KR20010020567A - 라임병 진단 및 예방을 위한 조성물용의 표면항원 및 단백질 - Google Patents
라임병 진단 및 예방을 위한 조성물용의 표면항원 및 단백질 Download PDFInfo
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Abstract
신규의 분리된 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토(Borrielia burgdorferi sensu lato) 표면항원은 상대 분자질량이 39.5 kDa인 특징이 있다. 이 항원은 B. 부르그도르페리 센수 라토 균주의 스피로헤타균에 의해 생체외에서 발현된다. 이 항원은 생체외에서 ADCK에 의해 B. 부르그도르페리 센수 라토 균주의 스피로헤타균을 사멸시키는 항체를 유발한다. 신규의 보렐리아 카세트 스트링(cassette string) 단백질 또는 그 단편은, P39.5 단백질과 마찬가지로 라임병(Lyme disease)의 진단 및 이 병의 치료 또는 예방용의 조성물에 사용된다.
Description
보렐리아 부르그도르페리 [Borrelia burgdorferi (sensu lato)]는 라임 보렐리오증 (라임병)의 원인물질과 관련이 있고, 또한 그 원인물질이라고 있는 몇가지 보렐리아종(B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii 및 B. afzelii)을 포함하는 속명(generic term)이다. 이 병은 스피로헤타균을 가진 각종의 참진드기(Ixodes ticks)에 물리면 전파된다. 미합중국에 있어서 주요 감염보유 숙주는 흰발 마우스 (Peromyscus leucopus)이며, 개, 고양이 및 인간을 비롯한 수많은 포유동물류에게 감염되고 있다 [J. G. Donahue, et al, Am. J. Trop. Med. Hyg., 36:92∼96 (1987); R. T. Green, et al, J. Clin. Micro., 26:648∼653 (1988)]. 활성면역 응답의 존재에도 불구하고 환자에 있어서 질환은 수년간 지속된다. 이러한 지속성은 적어도 일부는 세균 단백질의 항원성 변이의 결과인 것으로 추정되고 있다 [J. R. Zhang et al, Cell, 89:272∼285 (1977)].
인간 및 포유류에 있어서의 라임병의 진단은 신속하고도 정확한 시험을 할 수 있는 명확한 혈청학이 결핍되어 있어서 만족스럽지 못하다. 기존의 진단시험은 민감성과 특이성이 낮은데, 이것은 미합중국의 Wisconsin State Laboratory of Hygiene에서 발표한 진단 연구실의 최근 연구보고서에도 나와있다 [L. Bakken et al, J. Clin. Microbiol., 35:537 (1997)]. 라임병을 조기에 검출하기 위한 간편하고도 민감하며 특이한 진단 조성물 및 방법을 필요로 하고 있다.
보렐리아 부르그도르페리의 단백질 및 폴리펩티드와 관련된 여러가지 문헌에서는 진단제 또는 의약제로서의 이들의 용도에 대해 시사하고 있다. 이러한 단백질 및 폴리펩티드는 이들의 추정된 분자량에 따라 외부표면 단백질 A 및 B (OspA 및 OspB), 플라젤린(flagellin) 및 기타 P21, P39, P66 및 P83로 지정된 단백질을 포함한다 [A.G. Barbour et al, Infect. Immun., 45:94∼100 (1984); W.J. Simpson et al, J. Clin. Microbiol., 28:1329∼1337 (1990); K. Hansen et al, Infect. Immun., 56:2047∼2053 (1988); K. Hansen et al, Infect. J. Clin. Microbiol., 26:338∼346 (1988); B. Wilske et al, Zentral. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionshkr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe. A., 263:92∼102 (1986); D. W. Dorward et al, J. Clin. Microbiol., 29:1162∼1170 (1991); NT1S 발행 미합중국 특허출원 제 485,551호; 유럽 특허출원 제 465,204호 (1992. 1. 8 공고); 국제 특허출원 제 PCT/US91/01500호 (1991. 9. 19 공고); 국제 특허출원 제 PCT/EP90/02282호 (1991. 7. 11 공고); 국제 특허출원 제 PCT/DK89/00248호 (1990. 5. 3 공고); 국제 특허출원 제 WO92/00055호 (1992. 1. 9 공고)].
백신용의 바람직한 후보 단백질은 OspA이다 [M. Philipp et al, J. Spirochetal and Tick-borne Diseases, 3:67∼79 (1996)]. 스피로헤타균이 진드기의 중장(midgut)으로부터 침샘까지에 걸쳐 있고 혈액을 빨아먹게 되면 OspA의 발현은 없어지거나 약화된다 [A. DeSilva et al, J. Exp. Med., 183:271∼275 (1996)]. 이러한 현상에 의해 OspA 백신의 효능을 상실시키는 문제가 일어날 가능성이 커진다. 진드기의 중장(中腸)에서만 스피로헤타균이 감소할 수도 있으나 [A. DeSilva et al, 상기한 문헌 참조], 척추동물 숙주의 감염에서는 감소하지 않는다. 참진드기 (Ixodes scapularis)의 타액에는 보체(補體)제거 인자가 있기 때문에 [T. Mather et al, "Ixodes saliva: vector competence for Borrelia burgdoferi and potential vaccine strategies", in VII International Congress on Lyme Borreliosis, San Francisco, CA (1996)], 참진드기 중장에서의 스피로헤타균의 감소는 보체가 아닌 항체만이 개재된 메카니즘을 통해 일어난다.
항체 의존성 사멸작용 방식에 대해서는 완전히 규명되어 있지 않으나 항체와 보체가 합동작용하여 되는 경우보다 사멸 메카니즘이 비효율적인 것으로 생각하고 있다 [M. Sole et al, Infect. Immunol., 66:2540∼2546 (1998)]. 따라서 적은 OspA 표면밀도를 가진 이들 스피로헤타균의 중장으로부터 회피가 가능하게 된다. 실제로 OspA는 풍부한 B. burgdorferi 단백질이지만 OspA 분자중의 극히 적은 부분만이 스피로헤타의 외부표면에 노출되어 있다 [D. Cox et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7973∼7978 (1996)]. 따라서 OspA 표면분자의 절대수가 약간만이라도 변하면 스피로헤타 감소에 있어서 유의한 차이가 생기므로 잔존하는 스피로헤타의 일부가 침샘쪽으로 회피할 수 있게된다.
OspA 회피 돌연변이체는 함께 쉽사리 사멸을 피하게 되고, 이들이 척추동물 숙주에 감염되면 OspA 백신효능을 더 한층 저하시키게 된다. 생체외에서 생장시킨 B. burgdorferi의 클론 개체군에 있어서 항(anti-)OspA 항체에 의한 사멸에 저항성을 가진 돌연변이체의 우세도는 10-5내지 10-2의 범위이다 [A. Sadziene et al, J. Exp. Med., 176:799∼809 (1992)]. 이러한 빈도가, 부착 15시간 이내에 스피로헤타의 수가 평균 7,848에 도달하게되는 성장중인 애벌레에서 재현되면 [A. DeSailva et al, Am. J. Trop. Med. Hyg., 53:397∼404 (1995)], 단일의 참진드기에는 몇가지 돌연변이체가 존재하게 된다. 전형적인 돌연변이체 표현형은, OspA나 OspB를 발현하지 않는 것들로서 OspB의 C 말단 단편에 OspA의 N 말단 단편이 융합된 키메라 분자(chimeric molecule)의 발현인자들을 빈번히 발현하는 것들을 포함한다. 이들 결실 돌연변이체는 B. burgdorferi의 복합균주 [P. Rosa et al, Mol. Microbiol. 6:3031∼3040 (1992)]와 캘리포니아산의 몇가지 참진드기 분리물 [T. Schwan et al, J. Clin. Microbiol., 31:3096∼3108 (1993)]에서 발견되었다. 항 OspA 항체에만 의한 사멸에 대한 저항성을 가진 키메라 (결실) 돌연변이체는 항체와 보체의 복합작용에 의해 사멸된다. 보체는 참진드기내에서는 비기능성이고 [T. Mather et al, 위에 나온 문헌 참조], 또한 OspA와 그 키메라형도 감염 직후에 척추동물 숙주내에서 발현되지 않으므로, 키메라 OspA 회피 돌연변이체는 척추동물 숙주를 감염시킬 수 있게 된다. 또한 참진드기 (Ixodid ticks)의 2% 이하가 부분적으로만 성장한다고 추정되므로 아직까지 연구대상이 되고 있다 [Y. Lobet, 사적 의견조회 통신]. 이들 참진드기가 B. burgdorferi 감염 숙주로부터 영양을 불완전하게 취하게 되면 이들의 침샘속에 스피로헤타가 존재하게되어 OspA를 발현하지 않게되어 OspA 백신접종 숙주를 쉽사리 감염시키게 된다. OspA 백신접종 숙주의 스페로헤타균에 의한 공격에 대해 어떠한 효능촉진 효과도 관찰되지 않았고 [M. Phillip et al, 위에 나온 문헌 참조], 어떠한 기대도 할 수 없다. 그러므로 OspA 백신은 효과적인 항체역가를 유지하기 위해서 반복투여를 필요로 한다.
따라서 이 분야에서는 인간과 동물의 라임병 예방 및 그 치료를 위한 추가적인 개선된 방법과 조성물에 대한 요구가 있다.
본 발명은 라임 보렐리오증(Lyme borreliosis)의 진단, 치료 및 예방용의 각종 의약 조성물 및 진단 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 라임병(Lyme disease)의 진단, 치료 또는 예방용의 분리된 보렐리아(Borellia) 천연 표면항원 및 그 항체를 제공한다.
도 1은 JD1 스피로헤타로 접종한 붉은털 원숭이의 혈청을 사용하여, B. 부르그도르페리 균주 JD1 (), B31 () 및 B. 가리니이(B. garinii) 균주 IP90 () 유래의 스피로헤타에 대한 항체 의존성 보체매개에 의한 사멸(ADCK) 적정(titration) 그래프.
도 2는 37.7 kDa의 추정 단백질을 코우드하는 단일 오픈 리딩 프레임을 코우드하는 신규의 P39.5의 DNA 서열의 일부를 나타낸 개략도. 이 DNA를 7-1로 명명하고 추정 단백질을 P7-1로 명명한다. 흑색영역은 서열번호 1 (SEQ ID NO: 1)에서의 약 bp 769 내지 약 bp 854에 걸친 특이영역이다. IA로 표지한 영역은 SEQ ID NO: 1 에서 약 bp 1 내지 약 bp 309의 범위이고, IB는 SEQ ID NO: 1에서 약 bp 855 내지 약 bp 1189의 범위이다. 영역 IA와 IB는 70% 동일성을 가지고 있다. SEQ ID NO: 1에서 약 bp 310 내지 약 bp 494의 범위의 영역 IIA와, SEQ ID NO: 1에서 약 bp 595 내지 약 bp 769의 범위의 영역 IIB는 91% 동일성을 가지고 있다. SEQ ID NO: 1에서 약 bp 208 내지 약 bp 309의 범위의 영역 A와, SEQ ID NO: 1에서 약 bp 495 내지 약 bp 595의 범위의 영역 B는 84% 동일성을 가지고 있다. SEQ ID NO: 1에서 약 bp 1090 내지 약 bp 1189의 범위의 영역 B와 C는 함께 90% 동일성을 가지고 있다.
도 3은 아래의 것들로 처리했을 경우의 IP90 스피로헤타균의 생체외 사멸을 나타낸 막대 그래프:
JD1 스피로헤타 및 원숭이 보체로 감염시킨 원숭이의 혈장 (막대 1),
천연 P39.5 및 원숭이 보체로 친화성 정제한 동일한 혈장 유래의 항체 (막대 2),
보체없이 막대 2에 대한 것과 동일한 항체 (막대 3),
보체 단독 (막대 4), 및
BSK-H 배지 단독 (막대 5).
에러 막대는 2회 측정의 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 4는 아래의 것들을 사용하여 IP90 균주의 스피로헤타의 ADCK를 나타내는 막대 그래프:
1:10의 희석비로 B. 부르그도르페리 JD1로 감염시킨 원숭이 유래의 혈장 풀(plasma pool) (막대 1, 5),
재조합 형태의 P7-1 (rP7-1) 및 Ribi 보조제를 1:10의 희석비로 면역시킨 마우스 유래의 혈청 풀(막대 2, 6) 및 1:50의 희석비로 면역시킨 마우스 유래의 혈청 풀(막대 3), 및
Ribi 보조제 단독으로 면역시킨 마우스 (막대 4, 7).
막대 1∼4의 ADCK에 원숭이 보체를 사용하였고, 막대 5∼7의 ADCK에는 기니아 피그 보체를 사용하였다. 에러 막대는 2회 측정의 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 5는 DNA를 약 8 kb의 길이로 신장했을 경우의 사일런트 VLS 카세트 (silent VLS cassette)의 스트링(string)의 설명도 [J. R. Zhang et al, Cell, 89:275∼285 (1997) 참조].
도 6은 JD1 스피로헤타로써 천자접종 (레인 1) 및 참진드기 접종 (레인 2)을 한 원숭이의 혈청 및 살아있는 모든 JD1 스피로헤타의 후기 혈청 친화성 정제품 유래의 항체 (레인 3)로써 각각 생성시킨 B. 부르그도르페리 균주 JD1과 B31, 및 B. 가리니이 균주 IP90의 스피로헤타 유래의 세포용해 산물의 웨스턴 블롯.
서열목록 설명
SEQ ID NO:1은 클론 7-1의 핵산 서열.
SEQ ID NO:2는 클론 7-1의 추정 단백질 서열.
SEQ ID NO:3은 클론 1-1의 핵산 서열의 5' 말단.
SEQ ID NO:4는 클론 1-1의 부분 핵산 서열로서 핵산 서열의 중앙에서 발견됨.
SEQ ID NO:5는 클론 1-1의 핵산 서열의 3' 말단.
SEQ ID NO:6은 클론 3-1의 핵산 서열의 5' 말단.
SEQ ID NO:7은 클론 3-1의 핵산 서열의 3' 말단.
SEQ ID NO:8은 클론 6-1의 핵산 서열의 5' 말단.
SEQ ID NO:9는 클론 6-1의 핵산 서열의 3' 말단.
SEQ ID NO:10은 클론 9-1의 핵산 서열의 5' 말단.
SEQ ID NO:11은 클론 12-1의 핵산 서열의 5' 말단.
SEQ ID NO:12는 클론 12-1의 핵산 서열의 3' 말단.
SEQ ID NO:13은 클론 14로부터 얻은 부분 핵산서열의 5' 말단이며, 클론 7-1 [SEQ ID NO:1]의 5' 말단에 부가되면 P39.5의 큰 단편, 즉 P7-1을 형성한다. 첫번째 5' 말단의 6개 염기는 플라스미드 벡터에서 유래한다.
SEQ ID NO:14는 SEQ ID NO:13의 추정 단백질 서열.
[발명의 실시를 위한 최선의 형태]
본 발명은 척추동물 숙주내에(즉, "생체내에") 존재할 경우 스피로헤타에 의해 발현되는 신규의 보렐리아 표면항원인 P39.5를 제공한다. 이 항원은 항체 의존성의 보체 매개에 의한(ADCK) 생체외 사멸에 의하여 표적이 된다. 이 신규의 항원, 그 단편, 여기에 대해 생성되는 항체, 이것을 코우드하는 핵산서열, 및 라임병의 치료 또는 예방을 위한 진단, 치료 및 예방용 조성물 및 치료 또는 예방 방법에서의 이들 항원과 항체 및 핵산서열의 용도에 의해, 이러한 목적의 공지의 조성물 및 방법에서의 기타의 보렐리아 단백질 및 항체의 용도에 비해 장점을 제공한다.
I. 본 발명의 P39.5 항원
한가지 실시형태에 있어서 본 발명은 P39.5라고 하는 신규의 분리된 보렐리아 항원을 제공한다. 이 항원은 보렐리아 스피로헤타, 즉 B. 그리니이 균주 IP90에 의해 생체내외에서 발현된다. 이 항원 또는 그 상동체도 B. 부르그도르페리 센수 스트릭토(sensu stricto) 균주 JD1, B31 및 NT1의 스피로헤타에 의해 생체내에서 발현된다. 이 항원의 IP90 스피로헤타에서의 겉보기 분자질량은 39.5 kDa이며, 보렐리아 스피로헤타에 의한 자연감염 도중에 동물에 있어서 항체를 유발할 수 있는 능력을 가지고 있다는 기능적인 특징이 있다. 이들 유도된 항체는 생체외에서 ADCK에 의하여 IP90 스피로헤타를 사멸시킨다. 유도된 항체도 미합중국의 환자의 뇌척수액으로부터 분리된 균주인 B. 부르그도르페리 센수 라토의 NT1균주의 스피로헤타를 사멸시키지만, 센수 라토 복합종내에서 추가적인 특징을 가지고 있지 않다. 이 균주는 미합중국의 뉴욕 주립대학 (New York주의 Stony Brook 소재)의 Patricia Coyle 박사로부터 입수하였다.
B. 부르그도르페리 센수 라토 균주 (B. 가리니이 균주 IP90) 유래의 유전자 단편 7-1을 pBluescript II 플라스미드에 삽입하고 E. coli에서 형질변환시킨 것을 미합중국의 기탁기관 [the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland]에 1997년 6월 27일자로 수탁번호 제 98478호로 기탁하였다. 이 유전자 단편을 E. coli에서 발현시켜 순수한 단백질로서 분리하고, 이 단백질을 마우스에 있어서 면역원(immunogen)으로 사용하면 생성된 항체는 IP90의 P39.5와 반응한다. 보렐리아 가리니이 균주 IP90 유래의 기타의 유전자 단편 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 및 12-1을 마찬가지로 하여 각각 pBluescript II 플라스미드에 삽입하고 E. coli에서 형질변환시킨 것을 기탁하였다. 즉, 이들은 1998년 6월 25일 이전에 ATCC에 수탁번호 제 98768호(유전자 단편 1-1), 제 98769호(유전자 단편 3-1), 제 98770호(유전자 단편 6-1), 제 98771호(유전자 단편 9-1), 제 98772호(유전자 단편 12-1)로 기탁되었다.
이들 기탁은 모두가 특허절차를 위한 미생물 기탁의 국제인정에 관한 부다페스트 조약의 조건을 만족한 것이었고, 또한 특허목적의 기탁을 위한 미합중국 특허상표청의 조건을 완전히 충족한 것이었다. 본 발명에 사용되는 서열들은 이들 기탁기관으로부터 입수할 수 있다.
A. 핵산 서열
본 발명은 P39.5의 단편을 코우드하는 포유동물의 핵산서열을 제공한다. 본 발명의 이 핵산서열은 이들이 자연적으로 관계되어 있는 세포물질로부터 분리된 것이다. 아래에 나온 각 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 보렐리아 P39.5 유전자의 코우딩 영역의 일부를 코우드하는 1190 bp의 세그먼트를 클로닝하여 서열분석하였다. 이것은 추정의 37.7 kDa 단백질을 코우드하는 단일의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 이 부분 DNA 서열은 SEQ ID NO:13 및 1에 나와있다. SEQ ID NO:13은 SEQ ID NO:1의 첫번째 염기에 바로 인접한 서열 5'이다. 아울러 이들 서열은 1189 bp의 부분 단백질 및 약 396 아미노산과 관련이 있다. 서열이 분석된 단편들은 SEQ ID NO:1의 약 bp 627 내지 약 bp 712 범위의 특이영역과 몇개의 내부 반복영역을 함유하는 거의가 친수성인 도메인으로 되어 있다. 도 2를 참조하면 반복서열을 확인할 수 있고, 또한 이들 서열의 상동성과 % 동일성을 확인할 수 있다.
여기서는 단백질 및/또는 DNA 서열을 확인된 서열에 대한 이들의 상동성 또는 동일성으로 정의하게 되면, % 동일성 또는 % 유사성을 계산하는데 사용된 알고리즘에는 Smith-Waterman 알고리즘 [J. F. Collins et al, 1988, Comput. Appl. Biosci., 4:67∼72; J. F. Collins et al, Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M. J. Bishop et al, eds.) In Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK (1987), pp. 417] 및 BLAST와 FASTA 프로그램 [E. G. Shpaer et al, 1996, Genomics, 38:179∼191]을 포함한다. 이들 문헌을 본 명세서에서 참고문헌으로서 원용한다.
또한 본 발명에 포함된 것은 기타의 보렐리아 핵산 단편들, 즉 카세트 스트링 단편들과 P39.5의 단편들이다. 이들 단편들을 각각 1-1 (단백질/펩티드 P1-1을 코우드함), 3-1 (단백질/펩티드 P3-1을 코우드함), 6-1 (단백질/펩티드 P6-1을 코우드함), 9-1 (단백질/펩티드 P9-1을 코우드함), 및 12-1 (단백질/펩티드 P12-1을 코우드함)라 한다. 바람직하게는 이들 단편들은 P39.5의 생물학적 활성부분, 즉 에피토우프(epitope)를 코우드하는 특징을 가지고 있다. 일반적으로 이들 올리고뉴클레오티드 단편들은 적어도 그 길이가 15개 뉴클레오티드이다. 그러나 여러가지 크기의 올리고뉴클레오티드 단편들을 필요에 따라 선택할 수 있다. 이들 단편들을 이러한 목적으로 사용하여 예컨대 생검 조직시료에 대해 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)을 실시할 수 있다. 예컨대 유용한 P39.5 DNA 단편들 및 대응한 서열들은 SEQ ID NO:1의 bp 793∼816과 SEQ ID NO:13의 bp 59∼85 사이에서 발생하는 서열을 포함한다. 기타 유용한 단편들은 도 2에서 확인된다. 단편 1-1은 SEQ ID NO:3, 4 및 5의 서열을 포함하고, 단편 3-1은 SEQ ID NO:6 및 7의 서열을 포함하고, 단편 6-1은 SEQ ID NO:8 및 9의 서열을 포함하고, 단편 9-1은 SEQ ID NO:10의 서열을 포함하고, 단편 12-1은 SEQ ID NO:11 및 12의 서열을 포함한다. 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 및 12-1의 완전서열과 기타의 유용한 단편들은, 당업자라면 상기한 ATCC에 기탁된 DNA에 적용된 통상적인 DNA 서열분석 기술에 의하여 얻을 수 있다.
SEQ ID NO:1 및 3∼12의 DNA 서열과 상기한 기탁된 것들에 의하여 이들 DNA 서열의 대응한 앤티센스 스트랜드를 쉽사리 얻을 수 있다. 또한 공지의 기술을 이용하여 필요에 따라 설명된 DNA 서열 및 대응한 RNA 서열에 인접한 추가의 게놈 서열 및 cDNA 서열을 쉽사리 얻을 수 있다. 마찬가지로 본 발명의 기탁물질과 SEQ ID NO:1 및 3∼12을 입수할 수 있기 때문에 통상의 방법, 즉 폴리머라아제 연쇄반응에서 본 발명의 핵산서열을 프로우브로 이용하여 기타의 종 P39.5 상사체, B. 가라니이 및 그 단편들을 얻을 수 있다. P39.5 SEQ ID NO:2의 기타 변이체 등의 1종에 속하는 이들 서열 (예컨대, 1종 이내에서 공통적으로 발생하는 하나 이상의 서열과는 약간 개별적인 차이가 있는 서열이지만 동일한 기능을 가진 단백질 또는 동일한 단백질을 코우드하는 서열)의 대립형질 변이체도 본 발명에 의해 제공되는 이 서열에 관한 지식을 이용하여 쉽사리 얻을 수 있다.
또한 본 발명은 SEQ ID NO:1의 서열에 대해 긴축 조건하에서 하이브리다이즈 [J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989) 참조] 할 수 있는 핵산서열, 이들의 앤티센스 스트랜드 또는 그 생물활성 단편들을 포함한다. 하이브리다이제이션을 위한 고도의 긴축조건의 한가지 예로서는 2XSSC에서 60℃에서 하이브리다이제이션한 다음, 0.1XSSC에서 60℃에서 1시간 세정하는 것이다. 또는 극히 하이브리다이제이션을 위한 극히 고도의 긴축조건의 한가지 예로서는 50% 포름아미드중에서 4XSSC에서 42℃에서 실시하는 것이다. 하이브리다이제이션을 위한 완만한 고도의 긴축조건도 이용할 수 있는데, 즉 4XSSC에서 55℃에서 하이브리다이제이션한 다음, 0.1XSSC에서 37℃에서 1시간 세정하는 것이다. 또한, 하이브리다이제이션을 위한 완만한 고도의 긴축조건의 다른 예로서는 50% 포름아미드중에서 4XSSC에서 30℃에서 실시하는 것이다.
본 발명에 의하여 핵산서열을 변형할 수도 있다. SEQ ID NO:1 및 3∼12의 서열 데이타를 이용하여 통상의 방법에 따라 본 발명의 유용한 단편들 또는 전장(full-length) 단백질을 코우드하는, 기타의 폴리뉴클레오티드 서열 혹은 변형된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성적 혹은 재조합적으로 제조할 수 있다. 핵산 레벨에서의 이러한 변형은, 예컨대 발현 또는 분비를 향상시키기 위하여 사일런트(silent)한 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산을 변화시키는 뉴클레오티드 서열로의 변형을 포함한다. 또한, 유전 코우드의 자연 축중(degeneracy)에 의한 대립형질 변이체도 포함된다.
또한 본 발명에 포함되는 것으로는 P39.5 단편 및 여기에 구성된 카세트 스트링 서열 1-1, 3-1, 6-1, 7-1, 9-1 및 12-1의 돌연변이체이다. 이들 돌연변이체는 전장 P39.5 또는 기타 단백질 혹은 단편의 항원성을 실질적으로 유지하는 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 내부 결실을 포함한다. 이러한 결절된(truncated) 혹은 결실의 돌연변이체를 발현시켜 전장 혹은 야생형 유전자 또는 유전자 단편의 활성에 영향을 주도록 할 수도 있다.
이들 핵산서열을 각종 진단, 예방 및 치료에 사용할 수 있다. 바람직하게는 핵산서열을 이용하여 진단용 프로우브 및 앤티센스 프로우브를 개발하여 여러가지 공지의 핵산 분석, 즉 이 기술분야에서 공지된 Northern blot 및 Southern blot, 폴리머라아제 연쇄반응 (PCR), 및 기타의 분석기술을 이용한 라임병의 검출 및 진단에 사용할 수 있다. 본 발명의 핵산서열을 사용하여 P39.5 단백질 및 상동체와 기타의 B. 가리니이 단백질을 제조할 수도 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은, 위에서 인용한 바 있는 Sambrook 등의 저서 등의 종래의 텍스트에 기재된 것들과 같은 통상적인 폴리머라아제 연쇄반응 또는 클로닝 기술에 의해 분리할 수 있다. 예컨대 본 발명의 항원의 핵산서열은, DNA 프라이머와 프로우브 및 PCR 기술을 이용하여 B. 가리니이로부터 제조하여 분리할 수 있다. 또한, B. 가리니이 전(全) 게놈 DNA 유래의 유전자 뱅크로부터 항원을 얻을 수도 있다. 이들 서열, 그 단편, 이들에 대한 변형물 및 전장 서열을, 통상적인 유전공학 기술 또는 화학합성 기술 혹은 PCR을 이용하여 재조합함으로써 구축할 수 있다.
B. 단백질 서열
또한 본 발명은, 본 발명의 펩티드/단백질 P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1, 및 P12-1과, p39.5 폴리펩티드 및 단백질을 포함하여, B. 가리니이 펩티드 및 단백질 등의 B. 부르그도르페리 센수 라토 단백질을 제공한다. 이들 단백질은 자연에서 발견되는 기타의 혼입 단백질 또는 혼입물이 함유되지 않은 것이다. 천연의 P39.5를 Triton-X114 추출에 의해 세제속으로 완전히 추출하였기 때문에 그것은 지방 단백질일 수도 있다. P39.5 항원은 Western 면역 블롯으로 측정한 상대 분자질량이 39,500 kDa이다 (실시예 2 및 도 6 참조). 한가지 실시예에 있어서 본 발명은 약 354개의 아미노산으로 된 부분 P39.5 [SEQ ID NO:2] 폴리펩티드를 제공하는데, 이것은 지방 단백질과 유사하며 추축된 상대 분자질량은 약 37.7 kDa이다 (예컨대 "P7-1 단편"). 이 추정된 아미노산 서열[SEQ ID NO:2]은 보렐리아 헤름시이 (Borrelia hermsii)의 외부 표면 지방단백질의 변이성 주단백질 (Vmp)의 요소와 22% 까지 동일한데 (실시예 6 참조), 이것은 B. 부르그도르페리의 B31 균주의 Vmp 유사 서열 (vls) VlsE [J. R. Zhang et al, 위에 나온 문헌 참조]과 약 50% 동일하고, 또한 B. 부르그도르페리의 기타 vls 서열과 약 50% 동일하다 [예컨대, Vls-6 Genbank no. U76404 (190 aa에 대해 53% 동일); VlsEGenbank no. U84553 (210 aa에 대해 57%) 및 U84556 (209 aa에 대해 58%) 및 U84555 (210 aa에 대해 58%)].
VlsE는 재조합 메카니즘에 의해 항원 변이를 함으로써 발현된 카피 (VlsE)의 중앙 단편을 발현된 카피의 하류쪽에 위치한 15개의 "카세트"의 스트링 유래의 단편과 재조합하는 B 부르그도르페리의 항원의 일부이다 [J. R. Zhang, 위에 나온 문헌 참조]. 각 카세트는 그 평균길이가 500 bp이고, 전체 스트링은 약 8 kb의 신장된 DNA를 차지한다. 이 카세트 스트링의 한가지 현저한 특징은, B. 부르그도르페리 B31에 있어서 카세트는 카세트 vls11에서의 1 정지 코돈만큼 중단된 거의 연속적인 오픈 리딩 프레임내에서 배치되어 카세트 vls14 및 카세트 vls16에서 2 프레임 이동해 있다. 위에 나온 Zhang 등의 문헌에서 정의된 유사한 구조의 카피인 도 6을 참조.
P39.5의 길이가 긴 부분 단백질 서열은, 클론 14 유래의 부분 서열 [SEQ ID NO:14]을 SEQ ID NO:2의 서열의 5' 말단에다 직접 융합시켜 형성한다. 클론 14 유래의 서열은, 이들 서열을 얻게되는 두가지 클론 사이의 서열을 중첩시킴으로써 얻게 되는 P17-1의 서열에 대한 서열 5'로서 확인하게 되는데, 이러한 중첩서열에 의해 이들이 동일한 오픈 리딩 프레임의 일부임을 알 수 있다. 따라서 큰 P39.5 추정 아미노산 서열에 있어서 Leu (SEQ ID NO:14의 아미노산 47)에 바로 이어서 Lys (SEQ ID NO:2의 아미노산 1)이 온다.
본 발명은 B. 가리니이 IP90의 카세트 스트링의 일부인 몇개의 단편의 추정 아미노산 서열과 부분 DNA 서열을 제공한다. 7-1을 포함해도 좋은 이들 단편을 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 및 12-1로 명명하며 그 길이는 1∼12 kb이다. 이들 각각은, 삽입물의 크기와 같고 감염된 원숭이 유래의 항체와 반응하는 펩티드 (pBluescript의 lacZ 프로모우터의 오프)를 발현한다. 이들 단편 [SEQ ID NO:1, 3, 6, 8, 10 및 11]의 5' 말단은 어느것이라도 세균성 지방 단백질의 특징인 타입의 시그날 펩티다아제 II 콘센서스 서열 또는 소수성 리더(hydrophobic leader)를 가지지 않는다. 따라서 이들 단편은 IP90의 카세트 스트링의 일부이며, 또한 B31의 카세트 스트링처럼 이들은 프레임내에 있다. 이들 vls 유사 단백질은 부분 5' 및 3' 서열에 의해 확인된다 [SEQ ID NO:1, 3, 5 내지 12 참조]. PCR 등의 통상적인 기술을 이용하는 당업자라면 위에서 확인된 각각의 카세트 스트링 단백질에 대해 ATCC에 기탁된 물질 또는 B. 가리니이 (의 DNA 라이브러리의) DNA 서열 및 부분 5'와 3' 서열을 용이하게 사용하여 그 완전 서열을 확인할 수 있다. 이들 방법은 루틴한 것이어서 주어진 정보 한도내에서 불필요하게 많은 실험을 할 필요가 없다고 생각된다.
본 발명의 항원은 제한없이 SDS-PAGE/염색법, HPLC 등의 생물물리학적 측정법에 의한 거대분자 질량 측정법, 웨스턴 블롯과, 세포, 단백질 또는 항체의 양자전달(adoptive transfer)에 의한 면역보호 또는 면역 병리학을 확인하기 위한 항체인식 시험법, T세포 인식 시험법, MHC 결합 시험법 및 기타의 시험법을 비롯한 각종 면역학적 측정법으로 측정할 수 있다는 특징이 있다.
본 발명의 단백질성 P39.5 표면항원 (및 기타 종의 보렐리아에서의 자연발생하는 변이체 또는 상사체, 혹은 기타 Vls 유사 단백질)을 완전 그대로의 단백질 또는 폴리펩티드 혹은 그 단편의 형태로 분리할 수 있다. 한가지 예로서 아래의 실시예 5에 나온 바와 같이 각각의 분자질량에 따른 면역 블롯법에 의하여 P39.5를 분리할 수 있다. 이러한 분리에 의하여 미생물과 참진드기 벡터의 기타의 단백질성 물질 및 비단백질성 물질이 실질적으로 함유되지 않은 형태의 항원을 제공하게 된다. 본 발명의 보렐리아 폴리펩티드 및 항원을 함유한 분자들을 스피로헤타로부터 분리하여 각종의 통상적인 방법, 예컨대 HPLC, FPLC 등을 사용하는 정상적인 상(相) 또는 역상 액체 크로마토그래피, (예컨대 무기 리간드 또는 모노클로날 항체를 사용하는) 친화성 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피, 부동화 금속 킬레이트 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 이용하여 더욱 정제한다. 본 발명의 범위로부터 일탈하지 않는 한 가장 적절한 분리 및 정제 기술을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 P39.5 또는 기타의 보렐리아 단백질의 아미노산 서열은, 통상적인 유전공학 기술에 따라 재조합하여 생성시킬 수 있다 [Sambrook 등에 의한 위에 나온 문헌 및 아래에 나오는 단백질 제조에 관한 상세한 설명 참조].
가. 상사체/변형 항원
또한 본 발명에는 P39.5 단백질 또는 vls 유사 단백질 P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 및 P12-1의 각종 상사체와 변형체를 포함한다. 대표적으로 이들 상사체는 특이하게 확인된 단백질과는 1 내지 4 코돈 변화만큼 상이하다. 각 실시예에는, 예컨대 P7-1 (SEQ ID NO:2)의 부분 아미노산 서열로부터의 일부 아미노산의 변화, 특히 보존 아미노산 치환에 의한 폴리펩티드를 포함한다.
보존치환은 아미노산의 측쇄 및 화학적 성질과 관련된 아미노산내에서 일어나는 치환이다. 또한 SEQ ID NO:2와 적어도 85% 동일성을 가지거나 vls 유사 단백질의 서열을 가짐을 특징으로 하는 본 발명의 단백질의 상동체가 제공된다. 여기서 제공되는 서열정보에 근거하여 기타의 세균종으로부터 전장 P7-1 또는 P7-1 상동체와 상사체 및 전장 vls 유사 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 및 12-1 단백질 상동체와 상사체를 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명의 항원을 변형하여 그 면역원성(immunogenicity)을 증강시킬 수도 있다. 예컨대 항원을 화합물 또는 면역원성 담체에다 결합시킬 수 있는데, 이 결합에 의해 항원 또는 담체의 소요의 생물학적 활성이 저해되지 않는다. 이러한 결합에 대해 몇가지 일반적인 고려사항에 대해서는 문헌[antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow and D. Lane (1988)]을 참조하면 된다. 공지의 유용한 면역원성 담체로서는, 제한된 것은 아니나, 키이홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin: KLH), 소혈청 알부민 (BSA), 오브알부민, PPD [튜버큘린(tuberculin)의 정제 단백질 유도체], 적혈구, 파상풍 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 아가로오스 비이드, 활성탄 또는 벤토나이트 등을 들 수 있다. 결합용의 바람직한 화합물로서는, 한정된 것은 아니나, 디니트로페놀계 및 아르소닐산 등이 있다.
가열 및/또는 SDS에 의한 변성처리 등의 기타의 기술에 의해서도 항원을 변형시킬 수 있다.
나. 단편/결실 돌연변이체
본 발명에는 더욱이 P39.5 폴리펩티드, P7-1 펩티드 또는 기타의 vls 유사 단백질의 단편을 추가로 포함한다. 이들 단편은 라임병의 유발물질에 대한 항체를 유발하는 능력을 비롯하여 완전 단백질이 나타내는 것과 유사한 생물활성을 가짐을 특징으로 한다. 이들 단편을 아미노산 길이로 약 5∼8개로 적게 하는 등의 소요의 길이로 하여 디자인하거나 얻을 수 있다. 이러한 단편은 단백질의 에피토우프를 나타낸다.
P39.5의 내부 반복단위 (도 2)는 OspA 처럼 단백질이 보렐리아에서 상동성의 재조합을 함으로써, 짧아지고 부분적으로 결실된 유전자 버죤을 발현하는 돌연변이체를 생성함을 나타낸다. 따라서 본 발명의 P7-1 단백질 [SEQ ID NO:2]을, 예컨대 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 절단하거나, 혹은 하나 이상의 아미노산을 제거함으로써 변형하여 결실 돌연변이체를 생성시킨다. 반복 서열의 상동성 재조합 (도 2)에 의해 생성된 P7-1의 결실 돌연변이체도 본 발명에 포함되며, 이들을 코우드하는 DNA 서열도 포함된다. 어떠한 결실 돌연변이체에서는 상기한 P39.5 코우딩 영역의 일부, 즉 영역 IIA, IIB 및 B가 결실되어 있다.
OspA와는 달리 P39.5 처럼 생체내에서 발현되는 P39.5 항원의 결실 돌연변이체도 척추동물 숙주의 감염시에 사멸될 수 있다. 대부분의 결실 돌연변이체는 보체 부재하에서는 앤티-OspA 항체에 의한 사멸을 회피하지만, 이 항체와 보체가 함께 작용하면 사멸된다. 앤티-OspA 항체는 참진드기 중장 (여기서는 OspA는 발현되지만 보체는 비활성임)에서 스피로헤타균을 사멸하기 때문에 OspA 결실 돌연변이체는 OspA 백신에 의해 유발된 앤티-OspA 항체를 회피하게 된다. 이에 반하여 P39.5는 생체내에서 발현되기 때문에 보체와 앤티-P39.5 항체가 모두 존재하면 P39.5 결실 돌연변이체는 P39.5계 백신을 회피할 수 없다.
기타 변형 단편들인 P39.5, P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 및 P12-1는 통상적인 방법에 의하여 그 제조수율을 향상시키거나, 단백질 안정성 또는 기타 특성, 즉 결합활성 또는 생체 이용성을 향상시키거나, 단백질에 기타 몇가지 소요의 성질을 부여하기 위해 제조할 수도 있다. 이들 폴리펩티드의 기타 유용한 단편은 결실 돌연변이 유발 및 발현 등의 공지의 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다.
다. 융합 또는 다중 단백질 및 조성물
본 발명의 P39.5 단백질 또는 그 단편 및 vls 유사 카세트 스트링 단백질 또는 그 단편은, 통상적인 유전공학 기술을 이용하여 거대 및/또는 다중 단백질 혹은 단백질 조성물의 일부로서 구축할 수도 있다. 본 발명의 항원은 OspA, OspB 및 OspC 등의 B. 부르그도르페리 외부 표면 단백질 및 BmpA, B, C와 병용해도 좋고, 혹은 상기한 항원의 각종 단편들을 서로간에 병용해도 좋다. 이러한 병용에 있어서 항원은 융합 단백질 형태이어도 좋다. 본 발명의 항원을, 선택된 폴리펩티드 또는 단백질, 예컨대 보렐리아 항원 OspA, OspB, OspC, BmpA, BmpB, BmpC, 기타 보렐리아 항원, 및 기타의 미생물 유래의 단백질 또는 폴리펩티드에다 임의로 융합시킬 수 있다. 예컨대 본 발명의 항원 또는 폴리펩티드를 OspA 폴리펩티드, OspB 폴리펩티드 및 OspC 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 융합시키거나, 혹은 비(non) OspA 및 비 OspB 폴리펩티드 또는 이들의 조합에 대해 융합시킨다. 본 발명의 목적에 유용한 OspA 및 OspB 폴리펩티드는 종래에 확인된 폴리펩티드 [PCT/US91/04056 참조] 및 그 변이체를 포함한다. 본 발명의 목적에 유용한 비 OspA 및 비 OspB 폴리펩티드는, B. 부르그도르페리 OspC 단백질, 편모관련 단백질 및 그 단편, 기타의 B. 부르그도르페리 단백질 및 그 단편과 비(non)-B. 부르그도르페리 단백질 및 그 단편을 비롯하여 종래에 확인된 것들과 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 융합 단백질은, P39.5와 상동성 (25∼95% 동일)인 DNA 단편에 융합된 P39.5 DNA 서열 또는 그 단편에 의해 생성된 DNA 분자를 발현시켜 제조한다. 이러한 단백질의 한가지 예는 그 서열과 95% 까지 동일한 융합된 아미노산 단편이 융합된 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 함유한다. 이들 단편을 어떠한 순서로 삽입해도 좋으며, 여기에는 도 2에 나온 것과 같은 반복 서열을 함유하여도 좋다. 단일의 오픈 리딩 프레임을 형성하는 이들 길이가 긴 DNA 스트링은, P39.5를 포함하여 P39.5 상동체로부터 구성해도 좋고, 혹은 1종 이상의 vls 카세트 단백질 등의 천연산의 길이가 긴 오픈 리딩 프레임으로부터 유도해도 좋다. B. 가리니이 유래의 vls 카세트 단백질 (즉, 단백질 P1-1, P3-1, P6-1, P9-1 및/또는 P12-1)을 서로 융합시키고, 혹은 P39.5 또는 P7-1 DNA 서열속에 삽입함으로써 거대한 DNA 분자를 형성시켜 각종 항체 특이성을 자극할 수 있는 단백질을 발현시킨다.
본 발명의 다중 폴리펩티드를 함유한 이들 융합 단백질을 구축하여 본 발명의 방법과 조성물에 사용한다. 이들 융합 단백질 또는 다중 단백질을 재조합에 의해 제조하거나 화학합성하여 제조할 수 있다. 또한 이들은 지질 및 탄수화물을 비롯하여, 아미노산 이외의 성분에 융합 또는 결합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이 본 발명의 항원을 위에 나온 종래의 기타 보렐리아 백신제 및 기타의 바이러스 유래의 백신제와 병용할 수도 있다. 이들 단백질은 본 발명에 있어서 광범위한 종류의 B. 부르그도르페리 분리물에 의해 유발된 라임병의 예방, 치료 및 진단에 효과적이다.
상기한 융합 단백질의 바람직한 대체물인 단백질 조성물은 본 발명의 카세트 스트링 단백질의 상이한 혼합물 또는 상이한 P39.5 단백질 혹은 그 단편을 함유한 칵테일 (예: 단순 혼합물)이다. 이들 단백질 또는 그 항원성 단편의 이러한 혼합물들은 B. 가리니이에 대한 소요의 항체생성에 유용하다.
라. 염류
본 발명의 항원을 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용해도 좋다. 본 발명의 폴리펩티드와 염을 형성할 수 있는 적당한 산 및 염기는 공지되어 있으며, 무기 및 유기의 산 및 염기를 포함한다.
II. 본 발명의 항원 및 핵산서열의 제조방법
A. 생체외에서의 발현
본 발명의 재조합 P7-1 및/또는 기타의 카세트 스트링 단백질 혹은 기타의 P39.5 단편을 제조하자면 본 발명의 DNA 서열을 적당한 발현계에다 삽입한다. 바람직하게는 선택된 단백질, 예컨대 P7-1을 코우드하는 폴리뉴클레오티드 서열을, 단백질을 발현하는 이형의 발현제어 서열에다 연결함으로써 재조합 분자 혹은 벡터를 구성한다. 표준 분자 생물학에 의한 단백질 발현을 위해 여러가지 종류의 적당한 발현 벡터가 알려져 있다. 이러한 벡터들은 곤충을 포함한 종래의 벡터, 예컨대 바큘로바이러스 발현계 또는 효모, 진균, 박테리아 혹은 바이러스 등의 발현계중에서 선택한다. 여러가지 타입이 공지되어 있는 기타 적당한 발현 벡터도 이러한 목적으로 사용할 수 있다 [Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Miller et al, Genetic Engineering, 8:277∼298 (Plenum Press 1986) 및 이들 문헌에 인용된 문헌들 참조].
이 방법으로 감염시키는 적당한 숙주세포 또는 세포제는 세균세포를 포함한다. 바람직하게는. 지방 단백질로 믿어지는 P39.5 단백질의 사용 (실시예 5 참조)을 위해서는 적어도 선택된 단백질을, 지질을 부착시키는 세포기구를 가진 세균속에서 발현시킨다. 이 발현계는 단백질을 백신 또는 치료에 사용하기 위해 발현시킬 경우에 특히 바람직하다. 예컨대 각종 E. coli 균주 (예: HB101, MC1061, 및 아래의 실시예에서 사용되는 균주들)는 생물공학 분야에서 숙주세포로 공지되어 있다. B. 서브틸리스, 슈우도모나스, 스트렙토코커스 및 기타 바실루스 등의 각종 균주도 이 방법에 사용할 수 있다.
종래 공지된 효모세포의 대다수 균주는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주세포로서 사용할 수도 있다. 기타의 균상세포도 발현계로서 사용할 수 있다. 효모는 단백질을 지질화할 수도 있지만 이 지질화 패턴은 세균과는 상이한데, 즉 천연 단백질과는 상이하다.
차이니즈 햄스터 난소세포 (CHO), 원숭이 COS-1 세포계 또는 스위스 Balb-c 혹은 NIH 마우스 유래의 쥐 3T3 세포, 인간 293 세포 등의 포유류 세포를 사용한다. 다른 적당한 포유류 세포는 CV-1 세포계이다. 기타의 적당한 포유류 숙주세포와, 트랜스펙션, 배양, 증폭, 스크리닝, 증식 및 정제 등의 방법은 공지되어 있다. [예컨대 Gething and Sambrook, Nature, 293:620∼625 (1981), 또는 Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7):1750∼1759 (1985) 혹은 Howley et al, 미합중국 특허 제 4,419,446호 참조].
또한 스포돕테라 프루지페데라(Spodoptera frugipedera) (Sf9) 등의 곤충세포를 사용할 수도 있다.
따라서 본 발명은 전사조절 서열의 제어하에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적어도 하나의 발현벡터를 가진 숙주세포를, 예컨대 일렉트로포레이션 등의 통상적인 수단을 사용하여 트랜스펙션하는 것을 포함하는, 보렐리아 단백질, 즉 P7-1 또는 기타의 카세트 스트링 단백질의 제조방법을 제공한다. 이어서 트랜스펙션 또는 형질전환된 숙주세포를 단백질을 발현하는 조건하에서 배양한다. 발현된 단백질을 공지의 적당한 방법에 의하여 세포로부터 (또는 배지로부터, 필요한 경우에는 세포외에서) 회수하고, 분리한후, 임의로 정제한다.
예컨대 단백질을 세포용해법에 따라 가용성 형태로 분리하거나 공지의 방법을 사용하여 염화 구아니딘 등으로 추출한다. 필요에 따라서는 본 발명의 단백질 또는 단편을 융합 단백질로서 제조한다. 이러한 융합 단백질은 위에 나온 것들이다. 또한, 예컨대 선택된 숙주세포에서 단백질의 발현을 증대시키거나, 정제를 개선하거나, 또는 조직, 세포 또는 세포 추출물에서 소요의 단백질, 예컨대 P7-1의 존재를 모니터링하는데 사용하기 위해 융합 단백질을 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명의 단백질을 위한 적당한 융합 파트너는 공지되어 있으며, 그 중에서도 β-갈락토시다아제, 글루타티온-S-트란스페라아제 및 폴리-히스티딘을 포함한다.
B. 생체내에서의 발현
또한, 본 발명의 P7-1 또는 기타의 카세트 스트링 단백질 (전장 단편 또는 소요의 단편)을 생체내에서 발현시켜 항체를 또는 DNA 백신으로서 유발시키고자 할 경우에는 적당한 전달 벡터를 용이하게 선택할 수 있다. 생체내 유전자 전달을 위한 벡터는 여러가지 입수원, 즉 학계 및 시중에서 입수할 수 있으며, 이들 벡터는 아데노 관련 바이러스 [국제특허 출원 제 PCT/US91/03440], 아데노바이러스 벡터 [M. Kay et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2353 (1994); S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 92:883 (1993)], 혹은 기타의 바이러스 벡터, 즉 각종 폭스바이러스 (poxvirus), 우두진(vaccinia) 등을 포함한다. 소요의 유전자, 예컨대 P7-1를 삽입하여 코우드된 단백질을 생체내 발현시키는 방법은 공지되어 있다.
III. 본 발명의 항체
또한 본 발명은 본 발명의 분리 항원 또는 변형 항원 또는 다중 항원을 인식하여 결합할 수 있는 항체, 및 이들 항원 또는 그 단편의 혼합물 유래의 항체를 제공한다. 이들 항체는 라임병에 대해 시험시 양성을 나타내거나 시험전에 라임병의 증상을 나타내는 인간 및/또는 동물을 치료하는 치료용 조성물 및 라임병의 진단에 사용된다. 이들 항체는 진단에만 사용할 수도 있고, 혹은 본 발명의 기타 항원에 대한 항체 및 기타 공지의 B. 부르그도르페리 항원에 대한 항체와 병용할 수 있다. 또한 이들 항체를 수동 백신 조성물에 사용할 수도 있다.
본 발명의 항체는, 통상적인 수단에 의하여 본 발명의 분리 항원 또는 재조합 항원 또는 변형 항원 혹은 이들 항원 또는 항원성 단편의 혼합물을 사용하여 생성된다. 예컨대 폴리클로날 항체는, 선택된 동물 또는 인간의 면역계를 통상의 방법으로 본 발명의 분리항원 또는 항원성 단백질 또는 펩티드의 혼합물로써 자극시킨후 면역계에서 자연항체를 생성시켜, 동물 또는 인간의 혈액 또는 기타 체액으로부터 이들 항체를 채취함으로써 얻게된다.
예컨대 본 발명의 항체는 본 발명의 항원 또는 항원성 조성물, 예컨대 P7-1을 척추동물 숙주에 투여함으로써 생성된다. 바람직하게는, P7-1의 재조합 버젼 (rP7-1)을 면역원으로 사용한다.
(1) IP90 스피로헤타의 천연형 P39.5 항원 (웨스턴 블롯으로 분리한 것, 도 6 참조)을 면역흡착제로 사용하고, JD1 스피로헤타로써 붉은털 원숭이를 감염시키는 도중에 생성된 항혈청을 항체 공급원으로 사용하여 친화성 정제하여 항체를 얻거나, 혹은 (2) IP90 (rP7-1) 유래의 재조합 P7-1로써 마우스를 면역시켜 항체를 얻거나 하는 것과는 관계없이, P7-1 항원에 대한 적당한 폴리클로날 항체는 항체 의존성의 보체매개 사멸 (ADCK)에 의하여 IP90 스피로헤타균을 생체외에서 사멸시킨다.
따라서 본 발명의 항체는, 척추둥물, 즉 붉은털 원숭이를 JD1 스피로헤타로 감염시키는 도중에 생긴 항혈청을, 면역 흡착제로서 IP90의 천연 P39.5 항원 또는 여기서 확인된 한가지 이상의 카세트 스트링 단백질을 사용하여 친화성 정제함으로써 분리한다. 마찬가지로 본 발명의 항체는, 본 발명의 정제된 재조합 항원 또는 천연형의 정제, 분리된 P39.5로써 마우스를 면역시킴으로써 분리한다. P39.5에 대해 지향성인 모노클로날 항체 (MAbs)도 생성된다. 소요의 MAbs를 발현하는 하이브리도마 세포계는 공지의 통상적인 기술, 예컨대 Kohler 및 Milstein법 및 많이 알려진 그 변형법에 의해 생성된다. 마찬가지로 소요의 고역가 항체는 이들 항원에 대해 발생된 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체에 공지의 재조합 기술을 적용함으로써 생성된다 [PCT 특허출원 제 PCT/GB85/00392호; 영국 특허출원 공고 제 GB2188638A호; Amit et al, Science, 233:747∼753 (1986); Queen et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 86:10029∼10033 (1989); PCT 특허출원 제 PCT/WO9007861호; 및 Riechmann et al, Nature, 332:323∼327 (1988); Huse et al, Science, 246:1275∼1281 (1988)a 등 참조].
여기에 개시된 내용에 따라 본 발명의 항원에 대한 동물 또는 인간의 항체의 영역을 결정하는 상보성을 조작함으로써 공지의 방법으로 P39.5에 대해 지향성인 키메라 항체, 인간화 항체 혹은 완전한 인간항체나, 또는 카세트 단백질 또는 그 항원성 단편을 생성시킬 수 있다 [E. Mark and Padlin, "Himanization of Mono clonal antibodies", Chapter 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 113. The Pharmacology of Monoclonal antibodies, Springer-Verlag (June, 1994) 참조].
또한, 항원을 다중 항원성 착물 [유럽 특허출원 제 0339695호, 1989년 11월 2일 공고 참조]로서 형성시키거나 항원성 단백질/펩티드의 단순 혼합물로서 형성시켜, 이것을 사용하여 감염된 동물 또는 인간의 체액에서 나타나는 선택된 항원을 결합할 수 있는 고역가 항체를 유발시킨다.
또한 본 발명에서는 항유전자형(anti-idiotype) 항체 (Ab2) 또는 항-항유전자형(anti-anti-idiotype) 항체 (Ab3)가 제공된다. Ab2는 본 발명의 앤티-P39.5 항체와 Ab3가 그 결합 특이성과 생물학적 활성에 있어서 P39.5 항체 (Ab1)와 유사한 표적에 대해 특이적이다 [M. Wettendorff et al, "Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies". In Idiotypic Network and Diseases, ed. by J. Cerny and J. Hiernaux, J. Am. Soc. Microbiol., Washington DC: pp. 203∼229 (1990)]. 이들 항유전자형 및 항-항유전자형 항체는 공지의 기술을 사용하여 생성시킨다. 이러한 항유전자형 항체 (Ab2)는 P39.5의 내부 이미지(internal image), 카세트 단백질 또는 그 단편을 가질 수 있기 때문에 P39.5, 카세트 단백질 또는 그 단편과 동일한 목적으로 사용할 수 있다.
일반적으로 선택된 항원 (Ab1)에 결합하는 폴리클로날 항혈청, 모노클로날 항체 및 기타 항체를 사용하여 P39.5의 에피토우프 또는 카세트 단백질을 확인하여 생조직에서의 혼입물로부터 P39.5 (또는 카세트 단백질) 및 그 상사체를 분리 (예컨대 크로마토그래피 칼럼 등으로)하는데, 일반적으로 연구수단 및 상기한 기타 타입의 항체 개발에 필수적인 출발물질로 사용된다. 항유전자형 항체 (Ab2)를 사용하여 동일한 표적을 결합시킬 수 있으므로, 면역응답을 유도하기 위해 예컨대 P39.5 등의 원래의 항원 대신에 사용할 수 있다. Ab1을 사용하는 것과 동일한 이유로 Ab3 항체를 사용할 수 있다. 예컨대 기타의 혼입물로부터 P39.5 또는 카세트 단백질을 분리하기 위한 성분 및 연구수단으로서의 기타의 용도도 상기한 항체에 대해 고려할 수 있다.
진단 시험용으로서는 단독 혹은 기타의 조성물 또는 화합물과 더불어 검출가능한 시그날을 나타낼 수 있는 통상적인 표지물(label)로써 항체를 표지할 수 있다. 진단방법에 하나 이상의 항체를 사용할 경우에는 서로 작용하는 표지물을 사용하여 검출가능한 시그날을 나타내도록 하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 표지물이 육안으로, 예컨대 비색법으로 검출할 수 있는 것이어야 한다. 시험시에 비색법의 시그날을 나타내도록 작용하는 각종 효소계에 대해서는 공지되어 있다. 한가지 예로서 글루코오스 옥시다아제 (이것은 글루코오스를 기질로 사용함)는 과산화물을 생성물로서 유리한다. 퍼옥시다아제는 테트라메틸 벤지딘 (TMB) 등의 수소 공여체 및 과산화물과 반응하여 청색으로 발색하는 산화된 TMB를 생성한다. 기타의 예로서는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 또는 알칼리성 포스파타아제 (AP), 및 글루코오스, ATP와 반응하는 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제와 더불어 헥소키나아제와, 340 nm의 파장에서 중가된 흡광도로서 검출되는 NADH를 생성하는 NAD+를 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용되는 기타의 표지계는 기타의 수단에 의해 검출가능한 것이어야 하는데, 예컨대 착색된 라텍스 미세입자 [미합중국의 Bangs Laboratories, Indiana]의 경우에서는 염료를 침투시킨 것을 효소 대신에 사용하여 항체와의 공유결합을 형성시켜 적용되는 시험에서 생성된 착물의 존재를 나타내는 육안으로 식별 가능한 시그날을 생성시킨다. 기타의 표지물로서는 형광 화합물, 방사성 화합물 또는 원소를 포함한다. 본 발명의 진단시험에 사용되는 항체에 결합하는 검출가능한 표지물은 진단시험 분야에서 이미 공지되어 있고 입수가 용이한 여러가지 조성물중에서 용이하게 선택할 수 있다. 본 발명의 방법 및 항체는 어떠한 특정한 검출가능한 표지물 또는 표지계에 사용된 것에 한정되지 않는다.
IV. 진단방법 및 시험
또한 본 발명은 라임병 진단방법을 제공한다. 이들 진단방법을 사용하여 라임병을 가진 것으로 추측되거나 임상적인 증후를 나타내는 인간 또는 동물을 진단한다.
그 한가지 예로서 이 진단방법은, 감염된 환자 또는 동물의 체액의 면역계에 의해 발생되며, 본 발명의 항원 또는 그 조합에 대해 결합능이 있는 천연산 앤티-P39.5 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 이 방법은 본 발명의 P39.5 항원 또는 카세트 스트링 항원을 환자의 체액 시료와 더불어 배양하는 단계를 포함한다. B. 부르그도르페리 감염으로 인해 체액중에 존재하는 항체는 항원과 항체-항원 착물을 형성한다. 이어서 이 반응 혼합물을 분석하여 이들 항원-항체 착물의 존재 또는 부재를 확인한다. 반응 혼합물의 분석단계는 항체에 대해 표지된 특정 결합 파트너와 반응 혼합물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
마찬가지의 실시예에서 이 진단방법은, 감염된 환자 또는 동물의 체액의 면역계에 의해 발생되며, 본 발명의 항원 또는 그 조합에 대해 결합능이 있는 천연산 앤티-P1-1, 앤티-P3-1, 앤티-P6-1, 앤티-P7-1, 앤티-P9-1, 및/또는 앤티-P12-1 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 이 방법은 본 발명의 항원 한가지 또는 바람직하게는 그 항원들의 혼합물을 환자의 체액 시료와 더불어 배양하는 단계를 포함한다. B. 부르그도르페리 감염으로 인해 체액중에 존재하는 항체는 항원(들)과 항체-항원 착물을 형성한다. 이어서 이 반응 혼합물을 분석하여 이들 항원-항체 착물의 존재 또는 부재를 확인한다. 반응 혼합물의 분석단계는 항체에 대해 표지된 특정 결합 파트너와 반응 혼합물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
이 방법의 한가지 예에 있어서, 정제 항원, 그 단편 또는 항원들의 혼합물을 니트로셀룰로오스 종이위에다 전기 블로팅(electro-blotting) 또는 도트(dot) 블로팅한 다음, 체액 (예컨대 혈청 또는 혈장)을 브로팅된 항원과 함께 배양하여 체액중의 항체를 항원(들)에다 결합시킨다. 이어서 결합항체를 표준 면역효소법으로 검출한다.
다른 예에 있어서, 라텍스 비이드를 본 발명의 항원(들)에 결합시킨 다음, 비이드/단백질 결합물과 함께 체액을 배양함으로써 반응 혼합물을 형성한다. 이 반응 혼합물을 분석하여 항체의 존재를 확인한다.
또 다른 예에 있어서, 본 발명의 진단방법은 병원체로 감염된 동물 또는 인간의 체액중의 보렐리아 병원체와 관련하여 천연산 P39.5 또는 카세트 스트링 항원(들) 자체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 이 방법은 본 발명의 항체 (예컨대 검출을 위해 통상적으로 표지된 본 발명의 항원을 적당한 인간 및/또는 동물에 투여하여 생성시킨 것)를 진단대상이 되는 인간 또는 동물 유래의 체액 시료와 더불어 배양하는 단계를 포함한다. 환자 또는 병든 동물이 보렐리아에 감염되면 항원-항체 착물이 형성된다 (특이결합이 일어남). 이어서 과잉으로 표지된 항체를 임의로 제거하고 반응 혼합물을 분석하여 항원-항체 착물의 존재 또는 부재 및 결합된 표지물의 양을 측정한다.
본 발명의 단백질 항원을 사용하는 분석은 불균일계 (예컨대 분리단계를 필요로 함) 또는 균일계로 할 수 있다. 분석이 불균일계이면 원심, 여과, 크로마토그래피 또는 자성법(magnetism) 등을 비롯한 각종 분리수단을 사용할 수 있다.
혈액 또는 기타 생리학적 내지 생물학적 액체를 스크리닝하기 위한 한가지 바람직한 분석법은 ELISA (enzyme linked immunosorbant assay)이다. 전형적으로 ELISA에 있어서 본 발명의 분리된 항원(들)을 마이크로타이터 웰(microtiter well)의 표면에 직접 흡착시키거나 포획 메트릭스(capture matrix) (예컨대 항체)를 통해 흡착시킨다. 이어서 표면의 잔존 단백질 결합부위를, 적당한 시약, 예컨대 소혈청 알부민 (BSA), 가열실활 정상 염소 혈청 (NGS), 또는 BLOTTO (탈지분유의 완충액으로서 보존제, 염류, 소포제를 함유함)으로 블로킹한다. 이어서 이 웰(well)을 특정 앤티-B. 부르그도르페리 항체를 함유한 것으로 추측되는 생물학적 시료와 더불어 배양한다. 시료를 그대로 사용하거나, 혹은 BSA, NGS 또는 BLOTTO 등의 단백질을 소량 (0.1∼5.0 wt.%) 함유한 완충액으로 통상적으로 희석할 경우도 빈번히 있다. 충분한 시간동안 배양하여 특이결합을 시킨후 웰을 세척하여 미결합 단백질을 제거하고, 이어서 기타의 종, 예컨대 개에 대해 표지된 항체 또는 표지된 항-인간 면역 글로불린 (αHuIg)과 더불어 배양한다. 표지물은 상기한 바와 같이 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), β-갈락토시다아제, 알칼리성 포스파타아제 및 글루코오스 옥시다아제를 비롯한 각종 효소로부터 선택할 수 있다. 충분한 시간동안 다시 특이 결합을 시킨 다음, 웰을 다시 세척하여 미결합 결합물을 제거하고, 효소에 대한 기질을 첨가한다. 발색시킨후 웰의 내용물의 흡광도를 육안 또는 기기분석으로 측정한다.
또한 항원(들)에 대한 결합능이 있는 본 발명의 MAb 또는 기타 항체를 ELISA판(plate)에다 결합시킬 수도 있다. 또 다른 진단방법에 있어서, 체액을 항체결합판에서 배양한후 세척하고, 항원-항체 착물의 검출 및 표지된 MAb의 정량측정을 상기한 바와 같이 통상의 방법으로 실시한다.
기타 유용한 분석법으로서는 필터 컵에 의한 방법 및 딥스틱(dipstick)에 의한 방법이 있다. 전자의 경우는 본 발명의 항체를 소결된 유리 필터의 작은 컵의 개구에 고정시키고, 시료체액 (5 mL)을 필터를 통해 여과한다. 항원이 존재하면 (예컨대 B. 부르그도르페리 감염), 필터에 결합하게 되는데, 이것을 제 2 항체/검출제를 통해 가시화한다. 딥스틱법의 경우는 항원 또는 항체를 필터에 고정시킨 다음 체액속에 침지하고 건조한후 검출제 분자로로써 스크리닝한다.
기타의 진단법은 본 발명의 항원(들) 또는 단편을 핵산 프로우브 또는 앤티센스 서열로 사용하여, 체액중의 병원체에 의해 발생된 상보성 서열에 대해 하이브리다이즈시킴으로써 체액에서의 감염의 존재를 확인한다. PCR, Northern 또는 Southern 하이브리다이제이션법 등의 이러한 기술은 공지되어 있다.
여기서 알아 두어야 할 것은 당업자라면 통상적인 여러가지 단백질 시험법, 특히 면역 시험법 또는 핵산 시험법을 디자인하여 본 발명의 분리된 항원 및 항체 또는 이들의 핵산서열 또는 앤티센스 서열을 이용함으로써 동물 및 인간에 있어서의 보렐리아 감염을 검출할 수 있다는 점이다. 따라서 본 발명은 특정한 시험법의 선택에 의해 한정되는 것은 아니므로 공지된 시험법을 포함하는 것이다.
V. 진단용 키트
편의상 본 발명에 따라 ELISA 또는 기타의 시험법에 사용되는 시약을 키트형태로 하여 제공할 수 있다. 이러한 키트를 사용하여 인간 또는 동물 시료에서의 보렐리아 감염을 진단한다. 이러한 진단용 키트에는 본 발명의 항원 및/또는 본 발명의 항원을 결합할 수 있는 적어도 1종의 항체, 또는 이들을 코우드하는 핵산서열 혹은 앤티센스 서열을 포함한다. 또한, 이러한 키트에는 이들 항원 또는 서열의 단순 혼합물 혹은 이 단순 혼합물을 제조하기 위한 수단을 포함한다.
이들 키트에는 본 발명의 보렐리아 항원 단백질 또는 항체 혹은 핵산서열을 미리 흡착시켜둔 마이크로타이터 판(microtiter plate), 각종 희석제 및 완충제, 특이하게 결합한 항원 또는 항체 검출용의 표지된 결합물, 핵산, 및 효소기질, 보인자, 색원체 등의 기타의 시그날 발생 시약을 포함한다. 이들 키트의 기타 부품은 공지된 바에 따라 용이하게 결정할 수 있다. 이러한 부품으로서는 본 발명의 항원, 폴리클로날 또는 모노클로날 포획 항체, 혹은 2종 이상의 항체의 칵테일, 표준물로서의 이들 항원의 정제 또는 반정제 추출물, MAb 검출제 항체, 지시제 분자가 결합해 있는 항(抗)마우스 항체 혹은 항(抗)인간 항체, 흡수용으로 제조된 ELISA판, 비색비교를 위한 지시제 차아트, 일회용 글로브, 오염제거 지시서, 도포용 스틱 또는 용기, 및 시료 제조용 컵을 포함한다. 이러한 키트에 의해 임상 실험실에서 보렐리아 감염을 진단하기 위한 편리하고도 효율적인 방법이 제공된다.
VI. 치료용 조성물
또한 본 발명의 항원, 항체, 핵산서열 또는 앤티센스 서열 단독 혹은 기타의 항원, 항체, 핵산서열 또는 앤티센스 서열을, 치료용 조성물 및 라임병을 가진 환자 및/또는 병든 동물의 치료 방법에 사용할 수 있다. 예컨대 이러한 한가지 치료용 조성물에는 담체 또는 희석제와, 본 발명의 1종 이상의 앤티-P7-1 또는 기타의 앤티-카세트 스트링 단백질 항체를 함유시켜 조제해도 좋다. 단백질의 투여를 용이하게 하며 생리학적으로 비활성 및/또는 무해한 약제학적으로 허용되는 적당한 담체를 사용한다.
담체의 예로서는 멸균 식염수, 락토오스, 인산 칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩기름, 참기름 및 물 등을 들 수 있다. 더욱이 담체 또는 희석제에는 시간지연 물질, 예컨대 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 디스테아레이트 단독 혹은 왁스와의 혼합물을 함유시켜도 좋고, 또한 서방형 포리머(slow release polymer)를 사용해도 좋다.
임의로 이 조성물에는 보존제, 화학적 안정화제 등의 통상적인 의약용 첨가성분을 함유시켜도 좋다. 항체와 더불어 치료용 조성물에 사용할 수 있는 적당한 첨가제의 예로서는 카사미노산, 수크로오스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 이인산 일칼륨, 락토오스, 락트알부민 가수 분해물 및 분유 등이 있다.
또한, 본 발명의 항체 외에도 라임병 치료용의 기타 약제, 예컨대 항생제 또는 면역 자극제 및 사이토카인 조절 요소를 사용하면 병의 증상을 경감 내지 제거한다. 참진드기 벡터 또는 스피로헤타균에 의해 방출된 면역 억제물질을 억제하거나 제거하는데 사용되는 약은 감염된 인간 또는 동물의 자연 면역성을 촉진하도록 작용하는 것이어야 한다. 따라서 이러한 약제는 본 발명의 치료용 조성물과 병용하면 효과를 발휘한다. 이들 약제를 함유하는 치료용 조성물의 개발은 본 발명의 개시내용을 고려하여 당업자라면 가능하다.
본 발명의 방법에 의하면 이러한 치료용 조성물을 유효량 투여함으로써 라임병을 가진 인간 또는 동물을 치료할 수 있다. "유효량"이라 함은 본 발명의 항체 약 0.05∼약 1000 ㎍/mL의 범위를 말한다. 적당한 투여량은 이 유효량 약 1.0 mL이다. 이 조성물을 1일 내지 12주에 걸쳐 1일에 1 내지 3회 투여한다. 그러나 인간 또는 동물의 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강상태에 따라 의사 또는 수의사가 적당한 투여량을 조절한다. 바람직하게는 이 조성물을 비경구 투여하는데, 바람직하게는 근육내 또는 피하에 투여한다. 그러나 이 조성물을 경구 혹은 국소 등을 비롯하여 기타 적당한 경로로 투여할 수 있는 제제로 해도 좋다.
VII. 백신 조성물
척추동물 숙주에서 발현되는 항원에 근거한 백신에서는 종래의 심각한 문제가 전혀 발생되지 않는다. 인간 및 기타 동물에서의 라임병 예방을 위한 개량된 표면항원계 백신은 본 발명의 P39.5 항원과 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 함유시켜 제공된다. 이 백신 조성물에는 본 발명의 분리된 형태, 재조합 형태, 변형된 형태 혹은 다중형태의 P39.5 항원 1종 이상 혹은 이들의 혼합물을 함유한다. 마찬가지로 항원성 단백질의 염을 이 조성물에 사용할 수도 있다.
본 발명의 조성물의 기타의 예는 기타 카세트 스트링 항원, 예컨대 P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1, 및 P12-1로 된 것이다. 본 발명자들은 vlsE 항원이 항원성 변이되는 메카니즘으로부터 이 항원은 척추동물 숙주에서의 스피로헤타의 생존에 극히 중요함을 제안하고 있다. 본 발명에 의하면 신규의 백신법에는 변이의 직접적인 근원인 카세트 스트링에서 발현되는 대부분의 에피토우프로써 숙주를 면역시킴으로써 스피로헤타 방어 메카니즘을 피하는 것을 포함한다. 이것은 이 카세트 스트링의 대부분이 프레임내에 있다는 특이한 사실로서 가능하다. 본 발명자들은 아래의 각 실시예에 나온 바와 같이 스피로헤타를 사멸시키는 항체를 포함하여 카세트 스트링 항원 P7-1로써 숙주를 면역시킴으로써 이러한 개념을 입증하고 있다. 따라서 본 발명에 의하여 한가지 백신 접종방법은 IP90 카세트 스트링의 항원적으로 비유사한 부분 유래의 상기한 클로닝되고 정제된 단백질의 약간 혹은 전부를 숙주에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 단백질로부터 각종의 면역원성 조성물을 제조할 수는 있겠으나, 현재로서는 카세트 스트링 단백질 혹은 그 펩티드 단편 2종 이상의 단순 혼합물을 이러한 목적으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항원(들)과, OspA, OspB 및 OspC 단백질, BmpA, B, C 또는 D 단백질 혹은 이들의 단편들 등의 B. 부르그도르페리의 기타 항원과의 조합도 본 발명에 포함된다.
담체의 예는 치료용 조성물에 대해 상기한 바와 같다. 임의로 백신 조성물에 보조제, 보존제, 화학적 안정화제, 또는 기타의 항원성 단백질을 추가해도 좋다. 대표적으로 표적 인간 또는 동물에서의 효능을 가장 잘 발휘하는 제제로 하기 위하여 안정화제, 보조제 및 보존제를 적정화한다. 적당한 보존제의 예로서는 클로로부탄올, 소르브산 칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이드, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 들 수 있다.
상기한 백신 조성물 1종 이상에 통상적인 보조제를 첨가하거나 흡착시켜도 좋다. 보조제를 사용하여 백혈구를 유인하거나 면역응답을 증강시킨다. 이러한 보조제로서는 Ribi, 미네랄 오일 및 물, 수산화 알루미늄, 암피겐, 아브리딘, L121/스콸렌, D-락타이드-폴리락타이드/그리코사이드, 플루로닌 플리오이스, 무라밀 디펩티드, 보르데텔라(Bordetella) 사균, 및 Quil A 등의 사포닌을 들 수 있다. 더욱이 본 발명의 백신 조성물에는 추가로 보르데텔라 브롱키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 개의 파보바이러스, 견온열(canine distemper), 광견병, 렙토스포리디아(Leptosporidia), 개의 코로나바이러스, 및 개의 아데노바이러스를 비롯하여 기타의 비(non) B. 부르그도르페리 항원을 함유시켜도 좋다.
따라서 본 발명은 동물 또는 인간에게 유효량의 이러한 조성물을 투여하는 예방법을 포함한다. P39.5 및/또는 카세트 스트링 단백질 항원성 조성물을 유효량, 즉 백신효능, 예컨대 예방 면역을 발휘하기 위해 투여경로에 효과적인 항원의 양을 투여한다. 적당한 항원의 양은 소요의 면역응답 레벨에 따라 결정되지만, 일반적으로 백신 조성물중에는 항원을 1 ng 내지 1000 mg, 보다 바람직하게는 항원 1 mL당 0.005 ㎍ 내지 1 mg의 범위로 함유시킨다. 본 발명의 백신 조성물의 적당한 투여량은 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로 적당한 투여량은 백신 조성물 0.1 내지 5 mL이다. 또한, 치료하고자 하는 환자 또는 동물종, 예컨대 그 체중, 연령, 및 일반적인 건강상태에 따라서도 용이하게 결정할 수 있다.
일반적으로 백신을 계절에 따라 1회 투여할 수도 있다. 통상적으로 참진드기 계절에는 효능 촉진제를 투여해야 한다. 백신을 적당한 투여경로로 투여해도 좋지만, 비경구 투여, 특히 근육내 및 피하 투여가 바람직한 경로이고, 또한 경구투여 경로도 바람직하다. 필요에 따라서는 투여경로를 조합하거나 조절해도 좋다.
더욱이 백신을 DNA 백신으로 해도 좋은데, 이 경우에는 임의로 조절서열 제어하에 P7-1 DNA 서열 혹은 그 단편, 다른 카세트 스트링 단백질 혹은 그 단편을 함유한다. 따라서 항원 코우딩 DNA를 벡터, 예컨대 바이러스 벡터속에 함유시켜도 좋다. 일반적으로 적당한 벡터에 의한 치료는 1회 투여당 1 ×10-3pfu 내지 1 ×1012pfu를 함유한다. 그러나 이들 조성물의 투여량, 투여시기 및 투여방법은 당업자라면 결정할 수 있다. 백신의 물리적 상태, 연령 등의 인자들을 고려하여 본 발명의 면역원성 혹은 백신 조성물의 투여량, 투여시기 및 투여방법을 결정한다.
VIII. 약물 스크리닝 및 개발
본 발명의 단백질, 항체 및 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 라임병의 치료 또는 진단 또는 예방을 위한 의약이나 백신으로서 유용한 화합물 혹은 단백질을 스크리닝하거나 개발할 수도 있다. 한가지 예로서 P39.5에 결합하여 생물학적 활성을 예방할 수 있는 화합물은 라임병의 치료 혹은 예방을 위한 유용한 의약성분이다. 여기에 나온 방법들을 P39.5의 단편에도 적용할 수 있다. 마찬가지로 카세트 스트링 단백질 혹은 그 단편에 결합할 수 있는 화합물은 라임병의 치료 혹은 예방을 위한 유용한 의약성분이다.
적당한 시험방법은 용이하게 결정할 수 있다. 필요한 경우 및 선택된 시험방법에 따라서는 선택된 항원(들), 예컨대 P39.5를 적당한 표면에다 ELISA 등의 방법으로 직접 혹은 간접적 (예컨대, 앤티-P39.5 항체를 통해)으로 고정시킨다. 이러한 표면 고정화법은 공지되어 있다. 예컨대 습윤성의 비활성 비이드를 사용할 수 있다. 또한, 선택된 항원, 예컨대 P39.5를 사용하여 고정화를 필요로 하지 않는 스크리닝법, 예컨대 조합 라이브러리의 스크리닝에 사용할 수 있다. 본 발명의 항원, 예컨대 P39.5에 대한 결합능이 있는 의약의 스크리닝 혹은 개발을 위해 각종 시험법과 기술이 존재한다. 이들은 항원성 단백질의 발현을 위해 파아지 디스플레이 시스템을 사용하고, 또한 트랜스펙션된 E. coli 또는 기타의 미생물의 배양물을 사용하여 단백질을 생성시켜 화합물의 결합을 연구한다. 예컨대 문헌 [G. Cesarini, FEBS Letters, 307(1):66∼70 (July 1992); H. Gram et al, J. Immunol. Meth., 161:169∼176 (1993); C. Summer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3756∼3760 (May 1992)]에 기재된 방법을 참고할 수 있다.
본 발명의 단백질, 항체 혹은 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 기타 종래의 약물 스크리닝 방법을 적용할 수 있다. 한가지 예로서 본 발명의 단백질, 예컨대 P39.5에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인하는 방법에는 선택된 P39.5 단백질과 시험 화합물을 단순히 접촉시키는 것만으로 시험 화합물을 P39.5에 결합시키고, 필요한 경우에는 P39.5 단백질에 결합하는 시험 화합물의 양을 측정하는 것을 포함한다. 이 방법은 고체 지지체위에 고정시킨 P39.5 단백질과 시험 화합물의 배양을 포함할 수도 있다. 유사한 방법을 한가지 이상의 카세트 스트링 단백질에 적용할 수도 있다.
대표적으로 고정된 리간드를 함유한 표면을 단백질을 함유한 용액과 접촉시켜 적당한 검출계(detection system)를 사용하여 결합을 측정한다. 적당한 검출계로서는 스트렙타비딘 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 결합물, 플루오레시인 (fluorescein) 등에 의한 태그에서의 직접 접합 등이 있다. 기타의 계로는 공지되어 있는데, 본 발명은 사용된 검출계에 의해 한정되지 않는다.
본 발명의 P39.5 혹은 다른 단백질에 특이하게 결합하는 화합물의 확인방법은 고체 지지체위에 고정시킨 단백질, 예컨대 P39.5와 시험 화합물 및 P39.5의 수용체인 단백질 서열을 접촉시키고, P39.5 단백질에 결합하는 수용체의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 따라서 시험 화합물에 의한 정상적인 단백질의 결합억제로부터 P39.5 단백질에 대한 시험 화합물의 결합을 알 수 있다. 유사한 방법을 한가지 이상의 카세트 스트링 단백질에 적용할 수도 있다.
따라서 이러한 방법을 사용함으로써 본 발명은 P39.5 혹은 그 단편 및/또는 카세트 스트링 단백질 혹은 그 일부와 반응하고, 필요에 따라 단백질의 생리활성을 증강 혹은 감소시킬 수 있는 화합물을 제공할 수 있게 된다. 이들 화합물은 본 발명에 포함된다. 더욱이 P39.5 단백질이 관련되는 한에 있어서는 P7-1 혹은 기타의 카세트 스트링 단백질 1종 이상과 치환시킬 수 있다.
아래의 각 실시예에서 본 발명의 바람직한 단백질 항원의 수득방법과 본 발명의 시험방법 및 조성물의 제조방법을 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 P39.5 항원을 라임병의 진단 및 예방에 사용하며, 또한 라임 혈청학의 진보를 도모함을 유의해야 할 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 스피로헤타가 척추동물 숙주내에 체류하는 동안 발현하는 스피로헤타 항원에 근거한 라임병의 예방을 위한 방법 및 조성물을 제공함으로써 종래의 요구를 충족시킨다. 이러한 방법과 조성물은 라임병 치료에도 사용할 수 있다.
한가지 특징으로서 본 발명은 척추동물 숙주내에서 스피로헤타에 의해 생체내에서 발현되는 분리된 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토 표면항원을 제공한다. 이 항원 (이하, "P39.5"라 함)은 상대 분자질량이 39.5 kDa를 특징으로 한다. 이 항원의 단편 역시 본 발명의 조성물과 방법에 사용할 수 있다.
다른 특징으로서 본 발명은 신규의 보렐리아 카세트 스트링(Borrelia cassette string) 폴리펩티드/단백질을 제공한다.
또 다른 특징으로서 본 발명은 P39.5 또는 그 단편, 예컨대 P7-1을 코우드하는 핵산서열 및 기타의 보렐리아 카세트 스트링 단백질 또는 그 단편을 코우드하는핵산서열을 제공한다. 이들 핵산서열은 긴축 조건(stringent condition)하에서 상기한 서열에 대해 하이브리다이즈하는 서열과 그 대립형질 변이체 및 그 결실 돌연변이체를 포함한다.
또 다른 특징으로서 본 발명은 제2의 선택된 폴리펩티드 또는 단백질과 임의로 융합되거나 혼합된, 상기한 P39.5 단백질 서열 또는 카세트 스트링 단백질 서열의 단편을 함유한 신규의 단백질로서, P39.5, 또는 OspA 등의 기타의 보렐리아 항원 및 기타 미생물 유래의 단백질 혹은 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 90% 까지의 동일성을 가진 신규의 단백질을 제공한다.
또 다른 특징으로서 본 발명은 제2의 선택된 폴리펩티드 또는 단백질과 임의로 혼합된, 상기한 항원의 단백질 서열 또는 그 단편을 함유하고, P39.5, 또는 OspA 등의 기타의 보렐리아 항원 및 기타 미생물 유래의 단백질 혹은 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 90% 까지의 동일성을 가진 신규의 단백질 조성물을 제공한다.
추가의 특징으로서 본 발명은 단백질, 그 단편 또는 융합 단백질을 코우드하는 DNA 서열을 선택된 숙주세포속에서 발현시키고, 단백질을 분리함으로써, 상기한 P39.5 단백질, 그 단편 또는 이 단편을 함유한 융합 단백질을 재조합하여 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 DNA 서열로써 형질 전환된 숙주세포도 제공된다.
또 다른 특징으로서 본 발명은 P39.5 항원, 그 단편, 카세트 스트링 단백질 또는 단편, 혹은 이 단편을 함유한 융합 단백질 지향성의 분리된 항체를 제공한다. 이들 항체는 폴리클로날이어도 좋다. 또한 본 발명은, 본 발명의 상기한 분리된 항원, 1종의 그 단편 혹은 1종 이상의 그 단편의 혼합물, 또는 1종 이상의 단편을 함유한 융합 단백질로써 인간 또는 동물을 면역시키는 것을 포함하는 이들 항체의 제조방법을 제공한다. 예컨대 재조합, 모노클로날, 키메라, 인간화 등의 기타 종류의 항체를 이러한 면역된 동물로부터 제조할 수 있다.
또 다른 특징으로서 본 발명은 라임병을 가진 인간 및/또는 동물을 치료하기 위한 치료용 조성물 및 치료방법을 제공한다. 치료용 조성물은 상기한 항체, 또는 단백질 또는 단편과 적당한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다.
추가적인 특징으로서 본 발명은 백신 조성물 및 상기한 백신 조성물을 사용하여 라임병에 대해 인간 또는 동물을 예방접종하는 방법을 제공한다. 이 조성물은 본 발명의 적어도 1종의 보렐리아 항원, 즉 보렐리아 스피로헤타에 의해 생체외에서 발현시킨 상대 분자질량 39,500 달톤의 항원 또는 그 항원 단편, 혹은 이 단편을 함유한 융합 단백질, 혹은 카세트 스트링 단백질 유효량과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 이 백신 조성물은 P39.5 단백질, 그 단편, 융합 단백질 또는 상기한 단백질들의 혼합물을 함유해도 좋다.
또 추가적인 특징으로서 본 발명은 백신 조성물, 및 핵산 조성물, 즉 DNA 백신을 사용하여 라임병에 대해 환자 또는 병든 동물을 백신접종하는 방법을 제공한다. 이 조성물은 본 발명의 적어도 1종의 보렐리아 항원 또는 그 항원 단편(들), 카세트 스트링 항원(들)을 코우드하는 DNA 서열, 혹은 이 단편을 함유한 융합 단백질 유효량과 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다.
또 추가적인 특징으로서 본 발명은 인간이나 동물에 있어서의 라임 보렐리오증의 진단방법을 제공한다. 이 방법은 진단하고자 하는 인간이나 동물 유래의 체액시료를 사용하여, 바람직하게는 통상적으로 검출용으로 표지된 본 발명의 항원 또는 항체를 배양하는 단계를 포함한다. B. 부르그도르페리에 감염된 환자 또는 병든 동물에 있어서는 항원-항체 착물을 생성시킨 다음, 이 반응 혼합물을 분석하여 이들 항원-항체 착물의 존재 여부를 확인한다. 또 추가적인 실시형태에 있어서 진단시험은, 항원 또는 그 단편의 DNA 서열, 바람직하게는 앤티센스 서열을 이용하여, 하이브리다이즈하는 환자의 체액에서의 서열의 존재로 인한 감염을 진단한다. 기타 종래의 시험법은 본 발명에서 확인된 시약을 사용하여 실시할 수 있다.
또 다른 특징으로서 본 발명은, 본 발명의 적어도 한가지 항원 또는 그 항원 단편, 혹은 본 발명의 1종 이상의 항원을 코우드하는 DNA 서열 또는 그 앤티센스 서열을 결합할 수 있는 적어도 한가지 항체를 함유하는 환자 또는 병든 동물 시료에서의 B. 부르그도르페리에 의한 감염을 진단하는 진단용 키트를 제공한다. 항체와 서열을 임의로 표지하여 검출하거나 키트에다 검출 시스템을 포함시켜도 좋다. 본 발명의 특징과 효과에 대해 아래의 바람직한 실시예에 대한 상세한 설명에서 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 보렐리아 세균균주 및 항체
A. 세균균주
B. 부르그도르페리 센수 스트릭토 (B. burgdorferi sensu stricto)의 JD1 균주 [J. Piesman et al., J. Clin. Microbiol., 25:557∼558 (1987) 및 T. G. Schwan et al., J. Clin. Microbiol., 27:1734∼1738 (1989)]를 질병 방제센터(the Center for Disease Control and Prevention)에서 입수하여 로우 패시지 (＜7)의 동결균주로 하여 보관하였다. B31도 상기한 CDC로부터 입수한 B. burgdorferi sensu stricto의 균인데 상기와 마찬가지로 보관하였다. IP90은 B. 가리니이(garinii)의 균주인데 상기한 CDC로부터 입수하였다.
B. 부르그도르페리를 BSK-H 배지 (미합중국의 Sigma Chemical사)에서 34℃에서 배양하였다.
B. 원숭이 항체
I. 스카풀라리스 (I. scapularis) 애벌레에 물린 B. 부르그도르페리 균주 JD1로써 감염시킨 붉은털 원숭이 유래의 혈청 항체를 사용하여 스피로헤타 생균을 배양하였다. 스피로헤타로부터 미결합 항체를 제거하고, 결합항체를 낮은 pH의 완충액으로 분리하였다. 원숭이 항체를 아래의 세가지 공급원으로부터 얻었다.
가) 천자 접종에 의해 B. 부르그도르페리 균주 JD1로 감염시킨 붉은털 원숭이,
나) 참진드기 (Ixodes scapularis)의 JD1 감염된 애벌레에 동물을 노출시킴으로써 B. 부르그도르페리 균주 JD1로 감염시킨 붉은털 원숭이
다) 아래와 같이 하여 참진드기로 감염시킨 동물로부터 채취한 항혈청을 출발물질로 사용하여 스피로헤타 생균을 친화성 정제한 것:
참진드기에 접종된 동물 3마리로부터 채취한 희석(BSK-H 배지에서 1/40)된 가열실활 혈청시료 800 ㎕를 완전 생세균 1 ×109개와 함께 실온에서 30분간 배양하였다. 배양후에 시료를 4℃ 및 13,000 ×g에서 15분간 원심처리하였다. 이어서 상청액을 상기한 바와 같이 2회 이상 재흡착시켰다. 1차 흡착후에 회수한 세균 펠릿을 BSK-H로 3회 세척하여 미결합 항체를 제거하였다. 최종 세척후에 펠릿을 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.2, 0.5 M NaCl 400∼500 ㎕에 다시 현탁시키고 원심처리하였다. 상청액을 회수하고, 2.0 M Tris 염기를 첨가하여 pH를 7.00으로 하였다.
실시예 2: IP90의 P39.5의 예비확인
실시예 1의 B의 항체를 JD1, B31 및 IP90 스피로헤타 유래의 전추출물의 웨스턴 블롯(Western blot)과 반응시켰다. 웨스턴 블롯은 아래와 같이 실시하였다. 즉, 5% 아크릴아미드 스태킹 겔을 함유한 15% 아크릴아미드 미니 겔 (10 ×10 ×0.1 cm)중에서 전기영동하였다. [280 nm에서의 흡광도(OD)로 측정된] 단백질 25 ㎍ 혹은 용균(溶菌) 7 ×108개를 함유한 용해물 20 ㎕를 1트랙 마다 나누어 넣었다 (전체 예비 트랙은 16개의 단일 트랙이므로 각각의 예비 겔에 대해 단백질 400 ㎍ 을 부하하였음). 미니 겔 장치 (미합중국의 Integrated Separation Systems사)에서, U. Laemmli, Nature, 227:680∼685 (1970)의 완충액을 사용하여 23 mA의 정전류에서 정기영동을 실시하였다. 면역 브로팅을 하기 위하여, H. Towbin et al, Proc. Natl. Acad., USA, 76:4350∼4354 (1979)에 기재된 바와 같이 Mighty Small 전이장치 (미합중국의 Hoeffer Scientific Instruments사)에서 폴리아크릴아미드 겔로부터의 단백질을 니트로셀룰로오스 종이 (Schleicher and Schell사)위에다 22 V의 정전압에서 하루밤 전기전이 처리하였다. 전이효율을, 니트로셀룰로오스의 일부를 콜로이달 금 (Integrated Separation Systems사)으로 염색하여 평가하였다. 0.05% Tween-20 (Integrated Separation Systems사)을 함유한 PBS-T로 제조한 3% 탈지분유 (Carnation)을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다.
블로킹후에 멤브레인을 제조자의 지시에 따라 Miniblotter 45 (미합중국의 Immunetics사)에 설치하고, PBS-T로 1/50으로 희석한 각각의 혈청시료 110 ㎕를 Miniblotter의 채널속으로 도입한 다음, 요동대위에서 실온에서 1시간 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인과 반응시켰다. 배양이 끝난후에 메니포울드 시스템을 사용하여 PBS-T로써 멤브레인을 세척하였다. 이 시점에서 Miniblotter를 분리하고 블롯을 취하였다. 나머지 배양단계를 소형 트레이에서 실시하였다. 세척후에 멤브레인을, PBS-T로 1/200으로 희석한 비오티닐화 항(anti)인간 IgM (μ-연쇄 특이성) 항체 및 IgG (γ-연쇄 특이성) 항체 (미합중국의 Vector Laboratories사)와 함께 멤브레인을 1시간 배양하였다. 제조자의 지시에 따라 제조한 아비딘/비오티닐화 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 착물(Vector)을 사용하여 비오티닐화 항체를 조사하였다. 시약 4-클로로-1-나프톨 (Sigma)을 색원체로 사용하였다. 멤브레인을 증류수로 세척함으로써 정색반응을 정지시켰다.
JD1 스피로헤타로 참진드기 접종 및 천자 접종된 원숭이 유래의 혈청과, JD1 스피로헤타 생균의 친화성 정제된 원숭이 혈청 유래의 항체로 발육시킨 B. 부르그도르페리 균주 JD1 및 B31과 B. 가리니이 균주 IP90의 스피로헤타균 유래의 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯 (도 6)을 제조하였다. 친화성 정제 항체는 B. 부르그도르페리 JD1의 스피로헤타균 유래의 전 용해물의 웨스턴 블롯의 항원 4가지를 인식하였다. 이들 항원을 각각 P1 [상대 분자질량(Mr) 39-40,000], P2 (Mr 35-37,000), P3 (Mr 22-24,000) 및 P4 (Mr 18-19,000)로 명명하였다. 천자접종된 동물의 혈청시료 및 참진드기 접종된 원숭이의 혈청은, 예측한 바와 같이 이들 항원도 인식하였다. 더욱이 웨스턴 블롯으로부터 친화성 정제 항체들은 B. 가리니이에서 나타나는 P1 (약간 높은 상대 분자질량을 가짐)과 B31 스피로헤타에서 나타나는 P1, P2 및 P4 및 보다 높은 상대 분자질량의 추가적인 항원을 인식하였음을 알 수 있다. 마지막의 두가지 항원도 천자접종 및 참진드기 접종된 동물의 혈청에 의해서만 인식되었다. P1는 결과적으로 P39로 확인되었으며 BmpA로서도 알려져 있다. IP90 스피로헤타에 존재하는 유사한 항원은 잠정적으로 P39.5로 확인되었으며 상기한 웨스턴 블롯에서 나타났다.
실시예 3: JD1, B31 및 IP90 스피로헤타의 항체 의존성 보체매개 사멸
참진드기 접종된 원숭이의 혈청을 ADCK 시험에서 아래와 같이 사용하였다. 즉, B. 부르그도르페리의 동결시료를 37℃에서 신속히 해동하고, 중간 대수 증식기(mid-log phase)가 될 때까지(약 3일, 1∼2 ×107개 스피로헤타/ml) 배양한후 8,000×g에서 20분간 원심처리하고, BSK-H 배지에 다시 부유시켜 카운트하였다. ADCK 시험은 96웰 조직 배양판 (Costar)에서 2회 실시하였다. BSK-H 배지 25 ㎕에서의 5∼6×105개 스피로헤타를, 동일한 배지에서 1:10으로 희석한 가열실활(56℃, 30분) 혈청시료 50 ㎕를 함유한 각각의 웰에 첨가하였다. 이 판들을 3% CO2, 5% O2및 나머지 N2인 혼합가스 분위기하에서 34℃에서 20분간 배양한후에 보체 (정상 원숭이 혈청) 25 ㎕을 가하였다. 동일한 조건하에서 18∼24시간 배양한후 사균 (비이동성) 및 생균 (이동성)의 총 갯수를 암시야 현미경으로 정량하였다. 마찬가지의 시험에서 비이동성 및 사균 사이의 대응성을 미리 결정하였다 [M. Aydintug et al, 위에 나온 문헌 참조]. 스피로헤타 사균의 평균 %가 정상 혈청 존재하에서 관찰된 평균 사멸 %의 값의 3배를 상회하면 사멸은 유의(有意)한 수준인 것으로 생각하였다.
JD1 스피로헤타균으로 참진드기 접종시킨 동물의 혈청을 사용하여 B. 부르그도르페리 균주 JD1 및 B31과 B. 가리니이 균주 IP90 유래의 스피로헤타를 사용하여 ACDK를 실시하였다. 실시예 2에 나온 바와 같이 이 혈청은 IP90 블롯에서 두가지 항원을 인식하였는데, 그 하나는 상대 분자질량이 P1의 것과 유사한 것이고, 나머지 하나는 상대 분자질량이 훨씬 높은 것이었다. 도 1에 나온 바와 같이 세가지 스피로헤타 균주 모두는 혈청에 의해 사멸되었는데, 이것으로부터 IP90 웨스턴 블롯에 나온 항원중의 적어도 하나는 ADCK의 표적이었음을 알 수 있다.
실시예 4: P39.5의 확인
IP90 웨스턴 블롯에 나타난 추정 BmpA (P39)의 동일성을 조사하였다. 즉, 앤티-플라젤린(anti-flagellin) 모노클로날 항체(Mab), 앤티-P39 Mab, 앤티-P39 폴리클로날 항체, 앤티-P35 Mab, 앤티 BmpD 폴리클로날, 및 JD1 스피로헤타로 참진드기 감염된 원숭이 두마리의 혈청을 사용하여 JD1 및 IP90 유래의 용해물의 웨스턴 블롯을 형성시켰다. 동일한 겔에서 실시한 JD1 및 IP90 항원의 비교 웨스턴 블롯 분석에서 두가지 항원 추출물은 앤티-플라젤린 Mab H9724와 반응하였다. 그러나 앤티 BmpA Mab는 JD1 BmpA에 대해서만 반응하였고, JD1 유래의 재조합 BmpA로써 면역시킨 원숭이의 혈청은 예측한대로 JD1 블롯과 강하게 반응하였으나 IP90 유래의 BmpA 항원과는 극히 미미하였다. 더욱이 JD1 감염 원숭이 두마리로부터 얻은 혈청시료는 여전히 IP90 블롯에서의 두가지 동일한 항원과 반응하여 높은 분자질량의 밴드를 추가로 나타낼 때도 가끔 있었다. 두가지의 가장 낮은 분자질량의 밴드는 실제로, 앤티 BmpA 폴리클로날 항체에서 확인된 바와 같이 IP90 유래의 BmpA 보다 큰 분자에 상응하다. 분자질량이 높은 밴드일 수록 플라젤린에 상응할 개연성이 많은데, 이것은 Mab H9724와 반응한 IP-90의 밴드와 동일한 분자질량을 가진 것이었다.
모노클로날 항체는, 이 분자와 반응한 JD1로부터 P35에 대해 JD1 블롯에서는나타났으나 IP90에 대해서는 나타나지 않았은 반면, 마우스 폴리클로날 항혈청은 JD1 및 IP90 모두의 BmpD와 반응한 JD1 BmpD에서 나타났으나 IP90의 BmpD 밴드는 극히 미미하였다. 따라서 ADCK의 표적이었던 IP90 항원의 실체는 BmpA, BmpD 또는 P35가 아니었다. 이하, 이것을 P39.5라 한다.
이어서 JD1로 참진드기 접종된 원숭이의 혈청, P39에 대한 원숭이 폴리클로날 항혈청, 플라젤린에 대한 마우스 Mab H9724, JD1로 참진드기 접종된 원숭이의 혈청시료로부터 친화성 정제하여 얻은 원숭이 앤티-P39.5 항체, 및 마우스 앤티-재조합 P7-1 (rP7-1)로 배양시킨 JD1 및 IP90 스피로헤타의 용해물의 웨스턴 블롯을 형성시켰다. JD1 용해물의 웨스턴 블롯에서의 P39.5를 확인하기 위하여 JD1 감염된 원숭이에서 유도된 앤티-P39.5 항체를, IP90 유래의 P39.5가 부착된 니트로셀룰로오스 스트립을 사용하여 친화성 정제하였다. 예측한 대로 이 항체는 IP90 용해물의 웨스턴 블롯에서의 P39.5 항원과 반응하였으나, 놀랍게도 JD1 블롯과는 반응하지 않았다. 이 결과는 JDI의 P39.5는 생체외에서는 발현되지 않았거나, JD1 블롯에서의 친화성 정제된 앤티 P39.5 항체에 의해 검출 불가능할 정도로 극히 미미하게 발현되었거나, 혹은 IP90의 P39.5의 친화성 정제된 항체와 항원적으로 교차반응을 하지 않은 방식으로 JD1에 의해 생체외에서 발현되었음을 의미한다.
친화성 정제된 앤티-P39.5 항체는 첫번째로 유도되지 않았기 때문에 분명히 JD1 스피로헤타는 면역원성으로 되기에 충분히 높은 양으로 생체내에서 P39.5를 발현했음이 틀림없다. 상기한 웨스턴 블롯에 있어서 BmpA의 위치는 앤티-BmpA 폴리클로날 항혈청과의 반응에 의해 나타났고, 플라젤린의 위치는 이 분자와 Mab H9724와의 반응에 의해 나타났다.
따라서 B. 가리니이 균주 IP90에 의하여 생체외에서 풍부하게 발현되고 B. 부르그도르페리 센수 락토 균주 JD1에 의해 생체내에서 풍부하게 발현되는 신규의 보렐리아 항원을 확인하였다. 이 항원 P39.5는 IP90 스피로헤타의 ADCK에서 표적이었다.
실시예 5: P39.5의 클로닝
A. 박테리오파지에서의 클로닝
B. 가리니이 IP90 유래의 무작위 전단된 전체 DNA의 라이브러리를 λZAPII 박테리오파지 벡터 [미합중국의 Stratagene사]에 구축하고, B. 부르그도르페리의 JD1 균주로 감염시킨 붉은털 원숭이로부터 채취한 혈장 풀(plasma pool)로 스크리닝하였다. 이 풀에 사용된 혈장시료는, 몇가지 IP90 웨스턴 블롯에서 나타난 추가로 미확인된 한두개의 높은 분자질량의 미미한 밴드와 추정 플라젤린 및 P39.5만을 인식한 항체를 함유하도록 선택하였다.
수회의 스크리닝을 한후에 클론 11개를 구해 pBluescript 파아지미드 (phagemid) (Stratogene)에 넣고 재조합 플라스미드를 정제하여 이것을 사용하여 E. coli의 SURE 균주의 세포를 형질전환하였다. 각각의 원래의 클론으로부터 몇개의 형질전환체를 선택하여 삽입물의 존재를 확인한 다음, 각 클론 유래의 이 형질 전환체 하나를 성장시켜 발현을 유발시키고, 용해한후에 원래의 혈장 풀로써 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 11개의 클로닝된 단편은 도트-블롯(dot-blot) 하이브리다이제이션에 의해 서로간에 하이브리다이즈하였다.
11개의 클론중의 하나 (7-1로 명명)를 선택하여 혈장 항체와 발현된 단백질과의 강한 반응성에 근거하여 과발현 및 정제하였다. 7-1 삽입물은 그 길이가 950 bp이었다.
면역 흡수제로서 클론을 사용하여 친화성 정제한 원래의 혈장시료 유래의 항체가 B. 가리니이 용해물의 웨스턴 블롯에서 P39.5와 반응했음을 나타냄으로써, P39.5와 교차반응하였는지 혹은 이와 항원적으로 동일한지를 가지고 발현된 단백질의 실체를 확인하였다. JD1 스피로헤타로 감염된 원숭이 유래의 혈장 및 B. 가리니이 클론 1-1과 클론 7-1에 의해 발현된 재조합 항원으로써 친화성 정제한 동일한 혈장 유래의 항원과 반응한 IP90 스피로헤타 유래의 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯을 형성시켰다. 원숭이 혈장 풀과 IP90과의 반응성은 블롯에서 나타났다. 재조합 1-1 단백질로써 친화성 정제한 항체와 IP90 용해물과의 반응성이 나타났고, 또한 재조합 7-1 단백질로써 친화성 정제한 항체와 IP90 용해물과의 반응성도 나타났다.
P7-1의 부분 DNA 서열을 얻었다 [SEQ ID NO: 1]. 클론 7-1로부터는 약 950 bp가 유도되었고, 더욱이 클론 14로부터는 상류영역의 약 140 kb를 얻었다 [SEQ ID NO: 13]. 5' SEQ ID NO: 13 서열 및 SEQ ID NO: 1 서열에 의해 생긴 DNA 단편은 그 길이가 1189 bp인데 도 2에 나와있다. 이것은 37.7 kDa의 추정 단백질을 코우드하는 단일의 오픈 리딩 프레임을 포함하고 있으며, 그 알라닌 함량이 많으므로 인하여 오히려 낮은 분자질량을 가지고 있다. 이 단백질의 아미노산의 평균 분자질량이 95이므로 약 57 bp의 완전 코우딩 영역을 상실하고 있다. 소수성 리더 서열이 관찰되지 않았고, 또한 P39.5는 지방 단백질의 용해성을 가지고 있기 때문에 (아래 참조), P7-1은 P39.5와 항원적으로 교차반응을 하지만 그 자체가 완전한 P39.5가 아니다.
P7-1의 추정 아미노산 서열 [SEQ ID NO: 14 및 2] 이외의 데이타는 P39.5가 지방 단백질인 것을 시사하고 있다. 즉, 첫째로, IP90 스피로헤타의 전세포 추출물에 존재하는 천연형의 P39.5는 완전히 추출되었는데, 즉 Triton-X114 상분리 실험에서 세척제속으로 분배되었다. 둘째로, 그 서열의 대부분은 OspA와 극히 유사하게 친수성 도메인으로 구성되어 있으나, 항체의 표적이 되기 때문에 외부표면에 노출되어 있어야 한다. 세째로, 보렐리아 헤름시이 (Borrelia hermsii) 지방 단백질의 몇개의 Vmp와의 % 동일성은, 예컨대 Vmp4의 경우 22%, Vmp23의 경우 19%, Vmp17의 경우 18% 및 Vmp21의 경우 17%로서 상당한 레벨이다. 이들 서열은 GENBANK 데이타베이스에서 입수 가능하다.
그 뉴클레오티드 서열의 흥미로운 특징은 도 2에 나온 바와 같이 몇개의 내부반복 영역이 존재한다는 것이다. 블록 IA와 IB는 70% 동일하다. 블록 IIA는 IIB와 91% 동일하고, 블록 A, B 및 C는 84 내지 90% 동일하다. 내부적으로 특이한 유일의 단편은 흑색 블록으로 나타낸 것이다. 분명히 이러한 분자는 상동성 영역을 가지는 OspA 유전자와 OspB 유전자 사이에서 발생하는 동일한 종류의 상동성 재조합을 할 가능성이 충분히 있다 [P. Rosa et al, 위에 나온 문헌 참조]. 그러나 OspA에 관한 문헌 [Sole et al, 위에 나온 문헌 참조]에도 나온 바와 같이 가능성 있는 회피 돌연변이체는 항체와 보체의 협동작용을 회피하지 않아도 된다.
B. QIAEXPRESSTM계에 의한 재조합 P7-1의 발현 및 정제
미합중국의 Qiagen사로부터 입수한 QiaexpressTM은 Ni 등의 2가 양이온에 대한 연속적인 히스티딘 잔기의 고도의 친화성을 이용하고 있다. 니켈은 니트릴로-트리-아세트산 (NTA)에 결합하고, 이어서 아가로오스에 결합한다. 친화성 태그가 극히 작으므로 (최소 6개 잔기), 단백질 항원성에 대하여 연속함이 없이 융합 단백질에 잔류한다. 6 ×His 친화성 태그를 N 말단 또는 C 말단에 도입할 수 있다. 벡터 (pQE 벡터)의 범위는 두가지 타입의 융합을 형성하는데 사용된다.
재조합체를 먼저 스크리닝하여 플라스미드에서의 예측된 삽입물의 존재를 확인한 다음, 웨스턴 블롯에 의해 이들 재조합체에서의 단백질 발현을 확인하였다. 몇개의 pQE 벡터 [N 말단 융합을 위함]에 존재하는 친화성 태그 서열인, MRGS(His)6 에피토우프 (Qiagen)를 특이적으로 검출하는 마우스 항체, 혹은 상응한 균주의 스피로헤타로써 감염시킨 대조의 마우스 유래의 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯을 형성시켰다. 동일하게 감응성인 대체물로서는 Ni-NTA-알칼리성 포스파타아제 결합물 (이것 역시 Qiagen으로부터 입수하였음)을 사용하였다.
융합 형성물을 함유한 E. coli 세포를 중간 대수 증식기까지 성장시키고, 0.3 mM IPTG로써 3시간 유도한후 펠릿화하여 초음파 완충액 [50 mM NaPO4, pH 8.0, 300 mM NaCl]으로 1회 세척하고 -20℃에서 하루밤 보관하였다. 그 다음날 세포를 초음파 완충액중에 다시 부유시키고 15초 펄스를 사용하여 2분간 얼음으로 초음파 처리한 즉시 세린 프로테아제 저해제 PMSF (페닐-메틸술포나이드 플루오라이드)를 가하여 이 프로테아제에 의한 분해를 방지하였다. 세포 부스러기를 회전시켜 아래로 침강시키고, 상청액을 깨끗한 튜우브에 옮겼다. 한편, 초음파 완충액 10 칼럼 체적 (cv: column volume)을 사용하여 Ni-NTA 수지를 1회 세척하였다. 튜우브속에서 1시간 동안 융합 단백질을 Ni-NTA에 결합시키고, 수지를 회전에 의해 침강시킨후 상청액을 제거하였다. 수지를 10 cv의 초음파 완충액중에 다시 부유시켜 칼럼속에 부어넣고 10 cv의 동일한 완충액으로 3회 세척한 다음, 10 cv의 세척용 완충액 [50 mM NaPO4, pH 6.3, 300 mM NaCl]으로 3회 세척하였다. 최후로 10 cv의 용출용 완충액 [50 mM NaPO4, pH 4.5, 300 mM NaCl]으로 융합 단백질을 용출시켜 획분을 채취하였다. 이들 획분에 대해 단백질을 분석하여 최고농도의 단백질을 함유한 획분들을 회수하여 이염기성 NaPO4를 사용하여 pH 7.0으로 중화하였다. 회수한 시료중의 단백질 농도를 구하고, 그 일부를 취해 SDS-PAGE 겔에 가한후 은으로 염색하여 순도를 체크하였다. 대표적인 수율은 배양물 1 리터당 약 4∼5 mg이었다.
실시예 6: 원숭이에서의 P7-1의 생체외 예방작용
DNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용한 동일한 원숭이 혈장 풀로부터 앤티-P7-1 항체를 정제하였는데, 즉 클론 7-1에서 발현된 재조합 P7-1 단백질 (rP7-1)을 함유한 니트로셀룰로오스 스트립에다 흡수시킨 후에 이로부터 산 용출에 의해 용출시킴으로써 정제하였다. 이 항체의 단일 특이성을 실시예 2 및 4에 나온 바와 같이 웨스턴 블롯으로 확인하고, 이 항체를 실시예 3에 나온 바와 같이 ADCK에 사용하였다.
친화성 정제된 앤티-P7-1 항체에 의한 감염 24시간후의 IP90 스피로헤타 사균의 획분은 55%이었다 (도 3의 막대 2). 이 항체를 혈장에서의 농도의 1:10 희석비와 균등한 농도로 재구성하였다. 이 사멸율은 동일한 혈장의 1:10 희석비에서 관찰된 것과 비교되는 것이었다 (67%, 도 3의 막대 1). 보체의 부재하에서는 스피로헤타의 불과 12%만이 사멸되었으므로 (도 3의 막대 3), 사멸을 하기 위해서는 보체가 필수적이었다. 원숭이 보체 단독의 존재하에서의 사멸은 통상적인 경우보다 약간 높은 25% (도 3의 막대 4)인 반면, JD1 스피로헤타에 의한 감염에도 불구하고 빈번히 얻게되는 대부분의 값들은 10∼15%이었다 [M. Aydintug et al, Infect. Immun., 62:4929∼4937 (1994)]. BSK-H 배지 단독에서는 스피로헤타의 12%가 사멸하였다 (막대 5).
이들 결과는 JD1 스피로헤타에 의한 자연감염 도중에 원숭이에서 유발된, IP90의 재조합 P7-1 (P39.5의 단편) 항원에 대한 항체는 ADCK에 의하여 IP90 스피로헤타를 사멸시킬 수 있었음을 나타낸 것이다.
이들 실험은 P7-1의 예방작용을 입증한 것이며, 또한 백신 후보물질로서의 이 항원을 선택할 수 있는 근거를 제공하고 있다.
실시예 7: 마우스에서의 P7-1의 예방작용
본 실시예는 마우스를 재조합 P7-1로써 직접 면역시킬 수 있음을 설명하는 것이다. rP7-1 및 Ribi 보조제로 면역시켜 생성된 마우스 항체는 항체 의존성 보체매개 사멸 (ADCK)에 의해 생체외에서 IP90 스피로헤타를 60%까지 사멸시킬 수 있었다. P7-1의 예방작용을 보다 직접적으로 평가하기 위하여 실시예 5에 나온 바와 같이 클론 7-1의 DNA 단편을 pQE에 서브클로닝한 다음, 발현된 단백질을 밀리그람의 양으로 정제하여 C3H/HeJ 마우스의 면역에 사용하였다. Ribi R-700 보조제 (미합중국의 Ribi ImmunoChem Research사) 0.2 ml에 재조합 P7-1을 가한 것을 각각 30 ㎍을 마우스에 4회 주사하였다. R-700 제제는 0.25 ㎕/ml MPLTM, 0.25 mg/ml 합성 트레할로오스 디코리노마이콜레이트, 20 ㎕/ml 스콸렌 (헥사메틸테트라코사헥산) 및 2 ㎕/ml 모노올레에이트 (Tween 80)으로 된 것이다. 3주 간격으로 복강내에 주사하였다. 최종 면역 2주후에 마우스의 혈액을 채취하고, 유발된 항체의 특이성을, IP90 스피로헤타의 전세포 추출물을 항원으로 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인하고 혈청시료를 한데 모았다.
Ribi 보조제 단독으로 면역시킨 마우스의 혈청은 IP90 블롯에서 항원을 인식하지 않았다. rP7-1 및 Ribi로 면역시킨 마우스의 혈청은, 예측한대로 IP90 용해물에서의 P39.5 밴드를 인식하였으나 41 kDa 플라젤린 밴드보다 약간 높은 약한 밴드와 고분자 질량의 밴드도 인식하였다. 흥미롭게도 이러한 동일한 항체는 JD1 용해물의 웨스턴 블롯에서의 41 kDa 밴드를 인식하였고, 또한 약간 높은 분자질량의 항원도 인식하였다.
이 결과는 앞서 나온 실시예에서의 원숭이 유래의 친화성 정제된 앤티-rP7-1항체에서 나타난 결과와는 상이한데, 그 이유는 아마도 원숭이 항체 (4∼5주)의 경우보다 훨씬 길게 (12주) 마우스 항체의 친화성을 성숙시켰기 때문이다. 그 결과, 그 결합 친화성은 보다 높아졌으나 그 특이성은 보다 저하되었으므로, 교차 반응성이기는 하지만 동일성이 없는 에피토우프에 대해 결합할 수 있다.
추가로 효능촉진제 주사를 한 후에는, 생체외에서 ADCK에 의해 IP90 스피로헤타의 60%를 사멸시킨 앤티-P7-1 항체를 얻은 마우스에서는 동일한 종류의 실험에서 이러한 스피로헤타를 100% 사멸시킨 항혈청을 생성하였다. 더욱이 이러한 동일한 항혈청은 균주 NT1 (아직까지 미분류이지만 미합중국의 동북부의 환자의 뇌척수액에서 분리한 균주) 유래의 스피로헤타를 50% 사멸시킬 수 있었다. 이에 반하여 JD1 균주의 스피로헤타는, rP7-1 및 Ribi 보조제로 면역시킨 마우스에 대한 참진드기 공격 실험에서 생체외 (ADCK) 혹은 생체내에서 사멸되지 않았다.
ADCK를 기니아 피그 보체 및 원숭이에 대해 평가하였다. 후자의 경우에 있어서 정상적인 기니아 피그 혈청 (미합중국의 Sigma Chemical사)을 보체 공급원으로 사용하였다. B. 부르그도르페리 JD1로 감염된 동물 유래의 동일한 원숭이 혈장 풀을 양성 대조로 사용하였다. 1:10의 희석비에서 24시간 배양후에 이 혈장 풀은 IP90 스피로헤타를 57% 사멸시켰다 (도 3의 막대 1). rP39.5에 대한 마우스 항혈청은 1:10의 희석비에서 스피로헤타를 73.5% 사멸시켰고, 1:50의 희석비에서 스피로헤타를 60.5% 사멸시켰다 (각각 막대 2 및 3). Ribi 보조제 단독으로 면역시킨 마우스 유래의 혈청은 스피로헤타를 21% 사멸시켰다 (막대 4). 기니아 피그 보체는 ADCK 시험에서 효과가 없었다. 스피로헤타의 37%가 1:10의 희석비에서 양성 대조 혈장에 의해 사멸 (막대 5)된 반면, 동일한 희석비에서의 마우스 앤티-P39.5 항혈청은 기니아 피그 보체 존재하에 스피로헤타를 48% 사멸시켰다 (막대 6). Ribi 단독이 투여된 마우스 유래의 혈청의 1:10 희석비의 존재하에서는 스피로헤타의 12%가 사멸되었다. 흥미롭게도 마우스 앤티-r39.5 항혈청의 1:10의 희석비에서 배양했을 경우 JD1 스피로헤타는 불과 6%만이 사멸되었는데, 이것은 대조 혈청에 의해 사멸된 것과는 상이하지 않은 값이다. 따라서 JD1 블롯에서 인식된 밴드는 아마도 가성의 교차 반응성을 나타내는 것이라 할 수 있으나 JD1 P39.5의 경우에는 그렇지 않다.
실시예 8: 인간에 있어서의 P7-1의 진단에의 이용
미합중국의 질병방제 센터(CDC)로부터 인간혈청 시료 19개를 입수하였다. 이들 시료중 4개는, 라임병력이 전혀 없었고 이 질병이 유행하고 있는 지역에 거주한 적도 없었던 공여자들의 것이었다. 나머지 15개는 라임병 유행지역에서 거주하였고, 이 병의 증상 및/또는 징후를 가졌으며 한명만 제외하고는 CDC의 권장기준에 의해 혈청학적으로 양성이었던 환자들의 것이었다. 이 기준에 의하면 이들 환자는 민감성 라임 ELISA 테스트에 의해 양성이어야 하고, 또한 IgM 또는 IgG 웨스턴 블롯에 의해서도 양성이어야 하므로 세가지 밴드(24, 39 또는 41 kDa)중에서 적어도 두가지는 양성 IgM 블롯에 존재하였고, 10가지 밴드(18, 21, 28, 30, 39, 41, 58, 66 및 93 kDa)중에서 다섯가지는 양성 IgG에 존재하였다.
1:200으로 희석한 혈청시료를, 정제 P39.5 항원을 전기 블롯팅해 둔 니트로셀룰로오스 스티립과 더불어 배양함으로써 IgG 항체를 검출한 다음, 실시예 2의 면역효소법으로 결합항체를 검출하는 시험에서 아래의 결과를 얻었다. 라임병력이 전혀없었고 이 질병이 유행하고 있는 지역에 거주한 적도 없었던 공여자들의 혈청시료 4개는 검출 가능한 앤티-P39.5 항체가 전혀 없었다. 나머지 15개의 시료중에서 14개는 양성이었다. 오직 음성인 시료는 CDC의 권장기준에 의한 항체를 나타내지 않은 것이었다. 따라서 앤티-B. 부르그도르페리 항체에 대한 진단용 프로우브로서 P39.5 항원에 근거한 단순한 방법은 그 초기평가에서, 현재 CDC에서 권장하고 있는 보다 복잡한 2단계 방법과 같이 민감하고 특이적이다.
또 다른 진단평가에서 7-1 DNA 단편 rP7-1로부터 발현된 항원성 단백질을 붉은털 원숭이에서의 라임병의 초기 혈청학적 진단용 프로우브로 하여 시험하였다. 세가지 상이한 B. 부르그도르페리 B31, JD1 및 NT1으로 각각 감염시킨 붉은털 원숭이 3쌍으로부터 얻은 혈청시료에는 웨스턴 블롯으로 검출했을 경우 감염 2주까지 정제 rP7-1에 대한 검출 가능한 항체를 함유하였다. IgM 항체 및 IgG항체를 동시에 시험하였다. 그 결과로부터 항체응답을 유발하고 있는 B. 부르그도르페리 균주와는 관계없이 감염도중에 P7-1에 대한 항체가 초기에 나타남을 알 수 있다.
CDC로부터 입수한 인간 혈청시료 43개를 사용하여 상기한 웨스턴 블롯에 의해 항체검출의 민감도를 다시 평가하였다. 실험을 무작위식으로 실시하였다. CDC 시료는 각 경우에 대해 엄격한 CDC 기준을 만족한 라임병의 임상진단 환자로부터 채취한 것이었다. 임상적으로 양성인 환자 유래의 시료 43개중에서 34개는 MarDx Diagnostics사제의 웨스턴 블롯 테스트 (Lyme disease MarBlot)을 사용하여 Dressler 기준 [Dressler, F. et al, 1993 J. Infect. Dis., 167:392∼40]에 의해 판정한 결과, CDC에 의해 양성으로 나타났다. P7-1 항원에 근거한 진단용 웨스턴 블롯의 경우에서는 음성 또는 양성 결과가 항상 두가지 시험방법에서 일치하지 않았으나 동일한 수의 시료는 양성이었다 (34). 따라서 단일 밴드가 검출되고 (혹은 검출되지 않고), 따라서 해석이 단순한 시료인 P7-1계 웨스턴 블롯에서는 해석하기에 가장 완성되기는 하나 성가신 라임 진단시험법으로서 현재 시판되고 있는 것과 동일한 감도를 나타내었다.
항원 특이성 시험에 있어서, 이제까지 매독환자의 혈청시료 12개중에서 11개는 모든 시료가 전체 B. 부르그도르페리 항원의 웨스턴 블롯에서 다중 항원과 교차반응한 항체를 함유하고 있었다는 사실에도 불구하고 시험에서 음성이었다. 양성결과를 나타낸 단일 혈청시료는 HIV 감염 및 몇가지 AIDS 관련 감염되기도 한 한명의 환자의 것이었다.
실시예 9: 카세트 스트링 단백질
상기한 바와 같이 7-1 단편의 뉴클레오티드 서열로부터 예측된 아미노산 서열은 B. 부르그도르페리의 B31 균주의 VlsE와 약 50% 동일한데, 이것은, 재조합 메카니즘에 의해 항원변이를 함으로써 발현된 카피 (VlsE)의 중앙 단편이 발현된 카피의 상류쪽에 위치한 15개 "카세트"의 스트링 유래의 단편들과 재조합하는 B. 부르그도르페리의 항원의 일부이다 [J. Zhang, 위에 나온 문헌 참조].
B. 가리니이 IP90의 카세트 스트링의 일부로 생각되는 몇개의 DNA 단편을 클로닝하였다. 7-1 외에 단편 1-1, 3-1, 6-1, 9-1, 및 12-1은 길이 1 kb와 2 사이에 있다. P7-1에 대해 위에 나온 바와 같이 재조합형으로 발현시켰을 경우 (pBluescript의 lacZ 프로모우터의 오프위치), 카세트 스트링 단편 각각은 삽입물의 크기와 동일하며 감염된 원숭이 유래의 항체와 반응하는 펩티드를 발현한다. 이들 단편의 5' 말단은 어느것이라도 소수성 리더, 혹은 세균성 지방 단백질에 특징적인 타입의 시그날 펩티다아제 II 공통(consensus) 서열을 함유하지 않고 있다. 따라서 이들 단편은 IP90의 카세트 스트링의 일부임이 확인되며, B31의 카세트 스트링처럼 프레임내에 있다. 각 단편의 5' 말단 및 3' 말단의 DNA 서열 (약 100∼500 bp 사이)은 SEQ ID NO: 3 내지 12에 나와 있는데, 여기서 주목할 것은 단편 9-1의 5' 말단만이 SEQ ID NO: 10에 나타나 있다는 점이다.
이들 단편의 항원성을 두가지 방법으로 분석하였다. 그 첫번째는 붉은털 원숭이로부터 채취한 혈청시료와 웨스턴 블롯의 단편의 반응성을, B. 부르그도르페리로 접종하고 나서 48주 동안 조사하였다. 단편 9-1 및 7-1에 의해 발현된 단백질은 감염후(PI) 2주 내지 24주 사이에 채취한 혈청시료와 우세하게 반응하였고 (초기 반응물), 단편 3-1 및 6-1에 의해 발현된 단백질은 감염후(PI) 24주 내지 48주 사이에 채취한 혈청시료와 주로 반응하였으며 (후기 반응물), 단편 1-1 및 12-1 유래의 단백질은 조사기간 48주 동안에 균일성이 큰 반응성을 나타내었다. 이 결과는 클로닝된 단편 각각은 특이한 에피토우프를 함유한 것을 시사하는 것이다.
이것을 확인하기 위하여 상기한 웨스턴 블롯 분석시에 사용한 시료를 사용하여 혈청 풀을 형성시키고, 이러한 "시간" 풀의 일부를 취해 7-1로부터 발현된 정제항원 (rP7-1) 과잉량으로 예비배양하였다. 이 방법에 있어서 혈청 풀에 존재한 앤티-P7-1 항체는 웨스턴 블롯의 P7-1 항원과 그 이상 더 반응하지 않았다. 그러나 이 혈청 풀은 12-1을 제외하고는 기타의 DNA로부터 발현된 단백질과의 반응성을 가지고 있었다. 후자의 경우는 "후기" 반응물이므로 12-1의 추정적으로 특이한 에피토우프에 대한 항체를 혈청 풀에서 희석할 수 있었다. P7-1에 대해 위에 나온 바와 같이, 위에 나온 단편들 전부를 pQE 벡터속으로 서브클로닝하여 통상적인 방법으로 발현시켰다.
본 발명자들은 IP90 P39.5 항원을, B31의 vlsE 항원에 대한 상동성에 따라 항원성 변이를 시키는 메카니즘을 이론화하였고, 그 메카니즘으로부터 이 항원은 척추동물 숙주에서의 스피로헤타균의 생존에 극히 중요하다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 방법과 조성물은 변이의 직접적인 공급원인 카세트 스트링에서 발현되는 큰 획분의 에피토우프로써 숙주를 면역시킴으로써 이러한 스피로헤타 방어 메카니즘을 대처하게 된다. 이것은 이러한 대부분의 카세트 스트링이 프레임내에 있다는 특이한 사실로 인해 가능하다. 따라서 상기한 바와 같이 한가지 백신접종 방법은 IP90 카세트 스트링의 항원적으로 비유사한 부분 유래의 상기한 클로닝된 정제 단백질 몇가지 혹은 전부를 숙주에게 투여하는 것이다. 예컨대 P7-1을 숙주에 도입하여 항체를 유발시켜 스피로헤타를 사멸시킨 경우에서 나타나는 결과를 보면 알 수 있게된다.
Claims (65)
- 자연적으로 관련된 세포물질로부터 분리된, P39.5 또는 그 단편을 코우드하는 핵산서열.
- ATCC 수탁번호 제 98478호인 제1항에 의한 조성물.
- P39.5 또는 그 단편을 코우드하는, 아래의 것들로 된 군으로부터 선택되는 핵산서열.(a) SEQ ID NO: 1;(b) SEQ ID NO: 3;(c) SEQ ID NO: 4;(d) SEQ ID NO: 5;(e) SEQ ID NO: 6;(f) SEQ ID NO: 7;(g) SEQ ID NO: 8;(h) SEQ ID NO: 9;(i) SEQ ID NO: 10;(j) SEQ ID NO: 11;(k) SEQ ID NO: 12;(l) SEQ ID NO: 13;(m) 긴축 조건하에 상기 (a) 내지 (l)중의 어느 하나에 대해 하이브리다이즈하는 서열;(n) 상기 (a) 내지 (m)중의 어느 하나의 대립형질 변이체;(o) 상기 (a) 내지 (m)중의 어느 하나의 단편;(p) 상기 (a)의 결실 돌연변이체.
- 보렐리아 스피로헤타 (Borrelia spirochete)에 의해 발현되며 상대 분자질량이 39,500 달톤인 분리된 P39.5 단백질.
- 제4항에 있어서, 아래의 것들로 된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 함유하는 단백질.(a) SEQ ID NO: 2;(b) SEQ ID NO: 14;(c) (a) 또는 (b)의 단편;(d) SEQ ID NO: 2 또는 14와 80% 이상의 상동성을 가진 것을 특징으로 하는 (a) 또는 (b)의 상사체;(e) SEQ ID NO: 2 또는 14와 80% 이상의 상동성을 가진 것을 특징으로 하는 (a) 또는 (b)의 상동체.
- 아래의 단백질로 된 군으로부터 선택되는 재조합 단백질.(a) SEQ ID NO:2 또는 14의 아미노산 서열 또는 그 상사체, 상동체 혹은 그 단편을 함유한 단백질;(b) 두번째 단백질에 융합된, SEQ ID NO:2 또는 14의 아미노산 서열 또는 그 상사체, 상동체 혹은 그 단편을 함유한 융합 단백질;(c) SEQ ID NO:2 또는 14와 95% 까지 동일한 단편이 부가된 SEQ ID NO:2 또는 14의 아미노산 서열을 함유한 융합 단백질;(d) 아미노산 하나 이상이 결실된 SEQ ID NO:2 또는 14의 아미노산 서열을 함유한 결실 단백질.
- 적당한 조절서열의 제어하에 P39.5 또는 그 단편을 코우드하는 핵산서열을 함유한 벡터.
- 제7항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 유전자를 발현시키는 조건하에서, P39.5 핵산서열 또는 그 단편으로써 형질전환된 재조합 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 P39.5 유전자 또는 그 단편의 재조합에 의한 발현방법.
- P39.5 단백질 또는 그 펩티드를 발현시키는 조건하에서, 상기 P39.5 단백질 또는 그 단편을 코우드하는 핵산서열로써 형질전환된 재조합 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 P39.5 단백질 또는 그 폴리펩티드 혹은 펩티드 단편의 재조합에 의한 발현방법.
- 제10항에 있어서, 상기 발현된 단백질을 상기 세포 혹은 세포배지로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 P39.5 단백질이 융합 단백질인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 P39.5 단백질이 결실 돌연변이체 단백질인 방법.
- P39.5 단백질 혹은 단편을 화학합성하는 P39.5 혹은 그 단편의 제조방법.
- 아래의 것들로 된 군으로부터 선택되는 핵산서열 및 상기 서열과 관련된 검출 가능한 표지물을 함유하는 진단시약.(a) 자연적으로 관련된 세포물질로부터 분리된, P39.5를 코우드하는 핵산서열;(b) SEQ ID NO: 1 또는 그 상보서열;(c) SEQ ID NO: 3 또는 그 상보서열;(d) SEQ ID NO: 4 또는 그 상보서열;(e) SEQ ID NO: 5 또는 그 상보서열;(f) SEQ ID NO: 6 또는 그 상보서열;(g) SEQ ID NO: 7 또는 그 상보서열;(h) SEQ ID NO: 8 또는 그 상보서열;(i) SEQ ID NO: 9 또는 그 상보서열;(j) SEQ ID NO: 10 또는 그 상보서열;(l) SEQ ID NO: 11 또는 그 상보서열;(m) SEQ ID NO: 12 또는 그 상보서열;(n) SEQ ID NO: 13 또는 그 상보서열;(o) 긴축 조건하에 상기 (a) 내지 (n)중의 어느 하나에 대해 하이브리다이즈하는 서열;(p) 상기 (a) 내지 (o)중의 어느 하나의 대립형질 변이체;(q) 길이로 적어도 15 뉴클레오티드를 함유한 상기 (a) 내지 (o)중의 어느 하나의 단편;(r) 상기 (a), (b) 또는 (n)의 결실 돌연변이체; 및(s) 두번째 단백질을 코우드하는 서열에 융합된 P39.5 또는 그 단편을 코우드하는 서열.
- P39.5 또는 그 단편에 대해 지향적인 분리된 항체.
- 제16항에 있어서, P39.5, P7-1, P1-1, P3-1, P6-1, P9-1 및 P12-1로 된 군으로부터 선택되는 단백질 혹은 그 단편을 척추동물에 투여함으로써 생성되고, 항체 의존성 보체매개에 의한 사멸에 의해 생체외에서 IP90 스피로헤타를 사멸할 수 있는 항체.
- 제16항에 있어서, 상기 숙주를 제6항의 단백질로써 면역하여 분리된 항체.
- 제16항에 있어서, 키메라 항체, 인간화 항체, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체로 된 군으로부터 선택되는 항체.
- JD1 스피로헤타로써 붉은털 원숭이를 감염시키는 도중에 생성된 항혈청을, 보렐리아 P39.5 단백질 또는 그 단편을 면역 흡수제로 사용하여 친화성 정제하여 분리된 항체.
- 제16항의 항체에 대해 특이성을 가진 항유전형(anti-idiotype) 항체.
- 제16항에 의한 항체와 검출 가능한 표지물을 함유한 진단시약.
- 유효량의 P39.5 단백질, 융합 단백질 또는 그 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한 백신 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 단편은 P7-1, P1-1, P3-1, P6-1, P9-1 및 P12-1로 된 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 하나 이상의 기타 B. 부르그도르페리 항원 또는 그 단편을 함유한 조성물.
- 제25항에 있어서, 상기 기타의 항원은 OspA, OspB, OspC, BmpA, BmpB, BmpC, BmpD 및 그 단편 혹은 변이체로 된 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 조성물은, P39.5 또는 그 단편의 서열에 대해 상동성인 서열을 가진 단백질 또는 그 단편을 적어도 하나 이상 함유한 조성물.
- 제23항에 있어서, 각각의 단백질의 혼합물을 함유한 조성물.
- 제25항에 있어서, 상기 P39.5 단백질 또는 그 단편 및 상기 기타의 항원이 융합 단백질 형태인 조성물.
- 제23항의 조성물 유효량을 함유하는 조성물을 인간 또는 동물에게 투여하는 라임병에 대한 인간 또는 동물의 백신접종 방법.
- 진단하고자 하는 인간 또는 동물 유래의 체액 시료로써 앤티-P7-1 또는 앤티-39.5 항원 혹은 그 상동체를 배양하는 단계를 포함하고, B. 부르그도르페리의 존재하에 항원-항체 착물을 생성시킨 다음, 상기 체액을 분석하여 상기 착물의 존재를 확인하는, 인간 또는 동물에 있어서의 라임 보렐리오증의 진단방법.
- 적어도 하나 이상의 앤티-P39.5 또는 앤티-P7-1 항체와 적당한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한, 라임병을 가진 환자 또는 동물의 치료용의 치료 조성물.
- 제32항에 의한 조성물 유효량을 투여하는 것을 포함한 척추동물 숙주에서의 라임병 치료방법.
- 제16항의 앤티-P39.5 항체 혹은 P39.5 단백질 또는 그 단편을 함유한, 인간 또는 동물에서의 B. 부르그도르페리에 의한 감염 진단용 키트.
- 스피로헤타가 척추동물 숙주에 존재할 경우 스피로헤타에 의해 발현되는 표면항원을 함유한 라임병 예방용 백신.
- P39.5 단백질 또는 단편을 시험 화합물과 접촉시켜 시험 화합물을 P39.5에 결합시키고, P39.5에 결합하는 시험 화합물의 양을 결정하는 단계를 포함하는, P39.5 또는 그 단편에 특이적으로 결합하는 화합물의 확인방법.
- 제36항의 방법에 의해 확인된 화합물.
- 자연적으로 관련된 세포물질로부터 분리되며, 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 및 12-1로 된 군으로부터 선택된 보렐리아 카세트 스트링의 단백질 또는 그 단편을 코우드하는 핵산.
- 자연적으로 관련된 세포물질로부터 분리되며, P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 및 P12-1로 된 군으로부터 선택된 보렐리아 카세트 스트링의 단백질 또는 그 단편.
- 적당한 조절서열 제어하에 보렐리아 카세트 스트링 단백질 또는 그 단편을 코우드하는 핵산서열을 함유한 벡터.
- 제40항의 벡터로써 형질전환된 숙주세포.
- B. 가리니이 카세트 스트링 핵산서열 또는 그 단편으로써 형질전환된 재조합 숙주세포를 상기 서열을 발현하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, B. 가리니이 카세트 스트링 단백질 또는 그 단편의 재조합에 의한 발현방법.
- B. 가리니이 카세트 스트링 단백질 또는 그 단편을 코우드하는 핵산으로써 형질전환된 재조합 숙주세포를 상기 단백질 또는 펩티드를 발현하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, B. 가리니이 카세트 스트링 단백질 또는 그 펩티드 단편의 재조합에 의한 발현방법.
- 제43항에 있어서, 상기 발현된 단백질을 상기 세포배지로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 보렐리아 카세트 스트링 단백질 또는 펩티드 단편이 융합 단백질 또는 결실 돌연변이체 단백질인 방법.
- B. 가리니이 카세트 스트링 단백질 또는 펩티드 단편을 화학합성하는 것을 포함하는 B. 가리니이 카세트 스트링 단백질 또는 펩티드 단편의 제조방법.
- 분리된 앤티-B. 가리니이 카세트 스트링 단백질 항체.
- 제47항에 있어서, B. 가리니이 카세트 스트링 단백질 또는 단편을 척추동물 숙주에게 투여하여 생성시킨 항체.
- 제48항에 있어서, JD1 스피로헤타로써 붉은털 원숭이를 감염시키는 도중에 생성된 항혈청을, 보렐리아 카세트 스트링 단백질을 면역 흡수제로 사용하여 친화성 정제함으로써 분리된 항체.
- 제47항에 있어서, 제39항의 단백질 또는 상기 카세트 스트링 단백질의 혼합물로써 상기 숙주를 면역시킴으로써 분리된 항체.
- 제47항에 있어서, 키메라 항체, 인간화 항체, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체로 된 군으로부터 선택되는 항체.
- 제47항의 항체에 대해 특이성을 가진 항유전형(anti-idiotype) 항체.
- 제47항에 의한 항체와 검출 가능한 표지물을 함유한 진단시약.
- 유효량의 보렐리아 카세트 스트링 단백질, 융합 단백질 또는 그 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한 백신 조성물.
- 제54항에 있어서, 상이한 보렐리아 카세트 스트링 단백질 또는 단편의 혼합물을 함유한 조성물.
- 제54항에 있어서, 적어도 하나 이상의 기타 B. 부르그도르페리 항원 또는 그 단편을 함유한 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 기타의 항원은 OspA, OspB, OspC, BmpA, BmpB, BmpC, BmpD 및 그 단편 혹은 변이체로 된 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제54항에 있어서, P39.5 혹은 P39.5와 상동성인 서열을 가진 적어도 하나의 기타 단백질 또는 그 단편을 함유한 조성물.
- 제54항의 조성물 유효량을 함유하는 조성물을 인간 또는 동물에게 투여하는 라임병에 대한 인간 또는 동물의 백신접종 방법.
- 진단하고자 하는 인간 또는 동물 유래의 체액 시료로써 앤티-보렐리아 카세트 스트링 단백질 항체를 배양하는 단계를 포함하고, B. 부르그도르페리의 존재하에 항원-항체 착물을 생성시킨 다음, 상기 체액을 분석하여 상기 착물의 존재를 확인하는, 인간 또는 동물에 있어서의 라임 보렐리오증의 진단방법.
- 적어도 하나 이상의 보렐리아 카세트 스트링 단백질 항체 또는 단편 항체와 적당한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한, 라임병을 가진 환자 또는 동물의 치료용의 치료 조성물.
- 제61항에 의한 조성물 유효량을 투여하는 것을 포함한 척추동물 숙주에서의 라임병 치료방법.
- 보렐리아 카세트 스트링 단백질 또는 그 단편 혹은 그에 대한 항체를 함유한, 인간 또는 동물에서의 B. 부르그도르페리에 의한 감염 진단용 키트.
- 보렐리아 카세트 스트링 단백질 또는 단편을 시험 화합물과 접촉시켜 시험 화합물을 상기 카세트 스트링 단백질 또는 단편에 결합시키고, 상기 단백질 또는 단편에 결합하는 시험 화합물의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 보렐리아 카세트 스트링 단백질 또는 그 단편에 특이적으로 결합하는 화합물의 확인방법.
- 제64항의 방법에 의해 확인된 화합물.
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