MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA DETECTAR TAENIA SOLIUM LARVAL DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se hizo por el Centro para la Prevención y Control de Enfermedades, una agencia del Gobierno de los Estados Unidos. Por lo tanto, el Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención. La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular e inmunología y más específicamente se refiere a composiciones y métodos para diagnosticar cisticercosis. En particular, la invención pertenece a antígenos de Taenia solium sintéticos o recombinantes y su uso en inmunoensayos. La cisticercosis de Taenia solium, causada por la infección con quistes larvales de T. solium, ocurre en humanos y cerdos, resultando en penalidades económicas y de salud pública significativa. T. soli um, también referida como la solitaria del puerco, es un helminto que existe en una forma de solitaria madura y una forma larval. El ciclo de vida de T. soli um comienza cuando el cerdo, el huésped intermediario, ingiere huevos de solitaria excretados en las heces de un portador de solitaria. Las larvas se crían desde los huevos e invaden la mayoría de los tejidos del cerdo, dando origen a la enfermedad cisticercosis. Cuando los humanos ingieren carne cruda o medio cocida a partir de cerdo cisticercótico, se desarrollan
tenias, o teniasis. Los pacientes con teniasis pueden presentar incomodidad epigástrica, náusea, irritabilidad, diarrea y pérdida de peso. Además, los proglótidos, o segmentos individuales de la tenia que son unidades reproductivas hermafrodíticas autocontenidas, puede construir el apéndice, conducto biliar, o conducto pancreático. Los humanos también pueden ingerir huevos de T. solium presentes en alimento y agua contaminada y sirven como huéspedes intermediarios. Después de que se ingieren los huevos de T. solium, los cisticercos pueden desarrollarse en los tejidos subcutáneos, músculos, corazón pulmones, hígado cerebro y ojos. Aunque números pequeños de cisticercos viables fallan en producir los síntomas en el huésped infectado, la muerte de las larvas estimula una reacción inflamatoria marcada, fiebre, dolores musculares, y eosinofilia. Si las larvas invaden el sistema nervioso central, el huésped puede desarrollar meningoencefalitis, accesos epilépticos, demencia y otras manifestaciones neurológicas o psiquiátricas, y puede resultar en la muerte a partir de la hipertensión intracraneal aguda. Las diversas manifestaciones de la disfunción neurológica causada por la infección de T. solium se denominan colectivamente neurocisticercosis. Aunque la neurocisticercosis puede incluir muchos síntomas neurológicos, la epilepsia es el síntoma más común. De hecho, T. solium se considera la causa
infecciosa líder de los accesos epilépticos mundialmente . Adicionalmente, la neurocisticercosis de T. solium tiene un número de víctimas mundial común de 50 millones de casos con 50,000 muertes cada año. La neurocisticercosis se adquiere raramente en los
Estados Unidos; sin embargo, la enfermedad es común en Latinoamérica, Asia, Rusia y Europa Oriental. En México, la proporción media de puercos cisticercóticos en los rastros inspeccionados durante 1980-1981 fue 1.55%, y en áreas rurales de México y Sudamérica en donde está limitado el desecho de aguas negras, el número de puercos cisticercóticos puede estar en exceso de 50%. En éstos y otros países en desarrollo, el parásito causa una carga económica considerable a la industria porcina. Adicionalmente, debido a los crecientes viajes de inmigraciones a partir de áreas altamente endémicas, la detección y tratamiento de las enfermedades relacionadas a T. soli um se ha vuelto una prioridad de salud pública en los Estados Unidos. El diagnóstico se atuvo históricamente a la identificación histológica del parásito por biopsia o autopsia. El desarrollo reciente de métodos radiológicos y serológicos ha mejorado el diagnóstico. Sin embargo, mientras que los métodos radiológicos tales como tomografía computarizada (CT) o imágenes de resonancia magnética nuclear son útiles para diagnosticar neurocisticercosis, también son
í, Í-.i. -i Jl. Jy iíaá.y..,y¿y ¿.-i ^^gg/ frecuentemente caros o inaccesibles en países en desarrollo. Aunque algunas pruebas de diagnóstico están comunmente disponibles para identificar la infección de T. solium y diagnosticar neurocisticercosis, estas pruebas, tales como la descrita en la Patente Norteamericana No. 4,740,456 para Kuhn et al . , carece de especificidad y sensibilidad. Una prueba más específica y sensible para diagnosticar neurocisticercosis humana detectando la presencia de larvas de T. soli um usando tinción de inmunoelectotransferencia (EITB) se describe en la Patente Norteamericana No. 5,354,660 para Tsang et al . Sin embargo, la prueba utiliza glicoproteínas de T. solium larval, que ocurren naturalmente, purificadas, antígenos no producidos recombinántemente, haciendo con eso difíciles y caros de producir los reactivos de la prueba. En países en desarrollo en donde las enfermedades relacionadas a T. solium son endémicas, el acceso a pruebas de diagnóstico pueden limitarse debido al alto costo de usar antígenos producidos usando un procedimiento de purificación complicado. Además, debido a que la cisticercosis es más prevaleciente en áreas rurales de los países en desarrollo, se necesita una prueba de campo para estudios y vigilancia epidemiológica. Una prueba de campo sería una herramienta importante para romper el ciclo de transmisión del parásito, permitiendo el diagnóstico en el lugar de los cerdos infectados y el tratamiento inmediato con
agentes anti-helminticos tales como oxfendazol. ün diagnóstico de campo de la cisticercosis serviría también como un beneficio económico a los criadores de cerdos, debido a que los cerdos no infectados rigen un precio mayor. Por lo tanto existe una necesidad de inmonoensayos sensibles, específicos, y baratos que contengan reactivos estables que puedan detectar y medir T. soli um larval en la clínica, laboratorio, y campo. Se proporcionan composiciones y métodos para detectar y diagnosticar Taenia solium. Las composiciones contienen polipéptidos de T. soli um recombinantes o sintéticos. Los polipéptidos son útiles en inmunoensayos para la detección de T. solium larval en muestras biológicas. Los polipéptidos son antígenos larvales producidos recombinántemente o sintéticamente que tienen las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la presente y pesos moleculares de aproximadamente 14 kDa, 18 kDa y 21 kDa, como se determina por análisis de SDS-PAG, o fragmentos antigénicos del mismo. Los polipéptidos que ocurren naturalmente correspondientes, son subunidades de glicoproteínas de T. solium más grandes y se refieren en la presente como TS-14, TS-18 Y TSRS-1, respectivamente. El polipéptido larval recombinante de 14 kDa se codifica preferiblemente por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC. DE IDENT. NO.: 1 y tiene la secuencia de aminoácido
de SEC. DE IDENT. NO.: 2. El polipéptido larval recombinante de 18 kDa se codifica preferentemente por la secuencia de ácido nucleico de SEC. DE IDENT. NO.: 3 y tienen la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO.: 4. El polipéptido larval recombinante de 21 kDa se codifica preferentemente por la secuencia de ácido nucleico de SEC. DE IDENT. NO.: 5 y tienen la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO.: 6. Los polipéptidos sintéticos o recombinantes que tienen las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos anteriores, o fragmentos antigénicos de los mismos, son útiles en inmunoensayos para la detección de T. solium . Las secuencias de aminoácido proporcionadas en la presente son útiles para la síntesis de los antígenos o fragmentos antigénicos que usan técnicas de síntesis químicas bien conocidas. Las moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos larvales son útiles para la producción recombinante de los antígenos y fragmentos de antígeno y también son útiles como sondas moleculares o cebadores para la detección de ácido ribonucleico (ARN) y ácido desoxirribonucleico (AD?) involucrado en la transcripción y traducción de péptidos de T. soli um. Estas sondas moleculares o cebadores proporcionan medios para detectar y medir polipéptidos de T. solium en tejidos y células. Los polipéptidos de T. soli um recombinantes o
sintéticos pueden usarse en equipos de diagnóstico para determinar la presencia y cantidad de anticuerpos de T. solium que es diagnóstico o pronóstico para la ocurrencia o recurrencia de las enfermedades tales como cisticercosis y neurocisticercosis. Los polipéptidos de T. solium también pueden administrarse a un humano o animal en una composición farmacéutica para inmunizar el humano o animal en contra de la infección de T. soli um, reduciendo o previniendo con eso la enfermedad relacionada de T solium. Los métodos preferidos proporcionados en la presente son inmunoensayos dirigidos hacia la detección de anticuerpos de T. solium en muestras biológicas tales como fluidos y tejidos biológicos de humanos y animales. Los métodos alternativos preferidos son la hibridización de ácido nucleico o las pruebas de amplificación dirigidas hacia la detección de antígenos de T. solium en muestras biológicas. En una modalidad preferida, un inmunoensayo emplea uno o más de los polipéptidos larvales recombinantes o sintéticos, o fragmentos antigénicos de los mismos, para la detección de anticuerpos anti-larvales en una muestra biológica. El inmunoensayo preferido es una inmunotinción que contiene antígenos larvales recombinantes, o fragmentos antigénicos de los mismos, inmunoreactivos con anti-cuerpos T. solium en una muestra biológica. Pueden desarrollarse métodos y equipos analíticos y
de diagnóstico para la detección y medición de los anticuerpos de antígenos de T. soli um en una diversidad de muestras. Los métodos y equipos pueden estar en cualquier configuración bien conocida a aquéllos de experiencia común en la técnica. En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar métodos para detectar portadores de T. soli um y prevenir así la propagación de T. soli um de un huésped a otro. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para la detección de T. solium, particularmente el diagnóstico u observación de la infección de T. solium en humanos y animales, que es barato, sensible y preciso, con poca o ninguna reactividad cruzada. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método sencillo, sensible para el diagnóstico de cisticercosis o neurocisticercosis . Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar una prueba rápida, sencilla, y barata para la detección de larvas de T., solium que tiene una larga vida de anaquel, un tiempo de ensayo corto, y reactivos estables que pueden utilizarse en el campo, y los resultados pueden interpretarse sin el uso de instrumentación o condiciones de temperatura especiales, lo cual es óptimo para uso en países pobres subdesarrollados en donde la T. solium es
frecuentemente endémica. Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención se volverán aparentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las modalidades descritas y las reivindicaciones anexas. Se proporcionar composiciones y métodos para detectar la infección de T. solium y diagnosticar enfermedades relacionadas con la infección de T. soli um. Las composiciones son polipéptidos recombinantes o sintéticos, inmunogénicos, o inmunodominantes de las larvas del helminto T. solium, principalmente los polipéptidos referidos en la presente como TS-14, TS-18, y TSRS-1, o fragmentos antigénicos de los mismos. Se proporcionan las secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácido de los polipéptidos de larvas de T. soli um. Los polipéptidos de T. solium recombinante son útiles como reactivos de diagnóstico en los inmunoensayos descritos posteriormente. Los polipéptidos son también útiles in vitro como herramientas de investigación para estudiar T. soli um en general y enfermedades relacionadas a T. solí um tales como cisticercosis. Adicionalmente, los polipéptidos pueden ser útiles en composiciones farmacéuticas tales como vacunas . Los métodos proporcionados en la presente son pruebas para la detección o cuantificación de anti-cuerpos T.
solium o moléculas de ácido nucleico de T. solium en una muestra tal como un fluido o tejido humano o animal. Los polipéptidos de T. soli um recombmantes o sintéticos, o fragmentos antigénicos de los mismos, o moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de T. soli um, o sondas y cebadores de los mismos, se usan como reactivos en las pruebas. Definiciones Los términos "un/una", "uno/una" y "el/la" como se usa en la presente se definen para significar "uno o más" e incluye el plural a menos que el contexto sea inapropiado. Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína", como se usan en la presente, son intercambiables y se definen para significar una biomolécula compuesta de dos o más aminoácidos enlazados por un enlace peptídico. El término "antígeno" se refiere a una entidad o fragmento del mismo que puede inducir una respuesta inmune en un mamífero. El término incluye inmunógenos y regiones responsables de antigenicidad o determinantes antigénicos. "Determinante antigénico" se refiere a una región de proteína de T. soli um reconocida por un anticuerpo. Como se usa en la presente, el término "cebador de ADN complementario" significa un oligonucleótido que se fija a una molécula de ácido nucleico en una orientación particular para permitir la síntesis de una hebra de ADN
naciente en la presencia de una polimerasa bajo las condiciones descritas en la presente. También como se usa en la presente, la "condición" o "condiciones" bajo las cuales se sintetiza una hebra de ADN incluyen la presencia de nucleótidos, cationes y agentes reguladores apropiados en cantidades y a temperaturas tales que la molécula de ácido nucleico y el cebador de ADN se fijarán y los oligonucleótidos se incorporarán dentro de una hebra de ADN sintetizada. Como se usa en la presente, el término "par cebador" se refiere a dos cebadores, uno que tiene una designación hacia delante y el otro tiene una designación inversa en relación a sus orientaciones respectivas sobre una molécula de ADN de hebra doble que consiste de una secuencia de sentido y antisentido, tal que bajo las condiciones de amplificación descritas en la presente, el cebador hacia delante se fuija y ceba la amplificación de la secuencia de sentido y el cebador inverso se enfría y ceba la amplificación de la secuencia antisentido. Los cebadores pueden seleccionarse para uso en la reacción de amplificación sobre la base de tener menos del 50% de contenido de G-C, teniendo complementariedad mínima con otros cebadores en la reacción (para minimizar la formación de dímeros cebadores) y teniendo valores de Tm con el rango de temperaturas de reacción apropiados para el método de amplificación,
preferentemente PCR. Además, los cebadores pueden seleccionarse para fijarse con regiones específicas de la plantilla de ADN o ARN tal que el producto de amplificación de ADN resultante varía en tamaño de 100 a 5000 pares de base de longitud y más preferentemente alrededor de 300 pares de base de longitud o más largos. Como se usa en la presente, "detectar" o "detección" se refiere a determinar cuantitativamente o cuantitativamente la presencia de la biomolécula bajo investigación. Por "aislado" se quiere decir una molécula biológica libre de al menos algunos de los componentes con los cuales ocurre naturalmente. Por "sonda" se quiere decir una secuencia de ácido nucleico que puede usarse para la hibridización selectiva con secuencias de ácidos nucleicos complementarias para su detección. La sonda puede variar en longitud de aproximadamente 5 a 100 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos, más preferentemente aproximadamente 18 a 24 nucleótidos. Los términos "sonda" o "sondas" como se usa en la presente se definen para incluir "cebadores" . El término "anticuerpos" como se usa en la presente, incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena sencilla, biespecíficos, simianizados, y anticuerpos humanizados así como fragmentos Fab, que incluyen los productos de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina Fab. Polipéptidos o Fragmentos polipeptídicos de Taenia solium Las composiciones proporcionadas en la presente son polipéptidos de T. solium recombinantes o sintéticos que son inmunoreactivos con anticuerpos de T. soli um. Los anticuerpos de T. solium se derivan preferiblemente a partir de los cuerpos, saliva, fluido cerebroespinal u orina de pacientes infectados con T. solium. Más preferiblemente, los anticuerpos se derivan a partir de sueros de pacientes con T. solium. Los polipéptidos recombinantes o sintéticos corresponden a glicoproteínas que ocurren naturalmente que tienen pesos moleculares de aproximadamente 14 kDa, 18 kDa y 21 kDa. Los polipéptidos, referidos en la presente como TS- 14, TS-18 y TSRS-1, contienen las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el Listado de Secuencias Anexo como SEC. DE IDENT. NO.: 2, 4 y 6, respectivamente, y se codifican preferentemente por las secuencias de ácido nucleico indicadas en SEC. DE IDENT. NO.: 1, 3 y 5. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica, que los polipéptidos preferidos incluyen análogos de polipéptidos, que se definen en la presente como péptidos antigénicos que contienen secuencias de aminoácidos que difieren de la SEC. DE IDENT. NO. : 2, 4, o 6 por una substitución de aminoácido en
cualquier posición o que tienen otras moléculas agregadas a los grupos funcionales aminoácidos. Los polipéptidos están altamente cargados y polares, y son ricos en lisina. Los residuos de lisina contribuyen a puntos isoeléctricos relativamente altos, 9.25, 8.45 y 8.95 para TS-14, TS-18 y TSRS-1, respectivamente. TS-14 tiene un sitio de glicosilación N-enlazado potencial y TS-18 contiene tres sitios. TSRS-1 tiene un sitio de amidación. Los polipéptidos TS-14 y TS-18 contienen uno y dos residuos de cisteína, respectivamente. Los polipéptidos preferidos también incluyen fragmentos de los polipéptidos que tiene la misma antigenicidad o el equivalente funcional de los mismos, referido en la presente como fragmentos antigénicos. Preferentemente, los fragmentos antigénicos contienen secuencias de aminoácido que son homologas o considerablemente homologas a dos o los tres polipéptidos antigénicos. Más preferentemente, los fragmentos antigénicos contienen secuencias de aminoácidos que son homologas o considerablemente homologas a TS-14 y TS-18 tales como, pero no limitadas a, las siguientes secuencias: lAQLAK (SEC. DE IDENT. NO.: 7), KNKPKDD/VAASTKKE/GIEYI/V /HH/R (N) FFF (SEC. DE IDENT. NO.: 8), GIEYV/IHE/N (W) FFHE/DD (SEC. DE IDENT. NO.: 9) . Más preferentemente, el fragmento antigénico contiene la secuencia de aminoácido indicada en SEC. DE IDENT. NO.: 7. Los polipéptidos de T. soli um descritos en la
presente tienen una diversidad de usos. Por ejemplo los polipéptidos o fragmentos polipeptídicos se usan como reactivos en inmunoensayos para la detección de anticuerpos de T. solium como se describe en más detalle posteriormente. Además, los polipéptidos de T. solium pueden emplearse para desarrollar columnas de afinidad para aislar anticuerpos de T. solium. También, los polipéptidos que se enlazan a anticuerpos de T. soli um con alta especificidad y avidez pueden marcarse con una marca o grupo reportero y emplearse para la visualización y cuantificación en las pruebas descritas en la presente usando técnicas de detección tales como técnicas autoradiográficas y de enlace de membrana. El grupo reportero marca es comúnmente un grupo fluorescente o radioactivo o una enzima. Dichas aplicaciones proporcionan importantes herramientas de diagnóstico e investigación. Moléculas de Acido Nucleico Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de T. solium descritas anteriormente y las sondas o cebadores que se hibridizan a las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de T. soli um se proporcionan. Las moléculas de ácido nucleico preferidas son aquellas que tienen secuencias que codifican los polipéptidos de T. solium larval TS-14, TS-18, y TSRS-1, o fragmentos de los mismos, y se proporciona en el Listado de Secuencias Adjunto como SEC. DE IDENT. NO.: 1, 3, y 5, respectivamente.
Las moléculas de ácido nucleico son útiles para la producción de polipéptidos recombinantes. Debido a que los métodos recombinantes de producción de polipéptidos producen grandes cantidades de polipéptidos que requieren menos purificación, los polipéptidos recombinantes son frecuentemente menos caros de producir que los polipéptidos producidos usando técnicas de aislamiento o purificación tradicionales. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los péptidos de T. solium pueden insertarse dentro de un vector, tal como un plásmido, y expresarse recombinántemente en un organismo vivo para producir péptidos de T. soli um recombinantes de acuerdo con métodos bien conocidos a aquellos expertos en la técnica como se describe en más detalle posteriormente. Las moléculas de ácido nucleico también son útiles como sondas de ácido nucleico o cebadores para la detección de la infección de T. solium en un espécimen biológico con alta sensibilidad y especificidad. Las sondas o cebadores pueden usarse para amplificar o detectar moléculas de ácido nucleico de T. solium en la muestra, cuantificar la cantidad de T. solium en la muestra, diagnosticar la infección o determinar la contaminación con T. solium, u observar el progreso de las terapias usadas para tratar la infección. Las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente son también útiles como herramientas de investigación de laboratorio para estudiar el organismo y la enfermedad y para
Íyy..á j Ai.t desarrollar terapias y tratamientos para la enfermedad. Las sondas de ácido nucleico o cebadores proporcionados en la presente se hibridizan selectivamente con moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos descritos en la presente o secuencias complementarias de los mismos. La hibridización puede lograrse bajo diversas temperatura o condiciones, conforme a la temperatura de disociación (Td) de las moléculas que se hibridizan y la severidad requerida para el enlace específico. Las moléculas pueden hibridizarse una con otra en cualquier orden o preferiblemente al mismo tiempo. Las condiciones de reacción para la hibridización de un oligonucleótido, o polinucleótido, a una secuencia de ácido nucleico varía de oligonucleótido a oligonucleótido, dependiendo de factores tales como longitud del oligonucleótido, el número de nucleótidos G y C, y la composición del regulador utilizado en la reacción de hibridización. Las condiciones de hibridización moderadamente severas entienden generalmente por aquellos expertos en la técnica como condiciones aproximadamente 25°C abajo de la temperatura de fusión de un ADN de hebra doble de pares de bases a la perfección. La especificidad superior se logra generalmente empleando condiciones de incubación que tienen temperaturas superiores, en otras palabras condiciones más severas. Bajo condiciones de hibridización extremadamente severas, solamente oligómeros
-3k; que son completamente complementarios uno con otro permanecerán hibridizados uno con otro. En general, mientras más larga la secuencia o superior el contenido de G y C, mayor la temperatura requerida o la concentración de sal 5 permitida. El capítulo 11 del bien conocido manual de laboratorio de Sambrook et al . , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), describe condiciones de hibridización para sondas y cebadores de
10 oligonucleótido en mayor detalle, incluyendo una descripción de los factores involucrados y el nivel de severidad necesario para garantizar la hibridización con especificidad. Si se usa como cebadores, la composición incluye preferiblemente al menos dos moléculas de ácido nucleico que
15 se hibridizan a diferentes regiones de la molécula objetivo para amplificar una región deseada. Dependiendo de lá longitud de la sonda o cebador, la región objetivo puede variar entre 70% de bases complementarias y complementariedad completa y aún hibridizarse bajo condiciones severas. 20 Preferiblemente, las sondas o cebadores de ácido nucleico que se hibridizan descritas en la presente tienen al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, y 99% de complementariedad con el segmento de la secuencia al cual se hibridizan. Para el propósito de determinar la presencia de T. soli um, el grado
25 de complementariedad entre el ácido nucleico que se hibridiza
(sonda o cebador) y la secuencia a la cual se hibridiza es al menos suficiente para distinguir la hibridización con un ácido nucleico de otros organismos. Cada sonda o cebador es preferentemente una molécula de ADN que tiene una longitud de 20 a 40 nucleótidos. Más preferentemente, la longitud del cebador es de 25 a 35 nucleótidos. La longitud del cebador más preferida es 27 a 29 nucleótidos. La amplificación del ADN sintetizado puede detectarse por cualquier método para la detección de ADN conocido en la técnica tal como la prueba de hibridización de tinción Southern, por visualización de los productos de amplificación de ADN de peso molecular específico en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio, por medición de la incorporación de nucleótidos radiomarcados dentro de la hebra de ADN sintetizado por autoradiografía o medición de centelleo, por ELISA modificado para la captura de una porción detectable unida al ADN amplificado, o cualquier otro método de detección conocido a uno de experiencia común en la técnica. El método de detección preferido es por hibridización de ADN amplificado a una oligosonda específica interna usando técnicas tales como ELISA, hibridización de tinción Southern o métodos similares. La invención contempla secuencias, sondas y cebadores que se hibridizan selectivamente al ácido nucleico
que codifica, o la hebra complementaria u opuesta del ácido nucleico como aquells específicamente proporcionadas en la presente. La hibridización específica con ácido nucleico puede ocurrir con modificaciones o sustituciones menores en el ácido nucleico, siempre y cuando se mantenga la capacidad de hibridización específica para especies funcionales. Se proporcionan en la presente ácidos nucleicos aislados que se hibridizan selectivamente con los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos bajo condiciones estringentes y deben tener al menos cinco nucleótidos complementarios a la secuencia de interés como se describe por Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que los polipéptidos de T. solium descritos en la presente también se codifican por secuencias considerablemente similares a las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en el listado de secuencias. Por "considerablemente similar" se quiere decir una secuencia de ácido nucleico (que incluye ADN y ARN) la cual, por virtud de la degeneración del código genético, no es idéntica con la mostrada en cualquiera de SEC. DE IDE?T. ?O. : 1, 3 ó 5, pero que aún codifica la misma secuencia de aminoácidos; o una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos diferente pero
retiene las actividades o antigenicidad de las proteínas, debido a que un aminoácido se reemplaza con otro aminoácido similar, o debido a que el cambio (ya sea sustitución, substracción o inserción) no afecta el sitio activo de la proteína. Producción de Polipéptidos Sintéticos o de Larvas de T. solium Las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la presente son útiles para la producción de las proteínas o péptidos que codifican, o fragmentos antigénicos de los mismos, por métodos recombinantes o sintéticos conocidos a aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, una o más de la secuencia de nucleótido proporcionada en la presente, o un homólogo o equivalente funcional o porción de la misma, puede insertarse dentro de un vector tal como un plásmido, y expresarse recombinántemente en un organismo vivo para producir polipéptidos recombinantes. Alternativamente, los péptidos pueden sintetizarse por técnicas de fase sólida, desdoblarse de la resina, y purificarse por cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa (Por ejemplo, ver Creighton, 1983, PROTEINS STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, W. H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60). La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse por análisis de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; ver Creighton, 1983, PROTEINS,
í-JkÁÁi,í,í* *??¿.¡ -a-to-».-aiy&-fe.-y^¿»a»«a..s STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, W. H. Freeman and Co . , N.Y., pp. 34-49) . Las proteínas recombinantes se producen por métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, Un vector de clonación, tal como un plásmido o ADN de fago se desdobla por una enzima de restricción, y la secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas o fragmentos de la misa de interés se insertan dentro del sitio de desdoblamiento y se ligan. El vector de clonación se inserta después dentro de un huésped para producir la proteína o fragmento codificado por el ácido nucleico. Los huéspedes adecuados incluyen huéspedes bacterianos tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras vegetales, baculovirus, y otros cultivos celulares. Las levaduras son los huéspedes preferidos para la expresión del producto de vacuna o farmacéutico, la producción y purificación del producto del gen puede lograrse y mejorarse usando técnicas de biología molecular conocidas. Los péptido mosaico también pueden producirse combinando diversas secuencias de ácido nucleico en un vector de clonación. Ejemplos de técnicas de clonación y secuenciación apropiadas y las instrucciones suficientes para dirigir a las personas de experiencia a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran en Berger and Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY volume
. i& ? &ti.j.ú' jími il -* ..*¿ ^'fi-a a, aüijiiliii 152 Academic Press, Inc.. , San Diego, CA; Sambrook et al. ( 1989) MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F.M. Ausubel et al . , eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement) . La información del producto a partir de los fabricantes de reactivos biológicos y equipo experimental también proporciona información útil en los métodos biológicos conocidos. Dichos fabricantes incluyen
SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO) , R&D Systems
(Minneapolis, MN) , Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway,
NJ) , CLON-CH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) , Chem Genes
Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.
(Gaithersberg, MD) , Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluke
Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen (Carlsbad, CA) , and Applied Biosystems (Foster City, CA) , así como muchas otras fuentes comerciales conocidas a uno de experiencia. Proveído con las secuencias peptídicas descritas en la presente, uno de experiencia reconocerá una diversidad de ácidos nucleicos equivalentes que codifican los péptidos. Esto es debido a que el código genético requiere que cada residuo de aminoácido en un péptido sea especificado por al menos un triplete de nucleótidos en un ácido nucleico que
, ..i*??.ym .. ¿miií?&i.; üaeÉe codifica el péptido. Debido a la degeneración del código genético, muchos aminoácidos se codifican equivalentemente por más de un triplete de nucleótidos. Por ejemplo, todos los tripletes CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG codifican el aminoácido arginina. Así, en cada posición en donde una arginina será codificada por un triplete de ácido nucleico, el ácido nucleico tiene cualquiera de los tripletes que codifica arginina. Uno de experiencia está completamente familiarizado con el código genético y su uso. Una introducción al tema se encuentra en, por ejemplo, el capítulo 15 de Watson, et al . , MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE (Fourth Edition, The Benjamin/Cum~nings Company, Inc., Menlo Park, CA (1987)), y referencias citadas en eso. Aunque cualquier triplete de ácido nucleico codón que codifica un aminoácido puede usarse para especificar la posición del aminoácido en un péptido, algunos codones se prefieren. Es deseable seleccionar codones o para la expresión elevada de un péptido codificado, por ejemplo, cuando el péptido se purifica para uso como un reactivo inmunogénico. Los codones se seleccionan por referencia a tablas de especies de preferencia de codón, las cuales muestran qué codones se usan más típicamente por el organismo en el cual el péptido será expresado. Los codones usados frecuentemente por un organismo se traducen por los t-RNAs más abundantes en la células del organismo. Debido a que los
t-RNA son abundantes, la traducción del ácido nucleico dentro de un péptido por la maquinaria de traducción celular se facilita. Las tablas de preferencia de codón están disponibles para la mayoría de los organismos. Para una introducción a las tablas de preferencia de codón, ver, por ejemplo, Watson, et al . , supra. Además, será fácilmente aparente a aquellos de experiencia común en la técnica que los péptidos descritos en la presente y las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos péptidos inmunogénicos pueden estar sujetos a diversos cambios, tales como inserciones, substracciones, y sustituciones, conservativas o no conservativas, en donde dichos cambios pudieran proporcionar algunas ventajas en su uso, es decir, aumentar la actividad biológica. Uno de experiencia apreciará que dichas variaciones conservativas de construcciones de ácido nucleico producen una construcción funcionalmente idéntica. Por ejemplo, debido a la degeneración del código genético, las substituciones silenciosas (es decir, substituciones de una secuencia de ácido nucleico que no resultan en una alteración en un péptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia de ácido nucleico que codifica un aminoácido. Además, uno de experiencia reconocerá muchas formas para generar alteraciones en una construcción de ácido nucleico dada. Dichos métodos bien conocidos incluyen mutagénesis
dirigida al sitio, amplificación de PCR usando oligonucleótidos degenerados, exposición de células que contienen el ácido nucleico a agentes mutagénicos o radiación, síntesis química de un oligonucleótido deseado (por ejemplo, en conjunción con ligadura y/o clonación para generar ácidos nucleicos grandes) y otras técnicas bien conocidas. Ver, Giliman and Smith (1979) Gene 8:81-97, Roberts et al . (1987) Nature 328:731-734 and Sambrook, Ausbel, Berger and Kimmel, all supra . Las modificaciones a los ácidos nucleicos se evalúan por técnicas de selección de retina en pruebas adecuadas para la característica deseada. Por ejemplo pueden detectarse cambios en el carácter inmunológico de los péptidos codificados por una prueba inmunológica apropiada. Las modificaciones de otras propiedades tales como hibridización de ácido nucleico a un ácido nucleico complementario, estabilidad redox o térmica de proteínas codificadas, hidrofobicidad, susceptibilidad a proteólisis, o la tendencia a agregarse se prueban todas conforme a técnicas estándar. Igualmente, las substituciones de aminoácidos conservativas, en uno o unos cuantos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de una proteína se sustituyen con diferentes aminoácidos con propiedades altamente similares (ver, la sección de definiciones, supra) , también se
identifican fácilmente cpmo siendo altamente similares a una construcción descrita. Por sustituciones conservativas se quiere decir reemplazar un residuo de aminoácido con otro que es biológicamente y/o químicamente similar, por ejemplo, un 5 residuo hidrofóbico por otro, o un residuo polar por otro. Las substituciones incluyen combinaciones tales como, por ejemplo, Gly, Ala; Val, lie, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg;, y Phe, Tyr. Dichas variaciones conservativamente sustituidas de cada secuencia
10 explícitamente descrita son una característica de la presente invención. Pueden usarse diversas técnicas para preparar polipéptidos sintéticos. La síntesis de fase sólida en la cual el aminoácido C-términal de la secuencia peptídica se
15 agrega a un soporte insoluble seguido por la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia es el método preferido para preparar los péptidos sintéticos. Las técnicas para la síntesis de fase sólida se describen por Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, in The
20 Peptides : Analysis, Synthesis, Biology (Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, N.Y., vol. 2, pp. 3-284 (1980)); Merrifield, et al . , J. Am. Chem. Soc . 85, 2149-2156 (1963); and Stewart, et al . , Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ea., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984)), las enseñanzas de
25 las cuales se incorporan por la presente para referencia.
Muchos sistemas automatizados para realizar síntesis peptídica en fase sólida están comercialmente disponibles. La síntesis de fase sólida se inicia a partir del extremo carboxi-terminal (es decir, el C-término) del péptido acoplando un aminoácido protegido por medio de su grupo carboxilo a un soporte sólido adecuado. El soporte sólido usado no es una característica crítica de la presente invención con la condición de que sea capaz de enlazarse al grupo carboxilo mientras permanece considerablemente inerte a los reactivos utilizados en el procedimiento de síntesis peptídica. Por ejemplo, un material inicial puede prepararse agregando un aminoácido protegido en amino por medio de un enlace benciléster a una resina clorometilada o una resina de hidroximetilo o por medio de un enlace amina a una resina de benzhidrilamina (BHA) o resina de p-metilbezhidrilamina (MBHA) . Los materiales adecuados para uso como soportes sólidos son bien conocidos a aquellos de experiencia en la técnica incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: resinas de halometilo, tales como resina de clorometilo o resina de bromometilo; resinas de hidroximetilo; resinas de fenol, tales como resina de 4- (a- [2, 4-dimetoxifenil] -Fmoc- aminometil) fenoxi; resinas de tert-alquiloxicarbonil- hidrazidada, y similares. Dichas resinas son comercialmente disponibles y sus métodos de preparaciones son conocidos a aquellos de experiencia común en la técnica.
La forma acida* de los péptidos puede prepararse por el procedimiento de síntesis peptídica de fase sólida usando una resina de benciléster como un soporte sólido. Las amidas correspondientes pueden producirse usando resina de benzhidrilamina o metilbenzhidrilamina como el soporte sólido. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que cuando se usa la resina de BHA o MBHA, el tratamiento con ácido fluorhídrico anhidro para desdoblar el péptido a partir del soporte sólido produce un péptido que tiene un grupo amida terminal. El grupo a-amino de cada aminoácido usado en la síntesis debe protegerse durante la reacción de acoplamiento para prevenir reacciones secundarias que involucran la función a-amino reactiva. Algunos aminoácidos también contienen grupos funcionales de cadena lateral reactiva (por ejemplo, sulfhidrilo, amino, carboxilo, hidroxilo, etc.) que también deben protegerse con grupos protectores apropiados para prevenir que ocurran reacciones químicas en aquellos sitios durante la síntesis peptídica. Los grupos protectores son bien conocidos a aquellos de experiencia en la técnica. Un grupo protector de a-amino apropiadamente seleccionado volverá la función a-amino inerte durante la reacción de acoplamiento, será fácilmente eliminable después del acoplamiento bajo condiciones que no eliminarán los grupos protectores de cadena lateral, no alterará la estructura del fragmento peptídico, y prevendrá la racemización durante la activación inmediatamente antes del acoplamiento. Igualmente, pueden seleccionarse grupos protectores de cadena lateral para volver inerte el grupo funcional de la cadena lateral durante la síntesis. Deben ser estables bajo las condiciones usadas para eliminar el grupo protector de a-amino, y deben ser eliminables después de la terminación de la síntesis peptídica bajo condiciones que no alterarán la estructura del péptido. El acoplamiento de los aminoácidos puede lograrse por una diversidad de técnicas conocidas a aquéllos de experiencia en la técnica. Las propuestas típicas involucran la conversión del aminoácido en un derivado que volverá el grupo carboxilo más susceptible a la reacción con el grupo amino N-terminal del fragmento peptídico, o el uso de un agente de acoplamiento adecuado tal como, por ejemplo, N,N'-diciclohexilcarbodimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) . Frecuentemente, se emplea hidroxibenzotriazol (HOBt) como un catalizador en estas reacciones de acoplamiento. Se describen químicas de síntesis apropiadas en THE PEPTIDES: ANALYSIS, STRUCTURE, BIOLOGY, VOL. 1: METHODS OF PEPTIDE BOND FORMATION (Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, N.Y. (1979)); and Izurniya, et al . , SYNTHESIS OF PEPTIDES (Maruzen Publishing Co., Ltd., (1975)). Generalmente, LA síntesis del péptido se empieza acoplando primero el aminoácido C-terminal, el cual se protege en la posición N-ammo por un grupo protector tal como fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), a un soporte sólido. Antes del acoplamiento de Fmoc-Asn, el residuo de Fmoc debe eliminarse del polímero. Fmoc-Asn puede, por ejemplo, acoplarse a las resinas 4- (a- [2, 4-dimetoxifenil] -Fmoc-amino- etil) fenoxi usando N, N' -diciclohexilcarbodimida (DCC) e hidroxibenzotriazol (HOBt) a aproximadamente 25°C durante aproximadamente dos horas con agitación. Después del acoplamiento del aminoácido protegido con Fmoc al soporte de resina, el grupo protector de a-amino se elimina usando 20% de piperidina en DMF a temperatura ambiente. Después de la eliminación del grupo protector de a- amino, los aminoácidos protegidos con Fmoc restante se acoplan en forma de pasos en el orden deseado. Los aminoácidos apropiadamente protegidos están comercialmente disponibles a partir de un número de proveedores (por ejemplo, Novartis (Suiza) o Bachem (California) ) . Como una alternativa a la adición en forma de pasos de los aminoácidos individuales, los fragmentos peptídicos apropiadamente protegidos que consisten de más de un aminoácido también pueden acoplarse al péptido en "crecimiento" La selección de un reactivo de acoplamiento apropiado, como se explicó anteriormente, es bien conocida a aquellos de experiencia en la técnica. Debe anotarse que debido a que los péptidos
inmunogénicos son relativamente cortos en longitud, esta última propuesta (es decir, el método de condensación de segmento) no es el método más eficiente de la síntesis peptídica. Cada aminoácido o secuencia de aminoácidos protegida se introduce dentro del reactor de fase sólida en exceso y el acoplamiento se lleva a cabo en un medio de dimetilformamida (DMF) , cloruro de metileno (CH2C12) , o mezclas de los mismos. Si el acoplamiento es incompleto, la reacción de acoplamiento puede repetirse antes de la desprotección del grupo N-amino y la adición del siguiente aminoácido. La eficiencia de acoplamiento puede observarse por un número de medios bien conocidos a aquellos de experiencia en la técnica. Un método preferido para observar la eficiencia de acoplamiento es por la reacción de ninhidrina. Las reacciones de síntesis peptídica pueden realizarse automáticamente usando un número de sintetizadores peptídicos comercialmente disponibles (por ejemplo, Biosearch 9500, Biosearch, San Raphael, CA) . El péptido puede desdoblarse y los grupos protectores eliminarse agitando el portador insoluble o soporte sólido en fluoruro de hidrógeno (HF) líquido anhidro en la presencia de anisol y sulfuro de dimetilo a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 20 a 90 minutos, preferentemente 60 minutos; burbujeando bromuro de hidrógeno
(HBr) continuamente a través de una suspensión de 1 mg/10 ml de la resina en ácido trifluoroacético (TFA) durante 60 a 360 minutos a aproximadamente temperatura ambiente, dependiendo de los grupos protectores seleccionados; o incubando el soporte sólido dentro de la columna de reacción usada para la síntesis de fase sólida con 90% de ácido trifluoracético, 5% de agua y 5% de trietilsilano durante aproximadamente 30 a 60 minutos. También pueden usarse otros métodos de desprotección bien conocidos a aquellos de experiencia en la técnica. Los péptidos pueden aislarse y purificarse a partir de la mezcla de reacción por medio de purificación peptídica bien conocida a aquellos de experiencia en la técnica. Por ejemplo, los péptidos pueden purificarse usando procedimientos cromatográficos conocidos tales como HPLC de fase inversa, permeación en gel, intercambio iónico, exclusión de tamaño, distribución de afinidad, partición o a contracorriente . Polipéptidos marcados Cuando se marcan con una biomolécula o químico detectable, los polipéptidos de T. solium y los fragmentos antigénicos de los mismos descritos anteriormente son útiles para propósitos tales como diagnósticos e investigación de laboratorio, usando los métodos y pruebas descritas posteriormente. Diversos tipos de marcas y métodos para conjugar las marcas a los polipéptidos son bien conocidos a
aquellos expertos en la. técnica. Diversas marcas específicas se indican posteriormente. Por ejemplo, los polipéptidos se conjugan con una radiomarca, tal como, pero no restringida a, 2P, H, C, °S, 125I, o 131I. La detección de una marca puede ser por métodos tales como conteo de centelleo, espectrometría o autoradiografía de rayos gamma. Las marcas bioluminiscentes, tales como derivados de luciérnaga, también son útiles. La substancia bioluminiscente se enlaza covalentemente al polipéptido por métodos convencionales, y el polipéptido marcado se detecta cuando una enzima, tal como luciferasa, cataliza una reacción con ATP causando que la molécula bioluminiscente emita fotones de luz. También pueden usarse fluorógenos como marcas. Ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y derivados, ficoeritrina, alo-ficocianina, ficocianina, rodamina, y Texas Red. Los fluorógenos se detectan generalmente por un detector de fluorescencia. Los polipéptidos pueden marcarse alternativamente con un cromógeno para proporcionar una marca de enzima o afinidad. Por ejemplo, el polipéptido puede biotinilarse de manera que pueda utilizarse en una reacción de biotina- avidina, que también puede acoplarse a una marca tal como una enzima o fluorógeno. Alternativamente, el polipéptido puede
marcarse con peroxidasa, fosfatasa alcalina u otras enzimas que dan una reacción cro ogénica o fluorogénica durante la adición del substrato. Los aditivos tales como 5-amino-2,3- dihidro-1, 4-ftalazindiona (también conocido como Luminol™) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y mejoradores de velocidad tales como p-hidroxibifenilo (también conocido como p-fenilfenol) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) pueden usarse para amplificar enzimas tales como peroxidasa de rábano a través de una reacción luminiscente; y también pueden usarse derivados de dioxetano luminogeneico o fluorogénico de substratos enzimáticos. Dichas marcas pueden detectarse usando inmunoensayos enlazados a enzimas (ELISA) o detectando un cambio de color con el auxilio de un espectrofotómetro. Además, los péptidos pueden marcarse con oro coloidal para uso en microscopía in unoelectrónica de acuerdo con métodos bien conocidos a aquellos de experiencia en la técnica. El diagnóstico de una infección por larvas de T. soli um puede determinarse marcando un polipéptido como se describió anteriormente y detectando la marca de acuerdo con métodos bien conocidos a aquellos expertos en la técnica. Detección de Anticuerpos de T. solium Se conocen muchas técnicas en la técnica para detectar y cuantificar un componente tal como un anticuerpo en una mezcla y/o medir su cantidad. Los inmunoensayos que
emplean polipéptidos que se enlazan específicamente a los anticuerpos de interés, son algunas de las técnicas de medición mejor conocidas. Estos métodos permiten la detección de anticuerpos de T. soli um circulantes para indicar la presencia o nivel de la infección de T. solium. Los métodos clásicos involucran hacer reaccionar una muestra que contiene el anticuerpo con una cantidad en exceso conocida de polipéptido específico para el anticuerpo, separar el enlazado del anticuerpo libre, y determinar la cantidad de uno o el otro. Frecuentemente el polipéptido se marca con un grupo reportero para auxiliar en la determinación de la cantidad de analito enlazado como se describió anteriormente. El grupo reportero o "marca es comúnmente un grupo fluorescente o radioactivo o una enzima. En una modalidad preferida de la presente invención, el método de diagnóstico comprende usar una prueba de inmunotinción. En una modalidad adicionalmente preferida, el método de diagnóstico es una prueba de inmunotinción que contiene uno o más de los antígenos de glicoproteína de T. solium larval referida en la presente como TS-14, TS-18 y TSRS-1, o fragmentos antigénicos de los mismos. Como se mencionó anteriormente, estos polipéptidos tienen las secuencias de aminoácido indicadas en el Listado de Secuencias como SEC. DE IDENT. NOS.: 2, 4 y 6, respectivamente, y se codifica por las secuencias de ácidos
l?-i.JüiíA .i. tisá * -^-flHJal, ¡.í.jgtaá ?h-? ú ?í -.iu^?t nucleicos indicadas en el Listado de Secuencias como SEC. DE IDENT. NOS.: 1, 3, 5. Debe entenderse que los métodos de prueba contemplan incluir el uso de polipéptidos de T. soli um sintéticos y recombinantes como se describió anteriormente y fragmentos o derivados de los polipéptidos de T. solium descritos en la presente siempre y cuando los fragmentos polipeptídicos o derivados retengan actividad antigénica o muestren una actividad antigénica equivalente a los polipéptidos a inmunogénicos completos. Estos fragmentos o derivados incluyen péptidos con actividad antigénica que tienen sustituciones de aminoácidos o tienen otras moléculas agregadas a los grupos funcionales aminoácido. Se realiza un inmunoensayo para la detección de T. solium en una muestra como sigue: Se recolecta una muestra o se obtiene usando métodos bien conocidos a aquellos expertos en la técnica. La muestra que contiene los anticuerpos de T. solium a ser detectados puede obtenerse a partir de cualquier fuente biológica. Ejemplos de fuentes biológicas incluyen suero de sangre, plasma de sangre, orina, fluido espinal, saliva, fluido de fermentación, fluido de limfa, fluido de cultivo de tejidos y fluido de aceites de un humano o animal. La muestra puede diluirse, purificarse, concentrarse, filtrarse, disolverse, suspenderse o manipularse de otra forma antes del inmunoensayo para optimizar los resultados
del inmunoensayo. Para detectar anticuerpos de T. soli um, la muestra se incuba con uno o más polipéptidos recombinantes o sintéticos de T. solium, producidos como se describió anteriormente. El polipéptido puede marcarse o conjugarse a un lecho de fase sólida o partículas como también se describe en la presente. El polipéptido marcado se detecta después usando técnicas bien conocidas para detección de moléculas biológicas tales como métodos inmunoquímicos o histológicos . Dichos métodos incluyen técnicas inmunológicas que emplean anticuerpos monoclonales o policlonales para el polipéptido, tales como pruebas inmunosorbentes enlazadas a enzima, radioinmunoensayos, pruebas quimioluminiscentes, u otros tipos de pruebas que involucran anticuerpo conocidas a aquellos expertos en la técnica. En general, las pruebas de enlace descansan en el enlace del analito con receptores del analito para determinar las concentraciones del analito en una muestra. Estos inmunoensayos pueden describirse como competitivos o no competitivos. Los ensayos no competitivos utilizan generalmente receptores de analito en exceso considerable sobre la concentración de analito a ser determinado en la prueba. Las pruebas de emparedado son ejemplos de pruebas no competitivas, que comprenden un receptor de analito frecuentemente enlazado a una fase sólida
y un segundo receptor de analito marcado para permitir la detección. El analito se enlaza primero al receptor de analito enlazado a una fase sólida y el segundo receptor de analito marcado se agrega después para facilitar la cuantificación del analito. El analito enlazado puede separarse fácilmente de los reractivos no enlazados, tales como los primeros receptores de analito marcados no enlazados, debido al uso de un receptor de analito enlazado a una fase sólida. Las pruebas competitivas involucran generalmente una muestra que se sospecha contiene analito, . un conjugado analito-análogo, y la competencia de estas especies por un número limitado de sitios de enlace proporcionados por el receptor de analito. Las pruebas competitivas pueden describirse adicionalmente como siendo homogéneas o heterogéneas. En las pruebas homogéneas, todos los reactivos que participan en la competencia se mezclan juntos y se determina la cantidad de analito por su efecto en el grado de enlace entre el receptor de analito y el conjugado de analito o conjugado de análogo de analito. La señal observada es modulada por el grado de este enlace y puede relacionarse en la cantidad de analito en la muestra. En una modalidad preferida, el método para detectar anticuerpos de T. soli um larval comprende tomar muestras biológicas, tales como fluidos y tejidos, de un humano o animal para el diagnóstico o pronóstico de cisticercosis. La
ministra se obtiene preferiblemente de la sangre, fluido cerebroespinal, orina, saliva, o tejidos de un mamífero, preferentemente un humano o cerdo. Una determinación de la presencia de los anticuerpos puede hacerse después usando técnicas de prueba que son bien conocidas a aquellos expertos en la técnica e incluyen métodos tales como análisis por tinción Western, pruebas de radioinmunoensayo y ELISA. Equipo para Detectar la Presencia de T. soli um Un equipo para detectar la presencia y cantidad de péptidos de T. solium se proporciona también. El equipo puede estar en cualquier configuración bien conocida a aquéllos de experiencia común en la técnica y es útil realizar uno o más de los métodos descritos en la presente para la detección de T. solium en muestras biológicas o para la detección u observación de la infección de T. solium en un paciente o portador. Los equipos son convenientes porque suministran muchos sino es que todos los reactivos esenciales para conducir una prueba para la detección de T. soli um en una muestra biológica. Los reactivos pueden premedirse y contenerse en una forma estable en recipientes o sobre una fase sólida dentro o sobre la cual la prueba puede realizarse, minimizando con eso el número de manipulaciones llevadas a cabo por el individuo que conduce la prueba. Además, la prueba puede realizarse simultáneamente con un estándar que se incluye con el equipo, tal como una cantidad
pr determinada de antígeno de anticuerpo, para que los resultados de la prueba puedan validarse o medirse. El equipo contiene preferiblemente uno o más polipéptidos de T. soli um o moléculas de ácido nucleico que pueden usarse para la detección de anticuerpos de T. solium o moléculas de ácido nucleico en una muestra. El equipo puede contener adicionalmente los reactivos apropiados para enlazar los polipéptidos a los anticuerpos o hibridizar las moléculas de ácido nucleico con sus moléculas de ácido nucleico complementarias de T. solium respectivas en la muestra como se describe en la presente y los reactivos que auxiliar para detectar los complejos de anticuerpo, polipéptido o molécula de ácido nucleico. El equipo puede contener adicionalmente equipo para obtener seguramente la muestra, un recipiente para contener los reactivos, un medio para registrar el tiempo, un regulador para diluir la muestra, y un colorímetro, un reflectómetro, o estándar en contra del cual puede medirse un cambio de color. En una modalidad preferida, los reactivos, incluyendo los polipéptidos, se liofilizan, más preferentemente en un recipiente sencillo. La adición de la muestra acuosa al recipiente resulta en la solubilización de los reactivos liofilizados, ocasionándolos reaccionar. Más preferentemente, los reactivos se liofilizan secuencialmente en un recipiente sencillo, de acuerdo con métodos bien
conocidos a aquellos expertos en la técnica que minimizan la reacción de los reactivos antes de la adición de la muestra. El equipo de prueba incluye pero no se limita a reactivos a ser empleados en las siguientes técnicas: pruebas competitivas y no competitivas, pruebas de radioinmunoensayo, bioluminiscencia y quimioluminiscencia, pruebas fluorométricas, pruebas de emparedado, pruebas inmunoradiométricas, tinciones de punto, pruebas enlazadas a enzimas que incluyen inmunotinciones y ELISA, e inmunocitoquímicas. Los materiales usados en conjunción con estas técnicas, incluyen, pero no se limitan a, placas microtítulo, tiras recubiertas de anticuerpo o varilla indicadora para observación rápida de orina o sangre. Para cada equipo, se establece el rango, sensibilidad, precisión, confiabilidad, especificidad, y reproducibilidad de la prueba. En una modalidad preferida adicional, el equipo de prueba usa técnicas de inmunotinción y proporciona instrucciones y polipéptidos de T. soli um larval recombinantes conjugados con una molécula detectable. El equipo es útil para la detección y medición de T. soli um en fluidos biológicos y extractos de tejidos de animales y humanos para diagnosticar u observar cisticercosis o neurocisticercosis . Composiciones Inmunológicas y Farmacéuticas
Las composiciones inmunológicas, que incluyen vacunas, y otras composiciones farmacéuticas que contienen los polipéptidos de T. solium o fragmentos antigénicos de los mismos descritos en la presente son útiles para reducir o prevenir posiblemente la infección o transmisión de T. solium. Uno o más de los polipéptidos descritos en la presente se formulan y empacan solos o en combinación con adyuvantes u otros antígenos, usando métodos y materiales conocidos a aquellos expertos en la técnica de vacunas, la respuesta inmunológica puede usarse terapéuticamente o profilácticamente y puede proporcionar inmunidad de anticuerpo o inmunidad celular tal como la producida por linfocitos T. tales como linfocitos T citotóxicos o linfocitos CD4+. Para mejorar la inmunogenicidad, uno o más de los polipéptidos pueden conjugarse a una molécula portadora. Los portadores inmunogénicos adecuados incluyen proteínas, polipéptidos o péptidos tales como albúmina, hemocianina, tiroglobulina y derivados de los mismos, particularmente albúmina de suero bovino (BSA) y hemocianina de lapa ranurada (KLH) , polisacáridos, carbohidratos, polímeros, y fases sólidas. Otras sustancias derivadas de proteína o no derivadas de proteína son conocidas a aquellos expertos en la técnica. Un portador inmunogénico tiene típicamente un peso molecular de al menos 1,000 daltones típicamente,
-?
preferentemente más de 10,000 daltones. Las moléculas portadoras frecuentemente contienen un grupo reactivo para facilitar la conjugación covalente al hapteno. El grupo de ácido carboxílico o grupo amina de los aminoácidos o los grupos azúcar de las glicoproteínas son frecuentemente usados en esta forma. Los portadores que carecen de dichos grupos pueden hacerse reaccionar frecuentemente con un químico apropiado para producirlo. Alternativamente, un polipéptido antigénico múltiple que comprende copias múltiples de la proteína o polipéptido, o un polipéptido antigenicamente o inmunológicamente equivalente puede ser suficientemente antigénico para mejorar la inmunogenicidad sin el uso de un portador. Los polipéptidos de T. solium pueden administrarse con un adyuvante en una cantidad efectiva para mejorar la ? respuesta inmunogénica en contra del conjugado., En este momento, el único adyuvante ampliamente usado en humanos ha sido alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) . La saponina y su componente purificado Quil A, adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes usados en aplicaciones de investigación y veterinaria tienen toxicidades que limitan su uso potencial en vacunas humanas. Sin embargo, las preparaciones químicamente definidas como muramil dipéptido, monofosforil lípido A, conjugados fosfolípidos tales como aquellos descritos por Goodman-Snitkoff et al . J. Immunol .
/ 147:410-415 (1991), encapsulación del conjugado dentro de un proteoliposoma como se describe por Miller et al . , J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992), y la encapsulación de la proteína en vesículas lípidas también puede ser útil. El término "vacuna" como se usa en la presente incluye vacunas de ADN en las cuales la molécula de ácido nucleico que codifica polipéptidos de T. soli um en una composición farmacéutica se administra a un paciente. Para inmunización genética, los métodos de suministro adecuados conocidos a aquellos expertos en la técnica incluyen inyección directa de ADN de plásmido dentro de los músculos (Wolff et al . , Hum. Mol . Genet . 1:363 (1992)), suministro de ADN en forma de complejo con portadores de proteína específicos (Wu et al . , J. Biol . Chem. 264:16985 (1989)), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty and Reshef, Proc . Nati . Acad. Sci . 83:9551 (1986)), encapsulación de ADN en liposomas (Kaneda et al . , Science 243:375 (1989)), bombardeo de partículas (Tang et al . , Nature 356:152 (1992) y (Eisenbraun et al . , ADN Cell Biol . 12:791 (1993)), e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . 81:5849 (1984)). En una modalidad preferida, se empaca una vacuna en una dosificación sencilla para inmunización por administración parenteral (es decir intramuscular, intradérmica o subcutánea) o administración nasofaríngea (es
decir, intranasal) . La vacuna se inyecta más preferiblemente mtramuscularmente dentro del músculo deltoide. La vacuna se combina preferentemente con un portador farmacéuticamente aceptable para facilitar la administración. El portador es normalmente agua o una solución salina regulada, con o sin un conservador. La vacuna puede liofilizarse para resuspensión en el momento de la administración o en solución. El portador al cual el polipéptido puede conjugarse puede también ser un sistema de liberación retrasada polimérico. Los polímeros sintéticos son particularmente útiles en la formulación de una vacuna para efectuar la liberación controlada de los antígenos. La microencapsulación del polipéptido también tendrá una liberación controlada. Un número de factores contribuyen a la selección de un polímero particular para la % microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis polimérica y el proceso de microencapsulación, el costo de los materiales y procesos de microencapsulación, el perfil toxicológico, los requerimientos para la cinética de liberación variable y la compatibilidad fisicoquímica de los antígenos son todos factores que deben considerarse. Ejemplos de polímeros útiles son policebonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres, poliamidas, poli (d, 1-lacturo- co-glicoluro) (PLGA) y otros polímeros biodegradables. La dosis preferida para la administración humana de
la composición farmacéutica o vacuna es de 0.01 mg/kg a 10 mg/kg, preferentemente aproximadamente 1 mg/kg. Con base en este rango, pueden determinarse las dosificaciones equivalentes para pesos corporales más pesados. La dosis debe ajustarse para adecuar al individuo al cual la composición se administra y variará con la edad, peso y metabolismo del individuo. La vacuna puede contener adicionalmente estabilizadores tales como timerosal (sal sódica de etil (2- mercaptobenzoato-S) mercurio) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) o conservadores fisiológicamente aceptables. Esta invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, lo cual no debe interpretarse de ninguna forma como que impone limitaciones sobre el alcance de los mismos. Por el contrario debe entenderse claramente que puede hecharse mano de diversas otras modalidades, modificaciones y equivalentes de los mismos, los cuales, después de leer la descripción presente, pueden sugerirse así mismos a aquellos expertos en la técnica sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o el alcance de las reivindicaciones anexas. Ejemplo 1 Expresión y Análisis de los Polipéptidos de 14 y 18 kDa de T. solium Las regiones que condifican los polipéptidos maduros TS-14 y TS-18, indicados en SEC. DE IDENT . NOS: 1 y
3, se subclonaron dentro del vector de expresión pET-32 y expresaron en E. coli como proteínas de fusión tioredoxina. Después de la inducción de expresión, el lisado bacteriano total se analizó por inmunotinción. Las proteínas de TS-14 y TS-18 de E. coli totales de los cultivos inducidos se resolvieron sobre ?DS-PAGE, teñido sobre nitrocelulosa, y sondeados con suero de infección de cisticercosis, un anticuerpo monoclonar anti-tioredoxina (Invitrogen, Carlsbad, CA) , anticuerpos de una muestra de suero de un nativo de Alaska que tenía un Echinococcus mul ticularis, y anticuerpos de una reunión de suero que contiene sueros de humanos saludables que residen en los Estados Unidos sin ninguna historia de viaje. Las proteínas recombinantes inducidas de los plásmidos carecen de un inserto y que codifican solamente la etiqueta de tioredoxina fue solamente reconocida por el *"* anticuerpo monoclonal antitioredocina emigró a 20 kDa. Los -' anticuerpos anti-cisticercosis reconocieron específicamente las proteínas recombinantes TS-14 y TS-18 que emigraron en SDS-PAGE con un peso molecular predicho de 28 kDa debido a la etiqueta de tioredoxina. Ninguna subunidad reaccionó con anticuerpos del suero de infección de echinococcosis o la reunión de suero un infectado, indicando con eso una carencia de reactividad cruzada. Al comparar las concentraciones de proteína relativa, determinadas por tinción aurotinción y por reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-tioredoxina, y
reactividad anti-cisticercosis de las proteínas recombinantes de 14- y 18-kDa, parece que la proteína recombinante de 14 kDa es más reactiva con anticuerpos anti-cisticercosis, consistente con observaciones anteriores del antígeno nativo. Todas las patentes, publicaciones y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan por la presente para referencia. Las modificaciones y variaciones del método presente serán obvios a aquellos expertos en la técnica de la descripción detallada anterior. Dichas modificaciones y variaciones intentan entrar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
-LISTA DE SECUENCIA
<110> Tsang, Víctor C. W. Greene, Ryan M. ilkms, Patricia P. Hancock, Kathy <120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES EARA DETECTAR TAENIA SOLIUM LARVAL
<130> 03063-0551WP <140> <141> <160> 7 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2153 <212> DNA <213> Taenia solium <220> <221> CDS <222> (145) .. (531) <400> 1 ctgcagtgaa gttgacaagt agttgaccat ttacggaaca tcaatggagg acactttggt 60 agggaaagca tacgataaac ataaaccaat gctggttata taagagacga tctcggctac 120 acttgtaact gaacaacctg taga atg cgt gcc tac att gtg ctt ctc gct 171 Met Arg Ala Tyr lie Val Leu Leu Ala 1 5 ctc act gtt ttc gta gtg acg gtg tcg gcc gag tgg gtg ccc att tcg 219
Leu Thr Val Phe Val Val Thr Val Ser Ala Glu Trp Val Pro lie Ser
10 15 20 25 agt gtc cae ata gcc tca tgc aaa age cae tac atg ttc caa tta aaa 267 Ser Val His lie Ala Ser Cys Lys Ser Fis Tyr Met Phe Gln Leu Lys 30 35 40 cgc ttt ttt gcc ttt agg aaa aac aaa ccg aaa gat gtt gca aat agt 315 Arg Phe Phe Ala Phe Arg Lys Asn Lvs Pro Lys Asp Val Ala Asn Ser 45 50 55 acg aaa aaa ggg ata gaa tat gtc cae gaa ttc ttc cae gaa gac ccg 36 Thr Lys Lys Gly lie Glu Tyr Val His Glu Phe Phe His Glu Asp Pro 60 65 70 att ggt aaa caa att gct caa ctc gca aag gaa tgg aag gaa gca atg 411 lie Gly Lys Gln lie Ala Gln Leu Ala Lys Glu Trp Lys Glu Ala Met 75 80 85 ttg gaa ggt agg ttt tgg tgt ttt ctg tca gaa gaa aat tat cta ttc 459 Leu Glu Gly Arg Phe Trp Cys Phe Leu Ser Glu Glu Asn Tyr Leu Phe Í:
90 95 100 105 att cat cta gac aaa ggc aaa ata cgg acg tca ctg gtt gag cae tgc 507
He His Leu Asp Lys Gly Lys He Arg Thr Ser Leu Val Glu His Cys 110 115 120 aaa ggt cct aag aaa aaa act gct taacttgtca actttcatgc gttcttctct 561 Lys Gly Pro Lys Lys Lys Thr Ala 125 tcactaataa atgctcatta ataagaaagc tgccttttgc aagatcaacg agggccatag 621 actgtgaggg ttatagccta aggttatggg gtgaaatgag ataggaattg agcatttgag 681 aagttactaa tttaaattga aagccgcatt tcttctgcaa ttgacgtgtg atggttagcg 741 aaaccaagtg aagcacgacc tcttgagtcg tttcaacagc cgccagtggt ttcaccagtg 801 gcttcaccag tgggtagact ggtttgtcac acatgcgagg tacggtcaga gggctaacag 861 gtgtggtgga ggggccaaca cgtgtaagac aagcagttcc ccttctctgt cgtgaggcac 921 actcagcacc cacctcgttt acttctccct tgacgactgt aatgcatttg gggtcaccat 981 gcccccgcca agttgaaggc actgatgaca tttgtaccat atcaccgata agtattaact 1041 cttccacttc ccagattttg aggtcaggcg atcctactga ctcggtgtag ccccatggtg 1101 gtccatgctc tgcaccattc gctgttcagt ggagcatcca cctagacggc caaccaatct 1161 cgcctccctt. ctcctgtgct caagatgtgc gtcggtgaga tttggagggt ctgatcacca 1221 tactaaccac gtaggtttca tcatctctaa gaagcaccac ttcttgaggt cgcattgtgt 1281 accaccagcc ggtgtaatca agagtgactt tcgcgtcacc cctaagaagg ctatagatct 1341 gcaagtcagc gcaatagctt cagccatgct gactaaaatg tgtaagggac cagtagctct 1401 agcccaacac aagtggagct aataatgggc ttccccagat acatgaatcc caaatcggtg 1461 agcatgggcc atgaatatgg ccttctgagt cttccttgaa tgcaaacgaa ggcatagcac 1521 gagggtagga tgagtgtaca gaaaacagcg aggcaacgaa tctactggca tggccctgat 1581 gccaccccgc ccagctaggg tagtttggcc acctcagtcc ttaatcgaat gcggcagtca 1641 gaacaaacaa agtattacat agccacactc ttcttttgag cgtcgtcctc gacgctcctt 1701 tcgacacacc tcccgcatca gccaccacaa agtaatcagt actggggaga cacccacgag 1761 ctaaccgtgc cagtcatgga aaatttgacg gcaactgagg agatgcctga ccccctttgg 1821 cagttcgaat gctgcccgtg gtcaaactcc tgcatcagcc atcacctacg attcaaacat 1881 cctagtcgcc aaattttcgt gaaccctcta aaattttcgt gcactctcaa gacacttcca 1941 actgacttag agctttttca tttggtgaga acacgtaaaa gcttcaagta aacaacaggc 2001 aacgatttca ctttgatgct ctcaccatca attctcttgt atgtgccacc accttaaacc 2061 í i" *
ctccctgacc acttccactc tctctctctc cctaaataac aacacttgga agcatgaatg 2121 gtgtctgtca aagttacacc cctagactgc ag 2153
<213> Taenia solium <400> 2 Met Arg Ala Tyr He Val Leu Leu Ala Leu Thr Val Phe Val Val Thr 1 5 10 15 Val Ser Ala Glu Trp Val Pro He Ser Ser Val His He Ala Ser Cys 20 25 30 Lys Ser His Tyr Met Phe Gln Leu Lys Arg Phe Phe Ala Phe Arg Lys 35 40 45 Asn Lys Pro Lys Asp Val Ala Asn Ser Thr Lys Lys Gly He Glu Tyr 50 55 60 Val His Glu Phe Phe His Glu Asp Pro He Gly Lys Gln He Ala Gln 65 70 75 80 Leu Ala Lys Glu Trp Lys Glu Ala Met Leu Glu Gly Arg Phe Trp Cys 85 90 95 Phe Leu Ser Glu Glu Asn Tyr Leu Phe He His Leu Asp Lys Gly Lys 100 105 110 He Arg Thr Ser Leu Val Glu His Cys Lys Gly Pro Lys Lys Lys Thr 115 120 125 Ala
<210> 3 <211> 298 <212> DNA <213> Taenia solium <220> <221> CDS <222> (3) .. (224) <400> 3 ta ttc gta gtg gcg gtt tcg gcc gag aaa aac aaa ccg aag tgt gat 47 Phe Val Val Ala Val Ser Ala Glu Lys Asn Lys Pro Lys Cys Asp 1 5 10 15 gca aat agt act aag aaa gag ata gaa tat ate cae aat tgg ttt ttc 9 Ala Asn Ser Thr Lys Lys Glu He Glu Tyr He His Asn Trp Phe Phe 20 25 30 cat gat gac ccg att gga aaa caa att gct caa ctc gca aag gac tgg , 4
H s Asp Asp Pro He Gly Lys Gln He Ala Gln Leu Ala Lys Asp Trp 35 40 45 aat gaa aca gtg cag gaa gcc aaa ggc aaa ttt tgg gcg tca ctg gct 191 y¡M Asn Glu Thr Val Gln Glu Ala Lys Gly Lys Phe Trp Ala Ser Leu Ala 50 55 60 gag tac tgc aga ggt ctg aag aac aaa act gct taacttgtca actttcatgc 244 Glu Tyr Cys Arg Gly Leu Lys Asn Lys Thr Ala 65 70 gttcttctct tcaccaataa atgctgatta acaagaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 298
<210> 4 <211> 74 <212> PRT <213> Taenia solium <400> 4 Phe Val Val Ala Val Ser Ala Glu Lys Asn Lys Pro Lys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Asn Ser Thr Lys Lys Glu He Glu Tyr He His Asn Trp Phe Phe His 20 25 30 Asp Asp Pro He Gly Lys Gln He Ala Gln Leu Ala Lys Asp Trp Asn 35 40 45 Glu Thr Val Gln Glu Ala Lys Gly Lys Phe Trp Ala Ser Leu Ala Glu 50 55 60 Tyr Cys Arg Gly Leu Lys Asn Lys Thr Ala 65 70
<210> 5 <211> 294 <212> DNA <213> Taenia solium <220> <221> CDS <222> (3) .. (224) <400> 5 tt ttc gta gtg gcg gtg tcg gcc gag gaa act aaa cea gag gac gtg 47 Phe Val Val Ala Val Ser Ala Glu Glu Thr Lys Pro Glu Asp Val 1 5 10 15 gta aag aat att aag aaa ggg atg gaa gtt gtc tac aaa ttt ttc tac 95 Val Lys Asn He Lys Lys Gly Met Glu Val Val Tyr Lys Phe Phe Tyr 20 25 30 gaa gac ccg ttg gga aag aaa ata gct caa ctc gca aag gac tgg aag 14" Glu Asp Pro Leu Gly Lys Lys He Ala Gln Leu Ala Lys Asp Trp Lys 35 40 45 gaa gca atg ttg gaa gcc aga age aaa gtg cgg gcg tca ctg gct gag 191 E» H *
Glu Ala Met Leu Glu Ala Arg Ser Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Glu
tac a Tyr cttctcttca ctaataaatg etcattaata agaaaaaaaa aaaaaaaaaa
<210> 6 <211> 73 <212> PRT <213> Taenia solium <400> 6 Phe Val Val Ala Val Ser Ala Glu Glu Thr Lys Pro Glu Asp Val Val 1 5 10 15 Lys Asn He Lys Lys Gly Met Glu Val Val Tyr Lys Phe Phe Tyr Glu 20 25 30 Asp Pro Leu Gly Lys Lys He Ala Gln Leu Ala Lys Asp Trp Lys Glu 35 40 45 Ala Met Leu Glu Ala Arg Ser Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Glu Tyr 50 55 60 He Arg Gly Leu Lys Asn Glu Ala Ala 65 70
<210> 7 <211> 6 212> PRT <213> Taenia solium <400> 7 He Ala Gln Leu Ala Lys 1 5
Ala Met Leu Glu Ala Arg Ser Lys Val Arg Ala Ser Leu Ala Glu Tyr 50 55 60
He Arg Gly Leu Lys Asn Glu Ala Ala 65 70
<210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Taenia solium <400> 7 He Ala Gln Leu Ala Lys 1 5 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Taenia solium
<221> SITE <222> (21).. (22) <223> Asparagine at position 21 is an airiino acid insertion
<220> <221> VARIAMT <222> (14).. (15) <223> Amino acid at position 14 may also be glycine
<220> <221> VARIANT <222> (18).. (19) <223> Amino acid at position 18 may also be valine
<220> <221> VARIANT <222> (19).. (20) <223> Amino acid at position 19 may also be histidine
<220> <221> VARIA T <222> (20).. (21) <223 i>: Amino acid at position 19 may also be arginine
<400> 8 Lys Asn Lys Pro Lys Asp Asp Ala Ala Ser Thr Lys Lys Glu He Glu 1 5 10 15 Tyr He Trp His Asn Phe Phe Phe 20 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Taenia solium <220> <221> VARIANT <222> (5).. (6) <223> Amino acid at position 5 may also be isoleucine
<220> <221> VARI NT <222> (12).. (13) „
<223> Amino acid at position 12 may also be aspartic acid
<220> <221> VARIANT <222> (7).. (8) <223> Amino acid at position 7 may also be aspargine
<220> <221> SITE <222> (8).. (9) <223> Tryptophan at position is an amino acid insertion