DE60131962T2

DE60131962T2 - Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von taenia solium larven mittels eines klonierten antigens

Info

Publication number: DE60131962T2
Application number: DE60131962T
Authority: DE
Inventors: Victor C. Decatur TSANG; Ryan M. San Antonio GREENE; Patricia P. Gainesville WILKINS; Kathy Atlanta HANCOCK
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Centers of Disease Control and Prevention CDC
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Centers of Disease Control and Prevention CDC
Priority date: 2000-04-04
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2021-03-31
Also published as: US7094576B2; US20070122853A1; EP1282822A2; US20040033540A1; PT1282822E; DE60131962D1; US7595059B2; WO2001075448A2; AU2001249694C1; AU4969401A; DK1282822T3; WO2001075448A3; EP1282822B1; AU2001249694B2; ATE381713T1; BR0109871A

Description

Diese Erfindung wurde durch die Centers for Disease Control and Prevention, eine Agentur der United States Government, gemacht. Daher hat die United States Government bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Gebiet
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf die Gebiete der Molekularbiologie und der Immunologie und bezieht sich spezifischer auf Zusammensetzungen und Verfahren für die Diagnose von Zystizerkose. Insbesondere betrifft die Offenbarung synthetische oder rekombinante T. solium Antigene und deren Verwendung in Immunoassays für die Diagnose von Zystizerkose.
Hintergrund
Taenia solium Zystizerkose, verursacht durch die Infektion mit T. solium Larven-Zysten, tritt sowohl in Menschen als auch in Schweinen auf, was zu maßgeblichen öffentlichen Gesundheits- und ökonomischen Beschwernissen führt. T. solium, auch bezeichnet als der Schweine-Bandwurm, ist ein Darmwurm, der sowohl als eine reife Bandwurm-Form als auch eine Larvenform existiert. Der Lebenszyklus von T. solium beginnt, wenn Schweine, die Zwischenwirte, Bandwurmeier zu sich nehmen, die in den Fäkalien eines Bandwurmüberträgers ausgeschieden wurden. Die Larven schlüpfen aus den Eiern und dringen in die meisten Gewebe der Schweine ein, was die Krankheit Zystizerkose auslöst.
Wenn Menschen rohes oder nicht gares Fleisch von zystizerkotischen Schweinen aufnehmen, entwickeln sich Bandwürmer oder Taeniasis. Patienten mit Taenisasis können Unwohlsein in der Bauchgegend, Brechreiz, Reizbarkeit, Diarrhö und Gewichtsverlust zeigen. Zusätzlich können Proglottiden oder individuelle Segmente des Bandwurmes, die eigenständige zwittrige reproduktive Einheiten sind, den Blinddarm, Gallengang oder Pankreasgang blockieren.
Menschen können auch T. solium Eier aufnehmen, die in kontaminiertem Essen und Wasser vorkommen, und können mit der Larvenform infiziert werden. Nachdem T. solium Eier aufgenommen wurden, können sich Zystizerken in den subkutanen Geweben, in den Muskeln, im Herz, in den Lungen, in der Leber, im Gehirn und den Augen entwickeln. Obwohl eine geringe Anzahl von lebensfähigen Zystizerken daran scheitern kann, Symptome im infizierten Wirt zu produzieren, stimuliert der Tod der Larven eine merkliche entzündliche Reaktion, Fieber, Muskelschmerzen und Eosinophilie. Wenn die Larven in das zentrale Nervensystem eindringen, kann eine einzelne Zyste die Krankheit verursachen. Der Wirt kann Meningoencephelitis, epileptische Anfälle, Demenz und andere neurologische oder psychatrische Erscheinungsformen entwickeln und Tod kann aus akuter intrakranialer Hypertension resultieren. Die verschiedenen Erscheinungsformen der neurologischen Dysfunktion, die durch T. solium Infektion verursacht werden, werden gesamt als Neurozystizerkose bezeichnet. Obwohl Neurozystizerkose viele neurologische Symptome einschließen kann, ist Epilepsie das häufigste Symptom. Tatsächlich wird T. solium als die führende infektiöse Ursache für epileptische Anfälle weltweit betrachtet. Zusätzlich fordert T. solium Neurozystizerkose derzeit einen weltweiten Tribut von 50 Millionen Fällen mit 50.000 Toten pro Jahr.
Neurozystizerkose wird in den Vereinigten Staaten selten erworben, jedoch ist diese Erkrankung häufig in Lateinamerika, Asien, Russland und Osteuropa. In Mexiko betrug die durchschnittliche Rate für zystizerkotische Schweine in inspizierten Schlachthäusern zwischen 1980 bis 1981 1,55% und in ländlichen Gebieten von Mexiko und Südamerika, wo Abwasserentsorgung limitiert ist, kann der Anteil an zystizerkotischen Schweinen über 50% betragen. In diesen und anderen Entwicklungsländern verursacht der Parasit eine substantielle ökonomische Belastung für die Schweineindustrie. Aufgrund der erhöhten Reisetätigkeit und Immigration aus hoch endemischen Gebieten, ist außerdem die Detektion und Behandlung von mit T. solium zusammenhängenden Erkrankungen zu einer Priorität im US-amerikanischen Gesundheitswesen geworden.
Die Diagnose beruhte historisch auf der histologischen Identifizierung des Parasiten durch Biopsie oder Autopsie. Die kürzliche Entwicklung von radiologischen und serologischen Methoden hat die Diagnose verbessert. Während radiologische Methoden, wie z. B. die Computertomographie (CT) oder die bildgebende Kernspintomographie, nützlich bei der Diagnose von Neurozystizerkose sind, sind sie jedoch oft zu teuer oder in den Entwicklungsländern nicht zugänglich.
Obwohl einige diagnostische Tests derzeit erhältlich sind, um T. solium Infektion zu identifizieren und um Neurozystizerkose zu diagnostizieren, fehlen diesen Tests Spezifität und Sensitivität. Ein spezifischerer und sensitiverer Assay für die Diagnose von humaner Neurozystizerkose durch die Detektion der Anwesenheit von T. solium Larven unter der Verwendung von Immunoelektrotransfer-Blot (EITB) wird in US-Patent Nr. 5,354,660 von Tsang et al. beschrieben. Dieser Test ist der einzige Test, der von der Pan American Health Organization genehmigt wurde. Der Assay verwendet jedoch gereinigte, natürlich vorkommende T. solium Larven-Glykoproteine, was die Assay-Reagenzien teuer und schwierig in der Herstellung macht.
CHUNG JOON-YONG ET AL: "A recombinant 10-kDa Protein of Taenia solium metacestodes specific to active neurocysticerosis." JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, vol. 180, Nr. 4, Oktober 1999, Seiten 1307–1315, offenbaren die Verwendung eines rekombinanten 10 kDa Antigens von Taenia solium für diagnostische Zwecke.
LIGHTOWLERS MARCHALL W: „Eradication of Taenia solium cysticercosis: A role for vaccination of pigs." INTERNATIONAL JOURNAL FOR PARASITOLOGY, vol. 29, Nr. 6, Juni 1999, Seiten 811–817, erwähnt die Verwendung eines rekombinanten Antigens von Taenia solium für Impfzwecke.
In Entwicklungsländern, wo mit T. solium zusammenhängende Erkrankungen endemisch sind, kann der Zugriff auf diagnostische Assays aufgrund der hohen Kosten der Verwendung von Antigenen, die unter der Verwendung komplizierter Reinigungsprozeduren hergestellt werden, limitiert sein. Weil Zystizerkose am weitesten in ländlichen Gegenden von Entwicklungsländern verbreitet ist, wird weiterhin ein Feldtest für epidemiologische Studien und Überwachung benötigt. Ein Feldassay unter der Verwendung preiswerter und zuverlässiger Reagenzien könnte ein wichtiges Werkzeug bei der Durchbrechung des Transmissionszyklus des Parasiten sein, welcher die Diagnose von infizierten Schweinen vor Ort und die unmittelbare Behandlung mit Anti-Darmwurm-Mitteln, wie z. B. Oxfendazol, erlaubt. Eine Felddiagnose von Zystizerkose würde auch von ökonomischen Vorteil für Schweinefarmer sein, weil nicht infizierte Schweine einen höheren Preis erzielen.
Zusammenfassung der Offenbarung
Diese Offenbarung stellt einfache, sensitive Methoden für die Diagnose von Zystizerkose und/oder Neurozystizerkose und Zusammensetzungen für die Verwendung in solchen Methoden zur Verfügung. Die Erfindung stellt solche Methoden und Zusammensetzungen zur Verfügung, wie sie in den Ansprüchen dargelegt sind.
Ausführungsformen schließen eine Methode für die Detektion von T. solium Zystizerkose ein, insbesondere die Diagnose oder Überwachung von T. solium Infektion in Menschen und Tieren, welche kostengünstig, sensitiv und akkurat ist, geringe oder keine Kreuzreaktivität aufweist.
Es werden auch stabile Reagenzien für die Detektion von T. solium in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei die Reagenzien relativ kostengünstig hergestellt werden können.
Andere Ausführungsformen schließen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für immunogene T. solium Larven-Glykoproteine ein. Moleküle, die diese Sequenzen aufweisen, können für die Produktion großer Quantitäten an hoch reinem Polypeptid verwendet werden.
Eine noch weitere Ausführungsform stellt schnelle, einfache und kostengünstige Assays für die Detektion von T. solium Larven zur Verfügung. In spezifischen Beispielen hat der Assay eine lange Lagerzeit, eine kurze Assayzeit und/oder stabile Reagenzien, die auf dem Feld verwendet werden können. In spezifischen Beispielen können Ergebnisse, die mit dem hierin zur Verfügung gestellten Assays produziert werden, ohne die Verwendung von Meßtechnik oder speziellen Temperaturbedingungen interpretiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen werden Methoden für die Detektion der Anwesenheit von Antikörpern in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei die Antikörper mit mindestens einem T. solium Larven-Antigen reaktiv sind, wobei das Antigen rekombinant oder synthetisch produziert wurde. Solche Antikörper können auch an natürlich vorkommende T. solium Larven-Antigene binden, z. B. natürlich vorkommende Antigene, die durch Linsen-Lectin-Affinitätchromatographie isoliert wurden.
Weitere Ausführungsformen schließen Zusammensetzungen ein, die rekombinante oder synthetische T. solium Larven-Peptide oder -Polypeptide enthalten, welche für Immunoassays für die Detektion von T. solium Larven in biologischen Proben nützlich sind. Solche Polypeptide können rekombinant oder synthetisch unter der Verwendung der zur Verfügung gestellten Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen produziert werden.
Beispiele für zur Verfügung gestellte rekombinante oder synthetische Peptide oder Polypeptide (oder Fragmente davon) korrespondieren mit natürlich vorkommenden T. solium Glykoproteinen, wie z. B. gp50, wobei gp anzeigt, dass das Antigen ein Glykoprotein ist, und die Nummer das ungefähre Molekulargewicht in Kilodaltons (kDa), wie durch SDS-PAGE-Analyse bestimmt, anzeigt. Bestimmte zur Verfügung gestellte Polypeptide korrespondieren mit Glykoproteinen, die ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa aufweisen, wie mittels SDS-PAGE-Analyse bestimmt; diese rekombinanten oder synthetischen Polypeptide werden daher hierin als gp50-Polypeptide bezeichnet. Antigenische, immunogene oder immundominante Fragmente dieser gp50-Polypeptide werden hierin auch beschrieben.
In spezifischen Beispielen werden die rekombinantent Larven-Polypeptide und -Peptide durch Nukleisäuresequenzen der SEQ ID NOs: 1, 3 oder 5 kodiert und haben die korrespondierenden Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs: 2, 4 bzw. 6. Rekombinante oder synthetische Polypeptide, die die vorangehenden Nuldeinsäure- oder Aminsäuresequenzen aufweisen, oder antigenische Fragmente davon sind nützlich in Immunoassays für die Detektion von T. solium und werden hierin als gp50a, gp50b bzw. gp50c bezeichnet.
Aminsäuresequenzen, die hierin bereitgestellt werden, sind für die Synthese der Antigene oder Antigenfragmente unter der Verwendung bekannter chemischer Synthesetechniken nützlich.
Nukleinsäuremoleküle, die die T. solium Larven-Antigene kodieren, sind nützlich für die rekombinante Produktion der Antigene und Antigenfragmente und sind auch nützlich als molekulare Sonden oder Primer für die Detektion von Ribonukleinsäure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA), die bei der Transkription und Translation von T. solium Peptiden involviert ist. Solche molekularen Sonden oder Primer stellen hoch spezifische und sensitive Mittel zur Verfügung, um T. solium Larven-Polypeptide in Geweben und Zellen zu detektieren und zu messen.
Rekombinante oder synthetische T. solium Polypeptide können in diagnostischen Kits verwendet werden, um die Anwesenheit und Quantität von T. solium Antikörpern zu detektieren, welche diagnostisch oder prognostisch für das Auftreten, Wiederauftreten oder die Behandlung von Erkrankungen, wie z. B. Zystizerkose und Neurozystizerkose, sind. Die rekombinanten oder synthetischen T. solium Polypeptide können auch an einen Menschen oder ein Tier in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, um den Menschen oder das Tier gegen T. solium Infektion zu immunisieren, wodurch T. solium Infektion und/oder mit T. solium zusammenhängende Erkrankung reduziert oder verhindert wird.
Die hierin bereitgestellten Methoden schließen Immunoassays ein, die auf die Detektion von T. solium Antikörpern in biologischen Proben, wie z. B. biologischen Flüssigkeiten und Geweben von Menschen und Tieren, gerichtet sind. Andere bereitgestellte Methoden sind Nukleinsäurehybridisierung- und Amplifikations-Assays, die auf die Detektion von T. solium Antigenen in biologischen Proben gerichtet sind.
In einer Ausführungsform verwendet ein Immunoassay eines oder mehrere der rekombinanten oder synthetischen Larven-Polypeptide oder antigenische Fragmente davon, wie hierin beschrieben, mit einem oder mehreren anderen Larven-Polypeptiden von T. solium für die Detektion von anti-Larven-Antiköpern in einer biologischen Probe. Ein Beispiel für solch einen Immunoassay ist ein schneller immunochromatographischer diagnostischer Test (wie z. B. ein Card-Test), enthaltend rekombinante Larven-Antigene oder antigenische Fragmente davon, die mit anti-T. solium-Antikörpern in einer biologischen Probe immunoreaktiv sind. In anderen Beispielen sind die Methoden Immunoblot und ELISA-Tests.
Es werden diagnostische und analytische Methoden und Kits für die Detektion und die Messung von T. solium Antikörpern in einer Vielzahl von Proben zur Verfügung gestellt. Solche Kits können jede Konfiguration haben, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach der Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen und der angehängten Ansprüche offensichtlich werden.
Sequenzprotokoll
Die Nuklein- und Aminosäuresequenzen, die im beigefügten Sequenzprotokoll aufgelistet sind, werden unter der Verwendung von Standard-Buchstaben-Abkürzungen für Nukleotidbasen und dem Drei-Buchstabencode für Aminosäuren gezeigt. Es wird nur ein Strang jeder Nukleinsäuresequenz gezeigt, aber es wird davon ausgegangen, dass der komplementäre Strang durch jede Referenz des aufgeführten Stranges mit eingeschlossen ist.
SEQ ID NO: 1 zeigt die Nukleinsäure- und die kodierte Aminosäuresequenz von T. solium Larven-antigenischem Polypeptid gp50a.
SEQ ID NO: 2 zeigt die Aminosäuresequenz des T. solium Larven-antigenischem Peptids gp50a.
SEQ ID NO: 3 zeigt die Nukleinsäure- und die kodierte Aminosäuresequenz von T. solium Larven-antigenischem Polypeptid gp50b.
SEQ ID NO: 4 zeigt die Aminsäuresequenz des T. solium Larven-antigenischen Peptids gp50b.
SEQ ID NO: 5 zeigt die Nukleinsäure- und die kodierte Aminosäuresequenz von T. solium Larven-antigenischem Polypeptid gp50c.
SEQ ID NO: 6 zeit die Aminosäuresequenz des T. solium Larven-antigenischen Peptids gp50c.
Detaillierte Beschreibung
Kompositionen und Methoden für die Detektion von T. solium Infektion und für die Diagnose von Erkrankungen, die mit T. solium Infektion zusammenhängen, werden zur Verfügung gestellt. Die Zusammensetzungen umfassen eines oder mehrere rekombinante oder synthetische immunogene oder immundominante Polypeptide oder Peptide (oder Fragmente davon), der T. solium Darmwurm-Larven, z. B. der Polypeptide, die hierin als gp50a, gp50b und gp50c bezeichnet werden oder antigenische Fragmente davon. Die Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen von mehreren cDNA-Klonen von T. solium Larven-Polypeptiden werden zur Verfügung gestellt.
Rekombinante T. solium Polypeptide sind nützlich als diagnostische Reagenzien in den unten beschriebenen Immunoassays. Die Polypeptide sind auch nützlich in vitro als Forschungswerkzeuge für das Studium von T. solium im Allgemeinen und von T. solium Erkrankungen, wie z. B. Zystizerkose. Zusätzlich sind die Polypeptide nützlich in pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie z. B. als Impfstoffe, um eine Immunantwort in einem Subjekt auszulösen.
Die hierin zur Verfügung gestellten Methoden schließen Assays für die Detektion oder Quantifizierung von anti-T. solium Antikörpern oder T. solium Nukleinsäuremolekülen in einer Probe, wie z. B. einer humanen oder tierischen Flüssigkeit oder Gewebe, ein. Eines oder mehrere rekombinante oder synthetische T. solium Polypeptide oder antigenische Fragmente davon oder Nukleinsäuremoleküle, die die T. solium Polypeptide kodieren, oder Sonden und Primer davon, werden als Reagenzien in den Assays verwendet.
Es werden auch Methoden für das Auslösen einer Immunantwort in einem Subjekt zur Verfügung gestellt, wobei die Immunantwort auf ein T. solium Polypeptid (z. B. ein gp50 Polypeptid) stattfindet. In Beispielen solcher Methoden wird eine Zusammensetzung, umfassend eines oder mehrere Polypeptide oder eines oder mehrere antigenische Fragmente solcher Polypeptide in ein Subjekt eingeführt (z. B. durch Injektion). In anderen Beispielen wird ein Nukleisäuremolekül, das ein solches Peptid oder antigenisches Fragment kodiert, in das Subjekt eingeführt. In spezifischen Ausführungsformen wird die Auslösung einer Immunantwort in dem Subjekt zur teilweisen oder in einigen Fällen vollständigen Resistenz in diesem Subjekt gegen die Infektion durch T. solium führen.
Begriffe
Außer wenn es nicht anderweitig erwähnt ist, werden technische Begriffe gemäß der gebräuchlichen Verwendung verwendet. Definitionen von gebräuchlichen Begriffen in der Molekularbiologie können in Benjamin Lewin, Genes VII, veröffentlicht durch Oxford University Press, 2000 (ISBN 0-19-899276-X); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, veröffentlicht durch Blackwell Science Ltd.; 1994 (ISBN 0-632-02182-9); und Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, veröffentlicht von VCH Publishers, Inc. 1995 (ISBN 1-56081-569-8) gefunden werden.
Um die Durchsicht der verschiedenen Ausführungsformen zu erleichtern, wird die folgende Erklärung von Begriffen zur Verfügung gestellt:
Die Begriffe „ein/eine/eines" und „der/die/das", wie hierin verwendet, bedeuten „ein oder mehrere" und schließen den Plural ein, es sei denn der Zusammenhang ist ungeeignet dafür.
Der Begriff „Antikörper", wie hierin verwendet, schließt monoklonale Antikörper, polyklonale, chimäre, Einzelketten-, simianisierte („simianized") und humanisierte Antikörper, sowie Fab-Fragmente, einschließlich der Produkte einer Fab-Immunoglobulin-Expressionsbibliothek, ein.
Der Begriff „Antigen" bezieht sich auf ein Molekül oder ein Fragment davon, welches eine Immunantwort in einem Säugetier induzieren kann. Der Begriff schließt Immunogene und Regionen, die für die Antigenizität oder antigenische Determinanten verantwortlich sind, ein. Eine „antigenische Determinante” bezieht sich auf eine Region eines T. solium Proteins, das durch einen Antikörper erkannt wird.
Die „Bedingung" oder „Bedingungen", unter welchen ein DNA-Strang synthetisiert wird, schließen die Anwesenheit von Nukleotiden, Kationen und geeigneten Puffer-Mitteln in Mengen und bei Temperaturen ein, so dass das Nukleinsäuremolekül und ein DNA-Primer sich anlagern („anneal") und Oligonukleotide in einen synthetisierten DNA-Strang inkorporiert werden.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Detektieren" oder „Detektion” auf die quantitative oder quantitative Bestimmung der Anwesenheit eines Biomoleküls, das untersucht wird.
Mit „isoliert" ist ein biologisches Molekül gemeint, dass im Wesentlichen frei von mindestens einigen der Komponenten ist, mit welchen es natürlicherweise vorkommt. Nukleinsäuren und Proteine, die „isoliert" wurden, schließen Nukleinsäuren und Proteine ein, die mittels Standardreinigungsmethoden gereinigt wurden. Der Begriff bezieht aber auch Nukleinsäuren und Proteine ein, die mittels rekombinanter Expression in einer Wirtszelle hergestellt wurden, sowie chemisch synthetisierte Nukleinsäuren. Wie bei dem Begriff „gereinigt", ist „isoliert" ein relativer Begriff.
Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein", wie hierin verwendet, sind austauschbar und bedeuten ein Biomolekül, das aus zwei oder mehreren Aminosäuren aufgebaut ist, die durch eine Peptidbindung verbunden sind. Der Begriff „Polypeptid" schließt kleinere (z. B. antigenische) Fragmente der größeren Biomoleküle ein.
Der Begriff „synthetisches Polypeptid" bezieht sich auf ein Polypeptid, welches in vitro durch das Verbinden von Aminosäuren in einer bestimmten Reihenfolge gebildet wird, unter der Verwendung von Werkzeugen der organischen Chemie, um die Peptidbindungen zu bilden.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Primer" oder „DNA-Primer" ein Oligonuldeotid, das sich an ein Nukleinsäuremolekül in einer bestimmten Orientierung anlagert, um die Synthese eines naszierenden DNA-Strangs bei Anwesenheit einer Polymerase unter den Bedingungen, wie hierin beschrieben, erlaubt.
Wie hierin beschrieben, bezieht sich der Begriff „Primerpaar" auf zwei Primer, wovon der eine eine Vorwärts-Bestimmung aufweist und der andere eine Rückwärts-Bestimmung aufweist (relativ zu ihren entsprechenden Orientierungen an einem Doppelstrang-DNA-Molekül, das aus einer Sense- und Antisense-Sequenz besteht), so dass unter Ampflifikations-Bedingungen (z. B. denjenigen, die hierin beschrieben sind) sich der Vorwärts-Primer an die Sense-Sequenz anlagert und deren Ampflifikation auslöst („primes") und sich der Rückwärts-Primer an die Antisense-Sequenz anlagert und deren Ampflifikation auslöst („primes"). Primer können für die Verwendung in der Ampflifikations-Reaktion selektiert werden auf der Basis, dass sie minimal komplementär mit anderen Primer in der Reaktion sind (um die Bildung von Primer zu minimieren) und dass sie T_m-Werte in einem Bereich der Reaktionstemperaturen aufweisen, die für die Ampflifikations-Methode, wie z. B. PCR, geeignet sind. Zusätzlich können Primer selektiert werden, um sich an spezifische Regionen der DNA- oder RNA-Matrize anlagern, so dass das resultierende DNA-Ampflifikationsprodukt eine Größe im Bereich von 100 bis 5.000 Basenpaaren Länge aufweist, z. B. ungefähr 300 Basenpaare lang ist oder langer.
Mit „Sonde" ist eine Nukleinsäuresequenz gemeint, die für selektive Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäuresequenzen für deren Detektion verwendet werden kann. Die Sonde kann unterschiedlich lang sein, von ungefähr 5 bis 100 Nukleotiden oder von ungefähr 10 bis 50 Nukleotiden oder ungefähr 18 bis 24 Nukleotiden. Die Begriffe „Sonde” oder „Sonden" wie hierin verwendet, sind so definiert, dass sie auch „Primer” einschließen.
Der Begriff „gereinigt", wie hierin verwendet, verlangt nicht absolute Reinheit, er ist eher als ein relativer Begriff gemeint. Daher ist beispielsweise eine gereinigte Nukleinsäure-Präparation eine, in welcher das spezifizierte Protein mehr angereichert ist als die Nukleinsäure in ihrer generativen Umgebung, z. B. innerhalb einer Zelle oder in einer biochemischen Reaktionskammer. Eine Präparation von im Wesentlichen reiner Nukleinsäure kann gereinigt werden, so dass die gewünschte Nukleinsäure mindestens 50% des gesamten Nukleinsäuregehalts der Präparation repräsentiert. In bestimmten Ausführungsformen wird eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% oder mehr des gesamten Nukleinsäuregehalts der Präparation repräsentieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „rekombinant" auf eine Form eines synthetischen Peptides, das unter Verwendung von Technologie, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt ist, hergestellt wird.
Außer wenn es nicht anderweitig erklärt wird, haben alle technischen oder wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung wie die, die von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu welchem diese Erfindung gehört, gewöhnlicherweise verstanden wird. Obwohl Methoden und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu denjenigen sind, die hierin beschrieben sind, bei der Umsetzung oder dem Test der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Methoden und Materialien hierin unten beschrieben. Im Falle eines Konfliktes wird die vorliegende Beschreibung, einschließlich die Definitionen, ausschlaggebend sein. Zusätzlich sind die Materialien, Methoden und Beispiele nur illustrativ und sollen nicht limitierend verstanden werden.
Taenia solium Polypeptide und Polypeptid-Fragmente
Bestimmte Zusammensetzungen, die hierin zur Verfügung gestellt werden, enthalten rekombinante oder synthetische T. solium Larven-Polypeptide, die gegen T. solium Antikörper immunoreaktiv sind. T. solium Antikörper sind in bestimmten Ausführungsformen von den Seren, dem Speichel, der Zerebrospinalflüssigkeit oder vom Urin von Patienten abgeleitet, die mit T. solium infiziert sind. In spezifischen Beispielen sind die Antikörper T. solium Patienten-Serum-Antikörper. Alternativ dazu, sind die Antikörper monoklonale Antikörper.
In spezifischen Ausführungsformen korrespondieren die rekombinanten oder synthetischen Polypeptide mit natürlich vorkommenden Glycoproteinen, die Molekulargewichte von ungefähr 50 kDa aufweisen. Beispiele solcher Polypeptide, die hierin als gp50a, gp50b oder gp50c bezeichnet werden, enthalten die Aminosäuresequenzen, die im angefügten Sequenzprotokoll als SEQ ID NOs: 2, 4 bzw. 6 zur Verfügung gestellt werden. In bestimmten Fällen werden diese Polypeptide durch die Nukleinsäuresequenzen, die in den SEQ ID NOs: 1, 3 bzw. 5 dargestellt werden, kodiert, aber dies ist nicht notwendig (z. B. durch die Redundanz des genetischen Codes).
Die offenbarten immunoreaktiven Polypeptide schließen Polypeptid-Analoga ein, welche antigenische Peptide sind, die Aminosäuresequenzen enthalten, die sich von denjenigen, die in SEQ ID NOs: 2, 4 oder 6 gezeigt werden, durch eine oder mehre Aminosäuresubstitutionen an irgendeiner Position unterscheiden oder welche andere Moleküle an funktionalen Gruppen der Aminosäuren innerhalb der Sequenz angefügt haben. Auch werden immunreaktive Fragmente (antigenische Fragmente) der spezifisch bereitgestellten Polypeptide offenbart, wobei die Fragmente im wesentlichen dieselbe Antigenizität zu dem verwandten Polypeptid oder dem funktionellen Äquivalent davon aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen enthalten diese antigenischen Fragmente Aminosäuresequenzen, die homolog oder im wesentlichen homolog zu einem, zwei oder allen drei der antigenischen Polypeptide (gp50a, gp50b und gp50c) sind. In spezifischen Beispielen dieser Ausführungsformen enthalten die antigenischen Fragmente Aminosäuresequenzen, die homolog oder im wesentlichen homolog zu den drei gp50-Klonen sind.
T. solium Polypeptide, die hierin beschrieben werden, haben eine Vielfalt von Verwendungen. Zum Beispiel werden die Polypeptide oder Polypeptid-Fragmente (z. B. antigenische Fragmente) als Reagenzien in Immunoassays für die Detektion von T. solium Antikörpern verwendet, wie hierin in größerem Detail unten beschrieben wird. Weiterhin können die T. solium Polypeptide verwendet werden, um Affinitätssäulen für die Isolierung von T. solium Antikörpern zu entwickeln. Auch können Polypeptide, die an T. solium Antikörper mit hoher Spezifität und Avidität binden, mit einer Markierung oder einer Reporter-Gruppe markiert werden und für die Visualisierung und Quantifizierung in den Assays, die hierin beschrieben werden, unter der Verwendung von Detektions-Techniken, wie z. B. autoradiographische und Membranbindungs-Techniken, verwendet werden. Die Reporter-Gruppe oder -Markierung ist üblicherweise eine fluoreszierende oder radioaktive Gruppe oder ein Enzym. Solche Anwendungen stellen bedeutsame diagnostische und Forschungswerkzeuge zur Verfügung.
Nukleinsäuremoleküle
Es werden Nukleinsäuremoleküle, die die oben beschriebenen T. solium Larven-Polypeptide kodieren, und Sonden oder Primer, die an die Nukleinsäuremoleküle, die solche Polypeptide kodieren, hybridisieren, zur Verfügung gestellt. Die Nukleinsäuremoleküle schließen diejenigen ein, die Sequenzen aufweisen, die die T. solium Larven-Polypeptide gp50-Klone gp50a, gp50b und gp50c oder Fragmente davon kodieren. Sequenzen für die drei spezifischen Klone werden im beigefügten Sequenzprotokoll als SEQ ID NOs: 1, 3 bzw. 5 zur Verfügung gestellt.
Nukleinsäuremoleküle sind nützlich bei der Produktion von rekombinanten Polypeptiden. Weil rekombinante Methoden für die Polypeptidproduktion größere Quantitäten an Polypeptid produzieren, welche geringere Reinigung benötigen, können rekombinante Polypeptide oftmals preiswerter produziert werden als Polypeptide, die unter der Verwendung traditioneller Isolierungs- oder Reinigungstechniken produziert werden. Eine oder mehrere der Nukleinsäuresequenzen, die T. solium Peptide kodieren, können in einen Vektor, wie z. B. ein Plasmid, inseriert werden und in einem lebenden Organismus exprimiert werden, um rekombinante T. solium Peptide gemäß den Methoden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, zu produzieren, z. B. unter der Verwendung von Methoden, die unten in größerem Detail beschrieben werden.
Nukleinsäuremoleküle (und Fragmente oder Teile davon) sind auch nützlich als Nukleinsäure-Sonden oder Primer für die Detektion von T. solium Infektion in einer biologischen Probe, mit hoher Sensitivität und/oder Spezifität. Die Sonden oder Primer können verwendet werden, um T. solium Larven-Nukleinsäuremoleküle in der Probe zu amplifizieren oder zu detektieren, die Menge an T. solium in der Probe zu quantifizieren, die Infektion zu diagnostizieren oder Kontamination mit T. solium zu bestimmen, oder den Fortschritt von Therapien, die zur Behandlung der Infektion verwendet werden, zu überwachen. Die Nukleinsäuremoleküle, die hierin beschrieben werden, sind auch nützlich als Laborforschungs-Werkzeuge, um den T. solium Organismus und Erkrankungen, die mit diesem Organismus assoziiert sind (wie z. B.
Zystizerkose und Neurozystizerkose) zu studieren und um Therapien und Behandlungen für solche Erkrankungen zu entwickeln.
Detektierbare Sonden werden mit einer detektierbaren Markierung markiert, wie hierin in Bezug auf markierte Polypeptide beschrieben.
Nukleinsäuresonden oder -primer, die hierin zur Verfügung gestellt werden, hybridisieren selektiv mit Nukleinsäuremolekülen, die T. solium Larven-(Poly)Peptide kodieren, wie hierin beschrieben oder Sequenzen komplementär dazu. Hybridisierung kann unter verschiedenen Temperaturen und Bedingungen erreicht werden, gemäß der Temperatur der Dissoziation (T_d) der Moleküle, die hybridisiert werden, und der Stringenz, die für spezifische Bindung benötigt wird. Die Moleküle können aneinander hybridisiert werden in jeder Reihenfolge, oder zur selben Zeit oder im wesentlichen zur selben Zeit. Reaktionsbedindungen für die Hybridisierung eines Oligonukleotids oder Polynukleotids an eine Nukleinsäuresequenz variieren von Oligonukleotid zu Oligonukleotid, in Abhängigkeit von Faktoren wie z. B. die Länge des Oligonukleotids, die Anzahl von G- und C-Nukleotiden und die Zusammensetzung des Puffers, der in der Hybridisierungsreaktion verwendet wird. Moderat stringente Hybridisierungs-Bedingungen werden im Allgemeinen vom Fachmann auf dem Gebiet als Bedingungen verstanden, von ungefähr 25°C unter der Schmelztemperatur einer perfekten Basen-gepaarten Doppelstrang-DNA. Höhere Spezifität wird im Allgemeinen durch Anwenden von Inkubationsbedingungen erreicht, die höhere Temperaturen haben, in anderen Worten stringentere Bedingungen. Unter extrem stringenten Hybridisierungs-Bedingungen werden nur Oligomere, die vollständig komplementär zueinander sind, aneinander hybridisiert bleiben. Im Allgemeinen gilt, je langer die Sequenz oder je höher der G- und C-Gehalt, desto höher die benötigte Temperatur oder erlaubte Salzkonzentration. Kapitel 11 von Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschreibt Hybridisierungs-Bedingungen für Oligonukleotid-Sonden und Primer in großem Detail, einschließlich einer Beschreibung der Faktoren, die involviert sind, und des Niveaus an Stringenz, das notwendig ist, um Hybridisierung mit einer gewünschten Spezifität zu garantieren.
Wenn sie als Primer verwendet werden, werden Nukleinsäuremolekül-Zusammensetzungen, die in bestimmten Ausführungsformen beschrieben sind, mindestens zwei Nukleinsäuremoleküle einschließen, die an verschiedene Regionen des Zielmoleküls hybridisieren, um eine ge wünschte Region des Ziels zu amplifizieren. In Abhängigkeit von der Länge der Sonde oder des Primers kann die Zielregion zwischen 70% komplementären Basen und vollständiger Komplementarität rangieren und kann immer noch unter stringenten Bedingungen hybridisieren. In spezifischen Ausführungsformen haben die hybridisierenden Nukleinsäuresonden oder -primer, wie hierin beschrieben, mindestens 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% oder mindestens 99% Komplementarität mit dem Segment der Sequenz, an welches sie hybridisieren, z. B. 85% oder mehr. Für den Zweck der Bestimmung der Anwesenheit von T. Solium ist der Grad der Komplementarität zwischen der hybridisierenden Nukleinsäure (Sonde oder Primer) und der Sequenz, an welche sie hybridisiert, mindestens genug, um die Hybridisierung von der Hybridisierung mit einer Nukleinsäure von einem anderen Organismus zu unterscheiden.
In bestimmten Ausführungsformen ist jede Sonde oder Primer ein DNA-Molekül mit einer Länge von 20 bis 40 Nukleotiden. In einigen Ausführungsformen ist die Länge des Primers 25 bis 35 Nukleotide und z. B. 27 bis 29 Nukleotide.
Die Amplifizierung der synthetisierten DNA kann durch jede Methode für die Detektion von DNA, die im Stand der Technik bekannt ist, detektiert werden. Eine solche Detektion schließt die Detektion mittels eines Southern Blot-Hybridisierungs-Assays, mittels Visualisierung von DNA-Ampflifikationsprodukten von spezifischem molekularen Gewicht auf Ethidium Bromid-gefärbten Agarosegelen, mittels Messung der Einfügung von radiomarkierten Nukleotiden in den synthetisierten DNA-Strang mittels Autoradiographie oder Szintillations-Messung, mittels ELISA, der für den Einfang eines detektierbaren Rests, der an die amplifizierte DNA gebunden ist, modifiziert ist oder mittels irgendeiner Detektionsmethode, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt ist, ein. Eine bestimmte Detektionsmethode ist die Hybridisierung der amplifizierten DNA an eine interne spezifische Oligosonde unter der Verwendung von Techniken, wie z. B. ELISA, Southern blot-Hybridisierung oder ähnlichen Methoden.
Hierin werden auch Sequenzen, Sonden und Primer zur Verfügung gestellt, die selektiv an die kodierende Nukleinsäure oder den komplementären oder entgegengesetzten (oder Antisense-) Strang der Nukleinsäure, wie diejenigen, die hierin spezifisch zur Verfügung gestellt werden, hybridisieren. Die spezifische Hybridisierung mit einer Nukleinsäure kann mit geringfügigen Modifikationen oder Substitutionen in der Nukleinsäure stattfinden, solange eine funktionale Spezies-spezifische Hybridisierungs-Fähigkeit aufrechterhalten wird. Es werden isolierte Nukleinsäuren hierin zur Verfügung gestellt, die selektiv mit den Nukleinsäuren, die die T. solium Larven-Polypeptide kodieren, unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und welche mindestens fünf Nukleotide aufweisen, die komplementär zur Sequenz von Interesse sind, wie beschrieben von Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd et. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Es wird vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet verstanden werden, dass die T. solium Polypeptide, die hierin beschrieben werden, auch von Sequenzen kodiert werden, die im Wesentlichen ähnlich zu den Nukleinsäuresequenzen sind, die im Sequenzprotokoll zur Verfügung gestellt werden. Mit dem Ausdruck „im Wesentlichen ähnlich" ist eine Nukleinsäure(einschließlich DNA und RNA)-Sequenz gemeint, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes nicht identisch ist mit derjenigen, die in SEQ ID NOs: 1, 3 oder 5 gezeigt wird, aber welche noch dieselbe Aminosäuresequenz kodiert; oder eine Nukleinsäuresequenz, welche eine verschiedene Aminosäuresequenz kodiert, aber die Aktivitäten oder die Antigenizität des spezifischen Polypeptides beibehält, entweder weil eine Aminosäure mit einer anderen ähnlichen Aminosäure ausgetauscht wird, oder weil die Änderung (entweder durch Substitution, Deletion oder Insertion) nicht das aktive Zentrum des Proteins beeinflusst.
Produktion synthetischer oder T. solium Larven-Polypeptide
Die Nukleinsäuresequenzen, die hierin zur Verfügung gestellt werden, sind nützlich für die Produktion der Proteine, Polypeptide oder Peptide, die sie kodieren, oder der antigenischen Fragmente davon, entweder mittels rekombinanter oder synthetischer Methoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Zum Beispiel kann eine oder mehrere der Nukleinsäuresequenzen, die hierin zur Verfügung gestellt werden, oder ein Homolog oder funktionelles Äquivalent oder Teil davon in einen Vektor, wie z. B. ein Plasmid, inseriert werden und rekombinant in einem lebenden Organismus exprimiert werden, um rekombinante Polypeptide zu produzieren. Alternativ dazu können die Peptide mittels Festphasen-Techniken synthetisiert werden, vom Harz abgespalten werden und mittels präparativer High Performance Flüssigchromatographie gereinigt werden (z. B. siehe Creighton, 1983, PROTEINS STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, W. H. Freeman und Co., N. Y. Seiten 50–60). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann mittels Aminosäureanalyse oder Sequenzanalyse bestätigt werden (z. B. Edman-Abbau-Prozedur; siehe Creighton, 1983, PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, W. H. Freeman und Co., N. Y., Seiten 34–49). Auch kleinere Peptide können miteinander verbunden werden, um größere Polypeptide zu bilden, mittels einer Methode, die als chemische Legierung bekannt ist (Wilken und Kent, Current Opinion in Biotechnology 4: 412–426, 1998).
Rekombinante Proteine werden mittels Methoden produziert, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Ein Klonierungsvektor, wie z. B. ein Plasmid oder Phagen-DNA, wird mittels eines Restriktionsenzyms gespalten und die Nukleinsäure, die die Proteine oder Fragmente davon von Interesse kodiert, wird in die Spaltstelle inseriert und legiert. Der Klonierungsvektor wird dann in einen Wirt eingeführt, um das Protein oder Fragment, welches von der Nukleinsäure kodiert wird, zu produzieren. Geeignete Wirte schließen bakterielle Wirte, wie z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefen, Pflanzen, Insekten und Säugetier-Zellinien und andere Zellkulturen ein. Insektenzell-Expression kann ein vorteilhafter Wirt für die Generierung einer großen Menge des Proteins für die Verwendung in einem diagnostischen Assay sein. Hefen sind vorteilhafte Wirte für Impfstoff- oder pharmazeutische Produkt-Expression. Die Produktion und Reinigung des Genproduktes kann unter der Verwendung bekannter molekularbiologischer Techniken erreicht und verbessert werden. Die Kombination von verschiedenen Nukleinsäuresequenzen in einem Klonierungsvektor kann auch Mosaikpeptide produzieren.
Beispiele für geeignete Klonierungs- und Sequenzierungstechniken und Instruktionen, die ausreichend sind, um den Fachmann durch viele Klonierungstätigkeiten zu leiten, finden sich in: Berger und Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING – A LABORATORY MANUAL (2nd ed.) Vol. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; und CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, ein Joint Venture zwischen Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement). Die Produktinformation von Herstellern biologischer Reagenzien und experimenteller Ausrüstung stellen auch Information zur Verfügung, die in bekannten biologischen Methoden nützlich ist. Solche Hersteller schließen ein: die SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Paolo Alto, CA), ChemGenes Corp. (Ash land, MA), Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc. (Sterling, VA), Life Technologies, Inc. (Rockville, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Buchs, Schweiz), Invitrogen (Carlsbad, CA), and Perkin-Elmer Corp. Applied Biosystems Division (Foster City, CA), sowie viele andere kommerzielle Quellen, die dem Fachmann bekannt sind.
Der Fachmann, dem die hierin beschriebenen Peptidsequenzen zur Verfügung gestellt werden, wird eine Vielzahl von äquivalenten Nukleinsäuren erkennen, die die Peptide kodieren. Dies ist so, weil der genetische Code erfordert, dass jeder Aminosäurerest in einem Peptid durch mindestens ein Triplett von Nukleotiden in einer Nukleinsäure, welche das Peptid kodiert, spezifiziert ist. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes werden viele Aminosäuren äquivalent durch mehr als nur ein Triplett an Nukleotiden kodiert. Zum Beispiel kodieren die Tripletts CGU, CGC, CGA, CGG, AGA and AGG alle die Aminosäure Arginin. Daher kann an jeder Position, wo ein Arginin durch ein Nukleinsäuretriplett zu kodieren ist, die Nukleinsäure jedes der Tripletts aufweisen, die Arginin kodieren. Ein Fachmann ist durch und durch mit dem genetischen Code und seiner Verwendung vertraut. Eine Einführung in dieses Thema findet sich zum Beispiel in Kapitel 15 von Watson, et al. MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE (4^th Ed., The Benjamin/Cummings Company, Inc., Menlo Park, CA, 1987) und den darin zitierten Referenzen.
Obwohl jedes Nukleinsäuretriplett oder Codon, das eine Aminosäure kodiert, verwendet werden kann, um die Position der Aminosäure in einem Peptid zu spezifizieren, werden bestimmte Codons von bestimmen Organismen bevorzugt. In einigen Ausführungsformen ist es wünschenswert, Codons für erhöhte Expression eines kodierten Peptides zu selektieren, z. B. wenn das Peptid für die Verwendung als ein immunogenes Reagenz gereinigt wird. Codons können unter Bezug auf Spezies-Codon-Präferenz-Tabellen („species codon biss tables") selektiert werden, wobei die Tabellen zeigen, welche Codons am typischsten von dem Organismus verwendet werden, in welchem das Peptid exprimiert werden soll. Die Codons, welche häufig durch einen Organismus verwendet werden, werden von den reichlicher vorhandenen t-RNAs in den Zellen des Organismus translatiert. Weil die t-RNAs reichlich vorhanden sind, wird die Translation der Nukleinsäure in ein Peptid durch die zelluläre Translations-Maschinerie gefördert. Codon-Präferenz-Tabellen sind für die meisten Organismen erhältlich. Für eine Einführung in Codon-Präferenz-Tabellen, siehe z. B. Watson, et al., supra.
Zusätzlich wird es dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet leicht ersichtlich sein, dass die hierin beschriebenen Peptide und die Nukleinsäuremoleküle, die solche immunogenen Peptide kodieren, verschiedenen Veränderungen ausgesetzt sein können, wie z. B. Insertionen, Deletionen und Substitutionen, entweder konservativ oder nicht-konservativ, wobei solche Veränderungen bestimmte Vorteile bei ihrer Verwendung zur Verfügung stellen, wie z. B. die Erhöhung der biologischen Aktivität.
Ein Durchschnittsfachmann wird anerkennen, dass viele konservative Variationen des Nukleinsäurekonstruktes ein funktionell identisches Konstrukt ergeben. Zum Beispiel sind aufgrund der Degeneration des genetischen Codes stille Substitutionen (d. h. Substitutionen der Nukleinsäuresequenz, welche nicht zu einer Veränderung im kodierten Peptid führen), ein impliziertes Merkmal von jeder Nukleinsäuresequenz, welche eine Aminsäure kodiert. Zusätzlich wird der Fachmann viele Wege zur Generation von Veränderungen in einem gegebenen Nukleinsäurekonstrukt erkennen. Solche bekannten Methoden schließen ortsgerichtete Mutagenese; PCR-Amplifikation unter der Verwendung degenerierter Oligonukleotide; das Aussetzen der Zellen, die Nukleinsäuren enthalten, gegenüber mutagenen Mitteln oder Strahlung; chemische Synthese eines gewünschten Oligonukleotids (z. B. in Zusammenhang mit Ligation und/oder Klonierung, um große Nukleinsäuren zu generieren) und andere bekannte Techniken ein. Siehe Giliman und Smith (1979) Gene 8: 81–97, Roberts et al. 81987) Nature 328: 731–734 und Sambrook, Ausbel, Berger und Kimmel, alle supra.
Modifizierungen von Nukleinsäuren werden mittels Routine-Screening-Techniken in geeigneten Assays für die gewünschte Eigenschaft evaluiert. Zum Beispiel können Veränderungen im immunologischen Charakter von kodierten Peptiden detektiert werden mittels eines geeigneten immunologischen Assays. Modifikationen anderer Eigenschaften, wie z. B. Nukleinsäure-Hypridisierung an eine komplementäre Nukleinsäure, Redox- oder thermische Stabilität von kodierten Proteinen, Hydrophobizität, Anfälligkeit gegenüber Proteolyse oder die Tendenz zu aggregieren werden alle gemäß Standard-Techniken getestet.
Gleichermaßen werden konservative Aminosäuresubstitutionen, in einer oder einigen Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz eines Proteins, die mit verschiedenen Aminosäuren mit sehr ähnlichen Eigenschaften substituiert sind (siehe den Abschnitt Definitionen, supra), auch einfach als sehr ähnlich mit einem offenbarten Konstrukt identifiziert. Mit konservativen Substitutionen ist das Ersetzen eines Aminosäurerestes mit einem anderen Aminosäurerest ge meint, der biologisch und/oder chemisch ähnlich ist, zum Beispiel ein hydrophober Rest mit einem anderen hydrophoben Rest, oder ein polarer Rest mit einem anderen polaren Rest. Die Substitutionen schließen Kombinationen ein wie z. B. Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg und Phe, Tyr. Solche konservativ substituierten Variationen jeder explizit offenbarten Sequenz sind ein Merkmal der vorliegenden Offenbarung.
Verschiedene Techniken für die Herstellung synthetischer Polypeptide können verwendet werden. Festphasen-Synthese, in welcher die C-terminale Aminosäure der Peptidsequenz an einen unlöslichen Träger angeknüpft wird, dem die sequentielle Addition der verbleibenden Aminosäuren in der Sequenz folgt, ist eine nützliche und gut bekannte Methode für die Herstellung synthetischer Peptide. Techniken für die Festphasen-Synthese werden von Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology (Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, N. Y., vol. 2, Seiten 3–284 (1980)); Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2156 (1963); und Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984) beschrieben. Viele automatisierte Systeme für die Durchführung von Festphasen-Peptidsynthese sind kommerziell erhältlich.
Die Festphase-Synthese startet am Carboxy-terminalen Ende (d. h. dem C-Terminus) des Peptides durch Koppeln einer geschützten Aminosäure über ihre Carboxyl-Gruppe an einen geeigneten festen Träger. Der feste Träger, der verwendet wird, ist kein kritisches Merkmal, unter der Voraussetzung, dass der Träger in der Lage ist, die Carboxyl-Gruppe zu binden, während er im wesentlichen inert gegenüber den in der Peptidsynthese-Prozedur verwendeten Reagenzien bleibt. Zum Beispiel kann ein Ausgangsmaterial präpariert werden durch Anknüpfen einer Amino-geschützten Aminosäure über eine Benzylester-Bindung an ein Chlor-methyliertes Harz oder ein Hydroxymethyl-Harz oder über eine Amid-Bindung an ein Benzhydrylamin(BHA)-Harz oder p-Methylbenhydrylamin(MBHA)-Harz. Materialien, die zur Verwendung als feste Träger geeignet sind, sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, die folgenden: Halomethyl-Harze, wie zum Beispiel Chlormethyl-Harz oder Brommethyl-Harz; Hydroxymethyl-Harze; Phenol-Harze, wie zum Beispiel 4-(a-[2,4-Dimethoxyphenyl]-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-Harz; tert-Alkyloxycarbonyl-hydrazidatierte Harze und ähnliche. Solche Harze sind kommerziell erhältlich und ihre Herstellungsmethoden sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt.
Die Säureform der Peptide kann durch die Festphasen-Peptidsynthese-Prozedur unter der Verwendung eines Benzylester-Harzes als ein fester Träger generiert werden. Die korrespondierenden Amide können produziert werden durch die Verwendung von Benzhydrylamin- oder Methylbenzhydrylamin-Harz als der feste Träger. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass, wenn das BHA- oder MBHA-Harz verwendet wird, die Behandlung mit wasserfreier Flussäure bei der Spaltung des Peptids vom festen Träger ein Peptid produziert, dass eine terminale Amidgruppe aufweist.
Die α-Aminogruppe jeder Aminosäure, die in der Synthese verwendet wird, sollte während der Kopplungsreaktion geschützt sein, um Nebenreaktionen, die die reaktive α-Aminofunktion einschließen, zu verhindern. Bestimmte Aminosäuren enthalten auch reaktive funktionale Gruppen an den Seitenketten (z. B. Sulfhydryl, Amino, Carboxyl, Hydroxyl, etc.), welche auch mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden müssen, um chemische Reaktionen zu verhindern, die an diesen Stellen während der Peptidsynthese geschehen können. Schutzgruppen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Eine richtig selektierte α-Amino-Schutzgruppe wird die α-Aminofunktion während der Kopplungsreaktion inert lassen, wird leicht nach der Kopplung entfernbar sein, unter Bedingungen, die nicht die Seitenketten-Schutzgruppen entfernen, wird nicht die Struktur des Peptid-Fragments verändern und wird Razemisierung nach der Aktivierung unmittelbar vor der Kopplung verhindern. Gleichermaßen müssen Schutzgruppen der Seitenketten ausgewählt werden, um die funktionale Gruppe der Seitenkette während der Synthese inert zu lassen, müssen unter den Bedingungen, die für die Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe verwendet werden, stabil sein, und müssen nach der Beendigung der Peptidsynthese unter Bedingungen entfernbar sein, die die Struktur des Peptides nicht verändern.
Die Kopplung der Aminosäuren kann mittels einer Vielzahl von Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, erreicht werden. Typische Ansätze schließen entweder die Umwandlung der Aminosäure in ein Derivat ein, welches die Carboxylgruppe empfänglicher für eine Reaktion mit der freien N-terminalen Aminogruppe des Peptidfragments macht, oder die Verwendung eines geeigneten Kopplungsmittels, wie zum Beispiel N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI). Häufig wird Hydroxybenzotriazol (HOBt) als ein Katalysator in diesen Kopplungsreaktionen verwendet. Geeignete Synthesechemie wird offenbart in THE PEPTIDES: ANALYSIS, STRUCTURE, BIOLOGY, VOL. 1: METHODS OF PEPTIDE BOND FORMATION (Gross und Meienhofer (eds.), Academic Press, N. Y. (1979)); und Izumiya, et al., SYNTHESIS OF PEPTIDES (Maruzen Publishing Co., Ltd., (1975).
Im Allgemeinen wird die Synthese des Peptides durch zuerst Koppeln der C-terminalen Aminosäure, welche an der N-Aminoposition durch einen Schutzgruppe, wie zum Beispiel Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), geschützt ist, an einen festen Träger eingeleitet. Vor der Kopplung der Fmoc-Asn muss der Fmoc-Rest von dem Polymer entfernt werden. Fmoc-Asn kann zum Beispiel gekoppelt werden an das 4-(a-[2,4-Dimethoxyphenyl]-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-Harz unter der Verwendung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und Hydroxybenzotriazol (HOBt) bei ungefähr 25°C für ungefähr zwei Stunden unter Rühren. Nach der Kopplung der Fmoc-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die α-Amino-Schutzgruppe unter der Verwendung von 20% Piperidin in DMF bei Raumtemperatur entfernt.
Nach der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe werden die verbleibenden Fmoc-geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt. Geeignete geschützte Aminosäuren sind kommerziell erhältlich von einer Reihe von Anbietern (zum Beispiel Novartis (Schweiz) oder Bachem (Kalifornien)). Als eine Alternative zur schrittweisen Addition von individuellen Aminosäuren können auch geeignet geschützte Peptidfragmente, die aus mehr als einer Aminosäure bestehen, an das „wachsende" Peptid gekoppelt werden. Die Selektion eines geeigneten Kopplungsreagenz wie oben erklärt, ist dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Es sollte erwähnt werden, dass, weil die immunogenen Peptide relativ kurz sind, dieser spätere Ansatz (d. h. die Segment-Kondensationsmethode) nicht die effizienteste Methode für die Peptidsynthese ist.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor im Überschuss eingeführt und die Kopplung wird in einem Medium aus Dimethylformamid (DMF), Methylenchlorid (CH₂Cl₂) oder Mischungen davon durchgeführt. Wenn die Kopplung nicht vollständig ist, muss die Kopplungsreaktion vor dem Entschützen der N-Aminogruppe und der Addition der nächsten Aminosäure wiederholt werden. Die Kopplungseffizienz kann durch eine Reihe von Mitteln beobachtet werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Eine spezifische Methode für das Überwachen der Kopplungseffizienz ist die mittels Ninhydrin-Reaktion. Peptidsynthese-Reaktionen können automatisch durchgeführt werden unter der Verwendung einer Reihe von kommerziell erhältlichen Peptidsynthesizern (z. B. Biosearch 9500, Biosearch, San Raphael, CA).
Das Peptid kann abgespalten und die Schutzgruppen entfernt werden durch: Rühren des unlöslichen Trägers oder festen Trägers in wasserfreiem, flüssigem Fluorwasserstoff (HF) bei Anwesenheit von Anisol und Dimethylsulfid bei ungefähr 0°C für ungefähr 20 bis 90 Minuten, in besonderen Ausführungsformen ungefähr 60 Minuten; durch kontinuierliches Sprudeln von Bromwasserstoff (HBr) durch eine 1 mg/10 ml Suspension des Harzes in Trifluoressigsäure (TFA) für 60 bis 360 Minuten bei ungefähr Raumtemperatur, in Abhängigkeit von den ausgewählten Schutzgruppen; oder durch Inkubieren des festen Trägers in der Reaktionssäule, die für die Festphasensynthese verwendet wurde, mit 90% Trifluoressigsäure, 5% Wasser und 5% Triethylsilan für ungefähr 30 bis 60 Minuten. Andere Entschützungsmethoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, können auch verwendet werden.
Die Peptide können aus der Reaktionsmischung isoliert und gereinigt werden mittels Peptidreinigung, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt ist. Zum Beispiel können die Peptide unter der Verwendung von bekannten chromatographischen Prozeduren, wie zum Beispiel reverse Phase-HPLC, Gelpermeation, Ionenaustausch, Größenausschluss, Affinität, Abtrennung oder Gegenstrom-Verteilung, gereinigt werden.
Herstellung oder Identifizierung von Antigenischen Fragmenten
Um antigenische Fragmente zu identifizieren, können synthetische oder rekombinante Peptide oder Polypeptide durch jede der oben beschriebenen Prozeduren generiert werden. Die Peptide können an eine Plastik-Mikrovertiefung, Nitrozellulose, andere Membranen oder jeden anderen geeigneten Träger absorbiert werden. Ein Peptid kann mit sich selbst vernetzt werden unter der Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie z. B. Glutaraldehyd, oder mit einem Trägerprotein vernetzt werden, wie zum Beispiel Albumin, Keyhole-Limpet Hämocyanin vor der Absorption an den Träger. Antikörper, die in den Körperflüssigkeiten von Patienten mit Zystizerkose vorhanden sind, oder monoklonale Antikörper, die für T. solium Antigene spezifisch sind, binden die antigenischen Peptide oder Polypeptide und werden unter der Verwendung irgendeines oben beschriebenen Immunoassays detektiert. Die Reaktivität mit den Antikörpern identifiziert ein antigenisches Fragment.
Kleinere Peptide können miteinander verbunden werden, um Polypeptide in einem Größenbereich von 40 Aminosäuren bis 200 Aminosäuren durch eine Methode, die als chemische Ligation bekannt ist, zu bilden (Wilken und Kent, 1998).
Markierte Polypeptide
Wenn die T. solium Polypeptide und antigenischen Fragmente davon, wie oben beschrieben, mit einem detektierbaren Biomolekül oder einer Chemikalie markiert sind, sind sie nützlich für die Zwecke, wie zum Beispiel als Diagnostika und in der wissenschaftlichen Forschung, unter der Verwendung der Methoden und Assays, die unten beschrieben werden. Verschiedene Typen von Markierungen und Methoden für die Konjugation der Markierungen an die Polypeptide sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Verschiedene spezifische Markierungen werden unten dargestellt.
Zum Beispiel werden die Polypeptide mit einer Radiomarkierung konjugiert, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf ³²P, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I oder ¹³¹I. Die Detektion einer Markierung kann mittels Methoden, wie zum Beispiel Szintillations-Zählung, Gammaspektrometrie oder Audioradiographie, erfolgen.
Biolumineszierende Markierungen, wie zum Beispiel Derivate des Leuchtkäfer-Luciferin, sind auch nützlich. Die biolumineszierende Substanz wird kovalent an das Polypeptid mittels konventioneller Methoden gebunden und das markierte Polypeptid wird detektiert, wenn ein Enzym, wie zum Beispiel Luciferase, eine Reaktion mit ATP katalysiert, die verursacht, dass das biolumineszierende Molekül Lichtphotonen emittiert.
Fluorogene können auch als Markierungen verwendet werden. Beispiele für Fluorogene schließen Fluorescein und Derivate, Phycoerythrin, Allo-Phycocyanin, Phycocyanin, Rhodamin und Texas Rot ein. Die Fluorogene werden im Allgemeinen unter der Verwendung eines Fluoreszenz-Detektors detektiert.
Die Polypeptide können alternativ dazu mit einem Chromogen markiert werden, um ein Enzym oder eine Affinitäts-Markierung zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel kann das Polypeptid biotinyliert werden, so dass es in einer Biotin-Avidin-Reaktion verwendet werden kann, welche auch an eine Markierung, wie zum Beispiel ein Enzym oder Fluorogen gekup pelt sein kann. Alternativ dazu kann das Polypeptid mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen markiert sein, die eine chromogene oder fluorogene Reaktion nach Addition des Substrats ergeben. Additive, wie zum Beispiel 5-Amino-2,3-Dihydro-1,4-Phthalazindion (auch bekannt als Luminol^TM) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), und Geschwindigkeitsverstärker, wie zum Beispiel p-Hydroxybiphenyl (auch bekannt als p-Phenylphenol) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), können auch verwendet werden, um Enzyme, wie zum Beispiel Meerettich-Peroxidase, durch eine lumineszierende Reaktion zu ampflifizieren; und luminogene oder fluorogene Dioxetan-Derivate von Enzymsubstraten können ebenso verwendet werden. Solche Markierungen können detektiert werden unter der Verwendung von Enzym-verbundenen Immunoassays (ELISA) oder durch die Detektion einer Farbänderung mit Hilfe eines Spektrophotometers. Zusätzlich können Peptide mit kolloidalem Gold markiert werden zur Verwendung in der Immunoelektron-Mikroskopie gemäß den Methoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind.
Die Diagnose einer Infektion mit T. solium Larven kann bestimmt werden durch Markieren eines Polypeptids, wie oben beschrieben, und Detektieren der Markierung gemäß der Methoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind und die in größerem Detail unten beschrieben werden.
Detektion von T. solium Antikörpern
Viele Techniken sind für die Detektion und Quantifizierung einer Komponente, wie zum Beispiel eines Antikörpers, in einer Mischung und/oder für die Messung ihrer Menge bekannt. Immunoassays, welche Polypeptide verwenden, die spezifisch an Antikörper von Interesse binden, sind einige der besser bekannten Messungs-Techniken. Diese Methoden erlauben die Detektion (und/oder Quantifizierung) von zirkulierenden T. solium Antikörpern, um die Anwesenheit oder den Grad der T. solium Infektion anzuzeigen, und in einigen Ausführungsformen die Diagnose einer Erkrankung oder eines Zustandes, der mit einer solchen Infektion assoziiert ist. Klassische Methoden schließen das Reagieren einer Probe, die den Antikörper enthält, mit einer bekannten Überschussmenge des Polypeptides, das spezifisch für den Antikörper ist; das Separieren des gebundenen Antikörpers vom freien Antikörper und das Bestimmen der Menge des einen oder des anderen ein. Oftmals ist der sekundäre Antikörper mit einer Reportergruppe markiert, um bei der Bestimmung der Menge des gebundenen Ana lyten zu helfen, wie oben beschrieben. Die Reportergruppe oder die „Markierung" ist gewöhnlicherweise eine fluoresziernde oder radioaktive Gruppe oder ein Enzym.
In einer Ausführungsform verwendet die diagnostische Methode einen schnellen immunochromatographischen diagnostischen Test(Card-Test)-Assay. In einer weiteren Ausführungsform ist die diagnostische Methode ein schneller immunochromatographischer diagnostischer Test(Card-Test)-Assay, der eines oder mehrere der T. solium Larven-Glykoprotein-Antigene, die hierin als gp50a, gp50b oder gp50c bezeichnet werden, oder antigenische Fragmente davon enthält. Wie oben erwähnt, haben diese Polypeptide die Aminsäuresequenzen, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NOs: 2, 4 bzw. 6 aufgeführt sind, und werden kodiert von den Nukleinsäuresequenzen, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NOs: 1, 3 und 5 aufgeführt sind.
Es ist zu verstehen, dass die Assaymethoden so zu betrachten sind, dass sie die Verwendung von synthetischen und rekombinanten T. solium Polypeptiden, wie oben beschrieben, und Fragmenten oder Derivaten von den T. solium Polypeptiden, wie hierin beschrieben, einschließen, solange wie die Polypeptid-Fragmente oder Derivate die antigenische Aktivität behalten oder eine äquivalente antigenische Aktivität der gesamten immunogenen Polypeptide zeigen. Diese Fragmente oder Derivate schließen Peptide mit antigenischer Aktivität mit ein, die Aminosäuresubstitutionen aufweisen oder andere Moleküle an den funktionellen Gruppen der Aminosäuren angeknüpft haben, wie oben beschrieben.
Es ist zu verstehen, dass die Assaymethoden so zu betrachten sind, dass sie die Verwendung von synthetischen und rekombinanten T. solium Polypeptiden, wie oben beschrieben, einschließen, in Kombination mit einem oder mehreren anderen bekannten T. solium Polypeptiden oder Fragmenten oder Derivaten davon. Diese anderen Polypeptide schließen ein, sind aber nicht limitiert auf gp39–42, gp24, gp21, gp18, gp14 und gp13.
Ein Immunoassay für die Detektion von T. solium in einer Probe kann wie folgt durchgeführt werden: Eine Probe wird gesammelt oder erhalten unter der Verwendung von Methoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Die Probe, enthaltend die T. solium Antikörper, die detektiert werden sollen, kann von jeder biologischen Quelle erhalten werden. Beispiele für biologische Quellen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Blutserum, Blutplasma, Urin, spinale Flüssigkeit, Speichel, Fermentationsflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Ge webekulturflüssigkeit, Ascites-Flüssigkeit eines Menschen oder eines Tieres. Die Probe kann verdünnt, gereinigt, konzentriert, filtriert, gelöst, suspendiert oder anderweitig vor dem Immunoassay manipuliert werden, um die Ergebnisse des Immunoassays zu optimieren.
Um T. solium Antikörper in der Probe zu detektieren, wird die Probe mit einem oder mehreren T. solium rekombinanten oder synthetischen Polypeptiden inkubiert, die, wie oben beschrieben, produziert oder erhalten wurden. Das Polypeptid kann markiert sein oder an ein Festphasen-Kügelchen oder -Partikel konjugiert sein, wie hierin ebenso beschrieben. Das markierte Polypeptid wird dann detektiert unter der Verwendung gut bekannter Techniken für die Detektion von biologischen Molekülen, wie zum Beispiel immunochemischen oder histologischen Methoden. Solche Methoden schließen immunologische Techniken mit ein, die monoklonale oder polyklonale Antikörper zu dem Polypeptid verwenden, wie zum Beispiel Enzym-verbundene Immunosorbant-Assays, Radioimmunoassay, chemilumineszierende Assays oder andere Typen von Assays, die Antikörper einbeziehen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Im Allgemeinen beruhen Bindungsassays auf der Bindung des Analyten durch Analytrezeptoren, um die Konzentrationen des Analyten in einer Probe zu bestimmen. Diese Immunoassays können entweder als kompetitiv oder nicht-kompetitiv beschrieben werden. Nicht-kompetitive Assays verwenden im Allgemeinen Analytrezeptoren in im Wesentlichen Überschuss über die Konzentration des Analyten, der in dem Assay bestimmt werden soll. Sandwich-Assays sind Beispiele für nicht-kompetitive Assays, welche einen Analytrezeptor umfassen, der häufig an eine Festphase gebunden ist, und einen sekundären Analytrezeptor, der markiert ist, um Detektion zu erlauben. Der Analyt binden zuerst an den Anayltrezeptor, der eine feste Phase gebunden ist, und der sekundäre markierte Analytrezeptor wird dann addiert, um die Quantifizierung des Analyten zu ermöglichen. Gebundener Analyt kann leicht von ungebundenen Reagenzien separiert werden, wie zum Beispiel ungebundenem markierten ersten Analytrezeptoren, aufgrund der Verwendung eines Analytrezeptors, der an eine feste Phase gebunden ist. Kompetitive Assays schließen im Allgemeinen eine Probe ein, von der angenommen wird, dass sie den Analyt enthält, ein Analyt-Analogon-Konjugat und die Konkurrenz dieser Spezies um eine limitierte Anzahl an Bindungsstellen, die durch den Analytrezeptor bereitgestellt werden. Kompetetive Assays können weiterhin beschrieben werden als entweder homogen oder heterogen. In homogenen Assays werden alle Reaktanten, die an der Kompetition teilnehmen, zusammen gemischt und die Quantität des Analyten wird bestimmt durch seinen Einfluß auf das Ausmaß der Bindung zwischen Analytrezeptor und Analyt-Konjugat oder Analyt-Analogon-Konjugat. Das beobachtete Signal wird moduliert durch das Ausmaß dieser Bindung und kann mit der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung gebracht werden.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Methode für die Detektion der T. solium Larven-Antikörper das Erhalten biologischer Proben, wie zum Beispiel Flüssigkeiten und Gewebe, aus einem Menschen oder einem Tier für die Diagnose oder Prognose von Zystizerkose. Die Probe kann zum Beispiel aus dem Blut, der Zerebrospinalflüssigkeit, dem Urin, dem Speichel oder den Geweben eines Säugetiers, wie zum Beispiel einem Menschen oder Schwein, erhalten werden. Eine Bestimmung der Anwesenheit der Antikörper kann dann durchgeführt werden unter der Verwendung der rekombinanten oder synthetischen Polypeptide oder der antigenischen Fragmente davon, wie hierin beschrieben, als Reagenzien in Assays unter der Verwendung von Assay-Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, und schließen Methoden ein, wie zum Beispiel schnelle immunochromatographische diagnostische Tests, Western Blot-Analyse, Radioimmunoassay und ELISA-Assays.
Kits für die Detektion der Anwesenheit von T. solium, oder für die Diagnose von T. solium-assoziierter Erkrankung oder Zustand
Es werden auch Kits für die Detektion der Anwesenheit und Quantität von T. solium in einer biologischen Probe oder für die Diagnose einer T. solium-assoziierten Erkrankung oder Zustandes zur Verfügung gestellt. Die Kits können in jeder Konfiguration sein, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt ist und die für die Durchführung einer oder mehrerer der hierin beschriebenen Assays für die Detektion von T. solium in biologischen Proben oder für die Detektion oder Beobachtung von T. solium Infektion in einem Patienten oder Träger nützlich ist. Die Kits sind zweckmäßig dahingehend, dass sie viele, wenn auch nicht alle, der essentiellen Reagenzien für die Durchführung eines Assays für die Detektion von T. solium in einer biologischen Probe bereitstellen. Die Reagenzien können vor-abgemessen („pre-measured") sein und in einer stabilen Form in Gefäßen oder an einer festen Phase enthalten sein, in oder an welcher der Assay durchgeführt werden kann, wobei damit die Anzahl der Manipulationen minimiert wird, die von dem Individuum, das den Assay durchführt, ausgeführt werden. Zusätzlich kann der Assay simultan mit einem Standard, der mit dem Kit enthalten ist, durchgeführt werden, wie zum Beispiel einer vorbestimmten Menge an Antigen- oder Antikörper, so dass die Ergebnisse des Testes validiert oder gemessen werden können.
In bestimmen Ausführungsformen enthalten die Kits eines oder mehrere der rekombinanten oder synthetischen T. solium Polypeptide oder Nukleinsäuremoleküle, wie hierin beschrieben, die für die Detektion von T. solium Antikörpern oder Nukleinsäuremolekülen in einer Probe verwendet werden können. Die Kits können zusätzlich geeignete Reagenzien für die Bindung der Polypeptide an die Antikörper oder für die Hybridisierung der Nukleinsäuremoleküle an ihre entsprechenden komplementären T. solium Nukleinsäuremoleküle in der Probe, wie hierin beschrieben, und Reagenzien enthalten, die bei der Detektion der Antikörper-Polypeptid- oder Nukleinsäuremolekül-Komplexe helfen. Die Kits können zusätzlich enthalten: Ausstattung für das sichere Erhalten der Probe, ein Gefäß für das Enthalten der Reagenzien, ein Zeitbestimmungsmittel, einen Puffer für das Verdünnen der Probe und ein Kolorimeter, Reflektormeter oder Standard, gegen welchen eine Farbänderung gemessen werden kann.
In spezifischen Ausführungsformen sind die Reagenzien einschließlich der Polypeptide lyophilisiert, zum Beispiel in einem einzigen Gefäß. Die Addition von wässriger Probe zu dem Gefäß resultiert in der Solubilisierung der lyophilisierten Reagenzien, was dazu führt, dass sie reagieren. In bestimmten spezifischen Beispielen sind die Reagenzien sequenziell lyophilisiert in einem einzigen Behälter in Übereinstimmung mit Methoden, welche die Reaktion der Reagenzien vor der Addition der Probe minimieren. Solche Methoden sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt.
Spezifische Beispiele für Assay-Kits schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Reagenzien, die in einer oder mehreren der folgenden Techniken verwendet werden: kompetitive und nicht-kompititive Assays, Radioimmunoassay, Biolimuneszenz- und Chemilumineszenz-Assays, fluorometrische Assays, Sandwich-Assays, immunoradiometrische Assays, Dot Blots, Enzym-verbundene Assays, einschließlich Immunoblots und ELISA und Immunozytochemie. Materialien, die in Zusammenhang mit diesen Techniken verwendet werden, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Mikrotiterplatten, Antikörper-beschichtete Streifen („strips") oder Messstäbe („dipsticks") für die schnelle Überwachung von Urin oder Blut. Für jeden Kit werden der Bereich, die Sensitivität, die Präzision, die Verlässlichkeit, die Spezifität und Reproduzierbarkeit des Assays etabliert.
In einer anderen Ausführungsform verwendet der Assay-Kit Immunoblot-Techniken und stellt Instruktionen und rekombinante T. solium Larven-Polypeptide, die an eine detektierbares Molekül konjugiert sind, zur Verfügung. Der Kit ist nützlich für die Detektion und Messung von T. solium in biologischen Flüssigkeiten und Gewebeextrakten von Tieren und Menschen, um Zystizerkose oder Neurozystizerkose zu diagnostizieren oder zu überwachen.
Immunologische und pharmazeutische Zusammensetzungen
Immunologische Zusammensetzungen, einschließlich immunologische Auslöser-Zusammensetzungen und Impfstoffe, und andere pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend die T. solium Polypeptide oder antigenischen Fragmente davon, wie hierin beschrieben, sind nützlich für die Reduktion oder möglicherweise Verhinderung von T. solium Infektion oder Übertragung. Eines oder mehrere der Polypeptide, wie hierin beschrieben, werden formuliert und verpackt allein oder in Kombination mit Adjuvantien oder anderen Antigenen unter der Verwendung von Methoden und Materialien, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Impfstoffe bekannt sind. Die immunologische Antwort kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden und kann Antikörperimmunität oder zelluläre Immunität zur Verfügung stellen, wie zum Beispiel diejenige, die durch T-Lymphozyten, wie zum Beispiel cytotoxische T-Lymphozyten oder CD4⁺ T-Lymphozyten, produziert wird.
Um Immunogenizität zu verstärken, können eines oder mehrere der Polypeptide mit einem Trägermolekül konjugiert werden. Geeignete immunogene Träger schließen ein Proteine, Polypeptide oder Peptide, wie zum Beispiel Albumin, Hämocyanin, Thyroglobulin und Derivate davon, insbesondere Rinderserum-Albumin (BSA) und Keyhole-Limpet Hämocyanin (KLH), Polysaccharide, Kohlenwasserstoffe, Polymere und feste Phasen. Andere von Proteinen abgeleitete oder nicht von Proteinen abgeleitete Substanzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Ein immunogener Träger hat typischerweise ein Molekulargewicht von mindestens 1.000 Daltons und in einigen Ausführungsformen mehr als 10.000 Daltons. Trägermoleküle enthalten oftmals eine reaktive Gruppe, um die kovalente Konjugation an das Hapten zu ermöglichen. Die Carboxylgruppe oder Aminogruppe von Aminosäuren oder die Zuckergruppen von Glycoproteinen werden oftmals auf diese Weise verwendet. Träger, denen solche Gruppen fehlen, können oftmals mit einer geeigneten Chemikalie reagiert werden, um diese zu produzieren. Alternativ dazu kann ein multiples antigenisches Polypeptid, umfassend multiple Kopien des Proteins oder Polypeptids, oder ein antigenisches oder immunologisch äqui valentes Polypeptid ausreichend antigenisch sein, um die Immunogenizität ohne die Verwendung eines Trägers zu verbessern.
Die T. solium Polypeptide können mit einem Adjuvans in einer Menge verabreicht werden, die effektiv ist, um die immunogene Antwort gegen das Konjugat zu verstärken. Zu dieser Zeit war das einzige Adjuvans, was in Menschen weit verbreitet verwendet wurde, Alum (Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid). Saponin und seine gereinigte Komponente Quil A, Freund's vollständiges Adjuvans und anderen Adjuvantien, die in der Forschung und veterinären Anwendungen verwendet werden, weisen Toxizitäten auf, welche ihre potentielle Verwendung in humanen Impfstoffen limitieren. Jedoch können chemisch definierte Präparationen, wie zum Beispiel Muramyl-Dipeptid, Monophosphoryl-Lipid A, Phospholipid-Konjugate, wie diejenigen beschrieben von Goodman-Snitkoff et al. (J. Immunol. 147: 410–415, 1991), Verkapselung des Konjugates mit einem Proteoliposom, wie beschrieben von Miller et al. (J. Exp. Med. 176: 1739–1744, 1992) und Verkapselung des Proteins in Lipidvesikel auch nützlich sein.
Der Begriff „Impfstoff", wie hierin verwendet, schließt DNA-Impfstoffe ein, in welchen das Nukleinsäuremolekül, das T. solium Polypeptide kodiert, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten verabreicht wird. Für die genetische Immunisierung schließen geeignete Zuführungsmethoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, direkte Injektion von Plasmid-DNA in Muskel (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. 1: 363, 1992), die Zuführung von DNA, komplexiert mit spezifischen Proteinträgern (Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985, 1989), Co-Präzipitation von DNA mit Kalziumphosphat (Benvenisty and Reshef, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 9551, 1986), Verkapselung von DNA in Liposomen (Kaneda et al., Science 243: 375, 1989), Partikel-Beschuß (Tang et al., Nature 356: 152, 1992) und (Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. 12: 791, 1993) und in vivo Infektion unter der Verwendung von klonierten retroviralen Vektoren (Seeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 5849, 1984) ein.
In einer bestimmten Ausführungsform wird ein Impfstoff in einer einzelnen Dosierung für die Immunisierung mittels parenteraler (d. h. intramuskulärer, intradermaler oder subkutaner) Verabreichung oder nasopharyngealer (d. h. intranasaler) Verabreichung verpackt. In bestimmten Ausführungsformen wird der Impfstoff intramuskulär in den Deltamuskel injiziert. Der Impfstoff kann mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger kombiniert sein, um die Verabreichung zu unterstützen. Der Träger ist zum Beispiel Wasser, oder eine gepufferte Sa line mit oder ohne ein Konservierungsmittel. Der Impfstoff kann für die Resuspendierung zur Zeit der Verabreichung lyophilisiert sein oder in Lösung sein.
Der Träger, an welchen das Polypeptid konjugiert sein kann, kann auch ein polymeres verzögertes Freisetzungssystem sein. Synthetische Polymere sind insbesondere nützlich bei der Formulierung eines Impfstoffes, um die kontrollierte Freisetzung der Antigene zu bewirken.
Mikroverkapselung des Polypeptids wird auch eine kontrollierte Freisetzung ergeben. Eine Reihe von Faktoren tragen bei der Selektion eines bestimmten Polymers für die Mikroverkapselung bei. Die Reproduzierbarkeit der Polymersynthese und des Mikroverkapselungsprozesses, die Kosten für das Mikroverkapselungsmaterial und den Prozess, das toxikologische Profil, die Voraussetzungen für variable Freisetzungskinetiken und die physikochemische Kompatibilität des Polymers und der Antigene sind alles Faktoren, die berücksichtigt werden müssen. Beispiele für geeignete Polymere sind Polycarbonate, Polyester, Polyurethane, Polyorthoester-Polyamide, Poly(d,l-Lactid-co-glycolid) (PLGA) und andere bioabbaubare Polymere.
Die Dosis für humane Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Impfstoffes kann von ungefähr 0,01 mg/kg bis 10 mg/kg, zum Beispiel ungefähr 1 mg/kg betragen. Basierend auf diesem Bereich können äquivalente Dosierungen für schwerere Körpergewichte bestimmt werden. Die Dosis sollte eingestellt werden, um sich für das Individuum zu eignen, an welches die Zusammensetzung verabreicht wird, und kann mit dem Alter, dem Gewicht und dem Metabolismus des Individuums variieren. Solche Bestimmungen werden dem betreuenden Arzt oder einer anderen Person überlassen, die mit dem Patienten und/oder der spezifischen Situation vertraut ist. Der Impfstoff kann zusätzlich Stabilisatoren oder physiologisch akzeptable Konservierungsmittel enthalten, wie zum Beispiel Thimerosal (Ethyl (2-Mercaptobenzoat-S) Quecksilber Natriumsalz) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).
Diese Erfindung wird weiter illustriert durch das folgende Beispiel, welches in keiner Weise so verstanden werden soll, dass es deren Umfang limitieren soll. Im Gegensatz dazu, wird es klar verstanden werden, dass nach dem Lesen der Beschreibung hierin auf verschiedene andere Ausführungsformen, Modifikationen und Äquivalente davon zurückgegriffen werden kann, welche sich selbst dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet vorschlagen, ohne vom Geist der vorliegenden Erfindung und/oder Umfang der angefügten Ansprüche abzuweichen.
Beispiel 1
Expression und Analyse von 50 kDa T. solium Polypeptidketten
Die kodierenden Regionen für drei reife gp50-Polypeptide, die in den SEQ ID NOs: 1, 3 und 5 dargestellt sind, wurden in den Expressionsvektor pBlueBac4.5/V5-His TOPO, einen Baculuvirus-Transfervektor, subkloniert. Rekombinanter Virus, enthaltend die Sequenz für gp50, wurde durch Kotransfektion des Transfervektors mit Bac-N-Blue AcMNPV linearer DNA, ein modifizierter Baculuvirus-Vektor, in Sf9 Insektenzellen gebildet. Nach der Reinigung des rekombinanten Virus wurden Sf9 Zellen infiziert und 96 Stunden nach der Infektion geerntet. Gesamtzelllysate von den Kulturen, die mit dem rekombinanten Virus infiziert waren, und von Kulturen, die mit Wildtypvirus infiziert waren, wurden mittels Immunoblot analysiert.
Die Lysate wurden auf SDS-PAGE aufgelöst, auf Nitrozellulose ge-blotted und sondiert mit Zystizerkose-Infektionsseren, einem Serum eines Einheimischen aus Alaska, der eine Echinococcus mulilocularis Infektion hatte, und Seren von gesunden Menschen, die in den Vereinigten Staaten leben und keine Reisegeschichte aufwiesen. Die Anit-Zystizerkose-Antikörper erkannten spezifisch die rekombinanten gp50-Proteine, welche auf dem SDS-PAGE bei ungefähr 31 kDa migrierten. Es wurde keine Reaktivität mit rekombinantem GP50 bei mit dem Echinococcus-Infektionsserum oder den normalen humanen Seren gesehen. Es wurde keine Reaktivität gesehen mit einer Bande an derselben Position in den mit Wildtypvirus infizierten Zellen.
Zusätzlich wurden in einer zweiten kleinen Studie, die 19 Seren verwendet, rekombinantes gp50 von allen fünf normalen oder heterologen Infektionsseren, die getestet wurden, nicht erkannt. Das rekombinante gp50 wurde von 4 aus 4 Seren erkannt, die mit synthetischem Ts14 negativ waren, was anzeigt, dass gp50 hochsensitiv und spezifisch ist; und rekombinantes gp50 wurde von 10 aus 10 Seren aus bestätigten infizierten Fällen erkannt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung, umfassend mindestens ein synthetisches Polypeptid der T. solium-Larve, das mit anti-T. solium-Larven-gp50-Antikörpern immunreaktiv ist, oder ein antigenisches Fragment oder Analogon eines solchen Polypeptids, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie gezeigt in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid durch ein Nukleinsäuremolekühl, das eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, kodiert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekühl, kodierend ein Polypeptid in der Zusammensetzung nach Anspruch 1.
Isoliertes Nukleinsäuremolekühl nach Anspruch 4, umfassend eine Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5.
Zusammensetzung für die Detektion der Anwesenheit von T. solium in einer biologischen Probe, umfassend eine Nukleinsäuresonde, umfassend eine Sequenz von 10 oder mehr zusammenhängenden Nuldeotiden, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, zu hybridisieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Nukleinsäuresonde eine Sequenz umfaßt, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5.
Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von T. solium in einer biologischen Probe, umfassend das Kombinieren der Probe mit einer detektierbaren Nukleinsäuresonde, die zur Hybridisierung mit einer Nukleinsäure, kodierend ein gp50-Polypeptid, in der Lage ist, und Detektieren der hybridisierten Sonde, wobei die Nukleinsäuresonde mit einer Sequenz hybridisiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die biologische Probe eine humane oder tierische Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die biologische Probe eine Zellprobe, eine Gewebeprobe oder eine biologische Flüssigkeit umfaßt.
Verfahren zur Detektion von T. solium-Antikörpern in einer biologischen Probe, umfassend das Kombinieren der Probe mit einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und Detektieren der Bildung eines Komplexes zwischen dem Polypeptid und dem Antikörper in der Probe, wobei die Anwesenheit eines Antikörper-Polypeptid-Komplexes die Anwesenheit von T. solium-Antikörpern in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 11, weiterhin umfassend das in Kontakt bringen der Probe mit einem zweiten Polypeptid der T. solium-Larve, wobei das zweite Polypeptid gp42, gp24, gp21, gp18, gp14 oder gp13 ist.
Verfahren nach Anspruch 11, welches ein Verfahren zur Diagnose einer T. solium-assoziierten Erkrankung oder Zustandes in einem Säugetier ist, und wobei die Anwesenheit von T. solium-Antikörpern in der Probe die T. solium-assoziierte Erkrankung oder Zustand in dem Säugetier anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die T. solium-assoziierte Erkrankung oder Zustand Cysticercose oder Neurocysticercose ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder eine Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekühl, kodierend ein Polypeptid der T. solium-Larve der Zusammensetzung nach Anspruch 1 für die Verwendung in einem Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort gegen ein antigenisches Epitop in einem Subjekt, wobei das Verfahren das Einführen der Zusammensetzung in das Subjekt umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die ausgelöste Immunantwort zu einer verringerten Empfindlichkeit des Subjektes gegenüber der Infektion durch T. solium führt.