋白具有最高的升高程度(图2A-C；图8)，对应于这些儿童血流中检测到的最高的抗原。正如预期的那样，抗刺突-IgM在急性COVID-19中最高，反映了早期的适应性免疫反应(图2A)。然而，鉴于MIS-C在最初感染/暴露于SARS-CoV-2几周后出现，抗刺突-IgM仍然高于预期。此外，当评估与MIS-C症状发作时间相关的抗刺突-IgM水平时，在MIS-C症状发作后数月内抗刺突-IgM持续上升并保持升高状态(图2D)，这支持持续抗原暴露或长寿IgM浆细胞的发育的观察结论。如预期的那样，抗刺突-IgG、抗S1-IgG和抗RBD-IgG在延迟发作的MIS-C中最高(图2B；图8)，并随着时间的推移保持稳定(图2E)。IgA是最能反映粘膜免疫的免疫球蛋白，通常在病毒清除后减弱。此处，抗刺突-IgA、抗S1-IgA和抗RBD-IgA在MIS-C中均显著升高(图2C；图8)，并且意外地是，抗刺突-IgA在初始SARS-CoV-2感染后的数月内仍保持升高(图2F)。MIS-C患者中抗SARS-CoV-2IgA和IgM持续升高，支持MIS-C儿童的胃肠道粘膜表面持续存在病毒抗原暴露和炎症的假设。
比较了MIS-C儿童和急性COVID-19儿童针对SARS-CoV-2的血浆中和能力。有趣的是，尽管与急性COVID-19儿童相比，MIS-C儿童的SARS-CoV-2IgG水平显著升高，但两组儿童的中和滴度相当(图2G)。这表明，在患有MIS-C的儿童中，随着时间的推移，针对SARS-CoV-2病毒颗粒的抗体可能会变得非特异性。无效的中和和较差的抗原清除率，再加上胃肠道来源的持续病毒抗原渗漏，可以部分解释MIS-C受试者中检测到的高水平抗原。
示例3-时间动力学揭示MIS-C中的体液反应不足以抑制SARS-CoV-2抗原血症。
在MIS-C患者中可检测到SARS-CoV-2抗原和免疫球蛋白，其水平显著高于健康对照组。成人抗原血症发生在COVID-19病程早期，与肺部症状相关，而在MIS-C中，抗原血症发生在SARS-CoV-2上呼吸道感染或无症状感染消退后几周至几个月的显著胃肠道症状中。为了了解病毒抗原血症和体液反应之间的关系，我们研究了MIS-C患者的纵向样本。首先，评估自MIS-C症状出现以来随时间变化的抗原。之前的报告显示，在患有急性COVID-19的成人中，随着患者达到血清转化，SARS-CoV-2抗原会迅速被清除(Ogata,A.F.et al.Ultra-sensitive Serial Profiling of SARS-CoV-2Antigens and Antibodies in Plasma toUnderstand Disease Progression in COVID-19Patients with Severe Disease.ClinChem,(2020))。相比之下，本研究表明，尽管抗刺突-IgG和-IgA发生血清转化，但刺突抗原在MIS-C症状出现的最初几天内上升，并持续超过10天，有时甚至持续六个月(图9)。血清转化患者中刺突蛋白的高存在也是在任何成人COVID-19病例中未观察到的新表现(Ogata,A.F.et al.Ultra-sensitive Serial Profiling of SARS-CoV-2Antigens andAntibodies in Plasma to Understand Disease Progression in COVID-19Patientswith Severe Disease.Clin Chem,(2020))。结果发现，在我们的队列中开始类固醇和/或免疫球蛋白替代(IVIG)治疗后，SARS-CoV-2抗原水平并未显著下降(图3A)，这是目前唯一推荐的MIS-C治疗方法。这表明目前的疗法针对的是MIS-C的下游后果，即炎症反应，但未能解决引发持续炎症的持续抗原血症。图3B详细概括了一名典型的MIS-C住院儿童的刺突抗原血症和体液炎症反应，与SARS-CoV-2暴露、症状出现和治疗过程相关。
示例4-连蛋白拮抗作用减少了刺突抗原血症和细胞因子风暴，随后改善了MIS-C的临床结果
美国食品和药物管理局(FDA)批准同情性使用拉瑞唑来，每6小时10微克/公斤，用于治疗一名患有MIS-C的17个月大男孩，该男孩在抗炎治疗后病情未见好转。该幼儿有复杂的既往病史，包括14号染色体部分重复、肝门肠吻合术和胃切开管放置后胆道闭锁状态，经常发作上行性胆管炎，因严重的COVID-19需要住院治疗，并发呼吸衰竭和心脏复苏。在他被诊断出患有COVID-19一个月后，他出现了腹腔间隔室综合征，CRP为286mg/L，铁蛋白为51,223μg/L，NT-proBNP为16,462pg/mL，超声心动图上无心脏损伤的证据。他接受了IVIG、类固醇和阿那白滞素(Anakinra)治疗，炎症标志物短暂改善，但症状迅速复发。通过RT-PCR定量，在他的粪便中检测到1,020个SARS-CoV-2RNA拷贝，血浆刺突抗原水平为566pg/mL。开始服用拉瑞唑来后，他的CRP从峰值下降了85％，铁蛋白下降了87％。刺突抗原下降90％至59pg/mL。SARS-CoV-2核衣壳蛋白也下降了98％，从77pg/mL降至1.45pg/mL(检测限)(图4)。
他还经历了细胞因子水平和炎症介质的改善，包括IL-1β、IFNγ、IL-8、IL-2R、GM-CSF和IL-17(图5)。这些细胞因子和炎症介质最初在MIS-C的发展过程中激增，然后在IVIG后有所改善，但尽管使用类固醇，但仍趋于稳定或反弹。通过使用其抑制剂拉瑞唑来阻断连蛋白途径来去除刺突抗原触发器，使得这些介质急剧改善。重要的是，自入院以来，他已经实现了最长的无发烧时间，他的胃肠道症状得到改善，他能够恢复全食，并且他的通气状况也得到改善。图5概括了该MIS-C患者的临床病程。
示例5-连蛋白拮抗减少因MIS-C住院的儿童的住院时间(LOS)和症状持续时间
到目前为止，FDA已批准另外三名受MIS-C影响的儿童同情性使用拉瑞唑来，每6小时10微克/公斤。表3总结了这3名接受拉瑞唑来治疗的儿童与未接受治疗的22名MIS-C儿童(13名入住病房，9名入住重症监护室)相比，住院时间和自发病以来出现症状的天数如下：
表3
这些数据表明，与未经治疗的MIS-C儿童相比，拉瑞唑来缩短了接受治疗的儿童(一名入住ICU，两名入住病房)的住院时间和症状持续时间。
讨论
本文提供的数据首次证明了MIS-C儿童胃肠道长期暴露于SARS-CoV-2，同时发生连蛋白释放，表明粘膜屏障完整性丧失，以及SARS-CoV-2抗原血症，这可能是驱动因素定义MIS-C的高炎症反应(图6)。
此外，研究表明，抑制MIS-C患者的肠道通透性可以防止SARS-CoV-2抗原流入血液，解决MIS-C的潜在触发因素而不仅仅是炎症后果，从而带来临床益处。
此前未在MIS-C中报道过SARS-CoV-2抗原血症。尽管流行病学上与先前的SARS-CoV-2感染有关，但先前的研究无法将MIS-C归因于病毒血症。相比之下，77％患有严重COVID-19且因呼吸衰竭而需要入住重症监护病房(ICU)的成年人被发现患有血浆SARS-CoV-2抗原血症，被认为源自呼吸道(Ogata,A.F.et al.Ultra-sensitive SerialProfiling of SARS-CoV-2Antigens and Antibodies in Plasma to UnderstandDisease Progression in COVID-19Patients with Severe Disease.Clin Chem,(2020))。核衣壳和S1抗原是在重症COVID-19成人血液中检测到的最重要的SARS-CoV-2抗原。在MIS-C儿童中，刺突蛋白以及单独的S1蛋白是主要抗原。刺突蛋白的S1亚基(S1)包含超抗原样基序，可与T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合物(MHC)II相互作用，触发超抗原反应，导致MIS-C患者的TCR谱系出现偏差。T细胞受体β可变基因的扩增。此外，发现SARS-CoV-2超抗原样基序与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)超抗原基序具有显著的序列和结构相似性，后者与TCR和CD2837相互作用并介导中毒性休克综合征。SARS-CoV-2抗原血症的构成差异值得进一步研究，因为这可以深入了解MIS-C和严重的成人COVID-19之间的差异。
MIS-C中抗原血症的来源可能是肠道。MIS-C在初次感染消退后数天至数周内发生，通常当呼吸道分泌物中SARS-CoV-2病毒水平较低/检测不到时，这使得MIS-C触发因素不太可能来自上呼吸道来源。在患有COVID-19的成人中，可以在粪便和肠道活检中检测到SARS-CoV-2，并且抗SARS-CoV-2IgA水平在急性感染后4个多月内保持较高水平。这些发现表明，胃肠道可能是SARS-CoV-2的病灶，具有持续的免疫激活作用。此外，成人急性COVID-19严重程度的增加与胃肠道症状频率的增加有关。
在我们的MIS-C患者队列中，大多数MIS-C儿童的粪便样本含有SARS-CoV-2RNA，大多数MIS-C患者除了严重的胃肠道症状外，还表现出异常严重的胃肠道症状、腹痛、呕吐和腹泻。心肌功能障碍和心源性休克。为更好地了解胃肠道环境对SARS-CoV-2病毒和超抗原样病毒基序的影响，以及为什么儿童在急性感染几周后比成人更容易出现抗原血症，相关研究正在进行。
连蛋白水平升高表明肠上皮紧密连接被破坏，这可能会使SARS-CoV-2抗原渗漏到血流中。连蛋白是细胞间上皮紧密连接的调节剂；包括生态失调在内的各种刺激会激活MyD88依赖性连蛋白释放，使连蛋白与其目标蛋白酶激活受体(PAR)2结合并反式激活表皮生长因子受体(EGFR)。这会触发下游信号传导，导致紧密连接蛋白(包括闭带(ZO)1和肌球蛋白1c)磷酸化，最终导致紧密连接解体并增加对大分子的细胞旁通透性。这种机制已经在多种其他慢性炎症性疾病中得到描述。在川崎病血管炎小鼠模型中，肠道通透性增加与循环IgA水平升高及其在心血管病变中的沉积有关。
在川崎病小鼠模型中，使用连蛋白抑制剂AT1001(乙酸拉瑞唑来，目前正处于治疗乳糜泻的3期临床试验)阻断肠道通透性，可显著减少心血管病变的发展，表明连蛋白可能参与这一过程(Noval Rivas,M.et al.Intestinal Permeability and IgA ProvokeImmune Vasculitis Linked to Cardiovascular Inflammation.Immunity 51,508-521e506)。
在MIS-C发病机制中，连蛋白依赖性刺突蛋白从胃肠道运输到血流之间的机制联系得到了在患有MIS-C的幼儿中成功使用乙酸拉瑞唑来的支持，如本文所述。开始服用拉瑞唑来后，血液刺突蛋白水平降低了90％，减轻了炎症并改善了MIS-C相关症状。同样，在川崎病中，发病时表现出明显胃肠道症状的患者不太可能对单独的IVIG治疗产生反应，因此更有可能发生冠状动脉瘤。在这里，我们发现MIS-C中连蛋白水平升高表明在检测粪便中的SARS-CoV-2时通透性增加。这可能允许刺突蛋白从肠道进入血流，引发严重的细胞因子释放和高炎症反应。
对MIS-C患者刺突动力学曲线的分析表明，MIS-C症状出现后，抗原渗漏随着时间的推移而增加。单独的体液反应无法有效控制MIS-C中抗原水平的升高，而且实际上会导致炎症。我们发现，在MIS-C中，抗体，尤其是抗刺突IgM和IgA，对抗原的反应持续上升，表明适应性免疫无效，加上肠道通透性增加导致抗原持续释放。这一数据支持了以前关于多种非COVID-19病原体(包括常见的冠状病毒、流感和RSV11)以及许多自身抗原产生的抗体炎症扩张进而激活单核细胞并引起过度吞噬、巨噬细胞激活和细胞因子风暴的报道。值得注意的是，在本实验中使用的测定检测刺突蛋白S1-S2胞外亚基，但不能区分活病毒或死病毒。然而，病毒抗原可以驱动过度炎症反应，并且不需要活病毒来诱导免疫反应。
重要的是，在住院和接受MIS-C治疗后，抗原水平持续数天至数周，这表明当前的治疗方法(即类固醇和/或IVIG)针对炎症反应，但可能无法减轻SARS-CoV-2抗原渗漏到血液中或解决潜在的肠道通透性。这种长时间的抗原渗漏可能解释了一些儿童症状复发的原因，并证明了MIS-C患者长期逐渐减少免疫调节治疗的合理性。
此外，在MIS-C症状出现的最初几天内检测血源性抗原和连蛋白可以识别那些有发生MIS-C风险的人。相反，最近感染SARS-CoV-2的儿童中连蛋白水平升高可能表明个体患MIS-C的风险增加。
结论
据报道，令人信服的证据表明，在患有MIS-C的儿童的血液中检测到了高水平的连蛋白和SARS-CoV-2抗原的组合。这些数据表明，在MIS-C中，而非急性儿科COVID-19中，胃肠道中SARS-CoV-2的存在可能导致局部粘膜炎症、连蛋白释放增加，以及随后肠道通透性增加，从而使包括刺突蛋白的超抗原样基序在内的SARS-CoV-2抗原穿过粘膜屏障进入血流，从而加速沉淀MIS-C。这里的数据提供了使用新型生物标志物进行诊断、治疗和预防MIS-C的新概念，所有这些都是儿童中这种日益常见且危及生命的新疾病所迫切需要的。
方法
参与者，包括接受FDA批准的拉瑞唑来紧急授权治疗的患者，均被纳入机构审查委员会(IRB)批准的儿科COVID-19生物样本库(MGB#2020P000955)或马萨诸塞州综合医院的儿科生物样本库(MGB#2016P000949)获得医院知情同意并在适当时获得同意。从儿科COVID-19生物样本库中的儿童身上采集血液、鼻咽拭子、口咽拭子和粪便，并按照之前的描述进行处理(Lima,R.et al.Establishment of a pediatric COVID-19biorepository:unique considerations and opportunities for studying the impact of the COVID-19pandemic on children.BMC Med Res Methodol 20,228,(2020))。从病历中获得人口统计数据、既往病史和临床实验室结果。血清样本取自儿科生物样本库登记的儿童。所有程序均按照IRB指南进行。如果住院儿科患者符合CDC标准(https://www.cdc.gov/mis-c/hcp/)，则被定义为患有MIS-C：发烧、炎症的实验室证据、>2个器官受影响的证据，加上SARS-CoV-2感染证据(当前或近期鼻咽RT-PCR检测SARS-CoV-2呈阳性或SARS-CoV-2血清学呈阳性)或在过去4周内接触过确诊或疑似感染COVID-19的个体。鼻咽部SARS-CoV-2RT-PCR呈阳性且无MIS-C迹象的患者被定义为患有急性COVID-19。
抗原Simoa测定
SARS-CoV-2抗原Simoa检测按照之前的描述制备和进行(Ogata,A.F.etal.Ultra-sensitive Serial Profiling of SARS-CoV-2Antigens and Antibodies inPlasma to Understand Disease Progression in COVID-19Patients with SevereDisease.Clin Chem,(2020))。将血浆样本在Homebrew检测器/样本稀释剂(QuanterixCorp.)中与Halt蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher Scientific)和EDTA稀释8倍。检测抗体在Homebrew检测器/样本稀释剂中稀释至0.3μg/mL，链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(SβG)浓缩物(Quanterix)在SβG稀释剂(Quanterix)中稀释至150pM。抗体偶联捕获磁珠在磁珠稀释剂中稀释，每个反应总共500,000个磁珠(125,000个S1磁珠、125,000个S2磁珠和250,000个用于S1/S2多重测定的647nm染料编码辅助磁珠，以及125,000个核衣壳磁珠和375,000个647nm染料编码辅助珠，用于核衣壳测定)。所有试剂均在装入HD-X分析仪(Quanterix)的塑料瓶中稀释。根据制造商的说明和之前的描述，在HD-X分析仪上以自动三步测定形式进行测定(Rivnak,A.J.et al.A fully-automated,six-plex single molecule immunoassayfor measuring cytokines in blood.J Immunol Methods 424,20-27,(2015))。在每次测定中，捕获磁珠与样本孵育15分钟，检测抗体孵育5分钟，SβG孵育5分钟，中间有洗涤步骤。然后将磁珠重悬于25μL试卤灵-β-吡喃半乳糖苷中，并装入微孔阵列中进行成像。通过HD-X分析仪软件计算平均每个磁珠上携带的酶的个数(AEB)和样本浓度值。所有样本均重复测量。
蛋白质组学
血清连蛋白/触珠蛋白由西达赛奈医疗中心的蛋白质组学核心测量。使用TFE使血浆(10ul)变性并如概括的那样进行消化(Fu,Q.et al.A Plasma Sample Preparation forMass Spectrometry using an Automated Workstation.J Vis Exp,doi:10.3791/59842(2020))并通过数据-独立采集进行分析(Zhang,S.et al.A Dual Workflow to Improvethe Proteomic Coverage in Plasma using Data-Independent Acquisition-MS.JProteome Res 19,2828-2837,doi:10.1021/acs.jproteome.9b00607(2020))在EvosepOne系统(丹麦欧登塞)与Orbitrap Exploris 480质谱仪(德国不莱梅ThermoFisher)上使用21分钟梯度。
免疫球蛋白Simoa测定
如前所述，准备并进行了针对四种病毒抗原S1、刺突、核衣壳和RBD的SARs-CoV-2血清学Simoa测定(Norman,M.et al.Ultrasensitive high-resolution profiling ofearly seroconversion in patients with COVID-19.Nat Biomed Eng 4,1180-1187,doi:10.1038/s41551-020-00611-x(2020))。血浆样本在Homebrew检测器/样本稀释剂(Quanterix Corp.)中稀释4000倍。四个抗原结合的捕获磁珠混合并在磁珠稀释剂中稀释，每个反应总共500,000个磁珠(每种磁珠类型125,000个)。生物素化的抗小鼠免疫球蛋白抗体在Homebrew检测器/样本稀释剂中稀释至最终浓度：IgG(Bmethyl Laboratories A80-148B)：7.73ng/mL，IgM(Thermo Fisher MII0401)：216ng/mL，IgA(Abcam ab214003)：150ng/mL。链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(SβG)浓缩物(Quanterix)在SβG稀释液(Quanterix)中稀释至30pM。血清学测定在HD-X分析仪(Quanterix)上以自动三步测定法进行。通过HD-X分析仪软件计算平均每个磁珠上携带的酶的个数(AEB值)。使用每次HDX运行中包含的四个校准器将AEB值转换为归一化抗体滴度。
血清转化分类基于早期分类模型，该模型使用由RT-PCR SARS-Cov-2检测的142个阳性样本和200个大流行前阴性对照组成的独立小组进行训练。该模型的标记是使用交叉验证步骤选择的。该交叉验证产生了四种标记物(IgA S1、IgA核衣壳、IgG核衣壳以及IgG刺突)，并在训练集中表现出最佳性能。未知样本的阳性检测结果的阈值是根据训练集中产生100％特异性的截止值确定的(Norman,M.et al.Ultrasensitive high-resolutionprofiling of early seroconversion in patients with COVID-19.Nat Biomed Eng 4,1180-1187,doi:10.1038/s41551-020-00611-x(2020))。
细胞因子测定
使用CorPlex细胞因子面板(Quanterix Corp)测量血浆样本中的细胞因子，其中包括样本稀释缓冲液。将血浆样本在样本稀释缓冲液中稀释4倍，并按照CorPlex制造商方案进行测定。每个CorPlex细胞因子组试剂盒均通过SP-X成像和分析系统(QuanterixCorp.)进行分析。
中和试验
将SARS-CoV-2刺突蛋白假型化到GFP表达驱动慢病毒报告载体上，类似于之前发布的方案(Crawford,K.H.D.et al.Protocol and Reagents for PseudotypingLentiviral Particles with SARS-CoV-2Spike Protein for NeutralizationAssays.Viruses 12,doi:10.3390/v12050513(2020))。为了改善向细胞膜的运输以生成VLP，我们去除了细胞质尾部中的21个氨基酸，这些氨基酸被认为含有隐秘的ER保留信号(Ou,X.et al.Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2on virusentry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV.Nat Commun 11,1620,doi:10.1038/s41467-020-15562-9(2020))，但保持细胞外结构域完整。将血浆样本在58℃下热灭活一小时，并通过在细胞培养基(DMEM+10％FBS、1％P/S)中进行5倍系列稀释来创建稀释系列，从1:50稀释开始。然后将稀释液与CoV-2刺突假型VLP在37℃下孵育1小时，然后将修饰后的表达ACE2的HEK293T细胞接种到溶液中。将细胞孵育48小时，然后进行胰蛋白酶消化和固定(4％多聚甲醛，30分钟)，然后进行流式细胞术分析。在FACS表达hACE2之前，通过以高MOI整合单独的hEf1a-hACE2慢病毒载体来生成表达ACE2的HEK293T。分选后十几代hACE2表达稳定在95％。
通过测量随血浆稀释度的变化而在表达ACE2的HEK293T细胞中GFP产生的抑制来确定血浆样本的中和能力。通过流式细胞术测定GFP+细胞的相对定量，并将GFP表达细胞的数量归一化为血浆的最高稀释度。NT50计算为对应于0.5归一化信号的稀释度(即GFP表达的50％抑制)。
SARS-CoV-2病毒RNA检测
按照制造商的方案，使用TRIzol(Fisher Scientific，15596026)从100-200μL粪便中提取RNA。使用RNeasy PowerMicrobiome试剂盒(Qiagen，26000-50)从收集的水层中分离RNA，并用50μL无RNase的水洗脱。按照之前的报道对病毒RNA进行定量(Ter-Ovanesyan,D.et al.Ultrasensitive measurement of both SARS-CoV2 RNA and serology fromsaliva.medRxiv,2021.2001.2025.21249679,doi:10.1101/2021.01.25.21249679(2021))。简而言之，使用了Luna探针一步法RT-qPCR试剂盒(New England Biolabs)，以及CDC N1引物(CDC.CDC 2019-新型冠状病毒[2019-NCoV]实时RT-PCR诊断面板。https://www.fda.gov/media/134922/download(2020))(IDT)，靶向SARS-CoV-2的N基因：正向：GACCCCAAAATCAGCGAAAT(SEQ ID NO 2)，反向：TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG(SEQ ID NO 3)，探针：FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1(SEQ ID NO 4)。每次运行的SARS-CoV-2合成RNA分子(Twist Bioscience)都包含在同一RT-qPCR板上，由CFX96实时检测系统(Bio-Rad)读取。使用方程式RNA拷贝数＝1,000*2^(ΔCt)对每个样本中的病毒RNA含量进行定量，其中ΔCt是RNA对照和给定样本的循环阈值之间的差异。
数据分析
多重比较采用单因素方差分析(ANOVA)，Tukey多重比较，二分比较采用Mann-Whitney t检验。Fisher精确检验和卡方检验用于分析组间的分类差异。P<0.05被认为是显著的。所有数据拟合和统计测试均在Graphpad Prism9中进行。
所有数字均在Graphpad Prism 9和Adobe Illustrator 2015版中绘制。
示例6-连蛋白拮抗剂乙酸拉瑞唑来(AT1001)作为MIS-C的辅助治疗：病例系列
研究设计
在本研究中，四名MIS-C患者接受开放标签拉瑞唑来10mcg/kg(最大500mcg/剂量)口服治疗，每天四次，持续21天，作为MIS-C治疗(类固醇、IVIG、阿那白滞素，由多学科MIS-C临床团队决定)。本研究还包括另外22名未接受拉瑞唑来治疗的患者。因此，将接受拉瑞唑来治疗的患者与仅接受类固醇和/或IVIG治疗的MIS-C儿童进行比较，并通过Mann-WhitneyU检验或Fisher精确检验对结果进行分析。报告了临床结果、SARS-CoV-2抗原血症和细胞因子谱。
所有四名患者均获得了FDA的批准，IRB的批准、家长的同意以及适当时的同意也是如此。所有患者均符合CDC定义的MIS-C标准(https://www.cdc.gov/mis-c/hcp/)。所有MIS-C患者均向MGH儿科COVID-19生物存储库(IRB2020P000955)提供同意书，并在有指示时表示同意，以允许进行样本和元数据分析。从医疗记录中获得临床实验室(CRP、D-二聚体)、症状和体温。
按照文献中所述测量SARS-CoV-2抗体和细胞因子(onker LM,Gilboa T,OgataAF,et al.:Multisysteminflammatory syndrome in children is driven by zonulin-dependent loss of gut mucosal barrier.J Clin Invest 2021；131；Norman M,GilboaT,Ogata AF,et al.:Ultrasensitive high-resolution profiling of earlyseroconversion in patients with COVID-19.Nat Biomed Eng2020；4:1180-1187)。抗体水平以归一化的每珠平均酶数(AEB)表示，其中测量的AEB值通过从SARS-CoV-2阳性个体收集的血浆样本进行连续稀释所获得的校准器进行归一化。在筛选额外的捕获和检测抗体后，对测量SARS-CoV-2刺突和S1蛋白的测定方法进行了修改。虽然该测定以与上述工作相同的方式进行，但使用了不同的捕获和检测抗体，即作为捕获的针对刺突S2亚基的抗体(MA5-35946，Invitrogen)和抗RBD抗体作为检测器(LT1900，Leinco)。在进行测定之前，将血浆样本用10mM二硫苏糖醇(DTT)处理，并在37℃下孵育15分钟，以使与刺突抗原复合的任何抗体变性。血浆样本也无需经过DTT预处理即可进行分析。
使用Prism 9.2完成分析。Mann-Whitney U检验用于比较拉瑞唑来治疗组和历史对照组的非参数值。卡方检验用于比较两组之间的频率。
汇总结果
四名患有MIS-C的儿童，年龄范围为3-17岁(中位数7.5岁)，接受了同情性使用拉瑞唑来进行治疗。所有四名儿童均表现出先前感染SARS-CoV-2的血清学证据，并且就诊时具有可检测到的SARS-CoV-2抗原血症。虽然其中两名儿童表现出MIS-C心脏受累，但所有四名儿童就诊时均报告有明显的胃肠道症状，并有多器官受累的证据(表4)。
表4
将接受拉瑞唑来治疗的儿童的临床病程与诊断为MIS-C但未将拉瑞唑来治疗作为其临床治疗方案一部分的儿童进行比较(表5)。
表5
包括22名MIS-C儿童接受类固醇或单独IVIG治疗，中位年龄为8岁，与拉瑞唑来组儿童的年龄没有显著差异。
开始拉瑞唑来治疗后，胃肠道症状的持续时间显著缩短(观察到胃肠道症状消退的时间：拉瑞唑来治疗组中位时间为2.5天；拉瑞唑来未使用组中位时间为5.5天；P＝0.03)。虽然住院时间、发烧持续时间或护理升级方面没有显著差异，但拉瑞唑来治疗组的住院时间似乎稍短(拉瑞唑来治疗组的中位时间为4天，而未接受拉瑞唑来治疗的组为5天)。重要的是，拉瑞唑来治疗组中的刺突抗原水平清除得更快(首次清除刺突抗原的时间：拉瑞唑来治疗组中位数为1天；拉瑞唑来初治组中位数为5.5天；P＝0.03)。
个案结果
接受拉瑞唑来治疗的患者1：一名17岁女性，就诊前一个月患有轻度COVID-19，在报告五天发烧高达39.4℃、头痛、腹痛和腹泻后住院。她被发现C反应蛋白(CRP；峰值165mg/L)、红细胞沉降率(ESR；峰值57mm/h)、D-二聚体(峰值2446ng/mL)升高和淋巴细胞减少。
开始静脉注射类固醇治疗；由于她没有表现出心脏受累，因此决定不接受静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗。鉴于她被诊断为患有胃肠道受累的MIS-C，我们寻求并获得批准，同情性使用拉瑞唑来治疗她，她能够在开始使用类固醇后24小时内开始治疗。
开始使用类固醇后，她的发烧降至38.2℃，细胞因子标记物下降，但她仍然有一些腹痛和排便增加，值得注意的是，她的CRP仍然升高。然而，添加拉瑞唑来后，她的发烧、腹痛和腹泻在24小时内消失。她的CRP、ESR和D-二聚体有所改善，淋巴细胞减少症得到缓解，并出院回家(图10)。
在开始拉瑞唑来之前，在她的血液中检测到了刺突抗原，并在开始拉瑞唑来后24小时内达到了不可检测的水平(图11)。有趣的是，在开始类固醇治疗后，她的抗刺突IgG和IgA水平略有下降，与刺突抗原的增加相对应，然后恢复到较高水平。入院后第四天，她的刺突抗原降至检测水平以下，并且在21天的疗程中基本检测不到(图11)。
接受拉瑞唑来治疗的患者2：一名3岁女性，两周前近期家庭暴露于SARS-CoV-2，出现40℃高烧、严重腹痛、呕吐和腹泻。她的CRP升高(168.6mg/L)，D-二聚体升高(>10,000ng/mL)，淋巴细胞减少(WBC2,400/μL)。她开始服用类固醇，并在SARS-CoV-2RT-PCR检测结果呈阳性后，她还开始服用瑞德西韦。由于没有心脏受累，未给予IVIG。考虑到她腹痛的严重程度，咨询了外科医学以评估是否患有阑尾炎，但最终排除了这一诊断。开始使用类固醇后，她继续发烧，CRP仍然升高，细胞因子未能恢复正常。
鉴于她患有胃肠道受累的MIS-C症状，我们寻求并获得批准对她同情性使用拉瑞唑来进行治疗。拉瑞唑来在开始使用类固醇后48小时内开始使用。开始拉瑞唑来后24小时内，她的CRP显著下降，细胞因子谱改善，腹痛消失；因此，她能够再次开始进食和饮水，并于第二天出院(图10)。
她的S1抗原在开始拉瑞唑来治疗时高度升高，然后在拉瑞唑来治疗24小时内被急剧清除。她的刺突抗原在开始拉瑞唑来时升高，然后在入院第4天出现峰值，然后在第11天清除(图11)。虽然她在服用类固醇期间入院第2天的抗SARS-CoV-2IgG和IgA较低，但随着时间的推移，她的抗刺突IgG水平有所增加，这与她最近的暴露和感染相对应。入院第4天，刺突抗原达到峰值后，抗体水平急剧增加。(图11)。
接受拉瑞唑来治疗的患者3：一名6岁女孩，既往没有已知的COVID-19疾病，也没有家庭SARS-CoV-2接触史，出现四天发烧高达39.4℃、腹痛和呕吐。除了CRP(峰值254mg/L)、铁蛋白(峰值507ug/L)和d-二聚体(峰值4952ng/mL)升高外，还发现SARS-CoV-2抗体呈阳性。她的NT-proBNP升高(峰值2815pg/mL)，轻度肌钙蛋白渗漏(峰值26ng/L)，超声心动图显示右冠状动脉动脉瘤样扩张(z评分3.8)。开始使用静脉注射类固醇和IVIG进行治疗。在接下来的24小时内，她的发烧从39.4℃降至37.9℃，CRP下降，但仍保持在178mg/L的升高水平(图10)。然后她开始服用拉瑞唑来；第二天，她的腹痛消失了，而且仍然不发烧，所以她出院回家了。入院后第5天(拉瑞唑来治疗疗程48小时)，她的CRP进一步下降至40mg/L。入院后第18天，她的CRP和D-二聚体恢复正常，冠状动脉瘤也消失了。
在她的血液中检测到了刺突和S1抗原，并且她表现出激活的细胞因子谱，其中IL-6升高最为明显。尽管在开始拉瑞唑来后24小时内，她的刺突抗原显著下降，但直到入院后第18天，她的刺突抗原仍然高于可检测水平(图11)。在她患病期间，她的抗SARS-CoV-2IgG仍然相对较低，但她的抗刺突IgA变得高度升高(图11)，这可能反映了粘膜表面持续的抗原暴露。
接受拉瑞唑来治疗的患者4：一名9岁男孩，六周前患有轻度COVID-19，三天内发烧高达40℃，并伴有腹泻、恶心和呕吐、头痛和疲劳。他出现了皮疹、结膜炎和眶周水肿。他表现出炎症标记物升高(峰值CRP91.2mg/L)，超声心动图显示左主冠状动脉轻度扩张(z得分为2.3)。他开始服用IVIG和类固醇，但他的炎症标志物和胃肠道症状持续存在。他开始同情性使用拉瑞唑来。尽管开始服用拉瑞唑来后，他的CRP开始改善，但第二天，他仍然发烧38.6℃，因此开始服用阿那白滞素。在开始拉瑞唑来后48小时内，他的CRP和D-二聚体得到改善，退热，胃肠道症状也得到改善(图10)。
他的刺突抗原在入院时已升高，但到入院第4天时已检测不到(图11)。入院后第9天，在抗SARS-CoV-2IgG和IgA升高的情况下再次检测到刺突抗原(图11)，但炎症标志物、发烧或细胞因子没有相应升高。有趣的是，在完成拉瑞唑来疗程后，他的刺突抗原仍高于检测水平，抗RBDIgA不断上升，表明在MIS-C治疗三周后，胃肠道粘膜表面持续存在SARS-CoV-2抗原。
讨论
在上述研究中，与单独使用类固醇和/或IVIG治疗的儿童相比，四名MIS-C儿童在添加拉瑞唑来治疗时表现出改善的结果。开放标签拉瑞唑来治疗组中的四名儿童表现出胃肠道症状的更快缓解和刺突抗原的清除时间更快，这表明胃肠道粘膜屏障功能得到改善。此外，还有缩短停留时间的趋势。虽然需要进行双盲、随机安慰剂对照研究来确定拉瑞唑来的疗效，但这些研究结果表明拉瑞唑来可能为MIS-C的治疗提供安全且有益的辅助疗法。
有趣的是，当添加类固醇或IVIG时，四名患者中的三名出现了刺突抗原的增加。尽管类固醇和IVIG可以抑制不受控制的炎症反应，但最初的免疫抑制可能会造成抗原水平和免疫反应的不平衡。例如，患者1、3和4在类固醇治疗(使用或不使用IVIG)后均表现出抗体水平下降，从而使抗原水平随后上升。
随着抗体恢复，抗原水平随之下降。我们没有获得患者2的前类固醇抗体水平，可以确定低抗刺突IgG是否是由于感染时间或免疫抑制所致。这与我们之前关于MIS-C中SARS-CoV-2抗原水平的报告一致：在11名患者队列中，三分之二具有可用预处理值的MIS-C历史对照显示，在开始MIS-C的免疫调节治疗后刺突抗原水平增加。这些发现强调，单独的免疫抑制可能不是MIS-C的最佳治疗策略，而针对抗原渗漏源的新疗法(例如拉瑞唑来)将为治疗MIS-C提供额外的益处。
此外，尽管发烧和细胞因子风暴已经消退，但MIS-C发病后数周至数月仍可检测到抗原水平。最后，本研究报告的所有儿童都表现出刺突抗原血症。
说明书的序列表部分
SEQ ID NO 1-拉瑞唑来的氨基酸序列
GGVLVQPG
SEQ ID NO 2-CDC N1正向引物
GACCCCAAAATCAGCGAAAT
SEQ ID NO 3-CDC N1反向引物
TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
SEQ ID NO 4-探针
ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC
SEQ ID NO 5-连蛋白NP_005134.1的氨基酸序列
MSALGAVIALLLWGQLFAVDSGNDVTDIADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTEGDGVYTLND
KKQWINKAVGDKLPECEADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTEGDGVYTLNNEKQWINKAVGD
KLPECEAVCGKPKNPANPVQRILGGHLDAKGSFPWQAKMVSHHNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSE
NATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHPNYSQVDIGLIKLKQKVSVNERVMPICLPSKDYAEVGRVGY
VSGWGRNANFKFTDHLKYVMLPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDT
CYGDAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAEN
序列表
<110> 伊布里斯有限责任公司
<120> 用于治疗儿童（MIS-C）和成人（MIS-A）多系统炎症综合征的连蛋白拮抗剂
<130> BW1157R
<160> 5
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Seq ID No 1 - 拉瑞唑来的氨基酸序列
<400> 1
Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID No 2 - CDC N1正向引物
<400> 2
gaccccaaaa tcagcgaaat 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID No 3 - CDC N1反向引物
<400> 3
tctggttact gccagttgaa tctg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID No 4 - 探针
<400> 4
accccgcatt acgtttggtg gacc 24
<210> 5
<211> 406
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Seq ID No 5 - 连蛋白 NP_005134.1的氨基酸序列
<400> 5
Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu
1 5 10 15
Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly
20 25 30
Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val
35 40 45
Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly
50 55 60
Val Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly
65 70 75 80
Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro
85 90 95
Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys
100 105 110
Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn
115 120 125
Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu
130 135 140
Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln
145 150 155 160
Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln
165 170 175
Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile
180 185 190
Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His
195 200 205
Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu Tyr
210 215 220
Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro
225 230 235 240
Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val
245 250 255
Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr
260 265 270
Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala
275 280 285
Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala
290 295 300
Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu
305 310 315 320
Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu
325 330 335
His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr
340 345 350
Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr
355 360 365
Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala
370 375 380
Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln
385 390 395 400
Lys Thr Ile Ala Glu Asn
405
Claims (45)
1.连蛋白拮抗剂，用于预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征。
2.根据权利要求1所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，所述拮抗剂选自拉瑞唑来、其盐、衍生物和/或类似物。
3.根据权利要求1或2所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，所述拮抗剂是乙酸拉瑞唑来。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，所述儿童和/或成人患有粘膜屏障通透性过高和/或病毒抗原血症。
5.根据权利要求4所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，所述病毒抗原血症是SARS-CoV-2抗原血症。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，所述MIS-C和/或MIS-A由病毒感染引起和/或与其相关。
7.根据权利要求6所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，所述病毒感染是SARS-CoV-2感染。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，所述儿童和/或成人表现出一种或多种以下症状：腹痛、呕吐、腹泻、心肌功能障碍和/或心脏休克。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，与健康对照相比，所述儿童和/或成人表现出连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种以下细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的血液水平增加。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的该用途的连蛋白拮抗剂，其中，所述连蛋白拮抗剂以每4-6小时0.1-10μg/kg的剂量方案施用，优选以每6小时10μg/kg的剂量方案施用。
11.一种药物组合物，其包含连蛋白拮抗剂和至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体，用于预防和/或治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征。
12.根据权利要求11所述的该用途的药物组合物，其中，所述连蛋白拮抗剂选自拉瑞唑来、其盐、衍生物和/或类似物。
13.根据权利要求11或12所述的该用途的药物组合物，其中，所述拮抗剂是乙酸拉瑞唑来。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的该用途的药物组合物，其中，所述儿童和/或成人患有粘膜屏障通透性过高和/或病毒抗原血症。
15.根据权利要求14所述的该用途的药物组合物，其中，所述病毒抗原血症是SARS-CoV-2抗原血症。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的该用途的药物组合物，其中，所述MIS由病毒感染引起和/或与其相关。
17.根据权利要求16所述的该用途的药物组合物，其中，所述病毒感染是SARS-CoV-2感染。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的该用途的药物组合物，其中，所述儿童和/或成人表现出一种或多种以下症状：腹痛、呕吐、腹泻、心肌功能障碍和/或心脏休克。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的该用途的药物组合物，其中，与健康对照相比，所述儿童和/或成人表现出连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种以下细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的血液水平增加。
20.根据权利要求11至19中任一项所述的该用途的药物组合物，其中，所述连蛋白拮抗剂以每单位剂量0.1至10μg/kg的量存在，优选以等于每单位剂量10μg/kg的量存在。
21.根据权利要求11至20中任一项所述的该用途的药物组合物，其形式为溶液、悬浮液、粉末、胶囊、片剂、锭剂、颗粒剂。
22.根据权利要求11至21中任一项所述的该用途的药物组合物，其中，所述组合物被全身性施用和/或口服施用。
23.根据权利要求11至22中任一项所述的该用途的药物组合物，其中，所述组合物每4-8小时、优选每6小时施用一次。
24.根据权利要求1至10中任一项所述的连蛋白拮抗剂或根据权利要求11至23中任一项所述的药物组合物，用于治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征的方法。
25.根据权利要求24所述的该用途的连蛋白拮抗剂或药物组合物，其中，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的所述连蛋白拮抗剂或所述药物组合物。
26.根据权利要求25所述的该用途的连蛋白拮抗剂或药物组合物，其中，所述连蛋白拮抗剂以10μg/kg的剂量方案施用。
27.根据权利要求25或26所述的该用途的连蛋白拮抗剂或药物组合物，其中，所述施用每6小时进行一次。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的该用途的连蛋白拮抗剂或药物组合物，其中，所述施用通过全身性施用和/或口服施用的方式进行。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的该用途的连蛋白拮抗剂或药物组合物，其中，所述方法包括另外的步骤，其中，从所述患者获得的全血和/或血液成分样本已经通过定性和/或定量分析来测定连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5相比参考值所增加的水平。
30.根据权利要求29所述的该用途的连蛋白拮抗剂或药物组合物，其中，相比来自一名或多名健康患者的对照样本的参考值以及相比所述连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5中的每一者的预定截止值，来评估所述增加的水平。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的该用途的连蛋白拮抗剂或药物组合物，其在所述施用之后还包括以下步骤：
ii.通过定性和/或定量分析测定从所述患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白和/或病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5中的水平；
iii.根据步骤ii中所测定的所述连蛋白的水平和/或所述病毒抗原的水平和/或所述一种或多种所述细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平来调整所述连蛋白拮抗剂的剂量方案。
32.一种用于诊断和/或预后和/或鉴定处于发生儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征风险的那些患者的体外方法，包括：(a)通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白的水平。
33.根据权利要求32所述的体外方法，其中，所述步骤(a)还包括通过定性和/或定量分析测定从所述患者获得的所述全血和/或血液成分样本中的病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平。
34.根据权利要求32或33所述的体外方法，还包括以下步骤：
(b)将(a)中确定的水平与至少一个参考值进行比较；以及
(c)当(a)中确定的所述水平相对于所述至少一个参考值较高时，诊断MIS。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的体外方法，其中，所述至少一个参考值从来自一名或多名健康患者的对照样本中获取。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的体外方法，其中，所述水平通过执行选自免疫学测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定、RNA表达水平测定或其组合的体外测试来测定。
37.一种用于监测儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征进展的体外方法，包括：
(a)在第一时间点，通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白的水平；
(b)在一个或多个随后的时间点重复步骤(a)；以及
(c)比较步骤(a)和(b)中检测到的水平，从而监测MIS的进展。
38.根据权利要求37所述的体外方法，其中，所述步骤(a)还包括通过定性和/或定量分析测定从所述患者获得的所述全血和/或血液成分样本中的病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平。
39.根据权利要求37或38所述的体外方法，其中，所述水平通过执行选自免疫学测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定、RNA表达水平测定或其组合的体外测试来测定。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的体外方法，其中，步骤(b)中测定的所述水平相对于步骤(a)中测定的所述水平的显著降低是MIS改善的指示。
41.一种用于评估用于治疗儿童(MIS-C)和/或成人(MIS-A)多系统炎症综合征(MIS-A)的治疗剂的疗效的体外方法，包括：(a)在第一时间点，通过定性和/或定量分析测定从患者获得的全血和/或血液成分样本中的连蛋白的水平；(b)在用所述治疗剂治疗所述患者后的一个或多个随后的时间点重复步骤(a)；以及(c)比较步骤(a)和(b)中检测到的水平，从而评估所述治疗剂的疗效。
42.根据权利要求41所述的体外方法，其中，所述治疗剂是根据权利要求1至10中任一项所述的连蛋白拮抗剂或根据权利要求11至23中任一项所述的药物组合物。
43.根据权利要求42所述的体外方法，其中，所述步骤(a)还包括通过定性和/或定量分析测定从所述患者获得的所述全血和/或血液成分样本中的病毒抗原和/或一种或多种细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、IL-22、IFNγ、IL12p70、IL-8和IL-5的水平。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的体外方法，其中，所述水平通过执行选自免疫学测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定、RNA表达水平测定或其组合的体外测试来测定。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的体外方法，其中，步骤(b)中测定的所述水平相对于步骤(a)中测定的所述水平的显著降低是所述治疗剂的疗效的指示。
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|---|---|---|---|
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