KR20190027955A - Ｏｓｐａ 키메라 및 백신에서 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라임 질환에 대항 또는 보렐리아증 백신에 사용하기 위한 키메라 OspA 분자의 개발에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 키메라 OspA 분자는 또 다른 OspA 혈청형으로부터의 원거리 부분과 함께 하나의 OspA 혈청형으로부터 인접한 부분을 포함하고 모 폴리펩타이드 둘다의 항원성 성질을 보유한다. 상기 키메라 OspA 분자는 다양한 보렐리아 동유전자종으로부터의 보호를 제공하기 위해 단독으로 또는 조합하여 전달된다.

Description

ＯＳＰＡ 키메라 및 백신에서 그의 용도{OSPA CHIMERAS AND USE THEREOF IN VACCINES}

본 발명은 일반적으로 키메라 OspA 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 이들 분자들을 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

라임(Lyme) 질환은 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토(Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.))에 의해 유발되는 진드기-매개 질환이다. 상기 질환은 전형적으로 진드기에 물린 부위에서 확장된 붉은 반점의 생성에 이어서 뇌염, 심장염 또는 관절염을 포함하는 전신 합병증이 발병할 수 있음을 특징으로 한다. 라임 질환의 거의 모든 경우는 3개의 동유전자종(genospecies), 보렐리아 아프젤리(Borrelia afzelii), 보렐리아 가리니(Borrelia garinii) 및 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토(Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.)) 중 하나에 의해 유발된다. 유럽에서 사람을 감염시키는 모든 3개의 종이 발견된다. 그러나, 북아메리카에서는 단일종, 보렐리아 부그르도르페리 센수 스트릭토만이 발견된다. 보렐리아 부르그도르페리는 스피로헤타(spirochete) 강의 보렐리아 속의 그람 음성 세균중 한 종이다. 라임 질환의 항생제 치료는 대개 효과적이지만 일부 환자는 관절 또는 신경계를 포함하는 만성 불구 형태의 질환을 발병하고 이는 비경구 항생제 치료 후에도 실질적으로 차도가 없어서 고-위험 집단에 대한 백신의 필요성을 일깨워준다.

외부 표면 단백질(Outer surface protein) A (OspA)는 참 진드기(Ixodes tick)의 중장에 존재하는 보렐리아 부르그도르페리 에스. 엘. 종에 의해 발현되는 31kDa 항원이다. OspA는 북아메리카에서 라임 질환을 예방하는데 효과적인 것으로 입증되었다(Steere et al., N. Engl. J. Med. 339: 209-15,1998; Sigal et al., N. Engl. J. Med. 339:216-22, 1998; erratum in: N. Engl. J. Med. 339:571, 1998). 완전히 프로세싱된 OspA의 아미노 말단은 시스테인 잔기이고 이는 해독후 3개의 지방-아실 쇄로 변형되고 상기 쇄는 상기 단백질을 세균 막의 외부 표면에 부착시킨다(Bouchon et al., Anal. Biochem. 246: 52-61, 1997). OspA의 지질화는 상기 분자를 안정화시키는 것으로 보고되었고(Luft, personal communication) 강한 보조제의 부재하에 보호용으로 필수적이다(Erdile et al., Infect. Immun. 61 : 81-90, 1993). 아미노-말단 지질막 앵커가 결실된 상기 단백질의 가용성 재조합 형태는 교착 마우스 모노클로날 항체의 Fab 단편과 함께 동시-결정화시켜 OspA의 구조를 결정하였고 이는 21개의 역평행 β가닥에 이어서 단일 α-헬릭스를 포함하는 것으로 밝혀졌다(Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:3584-9, 1997).

1가 OspA-계 백신 (LYMErix®)은 라임 질환을 예방하기 위해 미국에서 시판되었다. 그러나, 유럽에서는, 상기 3개의 동유전자종에 걸친 OspA 서열내 이종성은 단일 균주 기원의 OspA계 백신을 사용한 광범위한 보호를 방해한다(Gern et al., Vaccine 15:1551-7, 1997). 7개의 기본 OspA 혈청형이 유럽 분리물중에서 인지되었다 (혈청형 1 내지 7로 지정됨, Wilske et al., J. Clin. Microbiol. 31:340-50, 1993). OspA 혈청형은 종과 관련이 있고; 혈청형 1은 비. 부르그도르페리 에스.에스.에 상응하고, 혈청형 2는 비. 아프젤리에 상응하고, 혈청형 3 내지 7은 비. 가리니에 상응한다.

OspA를 사용한 면역화를 통해 획득된 보호 면역은, 숙주 면역 반응과 병원체간의 상호작용이 숙주에서 발생하지 않고 진드기 매개체의 중장에서 발생하기 때문에 일반적이지 않다. 라임 질환의 경우에, 진드기는 라임 질환을 동물로부터 사람으로 전염시키기 위한 매개체 또는 보균체로서 작용한다. 사료 공급 동안에 감염된 진드기에 의해 획득된 OspA 특이적 항체는 비. 부르그도르페리 에스. 엘.의 면역화된 포유동물 숙주로의 전염을 예방한다(de Silva et al., J. Exp. Med. 183: 271-5, 1996). 보호는 항체-매개되고 주로 살균성 항체를 통해 영향을 받지만 진드기 장 상피를 따라 존재하는 수용체로 스피로헤타의 접착을 차단하는 항체가 또한 효과적일 수 있다(Pal et al., J. Immunol. 166: 7398-403, 2001).

효과적인 OspA 백신의 이상적인 개발은 보호용 모노클로날 항체 LA-2에 의해 한정되는 것들과 같은 보호용 에피토프의 동정을 필요로 한다(Golde et al., Infect. Immun. 65: 882-9, 1997). X-선 결정학 및 NMR 분석을 사용하여 OspA내 면역학적으로 중요한 초가변 도메인을 동정하였고 LA-2 에피토프가 아미노산 203-257번임을 맵핑하였다(Ding et al., J. Mol. Biol. 302: 1 153-64, 2000; Luft et al. J Infect Dis. 185 (Suppl.1): S46-51, 2002).

당업계에서는 미국, 유럽 및 그외 지역에 존재하는 다양한 종의 보렐리아에 대해 광범위한 보호를 제공할 수 있는 OspA 백신의 개발이 요구된다. 하기의 기재 내용은 상기 백신에 대한 특정 세부 사항을 기술한다.

본 발명은 라임 질환 또는 라임 보렐리아증의 예방 및 치료와 관련하여 당업계에서의 하나 이상의 요구 사항들을 충족시킨다.

본 발명은 서열번호: 1, 3, 및 5에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 서열번호: 1, 3, 및 5에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 분리된 핵산 분자를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 1, 서열번호: 3, 또는 서열번호: 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자와 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) (a)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) (a)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 심지어 추가의 측면에서, 본 발명은, (a) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 1 내지 25개의 보존성 아미노산 치환체를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 1 내지 25개의 보존성 아미노산 삽입체를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 1 내지 25개의 보존성 아미노산의 내부 결실을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 1 내지 25개의 아미노산이 C- 및/또는 N-말단 절단된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (e) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, C-말단 절단, 또는 N-말단 절단으로부터 선택된 1 내지 25개의 아미노산 변형을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.

본 발명은, 서열번호: 7, 9, 및 11에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 서열번호: 7, 9, 및 11에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 분리된 핵산 분자를 포함한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 7, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 11에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자와 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) (a)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) (a)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 심지어 추가의 측면에서, 본 발명은, (a) 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 1 내지 25개의 보존성 아미노산 치환체를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 1 내지 25개의 보존성 아미노산 삽입체를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 1 내지 25개의 보존성 아미노산의 내부 결실을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 1 내지 25개의 아미노산이 C- 및/또는 N-말단 절단된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (e) 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, C-말단 절단, 또는 N-말단 절단으로부터 선택된 1 내지 25개의 아미노산 변형을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.

본 발명은 벡터, 숙주 세포, 및 본원에서 논의된 숙주 세포를 배양함에 의해 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자중 어느 하나를 포함하는 벡터를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다른 측면에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포이다. 다양한 측면에서, 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 폴리펩타이드를 발현하기에 적합한 조건하에서 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하고 임의로 상기 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 분리함을 포함한다. 다양한 측면에서, 본 발명은 이들 키메라 핵산 분자 중 어느 하나 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 임의의 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 담체들을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 본원에서 논의된 핵산 분자 중 어느 하나 또는 본원에서 논의된 벡터중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 본원에서 논의된 2개 이상의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 이때, 상기 핵산 분자는 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 특정 측면에서, 본 발명은 서열번호: 1, 3, 및 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 서열번호: 2, 4, 및 6에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 서열번호: 2, 4, 및 6에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 분리된 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 이상의 서열 동일성을 갖는, 200개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 서열번호: 8, 10 및 12에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함한다. 심지어 추가의 측면에서, 본 발명은 서열번호: 8, 10 및 12에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 분리된 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 이상의 서열 동일성을 갖는, 200개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명은 본원에서 논의된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 본원에서 논의된 2개 이상의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를포함하는 조성물을 포함하고, 이때 상기 폴리펩타이드는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 측면에서, 본 발명은 서열번호: 2, 4, 및 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 면역원성 조성물을 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본원에서 논의된 임의의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 면역원성 조성물은 외부 표면 단백질 A(OspA) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도하는 성질을 갖는다. 특정 측면에서, 상기 면역원성 조성물은 보렐리아에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도하는 성질을 갖는다. 특정 측면에서, 상기 면역원성 조성물은 보렐리아를 중화시키는 항체의 생성을 유도하는 성질을 갖는다. 특정 측면에서, 상기 보렐리아는 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토이다. 특정 측면에서, 상기 보렐리아는 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니 또는 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토이다. 추가의 측면에서, 상기 보렐리아는 보렐리아 자포니카(Borrelia japonica), 보렐리아 안데르소니(Borrelia andersonii), 보렐리아 비세티(Borrelia bissettii), 보렐리아 시니카(Borrelia sinica), 보렐리아 투르디(Borrelia turdi), 보렐리아 타누키(Borrelia tanukii), 보렐리아 발라이시아나(Borrelia valaisiana), 보렐리아 루시타니애(Borrelia lusitaniae), 보렐리아 스피엘마니(Borrelia spielmanii), 보렐리아 미야모토이(Borrelia miyamotoi) 또는 보렐리아 로네스타(Borrelia lonestar)이다. 몇몇 측면에서, 상기 항체는 동물에 의해 제조된다. 추가의 측면에서, 상기 동물은 포유동물이다. 심지어 추가의 측면에서, 상기 포유동물은 사람이다.

본 발명은 추가로 백신 조성물을 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명의 백신 조성물은 본원에서 논의된 임의의 면역원성 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다양한 측면에서, 본 발명은 조합 백신을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 조합 백신은 하나 이상의 제2 백신 조성물과 조합된 본원에서 논의된 임의의 백신 조성물을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 제2 백신 조성물은 진드기-매개 질환에 대해 보호한다. 다양한 측면에서, 상기 진드기-매개 질환은 록키산홍반열(Rocky Mountain Spotted Fever), 바베시아증(Babesiosis), 회귀열(Relapsing Fever), 콜로라도 진드기 열(Colorado tick fever), 사람 단핵구 엘리히증(Human monocytic ehrlichiosis) (HME), 사람 과립구 엘리히증(Human granulocytic ehrlichiosis) (HGE), 남부 진드기-관련 발진병(Southern Tick-Associated Rash Illness) (STARI), 툴라레미아(Tularemia), 진드기 마비(Tick paralysis), 포와산 뇌염(Powassan encephalitis), Q 열, 크리민-콩고 출혈열, 시타욱스주노시스(Cytauxzoonosis), 부톤네즈열(boutonneuse fever), 또는 진드기-매개 뇌염이다. 다른 측면에서, 상기 제2 백신 조성물은 진드기-매개 뇌염 백신, 일본 뇌염 백신 및 록키산홍반열 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 백신이다. 다양한 측면에서, 상기 제2 백신 조성물은 보렐리아 감염 또는 라임 질환에 대한 면역화에 양립가능한 계절적 면역화 스케줄을 갖는다.

본 발명은 피검체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 방법은 본원에서 논의된 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을, 면역학적 반응을 유도하기 위한 유효량으로 상기 피검체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 면역학적 반응은 항-OspA 항체의 생성을 포함한다. 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩타이드 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다.

본 발명은 피검체에서 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 방법은 본원에서 논의된 임의의 백신 조성물 또는 본원에서 논의된 임의의 조합 백신을, 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하거나 치료하기 위한 유효량으로 상기 피검체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 본원에서 논의된 항체 중 어느 하나의 항체를 상기 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하거나 치료하기 위한 유효량으로 상기 피검체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 방법은 청구항 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항의 백신 조성물로 포유동물을 면역화시킴에 의해 생성된 항체 또는 이의 단편을, 상기 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하거나 치료하기 위한 유효량으로 상기 피검체에게 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 과면역 혈청, 과면역 혈장 또는 이의 정제된 면역글로불린 분획물이다.

본 발명은 피검체에서 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 수동으로 예방하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에서 논의된 백신 조성물 중 어느 하나의 조성물로 포유동물을 면역화시킴에 의해 생성된 항-OspA 항체 또는 이의 단편을, 상기 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하기 위한 유효량으로 상기 피검체에게 투여함을 단계를 포함하고, 이때, 상기 항체 또는 이이 단편은 정제된 면역글로불린 제제 또는 면역글로불린 단편 제제이다.

본 발명은 피검체에서 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에서 논의된 백신 조성물 중 어느 하나의 조성물로 피검체를 면역화시킨 후 생성된 항-OspA 모노클로날 항체 또는 이이 단편을, 상기 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하기 위한 유효량으로 상기 피검체에게 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 사람화한다. 특정 측면에서, 상기 모노클로날 항체는 F237/BK2이다.

본 발명은 약물을 제조하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 포함한다. 다른 관련된 측면이 또한 본 발명에 제공된다.

이전에 기재된 개요는 본 발명의 모든 측면을 한정하는 것으로 의도되지 않고 추가의 측면은 하기에 상세히 기재되는 바와 같이 다른 섹션에서 기재된다. 상기 전체 문헌은 통합 기재로서 관련되는 것으로 의도되고, 특징의 조합이 동일한 문장 또는 문단 또는 본원의 섹션에서 함께 발견되지 않는다 하더라도 본원에 기재된 모든 특징의 조합이 고려되는 것으로 이해되어야만 한다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기에 상세히 기재된 내용으로부터 자명할 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범위내에서 다양한 변화 및 변형이 상세한 기재로부터 당업자에게 자명할 것이기 때문에 상세한 기재 및 특정 예가 본 발명의 특정 양태를 지적하는 단지 예시로서 주어진 것으로 이해되어야만 한다.

도 1은 지질화된 OspA 키메라 작제물의 제조에 대한 도식적 개요이다.
도 2는 lipB sOspA 1/2²⁵¹ (서열번호: 2)의 아미노산 서열이다.
도 3은 lipB sOspA 1/2²⁵¹의 뉴클레오타이드(서열번호: 1) 및 추정 아미노산 서열(서열번호: 2)을 나타낸다.
도 4는 lipB sOspA 6/4 (서열번호: 4)의 아미노산 서열이다.
도 5는 lipB sOspA 6/4의 뉴클레오타이드(서열번호: 3) 및 추정 아미노산 서열(서열번호: 4)을 나타낸다.
도 6은 lipB sOspA 5/3 (서열번호: 6)의 아미노산 서열이다.
도 7은 lipB sOspA 5/3의 뉴클레오타이드(서열번호: 5) 및 추정 아미노산 서열(서열번호: 6)을 나타낸다.
도 8은 고수준 발현용 코돈 용법의 최적화를 도시한다.
도 9는 지질화된 작제물과 비-지질화된 작제물간의 서열 차이를 나타낸다.
도 10은 T7 발현 시스템의 기재이다.
도 11은 유도된 배양물 및 비-유도된 배양물 기원의 신규 재조합 OspA 단백질의 발현을 보여주는 SDS-PAGE이다.
도 12는 플라스미드 pUC18의 맵이다.
도 13은 플라스미드 pET30a의 맵이다.
도 14는 lipB sOspA 5/3 Kpn I-Bam HI 단편의 제조를 위한 전략을 도시한다.
도 15는 lipB sOspA 1/2²⁵¹에서 아미노산 변화(서열번호: 39)를 강조하는 정렬 및 상기 변화를 도입하기 위해 사용되는 PCR 프라이머 서열 (서열번호: 21 및 41)이다(lipB OspA 1/2 mod (서열번호: 38); 컨센서스 서열(서열번호: 40)).
도 16은 Blip OspA BPBP/A1의 OspA 서열과 변형된 분자 lipB sOspA 1/2²⁵¹의 정렬이다. 상부 가닥은 본래의 서열(서열번호: 42)이고 하부 가닥은 최적화된 서열(서열번호: 43)이다. 주지: 서열의 개시점에서 3개의 염기(CAT)는 나타내지 않는다; 이들은 Nde I 부위 CATATG의 일부를 형성한다.
도 17은 Blip OspA KT의 OspA 서열과 변형된 분자 lipB sOspA 6/4의 정렬이다. 상부 가닥은 본래의 서열(서열번호: 44)이고 하부 가닥은 최적화된 서열 (서열번호: 45)이다. 주지: 서열의 개시점에서 단일 염기(C)는 나타내지 않는다; 이들은 Nde I 부위 CATATG의 일부를 형성한다.
도 18은 Blip OspA 5/3의 OspA 서열과 변형된 분자 lipB sOspA 5/3의 정렬이다. 상부 가닥은 본래의 서열(서열번호: 46)이고 하부 가닥은 최적화된 서열(서열번호: 47)이다.
도 19는 비. 부르그도르페리 에스.에스. B31 균주를 투여하기 전에 3ng의 OspA 1/2로 면역화된 보호되고 감염된 동물중에 항체 표면 결합 및 성장 억제 분석에서 기능적 항-OspA 반응의 분포를 보여준다. 맨-휘트니(Mann-Whitney) p 값은 보호되고 감염된 동물간에 기능적 항체 함량에서의 고도의 유의적인 차이를 입증하였다.
도 20은 참 진드기를 투여하기 전에 3ng의 OspA 1/2로 면역화된 보호되고 감염된 동물중에 항체 표면 결합 및 성장 억제 분석에서의 기능적 항-OspA 반응의 분포를 보여준다. 맨-휘트니 p 값은 보호되고 감염된 동물간의 기능적 항체 함량에서의 고도의 유의적인 차이를 입증하였다.
도 21은 3-성분 키메라 OspA 백신으로 3회 투여로 면역화한 후 풀링된 마우스 혈청에서 표면 결합(평균 형광 강도(MFI)) 및 성장 억제(GI-50 역가)를 보여준다. 효율적인 표면 결합 및 성장 억제는 백신(1형 내지 6형)에서 OspA 유형과 상동성인 OspA 유형을 발현하는 모든 6개의 보렐리아 균주에 대해 검출된다.
도 22는 표면 결합 분석(SBA)에서 rOspA 백신의 조합으로 면역화된 개별 마우스 기원의 42일째 혈청을 사용하여 수득된 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다. 결과는 모든 3개의 rOspA 성분(1/2, 6/4, 및 5/3)이 C3H 마우스에서 모든 6개의 균주에 대해 표면 결합 IgG 항체의 고역가를 유도하기 위해 다가 백신에서 요구됨을 보여주었다. 2-성분 백신은 2개의 결실 균주를 완전히 채우지 못한다.
도 23은 rOspA 백신의 조합으로 면역화된 개별 마우스(10마리의 그룹에서) 기원의 42일째 혈청을 사용한 보렐리아의 성장 억제를 보여준다. 다가 백신(모든 3개의 균주를 포함하는 백신)만이 동물 90% 초과(>90%)(n = 10)에서 50% 초과(>50%)의 성장 억제를 나타내었다. 검은 막대(굵은 막대)는 사용되는 백신과 상동성인 균주를 지적한다.
도 24는 OspA의 내부형 변이체를 발현하는 보렐리아의 범위를 보여준다. 표면 결합은 강하거나(형광성이 10-배 초과(>10-fold)로 증가됨) 약한(형광성이 2 내지 10-배 증가)것으로 분류되었다.

본 발명은 라임 질환 또는 보렐리아 감염에 대한 면역원성 조성물 또는 백신 조성물로서 전달될 수 있는 항원으로서 유용한 키메라 OspA 분자를 제공한다. 본 발명의 임의의 양태를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 이의 응용에 있어서 하기에 기재되거나 도면 및 실시예에서 설명된 성분들의 작제 및 배열에 대한 세부 사항으로 제한되는 것이 아님을 이해해야만 한다. 본원에 사용되는 섹션 표제는 단지 구성적 목적을 위한 것이지 기재된 발명의 요지를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 본원에 인용된 모든 문헌은 본원에서 명백히 참조로서 인용된다.

본 발명은 다른 양태를 포함하고 다양한 방식으로 실행되거나 수행된다. 또한, 본원에 사용되는 문장 및 용어는 기재를 목적으로 하는 것으로 이해되어야만 하고 제한하는 것으로 간주되지 말아야 한다. 용어 "함유하는", "포함하는" 또는 "갖는" 및 이의 변형 어구는 이후 열거된 항목들 및 이의 등가물, 및 추가의 항목들을 포괄하는 것으로 의미된다.

본 발명의 양태는 3개의 명백히 구분된 지질화된 OspA 분자를 암호화하는 3개의 키메라 OspA 암호화 서열의 디자인 및 합성에서 예시되고 이의 모두는 일부 공통된 특징을 공유한다. 각각의 키메라 암호화 서열은 2개의 OspA 혈청형을 나타내고 키메라 암호화 서열은 안전하고 고도로 면역원성이며 비. 부르그도르페리 센수 라토(에스.엘.)의 감염으로부터 피검체를 보호하는 안정한 키메라 OspA 분자를 암호화하도록 디자인되었다.

하나의 측면에서, 상기 키메라 OspA 분자는 또 다른 OspA 혈청형 기원의 원거리 부분과 함께 하나의 OspA 혈청형으로부터의 인접 부분을 포함하고 상기 모 폴리펩타이드 둘다의 보호 성질을 보유한다. 상기 키메라 OspA 핵산 분자는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)(이. 콜리(E. coli))에 발현되어, 유럽에서 라임 질환 또는 보렐리아 감염과 관련된 모든 6개의 주요 혈청형(혈청형 1 -6) 및 북 아메리카에서 라임 질환 또는 보렐리아 감염과 관련된 단일 OspA 혈청형에 대한 보호를 제공하는 조합 백신으로서 제형화될 수 있는 항원을 제공한다. 혈청형 1 내지 6을 포함하는 백신은 비. 아프젤리, 비. 가리니 및 비. 부르그도르페리에 대한 보호를 제공하기 때문에, 상기 백신은 범용으로 디자인된다.

본 발명은 또한 지질화된 OspA 분자를 제조하기 위해 필요한 리더 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제거함에 의해, 하나의 측면에서 제1 세트의 3개의 유전자로부터 유래된 제2 세트의 키메라 OspA 암호화 서열의 제조를 포함한다. 2개 세트의 작제물(지질화되고 비-지질화된 폴리펩타이드를 생성시킴)은 발효기에서 이들 제조의 용이함(바이오매쓰, 안정성, 생성물 수율 등)을 평가하고 상이한 유형의 항원이 어떻게 용이하게 정제될 수 있는지를 평가하며 이들의 생물학적 특성(안전성 프로필 및 보호 효능)을 비교하기 위해 요구된다.

본 발명은 본 발명의 키메라 OspA 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 OspA 분자를 포함하는 백신 및 백신 키트, 면역원성 조성물 및 백신을 제조하기 위한 방법 및 사람 및 수의 의학적 치료 및 예방에서 상기 면역원성 조성물 및 백신의 용도를 포함한다. 본 발명은 추가로 본원에 기재된 OspA 조성물을 사용하여 라임 질환 또는 보렐리아 감염에 대해 면역화시키는 방법 및 라임 질환 또는 보렐리아 감염의 예방을 위한 의약의 제조에서 OspA 조성물의 용도를 포함한다.

정의

달리 상세히 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 통상적으로 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기의 문헌은 당업자에게 본 발명에 사용되는 많은 용어들의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale 및 Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

하기의 약어가 전반적으로 사용된다.

AA 아미노산

Amp 암피실린

bp 염기쌍

비. 아프젤리 보렐리아 아프젤리

비. 부르도르페리 보렐리아 부르그도르페리

비. 가리니 보렐리아 가리니

DNA 데옥시리보핵산

dNTP 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트

이. 콜리 에스케리치아 콜리

GC 함량 염기 구아닌 및 시토신을 함유하는 서 열의 퍼센트

hLFA-1 사람 백혈구 기능 관련 항원-1

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피

IP 지적 재산권

IPTG 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노 사이드

Kan 가나마이신

kDa 킬로돌턴

LB 루리아 브로쓰

Lip B 외부 표면 단백질 B 기원의 리더 서열

Mab 모노클로날 항체

OD 광학 밀도

OspA 외부 표면 단백질 A

OspB 외부 표면 단백질 B

PCR 폴리머라제 연쇄 반응

RNA 리보핵산

s.l. 센수 라토

s.s. 센수 스트릭토

SDS 나트륨 도데실 설페이트

SMK 이. 콜리에 대한 성장 배지(케토글루 타레이트 소르비톨 배지)

tRNA 운반 리보핵산

WCB 작동 세포 뱅크

본원 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같은 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 명백히 명시되지 않는 경우 복수 형태에 대한 언급을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 하기의 용어들은 달리 특정되지 않는 경우 이들 고유의 의미를 갖는다.

용어 "유전자"는 하나 이상의 폴리펩타이드, 단백질 또는 효소 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산의 서열을 암호화하는 DNA 서열을 언급하고, 예를 들어, 유전자가 발현되는 조건에 영향을 미치는, 인트론, 및 조절 DNA 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열, 5'-비해독된 영역 또는 3'-비해독된 영역을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본원에서, 상기 OspA 유전자는 세균성이고 따라서 인트론이 없다. 상기 용어 "암호화 서열"은 아미노산 서열을 암호화하지만 인트론 또는 조절 서열을 함유하지 않는 DNA 서열을 언급한다. 또한, 본원에서 OspA 암호화 서열은 조절 서열을 함유하지 않는다.

"핵산" 또는 "핵산 서열" 또는 "핵산 분자"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 언급한다. 상기 용어는 표준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 표준 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 합성되고, 천연적으로 존재하고 비-천연적으로 존재하는, 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 상기 유사체의 예는 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산 (PNAs)을 포함한다. 상기 용어는 제한 없이 4-아세틸시토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데닌, 아지리디닐-시토신, 슈도이소시토신, 5-(카복시하이드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카복시-메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소-펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카보닐-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린과 같은, DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체로부터 형성된 분자를 포함한다.

달리 특정되지 않는 경우, 특정 핵산 서열은 명백히 지적된 서열 뿐만 아니라, 보존적으로 변형된 이의 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열을 또한 명백히 포함한다. 구체적으로, 몇몇 측면에서 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴에 의해 성취된다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 상기 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 상호교환적으로 사용된다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 언급한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연의 아미노산의 인공 화학적 모사체인 아미노산 중합체, 및 천연 아미노산 중합체 및 비-천연 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어 "단백질"은 전형적으로 대형 폴리펩타이드를 언급한다. 상기 용어 "펩타이드"는 전형적으로 짧은 폴리펩타이드를 언급한다. 합성 폴리펩타이드는 예를 들어, 자동화된 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.

상기 용어 "Osp A 분자" 또는 "키메라 OspA 분자"는 하나의 측면에서, 서열번호: 1 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 3 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 5 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 7 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 9 (sOspA 6/4), 서열번호: 11 (sOspA 5/3), 서열번호: 168 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 170 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 172 (orig sOspA 5/3)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 "OspA 핵산"을 언급하거나, 또 다른 측면에서, 서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 8 (sOspA 1 /2²⁵¹), 서열번호: 10 (sOspA 6/4), 서열번호: 12 (sOspA 5/3), 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열을 포함하는 "OspA 폴리펩타이드"를 언급한다.

상기 용어 "lipB sOspA 분자"는 하나의 측면에서, 서열번호: 1 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 3 (lipB sOspA 6/4), 또는 서열번호: 5 (lipB sOspA 5/3)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 "OspA 핵산"을 언급하거나, 또 다른 측면에서, 서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 또는 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3)의 아미노산 서열을 포함하는 "OspA 폴리펩타이드"를 언급한다. 서열번호: 7, 9, 및 11의 핵산 서열은 lipB 리더 서열 (MRLLIGFALALALIG (서열번호: 13)을 암호화하는 핵산 서열이 없다. 추가로, 서열번호: 7, 9, 및 11의 핵산 서열은 서열번호: 2, 4, 및 6에서 lipB 리더 서열의 카복시 말단에 존재하는 시스테인 잔기 대신에 서열번호: 8, 10, 및 12의 아미노 말단에서 메티오닌 잔기를 암호화한다.

상기 용어 "orig sOspA 분자" 또는 "본래의 sOspA 분자"는 하나의 측면에서, 서열번호: 168 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 170 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 172 (orig sOspA 5/3)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 "OspA 핵산"을 언급하거나, 다른 측면에서, 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열을 포함하는 "OspA 폴리펩타이드"를 언급한다. 이들 "본래의" 분자는 돌연변이 및 코돈 최적화가 없는 키메라 작제물이다.

본 발명은 "지질화된 OspA" 및 비-지질화된 OspA" 키메라 분자를 포함한다. 다양한 측면에서, 지질화는 OspA에 대해 보조 성질을 부여한다. 본 발명의 몇몇 측면에서, 상기 지질화된 OspA 분자는 OspB 리더 서열을 포함한다. 본 발명의 몇몇 측면에서, 상기 OspB 리더 서열은 아미노산 MRLLIGFALALALIG (서열번호: 13)을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 OspB 리더 서열은 다른 아미노산을 포함한다.

당업계에 공지된 바와 같은 상기 용어 "동일한" 또는 퍼센트(percent) "동일성"은 서열의 비교 측정시 2개 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열간에 관계를 언급한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 핵산 분자 또는 폴리펩타이드간의 서열 관련성 정도를 의미하고, 이 경우는 2개 이상의 뉴클레오타이드 또는 2개 이상의 아미노산 서열의 쇄간에 일치성에 의해 측정될 수 있다. "동일성"은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리듬")에 의해(임의의 경우에) 해결되는 갭 정렬과 함께 보다 작은 2개 이상의 서열간에 동일한 일치성의 퍼센트를 측정한다. "실질적인 동일성"은 특정된 서열에 걸쳐 적어도 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 언급한다. 몇몇 양태에서, 상기 동일성은 길이가 적어도 약 50-100개 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역에 걸쳐 존재한다. 다른 측면에서, 상기 동일성은 길이가 적어도 약 100-200개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역에 걸쳐 존재한다. 다른 측면에서, 상기 동일성은 길이가 적어도 약 200-500개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역에 걸쳐 존재한다. 특정 측면에서, 퍼센트 서열 동일성은 GAP, BLASTP, BLASTN, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit 및 스미쓰-워터맨 알고리듬(Smith-Waterman algorithm)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정된다.

또한, 본원에 기재된 임의의 수치는 구체적으로 하한치에서 상한치까지의 모든 값을 포함하는 것으로 이해되고, 즉, 열거된 최저 값과 최고 값 사이의 모든 가능한 조합의 수치는 본원에서 명백히 진술되는 것으로 고려되어야만 한다. 예를 들어, 농도 범위가 약 1% 내지 50%로 기재된 경우, 2% 내지 40%, 10% 내지 30% 또는 1% 내지 3%등과 같은 값이 명백히 본 명세서에 기재된 것으로 의도된다. 상기 열거된 값은 구체적으로 의도된 것의 예에 불과하다.

다양한 측면에서 범위는 본원에서 "약" 또는 "대략적으로"의 하나의 특정 값 및/또는 "약" 또는 "대략적으로"의 또 다른 특정 값으로 나타낸다. 앞에 "약"을 사용하여 값을 대략적으로 나타낸 경우, 이것은 일부 변화량이 상기 범위에 포함되는 것으로 이해된다.

상기 용어 "유사성"은 상대적 개념이지만 "동일성"과는 대조적으로, 동일한 일치성 및 보존성 치환 일치성 둘다를 포함하는 유사성에 대한 척도를 언급한다. 2개의 폴리펩타이드 서열이 예를 들어, 10/20의 동일한 아미노산을 갖고 나머지가 모두 비-보존성 치환인 경우, 퍼센트 동일성 및 유사성은 둘다 50%일 것이다. 동일한 예에서, 보존성 치환이 5개 이상의 위치에서 있는 경우, 퍼센트 동일성은 50%이지만 퍼센트 유사성은 75%(15/20)이다. 따라서, 보존성 치환이 있는 경우, 2개의 폴리펩타이드간에 퍼센트 유사성 정도는 상기 2개의 폴리펩타이드간에 퍼센트 동일성보다 높을 것이다.

상기 용어 "분리된 핵산 분자"는 (1) 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 전체 DNA가 공급원 세포로부터 분리된 경우 천연적으로 발견되는 다른 물질로부터 임의의 정도로 분리되거나, (2) "분리된 핵산 분자"가 천연적으로 연결된 폴리펩타이드의 전부 또는 일부에 연결되어 있지 않거나, (3) 천연적으로 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결되어 있거나, (4) 대형 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부로서 천연적으로 존재하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 언급한다. 본원에서 사용된 바와 같은 실질적으로 부재라 함은, 핵산 분자가 어떠한 다른 오염 핵산 분자(들) 또는 폴리펩타이드 제조에서의 이의 용도 또는 이의 치료학적, 진단학적, 예방적 또는 연구 용도를 방해할, 이의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물이 없음을 지적한다.

상기 용어 "분리된 폴리펩타이드"는 (1) 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 공급원 세포로부터 분리되는 경우 천연적으로 발견되는 다른 물질로부터 임의의 정도로 분리되거나, (2) "분리된 폴리펩타이드"가 천연적으로 연결되어 있는 폴리펩타이드 전부 또는 일부에 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 연결되어 있지 않거나, (3) 천연적으로 연결되어 있지 않은 폴리펩타이드에 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동적으로 연결되어 있거나, (4) 천연적으로 존재하지 않는, 본 발명의 폴리펩타이드를 언급한다. 하나의 측면에서, 분리된 폴리펩타이드는 임의의 다른 오염 폴리펩타이드, 또는 치료학적, 진단학적, 예방적 또는 연구 용도를 방해하는 천연 환경에 존재하는 다른 오염물이 실질적으로 없다.

본원에 사용된 바와 같은, 폴리펩타이드의 "단편"은 전장(full-length)의 폴리펩타이드 또는 단백질 발현 생성물보다 작은 임의의 폴리펩타이드 부분을 언급한다. 단편은 전형적으로 하나 이상의 아미노산 잔기가 전장의 폴리펩타이드의 아미노 말단 및/또는 카복시 말단으로부터 제거된 전장 폴리펩타이드의 결실 유사체이다. 따라서, "단편"은 하기된 결실 유사체들의 서브세트이다.

본원에 사용된 바와 같은 "유사체"는 실질적으로 구조가 유사하고 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 언급하지만 특정 경우에 상이한 정도의 천연 분자를 언급한다. 유사체는 (i) 폴리펩타이드(상기된 바와 같은 단편을 포함하는)의 하나 이상의 말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실 및/또는 천연 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 내부 영역의 결실, (ii) 폴리펩타이드의 하나 이상의 말단에서 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 부가(전형적으로 "부가" 유사체) 및/또는 천연 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 내부 영역의 삽입 또는 부가(전형적으로, "삽입" 유사체) 또는 (iii) 천연 폴리펩타이드 서열에서 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 기초로 하여, 유사체가 유래된 천연 폴리펩타이드와 비교하여 이들의 아미노산 서열의 조성이 상이하다. 치환은 치환된 아미노산과 이것을 대체하는 아미노산의 물리-화학적 또는 기능성 관련 정도를 기준으로 보존성이거나 비-보존성이다.

"보존적으로 변형된 유사체"는 아미노산 서열 및 핵산 서열 둘다에 적용한다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 핵산은 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우 필수적으로 동일한 서열을 언급한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 소정의 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 변경시키는 것 없이 기재된 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 상기 핵산 변이는, 보존적으로 변형된 유사체의 한 종류인 "사일런트(silent) 변이"이다. 본원에서 폴리펩타이드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 사일런트 변이를 기재한다. 당업자는 핵산내 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대해 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대해 유일한 코돈인 TGG를 제외하고는)은 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 각각의 사일런트 변이는 각 기재된 서열에 명백하다.

아미노산 서열에 관하여, 당업자는 암호화된 서열내 단일 아미노산 또는 작은 퍼센트의 아미노산을 변형, 부가 또는 결실시키는, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열로의 개별 치환, 삽입, 결실, 부가 또는 절단이, 상기 변화가 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되도록 하는 경우 "보존적으로 변형된 유사체"임을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 보존적으로 변형된 변이체는 또한 발명의 다형태 변이체, 종간 동족체 및 대립형질체일 뿐만 아니라 이를 배제하지 않는다.

하기의 8개 그룹에서 각각은 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌 (A), 글라이신 (G);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);

6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);

7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및

8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, Creighton, Proteins (1984) 참조).

본원에 사용된 바와 같은 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 변형을 포함하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 이의 유사체를 언급하지만 단, 상기 변이체는 천연 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유한다.

본원에 사용된 바와 같은, "대립형질 변이체"는 동일한 유전자좌를 차지하는 임의의 2개 이상의 다형태의 유전자를 언급한다. 대립형질 변이는 천연적으로 돌연변이를 통해 발생하고 몇몇 측면에서 집단내 표현형 다형태를 유발한다. 특정 측면에서, 유전자 돌연변이는 사일런트이거나(암호화된 폴리펩타이드내 변화가 없음) 다른 측면에서는 변화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. "대립형질 변이체"는 또한 이들에 의해 암호화된 단백질 뿐만 아니라 유전자 대립형질 변이체의 mRNA 전사체로부터 유래된 cDNA를 언급한다.

상기 용어 "유도체"는 치료학적 또는 진단학적 제제로의 접합, 표지화(예를 들어, 방사선핵종 또는 다양한 효소를 사용한), 페길화와 같은 공유 중합체 부착(폴리에틸렌 글리콜을 사용한 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환에 의해 공유적으로 변형된 폴리펩타이드를 언급한다. 몇몇 측면에서, 유도체는 통상적으로 분자의 일부가 아닌 추가의 화학적 잔기를 포함하도록 변형된 것이다. 다양한 측면에서, 상기 잔기는 분자의 용해도, 흡광도 및/또는 생물학적 반감기를 조절한다. 상기 잔기는 다양한 다른 측면에서, 대안적으로 분자의 독성을 감소시키고 분자의 임의의 바람직하지 않은 역효과 등을 제거하거나 약화시킨다. 상기 효과를 매개할 수 있는 잔기는 Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)에 기재되어 있다. 상기 잔기를 분자에 커플링시키는 과정은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 몇몇 측면에서, OspA 유도체는 생체내에서 단백질에 보다 긴 반감기를 부여하는 화학적 변형을 갖는 OspA 분자이다. 하나의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 수용성 중합체의 부가에 의해 변형된다. 관련 양태에서, 폴리펩타이드는 당화, 페길화 및/또는 폴리시알릴화에 의해 변형된다.

예를 들어, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용되는 경우 용어 "재조합"은 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변화에 의해 변형된 것을 지적하거나 상기 세포가 상기 변형된 세포로부터 유래된 것임을 지적한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 천연 (비-재조합) 형태의 세포내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또한 비정상적으로 발현되거나, 하향 발현되거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.

본원에 사용된 바와 같이, "선별가능한 마커"는 이것이 세포 또는 기관에서 발현되는 즉시 동정가능한 표현형 변화, 예를 들어, 약물, 항생제 또는 기타 제제에 대한 내성을 부여하여 마커의 발현 또는 활성이 이를 위해 선별되거나(예를 들어, 제한 없이 양성 마커, 예를 들어, neo 유전자) 또는 이에 대항하여 선별되도록(예를 들어, 제한없이 음성 마커, 예를 들어, 디프테리아 유전자) 하는 효소 또는 기타 단백질을 암호화하는 유전자를 언급한다. "이종성 선별가능한 마커"는 통상적으로 발견되지 않는 동물의 게놈으로 삽입된 선별가능한 마커 유전자를 언급한다.

선별가능한 마커의 예는 네오마이신(neo)과 같은 항생제 내성 유전자, 푸로마이신(Puro), 디프테리아 독소, 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 크산틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 티미딘 키나제, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 하이포크산틴 포스폰보실트랜스퍼라제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 당업계에 공지된 임의의 선별가능한 마커가 본원에 기재된 방법에 유용한 것으로 이해할 것이다.

핵산 부분과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "이종성"은 상기 핵산이 천연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 서브서열을 포함함을 지적한다. 예를 들어, 상기 핵산은 전형적으로 재조합적으로 제조되고, 새로운 기능성 핵산이 되도록 배열된 비관련된 유전자 기원의 2개 이상의 서열, 예를 들어, 하나의 공급원 기원의 프로모터 및 다른 공급원 기원의 암호화 영역을 갖는다. 유사하게, 이종성 단백질은 상기 단백질이 천연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 서브서열을 포함(예를 들어, 융합 단백질)함을 지적한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "동족성"은 슈퍼패밀리(예를 들어, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 기원의 단백질 및 상이한 종 기원의 상동성 단백질(예를 들어, 미오신 경쇄 등)을 포함하는 "공통된 진화적 기원"을 소유하는 단백질간의 관계를 언급한다(Reeck et al., Cell 50:667, 1987). 상기 단백질 (및 이들의 암호화 유전자)는 퍼센트 유사성 또는 보존된 위치에서 특정 잔기 또는 모티프의 존재와 상관없이 이들의 서열 유사성에 의해 반영되는 바와 같은 서열 상동성을 갖는다.

비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어 제한 없이, Smith et al., Adv. Appl. Math. 2:482, 1981의 국소적 상동성 알고리듬에 의해; Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443, 1970의 상동성 정렬 알고리듬에 의해; Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988의 유사성 방법에 대한 연구에 의해; 이들 알고리듬의 컴퓨터화된 실행(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA ( Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl))에 의해 또는 육안 조사 (일반적으로, Ausubel et al., supra 참조)에 의해 수행된다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리듬의 또 다른 예는 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990에 기재된 BLAST 알고리듬이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 기관[National Center for Biotechnology Information]을 통해 대중에게 가용하다. 퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것뿐만 아니라 상기 BLAST 알고리듬은 또한 2개의 서열간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993 참조).

상기 용어 "벡터"는 암호화 정보를 숙주 세포에게 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자(예를 들어, 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 언급하기 위해 사용된다.

*"클로닝 벡터"는 외래 DNA 단편이 삽입될 수 있는 작은 조각의 DNA이다. 단편의 클로닝 벡터로의 삽입은 상기 비히클 및 외래 DNA를 동일한 제한 효소로 처리함에 이어서 상기 단편을 함께 연결시킴에 의해 수행된다. 많은 유형의 클로닝 벡터가 있고 모든 유형의 클로닝 벡터가 본 발명에 사용된다. 유전학적으로 가공된 플라스미드 및 박테리오파아지(예를 들어, 파아지 λ)가 상기 목적을 위해 가장 보편적으로 사용되는 것일 수 있다. 다른 유형의 클로닝 벡터는 세균성 인공 염색체(BAC) 및 효모 인공 염색체(YAC)를 포함한다.

"발현 벡터"는 숙주 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정 핵산 요소들과 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 제조된 핵산 작제물이다. 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 특정 측면에서, 상기 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 연결되어 전사될 핵산을 포함한다.

용어 "암호화 서열"은 본원에서 적당한 조절 서열의 통제하에 놓여진 경우 mRNA로 전사되고 폴리펩타이드로 해독되는 핵산 서열로서 정의된다. 상기 암호화 서열의 경계선은 일반적으로 ATG 개시 코돈에 의해 결정되고, 상기 코돈은 mRNA의 5' 말단에서 개방 판독 프레임의 개시점이고 전사 종결인자 서열은 mRNA의 3'말단에서 개방 판독 프레임의 바로 다운스트림에 위치한다. 암호화 서열은 게놈 DNA, cDNA, 반합성, 합성 및 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 측면에서, 프로모터 DNA 서열은 이와 연합된 암호화 서열의 업스트림에 위치한 DNA 서열이고 상기 암호화 서열의 발현을 조절할 수 있는 것으로 정의된다.

"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 배열의 핵산 조절 서열로서 정의된다. 본원에 사용된 바와 같이, 프로모터는 폴리머라제 II형 프로모터의 경우에 TATA 요소와 같이, 전사의 개시 부위 근처에 필요한 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 전사 개시 부위로부터 수천개의 많은 염기쌍으로서 위치할 수 있는 원거리 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함한다. "항상성" 프로모터는 대부분의 환경적 및 발육 조건하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경적 또는 발육적 조절하에 활성인 프로모터이다.

용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 배열된 전사 인자 결합 부위들) 및 제2 핵산 서열간의 기능적 연결을 언급하고, 이때, 상기 발현 조절 서열은 상기 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.

용어 "형질도입"은 일반적으로 파아지에 의한 하나의 세균으로부터 또 다른 세균으로의 핵산 전달을 언급하기 위해 사용된다. "형질도입"은 또한 레트로바이러스에 의한 진핵 세포 서열의 획득 및 전달을 언급한다.

용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 취득을 언급하기 위해 사용되고, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입되는 경우 세포는 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, Graham et al., Virology, 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, (1986); and Chu et al., Gene, 13:197 (1981)을 참조한다. 상기 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 잔기를 적합한 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"은 세포의 유전학적 환경의 변화를 언급하고 세포는 이것이 새로운 DNA를 함유하도록 변형된 경우 형질전환된다. 예를 들어, 세포는 이것이 유전학적으로 이의 본래의 상태로부터 변형된 경우에 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후, 형질전환하는 DNA는 물리적으로 세포의 염색체내로 통합함에 의해 세포의 DNA와 재조합할 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 DNA는 복제되는 것 없이 에피좀 요소로서 일시적으로 유지되거나 이것은 플라스미드로서 독립적으로 복제한다. 세포는 DNA가 세포의 분열과 함께 복제되는 경우 안정하게 형질전환된 것으로 고려된다.

용어 "내인성"은 숙주 유기체에서 천연적으로 발현되거나 세포, 조직 또는 유기체내에서 기원하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 화합물을 언급한다. "외인성"은 세포, 조직 또는 유기체 외부에서 유래되는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 화합물을 언급한다.

용어 "제제" 또는 "화합물"은 본 발명에서 생물학적 파라미터에 영향을 미치는 능력을 갖는 임의의 분자, 예를 들어, 단백질 또는 약제를 기재한다.

본원에 사용된 바와 같은 "조절"은 활성, 양성, 음성 또는 비히클 조절을 언급할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 대조군은 실험적 결과의 관련성을 설정하고 시험된 조건에 대한 비교를 제공하기 위해 사용된다.

라임 또는 라임 질환의 증상을 언급하는 경우, 용어 "중증도를 감소시키는"은 증상의 발병이 지연되거나 중증도가 감소되거나 피검체에 대한 손상이 덜하도록 하는 것을 의미한다. 일반적으로, 증상의 중증도는 예를 들어, 활성 예방학적 또는 치료학적 조성물을 투여받지 않은 대조군과 비교한다. 상기 경우에, 조성물은 증상이 증상의 대조군 수준과 비교하여 10%, 25%, 30%, 50%, 80%, 또는 100%(즉, 필수적으로 제거된)까지 감소되는 경우, 라임 증상의 중증도가 감소된 것으로 일컬어질 수 있다.

용어 "항원"은 항체와 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있고 추가로 피검체에 사용되어 각각의 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 제조할 수 있는 분자 또는 이의 일부를 언급한다. 다양한 측면에서 항원은 하나 이상의 에피토프를 갖는다.

용어 "항체"는 OspA 폴리펩타이드에 대해 특이성을 갖는 분자 또는 분자들을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 "특이적", "특이성" 및 "특이적으로 결합하는"은 항체가 OspA 폴리펩타이드에 결합하고 비-OspA 폴리펩타이드에 결합하지 않는 능력을 언급한다. 특정 측면에서, 상기 항체는 "중화 항체"이고 이때, 상기 항체는 감염성 제제와 반응하고 이의 감염성 또는 독성을 파괴하거나 억제한다. 본 발명은 보렐리아를 "중화시키는" 항체를 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "생리학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 조성물로서 OspA 폴리펩타이드, OspA 핵산 분자 또는 OspA 항체의 전달을 성취하거나 증진시키기 위해 적합한 하나 이상의 제형 물질을 언급한다.

용어 "안정화제"는 가열 또는 동결 동안에 일어나는 것들과 같은 백신의 면역원성 조성물을 해로운 조건으로부터 보호하고/하거나 안정하고 면역원성인 조건 또는 상태에서 면역원성의 조성물의 안정성 또는 반감기를 지속시키는 물질 또는 백신 부형제를 언급한다. 안정화제의 예는 슈크로스, 락토스 및 만노스와 같은 당; 만니톨과 같은 당 알콜; 글라이신 또는 글루탐산과 같은 아미노산; 및 사람 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "항미생물성 보존제"는 용기가 사용되어야만 하는 경우 다용량 바이엘(vial)의 반복적인 천공시 도입될 수 있는 미생물의 성장을 억제하는 면역원성 조성물 또는 백신에 첨가되는 임의의 물질을 언급한다. 항미생물성 보존제의 예는 티메로살, 2-페녹시에탄올, 벤즈에토늄 클로라이드 및 페놀과 같은 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "면역원성 조성물"은 항원 특이적 항체가 이에 대해 만들어지는 항원(예를 들어, 키메라 OspA 분자) 및 피검체의 숙주 면역 반응을 자극하는 보조제 및 적합한 면역학적 불활성의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 언급한다. 임의로, 면역원성 조성물은 하나 이상의 안정화제를 포함한다. 임의로, 면역원성 조성물은 하나 이상의 항미생물성 보존제를 포함한다.

용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 특정 질환(예를 들어, 라임 질환 또는 보렐리아 감염)에 대한 면역성을 개선시키는 생물학적 제제를 언급한다. 백신은 전형적으로 질환 유발 미생물과 유사한 제제(예를 들어, 보렐리아의 키메라 OspA 분자(항원))을 함유한다. 상기 제제는 외래 물질로서 제제를 인지하고 이를 파괴하고 이를 "기억"하여 체내 면역계가 이후에 만나게 될 상기 임의의 미생물을 용이하게 인지하고 파괴할 수 있도록 체내 면역계를 자극한다. 다양한 측면에서, 백신은 예방용(임의의 천연 또는 "야생형" 병원체에 의한 향후 감염의 효과를 차단하거나 완화시키는) 또는 치료용(현존하는 감염에 대한 백신)이다. 상기 제시된 바와 같이, 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제형을 포함한다. 임의로, 백신은 또한 하나 이상의 안정화제 및/또는 하나 이상의 항미생물성 보존제를 포함한다.

용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 각각 본원에 제시된 바와 같은 OspA 폴리펩타이드의 관찰가능한 수준의 하나 이상의 생물학적 활성을 지지하기 위해 사용되는 핵산 분자, 폴리펩타이드, 조성물 또는 항체의 양을 언급한다. 예를 들어, 본 발명의 몇몇 측면에서, 유효량은 보렐리아 감염을 예방하거나 중화시키거나 감소시키는데 필요한 양이다.

용어 "조합"은 본 발명의 2개 이상의 핵산 분자 또는 본 발명의 2개 이상의 폴리펩타이드를 언급한다. 몇몇 측면에서, 본 발명의 분자의 조합체는 본원에 기재된 보렐리아의 6개의 혈청형(1-6) 중 적어도 4개로부터 면역성을 제공하거나 감염에 대해 맞서기 위해 투여된다. 다양한 측면에서, 본 발명의 2개 또는 3개의 분자 또는 폴리펩타이드의 조합체가 사용된다. 특정 측면에서, 본 발명의 분자의 조합체가 본원에 기재된 보렐리아의 모든 6개의 혈청형(1-6)으로부터 면역성을 제공하기 위해 피검체에 투여된다. 상기 후자 조합체는 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 조합으로 존재하지 않는 OspA 유형을 발현하는 보렐리아의 이종성 균주에 대한 면역성을 제공하는 것으로 나타났다.

용어 "조합 백신"은 하나 이상의 질환에 대해 하나 이상의 백신 조성물 또는 하나 이상의 보호 항원을 함유하는 백신 제형을 언급한다. 본 발명은 하나 이상의 다른 질환에 대한 항원 뿐만 아니라 라임 질환 또는 보렐리아에 대한 OspA 키메라 항원을 포함하는 조합 백신을 포함한다. 다양한 측면에서, 다른 질환중 하나 이상은 진드기-매개 질환이다. 특정 측면에서, 다른 진드기-매개 질환은 록키산홍반열, 바베시아증, 회귀열, 콜로라도 진드기 열, 사람 단핵구 엘리히증(HME), 사람 과립구 엘리히증(HGE), 남부 진드기-관련 발진병(STARI), 툴라레미아, 진드기 마비, 포와산 뇌염, Q 열, 크리민-콩고 출혈열, 시타욱스주노시스, 부톤네즈열, 또는 진드기-매개 뇌염이다. 특정 측면에서, 본 발명은 진드기-매개 뇌염 백신, 일본 뇌염 백신 및 록키산 홍반열 백신을 포함하는 하나 이상의 백신을 포함하는 조합 백신을 포함한다. 몇몇 측면에서, 조합 백신은 보렐리아 감염 또는 라임 질환에 대한 면역화에 상용하는 계절적 면역화 스케줄을 갖는 백신 조성물을 포함한다. 보다 특정 측면에서, 조합 백신은 이들 질환이 만연된 지정학적 위치에서 사용하기 위한 다발성 질환의 예방에 유용하다.

용어 "보렐리아"는 스피로헤타 부류의 보렐리아 속의 그람 음성 세균의 종을 언급한다. 하나의 측면에서, "보렐리아 부르그도르페리 센수 라토(s.l.)"는 보다 광범위한 의미에서는 보렐리아 부르그도르페리를 언급한다. 거의 모든 경우의 라임 질환 또는 보렐리아증은 3개의 동유전자종, 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니, 및 엄밀한 의미에서 비. 부르그도르페리를 언급하는 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토(s.s.)중 하나에 의해 유발된다. 보렐리아의 OspA 혈청형은 종과 관련된다; 혈청형 1은 비. 부르그도르페리(s.s.)에 상응하고, 혈청형 2는 비. 아프젤리에 상응하고, 혈청형 3 내지 7은 비. 가리니에 상응한다. 다양한 측면에서, 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물은 또한 보렐리아 자포니카(Borrelia japonica), 보렐리아 안데르소니(Borrelia andersonii), 보렐리아 비세티(Borrelia bissettii), 보렐리아 시니카(Borrelia sinica), 보렐리아 투르디(Borrelia turdi), 보렐리아 타누키(Borrelia tanukii), 보렐리아 발라이시아나(Borrelia valaisiana), 보렐리아 루시타니애(Borrelia lusitaniae), 보렐리아 스피엘 마니(Borrelia spielmanii), 보렐리아 미야모토이(Borrelia miyamotoi) 또는 보렐리아 론스타(Borrelia lonestar)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 종의 보렐리아에 대한 보호를 제공한다.

"피검체"는 비-식물의 비-원생동물 생명체로서의 통상적인 의미이다. 대부분의 측면에서, 상기 피검체는 동물이다. 특정 측면에서, 상기 동물은 포유동물이다. 보다 특정 측면에서, 상기 포유동물은 사람이다. 다른 측면에서, 상기 포유동물은 애완동물 또는 반려동물, 가축 동물 또는 동물원 동물이다. 특정 측면에서, 상기 포유동물은 고양이, 개, 말 또는 소이다. 다양한 다른 측면에서, 상기 포유동물은 사슴, 마우스, 얼룩 다람쥐, 다람쥐, 주머니쥐 또는 미국 너구리이다.

라임 질환( 보렐리아증 또는 라임 보렐리아증 )

몇몇 측면에서, 본 발명은 키메라 OspA 분자 및 라임 질환 또는 보렐리아 감염의 예방에서 상기 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 라임 질환은 또한 당업계에서 보렐리아증 또는 라임 보렐리아증으로서 공지되어 있고 따라서 모든 상기 용어는 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 키메라 OspA 분자를 투여함을 포함하는, 라임 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다. 라임 질환 또는 보렐리아증은 보렐리아 속에 속하는 3개 이상의 그람 음성 스피로헤타 세균 종에 의해 유발되는 감염성 질환이다. 13개 이상의 보렐리아 종이 발견되었고 이중 3개가 라임 질환과 관련된 것으로 공지되어 있다. 라임 질환을 유발하는 상기 보렐리아 종은 총체적으로 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토로서 공지되어 있고 상당한 유전학적 다양성을 보여준다. 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토 그룹은 대다수의 경우에 관여하는 것으로 보이는 3개의 밀접하게-관련된 종으로 이루어진다. 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토는 미국(그러나 유럽에서도 존재함)에서 라임 질환의 주요 원인인 반면, 보렐리아 아프젤리 및 보렐리아 가리니는 대부분 유럽에서의 주요 원인이다. 일부 연구는 또한 보렐리아 종(예를 들어, 보렐리아 비세티, 보렐리아 스피엘마니, 보렐리아 루시타니애 및 보렐리아 발라이시아나)이 때때로 사람을 감염시킬 수도 있음을 제안하였다. 이들 종이 중요한 병인인 것이 보이지 않으나, 이들 종으로부터의 면역 보호는 또한 본 발명에 포함된다.

라임 질환은 북반구에서 가장 흔한 진드기-매개 질환이다. 상기 질환은 1975년에 다수의 사례가 확인된 커넷티컷 라임 마을 이름을 따라 명명되었다. 보렐리아는 이속데스(Ixodes) 속의 수개의 종에 속하는 감염된 진드기("경질 진드기")에 의한 물림에 의해 사람에게 전달된다. 몇몇 경우에, 초기 증상은 열, 두통, 피로, 우울증, 및 이동 홍반으로 불리우는 특징적인 환형 피부 발진을 포함한다. 치료하지 않은채 유지되면, 이후 증상은 흔히 관절, 심장 및 중추신경계를 포함할 수 있다. 대부분의 경우, 상기 감염 및 이의 증상은, 특히 병이 조기 치료되는 경우, 항생제에 의해 제거된다. 그러나, 늦거나 지연되거나 부적당한 치료는 보다 심각한 증상을 유발할 수 있으며 이는 치료 불능 및 난치성일 수 있다. 때때로, 관절염과 같은 증상은 감염이 항생제에 의해 제거된 후에도 지속한다.

일부 그룹은 "만성" 라임 질환이 후기 라임 질환의 인지되는 증상 이상의 의학적으로 설명되지 않는 범위의 증상에 관여하고, 추가적인 장기 항생제 치료가 요구됨을 주장하였다. 그러나, 장기 치료는 논란이 많고 상기 치료에 관한 분쟁은 치료 지침서 이상의 합법적인 처치를 유도하였다.

라임 질환은 이것이 설치류 및 새를 포함하는 천연 보고로부터 상기 2개 세트의 숙주상에서 영양공급을 받는 진드기에 의해 사람에게 전달됨으로서 인수공통전염병(zoonosis)로서 분류된다. 이속데스 속의 경질체의 진드기는 라임 질환의 주요 매개체이다. 대부분의 사람 감염은 애벌레 진드기가 매우 작고 오랜기간 동안 검출되지 않은 상태로 영양공급 받을 수 있는 애벌레 단계의 진드기에 의해 유발된다. 진드기 물림은 흔히 애벌레 단계의 작은 크기의 진드기 및 숙주가 물렸을때 임의의 가려움증 또는 통증을 느끼지 못하게 하는 진드기 분비물 때문에 인지되지 않는다.

라임 질환은 증상, 객관적인 물리적 발견(예를 들어, 이동홍반, 안면 신경마비 또는 관절염), 또는 감염된 진드기에 대한 가능한 노출 병력, 및 혈청학적 혈액 시험을 기반으로 임상적으로 진단된다. 대략적으로 라임 질환을 갖는 환자의 절반은 특징적인 홍진을 나타내지만 많은 환자들은 진드기 물림을 상기할 수 없다. 연구 시험은 라임 질환의 증상을 갖지 않는 사람에게 추천되지 않는다.

연구실에서 보렐리아 세균을 배양하는데 있어서의 어려움 때문에, 라임 질환의 진단은 통상적으로 임상적 조사 발견 및 풍토성 라임 영역에 대한 노출 병력을 기초로 한다. 모든 경우 약 50%에서만 발생하는 이동홍반(EM) 발진은 혈청학적 혈액 시험이 음성인 경우에도 라임 질환의 진단을 확정하기 위해 충분한 것으로 고려된다. 혈청학적 시험을 사용하여 임상적으로 의심되는 경우를 지원할 수 있지만 그 자체가 진단하는 것은 아니다. 후기 라임 질환의 진단은 흔히, 많은 다른 질환의 증상과 유사할 수 있는 다방면으로 출현하기 때문에 어렵다. 이러한 이유 때문에, 검토자는 라임을 새로운 "위대한 모방자"로서 지칭한다. 일부 경우에, 라임 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 섬유근육통, 만성 피로 증후군(CFS), 낭창 또는 다른 자가면역 및 신경퇴행성 질환으로서 오진된다. 따라서, 당업계에서는 라임 질환을 예방하거나 치료하기 위한 백신이 크게 요구되고 있다.

보렐리아의 외부 표면 단백질 A( OspA )

다양한 측면에서, 본 발명은 보렐리아의 키메라 OspA 분자, 및 라임 질환 또는 보렐리아 감염의 예방 및 치료에 있어서의 상기 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 스피로헤타가 진드기로부터 포유동물로 전달됨에 따라 온도- 및/또는 포유동물 숙주 특이적 시그날에 의해 상향-조절되는 여러개의 보렐리아 외부 표면 단백질이 과거 10년 동안 동정되었다.

보렐리아 부르그도르페리의 주요 외부 표면 단백질, OspA는 백신 후보물로서의 이의 잠재능 때문에 특정 관심 대상인 지질단백질이다. 보렐리아의 유럽 및 북 아메리카 균주 둘다로부터 기원하는 OspA의 혈청학적 및 유전학적 분석은 항원성 및 구조적 이종성을 입증하였다. OspA는 공개된 PCT 특허원 제WO 92/14488호에, Jiang et al. (Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 : 406-12, 1994)에 기재되어 있고 당업계에 공지되어 있다. OspA는 마우스, 햄스터 및 개 기회감염 연구에서 보호성 면역을 유도하는 것으로 나타났다. 사람에서 임상적 시험은 OspA의 제형이 사람에서 안전하고 면역원성인 것으로 나타났다(Keller et al., JAMA (1994) 271 :1764 1768).

OspA는 북아메리카 기원의 보렐리아 부르그도르페리의 방대한 대다수의 임상적 분리물에서 발현되지만 유럽에서 임상적 보렐리아의 조사로부터 상이한 형태가 출현하였다. 유럽에서, 라임 질환은 주로 보렐리아의 3개의 동유전자종, 즉, 비. 부르그도르페리, 비. 가리니 및 비. 아프젤리에 의해 유발된다. 본 발명은 보렐리아의 모든 동유전자종에 대한 보호 면역을 제공하는 키메라 OspA 분자에 관한 것이다. 본 발명은 공통된 특징을 공유하는 3개의 구분되는 지질화된 OspA 분자를 암호화하는 3개의 키메라 OspA 유전자의 디자인 및 합성을 기재한다. 각각의 유전자는 2개의 OspA 혈청형을 나타내고 상기 유전자는 안전하고 고도로 면역원성인 안정한 OspA 분자를 암호화하고 비. 부르그도르페리 센수 라토(s.l.)에 의한 감염에 대해 피검체에게 보호를 제공하도록 디자인하였다. 본 발명은 또한 돌연변이 및 코돈 최적화 없이 공통된 특징을 공유하는 3개의 구분되는 지질화된 OspA 분자를 암호화하는 3개의 본래의 키메라 OspA 유전자를 기재한다. 각각의 유전자는 2개의 OspA 혈청형을 나타내고 비. 부르그도르페리 센수 라토(s.l.)에 대한 감염으로부터의 피험체 보호를 제공하는 분자를 암호화한다.

7개의 주요 OspA 혈청형은 유럽 분리물(혈청형 1 내지 7로 지정함, Wilske et al., J. Clin. Microbiol. 31:340-50, 1993) 중에서 인지되었다. OspA 혈청형은 종과 관련된다; 혈청형 1은 비. 부르그도르페리 에스.에스.에 상응하고 혈청형 2는 비. 아프젤리에 상응하고 혈청형 3 내지 7은 비. 가리니에 상응한다. 유럽 보렐리아 분리물의 역학적 연구는 OspA 1형, 2형, 3형, 4형, 5형 및 6형을 기본으로 하는 백신이 유럽에서 라임 질환의 98.1%에 대해 이론적 보호를 제공하고 공격적 질환 분리물의 96.7%에 대해 보호를 제공함을 지적한다. 본 발명은 모든 6개의 혈청형 1-6에 대해 보호 면역을 제공할 수 있는, 6개의 키메라 OspA 핵산 분자(서열번호: 1, 3, 및 5, 및 서열번호: 168, 170, 및 172) 및 6개의 키메라 OspA 폴리펩타이드 분자(서열번호: 2, 4, 및 6, 및 서열번호: 169, 171, 및 173)를 제공한다. 6개의 합성 OspA 유전자는 OspA 혈청형 1 및 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹ (서열번호: 1 (핵산) 및 2 (아미노산) 및 orig sOspA 1/2 (서열번호: 168 (핵산) 및 169 (아미노산)); OspA 혈청형 6 및 4 (lipB sOspA 6/4 (서열번호: 3 (핵산) 및 4 (아미노산) 및 orig sOspA 6/4 (서열번호: 170 (핵산) 및 171 (아미노산)); 및 OspA 혈청형 5 및 3 (lipB sOspA 5/3 (서열번호: 5 (핵산) 및 6 (아미노산) 및 orig sOspA 5/3 (서열번호: 172 (핵산) 및 173 (아미노산)) 기원의 보호 에피토프를 갖는 OspA 분자를 암호화하도록 디자인하였다. 상기 키메라 OspA 유전자는 합성 중첩 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 제조되었다. 이들 재조합 단백질은 특정 측면에서 고수율 및 고순도로 제조되고 다양한 측면에서 목적하는 활성을 최대화하고 목적하지 않는 활성을 최소화하도록 조정된다.

키메라 OspA 핵산 분자 및 폴리펩타이드 분자

다양한 측면에서, 본 발명은 보렐리아의 키메라 OspA 핵산 및 폴리펩타이드 분자를 포함한다. 본 발명의 OspA 핵산은 서열번호: 1 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 3 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 5 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 7 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 9 (sOspA 6/4), 서열번호: 11 (sOspA 5/3), 서열번호: 168 (orig sOspA 1 /2), 서열번호: 170 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 172 (orig sOspA 5/3)에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 8 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 10 (sOspA 6/4), 서열번호: 12 (sOspA 5/3), 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)에 제시된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어지거나 이들로 이루어진 핵산 분자를 포함한다.

서열번호: 7, 9, 및 11의 핵산 서열은 lipB 리더 서열 (MRLLIGFALALALIG (서열번호: 13))을 암호화하는 핵산 서열이 없다. 추가로, 서열번호: 7, 9, 및 11의 핵산 서열은 서열번호: 2, 4, 및 6에서 lipB 리더 서열의 카복시 말단에서 존재하는 시스테인 잔기 대신에 서열번호: 8, 10, 및 12의 아미노 말단에서 메티오닌 잔기를 암호화한다. 서열번호: 1, 3, 및 5는 lipB sOspA 폴리뉴클레오타이드이고 서열번호: 2, 4, 및 6은 lipB sOspA 폴리펩타이드이다.

몇몇 측면에서, 본 발명은 돌연변이 및 코돈 최적화 없이 보렐리아의 본래의("orig") 키메라 OspA 핵산 및 폴리펩타이드 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 OspA 핵산은 서열번호: 168 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 170 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 172 (orig sOspA 5/3)에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)에 제시된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어지거나 이들로 이루어진 핵산 분자를 포함한다.

키메라 OspA 분자에 대한 DNA 및 아미노산 서열에 대한 서열 동정 번호는 하기 표 1에 기재되어 있다.

[표 1]

본 발명의 OspA 폴리펩타이드는 서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 8 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 10 (sOspA 6/4), 서열번호: 12 (sOspA 5/3), 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 이들로 이루어진 폴리펩타이드 및 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 관련 폴리펩타이드는 OspA 폴리펩타이드 유사체, OspA 폴리펩타이드 변이체 및 OspA 폴리펩타이드 유도체를 포함한다. 몇몇 측면에서, OspA 폴리펩타이드는 이들이 제조되는 방법에 따라 아미노 말단 메티오닌 잔기를 갖는다. 관련된 측면에서, 본 발명의 OspA 폴리펩타이드는 OspA 활성을 포함한다.

하나의 양태에서, 관련된 핵산 분자는 서열번호: 1 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 3 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 5 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 7 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 9 (sOspA 6/4), 서열번호: 11 (sOspA 5/3), 서열번호: 168 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 170 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 172 (orig sOspA 5/3)로 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 약 70 퍼센트(70%) 동일하거나 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 특정 측면에서, 서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 8 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 10 (sOspA 6/4), 서열번호: 12 (sOspA 5/3), 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)에 제시된 폴리펩타이드와 약 70 퍼센트(70%) 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다. 다양한 양태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1 (lipB sOspA 1 /2²⁵¹), 서열번호: 3 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 5 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 7 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 9 (sOspA 6/4), 서열번호: 11 (sOspA 5/3), 서열번호: 168 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 170 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 172 (orig sOspA 5/3)에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 약 70 퍼센트, 또는 약 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 또는 79 퍼센트, 또는 약 80 퍼센트, 또는 약 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 또는 89 퍼센트, 또는 약 90 퍼센트, 또는 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 동일하거나 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 8 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 10 (sOspA 6/4), 서열번호: 12 (sOspA 5/3), 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)에 제시된 폴리펩타이드 서열과 약 70 퍼센트, 또는 약 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 또는 79 퍼센트, 또는 약 80 퍼센트, 또는 약 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 또는 89 퍼센트, 또는 약 90 퍼센트, 또는 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 동일한 폴리펩타이드를 암호화한다.

몇몇 양태에서, 서열 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 방법은 시험된 서열간에 최대 일치성을 제공하도록 디자인한다. 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 방법은 대중에게 가용한 컴퓨터 프로그램으로 기재한다. 몇몇 측면에서, 2개의 서열간의 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))를 포함하는 GCG 프로그램 팩키지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 BLASTX 프로그램은 기관[National Center for Biotechnology Information (NCBI)] 및 다른 공급원(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NiH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra (1990))으로부터 대중에게 가용하다. 상기 널리 공지된 스미쓰 워터맨 알고리듬(Smith Waterman algorithm)을 또한 사용하여 동일성을 측정한다.

2개의 아미노산 서열을 정렬시키는 특정 정렬 계획은 몇몇 측면에서 2개의 서열의 단지 최단 영역의 일치를 유도하고 이러한 작은 정렬된 영역은 2개의 전장 서열간에 어떠한 유의적인 관계가 없다 하더라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.

따라서, 하나의 양태에서, 상기 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 표적 폴리펩타이드의 50개 이상의 연속 아미노산을 포괄하는 정렬을 유도한다. 예를 들어, 컴퓨터 알고리듬 GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)을 사용하여, 퍼센트 서열 동일성이 측정되어야만 하는 2개의 폴리펩타이드가 이들의 각각의 아미노산의 최적의 일치(알고리듬에 의해 측정된 바와 같이 "일치된 범위")를 위해 정렬된다. 갭 개방 페널티(3x 평균 대각선으로 계산되는; "평균 대각선"은 사용되는 비교 행렬의 정사각 평균이다; 상기 "대각선"은 특정 비교 행렬에 의한 각각의 완벽한 아미노산 일치에 할당되는 스코어 또는 점수이다) 및 갭 연장 페널티 (통상적으로 갭 개방 페널티의 10분의 1(1/10)배인), 및 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 행렬을 알고리듬과 연계하여 사용한다. 표준 비교 행렬(Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) for the BLOSUM 62 comparison matrix 참조)은 또한 상기 알고리듬에 의해 사용된다.

다양한 측면에서, 폴리펩타이드 서열 비교용 파라미터는 다음을 포함한다:

알고리듬: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970);

비교 행렬: BLOSUM 62 from Henikoff et al., supra (1992);

갭 페널티: 12

갭 길이 페널티: 4

유사성 역치: 0

*상기 GAP 프로그램은 상기 파라미터와 함께 유용하다. 상기 언급된 파라미터는 GAP 알고리듬을 사용하는 폴리펩타이드 비교를 위한 디폴트 파라미터이다(말단 갭에 대해서는 페널티가 없음).

몇몇 측면에서, 핵산 분자 서열 비교를 위한 파라미터는 다음을 포함한다:

알고리듬: Needleman et al., supra (1970);

비교 행렬: 일치 = +10, 불일치 = 0

갭 페널티: 50

갭 길이 페널티: 3

상기 GAP 프로그램은 상기 파라미터와 함께 유용하다. 상기 언급된 파라미터는 핵산 분자 비교용의 디폴트 파라미터이다. Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997에 기재된 것들을 포함하는, 다른 예시적인 알고리듬, 갭 개방 페널티, 갭 연장 페널티, 비교 행렬, 유사성 역치 등은 당업자에 의해 사용된다. 수행될 특정 선택은 당업자에게 자명하고 수행될 특정 비교에 의존한다: 예를 들어, DNA-대-DNA, 단백질-대-단백질, 단백질-대-DNA; 추가로 소정의 서열 쌍간의 비교(이 경우에 GAP 또는 BestFit가 일반적으로 바람직하다) 또는 하나의 서열과 서열의 대형 데이타베이스간의 비교(이 경우에 FASTA 또는 BLAST가 바람직하다).

몇몇 측면에서 핵산 서열내 차이는 서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 8 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 10 (sOspA 6/4), 서열번호: 12 (sOspA 5/3), 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열과 상대적인 아미노산 서열의 보존성 및/또는 비-보존성 변형을 유도한다.

서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 8 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 10 (sOspA 6/4), 서열번호: 12 (sOspA 5/3), 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열에 대한 보존성 변형(및 암호화 뉴클레오타이드에 대한 상응하는 변형)은 천연의 OspA 폴리펩타이드와 유사한 기능적 및 화학적 특성을 갖는 OspA 폴리펩타이드를 생성시킨다. 대조적으로, OspA 폴리펩타이드의 기능적 및/또는 화학적 특성에서의 실질적인 변형은 서열번호: 2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 4 (lipB sOspA 6/4), 서열번호: 6 (lipB sOspA 5/3), 서열번호: 8 (sOspA 1/2²⁵¹), 서열번호: 10 (sOspA 6/4), 서열번호: 12 (sOspA 5/3), 서열번호: 169 (orig sOspA 1/2), 서열번호: 171 (orig sOspA 6/4), 또는 서열번호: 173 (orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열 중에서 치환을 선택함에 의해 성취되고 이들 변형은 (a) 치환 영역내 분자 골격 구조, 예를 들어, 쉬트 또는 이중나선 형태, (b) 표적 부위에서 상기 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는데에 대한 이들의 효과에서 유의적인 차이가 있다.

예를 들어, 몇몇 측면에서, "보존성 아미노산 치환"은 해당 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 거의 영향이 없도록 고유 아미노산 잔기의 비-고유 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 추가로, 특정 측면에서 상기 폴리펩타이드내 임의의 고유 잔기는 또한 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"에 대해 이전에 기재된 바와 같이 알라닌으로 치환된다.

보존성 아미노산 치환은 또한 생물학적 시스템에서의 합성에 의해서 보다는 통상적으로 화학적 펩타이드 합성에 의해 도입되는 비-천연 아미노산 잔기를 포함한다. 이들은 펩티도모사체 및 아미노산 잔기의 다른 역전 또는 역위된 형태를 포함한다.

천연 잔기는 다양한 측면에서 통상적인 측쇄 성질을 기준으로 분류된다:

1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, lle;

2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

3) 산성: Asp, Glu;

4) 염기성: His, Lys, Arg;

5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및

6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

예를 들어, 비-보존성 치환은 몇몇 측면에서 상기 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류 기원의 구성원으로 교환하는 것을 포함한다. 상기 치환된 잔기들은 다양한 측면에서 OspA 폴리펩타이드 오톨로그를 사용하여, 상동성이거나 유사한 OspA 폴리펩타이드의 영역들로 도입되거나 분자의 비-상동성 영역으로 도입된다.

상기 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 하이드로패틱 지수(hydropathic index)가 흔히 고려된다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 성질을 기초로 하이드로패틱 지수가 할당된다. 이들은 다음과 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질에 대한 상호활성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 하이드로패틱 아미노산 지수의 중요성은 당업자에 의해 이해된다. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). 특정 아미노산이 유사한 하이드로패틱 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 하이드로패틱 지수를 기준으로 변화시키는데 있어서, 하이드로패틱 지수가 ±2 이내에 있는 아미노산들의 치환은 특정 측면에서 바람직하고, ±1 내에 있는 아미노산들의 치환이 다른 측면에서 특히 바람직하고 ±0.5 이내에 있는 아미노산들의 치환은 다양한 측면에서 보다 특히 바람직하다.

또한, 당업계에서는 유사한 아미노산의 치환이 특히, 본 발명의 경우에서와 같이 면역학적 양태로 사용하기 위해, 생물학적으로 기능이 동등한 단백질 또는 펩타이드가 부분적으로 의도되는 경우, 친수성을 토대로 효과적으로 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 이의 면역원성 및 항원성, 즉 상기 단백질의 생물학적 성질과 관련된다.

하기의 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값을 토대로 변화시키는데 있어서, 친수성 값이 ±2 이내에 있는 아미노산의 치환이 특정 측면에서 바람직하고, ±1 범위내에 있는 아미노산 치환이 특히 바람직하고 ±0.5 내에 있는 아미노산 치환이 다양한 측면에서 보다 특히 바람직하다. 당업자는 또한 친수성을 기준으로 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 동정한다. 이들 영역은 "에피토프 코어 영역"으로서 언급된다.

목적하는 아미노산 치환(보존성 또는 비-보존성 치환이든 상관 없이)은 상기 치환이 요구되는 시점에서 당업자가 측정할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 사용하여 OspA 폴리펩타이드의 중요한 잔기를 동정하거나 본원에 기재된 이들의 기질에 대한 OspA 폴리펩타이드의 친화성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다.

몇몇 측면에서, 뉴클레오타이드 서열에서의 뉴클레오타이드의 치환 및 아미노산 서열에서 아미노산의 치환이 본 발명에 포함된다. 상기 치환은 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 1 내지 20개, 1 내지 25개, 1 내지 30개, 1 내지 35개, 1 내지 40개, 1 내지 45개, 1 내지 50개, 1 내지 55개, 1 내지 60개, 1 내지 65개, 1 내지 70개, 1 내지 75개, 1 내지 80개, 1 내지 85개, 1 내지 90개, 1 내지 95개, 1 내지 100개, 1 내지 150개, 및 1 내지 200개 뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 치환은 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 1 내지 20개, 1 내지 25개, 1 내지 30개, 1 내지 35개, 1 내지 40개, 1 내지 45개, 1 내지 50개, 1 내지 55개, 1 내지 60개, 1 내지 65개, 1 내지 70개, 1 내지 75개, 1 내지 80개, 1 내지 85개, 1 내지 90개, 1 내지 95개, 및 1 내지 100개의 아미노산을 포함한다. 상기 치환은 다양한 측면에서 보존성이거나 비-보존성이다.

예시적인 아미노산 치환은 표 2에 나타낸다.

[표 2]

당업자는 널리 공지된 기술을 사용하여 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 적합한 유사체 또는 변이체를 결정할 수 있다. 활성을 파괴하는 것 없이 변화될 수 있는 분자의 적합한 영역을 동정하기 위해, 당업자는 활성을 위해 중요한 것으로 사료되지 않는 영역을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 동일한 종 기원 또는 다른 종 기원의, 유사한 활성을 갖는 유사한 폴리펩타이드가 공지되어 있는 경우, 당업자는 OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 상기 유사한 폴리펩타이드와 비교할 수 있다. 상기 비교와 함께, 당업자는 유사한 폴리펩타이드 중에 보존된 분자의 잔기 및 위치를 동정할 수 있다. 상기 유사한 폴리펩타이드에 상대적으로 보존되지 않은 OspA 폴리펩타이드의 영역에서의 변화가 OspA 폴리펩타이드의 생물학적 활성 및/또는 구조에 역효과를 나타낼 가능성이 적다는 것은 인지될 것이다. 당업자는 또한 상대적으로 보존된 영역에서도 활성을 보유하면서 천연의 잔기를 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환(보존성 아미노산 잔기 치환)할 수 있음을 숙지한다.

몇몇 양태에서, OspA 폴리펩타이드 변이체는 당화 변이체를 포함하고, 이때, 당화 부위의 수 및/또는 유형이 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에서 제시된 아미노산 서열과 비교하여 변경되었다. 하나의 양태에서, OspA 폴리펩타이드 변이체는 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에서 제시된 아미노산 서열보다 크거나 적은 수의 N-연결된 당화 부위를 포함한다. N-연결된 당화 부위는 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 특징으로 하고, 이때, X로서 지정되는 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 상기 서열을 제조하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결된 탄수화물 쇄의 부가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 대안적으로, 상기 서열을 제거하는 치환은 기존의 N-연결된 탄수화물 쇄를 제거한다. 또한, N-연결된 탄수화물 쇄의 재배열이 제공되고, 여기서, 하나 이상의 N-연결된 당화 부위(전형적으로 천연적으로 존재하는 것들)가 제거되고 하나 이상의 새로운 N-연결된 당화 부위가 생성된다. 추가의 OspA 변이체는 시스테인 변이체를 포함하고, 이때, 하나 이상의 시스테인 잔기는 이로부터 결실되거나 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에 제시된 아미노산 서열과 비교하여 또 다른 아미노산(예를 들어, 세린)을 치환한다. 시스테인 변이체는 OspA 폴리펩타이드가 불용성 봉입체의 분리 후와 같이 생물학적 활성 형태로 재폴딩되어야만 하는 경우 유용하다. 시스테인 변이체는 일반적으로 본래의 단백질보다 적은 시스테인 잔기를 갖고 전형적으로 쌍을 이루지 않은 시스테인으로부터 비롯되는 상호작용을 최소화하기 위해 짝수를 갖는다.

본 발명은 추가로 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에 나타낸 바와 같은 단백질의 에피토프 함유 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 용어 "에피토프"는 항체가 결합할 수 있는 단백질 영역을 언급한다. 예를 들어, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :3998-4002 (1984)를 참조한다. 에피토프는 선형이거나 형태일 수 있고, 후자는 단백질의 폴딩시 에피토프를 형성하는 단백질의 불연속 영역으로 구성된다. 선형 에피토프는 일반적으로 길이가 6개 이상인 아미노산 잔기이다. 단백질 서열의 일부를 모사하는 상대적으로 짧은 합성 펩타이드는 통상적으로 부분적으로 모사된 단백질과 반응하는 항혈청을 유발할 수 있다. Sutcliffe et al., Science 219:660-666 (1983)을 참조한다. 짧은 선형 에피토프를 인지하는 항체는 특히 웨스턴 블롯팅과 같은 변성된 단백질을 사용하는 분석적 및 진단적 적용에 유용하다. Tobin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-4356 (1979)을 참조한다. 특정 경우에 짧은 펩타이드에 대한 항체는 또한 본래 형태의 단백질을 인지하고 따라서 단백질 발현 및 단백질 분리를 모니터링하기 위해서 유용하고 ELISA 또는 면역침전 연구에서와 같이 용액중 OspA 단백질을 검출하는데 유용하다.

키메라 OspA 핵산 분자 및 폴리펩타이드 분자의 합성

상기 핵산 분자는 OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하고, 제한 없이 재조합 DNA 방법 및 화학적 합성을 포함하는 다양한 방법으로 용이하게 수득될 수 있다.

재조합 DNA 방법은 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 및/또는 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY (1994)에 기재된 방법들이다. 하기에 기재된 바와 같이 수행되는 재조합 발현 기술은 다양한 측면에서 이들 폴리뉴클레오타이드를 제조하고 암호화된 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 수행된다. 예를 들어, OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 적당한 벡터에 삽입시킴에 의해, 당업자는 대량의 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 용이하게 제조할 수 있다. 이어서 상기 서열을 사용하여 검출 프로브 또는 증폭 프라이머를 제조할 수 있다. 대안적으로, OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터에 삽입시킬 수 있다. 상기 발현 벡터를 적당한 숙주로 도입함에 의해, 상기 암호화된 OspA 폴리펩타이드 또는 OspA 폴리펩타이드들은 몇몇 측면에서 대량으로 제조된다.

또한, 핵산 및 폴리펩타이드의 화학적 합성은 Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 (1989)에 기재된 것들과 같이 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 방법은 특히 핵산 합성을 위한 포스포트리에스테르, 포스포르아미디트 및 H-포스포네이트 방법을 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 화학적 합성을 위한 방법은 표준 포스포르아미디트 화학을 사용하는 중합체-지지된 합성이다. 전형적으로, OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA는 길이가 수백개인 뉴클레오타이드이다. 약 100개의 뉴클레오타이드 보다 큰 핵산은 상기 방법을 사용하여 여러 단편으로서 합성된다. 상기 단편들은 이어서 함께 연결되어 본 발명의 전장 뉴클레오타이드 서열을 형성한다. 특정 측면에서, 상기 폴리펩타이드의 아미노 말단을 암호화하는 상기 DNA 단편은 메티오닌 잔기를 암호화하는, ATG를 갖는다.

본 발명의 특정 측면에서, 키메라 OspA 암호화 서열은 합성 중첩 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 제조된다. 보렐리아 세포 기원의 DNA는 사용되지 않기 때문에 합성 방법의 추가의 이점은 보렐리아 배양 배지에 존재하는 동물 기원의 물질(즉, 혈청 또는 혈청 알부민)에 함유된 우발적인 제제로의 오염을 회피한다는 것이다. 상기 전략은 또한 발현을 최적화하거나(OspB 리더 서열), 클로닝을 촉진시키기 위해 제한 부위를 도입하거나 잠재적인 지적 재산권 문제를 회피하기 위한 변형과 같이, 단일 단계로 서열을 변형시킬 수 있기 때문에, 키메라 유전자를 제조하기 위해 요구되는 조작의 수를 상당히 감소시킨다. 또한, 이. 콜리내에 드물게 사용되는 코돈의 존재는 잠재적으로 외래 유전자의 고수준의 발현을 방해하기 때문에, 이. 콜리 숙주에 대해 코돈 용법을 최적화시킬 수 있다(Makoff et al., Nucleic Acids Res. 17:10191-202, 1989; Lakey et al., Infect. Immun. 68:233-8, 2000). 당업자에게 공지된 다른 방법이 또한 사용된다.

특정 양태에서, 핵산 변이체는 소정의 숙주 세포내에서 OspA 폴리펩타이드의 최적의 발현을 위해 변경된 코돈을 함유한다. 특정 코돈 변경은 발현을 위해 선택된 OspA 폴리펩타이드(들) 및 숙주 세포(들)에 의존한다. 상기 "코돈 최적화"는 다양한 방법, 예를 들어, 소정의 숙주 세포내에서 고도로 발현되는 유전자에서 사용하기 위해 바람직한 코돈을 선별함에 의해 수행될 수 있다. 몇몇 경우에 고도로 발현되는 세균 유전자의 코돈 선호도에 대해 "Ecohigh.cod"와 같은 코돈 빈도수 표를 삽입하는 컴퓨터 알고리듬이 사용되고 기관[University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI]에 의해 제공된다. 다른 유용한 코돈 빈도수 표는 "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod" 및 "Yeast_high.cod"을 포함한다

특정 측면에서, OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자는 표준 연결 기술을 사용하여 적당한 발현 벡터에 삽입된다. 상기 벡터는 전형적으로 사용되는 특정 숙주 세포에서 기능하는 것으로 선택된다(즉, 상기 벡터는 숙주 세포 기구와 양립가능하여 상기 유전자의 증폭 및/또는 상기 유전자의 발현이 일어날 수 있다). 다양한 측면에서 OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자는 원핵 세포, 효모, 곤충(바쿨로바이러스 시스템), 및/또는 진핵 숙주 세포에서 증폭되고/발현된다. 숙주 세포의 선별은 부분적으로 OspA 폴리펩타이드가 해독후 변형(예를 들어, 당화되고/되거나 인산화된)되어야만 하는지의 여부에 따라 다양하다. 변형되어야만 하는 경우, 효모, 곤충 또는 포유동물 숙주 세포가 바람직할 수 있다. 발현 벡터의 검토를 위해, Meth. Enz., vol.185, D.V. Goeddel, ed., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)을 참조한다.

클로닝 벡터는 당업계에 공지된 모두를 포함한다. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989를 참조한다. 하나의 측면에서, pUC18은 유전자 조작 및 서열분석이 벡터 pET30a를 사용하는 것보다는 상기 플라스미드를 사용하는 것이 더 용이하기 때문에 모든 중간 단계용 클로닝 벡터로서 사용된다. 기본적 특징은 명백하게 염기쌍 149 내지 469의 LacZ 알파 펩타이드를 암호화하는 lacZ 유전자 단편(lac 프로모터는 염기쌍 507에 있다), 염기쌍 1629 내지 2486의 앰피실린 내성 결정인자를 암호화하는 bla 유전자(bla 프로모터는 염기쌍 2521에 있다), 염기쌍 867에서 복제 오리진 및 염기쌍 185 내지 451의 다중 클로닝 부위이다(도 12).

발현 벡터는, 제한 없이, 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 나출되거나 리포좀내에 함유된) 및 재조합 폴리펩타이드가 도입된 바이러스를 포함하는, 당업계에 공지된 것들 모두를 포함한다. 상기 발현 벡터는 당업계에 공지된 기술을 사용하는 형질전환 또는 형질감염을 통해, 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현용으로 적당한 숙주 세포로 (예를 들어, 형질전환 또는 형질도입을 통해) 삽입된다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989를 참조한다. 하나의 측면에서, pET30a (Novagen)는 최종 완전한 OspA 유전자 삽입을 위한 발현 벡터로서 사용된다. pET 벡터에서, 유전자는 T7 프로모터의 조절하에 클로닝되고 발현은 숙주 세포내 T7 RNA 폴리머라제 공급원을 제공함에 의해 유도한다(T7 RNA 폴리머라제 공급원이 제공될때까지 어떠한 발현도 일어나지 않는다). 기본적 특징은 염기쌍 4048 내지 4860에서 가나마이신 내성(kan)을 암호화하는 유전자, lacl 유전자 염기쌍 826 내지 1905, 염기쌍 4956 내지 5411에서의 F1 복제 오리진 및 염기쌍 158 내지 346의 다중 클로닝 부위이다(도 13).

벡터를 작제하고 OspA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 상기 벡터의 적당한 부위에 삽입한 후, 상기 완성된 벡터를 증폭 및/또는 폴리펩타이드 발현을 위해 적당한 숙주 세포에 삽입한다. OspA 폴리펩타이드에 대한 발현 벡터로 선택된 숙주 세포를 형질전환시키는 방법은 다양한 측면에서 형질감염, 감염, 염화칼슘 매개 형질전환, 전기천공, 미세주사, 리포펙션 또는 DEAE-덱스트란 방법 또는 기타 공지된 기술과 같은 널리 공지된 방법에 의해 수행된다. 선택된 방법은 부분적으로 사용될 숙주 세포 유형의 함수이다. 이들 방법 및 다른 적합한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고 예를 들어, Sambrook et al., supra에 제시되어 있다.

몇몇 측면에서 숙주 세포는 원핵 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜리) 또는 진핵 숙주 세포(예를 들어, 효모, 곤충 또는 척추동물 세포)이다. 적당한 조건하에서 배양되는 경우 상기 숙주 세포는 후속적으로 배양 배지로부터 수거될 수 있거나(상기 숙주 세포가 이를 배지로 분비하는 경우) 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접 수거될 수 있는(이것이 분비되지 않는 경우) OspA 폴리펩타이드를 합성한다. 적당한 숙주 세포의 선별은 목적하는 발현 수준, 활성을 위해 요구되거나 필요한 폴리펩타이드 변형(예를 들어, 당화 또는 인산화) 및 생물학적 활성 분자로의 폴딩 용이함과 같은 다양한 인자에 의존한다. 상기 숙주 세포는 세균, 효모, 진균류, 바이러스, 무척추동물 및 포유동물 공급원의 숙주 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 숙주 세포의 예에 대해서는 Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)를 참조한다. 추가의 측면에서, Maniatis (상기)의 매뉴얼의 공개 이후 당업계에 사용되는 숙주 세포가 또한 본 발명에 사용된다.

하나의 측면에서, 상기 숙주 세포는 이. 콜리 세포이다. 이. 콜리의 적합한 균주는 BL21, DH5α, HMS174(DE3), DH1OB, 또는 E. CLONI 10G (Lucigen, Middleton, Wis.)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 몇몇 양태에서, 숙주 세포는 형질전환 효율 및/또는 벡터의 유지를 증진시키기 위해 유전자 조작된다.

하나의 측면에서, 이. 콜리 균주 DH5α [유전자형: 말단 A1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 D(lacZYA-argF)U169 deoR (F80dlacD(lacZ)M15] (Gibco BRL)이 모든 중간 클로닝 단계를 위해 사용된다. 상기 균주는 유전자 조작에서 가장 광범위하게 사용되는 숙주 중 하나인 이. 콜리 균주 K12로부터 유래한다. 상기 균주는 amp- 이어서 앰피실린 내성 유전자(amp)를 함유하는 벡터를 갖는 형질전환체의 선별이 가능하다.

또 다른 측면에서, 이. 콜리 균주 HMS174(DE3)가 발현용 숙주로서 사용된다. 이. 콜리 HMS174(DE3) 숙주 세포[유전자형 : F- recA1 hsdR (rk12-mk12+) RifR (DE3)] (Novagen)는 최종 클로닝 단계를 위해 본원의 다양한 실시예에서 사용된다. 상기 균주는 kan- 이어서 가나마이신 내성 유전자(kan)를 함유하는 벡터를 갖는 형질전환체의 선별이 가능하다.

OspA 폴리펩타이드 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포는 당업자에게 널리 공지된 표준 배지를 사용하여 배양한다. 상기 배지는 일반적으로 세포의 성장 및 생존을 위해 필요한 모든 영양물을 함유한다. 이. 콜리 세포를 배양하기 위해 적합한 배지는 예를 들어, 루리아 브로쓰(Luria Broth) (LB) 및/또는 테리픽 브로쓰(Terrific Broth)(TB)를 포함한다. 진핵 세포를 배양하기 위해 적합한 배지는 로즈웰 파크 메모리얼 연구소 배지(Roswell Park Memorial Institute medium) 1640 (RPMI 1640), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium) (MEM) 및/또는 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)를 포함하고, 몇몇 경우에 이 모두에는 배양되는 특정 세포주에 따라 혈청 및/또는 성장 인자가 보충된다. 곤충 배양을 위해 적합한 배지는 효모추출물, 락트알부민 가수분해물 및/또는 태아 소 혈청이 필요한 만큼 보충된 그레이스 배지(Grace's medium)이다.

전형적으로, 형질전환된 세포의 선택적 성장을 위해 유용한 항생제 또는 기타 화합물은 배지에 보충물로서 첨가된다. 사용될 상기 화합물은 숙주 세포를 형질전환시키는 플라스미드상에 존재하는 선별가능한 마커 요소에 의해 정해진다. 예를 들어, 상기 선별가능한 마커 요소가 가나마이신 내성인 경우, 상기 배양 배지에 첨가될 화합물은 가나마이신이다. 선별 성장을 위한 기타 화합물은 앰피실린, 테트라사이클린 및 네오마이신을 포함한다.

숙주 세포에 의해 생산되는 OspA 폴리펩타이드의 양은 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 상기 방법은 제한 없이 웨스턴 블롯 분석, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 비-변성 겔 전기영동, 크로마토그래피 분리, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 면역침전과 같은 면역검출 및/또는 DNA 결합 겔 전이 분석과 같은 활성 분석을 포함한다.

몇몇 경우에, OspA 폴리펩타이드는 분리시 생물학적 활성이 아니다. 상기 폴리펩타이드를 이의 3차 구조로 "재폴딩"하거나 전환시키고 디설파이드 연결을 생성시키기 위한 다양한 방법을 사용하여 생물학적 활성이 복구되도록 한다. 상기 방법은 특정 농도의 카오트로프(chaotrope)의 존재하에 상기 가용화된 폴리펩타이드를 일반적으로 7 이상의 pH에 노출시킴을 포함한다. 카오트로프의 선별은 봉입체 가용화를 위해 사용되는 선택과 매우 유사하지만 일반적으로 상기 카오트로프는 보다 낮은 농도로 사용되고 가용화를 위해 사용되는 카오트로프와 필수적으로 동일하지는 않다. 몇몇 경우에, 상기 재폴딩/산화 용액은 또한 환원제, 또는 환원제 및 이의 산화된 형태를 특정 비로 함유하여 특정 산화환원 전위를 발생시켜 단백질의 시스테인 브릿지(들)의 형성에서 디설파이드 셔플링이 일어나도록 한다. 통상적으로 사용되는 몇몇 산화환원 커플은 시스테인/시스타민, 글루타티온(GSH)/디티오비스 GSH, 염화구리, 디티오트레이톨(DTT)/디티안 DTT, 및 2-2머캅토에탄올(bME)/디티오-b(ME)를 포함한다. 조용매는 흔히 재폴딩의 효율을 증가시키기 위해 사용되고 상기 목적을 위해 사용되는 보다 일반적인 시약은 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 아르기닌 등을 포함한다.

OspA 폴리펩타이드의 발현시 봉입체가 상당한 정도로 형성되지 않는 경우, 상기 폴리펩타이드는 주로 세포 파쇄물의 원심분리 후 상등액에서 발견된다. 상기 폴리펩타이드는 본원에 기재된 것들 또는 당업계에 공지된 것들과 같은 방법을 사용하여 상등액으로부터 추가로 분리된다.

용액으로부터 OspA 폴리펩타이드의 정제는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 성취할 수 있다. 상기 폴리펩타이드가 이의 카복실 또는 아미노 말단에서 헥사히스티딘(OspA 폴리펩타이드/헥사His)와 같은 태그, 또는 FLAG(Eastman Kodak Co., New Haven, CT) 또는 myc(Invitrogen, Carlsbad, CA)와 같은 소형 펩타이드를 함유하도록 합성되는 경우, 상기 폴리펩타이드는 흔히 상기 용액을, 칼럼 매트릭스가 상기 태그에 대해 고친화성을 갖는 친화성 칼럼에 통과시킴에 의한 1단계 공정으로 정제된다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 니켈에 대해 높은 치환성 및 특이성으로 결합하고 따라서 니켈의 친화성 칼럼(예를 들어, Qiagen® 니켈 칼럼)은 OspA 폴리펩타이드/폴리His의 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)을 참조한다.

추가로, 상기 OspA 폴리펩타이드는 OspA 폴리펩타이드를 특이적으로 인지하고 이에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 사용을 통해 정제할 수 있다. 따라서, 정제를 위해 적합한 과정은 제한없이, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 전기영동(고유 겔 전기영동)에 이어서 겔 용출 및 정제용 등전점 포커싱 ("Isoprime" machine/technique, Hoefer Scientific, San Francisco, CA)을 포함한다. 몇몇 경우에, 2개 이상의 정제 기술을 조합하여 증가된 순도를 성취한다.

OspA 폴리펩타이드는 또한 당업계에 공지된 기술, 예를 들어, Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132 (1985), 및 Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)에 제시된 기술들을 사용하는 화학적 합성 방법(예를 들어, 고체상 펩타이드 합성)에 의해 제조된다. 상기 폴리펩타이드는 아미노 말단상에 메티오닌을 갖거나 갖지 않도록 제조된다. 몇몇 측면에서, 화학적으로 합성된 OspA 폴리펩타이드는 상기 문헌에 제시된 방법을 사용하여 산화시킴으로써 디설파이드 브릿지를 형성하도록 한다. 화학적으로 합성된 OspA 폴리펩타이드는 재조합적으로 제조되거나 천연 공급원으로부터 정제된 상응하는 OspA 폴리펩타이드와 유사한 생물학적 활성을 가질 것으로 예상되고 따라서 흔히 재조합 OspA 폴리펩타이드와 상호교환적으로 사용된다. 핵산 및 폴리펩타이드를 제조하기 위한 다수의 추가의 방법이 당업계에 공지되어 있고 상기 방방법을 사용하여 OspA 폴리펩타이드를 제조할 수 있는 것으로 인지된다.

OspA 폴리펩타이드 분자의 화학적 유도체

상기 OspA 폴리펩타이드의 화학적으로 변형된 유도체는 하기 제시된 기재를 토대로 당업자에 의해 제조된다. OspA 폴리펩타이드 유도체는 상기 폴리펩타이드에 천연적으로 부착된 분자의 유형 또는 위치에서 상이한 방식으로 변형된다. 유도체는 몇몇 측면에서 하나 이상의 천연 부착된 화학적 그룹이 결실되어 형성된 분자를 포함한다. 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 OspA 폴리펩타이드 변이체는 하나의 측면에서 하나 이상의 중합체의 공유적 부착에 의해 변형된다. 예를 들어, 선택된 상기 중합체는 전형적으로 수용성이어서 이것이 부착된 단백질은 수성 환경, 예를 들어, 생리학적 환경에서 침전하지 않는다. 적합한 중합체 범위내에 중합체의 혼합물이 포함된다. 특정 측면에서, 최종 생성물 제제의 치료학적 용도를 위해, 상기 중합체는 약제학적으로 허용가능해야 한다.

상기 중합체는 각각, 다양한 측면에서 임의의 분자량을 갖고 측쇄이거나 비측쇄이다. 상기 중합체는 각각 전형적으로 약 2kDa 내지 약 100kDa(여기서, 용어 "약"은 수용성 중합체의 제조시 몇몇 분자가 진술된 분자량보다 더 높은 분자량이거나 더 낮은 분자량임을 지적한다)의 평균 분자량을 갖는다. 각각의 중합체의 평균 분자량은 다양한 측면에서 약 5kDa 내지 약 50kDa, 약 12kDa 내지 약 40kDa, 및 약 20kDa 내지 약 35kDa이다.

적합한 수용성 중합체 또는 이의 혼합물은 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물; 당; 포스페이트; 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(모노-(C₁-C₁₀) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜을 포함하는, 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 PEG 형태를 포함하는); 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜; 덱스트란(예를 들어 약 6kDa의 저분자량의 덱스트란); 셀룰로스; 또는 다른 탄수화물계 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명은 때때로 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 OspA 폴리펩타이드 변이체의 공유적으로 부착된 다량체를 제조하기 위해 사용되는 이기능성 가교결합 분자를 포함한다.

몇몇 측면에서, 화학적 유도체화는 단백질이 활성화된 중합체 분자와 반응하도록 사용되는 임의의 적합한 조건하에서 수행한다. 폴리펩타이드의 화학적 유도체를 제조하기 위한 방법은 일반적으로 (a) 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 OspA 폴리펩타이드 변이체가 하나 이상의 중합체 분자에 부착되도록 하는 조건하에서 상기 폴리펩타이드와 활성화된 중합체 분자(예를 들어, 중합체 분자의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체)를 반응시키는 단계 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함한다. 최적의 반응 조건은 공지된 파라미터 및 목적하는 결과를 기준으로 결정한다. 예를 들어, 중합체 분자:단백질의 비율이 클수록 부착된 중합체 분자의 퍼센트가 증가한다. 하나의 양태에서, 상기 OspA 폴리펩타이드 유도체는 아미노 말단에 단일 중합체 분자 잔기를 갖는다(예를 들어, 미국 특허 제5,234,784호 참조).

특정 측면에서 폴리펩타이드의 페길화는 구체적으로, 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 임의의 페길화 반응에 의해 수행된다: Francis et al., Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992); EP 0154316; EP 0401384 및 미국 특허 제4,179,337호. 예를 들어, 페길화는 본원에 기재된 바와 같은 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 유사한 반응 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 아실화 반응을 위해, 선택된 중합체(들)는 단일 반응성 에스테르 그룹을 가져야만 한다. 환원 알킬화를 위해, 선택된 상기 중합체(들)은 단일 반응성 알데하이드 그룹을 가져야만 한다. 반응성 알데하이드는 예를 들어, 물에 안정한 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드 또는 이의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체이다(미국 특허 제5,252,714호 참조).

또 다른 양태에서, OspA 폴리펩타이드는 화학적으로 비오틴에 커플링되고 이어서 접합된 비오틴/OspA 폴리펩타이드 분자는 아비딘에 결합하도록 하여 4가의 아비딘/비오틴/OspA 폴리펩타이드 분자를 수득한다. OspA 폴리펩타이드는 또한 디니트로페놀(DNP) 또는 트리니트로페놀(TNP)에 공유적으로 커플링시키고 수득한 접합체는 항-DNP 또는 항-TNP-IgM으로 침전시켜 10가의 십합성 접합체를 형성시킨다. 특정 측면에서 본원에 기재된 상기 OspA 폴리펩타이드 유도체는 추가의 활성, 증진되거나 감소된 생물학적 활성 또는 기타 특성, 예를 들어, 비-유도체화된 분자와 비교하여 증가되거나 감소된 반감기를 갖는다.

면역원성 조성물, 백신 및 항체

본 발명의 몇몇 측면은 면역원성 조성물 및 백신을 포함한다. 본 발명의 면역원성 키메라 OspA 분자는 항원(들)과 조합하여 사용되어 피검체에서 항-OspA 면역 반응을 유발한다(즉, 백신으로서 작용한다). 예시적인 면역원성 OspA 폴리펩타이드(서열번호: 2, 4, 6, 169, 171, 및 173)는 조합하여 제공되어 보렐리아의 임의의 혈청형 1-6중 하나 이상 및 보다 일반적으로는 본원에 논의된 바와 같이 많은 다른 보렐리아 종에 대한 면역 반응을 유발한다. 면역 반응은 또한 본 발명의 OspA 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드 벡터를 전달하여 생성될 수 있다(즉, "나출된 DNA"의 투여). 몇몇 측면에서, OspA 핵산 분자(서열번호: 1, 3, 5, 168, 170, 및 172)는 주사에 의해, 리포좀을 통해, 또는 본원에 기재된 임의의 투여 수단에 의해 전달된다. 일단 면역화된 경우, 상기 피검체는 보렐리아의 혈청형 1-6의 OspA 단백질 및 보렐리아의 다른 종에 대해 강한 면역 반응을 나타낸다.

따라서, 상기 제시된 바와 같이, OspA 폴리펩타이드 및 OspA 핵산 분자 둘다는 본 발명의 면역원성 및/또는 백신 조성물에 항원으로서 사용하기 위해 포함된다. 특정 측면에서, 핵산 및 단백질 둘다는 피검체에 전달된다. 특정 측면에서, 핵산 백신에 대한 면역 반응은 동족 단백질의 동시 투여에 의해 증진되는 것으로 나타난다(WO 99/30733 참조). 상기 핵산 및 단백질은 동일한 조성물로 투여될 필요는 없다. 상기 둘다는 단지 상기 단백질을 사용한 면역 반응의 유도 단계 동안에 투여되어야만 하고 몇몇 측면에서 상기 단백질은 핵산이 면역계를 프라이밍한 후 때까지 차폐되거나 억제되어 있다. 특정 측면에서, 백신은 핵산 및 단백질 항원을 항원 제공 세포로 전달하도록 의도된다(WO 97/28818 참조). 다양한 측면에서, 상기 핵산 및 단백질은 예를 들어, 공유 접합에 의해 복합체를 형성한다. 추가의 측면에서, 리포좀 제형은 또한 백신 항원의 면역원성을 증진시키기 위해 포함된다.

특정 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 약제학적 담체와 함께 본원에 기재된 OspA 분자 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 여기서, 상기 조성물은 외부 표면 단백질 A(OspA) 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도한다. 몇몇 측면에서, 상기 면역원성 조성물은 또한 안정화제 또는 항미생물성 방부제를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 면역원성 조성물은 보렐리아에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도한다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 보렐리아를 중화시키는 항체의 생성을 유도한다.

몇몇 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 키메라 OspA 분자(항원)를 포함하는 면역원성 조성물중에 보조제의 용도를 포함한다. 특정 측면에서, 면역원성은 항원이 보조제와 동시에 투여되는 경우 상당히 개선된다. 몇몇 측면에서, 보조제는 포스페이트 완충 식염수(PBS)중에서 0.001% 내지 50% 용액으로서 사용된다. 보조제는 항원의 면역원성을 증진시키지만 이들 자체는 필연적으로 면역원성이 아니다.

몇몇 측면에서, 보조제는 백신 접종에 대해 다수의 양성 효과를 갖는다. 몇몇 경우에, 보조제는 피검체에서 강한 면역 반응의 생성을 가속화한다. 다른 경우에 보조제는 면역 반응의 수준을 증가시키고 이의 작용기간을 연장시키고 면역 기억을 개선시킨다. 보조제는 흔히 특정 피검체 그룹(예를 들어, 노인 환자 또는 면역-억제된 환자)의 약해진 면역성을 극복하거나 특정 "위험 그룹"(예를 들어, 제한 없이 영아 또는 노인)의 면역원성을 개선시키기 위해 사용된다. 다양한 경우에 보조제의 면역 증진 효과는 보호 반응을 부여하기 위해 최종 제형에 요구되는 항원의 양을 감소시킨다(즉 용량-절감).

일반적으로, 보조제는 이들의 주요 작용 기작에 따라 2개의 주요 그룹으로 분류된다. 제1 그룹은 선척적인 면역계 수용체 또는 센서의 효능제, 예를 들어, 톨형 수용체(Toll-like-receptor)(TLR) 효능제, C-형 렉틴 수용체 효능제, 레티노산 유도성 유전자 1 (RIG-1)형 수용체(RLR) 효능제, 및 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 류신 풍부 반복-함유 수용체(NLR) 효능제이다. 제2 그룹은 또한 TLR-비의존성 보조제로서 공지된 전달 시스템으로서 작용하는 물질이다. TLR 효능제 보조제의 예는 시판되는 간염 B 및 파릴리오마 바이러스 백신 중에 보조제로서 사용되는 ASO4 (Glaxo Smith Kline), TLR-4 효능제; 백시네이트(Vaxinate), 플라겔린 융합 단백질 TLR-5 효능제; 및 많은 TLR-9 효능제 보조제, 예를 들어, 이중가닥 DNA(dsDNA) 및 올리고뉴클레오타이드 CpG 또는 ODN1a를 사용하는 것들이다. 보조제의 범주에 속하는 다른 TLR-효능제는 당지질(TLR-1), 리포테이코산 및 지질단백질(TLR-1 /TLR-2 및 TLR-2/TLR-6) 리포폴리사카라이드, 리포올리고사카라이드 및 모노포스포릴 지질 A (MPL) (TLR-4), 단일가닥 RNA (TLR-3); 펩티도글리칸 (TLR-6), 단일 가닥의 RNA (TLR-7)을 포함한다. 2개의 C형 렉틴 수용체 효능제 보조제의 예는 β-글루칸(덱틴(Dectin)-1) 및 만난(덱틴-2)을 포함하고 이 둘다는 진균류 세포벽으로부터 유래한다. RLR 수용체 효능제 보조제는 이중가닥 바이러스 RNA 및 이중가닥 바이러스 DNA를 포함하고, NLR 효능제 보조제는 펩티도글리칸 분해 생성물, 미생물 생성물 및 비-감염성 결정 입자를 포함한다. 모든 경우에, 상기 효능제는 본래의 면역계 수용체를 직접 활성화시켜 면역 증진 염증 반응을 유발하는 작용을 한다. 보조제의 제2 그룹, TLR 비의존성 보조제는 대부분 전달 시스템으로서 작용하고 항원 제공 세포에 의한 항원 취득 및 제공을 증진시킨다. 몇몇 경우에, 이들 보조제는 또한 항원의 면역계 세포로의 느린 지연성 방출을 촉진시키는 데포 효과를 생성하는 투여 부여 근처에 국소적으로 항원을 유지시키는 작용을 할 수 있다. 보조제는 또한 면역계의 세포를 항원 데포로 유인하고 상기 세포가 면역 반응을 유발하도록 자극시킨다. TLR 비의존성 보조제의 예는 미네랄 염, 예를 들어, 수산화알루미늄 및 인산알루미늄(총체적으로 알룸으로서 언급됨) 및 인산칼슘; 수-중-유 에멀젼(예를 들어, MF59, AS03 및 ProVax); 유중수 에멀젼(Montanide, TiterMax); 생물중합체(Advax); 식물 유도체, 특히 사포닌 분획물, 남아메리카 몰리나 소프 나무 퀼라이야 사포나리아(Quillaja saponaria) (SFA-1, QS21, QuilA)의 나무껍질로부터 트리테르페노이드 추출물; 사포닌 추출로 구성된 면역 자극 복합체(ISCOM 및 ISCOM 매트릭스), 스테롤 및 임의로 인지질(ISCOMATRIX 및 Matrix-M); 다양한 크기 및 전하의 인지질 구형체인 리포좀(Vaxfectin 및 Vaxisome); 인플루엔자 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제와 같은 바이러스 표면 항원을 함유하는 리포좀인 바이러스-유사 입자 및 바이로좀; 다양한 조성물의 나노입자; 키토산, 폴리아르기닌과 같은 펩타이드 및 KLK 펩타이드로서 공지된 펩타이드를 포함한다.

상기 본원에 열거된 보조제는 단독으로 사용되거나 조합하여 사용된다. TLR-의존성 및 TLK-비의존성 보조제의 조합은 흔히 항원으로서 바람직하고 TLR-의존성 보조제는 또한 취득 및 안전성을 자극하는 TLR-비의존성 보조제에 의해 항원 제공 세포에 포획되는 것으로 사료되고 TLR-의존성 보조제는 TLR 시그날 전달의 활성화를 통해 직접적으로 면역성을 증진시키다.

TLR-의존성 및 TLR 비의존성 보조제 조합의 예는 AS01: MPL(TLR-4 효능제), 리포좀 및 QS-21 (둘다 TLR-비의존성 보조제)의 혼합물; AS04: MPL(TLR-4 효능제) 및 수산화알루미늄/포스페이트; IC31: ODN1a (TLR-9 효능제) 및 KLK 펩타이드(TLR-비의존성 보조제); 및 프룬트 완전 보조제, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)의 막 추출물(TLR-4 효능제) 및 수-중-유 에멀젼(TLR-비의존성 보조제)을 포함한다.

다중 TLR-의존성 보조제로 이루어진 조합물을 또한 사용하여 보조 백신 제형의 면역 증진 효과를 최대화한다. 상이한 어댑터 단백질을 사용하는 TLR의 효능제는 흔히 조합된다(예를 들어, TRIF(톨/인터류킨 1 수용체 도메인 함유 어댑터 단백질 유도 INF-β) 어댑터 경로를 사용하는 혈장막 결합된 TLR-3 또는 TLR-4 수용체에 대한 효능제와 엔도좀 또는 리소좀 기관에서 발현되고 MyD88(골수 분화 1차 반응 단백질) 어댑터 단백질 경로를 사용하는 TLR(TLR-7, TLR-8 및 TLR-9)의 효능제의 조합).

이들 면역자극제 또는 보조제는 또한 백신에서 숙주 면역 반응을 개선시킨다. 몇몇 경우에, 리포폴리사카라이드와 같은 물질은 이들이 정상적으로 백신으로서 사용되는 사멸되거나 약독화된 세균의 성분이기 때문에 내인성 보조제로서 작용할 수 있다. 상기 본원에 열거된 것들과 같은 외인성 보조제는 전형적으로 항원과 비-공유적으로 결합되고 숙주 면역 반응을 증진시키기 위해 제형화된 면역조절제이다.

광범위한 외인성 보조제는 항원에 대해 강력한 면역 반응을 유발할 수 있다. 이들은 막 단백질 항원과 복합체화된 사포닌(면역 자극 복합체), 미네랄 오일과의 풀루로닉 중합체, 미네랄 오일 중 사멸된 마이코박테리아, 프룬트 완전 보조제, 세균 생성물, 예를 들어, 무라밀 디펩타이드 (MDP) 및 리포폴리사카라이드(LPS), 및 지질 A 및 리포좀을 포함한다. 체액성 면역 반응(HIR) 및 세포-매개 면역성(CMI)을 효율적으로 유도하기 위해, 면역원은 특정 측면에서 보조제중에 유화된다.

이상적인 보조제의 목적하는 특성은 하기중 임의의 특성 또는 모든 특성을 포함한다: 독성의 부재; 오래 지속적인 면역 반응을 자극하는 능력; 제조의 간편성 및 장기 저장시 안정성; 다양한 경로에 의해 투여되는 항원에 대해 CMI 및 HIR 둘다를 유발하는 능력; 다른 보조제와의 상승작용; 항원 제공 세포(APC)의 집단과 선택적으로 상호작용하는 능력; 적당한 T_H1 또는 T_H2 세포-특이적 면역 반응을 특이적으로 유발하는 능력; 및 항원에 대해 적당한 항체 이소형 수준(예를 들어 IgA)을 선택적으로 증가시키는 능력.

본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제4,855,283호는 N-글리코실아미드, N-글리코실우레아 및 N-글리코실카바메이트를 포함하는 당지질 유사체를 교시하고 있고, 상기 각각은 당 잔기에서 면역-조절제 또는 보조제로서 아미노산에 의해 치환된다. 미국 특허 제4,855,283호는 글리코스핑고리피드 및 글리코글리세로리피드와 같은 천연 당지질과 구조적 유사성을 나타내는 N-당지질 유사체가 헤르페스 심플렉스 바이러스 백신 및 슈도랍비 바이러스 백신 둘다에서 강한 면역 반응을 유발할 수 있음을 보고하였다. 몇몇 당지질은 비대칭 탄소 원자를 통해 당과 직접적으로 연결되어 천연의 지질 잔기의 기능을 모방하는 장쇄 알킬아민 및 지방산으로부터 합성되었다.

몇몇 측면에서, 상기 면역원성 조성물은 면역원에 대한 면역 반응을 증진시키기에 충분한 양의 보조제를 함유한다. 적합한 보조제는 알루미늄 염(인산알루미늄 또는 수산화알루미늄), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 무라밀 펩타이드, 사포닌 유도체, 마이코박테리움 세포벽 제제, 모노포스포릴 지질 A, 마이콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유니트, 폴포스파젠 및 유도체 및 면역자극 복합체(ISCOM), 예를 들어, Takahashi et al. (Nature 344:873-875, 1990)에 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 몇몇 측면에서, 상기 보조제는 합성 보조제이다. 특정 측면에서, 합성 보조제는 글루코피라노실 지질 보조제(GLA)이다.

본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 면역원성 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신이다. 상기 본원에 논의된 바와 같이, 특정 측면에서 상기 백신은 하나 이상의 안정화제 및/또는 하나 이상의 보존제를 포함한다.

하나의 측면에서, 항원(본원에 기재된 키메라 OspA 폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 작제물 및 보조제를 포함하는 백신이 제공된다. 하나의 양태에서, 상기 재조합 발현 작제물(OspA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터)은 특정 추가의 양태에서 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스 및 레트로바이러스로부터 선택되는 바이러스에 존재하는 바이러스 벡터에 존재한다.

본 발명의 추가의 측면은 본원에 기재된 키메라 OspA 분자에 대한 항체를 포함한다. 다양한 측면에서, 본 발명은 항-OspA 항체를 제조하고 보렐리아 감염에 대한 면역성을 제공하기 위해 키메라 OspA 분자를 포함한다. 몇몇 측면에서, 이들 항-OspA 항체, 예를 들어, 쥐, 사람 또는 사람화된 모노클로날 항체 또는 단일쇄 항체는 피검체에 투여되어 (예를 들어, 수동 면역화) 보렐리아의 혈청형 1-6중 임의의 하나 이상의 OspA 단백질에 대한 면역 반응을 유도한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "항체"는 하나 이상의 OspA 폴리펩타이드에 대해 특이성을 갖는 분자를 언급한다. 적합한 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조한다. 특정 측면에서, OspA 항체는 OspA 폴리펩타이드의 특정 부분에 결합하여 상기 폴리펩타이드의 OspA 폴리펩타이드 수용체(들)로의 결합을 억제할 수 있다. 본 발명의 키메라 OspA 폴리펩타이드에 결합하는 항체 및 항체 단편은 본 발명의 범위내에 있다.

몇몇 측면에서, 본 발명의 항체는 동물을 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 및 173으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 면역화시켜 제조된 하나 이상의 OspA 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 168, 170, 및 172로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 사람, 사람화된, 폴리클로날 또는 모노클로날이다. 추가의 측면에서, 상기 항체는 Fab 또는 Fab' 항체이다. 특정 측면에서, 상기 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 항체는 항체의 화학적으로 변형된 유도체이다.

본 발명에 따른 키메라 OspA 분자의 투여는 사람 또는 동물에서 면역 또는 항체 반응을 자극한다. 몇몇 측면에서, 3개의 키메라 OspA 분자(예를 들어, 지질화된 OspA 1/2²⁵¹, 지질화된 OspA 6/4 OspA, 및 지질화된 OspA 5/3; 또는 본래의 OspA 1/2, 본래의 OspA 6/4, 및 본래의 OspA 5/3)는 함께 투여되어 본원에서 논의된 모든 6개의 혈청형(1-6)에 대한 항체 반응을 유발한다. 상기 항체 반응은 상기 수득된 항체(보호 반응성이 없음)가 그럼에도 불구하고 유용하기 때문에 본 발명의 방법이 다양한 측면에서 단지 면역 반응(보호 반응과는 반대되는)을 자극하기 위해 사용됨을 의미한다. 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 항체를 유발함에 의해 모노클로날 항체를 제조하고, 상기 모노클로날 항체는 널리 공지된 항체 결합 분석, 진단 키트 또는 보렐리아 부르그도르페리 에스. 엘.의 존재 유무를 측정하거나 스피로헤타에 대한 면역 반응이 단순히 자극되었는지의 여부를 측정하기 위한 시험에 사용된다. 특정 측면에서, 상기 모노클로날 항체는 OspA와 같은 보렐리아 항원을 회수하거나 분리하기 위해 면역흡착 크로마토그래피에 사용된다.

본 발명의 OspA 항체, 및 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 다양한 측면에서, 단일특이적 폴리클로날를 포함하는 폴리클로날, 모노클로날(MAb), 재조합, 키메라, CDR 접목된과 같이 사람화된, 사람, 단일쇄 및/또는 이특이적이다. 항체 단편은 OspA 폴리펩타이드상의 에피토프에 결합하는 항체 부분을 포함한다. 상기 단편의 예는 전장 항체의 효소적 절단에 의해 생성된 Fab 및 F(ab') 단편을 포함한다. 다른 결합 단편은 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 플라스미드의 발현과 같이, 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 것들을 포함한다.

OspA 폴리펩타이드에 대해 지시된 폴리클로날 항체는 OspA 폴리펩타이드 및 보조제의 다중 피하, 근육내 또는 복강내 주사에 의해 피검체(래빗, 마우스 또는 다른 동물 또는 포유동물을 포함함)에서 제조된다. 특정 측면에서 본 발명의 OspA 폴리펩타이드를 면역화될 종에서 면역원성인 담체 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청, 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합시키는 것이 유용하다. 또한, 알룸과 같은 보조제를 사용하여 면역 반응을 증진시킨다. 면역화 후, 혈액 샘플을 면역화된 피검체로부터 채취하고 혈청을 항-OspA 폴리펩타이드 항체 역가에 대해 분석한다.

OspA 폴리펩타이드에 대해 지시된 모노클로날 항체는 연속 배양 세포주에 의해 항체 분자를 제조하기 위해 제공되는 임의의 방법을 사용하여 제조된다. 모노클로날 항체를 제조하기 위해 적합한 방법의 예는 Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975) 및 the human B-cell hybridoma method, Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)의 하이브리도마 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 OspA 폴리펩타이드와 반응하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

몇몇 경우에, 본 발명의 모노클로날 항체는 치료제로서 사용하기 위해 변형된다. 하나의 양태는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이면서 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체이다. 또한 상기 항체의 단편들은 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 이상 포함된다. 미국 특허 제4,816,567호 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1985)를 참조한다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 "사람화된" 항체이다. 비-사람 항체를 사람화시키기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(미국 특허 제5,585,089호 및 제5,693,762호 참조). 일반적으로, 사람화된 항체는 비-사람인 공급원으로부터 여기에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 사람화는 예를 들어, 당업계에 기재된 방법(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))에 기재된 방법을 사용하여, 설치류 상보성 결정 영역(CDR)의 적어도 일부를 사람 항체의 상응하는 영역으로 치환시킴에 의해 수행될 수 있다.

또 다른 양태에서, 사람 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리로부터 제조된다(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). 이들 방법은 필라멘트성 박테리오파이지의 표면상에 항체 레퍼토리의 디스플레이 및 이어서 선택된 항원에 결합시킴에 의한 파아지의 선별을 통한 면역 동정과 유사하다. 하나의 상기 기술은 상기 방법을 사용하여 MPL- 및 msk-수용체에 기능적 효능성 항체 및 고친화성의 분리를 기재하는 PCT 출원 번호 제PCT/US98/17364호 (Adams et al.)에 기재되어 있다.

키메라, CDR 접목되고 사람화된 항체는 전형적으로 재조합 항체에 의해 제조된다. 상기 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포내로 도입시키고 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 물질 및 과정을 사용하여 발현시킨다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 포유동물 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포에서 제조한다. 모노클로날(예를 들어, 사람) 항체는 다양한 측면에서 숙주 세포에서 재조합 DNA를 발현시키거나 본원에 기재된 바와 같은 하이브리도마 세포내에서 발현시켜 제조한다. 몇몇 측면에서, 상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편은 사람화한다. 특정 측면에서, 상기 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같은 F237/BK2이다.

특정 측면에서, 본 발명은 피검체에서 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하거나 치료하기 위한 유효량으로 피검체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 고도면역성 혈청, 고도면역성 혈장 또는 이의 정제된 면역글로불린 분획물이다. 다른 측면에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 정제된 면역글로불린 제제 또는 면역글로불린 단편 제제이다.

다양한 측면에서, 본 발명의 항-OspA 항체는 OspA 폴리펩타이드의 검출 및 정량을 위해, 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어, 경쟁 결합 분석, 직접적이고 간접적인 샌드위치 분석 및 면역침전 분석에 사용된다(Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)). 상기 항체는 사용되는 분석 방법에 적당한 친화성으로 OspA 폴리펩타이드에 결합한다.

특정 양태에서, 진단학적 또는 임상적 적용을 위해, 항-OspA 항체는 검출가능한 잔기로 표지시킨다. 상기 검출가능한 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 시그날을 생성할 수 있는 임의의 하나일 수 있다. 예를 들어, 특정 측면에서, 상기 검출가능한 잔기는 방사능동위원소, 예를 들어, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광성 또는 화학발광성 화합물, 예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린; 또는 효소, 예를 들어, 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제이다(Bayer et al., Meth. Enzym. 184:138-163 (1990)).

경쟁 결합 분석은 제한된 양의 항-OspA 항체에 결합하는 것에 대해 시험 샘플 분석물(OspA 폴리펩타이드)와 경쟁하는 표지된 표준물(예를 들어, OspA 폴리펩타이드 또는 이의 면역학적 반응성 부분)의 능력에 의존한다. 상기 시험 샘플에서 OspA 폴리펩타이드의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물의 양에 역비례한다. 결합하게 되는 표준물 양의 결정을 용이하게 하기 위해, 상기 항체는 전형적으로 경쟁 전후에 불용성화되어 항체에 결합된 표준물 및 분석물이 미결합된 채로 있는 표준물 및 분석물로부터 간편하게 분리되도록 한다.

샌드위치 분석은 전형적으로 2개 항체를 사용함을 포함하고 상기 항체 각각은 검출되고/되거나 정량될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 샌드위치 분석에서, 상기 시험 샘플 분석물은 전형적으로 고체 지지체상에 고정화된 제1 항체에 의해 결합되고 이후 제2 항체는 분석물에 결합하여 불용성 3개 부분의 복합체를 형성한다. 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 몇몇 경우에, 상기 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지시키거나(직접적인 샌드위치 분석) 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정한다(간접적인 샌드위치 분석). 예를 들어, 한가지 유형의 샌드위치 분석은 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA)이고 이 경우에 검출가능한 잔기는 효소이다.

상기 항-OspA 항체는 또한 생체내 이미지화를 위해 유용하다. 검출가능한 잔기로 표지된 항체는 특정 측면에서 동물의 혈류로 투여되고 숙주내 표지된 항체의 존재 및 위치를 분석한다. 다양한 측면에서 상기 항체는, 핵 자기 공명, 방사선학적 방법 또는 당업계에 공지된 다른 검출 수단에 의하든 상관없이 동물에서 검출가능한 임의의 잔기로 표지시킨다. 본 발명의 몇몇 측면에서, OspA 항체는 치료제로서 사용된다.

키메라 OspA 조성물 및 투여

본원에 기재된 OspA 키메라 폴리펩타이드를 피검체에 투여하기 위해, OspA 폴리펩타이드는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물중에 제형화한다. 상기 용어 "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"는 하기에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지된 경로를 사용하여 투여되는 경우 알레르기 또는 또 다른 역반응을 발생시키지 않는 분자 실체 및 조성물을 언급한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 피복물, 항세균 및 항진균 제제, 등장성 및 흡착 지연 제제 등을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 조성물은 물 또는 통상의 유기 용매와 용매화물을 형성한다. 상기 용매화물이 또한 포함된다.

본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 다양한 측면에서 경구로, 국소적으로, 경피로, 비경구로, 흡입 분무에 의해, 질내, 직장내 또는 두개내 주사에 의해 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은 상기 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 낭내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 특정 부위에서 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척추강내, 안구뒤쪽, 폐내 주사 또는 수술적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물은 필수적으로, 수용자에게 해로울 수 있는 다른 불순물뿐만 아니라 발열원이 없다.

약제학적 조성물의 제형(예를 들어, 용제, 에멀젼)은 선택된 투여 경로에 따라 다양하다. 투여될 조성물을 포함하는 적당한 조성물은 생리학적으로 허용되는 비히클 또는 담체중에서 제조한다. 용액 또는 에멀젼을 위해, 적합한 담체는 예를 들어, 식염수 및 완충 매질을 포함하는, 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멸젼 또는 현탁제를 포함한다. 몇몇 측면에서 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거 또는 비휘발성 오일을 포함한다. 특정 측면에서 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 방부제, 또는 유체, 영양물 또는 전해질 보충제를 포함한다.

활성 성분으로서 OspA 폴리펩타이드를 함유하는, 본 발명의 화합물 및 방법에 유용한 약제학적 조성물은 다양한 측면에서 투여 경로에 따라 약제학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 함유한다. 상기 담체 또는 첨가제의 예는 물, 약제학적으로 허용되는 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카복시비닐 중합체, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 나트륨 알기네이트, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 전분 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 크산탄 검, 아라비아 검, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 사람 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토스, 약제학적으로 허용되는 계면활성제 등을 포함한다. 사용되는 첨가제는 상기된 물질 또는 본 발명의 투여 형태에 따라 적절한 이의 배합물로부터 제한없이 선택된다.

다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글라이신, 또는 수성 현탁제는 다양한 측면에서 수성 현탁제의 제조를 위해 적합한 부형제와 혼합된 활성 화합물을 포함한다. 상기 부형제는 현탁 제제, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 몇몇 경우에, 분산 또는 습윤화 제제는 천연 포스파티드, 예를 들어, 렉시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 헵타데카에틸-엔옥시세탄올, 또는 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 몇몇 측면에서, 상기 수성 현탁제는 하나 이상의 방부제, 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 함유한다.

몇몇 측면에서, OspA 조성물은 저장을 위해 동결건조시키고 사용전에 적합한 담체중에서 재구성한다. 상기 기술은 통상적인 면역글로불린과 효과적인 것으로 나타났다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기술이 사용된다. 동결건조 및 재구성이 다양한 정도로 항체 활성 손실을 유발하고 사용 수준이 흔히 보상을 위해 조정된다는 것은 당업자가 인지하고 있다.

물의 첨가에 의해 수성 현탁제의 제조를 위해 적합한 분산성 산제 및 입제는 분산 또는 습윤화 제제, 현탁 제제 및 하나 이상의 방부제와 혼합된 활성 화합물을 제공한다. 적합한 분산 또는 습윤화 제제는 이미 상기 언급된 것들로 예시된다.

특정 측면에서, 이들 제형중 OspA의 농도는 광범위하고, 예를 들어, 약 0.5% 미만, 일반적으로 약 1중량% 이상 내지 15 또는 20중량% 정도의 많은 양이고 주로 선택된 특정 투여 방식에 따라, 유체 용적, 점도 등을 기준으로 선택된다. 따라서, 예를 들어, 제한 없이, 비경구 주사용의 전형적인 약제학적 조성물은 1ml의 멸균 완충수 및 50 mg의 혈액 응고 인자를 함유하도록 구성된다. 정맥내 주입용의 전형적인 조성물은 250ml의 멸균 링거 용액 및 150mg의 혈액 응고 인자를 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 공지되어 있거나 당업자에게 자명하고 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)에 상세히 기재되어 있다. 유효 투여량은 일반적으로 투여당 체중 kg당 0.01mg 내지 1000mg의 범위 내에 있다.

다양한 측면에서, 약제학적 조성물은 멸균 주사가능한 수성, 유성 현탁제, 분산제 또는 멸균 주사가능한 용제 또는 분산제를 즉시 제조하기 위한 멸균 산제의 형태이다. 몇몇 측면에서, 상기 현탁제는 상기 언급된 적합한 분산 또는 습윤화제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 바에 따라 제형화한다. 특정 측면에서, 상기 멸균 주사가능한 제제는 비독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매중 멸균 주사가능한 용제 또는 현탁제이고, 예를 들어, 1,3-부탄 디올중 용제이다. 몇몇 양태에서, 상기 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 이의 혼합물, 식물성 오일, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액을 함유하는 용매 또는 분산 매질이다. 추가로, 멸균된 비휘발성 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해, 다양한 측면에서, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드의 비휘발성 오일이 사용된다. 추가로, 올레산과 같은 지방산은 주사가능한 제제에 사용된다.

모든 경우에, 상기 형태는 멸균성이어야만 하고 용이한 주사능력이 존재할 정도로 유동성이어야만 한다. 적당한 유동성은 렉시틴과 같은 피복물을 사용하고, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하고 계면활성제를 사용함에 의해 유지된다. 이것은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야만 하고 미생물, 예를 들어, 세균 및 진균류의 오염 작용으로부터 보존되어야만 한다. 미생물 작용은 다양한 항세균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 예방된다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 측면에서, 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서 사용함에 의해 수행된다.

특정 측면에서 투여용으로 유용한 조성물은 취득 증진제 또는 흡수 증진제와 제형화됨으로써 이의 효능이 증가된다. 상기 증진제는 예를 들어, 살리실레이트, 글리코콜레이트/리놀레에이트, 글리콜레이트, 아프로티닌, 바시트라신, SDS, 카프레이트 등을 포함한다. 예를 들어, Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285, 1996) 및 Oliyai et al. (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544, 1993)을 참조한다.

추가로, 본 발명의 화합물 및 방법에 사용되는 조성물의 친수성 및 소수성의 성질은 잘 균형을 맞춤으로써 시험관내 및 특히 생체내 용도 둘다에 대한 이의 유용성이 증진되고 상기 균형이 없는 다른 조성물은 실질적으로 유용성이 떨어진다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 체내에서 흡수 및 생물유용성을 허용하는 수성 매질에서 적당한 용해도를 갖고 또한 화합물이 세포막을 통과하여 추정된 작용 부위에 도달하도록 허용하는 지질에서의 용해도를 갖는다.

특정 측면에서, 본원에 기재된 OspA 폴리펩타이드는 보조제를 포함하는 백신 조성물중에 제형화한다. 당업계에 공지된 임의의 보조제는 오일계 보조제, 예를 들어, 프룬트 완전 보조제 및 프룬트 불완전 보조제, 마이콜레이트계 보조제(예를 들어, 트레할로스 디마이콜레이트), 세균성 리포폴리사카라이드(LPS), 펩티도글리캔(즉, 뮤레인, 뮤코펩타이드 또는 당단백질, 예를 들어, N-오파카, 무라밀 디펩타이드[MDP] 또는 MDP 유사체), 프로테오글리캔(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)로부터 추출된), 스트렙토코커스 제제(예를 들어, OK432), Biostim™ (예를 들어, 01K2), EP 109 942, EP 180 564 및 EP 231 039의 "Iscoms", 수산화알루미늄, 사포닌, DEAE-덱스트란, 중성 오일(예를 들어, 미글리올), 식물성 오일(예를 들어, 아라키스 오일), 리포좀, Pluronic® 폴리올, 리비 보조제 시스템(예를 들어, GB-A-2 189 141 참조), 또는 인터류킨, 특히 세포 매개 면역을 자극하는 것들을 포함하는, 다양한 측면의 백신 조성물중에 사용된다. 액티노마이세탈레스(Actinomycetales) 강내 아미콜라타(Amycolata) 세균 속의 추출물로 이루어진 또 다른 보조제가 미국 특허 제4,877,612호에 기재되어 있다. 추가로, 등록 상표의 보조제 혼합물이 시판되고 있다. 사용되는 보조제는 부분적으로 수용 피검체에 따라 다양하다. 보조제의 투여량은 피검체의 유형 및 크기에 따라 다양하다. 최적의 투여량은 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정된다.

상기 백신 조성물은 임의로, 약제학적 비히클, 부형제 또는 매질로서 작용하는 백신-혼화성의 약제학적으로 허용되는 (즉, 멸균 및 비-독성) 액체, 반고체 또는 고체 희석제를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 희석제가 사용된다. 예시적인 희석제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 마그네슘 스테아레이트, 메틸- 및 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 알기네이트, 전분, 락토스, 슈크로스, 덱스트로스, 소르비톨, 만니톨, 아카시아 검, 인산칼슘, 미네랄 오일, 코코아 버터 및 테오브로마의 오일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

상기 백신 조성물은 전달을 위해 간편한 형태로 팩키징된다. 상기 조성물은 캡슐, 카플렛, 사켓, 카쉐트, 젤라틴, 종이 또는 다른 컨테이너에 밀봉된다. 이들 전달 형태는 면역원성 조성물이 수용자 기관으로 진입시 혼화성이고 특히 면역원성 조성물이 단위 투여 형태로 전달되는 경우 바람직하다. 상기 투여 단위는 예를 들어, 정제, 캡슐, 좌제, 바이엘 또는 카쉐트에 팩키징된다.

본 발명은 본원에 기재된 유효량의 OspA 조성물을 투여함을 포함하는, 포유동물 숙주내 OspA 항체를 포함하여 피검체내 면역학적 반응을 유도하기 위한 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 피검체내에서 보렐리아 감염 또는 라임 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에 기재된 유효량의 백신 조성물을 피검체에게 투여하는 단계를 포함한다.

상기 백신 조성물은 상기에 상세하게 기재된 바와 같은 임의의 방법에 의해 면역화되도록 피검체로 도입된다. 특정 측면에서, 상기 조성물은 일정 기간동안 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여된다(하기에서 보다 상세하게 기재됨).

키메라 OspA 조성물의 투여/면역학적 반응을 유도하기 위한 방법

투여될 면역원성 조성물 또는 백신 조성물의 유용한 용량은 약물의 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예를 들어, 피검체의 연령, 병태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간, 투여 방식 및 다른 임상적 인자에 따라 다양하다.

몇몇 측면에서, 본 발명의 제형 또는 조성물은 일정 시간이 경과된 후 처음에 볼러스(bolus)에 이어서 부스트 전달에 의해 투여된다. 특정 측면에서, 본 발명의 제형은 처음에 볼러스에 이어서 약물 제품의 치료학적 순환계 수준을 유지하기 위한 연속적 주입에 의해 투여된다. 특정 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 다양한 시간 후 백신 접종 계획으로 투여된다. 몇몇 측면에서, 백신은 보렐리아 감염되기 쉬운 지역으로 여행하는 여행자를 위해 급속한 면역 계획으로 전달된다. 또 다른 예로서, 본 발명의 조성물 또는 제형은 1회 용량으로 투여된다. 당업자는 개별 피검체의 우수한 의학적 관행 및 임상적 병태에 의해 결정된 바와 같이 유효 용량 및 투여 계획을 용이하게 최적화한다. 투여 횟수는 제제의 약리역학적 파라미터 및 투여 경로에 따라 다양하다.

상기 약제학적 제형은 투여 경로 및 목적하는 용량에 따라 당업자가에 의해 결정된다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 페이지 1435-1712를 참조하고 이의 내용은 본원에 참조로서 인용된다. 몇몇 경우에 상기 제형은 투여된 조성물의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출율 및 생체내 제거율에 영향을 미친다. 투여 경로에 따라, 특정 측면에서 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 적합한 용량이 계산된다. 몇몇 측면에서, 적당한 용량은 적당한 용량 반응 데이타와 연계하여 혈액 수준 용량을 결정하기 위해 확립된 분석을 통해 확인된다. 특정 측면에서, 개인의 항체 역가는 최적의 용량 및 투여 계획을 결정하기 위해 측정된다. 최종 용량 계획은 담당의 또는 내과의가 약제학적 조성물의 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예를 들어, 조성물의 특이적 활성, 피검체의 반응, 피검체의 연령, 병태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 중증도 또는 악성 병태, 투여 시간 및 다른 임상적 인자를 고려하여 결정한다. 연구가 수행됨에 따라, 관련 병태의 예방 및/또는 치료를 위한 적당한 용량 수준 및 치료 지속시간에 관한 추가의 정보가 나타날 것이다.

특정 측면에서, 상기 OspA 면역원성 또는 백신 조성물은 피검체내에서 면역 반응을 유발하기에 충분한 임의의 용량의 OspA 핵산 분자(들) 또는 폴리펩타이드(들)을 포함한다. 치료학적으로 사용될 OspA 면역원성 또는 백신 조성물의 유효량은 예를 들어, 치료학적 사항 및 목적에 따라 다양하다. 당업자는 백신 접종 또는 치료를 위한 적당한 용량 수준이 부분적으로 전달될 분자, OspA 분자(들)가 사용되는 징후, 투여 경로 및 환자의 크기(체중, 체표면적 또는 기관 크기) 및 조건(연령 및 일반적 건강 상태)에 따라 다양하다. 따라서, 몇몇 경우에, 임상의는 용량을 적정하고 투여 경로를 변형시켜 최적의 치료학적 효과를 수득한다.

다양한 측면에서 전형적인 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 이상의 범위이다. 다른 양태에서, 상기 용량은 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 5 μg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 OspA 폴리펩타이드의 용량은 대략적으로 10μg/ml, 20μg/ml, 30μg/ml, 40μg/ml, 50μg/ml, 60μg/ml, 70 μg/ml, 80μg/ml, 90μg/ml, 100μg/ml, 110μg/ml, 120μg/ml, 130μg/ml, 140μg/ml, 150μg/ml, 160μg/ml, 170μg/ml, 180μg/ml, 190μg/ml, 200μg/ml, 210μg/ml, 220μg/ml, 230μg/ml, 240μg/ml, 250μg/ml, 260μg/ml, 270μg/ml, 280 μg/ml, 290μg/ml, 300μg/ml, 320μg/ml, 340μg/ml, 360μg/ml, 380μg/ml, 400μg/ml, 420μg/ml, 440μg/ml, 460μg/ml, 480μg/ml, 500μg/ml, 520μg/ml, 540μg/ml, 560μg/ml, 580μg/ml, 600μg/ml, 620μg/ml, 640μg/ml이다. 특정 측면에서, 전형적인 용량은 피검체당 0.1 내지 5.0ml를 포함한다. 보다 특정 측면에서, 전형적인 용량은 피검체당 0.2 내지 2.0ml를 포함한다. 특정 측면에서, 용량은 피검체당 0.5 내지 1.0 ml를 포함한다.

투여 횟수는 사용되는 제형중에 OspA 분자의 약리역학적 파라미터에 의존한다. 전형적으로, 임상의는 목적하는 효과를 성취하는 용량에 도달할 때까지 조성물을 투여한다. 따라서 다양한 측면에서 상기 조성물은 단일 용량으로서 또는 시간 경과에 따라 2회 이상의 용량(목적하는 분자의 동일량을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여된다. 적당한 용량의 추가의 조정은 통상적으로 당업자에 의해 수행되고 당업자에 의해 통상적으로 수행되는 작업 범위내에 있다. 적당한 용량은 흔히 통상적으로 수득되는 적당한 용량-반응 데이터를 사용하여 확인한다.

키트

추가의 측면으로서, 본 발명은 피검체 투여용으로 이들의 사용을 촉진시키는 방식의 팩키징된 형태로, OspA 폴리펩타이드(들)를 피검체에게 투여하기 위한 하나 이상의 약제학적 제형을 포함하는 키트를 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명은 단일 용량 투여 단위를 제조하기 위한 키트를 포함한다. 다양한 측면에서 키트 각각은 건조된 단백질을 갖는 제1 컨테이너 및 수성 제형을 갖는 제2 컨테이너 둘다를 함유한다. 또한 본 발명의 범위내에 단일 및 다중 챔버의 미리 충전된 시린지(예를 들어, 액체 시린지 및 동결건조된 시린지)를 함유하는 키트가 포함된다.

또 다른 양태에서, 상기 키트는 밀봉된 병 또는 용기와 같은 컨테이너에 팩키징된, 본원에 기재된 약제학적 제형(예를 들어, 치료학적 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물)을 포함하고 상기 컨테이너에 표지가 부착되어 있거나 방법을 수행하는데 있어서 화합물 또는 조성물의 용도를 기재하는 팩키지에 포함된다. 하나의 양태에서, 상기 약제학적 제형은 컨테이너내에 팩키징되어 컨테이너내 상부 공간의 양(예를 들어, 액체 제형과 컨테이너 상부 사이의 공기의 양)이 매우 작도록 한다. 바람직하게, 상부 공간의 양은 무시할만하다(즉 거의 없음).

하나의 측면에서, 상기 키트는 치료학적 단백질 또는 펩타이드 조성물을 갖는 제1 컨테이너 및 상기 조성물에 대한 생리학적으로 허용되는 재구성 용액을 갖는 제2 컨테이너를 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 약제학적 제형은 단위 용량 형태로 팩키징된다. 상기 키트는 특정 투여 경로에 따라, 약제학적 제형을 투여하기 위해 적합한 장치를 임의로 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 키트는 약제학적 제형의 용도를 기재하는 표지를 함유한다.

본원에 인용된 각각의 공보, 특허 출원, 특허문헌 및 기타 문헌은 이의 전반적인 내용이 본원의 기재에 불일치 하지 않는 정도로 본원에 참조로서 인용된다.

본원에 기재된 실시예 및 양태는 단지 설명을 목적으로 하는 것이고 이의 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 수 있어 본원의 취지 및 범위 및 첨부된 특허청구범위의 범위내에 포함되는 것으로 이해되어야만 한다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 문헌 및 특원 출원은 이들의 전반적인 내용이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 인용된다.

실시예

본 발명의 추가의 측면 및 세부사항은 하기의 실시예로부터 명백해질 것이고 이것은 제한하려하는 것이 아니라 설명을 목적으로 의도된다.

실시예 1:

OspA 백신 제형의 결정을 위한 유럽 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토 균주 기원의 OspA의 서열 분석(분자 역학)

연구의 목적은 유럽에서의 라임 질환 OspA 백신을 위해 적합한 제형을 결정하는 것이다. 상기 연구는 유럽의 광범위한 지정학적 커버리지, 질환과 관련된 다양한 임상적 증후군 및 라임 질환과 관련된 3개의 병원성 동유전자종(비. 아프젤리, 비. 가리니 및 비. 부르그도르페리 에스.에스) 각각을 대표하는 비. 부르그도르페리 센수 라토의 크고 다양한 균주 수거물로부터 기원하는 OspA 유전자의 서열 분석(분자 역학)을 근거로 하였다. 라임 질환은 총 13개의 동유전자종을 포함하고 이중 3개(비. 아프젤리, 비. 가리니, 비. 부르그도르페리 에스.에스)가 사람에서 병원성인 것으로 인지되는 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토에 의해 유발된다.

처음에, 유럽의 21개 국가의 라임 질환을 앓는 환자(및 진드기로부터)로부터 기원하는 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토 균주를 평가하는 대규모 역학적 연구(하기 표 3 참조)를 수행하였다. 16개 유럽 국가로부터 수거된 총 553개의 유럽 보렐리아 분리물을 연구하였다. 각각의 종은 각각의 종의 16s rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용한 PCR로 결정하였다.

유럽에서 사람 라임 질환을 유발하는 것으로 공지된 3개의 보렐리아 종 각각으로부터 기원하는 분리물이 확실히 제공되었다: 비. 아프젤리(n=309, 55.9%), 비. 부르그도르페리 센수 라토 스트릭토(n=67, 12.1%), 및 비. 가리니 (n=173, 31.3%). 359명의 사람 분리물중 56.8%는 비. 아프젤리이고 비. 아프젤리는 대부분의 지역내 사람 분리물로부터 결정된 주요 종이었다. 유사하게, 비. 아프젤리는 진드기 분리물 54.1%로부터 분리되었다. 비. 부르그도르페리 에스.에스.는 사람 균주 중 11.7% 및 진드기 분리물중 12.9%로부터 분리되었다. 비. 부르그도르페리 에스.에스.는 남동 유럽, 특히 이탈리아, 헝가리, 슬로베니아 및 오스트리아 기원의 사람 분리물로부터 분리되었다. 비. 가리니 균주는 사람 분리물 30.4%로부터 분리되었고 진드기 분리물의 33%를 차지하였다. 사람 및 진드기 기원의 비. 가리니 균주는 유럽 전반의 지정학적 지역 대부분으로부터 수득되었다. 본 연구로부터의 상기 데이타는 다른 유럽 연구로부터 제공된 데이타와 상호관련이 있었고 연구된 수거 분리물이 유럽에서 라임 질환의 정확한 양태를 대표함을 제안한다.

OspA 서열 분석은 유럽용의 최적의 백신 제형을 결정하기 위해 수행하였다. 상기 데이타를 기준으로, OspA 1형 내지 6형을 포함하는 백신은 상기 균주의 98.1% 및 공격적 질환 사례의 96.7%를 차지한다. 유럽 보렐리아 분리물의 역학적 연구 결과는 OspA 1형, 2형, 3형, 4형, 5형 및 6형을 기본으로 하는 백신이 유럽에서 이론적으로 라임 질환의 98% 및 공격적 신경보렐리아증 분리물의 96.7%를 포괄함을 지적한다.

[표 3]

¹다수의 분리물을 기초로 하는 예측된 백신 커버리지; 전체 값은 누적값이다.

²신경보렐리아증 사례 기원의 분리물의 예측된 백신 커버리지; 전체 값은 누적값이다.

따라서, 각각 2개의 OspA 혈청형을 대표하는 3개의 신규 재조합 OspA(1/2, 6/4 및 5/3)을 포함하는 백신은 유럽에서 라임 보렐리아증과 관련된 모든 6개의 만연된 OspA 혈청형(1-6) 및 미국에서 라임 보렐리아증과 관련된 단일 OspA 혈청형으로부터의 보호를 위해 필요한 주요 구조적 요소를 보유한다.

비. 가리니 OspA 혈청형 5 및 3을 나타내는 OspA 5/3 작제물의 내포(OspA 혈청형 1/2 및 6/4와 함께)는 질환의 98.1% 및 공격적 분리물의 96.7%에 대해 보호해야만 한다. OspA 5/3이 없는 백신은 단지 질환의 약 88.9% 및 공격적 질환의 약 73.4%에 대해서만 보호할 것으로 예상된다. 따라서, 모든 6개의 혈청형을 포함하는 백신이 단지 4개의 혈청형을 갖는 백신 보다 라임 질환의 예방에서 보다 효과적이다.

실시예 2:

지질화된 OspA를 암호화하는 합성 OspA 유전자의 작제를 위한 전략

상기 연구의 목적은 수개의 보렐리아 균주 기원의 지질화된 OspA 키메라 작제물을 제조하여 임의의 상기 수개의 보렐리아 균주에 의해 유발되는 라임 질환으로부터 수용자를 보호하는 백신을 제조하는 것이다. 상기 일반적인 전략은 도 1에 요약되어 있고 하기에 기재한다.

각각의 신규한 OspA 유전자에 대해, 30-60개 염기 사이의 4개 세트의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 각각의 올리고뉴클레오타이드는 8-12개의 상보적 중첩 올리고뉴클레오타이드로 이루어졌다. 각각의 세트 기원의 올리고뉴클레오타이드는 별도의 실험에서 함께 어닐링하여 말단 어느 한쪽에 특이적 제한 효소 인지 부위를 갖는 이중가닥 DNA 단편, 즉, 단편 N-H (Nde I - Hind III), H-K (Hind III - Kpn I), K-E (Kpn I - EcoR I) 및 E-B (EcoR I - BamH I)를 제조하였다. 4개 단편의 각각은 독립적으로, 상응하는 제한 효소로 절단된 pUC18에 클로닝시키고 이. 콜리 숙주 DH5α를 형질전환시키고 이후 클로닝된 단편의 서열을 확인하였다.

이. 콜리 균주 DH5α [유전자형: 말단 A1 hsdR17 (r_k ^-m_k ⁺) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nal^r) relA1 △(lacZYA-argF)U169 deoR (Φ80dlac△(lacZ)M15] (Gibco BRL)를 모든 중간 클로닝 단계를 위해 사용하였다. 상기 균주는 이. 콜리 균주 K12 로부터 기원하고 상기 균주는 유전자 가공 기술에서 가장 광범위하게 사용되는 숙주 중 하나이다. 상기 균주는 amp^-이고 앰피실신 내성 유전자(amp)를 함유하는 벡터를 갖는 형질전환제의 선별을 가능하게 한다. 이. 콜리 HMS174(DE3)는 발현용 숙주로서 선택하였다. 이. 콜리 HMS174(DE3) 숙주 세포[유전자형: F-recA1 hsdR (r_k12 ^- m_k12 ⁺) Rif^R (DE3)] (Novagen)을 최종 클로닝 단계를 위해 사용하였다. 상기 균주는 kan^-이어서 가나마이신 내성 유전자(kan)를 함유하는 벡터를 갖는 형질전환체의 선별을 가능하게 한다.

pUC18 (Gibco BRL, Basel, Switzerland)는 유전자 조작 및 서열분석이 pET30a 보다는 상기 플라스미드를 사용하는 것이 용이하기 때문에 모든 중간 단계를 위해 클로닝 벡터로서 사용하였다. 주요 특징은 명백하게 149번 내지 469번 염기쌍 기원의 LacZ 알파 펩타이드를 암호화하는 lacZ 유전자 단편(염기쌍 507번에서 lac 프로모터), 1629번 내지 2486번 염기쌍 기원의 앰피실린 내성 결정인자를 암호화하는 bla 유전자(2521번 염기쌍에서 bla 프로모터), 867번 염기쌍에서 복제 오리진 및 염기쌍 185번 내지 451번 기원의 다중 클로닝 부위이다(도 12).

pET30a (Novagen)은 최종 완전한 OspA 유전자 삽입체를 위한 발현 벡터로서 사용하였다. pET 벡터에서 유전자는 T7 프로모터의 조절하에 있도록 클로닝하였고 발현은 숙주 세포내 T7 RNA 폴리머라제 공급원을 제공함에 의해 유도하였다(T7 RNA 폴리머라제의 공급원이 제공될때까지 어떠한 발현도 일어나지 않음). 기본적 특징은 4048번 내지 4860번 염기쌍에서 가나마이신 내성(kan)을 암호화하는 유전자, lacl 유전자 염기쌍 826-1905번, 염기쌍 4956-5411번에서의 F1 복제 오리진 및 염기쌍 158번 내지 346번 기원의 다중 클로닝 부위이다(도 13).

전장 OspA 유전자를 제조하기 위해 요구되는 4개의 단편들은 DNA 미니프렙으로부터 절단하였다. DNA는 본래의 클로닝 단계를 위해 사용되는 동일한 제한 효소를 사용한 4개의 클론 각각으로부터 분리하였다. 상기 DNA 단편을 정제하고 NdeI 및 BamH I 절단된 pUC18 DNA와 함께 연결하고 이. 콜리 DH5α 컴피턴트 세포를 형질전환시켰다. pUC18에 클로닝된 전장 OspA 유전자를 서열분석하여 어떠한 오류도 상기 단계에서 도입되지 않았음을 확인하였다.

이어서 상기 OspA 유전자를 제한 효소 Nde I 및 BamH I를 사용하여 pET-30a 발현 벡터에 서브클로닝하고 이. 콜리 숙주 HMS174(DE3)를 형질전환시켰다. 상기 pET30a 벡터에서, 상기 OspA 유전자는 박테리오파아지 T7 프로모터로 조절한다.

3개의 합성 OspA 유전자가 보렐리아의 혈청형 1 및 2 OspA (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 혈청형 6 및 4 OspA (lipB sOspA 6/4) 및 혈청형 5 및 3 OspA (lipB sOspA 5/3) 기원의 보호 에피토프를 갖는 OspA 분자를 암호화하도록 디자인하였다. 이들 분자의 1차 아미노산 서열 (각각 서열번호: 2, 4, 및 6)은 도 2-8에 나타내고 이들의 디자인으로 혼입된 주요 특징에 대한 전체 기재와 함께 본원에 기재된다.

lipB sOspA 1/2 작제물에 대한 올리고뉴클레오타이드는 ABI 394 DNA/RNA 합성기를 사용하여 실험실에서 합성하였다. lipB sOspA 5/3 및 lipB sOspA 6/4 작제물에 대한 올리고뉴클레오타이드는 GenXpress (Wiener Neudorf, Austria)으로부터 구입하였고 HPLC 정제하였다.

[표 4]

* 단일 아미노산 변화는 PCR에 의해 도입되었고 lipB sOspA 1/2는 도입된 변화전에 작제물의 명칭이고 lipB sOspA 1/2²⁵¹은 도입된 변화 후 명칭이다.

L은 올리고뉴클레오타이드 염기 길이이다.

S는 가닥이고, C는 (암호화) 또는 상보적(C')임을 나타낸다.

[표 5]

L은 올리고뉴클레오타이드 염기 길이이고,

S는 가닥이고, C는 (암호화) 또는 상보적(C')임을 나타낸다.

[표 6]

L은 올리고뉴클레오타이드 염기 길이이고,

S는 가닥이고, C는 (암호화) 또는 상보적(C')임을 나타낸다.

이. 콜리 컴피턴트 세포의 제조. 단일 콜로니를 사용하여 5ml의 변형된 LB 브로쓰(물 리터 당 5.5g NaCl, 5g 효모 추출물, 동물 또는 유전학적으로 변형된 식물 공급원으로부터 수득되지 않은 10g의 대두 펩톤)에 접종하였다. 상기 배양물은 혼탁될 때까지 배양하였고, 이후 상기 배양물을 미리 가온된 변형된 LB 브로쓰로 25ml의 용적으로 희석하였다. 상기 배양물을 이것이, 0.2 내지 0.6의 OD600nm 값에 도달할 때까지(40-60분) 배양하고 125ml의 용적으로 희석하고 500ml의 플라스크에 전달하고 0.6의 OD600nm 값에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 배양물을 빙욕조에서 5분 동안 약한 진탕에 의해 신속하게 냉각시키고 상기 세포를 직접적으로 펠렛화하였고(벡크만 원심분리(Beckman centrifuge), 10분 동안 4000 rpm), TfBI 완충액(Teknova Hollister, CA) (30 mM K-아세테이트, 50 mM MnCl₂, 100 mM KCl, 10 mM CaCl₂ 15% 글리세롤)으로 주의깊게 세척하고, 5ml의 TfBII (10 mM Na-MOPS, 75 mM CaCl₂, 10 mM KCl, 15% 글리세롤)중에 재현탁시키고 15분 동안 빙상에 유지시켰다. 상기 세포를 이어서 100 ㎕의 적정액으로 피펫팅하고 무수 빙상에서 직접적으로 순간 냉동시켰다.

OspA 유전자 단편을 형성하기 위한 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 어닐링 (드 노보 합성). 3개의 합성 OspA 유전자가 혈청형 1 및 2 OspA (lipB sOspA 1/2), 혈청형 6 및 4 OspA (lipB sOspA 6/4) 및 혈청형 5 및 3 OspA (lipB sOspA 5/3) 기원의 보호 에피토프를 갖는 OspA 분자를 암호화하도록 디자인하였다. 각각의 신규한 OspA 유전자(지질화된)에 대한 30-60개 염기쌍의 4개 세트의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다(표 4-6 참조). 도 16-18은 공개된 서열로부터 예측된 뉴클레오타이드 서열과 정렬된 각각의 작제물에 대한 코돈 최적화된 서열을 보여준다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 세트는 8-12개 상보적 중첩 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다. 각각의 세트 기원의 올리고뉴클레오타이드는 별도의 실험에서 함께 어닐링하여 말단 어느 하나에 특이적 제한 효소 인지 부위를 갖는 이중 가닥의 DNA 단편, 즉, 단편 N-H (Nde I - Hind III), H-K (Hind III -Kpn I), K-E (Kpn I - EcoR I) 및 E-B (EcoR I - BamH I)를 제조하였다.

상기 동결건조된 올리고뉴클레오타이드는 증류수로 재구성하였고, OD260nm 값을 측정하고 농도를 10 μΜ로 조정하였다. 각각의 OspA 단편에 대해, 2㎕의 각각의 올리고뉴클레오타이드를, 1㎕의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 T4 DNA 리가제 완충액(10x)과 함께 혼합하고 상기 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온처리하여 올리고스가 인산화되도록 하였다(lipB sOspA 6/4 작제물에 대해서는 이러한 단계를 생략하였는데 그 이유는 상기 올리고스가 이미 인산화되어 있기 때문이다). 상기 혼합물을 1분 동안 95℃로 가열하고(변성 단계) 이어서 상기 혼합물이 실온으로 서서히 냉각되도록 방치하므로써 올리고스가 어닐링되도록 하였다. 상기 어닐링된 혼합물을 직접 연결에 사용하거나 추후 요구될 때까지 -20℃에서 저장하였다.

OspA 유전자 단편의 클로닝 . 개별 합성 OspA 유전자를 작제하기 위해 요구되는 4개의 단편 각각을 독립적으로 pUC18에 클로닝하고 이. 콜리 숙주 DH5α를 형질전환시켰다(도 1 참조).

각각의 신규 OspA 유전자에 대한 30-60개 염기쌍의 4개 세트의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 세트는 8-12개의 상보적 중첩 올리고뉴클레오타이드로 이루어졌다. 각각의 세트 기원의 올리고뉴클레오타이드를 함께 별도의 실험에서 어닐링하여 말단 어느 하나에서 특이적인 제한 효소 인지 부위를 갖는 이중 가닥 DNA 단편, 즉, 단편 N-H (Nde I - Hind III), H-K (Hind III - Kpn I), K-E (Kpn I - EcoR I) 및 E-B (EcoR I - BamH I)를 제조하였다. 네(4)개의 단편 각각을 독립적으로 상응하는 제한 효소로 절단된 pUC18에 클로닝하고 이. 콜리 숙주 DH5α를 형질전환시키고 이후 클로닝된 단편의 서열을 확인하였다.

플라스미드 DNA(pUC18)를, 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAGEN 플라스미드 정제 시스템을 사용하여 밤새 이. 콜리 배양물(LB 브로쓰)로부터 정제하였다. 벡터 DNA는 이어서 제한 효소 쌍; Nde I 및 Hind III, Hind III & Kpn I, Kpn I & EcoRI, EcoR I & BamH I로 제조업자의 프로토콜에 따라 분해하였다. 상기 분해된 샘플을 0.8% 아가로스 겔에 적용하여 전기영동으로 분리하였다. 상기 선형화된 벡터 DNA를 절단하고 제조업자의 프로토콜에 따라 상업적 겔 용출 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen)를 사용하여 용출시키고 T4 DNA 리가제를 사용하여 상기 어닐링된 올리고뉴클레오타이드 혼합물에 연결하였다. 상기 연결 생성물로 이. 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포를 형질전환시키고 상기 플라스미드를 함유하는 형질전환체를 앰피실린 (100 μg/ml) 함유 LB 한천상에서 선별하였다.

클로닝 벡터, pUC18에서 예상된 크기를 갖는 삽입체의 존재는 플라스미드 DNA를 정제하고 상기 DNA를 클로닝을 위해 사용되는 효소로 분해하고 상기 DNA 단편을 이전에 기재된 과정을 사용하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하여 확인하였다. 상기 클로닝된 DNA 단편은 DNA 주형으로서 정제된 플라스미드 DNA 및 서열분석 프라이머 5'-TCGGGGCTGGCTTAACTATG-3' (서열번호: 14) 및 5'-GCTTCCGGCTCGTAT (서열번호: 15) (이는 다중 클로닝 부위, 각각 bp 130-150 및 bp 530-515 외부의 pUC18 벡터에 존재한다)를 사용하여 서열분석하였다. 서열 반응물은 자동화 서열분석기(ABI 310)상에서 전개하였다. 서열은 서열편집기를 사용하여 편집하고 서열을 분석용 벡터 NTI에 도입하였다. 올바른 서열을 갖는 클론만을 전장의 OspA 유전자를 작제하기 위한 빌딩 블록으로 사용하였다.

lipB sOspA 5/3 유전자에 대해서는, 어떠한 적합한 고유 내부 부위가 Kpn I - BamH I 단편에서 발견될 수 없고 아미노산 서열이 내부 EcoR I 부위의 사용을 허용치 않기 때문에 상이한 전략을 사용하였다(도 14 참조). Pvu II 부위는 Kpn I - BamH I 단편내에 존재하지만 pUC18 벡터에는 2개의 Pvu II 부위가 존재하고 이것은 pUC18내 단편의 직접적인 클로닝은 가능하지 않음을 의미한다. 따라서, 상기 작제물에 대한 올리고스는 EcoR I 부위가 Pvu II 부위의 외부 및 이에 인접한 부위에 삽입되도록 디자인하여 Kpn I - EcoR I 및 EcoR I - BamH I 단편이 pUC18에 클로닝되도록 하였다. Kpn I, EcoR I 및 BamH I를 사용한 상기 삽입된 단편의 후속적 분해로 단편을 제조하였고 상기 단편은 이어서 Pvu II로 분해하였다. 상기 Pvu ll-분해된 단편(Kpn I -Pvu II 및 Pvu II- BamH I)을 이어서 Kpn I 및 BamH I로 절단된 pUC18 벡터 DNA와 함께 3중 연결에 사용하여 Kpn I - BamH I 단편을 제조하였다.

전장 OspA 유전자의 작제 . 다음 단계에서, 개별 합성 OspA 유전자를 작제하기 위해 요구되는 4개 단편의 각각을 pUC18 벡터로부터 절단하고 1단계로 pUC18 벡터에 재클로닝시켜 전장 OspA 유전자를 제조하였다(도 1 참조).

전장 유전자를 제조하기 위해 요구되는 4개의 단편을 미니프렙으로부터 절단하였다. DNA는 본래의 클로닝 단계를 위해 사용된 것과 동일한 제한 효소를 사용하여 분리하였다. 상기 분해된 샘플을 아가로스 겔에 적용하고 전기영동으로 분리하였다. 각각의 4개의 삽입체 단편의 각각에 대한 DNA를 절단하고 제조업자의 프로토콜에 따라 시판되는 겔 용출 키트(QiaQuick 겔 추출 키트)를 사용하여 용출하고 T4 DNA 리가제를 사용하여 Nde I 및 BamH I로 분해된 선형화된 벡터 DNA에 연결하고 QIAquick 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 상기 연결된 DNA로 이. 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포를 형질전환시키고 상기 플라스미드를 함유하는 클론을, 앰피실린 (100 μg/ml)을 함유하는 LB 한천상에서 선별하였다. 콜로니는 예상된 크기(대략적으로 830bp)의 삽입체의 존재에 대해 PCR로 스크리닝하였다.

단일 콜로니를 10X 완충액 (15 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂), 200 μΜ dNTP, 1.25 U Amplitaq DNA 폴리머라제, 400 nM의 정배향 프라이머 5'-TCGGGGCTGGCTTAACTATG -3 (서열번호: 14) 및 400 nM의 역배향 프라이머 5'-GCTTCCGGCTCGTAT (서열번호: 15)를 포함하는 PCR 반응에서 주형 DNA로서 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다; 5분 동안 94℃, 35 x (30초 동안 94℃, 30초 동안 48℃, 1분 30초 동안 72℃)에 이어서 5분 동안 72℃에서 담금 및 4℃에서 유지. PCR 생성물은 직접 사용하거나 추가로 사용시 때까지 15℃ 이하(≤15℃)에서 보관하였다. PCR 생성물은 올바른 크기(대략적으로 980 bp)의 삽입체의 존재에 대해 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 올바른 크기의 삽입체를 서열분석하여 어떠한 오류도 도입되지 않았음을 확인하였고, 즉, 서열 반응은 밤새 배양물(LB amp 브로쓰)로부터 분리된 플라스미드 DNA(QIAGEN 플라스미드 정제 키트)를 사용하고 상기 클로닝 부위 (5'-TCGGGGCTGGCTTAACTATG-3'(서열번호: 14) 및 5'-GCTTCCGGCTCGTATGTTGT-3' (서열번호: 16), 각각 bp 130-150 및 530-510)를 플랭킹하는 서열분석 프라이머를 사용하여 설정하였다. 서열 반응은 자동화 서열분석기(ABI 310) 상에서 전개하였다. 서열은 서열편집기를 사용하여 편집하고 상기 서열은 분석용 벡터NTI로 삽입하였다.

신규 OspA 유전자의 pET30a 발현 벡터로의 서브- 클로닝 . 일단 전장 OspA가 pUC18내에서 확인되면, 이어서 상기 OspA 유전자를 제한 효소 NdeI 및 BamH I를 사용하여 pET-30a 발현 벡터에 서브클로닝하고 이. 콜리 숙주 HMS 174(DE3)를 형질전환시켰다.

올바른 서열을 갖는 pUC18 클론 기원의 미니프렙 DNA를 Nde I 및 BamH I로 분해하였다. 유사하게 pET30a 벡터 DNA를 Nde I 및 BamH I로 분해하였다. 상기 분해된 DNA를 아가로스 겔 상에서 전개하고 전기영동적으로 분리하였다. 대략적으로 830bp의 삽입체 단편 및 선형된 벡터 DNA를 절단하고 이전에 기재된 바와 같이 정제하였다. 상기 벡터 및 삽입체 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결하고 상기 연결 생성물로 이. 콜리 HMS174(DE3)(Novagen)의 컴피턴트 세포를 형질전환시켰다. 상기 형질전환체는 가나마이신 (30 μg/ml)을 함유하는 LB 플레이트상에 도말하였다. 단일 콜로니를, 프라이머 5'-TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG-3' (서열번호: 17) 및 5'-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT-3' (서열번호: 18)을 사용하는 PCR로 스크리닝하였다. PCR 생성물은 아가로스 겔에 적용하고 전기영동으로 분리하였다. 올바른 크기(대략적으로 1kb)의 생성물을 생산하는 콜로니를 후속적으로 사용하여 밤새 배양물을 설정하였고 이로부터 미니프렙 DNA를, 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAGEN 플라스미드 정제 키트를 사용하여 분리하였다. 상기 서열은 (프라이머 5'-TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG-3'(서열번호: 17) 및 5'-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT-3' (서열번호: 18), 각각 bp 65-86 및 395-373을 사용하여) 다시 확인하였고 콜로니는 발현 시험을 위해 선별하였다.

lipB sOspA 1/2로부터 lipB sOspA 1/2 ²⁵¹ 의 제조. 단일 아미노산을 lipB sOspA 1/2 작제물에서 변화시켰고, 즉, 251번 위치에서 아미노산 알라닌을 아스파라긴 잔기로 변화시켜 면역원성을 증진시켰다. 상기 아미노산 변화는 PCR로 도입하였다. 처음에, PCR은 외부 정배향 프라이머 및 내부 역배향 프라이머로 설정하여 도입된 아미노산 변화를 갖는 약 730bp의 생성물을 생성시켰다(도 15 참조). 두번째로, PCR은 내부 정배향 프라이머 및 외부 역배향 프라이머로 설정하여 도입된 아미노산 변화를 함유하는 100bp의 생성물을 생성시켰다. 이어서 서열이 중첩된 2개의 PCR 생성물을, 외부 정배향 및 외부 역배향 프라이머를 사용한 최종 PCR 반응에서 주형 DNA로서 사용하여 도입된 아미노산 변화를 함유하는 최종 전장 OspA 생성물을 생성시켰다.

상기 pET30a 작제물은 주형 DNA의 공급원으로서 사용하였다. PCR 반응은 10X 완충액[15 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2], 200 μm dNTP, 1.25 U Amplitaq DNA 폴리머라제, 및 400 nM의 각각의 프라이머 쌍(프라이머 쌍 5'- GGA ATT CCA TAT GCG TCT GTT GAT CGG CT (서열번호: 19) & 5'- TTG GTG CCT GCG GAG TCG (서열번호: 20) 및 프라이머 쌍 5'- AAT ACG ACT CCG CAG GCA CC (서열번호: 21) & 5'-CTG-GGA TCC GCT CAG CTT ATT TCA (서열번호: 22))을 포함하도록 설정하였다. PCR 반응은 하기의 조건을 사용하여 설정하였다; 5분 동안 94℃, 35 x (30초 동안 94℃, 30초 동안 48℃, 1분 30초 동안 72℃)에 이어서 5분 동안 72℃에서 담금 및 4℃에서 유지. 상기 반응으로 2개의 별도의 중첩 생성물을 생성하고 2개의 생성물을 외부 프라이머 5'-GGA ATT CCA TAT GCG TCT GTT GAT CGG CT (서열번호: 19) 및 5'- CTG-GGA TCC GCT CAG CTT ATT TCA (서열번호: 22)(Nde I 및 BamH I에 대한 제한 부위가 도입됨)을 사용하는 제3 PCR 반응에서 주형 DNA로서 사용하였다. 상기 반응 조건은 60초 동안 94℃에 이어서 35회 사이클(30초 94℃, 60초 49℃, 90초 72℃)에 이어서 5분 동안 72℃이다. 상기 증폭된 생성물은 제조업자의 지침에 따라 QiaQuick 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고 상기 생성물을 Nde I 및 BamH I를 사용하여 분해하고 Nde I 및 BamH I로 절단된 pET30a 벡터 DNA에 연결하였다. 상기 연결 생성물로 이. 콜리 DH5α의 컴피턴트 세포를 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 가나마이신(30 μg/ml)을 함유하는 LB 플레이트상에 도말하였다. 단일 콜로니는 프라이머 5'-TTATGCT AGTTATTGCTCAGCG -3' (서열번호: 17) 및 5'-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT-3' (서열번호: 18)을 사용하는 PCR로 스크리닝하였다. PCR 생성물은 아가로스 겔에 적용하고 전기영동적으로 분리하였다. 이어서 올바른 크기(대략 1kb)의 생성물을 생성하는 콜로니를 사용하여 밤새 배양을 수행하고 이로부터 미니프렙 DNA를, 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAGEN 플라스미드 정제 시스템을 사용하여 분리하였다. 상기 서열은 프라이머 5'-TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG-3' (서열번호: 17) 및 5'-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT-3' (서열번호: 18)을 사용하여 확인하고 수득한 작제물로 이. 콜리 HMS174(DE3) 컴피턴트 세포를 형질전환시키고 수득한 양성 형질전환체는 lipB sOspA 1/2²⁵¹로 명명하였다.

리더 서열 없는 작제물의 제조. 작제물은 지질 잔기가 아미노 말단 시스테인 잔기에 전형적으로 부착된 lipB 리더 서열을 갖도록 제조하였다. 상기 재조합 지질화된 OspA를 실험적 시험하여 지질 잔기의 존재를 확인하였다. 그러나, lipB 리더 서열을 함유하지 않는 작제물을 또한 제조하였다. lipB 리더 서열을 함유하지 않는 작제물은 리더 서열을 암호화하는 핵산이 없고 시스테인 잔기에 대한 코돈이 메티오닌 잔기에 대한 코돈으로 대체된 769-771bp의 최종 생성물을 생성하도록 선택된 프라이머를 사용하는 3개의 lipB 작제물(pET30a 내) 각각으로부터의 PCR 증폭에 의해 제조하였다.

PCR 반응은 10X 완충액[15 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂], 200 μm dNTP, 1.25 U Amplitaq DNA 폴리머라제, 400 nM 정배향 프라이머 5'-CGTGCGTACCATATGGCACAGAAAGGTGCTGAGTCT-3' (서열번호: 23) 및 400 nM 역배향 프라이머 5'-CTGGGATCCGCTCAGCTTATTTCA-3' (서열번호: 22) 및 주형 DNA를 포함하도록 설정했다. PCR 조건은 다음과 같다: 5분 동안 94℃, 35 x (30초 동안 94℃, 30초 동안 48℃, 1분 30초 동안 72℃)에 이어서 5분 동안 72℃에서 담금 및 4℃에서 유지. PCR 반응물을 직접 사용하거나 추가로 사용할 때까지 15℃ 이하(≤15℃)에서 보관하였다.

상기 PCR 생성물을 QiaQuick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고, NdeI 및 BamH I로 분해하고 NdeI 및 BamH I로 분해된 pET30a 벡터 DNA에 연결하였다. 상기 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜리 HMS174(DE3)를 형질전환시키고 재조합 플라스미드를 함유하는 콜로니는 가나마이신에 대한 이들의 내성으로 선별하고 상기 서열은 PCR 생성물로부터 확인하였다.

이. 콜리 HMS 174(DE3)에서의 발현 평가. 선별된 콜로니는 각각의 신규 OspA 단백질을 발현하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 각각의 경우에, 단일 콜로니를 사용하여 가나마이신(30 μg/ml)을 함유하는 LB 브로쓰에 접종하고 OD(600nm) 값이 0.6 초과 및 1 미만에 도달할 때까지 1 내지 5시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이 시점에서, 배양 샘플을 보유하고(비유도된 샘플을 나타내는) 나머지 배양물은 IPTG를 첨가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 하였다. 비-유도된 샘플(1 ml)을 원심분리하고 상기 펠렛을 보유하고 -20℃에서 보관하였다. 상기 유도된 배양물은 추가로 3시간 동안 성장하도록 방치하고 이후 1ml의 샘플은 취하고 OD(600nm) 값을 측정하고, 상기 샘플을 원심분리하고 상기 펠렛을 보유하고 -20℃에서 보관하였다.

1차 세포의 제조. 1차 세포는 3개의 지질화된 작제물 각각 및 3개의 비-지질화된 작제물 각각에 대해 제조하였다. 상기 1차 세포는 각각의 OspA를 발현하는 pET30a 플라스미드를 갖는 이. 콜리 세포 (HMS174(DE3))를 포함했다. 1차 세포의 제조를 위해, 각각의 스톡 기원의 단일 콜로니를 가나마이신 (30 μg/ml) 및 리팜피신 (200 μg/ml)을 함유하는 플레이트로부터 집어내고 이를 사용하여 500㎕의 SMK 배지(SOP 8114)에 접종하고 밤새 배양하였다. 이어서 100㎕의 상기 배양물을 사용하여 100ml의 SMK 배지(2회)에 접종하고 상기 배양물을 37℃에서 진탕하면서 17 내지 20시간 동안 배양하였다. 이어서 멸균 글리세롤을 15%의 최종 농도로 배양물에 첨가하고 상기 물질을 500㎕의 양의 분취량을 60개 앰푸울에 피펫팅하고 이어서 -80℃에서 직접 보관된 60개의 1차 세포 앰푸울을 제조하였다.

3개의 합성 OspA는 혈청 1 및 2 OspA (lipB sOspA 1/2²⁵¹), 혈청형 6 및 4 OspA (lipB sOspA 6/4) 및 혈청형 5 및 3 OspA (lipB sOspA 5/3) 기원의 보호 에피토프를 갖는 OspA 분자를 암호화하도록 디자인하였다. 상기 분자의 1차 아미노산 서열 및 이들의 디자인에 혼입된 주요 특징에 대한 기재는 하기의 실시예에 나타낸다.

실시예 3:

지질화된 1/2 ²⁵¹ OSPA ( LIPB SOSPA1 / 2 ²⁵¹ )에 대한 기재

본 연구의 목적은 혈청형 1 및 2를 포함하는 신규 OspA 항원인 지질화된 1/2²⁵¹ OspA (lipB sOspA 1/2²⁵¹)을 디자인하는 것이다. LipB sOspA 1/2²⁵¹는 혈청형 2 서열(균주 Pko, GenBank 수탁번호. S48322)의 원거리 부분에 융합된 혈청형 1 OspA 서열 (균주 B31, GenBank 수탁번호 X14407)의 인접 부분을 포함한다. 2형 혈청형에 유일한 서열의 개시점은 216번 위치에서 라이신 (K) 잔기이다. 상기 작제물은 본래 251번 위치에서 아미노산 알라닌(A)를 암호화하도록 디자인하였다. 그러나, 후속적으로 상기 작제물은 면역원성을 증진시키기 위해 아스파라긴 (N) 잔기(Pko로부터 공개된 서열내 실제 잔기)를 암호화하도록 PCR로 변형시키고 이어서 lipB sOspA 1/2²⁵¹로 명명하였다.

lipB sOspA 1/2²⁵¹의 2차 특징은 도 2에서 lipB sOspA 1/2²⁵¹의 주석이 달린 아미노산 서열에서 나타나고 다음을 포함한다:

● 분자(아미노산 161 내지 185)의 인접 부분에서 추정 관절염 유발 에피토프(Gross et al., 1998), hLFA-1(YVLEGTLTA)(서열번호: 24)의 혈청형 2 OspA 서열 (균주 Pko; GenBank 수탁번호 S48322) 기원의 균등한 서열(이탤릭 및 플랭킹 서열로 나타냄): 상기 hLFA-1 에피토프와는 명백히 다른 서열로의 대체;

● OspB 리더 서열(도 2의 아미노산 1 내지 15) 및 선행 기술을 피하기 위한 다양한 치환. 44번 및 46번 위치에 아스파라긴(N) 및 아스파르트산(D) 잔기는 각각 아스파르트산(D) 및 아스파라긴(N)으로 대체하여 서열 KEKDKN (서열번호: 25)의 제조하였다. 78번 및 79번 위치에서 알라닌 (A) 및 아스파르트산 (D) 잔기는 각각 트레오닌 (T) 및 아스파라긴(N)으로 대체하여 서열 KTNKSK (서열번호: 26)를 제조하고;

● 국제 특허 공개 번호 WO 02/16421 A2 (Luft & Dunn)에 기재된 바와 같은 안정화 돌연변이. 예를 들어, 메티오닌 (M)은 136번 아미노산에서 아르기닌(R)을 대체(R139M)하였고; 티로신 (Y)은 아미노산 157에서 글루탐산 (E)를 대체(E160Y)하였고; 메티오닌 (M)은 186번 아미노산에서 라이신 (K)를 대체(K189M)하였고;

● 추가의 안정화 돌연변이. 예를 들어, 트레오닌 (T)는 아미노산 173(본원에서는 아미노산(aa) 176번으로 기재됨)에서 발린(V)을 대체하였다. 비. 부르그도르페리 서열의 비. 아프젤리 서열로의 대체로 추정 관절염유발 에피토프(161-185번 위치)의 제거로 173번과 174번(본원에서는 아미노산(aa) 176번 및 177번으로 기재됨)간의 수소 결합을 파괴시켰다. 이것은 보호 모노클로날 항체(105.5 및 LA-2)로의 결합을 감소시켰다(Jiang et al., J. Immunol. 144: 284-9, 1990; Golde et al., Infect. Immun. 65: 882-9, 1997; 및 Ding et al., J. Mol. Biol. 302: 1 153-64, 2000). 트레오닌(T)는 발린(V) 대신에 173번 위치에 도입하여 수소 결합을 복구시키고 보호 모노클로날 항체 105.5 및 LA2에 대한 반응성을 증가시켰다.

추가로, 아미노산 16번-25번 (성숙한 단백질의 개시점)은 OspB 서열 (GenBank Accession No. X74810)과 동일하다.

lipB sOspA 1/2²⁵¹의 뉴클레오타이드 및 추정 아미노산 서열은 도 3에 나타낸다. 상기 리더 서열(녹색)은 단백질 분비 동안에 절단된다. 성숙한 OspA 단백질의 서열은 단백질의 지질 앵커에 대한 부착 부위를 형성하는 시스테인 잔기(밑줄친)로 시작한다.

실시예 4:

지질화된 6/4 OSPA ( LIPB SOSPA 6/4)의 기재

본 연구의 목적은 혈청형 4 및 6을 포함하는 신규한 OspA 항원인 지질화된 sOspA 6/4 OspA (lipB sOspA 6/4)를 디자인하는 것이다. LipB sOspA 6/4는 혈청형 4 서열 (균주 pTroB; GenBank 수탁번호 I40089)의 원거리 부분에 융합된 혈청형 6 OspA 서열(균주 K48, GenBank 수탁번호 I40098)의 인접 부분을 포함한다. 4형 혈청형에 유일한 서열의 개시점은 217번 위치에서 아스파라긴(N) 잔기이다. 2차 특징은 도 4에서 lipB sOspA 6/4의 주석이 달린 아미노산 서열에 나타내고 다음을 포함한다:

● 국제 특허 출원 번호 WO 02/16421 A2 (Luft 및 Dunn)호에 기재된 안정화 돌연변이: 136번 아미노산에서 아르기닌(R) 대신 메티오닌 (M), 157번 아미노산에서 글루탐산(E) 대신 티로신 (Y), 및 아미노산 187번에서 라이신(K) 대신 메티오닌(M); 및

● 상기된 바와 같은 lipB sOspA 1/2²⁵¹와 동일하게, OspB 리더 서열(도 4에서 아미노산 1번 내지 5번)을 사용하였고 아미노산 16-25번은 OspB 기원의 서열 (GenBank 수탁번호 X74810)과 동일하다.

펩타이드 서열 KEKNKD (서열번호: 27)은 모 OspA 6형 서열 (KEKDKD) (서열번호: 28)에는 없지만, 46번 위치에서 아스파르트산 (D) 잔기는 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 작제물에서 만들어진 균등한 변화와 일치되게 아스파라긴 잔기(N)로 대체하여 서열 KEKDKN (서열번호: 25)을 제조하였다.

펩타이드 서열 KADKSK (서열번호: 29)은 모 OspA 6형 서열 (KTDKSK) (서열번호: 30)에는 없지만 79번 위치에서 아스파르트산(D) 잔기는 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 작제물내에서 만들어진 균등한 변화와 일치하게 아스파라긴 잔기(N)으로 대체하여 서열 KTNKSK (서열번호: 26)를 제조하였다.

아미노산 37번은 모든 6개 유형의 서열이 상기 위치에서 발린을 갖고 있기 때문에 모 서열 (균주 K48; GenBank 수탁번호 I40098)에 존재하는 바와 같은 글루탐산 (E)로부터 발린 (V)로 변형시켰다.

lipB sOspA 6/4의 상기 뉴클레오타이드 및 추정 아미노산 서열은 도 5에 나타낸다. 상기 리더 서열(녹색)은 단백질 분비동안에 절단된다. 상기 성숙한 OspA 단백질의 서열은 단백질의 지질 앵커에 대한 부착 부위를 형성하는 시스테인 잔기(밀줄친, 도 5 참조)로 개시한다.

실시예 5:

지질화된 5/3 OSPA ( LIPB SOSPA 5/3)에 대한 기재

본 연구의 목적은 혈청형 3 및 5를 포함하는 신규 OspA 항원인 지질화된 sOspA 5/3 OspA (lipB sOspA 5/3)를 디자인하는 것이다. LipB sOspA 5/3은 서열번호: 5 및 6에 나타낸 바와 같은 변형을 갖는 혈청형 3 서열(균주 PBr; Genbank 수탁번호 X80256, 비. 가리니 OspA 유전자)의 원거리 부분에 융합된 혈청형 5 OspA 서열 [데이타베이스 수탁번호 emb|X85441|BGWABOSPA, B. garinii OspA 유전자 (WABSou 아주(substrain))]의 인접 부분을 포함한다. 3형 혈청형에 유일한 서열의 개시점은 216번 위치에 아스파르트산(D) 잔기이다. 2차 특징은 도 6에 lipB sOspA 5/3의 주석이 달린 아미노산 서열에 나타내고 다음을 포함한다:

● 국제 특허 출원 번호 WO 02/16421 A2 (Luft 및 Dunn)에 기재된 바와 같은 안정화 돌연변이: 아미노산 136번에서 아르기닌(R) 대신 메티오닌 (M); 아미노산 157번에서 글루탐산 (E) 대신 티로신 (Y); 및 아미노산 187번에서 라이신 (K) 대신 메티오닌 (M); 및

● 상기된 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 및 lipB sOspA 6/4에서와 같이, OspB 리더 서열(도 6에서의 아미노산 1번 내지 15번)을 사용하고 아미노산 16-25번은 OspB 기원의 서열 (GenBank 수탁번호 X74810)과 동일하다.

펩타이드 서열 KEKNKD (서열번호: 27)은 모 OspA 5형 서열(KEKDKD) (서열번호: 28)에는 없지만, 46번 잔기에서 아스파르트산 (D) 잔기는 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 작제물에서 만들어진 균등한 변화와 일치되게 아스파라긴 잔기(N)으로 대체하고 서열 KEKDKN (서열번호: 25)을 수득한다.

펩타이드 서열 KADKSK (서열번호: 29)는 모 OspA 5형 서열 (KTDKSK) (서열번호: 30)에는 없지만, 79번 위치에서 아스파르트산 (D) 잔기는 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 작제물에서 만들어진 균등한 변화와 일치되게 아스파라긴 (N)으로 대체하여 서열 KTNKSK (서열번호: 26)을 수득한다.

lipB sOspA 5/3의 뉴클레오타이드 및 추정 아미노산 서열은 도 7에 나타낸다. 상기 리더 서열 (녹색)은 단백질 분비동안에 절단된다. 성숙한 OspA 단백질의 서열은 단백질의 지질 앵커에 대한 부착 부위를 형성하는 시스테인 코돈(밑줄친, 도 7 참조)으로 시작한다.

실시예 6:

이. 콜리에서 고수준 발현을 위한 코돈 용법의 최적화

이. 콜리에서 드물게 사용되는 코돈의 존재는 외래 유전자의 고-수준 발현을 잠재적으로 방해하는 것으로 공지되어 있기 때문에 낮은-용법의 코돈은 이. 콜리에서의 고발현 유전자가 사용하는 코돈으로 대체하였다. 신규 OspA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 고발현된 부류 II의 이. 콜리 유전자중에서 가장 흔하게 발견되는 코돈(바람직한 코돈)을 사용하도록 디자인하였다(Guerdoux-Jamet et. al., DNA Research 4:257-65,1997). 신규 OspA 유전자 중의 코돈 용법 및 고도로 발현되는 부류 II의 이. 콜리 유전자에 대한 데이타는 표 7 및 8에 요약되어 있다. tRNA 분자가 율속 단계일 가능성이 적은 덜 흔한 아미노산에 대한 데이타(표 7)는 가장 흔하게 나타나는 아미노산에 대한 데이타(표 8)와는 별개로 제공한다.

[표 7]

* 즉, 갯수가 총 아미노산의 2.5% 미만(<2.5%)을 차지하는 아미노산.

[표 8]

신규 OspA 유전자에 대해 선택된 코돈 용법(단지 통상의 아미노산)과 이. 콜리 부류 II 유전자간의 고도의 일치성은 명백하다(즉, 개별 신규 OspA 유전자에 대한, 부류 II 유전자에 대한 표 8로부터의 퍼센트 수치의 플롯; 도 8 참조). 3개의 지질화된 작제물에 대해, 본래의 서열은 32.8% 내지 33.8% 범위의 GC 함량을 가졌고, 상기 코돈 최적화된 서열은 이. 콜리의 50% GC 함량과 유사한 43.8% 내지 46.8% 범위의 GC 함량을 가졌다.

실시예 7:

비- 지질화된 OspA 유전자의 작제

lipB 리더 서열을 함유하지 않는 작제물을 또한 제조하였다. 발효기내 생산의 용이함 (바이오매쓰, 안정성, 생성물 수율 등)을 평가하고 상이한 유형의 항원이 어떻게 정제될 수 있는지의 여부를 평가하고 이들의 생물학적 특성(안전성 프로필 및 보호 효능)을 평가하기 위해서는 2개의 작제물 세트(지질화된 것과 비-지질화된 것)가 필요하다.

상기 작제물(서열번호: 7, 9, 및 11)은 제한 부위가 혼입된 PCR 프라이머를 사용하여 3개의 lipB OspA 작제물(서열번호: 1, 3, 및 5) 각각으로부터 PCR 증폭시켜 제조하였다. 상기 PCR 생성물을 정제하고 Nde I 및 BamH I로 분해하고 분해된 pET30a 벡터 DNA에 연결하였다. 상기 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜리 DH5α를 형질전환시키고 상기 OspA 서열을 확인하였다. 미니프렙 DNA를 제조하고 분리하고 이를 사용하여 HMS 174(DE3) 숙주 세포를 형질전환시켰다. 비-지질화된 유도체의 서열은 이들이 리더 서열을 암호화하는 처음 45개 염기쌍이 없고 지질화된 버젼내 시스테인 코돈을 대체하는 메티오닌 코돈을 함유하는 Nde I 부위를 함유함을 제외하고는, 지질화된 버젼과 동일하다(도 9 참조).

실시예 8:

신규 재조합 OsPA 항원의 발현

항원 목적으로 신규 재조합 OspA 유전자를 발현제조하기 위해, 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제에 의해 조절되는 이. 콜리 발현 시스템(Studier et al., J. Mol. Biol. 189:113-30, 1986)을 사용하였다. 상기 발현 시스템에서, 신규한 OspA 유전자를 pET 계열의 플라스미드 중 하나(예를 들어, pET30a)에 다중 클로닝 부위로 클로닝하였다. 외래 유전자의 발현은 이. 콜리 RNA 폴리머라제에 의해 인지되지 않는 박테리오파아지 T7 프로모터의 조절하에 있기 때문에, 발현은 T7 RNA 폴리머라제의 공급원에 의존한다. 상기 효소는 재조합 플라스미드가 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 염색체 카피를 함유하는 적당한 발현 숙주, 예를 들어, 이. 콜리 HMS174(DE3)에 전달되는 경우 제공된다. 염색체에 통합된 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 발현은 lacUV5 프로모터의 조절하에 있고 이는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG) 또는 락토스를 첨가함에 의해 가동(즉 유도)될 수 있다(도 10 참조). 결과적으로 외래 유전자의 발현은 또한 유도인자 분자를 첨가함에 의해 조절된다.

상기 세포는 후기 로그-단계에서 유도되고 유도후 3-4시간에 수거하였다. 유도된 세포에서 키메라 OspA 항원은 세포 용해물의 SDS-PAGE에 의한 측정시 가장 고도로 발현되는 단백질이었다. OspA 키메라 대부분은 상등액에서 발견되었다. 이. 콜리 단백질 오염물은 음이온 교환 크로마토그래피로 제거하고 상기 보이드(void) 용적에서 용출된 키메라 OspA 단백질은 한외여과로 농축시켰다.

작제물 각각으로부터의 신규한 재조합 OspA 단백질의 발현을 시험하였고 유도되고 비유도된 배양물 기원의 샘플을 SDS 폴리아크릴아미드 겔상에 전개하였다(도 11). 지질화된(서열번호: 2, 4, 및 6) 및 비-지질화된 (서열번호: 8, 10, 및 12) 항원에 대해, 대략 31kDa의 밴드가 각각의 경우에서 관찰되었다(도 11 참조). 상기 단백질은 특징적이었고 측정된 분자량이 이론적 분자량과 관련되고(+/- 0.5 돌턴) 이는 상기 말단 메티오닌이 절단된 것으로 추정된다. 도 11은 발현된 재조합 지질화된 OspA 단백질이 총 단백질 수율의 10% 이상을 포함함을 보여주고 이는 상기 작제물이 이들의 의도된 목적을 위해 유용함을 입증한다.

실시예 9:

단일 재조합 OspA 항원 (R OSPA 1/2)은 비. 부르그로르페리 에스.에스 . 및 비. 아프젤리의 감염으로부터 보호한다

상기 연구의 목적은 단일 재조합 항원 (rOspA 1/2; 서열번호: 2를 포함하는 폴리펩타이드(lipB sOspA 1/2²⁵¹))이 OspA 혈청형 1 및 2의 보호 성질을 보유하도록 디자인된 경우, 비. 부르그도르페리 에스.에스.(OspA 혈청형 1) 또는 비. 아프젤리(OspA 혈청형 2)를 사용한 감염으로부터 마우스를 보호하는 항체 반응을 유도할 수 있는지의 여부를 측정하는 것이다. 추가의 rOspA 항원의 내포가 rOspA 1/2 항원에 의해 제공된 보호 면역성에 대해 길항 효과를 나타내지 않았음을 보여주기 위한 증거가 제공된다.

rOspA 1/2의 디자인 및 작제 . 우발적인 제제를 도입할 위험성을 제거하기 위해, 상보적 중첩 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 함께 연결되어 벡터 pET30a에 클로닝된 DNA 단편을 제조하였고 상기 서열을 확인하였다. 상기 방법은 또한 상기 OspA 유전자를 발현시키기 위해 사용되는 이. 콜리 숙주 HMS174(DE3)에 대해 최적화된 코돈 용법을 사용가능하게 하였다. 상기 신규 유전자는 혈청형-2 서열의 원거리 부분(아미노산 219번 내지 273번, 균주 PKo; 수탁번호 S48322)에 융합된 혈청형-1 OspA 서열의 인접 부분(아미노산 29번 내지 218번, 균주 B31; GenBank 수탁번호 X14407)을 기초로 한다. 비. 부르그도르페리 균주 B31(aa 164번 내지 188번) 기원의 25개 아미노산 단편은, B31 OspA의 상기 영역(aa 165-173번)이 hLFA-1 에피토프를 포괄하는 영역(aa 332-340번)과 크게 관련되어 있기 때문에 비. 아프젤리 균주 PKo (aa 164번 내지 188번) 기원의 서열로 대체하였다. 리더 서열 및 처음 11개 아미노산을 포함하는 N-말단 서열은 지질화된 단백질 발현을 최적화하기 위해 OspB (균주 B31; GenBank 수탁번호 X74810)로부터 유래하였다. 다른 특이적 아미노산 변화는 rOspA 1/2 분자의 면역원성 및 형태적 안정성을 개선시키기 위해 수행되었고 상기 rOspA 1/2 (lipB sOspA 1/2²⁵¹)의 서열은 서열번호: 2로 나타낸다.

동물 시험. 상이한 OspA 항원을 발현하는, 2개 종의 보렐리아에 의한 감염을 예방하기 위한 단일 재조합 OspA 항원 (rOspA 1/2)의 능력은 보조제로서 0.2% (w/v)의 수산화알루미늄으로 제형화된 정제된 OspA 항원 (0.1 μg 또는 0.03μg 용량)으로 피하 면역화된(0일 및 28일) CH3/HeJ 마우스에서 평가하였다. 마우스를 부스터 면역화 2주 후에 피내 주사(바늘 투여; 7 x 10⁴ 세포)에 의해 또는 천연 감염 경로(진드기 기회감염)에 의해 기회감염(challenge)시켰다. 후자 실험을 위해, 8 마리 애벌레 진드기를 마우스 당 적용하고 5일 동안 까지 영양 공급하였다. 애벌레는 라임 질환이 만연되어 있는 지역인, 부드바이즈(Budweis)(체코 공화국)의 부근에서 수거하였다. 상기 진드기의 대다수는 영양공급되지 않은 진드기를 PCR로 시험함에 의해 측정된 바와 같이 비. 아프젤리로 감염되어 있었다. 마우스의 감염 상태는 4주 후에 결정하였다. 진드기의 기회감염 실험에서, 보렐리아의 존재는 배양(뇨 방광)하고 실-시간 PCR로 보렐리아 DNA를 검출(심장)하여 확인하였다. 동물 실험은 동물 실험에 대한 오스트리아 법 및 국제 지침 (AAALAC 및 OLAW)에 따라 수행하였고 기관[Institutional Animal Care and Use Committee]에 의해 검토되고 기관[Austrian regulatory authorities]에 의해 승인되었다. 면역원성. rOspA 1/2 항원에 대한 항체 반응(μg IgG/ml)은 피복 항원으로서 rOspA 1/2를 사용하고 표준물로서 IgG 함량이 한정된 OspA 특이적 모노클로날 항체(실험실에서 제조됨)를 사용하는 ELISA에 의해 결정하였다.

진단 과정. 바늘 기회감염 실험을 위해, 표면-노출된 지질단백질 VlsE 단백질 (C6 ELISA; 피복된 플레이트(제조원: Immunetics® C6 Lyme ELISA™)) 또는 OspA 면역원 이외의 보렐리아 항원(웨스턴 블롯팅)에서 보존된 에피토프에 대한 항체의 존재는 감염을 진단하기 위해 사용하였다. 웨스턴 블롯팅은 기회감염 유기체인 비. 부르그도르페리 에스.에스. 균주 ZS7로부터 제조된 세포 용해물을 사용하였다. 동물은 이들이 상기 분석 둘다에서 양성인 경구 감염된 것으로 간주하였다.

진드기 기회감염 실험을 위해, C6 ELISA 및 웨스턴 블롯팅을 또한 수행하였다. 그러나, 웨스턴 블롯팅은 감염 유기체의 동정이 알려져 있지 않기 때문에 비. 부르그도르페리 에스.에스. ZS7, 비. 아프젤리 ACA1 및 비. 가리니 KL11 기원의 용해물을 사용하였다. 동물은 단지 분석 둘다가 양성인 경우 혈청 전환을 진행한 것으로 고려하였다. 추가로, 보렐리아 감염은 뇨 방광으로부터 배양하고 OspA의 5'- 영역을 표적화하는 실-시간 PCR 분석 및 16S rRNA 유전자 기반 분석을 사용하여, 심장 조직으로부터 추출된 게놈 DNA에서 비. 부르그도르페리 에스.엘. 핵산을 검출하여 평가하였다. 동물은 PCR 생성물이 분석 둘다로 검출되는 경우에만 PCR-양성인 것으로 간주하였다. 전반적으로, 동물이 감염된 것으로서 판정하기 위해서는 마우스는 배양, PCR 또는 혈청학에 있어서 양성일 필요가 있다.

감염 보렐리아의 특징 분석. 가능한 경우, 감염 유기체를 배양하고 OspA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 OspA 잔기 38-262번(비. 아프젤리 VS461, GenBank 수탁번호 Z29087)에 대해 결정하였다. 상기 정보는 OspA 유형 및 보렐리아 종이 추론될 수 있도록 OspA 참조 서열과 비교하였다. 단일 OspA 혈청형을 발현하는 종에 대해, 종에 대한 균주 유형에 대한 OspA 서열은 참조물로서, 예를 들어, 비. 아프젤리 VS461 또는 비. 발라이시아나 VS116 (GenBank 수탁번호 Z29087; AF095940)로서 선택하였다. 비. 가리니는 다중 OspA 유형을 갖고 있기 때문에, OspA 유전자형 3-7에 대한 OspA 서열을 사용하였다(즉, 균주 PBr, PTrob, WABSou, Tlsl 및 T25; 각각 GenBank 수탁번호 X80256, X80186, X85441, X85440 및 X80254). 실-시간 PCR-기반 분류동안, 상기 GenBank에 기탁된 124개의 비. 부르그도르페리 에스.엘. 종의 OspA 유전자의 서열 정렬은 혈청형-특이적 서열에 대해 조사되었고 프라이머 발현 3.0(Applied Biosystem)을 사용하여 적합한 프라이머-프로브 조합을 디자인하였다. 모든 분석은 범 사이클링 조건을 사용하여 ABI Prism® 7900HT 서열 검출 유니트상에서 수행하였다.

rOspA 1/2를 사용한 면역화에 의한 비. 부르그도르페리 에스.에스(OspA 혈청형-1) 감염의 예방. 낮은 용량의 2개의 상이한 로트의 rOspA 1/2 항원으로 면역화된 마우스 모두는 ELISA에 의한 측정시 상기 면역원에 대해 특이적인 IgG 항체를 나타냈다. 수산화알루미늄을 함유하는 백신 제형 완충액으로 처리된 대조군 마우스에서는 어떠한 항체도 검출되지 않았다. 혈청형-1 OspA를 암호화하는 비. 부르그도르페리 에스.에스. 종을 사용한 감염을 예방하기 위한 면역 반응의 능력을 평가하기 위해, 상기 마우스에 비. 부르그도르페리 에스.에스 균주 ZS7의 7 x 10⁴개의 세포를 피내 주사하였다. 보조제를 함유하는 완충액으로 처리된 모든 대조군 마우스는 C6 ELISA 및 웨스턴 블롯팅에 의한 입증시 감염에 대한 혈청학적 증거를 보여주었다. rOspA 1/2 항원으로 면역화된 어떠한 마우스도 감염되지 않았고 이들 마우스 기원의 혈청은 분석 둘다에서 음성이었다. 0.03㎍의 적은 rOspA 1/2 항원이 보조제로서 수산화알루미늄과 제형화되고 2회 용량의 면역화 계획으로 투여되는 경우 이는 독성 비. 부르그도르페리 에스.에스. 균주 ZS7을 사용한 바늘 기회감염에 대해 100% 보호(P < 0.0001, 피셔의 정확한 투 테일드(two tailed) 시험)를 제공하엿다.

rOspA 1/2를 사용한 면역화에 의한 비. 아프젤리(OspA 혈청형-2) 감염의 예방. 혈청형-2 OspA를 암호화하는 종인 비. 아프젤리에 의한 감염을 예방하는, rOspA 1/2 항원을 사용한 면역화의 능력을 평가하기 위해, 마우스를 2개의 별도의 실험에서, 상기된 바늘 기회감염 실험에 사용되는 것과 동일한 항원 로트 및 연구 디자인으로 면역화시켰다. 그러나, 이 경우에, 상기 면역화된 마우스를 주로 비. 아프젤리로 감염된 것으로 공지된 야생 진드기(애벌레)로 기회감염시켰다. 이들 야생 진드기가 비. 부르그도르페리 에스.엘.을 마우스에게 전염시킬 능력은 비-면역화된 대조군 동물에 기회감염시킴에 의해 확인하였다.

대조군 마우스의 대부분(총 11/14, 79%)은 감염되었다. 모든 감염된 대조군 동물은 2개의 독립적인 실-시간 PCR 분석(16S rRNA 및 OspA 유전자)으로 보렐리아 DNA에 대해 양성이었다. 11건 중 10건(11/10)의 경우에서, 뇨 방광 배양에 의해 보렐리아를 분리할 수 있었다. 나머지 마우스는 혈청학 및 PCR에서 양성이었다. 10개의 배양 분리물중 9개에서 OspA 서열이 검색되었고 이 모두는 비. 아프젤리(99% 초과(>99%)의 OspA 서열 동일성)로서 분류되었다. 추가로, 모든 감염 유기체는 특이적으로 혈청형 2 OspA 유전자를 표적화하는 실-시간 PCR 분석을 사용하는 심장으로부터 추출된 DNA의 PCR 분석에 의해 비. 아프젤리로서 분류되었다. 이들 데이타는 비. 아프젤리가 감염된 야생 진드기로부터 이들의 마우스 숙주로 전염되는 주요 보렐리아 종이었음을 확인시켜준다.

rOspA 1/2 (총 3/32, 9%)로 면역화된 소수의 마우스가 감염되었다. 이들 3개의 마우스중 하나는 모든 3개의 진단학적 표준방법(혈청학, PCR 및 배양)에 의한 측정시 감염되었고 서열 분석은 감염 유기체가 비. 가리니 혈청형-6(99% 초과(>99%)의 OspA 서열 동일성)임을 밝혔다. 감염된 것으로 간주된 나머지 2개의 동물은 3개의 표준 방법중 2개에서만 양성이었다. 하나의 마우스는 혈청학 및 PCR에서만 양성이었다. 그러나, 상기 감염 유기체는 배양물중에서 검출될 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 상기 유기체는 혈청형-7 OspA 유전자에 특이적인 PCR을 사용하는, 심장으로부터 추출된 DNA의 PCR 분석에 의해 비. 가리니 혈청형-7으로서 분류될 수 있었다. 3번째 마우스는 PCR 및 배양 방법에 양성이었지만 혈청학적으로는 음성이었다. 상기 마우스로부터 배양된 분리물은 서열분석에 의한 측정시(비. 발라이시아나 균주 VS116과 OspA 서열 동일성) 비. 발라이시아나였다. 중요하게, 면역화된 마우스중 어떠한 것(0/32)도 비. 아프젤리에 의해 감염되지 않았다. 0.03μg의 적은 양의 rOspA 1/2 항원이 보조제로서 수산화알루미늄과 제형화되고 2회 용량 면역화 계획으로 투여되는 경우 이는 야생 진드기에 의해 전염되는 비. 아프젤리에 대해 완전한 보호를 제공하였다.

결론. 2개의 상이한 OspA 혈청형(1 및 2) 기원의 보호 요소를 함유하도록 디자인된 단일 재조합 외부 표면 항원 A(OspA) 항원은 비. 부르그도르 센수 스트릭토(OspA 혈청형-1) 또는 비. 아프젤리(OspA 혈청형-2)에 의한 감염으로부터 마우스를 보호하는 항체 반응을 유도할 수 있었다. 비. 부르그도르페리 에스.에스. 균주 ZS7에 의한 감염에 대한 보호는 바늘 기회감염 모델에서 입증되었다. 비. 아프젤리 종에 대한 보호는 야생 진드기를 사용하는 진드기 기회감염 모델에서 나타났다. 2개의 모델에서, 0.03μg의 적은 양의 항원이 보조제로서 수산화알루미늄을 갖는 2회 용량 면역화 계획으로 투여되는 경우 표적화된 종에 대한 완전한 보호를 제공하기 위해 충분하였다. 예상된 바와 같이, 상기 신규한 항원에 의해 제공되는 보호는 비. 가리니 및 비. 발라이시아나 균주에 의한 감염에 대해 보호를 제공하는 항원의 무능력에 의해 입증되는 바와 같이 다른 보렐리아 종까지 확대되지 않았다. 상기 기본 연구에 대한 입증은 보다 소수의 OspA 항원을 필요로 하는 효과적인 유전학적-변형된 백신의 이상적 디자인을 위해 사용될 수 있음을 입증하고 이러한 방법이 범용의 OspA 백신의 개발을 용이하게할 수 있음을 시사한다.

실시예 10:

생 보렐리아의 표면에 결합하거나 이의 성장을 억제하는 마우스 항- OspA 항체의 효율은 비. 부르그도르페리 에스.에스 . 1형 균주를 사용한 바늘 기회감염에 대한 보호와 상호관련이 있다

본 연구의 목적은 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토 OspA 1형 균주를 사용하는 바늘 기회감염 모델에서 rOspA 1/2 항원으로 면역화된 마우스에 대한 보호의 상호관련성을 설정하는 것이었다. 분석된 파라미터는 생 보렐리아의 표면과 결합하거나 보렐리아의 성장을 억제하는 항-OspA 항체의 효능이었다.

기회감염시 보호되고 감염된 동물이 관찰되도록, 준최적의 3ng 용량의 rOspA 1/2 항원을, 프라임-부스터 계획으로 실시예 9에서 사용되는 하한 용량 보다 더 10-배 낮은 0.2% AI(OH)3의 보조제와 함께 사용하여 98마리의 마우스를 의도적으로 면역화시켰다. 백신 접종은 0, 14일 및 28일째에 100㎕의 용량을 피하 주사하여 수행하였다. 28일째에, 기회감염-전 혈청 샘플을 96마리의 마우스로부터 채취하고 10일 후 동물을 비. 부르그도르페리 에스.에스. ZS7이 성장한 19.4 x ID₅₀의 배양물로 기회감염시키고 4주 후 감염 상태를 결정하였다. 96마리의 마우스중 71마리(72%)는 상기 저용량의 항원으로 면역화된 후 보호되는 것으로 밝혀졌다.

기회감염-후 4주에 혈액을 채취하여 이들의 혈청을 비. 부르그도르페리 에스.에스. 균주 ZS7의 막 분획물에 대해 웨스턴 블롯팅함에 의해 감염된 마우스를 동정하였다. 사용되는 기회감염 용량에서, 단지 감염된 마우스는 OspA 이외에 균주 ZS7의 막 항원에 대해 항체 반응을 가졌다(백신에 의해 유도된 OspA에 대한 반응은 나타내지 않았다).

생 보렐리아의 표면에 결합하는 OspA 항체의 정량. 상기 분석에서, OspA 1형을 발현하는 비. 부르그도르페리 에스.에스. 균주 B31은 고정된 희석(1:100)에서 보체 활성화를 예방하기 위한 EDTA의 존재하에 실온에서 기회감염 전 마우스 혈청을 사용하여 배양하였다. 미결합된 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 세포 표면에 특이적으로 결합하는 항체는 상기 처리된 세포를 r-피코에리트린-접합된 항-마우스 Ig 폴리클로날 항체로 항온처리함에 의해 표지시켰다. 이어서, 적색 형광을 발산하여 검출을 증진시키는 DNA 염색(LDS-751)을 사용하였고 이어서 세균은 유동 세포측정기(FACSCalibur, Beckton-Dickinson)로 분석하였다. 세포 표면에 부착된 항체 분자의 수와 관련되는 형광 강도는 2,000개 이상의 개별 보렐리아에 대해 기록하고 형광 강도(MFI)의 평균을 계산하였다. 정상적인 마우스 혈청은 항체의 비-특이적 표면 결합의 정도를 평가하기 위한 음성 대조군으로서 사용되었고, OspA 혈청형 1-특이적 mAb는 OspA 유형의 동정을 확인하고 세균 배양에서 세포의 OspA 발현 수준을 입증하기 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.

세균 성장 억제 분석. 보렐리아의 성장을 억제하는 기회감염-전 혈청의 효능을 측정하기 위해, OspA 1형을 발현하는 비. 부르그도르페리 에스.에스. 균주 B31은 보체의 존재(정상적인 기니아 피그 혈청)하에 연속된 희석의 열-불활성화된 기회감염-전 또는 비-면역 마우스 혈청(음성 대조군)의 존재하에 33℃에서 배양하였다. 비-면역 혈청으로 항온처리된 대조군 배양물중 세균이 현미경으로 측정시 충분히 성장한 경우, 정확한 세포의 수를 유동 세포측정 분석으로 계수하였다. 세포 배양물을, 한정된 수의 형광-표지된 비드를 함유하는 용액과 혼합하고 DNA-염료를 첨가하여 보렐리아 세포를 형광적으로 표지시켰다. 샘플은 100개의 비드가 계수될때까지 FACSCalibur 유동 세포측정기를 사용하여 프로세싱하고 절대 세포 농도는 비드를 한정하는 게이트 및 보렐리아를 한정하는 게이트에서 반응 수를 비교함에 의해 계산하였다(세포/ml). 세균 성장을 50%까지 억제하는 혈청 희석물을 NMS 대조군과 비교하여 계산하고 GI-50 역가로 보고하였다. 표준 혈청 제제를 사용하여 상이한 분석간의 역가를 표준화하였다. 측정된 혈청 파라미터의 분포는 비-파라미터성 맨-위트니 U 시험 (Graphpad Prism Vers. 5.0)에 의해, 감염되고 보호된 동물 중에서 비교하였다.

상기 연구 결과(도 19 참조)는 고도로 유의적인 관련성 기회감염시에 면역 혈청의 기능적 항체 함량과 비. 부르그도르페리 에스.에스.(ZS7)의 고용량(19.4 x ID₅₀) 바늘 기회감염에 대한 보호간에 상호관련성이 존재함을 명백하게 입증한다. OspA 1형을 발현하는 생 보렐리아의 FACS-기본 형광 강도 측정은 세포 표면에 부착된 항-OspA 항체 분자의 수를 반영하고 고정된 희석에서 기회감염전 혈청으로 세균을 항온처리한 후에 수행되고 보호와 최상으로 관련된다.(p < 0.0001 미만의 맨-휘트니 U 시험). 그러나, 성장 억제 역가는 또한 보호 (p =0.0002 맨-휘트니 U 시험, 도 19)와 고도로 유의적으로 관련된다.

실시예 11:

생 보렐리아의 표면에 결합하거나 성장을 억제하는 마우스 항- OspA 항체의 효율은 비. 아프젤리 2형 균주를 사용하는 진드기 기회감염에 대한 보호와 상호관련이 있다

상기 연구의 목적은 마우스를 감염시키기 위해 체코공화국의 부드바이즈 (Budweis)로부터 수거된 야생 진드기를 사용함에 의해 천연 감염 경로를 사용하는, 진드 기회감염 모델에서 키메라 OspA 1/2 항원으로 면역화된 마우스의 보호의 상호관련성을 설정하는 것이었다. 상기 풍토성 지역 기원의 애벌레 진드기는 주로 비. 아프젤리에 의해 감염되어 있기 때문에, 이들은 비. 아프젤리 OspA 2형 균주 기회감염을 제공하는 것으로 고려된다. 실시예 10에 제시된 바와 같이, 분석되는 파라미터는 생 보렐리아의 표면과 결합하거나 보렐리아의 성장을 억제하는 항-OspA 항체의 효능이고 상기 분석 둘다는 보렐리아 부르그도르페리 에스.에스.와 바늘 기회감염에 대해 상호관련성이 있는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 연구는 이들 2개의 파라미터가 유럽에서 가장 주요한 사람 질환 관련 동종유전자 종인 비. 아프젤리의 천연 감염에 대한 보호의 상호관련성으로서 상기 2개의 파라미터를 사용하여 확대 적용시키는 작용을 한다.

40마리의 마우스를 프라임-부스터 계획에서 실시예 9에 사용된 하한 용량 보다 10-배 더 낮은 0.2% AI(OH)3)의 보조제와 함께 준-최적의 3ng 용량의 rOspA 1/2으로 면역화시켰다. 실시예 10에서와 같이, 상기 준 최적 용량은 2개의 보호되고 감염된 동물이 기회감염 후 관찰됨을 확신하기 위해 선택되었다. 백신 접종은 0일, 14일 및 28일째에 100㎕의 주사 용량을 사용하여 피하로 수행하였다. 40일째에 개별 혈액 샘플을 마우스로부터 채취하여 기회감염-전 혈청을 제조하였다. 가용한 제한된 수의 진드기가 모든 40마리의 마우스의 기회감염을 허용하지 않기 때문에, 광범위한 반응을 포괄하는 표면 결합 및 항-2형 IgG 농도를 기준으로 20마리의 마우스를 선별하였다. 8마리의 진드기를 각각의 마우스에 적용하고 5일 동안 마우스상에서 영양 공급받도록 하였다. 기회감염 후 4주에, 상기 마우스를 희생시키고 면역화된 마우스 및 대조군 마우스의 감염 상태를 비. 부르그도르페리 에스.에스., 비. 아프젤리 및 비. 가리니 기원의 막 항원에 대한 혈청의 웨스턴 블롯팅; 방광 기원의 보렐리아 유기체의 배양; 및 방광으로부터 추출된 DNA로부터 보렐리아의 실시간 PCR 검출에 의해 결정하였다.

생 보렐리아의 표면에 결합하는 OspA 항체의 정량. 상기 분석에서, OspA 2형을 발현하는 비. 아프젤리 균주 Arcon을 고정화된 희석(1:100)으로 보체 활성화를 예방하기 위한 EDTA의 존재하에 실온에서 기회감염-전 마우스 혈청과 항온처리하였다. 미결합된 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 세포 표면에 특이적으로 결합된 항체를, 상기 처리된 세포를 r-피코에리트린-접합된 항-마우스 Ig 폴리클로날 항체와 항온처리함에 의해 표지시켰다. 분석에서 모든 후속 단계는 실시예 10에 기재된 것들과 유사하다. 정상적인 마우스 혈청은 비-특이적 항체 결합에 대한 음성 대조군으로서 작용한다. 3개-성분 rOspA 백신 제형에 대해 생성된 높은 역가의 마우스 혈청은 OspA 혈청형 2-특이적 mAb와 함께 세균 배양물에서 OspA 혈청형 특이성 및 세포의 OspA 발현 수준을 확인하기 위한 양성 대조군으로 작용하였다.

세균 성장 억제 분석. 보렐리아의 성장을 억제하기 위한 기회감염-전 혈청의 효능을 측정하기 위해, OspA 2형을 발현하는 비. 아프젤리 균주 Arcon을 보체 없이 연속으로 희석된 열-불활성화된 기회감염-전 또는 비-면역 마우스 혈청(음성 대조군)의 존재하에 33℃에서 항온처리하였다. 대조군 배양물중에 세균이 비-면역 혈청으로 항온처리되어 현미경으로 측정시 충분히 성장한 경우, 정확한 세포 수는 유동 세포측정기 분석으로 계수하였다. 세균을 계수하기 위해 사용되는 과정은 실시예 10에서의 성장 억제 분석을 위해 이전에 기재된 것과 유사하였다. 세균 성장을 50%까지 억제하는 혈청 희석물은 NMS 대조군과 비교하여 계산하였고 GI-50 역가로서 보고하였다. 표준 혈청 제제를 사용하여 상이한 분석간의 역가를 표준화시켰다.

통계학적 분석. 측정된 혈청 파라미터의 분포는 비-파라미터성 맨-휘트니 U 시험 (Graphpad Prism Version 5.0)에 의해 감염되고 보호된 동물에서 비교하였다.

결과. 0.003 pg의 rOspA 1/2로 3회 면역화되고 8마리의 야생 진드기로 기회감염된 20마리의 동물중에서, 7/20 (35%)가 감염된 것으로 밝혀졌다. 제한된 진드기 가용성으로 인해, 비-면역화된 마우스의 대조군 그룹을 기회감염시킴에 의한 기회감염의 정확한 감염률을 결정할 수 없었다. 그러나, 상기 기회감염은 본 연구의 목적에 요구되지 않았고 전형적으로 70-80%의 감염률이 부드바이즈(Budweis) 기원의 야생 진드기를 사용한 기회감염 실험에서 성취된다.

표면 결합 (p = 0.007) 및 성장 억제 (p = 0.03) 분석에 대한 보호되고 감염된 그룹간의 유의적인 차이가 검출되었다(도 20).

결론. 본 연구에서, 통계학적으로 유의적인 상호관련성이 기회감염시에 마우스 혈청내 기능성 항체 함량과 마우스당 8마리의 진드기를 적용하는 야생 진드기 기회감염을 사용한 감염에 대한 보호간에 존재함이 밝혀졌다. OspA 2형을 발현하는 생 보렐리아의 FACS 기본 형광 강도 측정은 세포 표면에 부착된 항-OspA 항체 분자의 수를 반영하고 이는 고정된 희석에서 기회감염 전 혈청으로 세균을 항온처리한 후 수행하였고 보호와 최상의 상호관련성을 나타냈다. 또한 성장 억제 역가는 또한 보호와 상호관련성이 있었다. 보렐리아 부르그도르페리 에스.에스. 균주와는 반대로, 보체가 효율적인 사멸을 위해 요구되는 경우, rOspA 1/2 항원은 보체의 부재하에서도 보렐리아 성장을 효과적으로 억제하는 항체를 유도하였다.

실시예 10 및 11에 제공된 연구 결과를 종합하는 경우 2개의 샘플에서 생 보렐리아에 대해 표면 결합된 항체의 평균 형광 강도(MFI)와 면역 마우스 혈청의 GI-50 역가의 시험관내 파라미터를 "보호의 상호관련성"으로 설정하고, 여기서, 활성 마우스 보호 모델이 현재 가용하고, 예를 들어, 즉, 비. 부르그도르페리 에스.에스. OspA 1형 균주에 대한 바늘 기회감염 모델 및 비. 아프젤리 OspA 2형 균주에 대한 진드기 기회감염 모델이 가용하다. 더욱이, 추론에 의해, OspA 유형 3-6 을 발현하는 상동성 비. 가리니 균주에 대한 보호를 평가하기 위한 신임할 수 있는 활성 보호 모델의 부재하에, 상기 언급된 모델은 모든 백신 상동성 OspA 유형에 대해서 및 이종성 OspA 유형을 발현하는 것들에 대해서 다양한 백신 제형의 보호 잠재력 및 교차 균주 포괄을 평가하기 위한 시험관내 "보호의 대용 마커"로서 사용될 수 있다. 실제로, 이들 기능성 면역 반응 분석을 사용한 연구가 3개-성분 키메라 rOspA 백신 제형으로 면역화된 마우스 기원의 면역 혈청상에 수행되는 경우, 상응하는 MFI 및 GI-50 역가가 비. 가리니(OspA 유형 3, 4, 5, 6)에 대해서 수득되었고(실시예 13 참조), 따라서 이들 보호의 대용 마커를 통해 현재 활성 마우스 보호 모델이 존재하지 않는 균주에 대해서도 보호 반응이 성취됨을 지적한다. 추가로, (a), 개별 키메라 rOspA 항원; (b), 가능한 2개-성분 키메라 rOspA 항원 백신 제형 조합중 어느 하나; 또는 (c), 3개-성분 키메라 rOspA 항원 제형으로 면역화된 마우스의 면역 반응을 비교함에 의해, 후자 3개-성분 백신이 OspA 유형 1-6을 발현하는 균주를 최적으로 포괄하기 위해 요구됨을 보여줄 수 있었다(실시예 14). 더욱이, 이들 시험관내 대용 마커 분석을 사용함을 통해 3개-성분 키메라 OspA 백신 제형 (rOspA 1/2, rOspA 6/4 및 rOspA 5/3)으로 마우스를 면역화시킨 후 생성된 면역 반응이 지금까지 시험된 유형 1, 2, 3, 5, 및 6의 모든 내부 유형(또는 아유형) 변이체 (실시예 15 참조) 및 상기 백신내 존재하는 상동성 OspA 유형 1-6 이외의 이종성 OspA 유형(실시예 16 참조)에 대해서도 기능성 면역 반응을 유도함을 보여줄 수 있었다.

실시예 12:

3개의 항원 (1/2, 6/4, 및 5/3)을 포함하는 다가 재조합 OspA 제형은 마우스에서 고도로 면역원성이다

다가의 OspA 백신(rOspA 1/2, rOspA 5/3, 및 rOspA 6/4)은 진드기 기회감염 모델에서 평가하였다. OspA 혈청형 1 및 2(서열번호: 2), OspA 혈청형 6 및 4(서열번호: 4) 및 OspA 혈청형 5 및 3(서열번호: 6) 기원의 보호성 에피토프를 함유하는 3개의 재조합 OspA 항원은 백신으로 조합되었다.

10마리의 암컷 C3H/HeJ 마우스(면역화시 연령: 11주) 그룹을 0일째 및 28일째에 0.3μg의 고정된 용량의 다가 백신(각각 0.1 μg, rOspA 1/2, rOspA 5/3, 및 rOspA 6/4)으로 피하내 면역화시켰다. 진드기 기회감염은 체코공화국, 부드바이즈(Budweis) 기원의 진드기로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 야생 진드기의 비. 부르그도르페리 에스.엘.을 마우스로 전염시키는 능력은 비-면역화된 대조군 동물을 기회감염시킴에 의해 확인하였다. 상기 기회감염된 마우스의 감염 상태는 웨스턴 블롯팅, 실-시간 PCR 및 배양에 의해 결정하였다.

잠정적인 혈액 샘플은 궤도 천공에 의해 41일째에 채취하였다. 최종 혈액 샘플(70/71일)은 심장 천공에 의해 수거하였다. 개별 혈청은 원심분리에 의해 전혈로부터 제조하였다(10 분; 1000-2000xG; RT). 혈청은 사용할 때까지 -20℃ 이하(≤-20℃)에서 보관하였다.

상기 실험에서, 마우스를 기회감염시키기 위해 사용되는 동일한 배치로부터 수득한 영양공급되지 않은 진드기를 특징 분석하여 전체 감염률을 결정하고 감염 유기체의 종을 확인하였다. 80마리의 애벌레 진드기가 비. 부르그도르페리 에스.엘. DNA의 존재에 대해 16S rRNA 실-시간 PCR에 의해 시험되는 경우, 32.5% (26/80)가 감염된 것으로 밝혀졌다. 상기 OspA-혈청형은 26마리의 감염된 애벌레중 22마리에 대해 PCR-ELISA로 결정할 수 있고, 86% (19/22)가 비. 아프젤리로서 분류되었고 14% (3/22)는 비. 부르그로르페리 에스.에스.로서 분류되었다.

비-면역화된 대조군 마우스 모두(100%; 10/10)가 감염된 반면에 다가 rOspA 백신으로 면역화된 마우스중 1마리만이 감염되었다(10%; 1/10). 감염된 마우스를 동정하기 위해 사용되는 상이한 방법간에 100%가 일치하였다. 상기 다가의 rOspA 백신은 대조군 그룹과 비교하여 통계학적으로 매우 유의적인 보호를 유도하였다(p=0.00012; 피셔의 정확한 투 테일드 시험).

이들 데이타는 rOspA 1/2 항원을 함유하는 다가의 rOspA 백신이 혈청형 2 OspA를 발현하는 보렐리아 종인 비. 아프젤리에 의한 감염을 예방할 수 있음을 보여준다. 추가로, 추가의 rOspA 항원의 내포가 rOspA 1/2 항원에 의해 부여된 보호 면역에 대해 길항적 효과를 나타낸다는 증거는 없다.

상기 백신은 비. 아프젤리와 함께 진드기 전염된 감염에 대한 보호를 제공하고 이는 OspA 1/2 항원을 사용했을 때 나타난 것과 동일하였고; 0.3㎍의 백신(각각의 항원 0.1 μg)이 0.2% AI(OH)3과 제형화되어 2개의 용량 계획으로 투여되는 경우 웨스턴 블롯, 보렐리아의 배양 및 PCR에 의한 보렐리아 DNA의 검출을 사용한 측측정시 90%의 보호를 제공하였다.

실시예 13:

3개-성분 백신( OspA 1/2, OspA 6/4 및 OspA 5/3)을 포함하는 백신은 OspA 유형 1-6을 발현하는 보렐리아 균주에 결합하고 이의 성장을 억제하는 고수준의 기능성 항- OspA 항체를 유도한다

표면 결합(MFI) 및 성장 억제(GI-50 역가)는 바늘 기회감염 (비. 부르그도르페리 에스.에스.) 모델(실시예 10) 및 진드기 기회감염(비. 아프젤리) 마우스 모델(실시예 11)에서 보호의 우수한 상호관련성을 나타내었기 때문에 본 연구는 균등한 기능성 면역 반응이, 어떠한 생체내 보호 모델이 백신의 효능을 조사하기 위해 가용하지 않은 비. 가리니 OspA 혈청형 3-6에 대해 3개-성분 키메라 rOspA 항원 백신 제형에 의해 유도되는지의 여부를 결정하기 위해 착수하였다.

마우스 면역화. 10마리의 암컷 C3H/HeJ 마우스 그룹을 보조제로서 0.2% AI(OH)3과 조합된 3개의 상이한 용량(용량 당 1, 0.1, 0.03 ㎍의 단백질)에서 rOspA-1/2, rOspA-6/4 및 rOspA-5/3의 1:1:1의 혼합물로 3회 (0일, 14일 및 28일) 피하내 면역화시켰다. 혈청은 40일째 채취한 혈액 샘플로부터 제조하였다.

생 보렐리아의 표면에 결합하는 OspA 항체의 정량. 상기 분석에서, OspA 유형 1-6(비. 부르그도르페리 센수 스트릭토 B31/OspA-1; 비. 아프젤리 Arcon/OspA-2; 비. 가리니 PBr/OspA-3; 비. 가리니 DK6/OspA-4; 비. 가리니 W/OspA-5 및 비. 가리니 KL11/OspA-6)을 발현하는 6개의 대표적인 보렐리아 균주의 시험관내 성장한 배양물을 보체 활성화를 예방하기 위한 EDTA의 존재하에 실온에서 피크 역가 마우스 혈청 풀과 고정된 희석(1:100)에서 항온처리하였다. 후속적인 세척, 표지화, 검출 및 분석 과정은 실시예 10에 기재된 것들과 유사하였다. 정상적인 마우스 혈청은 항체의 비-특이적 결합에 대해 음성 대조군으로서 작용하였다.

세균 성장 억제 분석. 보렐리아의 성장을 억제하는 기회감염-전 혈청의 효능을 측정하기 위해, OspA 유형 1-6을 발현하는 6개의 대표적인 균주(B31, Arcon, PBr, DK6, W, 및 KL11)을 연속 희석된 열-불활성화된 피크 역가 혈청 풀 또는 비-면역 마우스 혈청(음성 대조군)의 존재하에 33℃에서 배양하였다. B31은 보체(기니아 피그 혈청)의 존재하에 배양하고 나머지 다른 5개의 균주는 보체의 부재하에 시험하였다. 일단 다시, 성장 억제 분석을 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행하였다. 표준 혈청 제제를 사용하여 상이한 분석간의 역가를 표준화시켰다.

항- OspA 항체 반응의 표면 결합 및 성장 억제 효능. 50 내지 200의 범위에 이르는 MFI 값을 갖는 강한 형광 염색은 1:100의 희석에서 3개-성분 백신의 상이한 면역화 용량 그룹(용량 당 1.0, 0.1 및 0.03 μg의 단백질)으로부터 유래된 3개의 혈청 풀과 함께 시험되는 경우 모든 6개의 보렐리아 균주에 대해 관찰되었다(도 21). 3개의 용량 그룹 기원의 혈청 풀이 세균 성장을 억제하는 능력에 대해 시험되는 경우, 3개-성분 백신이 또한 모든 6개의 OspA 유형 균주에 대해 1000 (4형 균주, 0.03 μg 용량) 내지 20,000 (6형 균주)에 이르는 범위의 강한 GI-50 역가를 유도하는 것으로 밝혀졌다.

결론. 종합했을때, 이들 결과는 rOspA 항원이 고도로 면역원성이고 생 보렐리아에 결합하고 보렐리아의 성장을 억제하는 대량의 기능성 항체를 유도함을 입증한다. 높은 형광 강도 및 높은 성장 억제 역가가 OspA 유형 1 및 2에 대해 관찰된 수준에 상당하는 것으로 검출됨에 따라 시험된 6개의 균주 중의 포괄은 완전하다. 요약컨대, 상기 연구에서 제공된 결과는 3개-성분 rOspA 백신 (1/2 + 5/3 + 6/4)이 AI(OH)3과 제형화되는 경우, 역학적 연구가 보여준 바와 같이 이론적으로 유럽 및 북아메리카에서 사람 질환을 유발하는 분리물의 99% 이상을 포괄하는 OspA 유형 1-6을 발현하는 균주에 의한 감염을 예방하고 라임 보렐리아증을 예방하는데 효과적임을 지적한다.

실시예 14:

3개 성분 백신 ( OspA 1/2, OspA 6/4, 및 OspA 5/3)을 포함하는 백신은 OspA 유형 1-6을 발현하는 보렐리아를 최적으로 포괄하는데 요구된다

본 연구의 목적은 다시 보호의 상호관련성으로서 생 보렐리아의 표면과 결합하고 시험관내 보렐리아의 성장을 억제하는 항-OspA 항체의 효율을 사용하여 rOspA 라임 보렐리아증 백신의 단일 및 다중-성분 제형에 의해 유도된 기능성 표면 결합 및/또는 성장 억제 항체의 면역원성 및 교차 균주 포괄을 조사하고 비교하는 것이다.

마우스의 면역화. 그룹당 10마리의 암컷 마우스(C3H)를 rOspA 1/2 항원, rOspA 6/4 항원, 또는 rOspA 5/3 항원을 포함하는 0.1㎍의 단일 성분 백신; 0.1 μg의 1 /2 + 5/3 항원 둘다, 1/2 + 6/4 항원, 또는 5/3 + 6/4 항원을 포함하는 2개-성분 백신; 또는 프라임-부스터 계획으로 보조제로서 0.2% AI(OH)3과 함께 0.1μg의 모든 3개의 1/2 + 5/3 + 6/4 항원 조합을 포함하는 3개-성분 백신으로 면역화시킨다. 백신 접종은 0일, 14일 및 28일째 200㎕의 용량을 사용하여 피하내 주사하여 수행하였다. 42일째에, 개별 혈액 샘플은 마우스로부터 채취하여 혈청을 제조하였다.

항체 표면 결합 및 성장 억제 분석. 약간 변형된 버젼의 표면 결합 분석을 사용하여 생 보렐리아의 표면에 결합하는 항-OspA IgG의 효율을 결정하였다. 한정된 MFI 역가를 갖는 연속 희석된 혈청 풀을 상기 분석에 포함시켜 표준 곡선을 작성하고 이로부터 시험 혈청의 상대적 역가를 비-선형 발현 회귀 곡선과의 외삽 후 판독하였다. OspA 유형 1-6을 발현하는 개별 균주에 대한 표준 혈청의 MFI 역가를 보렐리아의 형광 강도가 측정되어 정상적인 마우스 혈청을 사용하여 관찰되는 형광 강도 보다 적어도 3-배인 최고의 희석으로서 정의하였다. 모든 측정은 2회 수행하였다.

도 22에 제공된 스캐터 플롯은 단일 rOspA 항원 또는 rOspA 항원 조합으로 면역화시킨 후 개별 C3H 마우스의 면역 혈청에 대해 관찰된 상동성 OspA 유형을 발현하는 6개의 균주에 대해 MFI 역가를 비교한다. 결과는 모든 3개의 rOspA 항원(1 /2, 5/3 및 6/4)을 함유하는 제형이 OspA 유형 1-6을 발현하는 모든 6개의 보렐리아 균주에 대해 높은 MFI 역가를 유도할 필요가 있었고 2개의 rOspA 항원으로 구성된 제형(즉 4개의 균주를 포괄하는)이 제형중에 존재하지 않는 2개의 OspA 유형을 발현하는 균주를 완전히 포괄하지 못함을 보여주었다.

성장 억제 항체를 유도하는 다양한 백신 조합의 효능을 측정하기 위해, 각각 OspA 유형 1-6을 발현하는 6개의 대표적인 보렐리아 균주(B31, Arcon, PBr, DK6, W, KL11)를 열-불활성화된 면역 또는 비면역 마우스 혈청 풀의 존재하에 33℃에서 배양하였다. 모든 혈청은 단일 희석으로 시험하였다. 하기의 희석율을 사용하였다: B31, PBr 및 KL11 1:200, Arcon, DK6 및 W 1:100. PBr은 20% 보체의 부재하에 배양하고 다른 5개의 균주는 보체의 존재하에 시험하였다. 베이비 토끼 보체는 DK6, W 및 KL11에 대해 사용하였고, 기니아 피그 혈청은 B31 및 Arcon에 대해 사용하였다. 비-면역 혈청과 항온처리된 대조군 배양물중의 세균이 현미경으로 측정된 바와 같이 충분히 성장한 경우, 정확한 세포의 수를 이전에 기재된 바와 같이 계수하였다(실시예 10 참조). 세균 성장 억제 퍼센트는 표준 마우스 혈청 대조군과 대비하여 시험 혈청과 함께 관찰되는 세포로부터 계산하였다. 이어서 시험된 상이한 제형에 대해 관찰된 전체 성장 억제는 50% 이상의 성장 억제를 나타내는 10 마리의 C3H 마우스의 상이한 그룹중에 동물의 수로서 제공된다(도 23). 결과는 상기 3개-성분 제형이 OspA 유형 1-6을 발현하는 모든 6개의 대표적인 균주에 대한 높은 역가의 성장-억제 항체를 유도할 수 있는 유일한 제형임을 입증하였다(도 23). 모든 경우에, 3개-성분 백신 제형은 면역화된 동물 중 90% 초과(>90%)에서 50% 초과(>50%)의 성장 억제를 제공하였다. 2개-성분 백신 제형은 상기 백신에 존재하지 않는 OspA 유형을 발현하는 2개의 균주를 완전히 포괄하지 못했다. rOspA 1/2 + 6/4를 포함하는 제형은 3형 균주를 포괄하지 못했고; rOspA 1/2 + 5/3 제형을 포함하는 제형은 4형 또는 6형을 포괄하지 못했고; 그리고 rOspA 5/3 + 6/4를 포함하는 제형은 1형을 포괄하지 못했다.

실시예 15:

다가 OspA 백신 제형은 OspA 유형 1-6의 내부-유형 변이체 또는 아유형을 발현하는 보렐리아를 포괄한다

보렐리아 OspA 유형 1-6이 다가 rOspA 백신의 디자인 및 작제를 위한 기본으로서 선택되었지만, 유형 1, 2, 3, 5 및 6의 OspA 단백질 변이체를 발현하는 보렐리아가 또한 분리되었다. 동일한 유형내에 있는 것으로 분류되는 이들 변이체는 약간 변형된 뉴클레오타이드 유전자 서열 및 아미노산 단백질 서열을 갖는다. 따라서, 내부-유형 변이체 또는 아유형은 OspA 유형 1, 2, 3, 5, 및 6중에 존재한다 (도 24 참조). 내부-유형 변이체 또는 아유형은 OspA 4형에 대해 아직 관찰되지 않았다.

상기 연구 목적은 3개-성분 다가 rOspA 백신을 사용하여 마우스를 면역화시킴에 의해 생성된 면역 혈청이 상기 내부-유형의 변이체 또는 아유형을 발현하는 생 보렐리아 표면에 결합할 수 있는 기능성 항체를 함유하는지를 확인하는 것이었다.

상기 연구를 위해, 풀링된 마우스 면역 혈청을, 0일, 14일 및 28일째에 3개-성분 다가 rOspA 백신 0.3㎍으로 3회 70마리의 암컷 C3H 마우스를 면역화시킴에 의해 제조하였다. 42일째에, 마우스로부터 채혈하고 혈청을 수득하고 풀링하였다. 이어서 상기 풀링된 면역 혈청을 사용하여 생 보렐리아의 표면에 대한 항체의 결합에 대해 시험하였다. 보렐리아 배양물은 2회 1:100으로 풀링되거나 대조군의 정상적인 마우스 혈청으로 항온처리하고 상기 세균에 대한 항-OspA 항체의 결합을 측정하는 보렐리아의 형광 강도는 상기 본원에 기재된 바와 같이 FACS 분석으로 모니터링하였다.

1:100의 혈청 희석에서 고수준의 표면 결합 항체(비-면역화된 마우스 대조군 혈청에 대해 관찰되는 것의 10배 이상의 형광 광도로서 정의되는)는 OspA 아유형 1-6을 발현하는 균주 대부분에 대해서 검출되었다. 특히, 고수준의 항체 결합은 OspA 아유형 1a, 1b, 1c, 1d, 1f, 1h, 1J, 1k, 및 1l; 2a, 2b, 2e, 2g, 2k, 21, 및 2n; 3a, 3c, 3d, 및 3e; 5a 및 5c; 및 6a, 6e, 6f, 6g, 및 6k를 발현하는 보렐리아 균주를 사용하여 검출하였다(도 24). 보다 약한 결합(비-면역화된 마우스 대조군 혈청에 대해 관찰되는 것의 2-10배의 형광 강도로서 정의되는)이 OspA 아유형 1g, 2j, 2m, 3b, 5d, 및 6I를 발현하는 보렐리아 균주에서 관찰되었지만(도 24), 이의 보다 약한 결합은 주로 사용되는 성장 조건하에서 OspA 단백질의 낮은 발현 때문이다.

결론. 3개-성분 키메라 rOspA 백신은 C3H 마우스에서 OspA 유형 1, 2, 3, 5, 및 6의 모든 내부-유형 변이체 또는 아유형에 대한 기능성, 표면 결합 항체를 유도한다.

실시예 16:

다가 OspA 백신 제형은 OspA 유형 1-6을 발현하는 균주 뿐만 아니라 다른 유형의 보렐리아에 대한 보호를 제공한다

본 연구의 목적은 3개-성분 키메라 rOspA 항원 백신 제형(모든 3개의 키메라 항원 － 1/2, 6/4 및 3/5를 포함하는)이 또한 상동성 OspA 유형 1-6 이외의 OspA 유형을 발현하는 보렐리아에 대한 보호를 제공할 수 있는지를 결정하기 위한 것이다. 40마리의 C3H 마우스를 0일, 14일 및 28일째에 0.3㎍의 3개-성분 백신으로 3회 면역화시켰다. 42일째에, 상기 마우스로부터 채혈하고 혈청 풀을 제조하고 이를 사용하여, 이종성 OspA 유형을 발현하는 균주에 대한 표면 결합 및 성장 억제의 효율을 평가하였다.

상기 연구 결과는 3개-성분 키메라 rOspA 백신이 비. 스피엘마니, 비. 발라이시아니아, 비. 루시타니아 및 비. 자포니카의 균주를 포함하는, 보렐리아의 표면에 결합하고 다른 유형의 보렐리아의 성장을 억제하는 항체를 유도함을 보여주었다(표 9 참조). OspA 7형을 발현하는 비. 가리니의 경우에, 단지 약한 표면 결합 및 거의 없는 성장 억제가 관찰되었지만 이러한 약한 결합 및 소량의 성장 억제는 면역 혈청 항체의 결합 부재 보다는 사용되는 시험관내 배양 조건하에 낮은 발현 수준 때문일 수 있다.

[표 9]

+: 유의적인 표면 결합 및/또는 성장 억제

-: 유의적인 결합/성장 억제 부재

(+-): 낮은 강도의 표면 결합

실시예 17:

다가 OspA 백신 제형은 임의의 OspA 발현 보렐리아 균주에 대한 보호에 기여할 수 있는 OspA 분자의 N-말단에서 통상적인 에피토프에 대한 항체를 유도한다

다가 키메라 rOspA 제형의 보호 효능을 조사하는 과정 동안에, 모노클로날 항체(F237/BK2)를, rOspA-1/2 및 rOspA-6/4를 포함하는 2개-성분 rOspA 백신에 대해 제조하였다.

F237/BK2는 항-OspA ELISA에 의해, 3개의 키메라 rOspA 항원(rOspA-1/2, rOspA-5/3 및 rOspA-6/4) 뿐만 아니라 지금까지 조사된 모든 OspA 유형(OspA 유형 1-7)에 결합하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 F237/BK2가 모든 OspA 분자상에서 발견되는 통상의 에피토프를 인지함을 지적한다. 더욱이, 예비 에피토프 맵핑 연구는 상기 공통된 에피토프가, OspA 서열 상동성이 가장 통상적으로 관찰되는 분자의 덜 가변적인 N-말단 중간(즉, 아미노산 130번의 N-말단)에 위치함을 지적한다.

흥미롭게도, F237/BK2는 또한 C-말단 유형-특이적 에피토프에 대해 지시된 모노클로날 항체보다 덜 효율적이긴 하지만 비. 스피엘마니, 비. 발라이시아니아 및 비. 자포니카에 의해 발현되는 것들을 포함하는, 상동성 OspA 유형 1-6 및 이종성 OspA 유형을 발현하는 보렐리아의 표면에 결합하는 것으로 나타났다. 이전의 실시예에 기재된 것들과 유사한 방법을 사용하여, F237/BK2는 또한 OspA 유형 1, 2, 4, 5 및 6을 발현하는 대표적인 균주의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.

F237/BK2가 마우스에서 생체내 수동 보호 모델로 시험되는 경우, F237/BK2는 비. 아프젤리 유형 2 기회감염에 상응하는 야생 진드기 기회감염에 대한 보호를 제공하는 것으로 관찰되었다. 진드기는 주로 비. 아프젤리로 감염되는 것으로 공지된 오스트리아 스티리아(Styria, Austria)의 지역(Wundschuh)에서 수거되었다. 10마리의 암컷 C3H 마우스에 500μg의 친화성-정제된 mAb F237/BK2를 복강내 주사하였다. 2시간 후에, 8마리의 진드기를 동물당 10마리의 능동적으로 면역화된 마우스 및 10마리의 허위-면역화된 동물에게 적용하였다. 4일 후에, 영양공급받은 진드기를 제거하였다. 90일째에, 마우스를 희생시키고 상기된 바와 같은 혈청학적 시험, PCR 분석 및 보렐리아 배양에 의한 감염에 대해 분석하였다. 어떠한 동물도 F237/BK2로 처리된 그룹에서 감염되지 않은 반면, 5마리의 동물(50%)은 대조군 그룹에서 비. 아프젤리로 감염되었다. 따라서, 모노클로날 항체 F237/BK2는 허위-면역화된 대조군 마우스와 비교하는 경우 진드기 기회감염에 대해 통계학적으로 유의적인(p = 0.0325) 수동 보호를 제공하였다. 이것은 분자의 N-말단 중간상에 있는 통상의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체가 보호에 관여하는 것으로 최초로 보고하는 것이다. 더욱이, 백신이 상기 통상의 에피토프를 인지하는 항체를 유도하는 경우, 상기 항체는 확실히 백신의 교차 보호 효능에 기여할 것이다.

상기 항체가 실제로 3개-성분 키메라 rOspA 백신 제형에 의해 유도되는지의 여부를 시험하기 위해, 모노클로날 항체 억제 ELISA를, 퍼옥시다제 표지된 F237/BK2를 사용하여 수행하였다. 이들 실험에서, GST-OspA 3형 단백질을 피복 항원으로서 사용하였고 정상적인 마우스 혈청 또는 3개-성분 키메라 rOspA 백신으로 3회 면역화된 C3H 마우스 기원의 혈청 풀을 1:100의 희석으로 상기 웰에 첨가하였다. 60분 후에, 퍼옥시다제-표지된 F237/BK2를 예비-최적화된 농도로 첨가하여 궁극적으로 비-억제 정상적인 마우스 혈청 대조군에 대한 광학 밀도(OD) 값이 약 1이 되게하고 추가로 60분동안 항온처리를 계속하였다. 최종적으로, ELISA 플레이트를 세척하고 TMB 기질과 함께 전개하였다.

상기 모노클로날 항체 억제 ELISA 분석을 사용하여, 3개-성분 키메라 rOspA 제형이 실제로 mAb F237/BK2에 의해 인지되는 에피토프와 동일한 에피토와 결합하거나 이의 인접한 부위에 결합하는 항체를 유도함이 입증될 수 있다. OD 값은 비-억제 정상적인 혈청 대조군과 비교하여 항-OspA 면역 혈청에 의해 상당히(예를 들어, 전형적으로 20 내지 30%로) 감소하였다.

결론. 상기 연구는 3개-성분 키메라 rOspA 백신이 유형-특이적 및 광범위 교차-보호 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.

실시예 18:

추가의 합성 OspA 핵산 및 폴리펩타이드 분자

본 연구의 목적은 각각 혈청형 1 및 2, 6 및 4, 및 5 및 3을 포함하는 추가의 신규한 OspA 항원을 디자인하는 것이었다. 3개의 합성 OspA 유전자 (서열번호: 168 (orig sOspA 1/2), 170(orig sOspA 6/4), 및 172 (orig sOspA 5/3))는 보렐리아의 OspA 혈청형 1 및 2 (orig sOspA 1/2), OspA 혈청형 6 및 4 (orig sOspA 6/4) 및 OspA 혈청형 5 및 3 (orig sOspA 5/3) 기원의 보호 에피토프를 갖는 OspA 폴리펩타이드 분자를 암호화하도록 디자인하였다. 이들 분자의 1차 아미노산 서열(각각 서열번호: 169, 171 및 173)은 표 1에 제공된다. 이들 서열은 즉, 돌연변이 및 코돈 최적화 없이 본래의 키메라 작제물을 포함한다.

실시예 19:

3개의 항원 (1/2, 6/4, 및 5/3)을 포함하는 다가 재조합 OspA 제형은 마우스에서 면역원성이다

코돈 최적화 및 돌연변이 없이 본래의 작제물 제형을 포함하는 다가 OspA 백신(orig OspA 1 /2, orig OspA 5/3, 및 orig OspA 6/4)를 진드기 기회감염 모델에서 평가한다. OspA 혈청형 1 및 2 (서열번호: 169), OspA 혈청형 6 및 4 (서열번호: 171), 및 OspA 혈청형 5 및 3 (서열번호: 173) 기원의 보호 에피토프를 함유하는 3개의 재조합 OspA 항원을 백신으로 조합한다.

10마리의 암컷 C3H/HeJ 마우스 그룹(면역화시 연령: 11주령)을 0일 및 28일째에 고정된 용량의 0.3㎍의 다가 백신(각각 0.1 μg, orig OspA 1/2, orig OspA 5/3, 및 orig OspA 6/4)으로 피하내 면역화시킨다. 상기 진드기 기회감염은 체코 공화국, 부드바이즈(Budweis) 기원의 진드기로 본원에 기재된 바와 같이 수행한다. 비. 부르그로르페리 에스.엘.을 마우스에 전염시키는 야생 진드기의 능력은 비-면역화된 대조군 동물을 기회감염시킴에 의해 확인한다. 기회감염된 마우스의 감염 상태는 웨스턴 블롯팅, 실-시간 PCR 및 배양에 의해 결정한다.

잠정적인 혈액 샘플은 41일째에 궤도 천공에 의해 채혈한다. 최종 혈액 샘플(70/71일)은 심장 천공에 의해 수거한다. 개별 혈청은 원심분리(10분: 1000 -2000xG; RT)에 의해 전혈로부터 제조한다. 혈청은 사용시 때까지 -20℃ 이하(≤-20℃)에서 보관한다.

상기 실험에서, 마우스를 기회감염시키기 위해 사용되는 동일한 배치로부터 취득한 영양공급되지 않은 진드기를 특징 분석하여 전체 감염률을 측정하고 감염 유기체의 종을 확인한다.

실시예 20:

3개-성분 백신 ( Orig OspA 1/2, Orig OspA 6/4, 및 Orig OspA 5/3)을 포함하는 백신은 OspA 유형 1-6을 발현하는 보렐리아 균주에 결합하고 이의 성장을 억제하는 고수준의 기능성 항- OspA 항체를 유도한다

실시예 13에 제공된 결과는 3개-성분 rOspA 백신 (lipB sOspA1/2 + lipB sOspA 5/3 + lipB sOspA 6/4)이 AI(OH)3과 제형화되는 경우 이에 의해 유발된 항체 반응이 OspA 유형 1-6을 발현하는 균주에 의한 감염을 예방하고 따라서 라임 보렐리아증을 예방하는데 효과적임을 지적한다. 따라서, 본 연구는 균등한 기능성 면역 반응이 키메라 본래의 (orig) OspA 항원 (Orig sOspA 1/2 + Orig sOspA 5/3 + Orig sOspA 6/4)을 포함하는 3개-성분 OspA 백신에 의해 유도되는지의 여부를 결정하기 위해 수행한다.

마우스 면역화. 10마리 암컷 C3H/HeJ 마우스의 그룹을 보조제로서 0.2% AI(OH)3과 조합된 3개의 상이한 용량 (1, 0.1, 0.03μg 단백질 용량)에서 1:1:1 혼합물의 Orig sOspA 1/2 + Orig sOspA 5/3 + Orig sOspA 6/4로 3회 (0일, 14일 및 28일) 피하내 면역화시킨다. 혈청은 40일째에 채혈된 혈액 샘플로부터 제조한다.

생 보렐리아의 표면에 결합하는 OspA 항체의 정량. 상기 분석에서, OspA 유형 1-6을 발현하는 6개의 대표적인 보렐리아 균주(비. 부르그도르페리 센수 스트릭토 B31 /OspA-1; 비. 아프젤리 Arcon/OspA-2; 비. 가리니 PBr/OspA-3; 비, 가리니 DK6/OspA-4; 비. 가리니/W/OspA-5; 및 비. 가리니 KL11/0spA-6)의 시험관내 성장한 배양물을 보체 활성화를 예방하는 EDTA의 존재하에 실온에서 피크 역가 마우스 혈청의 풀로 고정된 희석율(1:100)로 항온처리하였다. 후속적인 세척, 표지화, 검출 및 분석 과정은 실시예 10 및 13에 기재된 것들과 유사하다. 정상적인 마우스 혈청은 항체의 비특이적 결합에 대한 음성 대조군으로서 작용한다.

세균 성장 억제 분석. 보렐리아의 성장을 억제하는 기회감염-전 혈청의 효능을 측정하기 위해, OspA 유형 1-6 (B31, Arcon, PBr, DK6, W, 및 KL11)을 발현하는 6개의 대표적인 균주는 연속적으로 희석된 열-불활성화된 피크 역가 혈청 풀 또는 비-면역 마우스 혈청(음성 대조군)의 존재하에 33℃에서 배양한다. B31은 보제(기니아 피그 혈청)의 존재하에 배양하고 다른 5개의 균주는 보체의 부재하에 시험한다. 성장 억제 분석은 실시예 10 및 13에 기재된 바와 같이 수행한다. 표준 혈청 제제를 사용하여 상이한 분석간에 역가를 표준화한다.

항- OspA 항체 반응의 표면 결합 및 성장 억제 효능. 형광 염색은 1:100으로 희석된 3개-성분 백신의 상이한 면역화 용량 그룹 (용량 당 1.0, 0.1 및 0.03 μg)으로부터 유래된 3개의 혈청 풀로 시험하는 경우 모든 6개의 보렐리아 균주에서 측정한다.

실시예 21 :

3개-성분 백신 ( OspA 1/2, OspA 6/4 및 OspA 5/3)을 포함하는 백신은 최적으로 OspA 유형 1-6을 발현하는 보렐리아를 포괄하는데 요구된다

상기 연구의 목적은 보호의 상호관련성으로서 시험관내 보렐리아의 성장을 억제하고 생 보렐리아의 표면에 결합하는 항-OspA 항체의 효율을 사용하여, Orig sOspA 라임 보렐리아증 백신의 단일 및 다가-성분 제형에 의해 유도된 기능성 표면 결합 및/또는 성장 억제 항체의 면역원성 및 교차 균주 포괄을 조사하고 비교하는 것이다.

마우의 면역화. 그룹 당 10마리의 암컷 마우스(C3H)을 프라임-부스터 계획에서, 보조제로서 0.2% AI(OH)3과 함께, Orig sOspA 1/2 항원, Orig sOspA 5/3 항원, 또는 Orig sOspA 6/4 항원을 포함하는 0.1㎍의 단일 성분 백신; 0.1 μg의 1/2 + 5/3 항원 둘다, 1/2 + 6/4 항원, 또는 5/3 + 6/4 항원을 포함하는 2개-성분 백신; 또는 0.1 μg의 모든 3개의 1/2 + 5/3 + 6/4 항원의 조합을 포함하는 3개-성분 백신으로 면역화시킨다. 백신 접종은 0일, 14일 및 28일째에 200㎕의 용적을 사용하여 피하내 수행한다. 42일째에 개별 혈액 샘플은 마우스로부터 채취하여 혈청을 제조한다.

항체 표면 결합 및 성장 억제 분석. 약간 변형된 버젼의 상기된 표면 결합 분석을 사용하여 생 보렐리아의 표면에 결합하는 항-OspA IgG의 효율을 결정한다. 한정된 MFI 역가를 갖는 연속적으로 희석된 혈청 풀을 분석에 포함시켜 표준 곡선을 작성하고 이로부터 시험 혈청의 상대적 역가를 비-선형 회귀 곡선과 외삽한 후 판독한다. OspA 유형 1-6을 발현하는 개별 균주에 대한 표준 혈청의 MFI 역가는 보렐리아의 형강 강도가 정상의 마우스 혈청으로 관찰되는 형광 강도 보다 3-배 이상인 것으로 측정되는 최고 희석율로서 정의된다. 모든 측정은 2회 수행한다.

성장 억제 항체를 유도하는 다양한 백신 조합의 효능을 결정하기 위해, 각각 OspA 유형 1-6을 발현하는 6개의 대표?인 보렐리아 균주(B31, Arcon, PBr, DK6, W, KL11)을 열-불활성화된 면역 또는 비-면역 마우스 혈청 풀의 존재하에 33℃에서 배양한다. 모든 혈청은 단일 희석으로 시험한다. 하기의 희석을 사용한다: B31, PBr 및 KL11 1:200, Arcon, DK6 및 W 1:100. PBr은 20% 보체의 부재하에 배양하고 다른 5개의 균주는 보체의 존재하에 시험한다. 베이비 래빗 보체는 DK6, W 및 KL11을 위해 사용하고 기니아 피그 혈청은 B31 및 Arcon에 대해 사용한다. 비-면역 혈청으로 항온처리된 대조군 배양물중의 세균이 현미경으로 측정시 상당히 성장한 경우, 정확한 세포수는 이전에 기재한 바와 같이 계수한다(실시예 10 참조). 세균 성장 억제의 퍼센트는 정상적인 마우스 혈청 대조군과 비교하여 시험 혈청과 함께 관찰된 세포 계수로부터 계산한다. 이어서 시험된 상이한 제형에 대해 관찰된 전체 성장 억제는 50% 이상의 성장 억제를 나타낸 10마리의 C3H 마우스의 상이한 그룹중의 동물의 수로서 나타낸다.

실시예 22:

다가의 OspA 백신 제형은 OspA 유형 1-6의 내부-유형 변이체 또는 아유형을 발현하는 볼레리아를 포괄한다

본 연구의 목적은 마우스를 3개-성분 다가 orig OspA 백신 (orig sOspA 1/2, orig sOspA 6/4, 및 orig sOspA 5/3)으로 면역화시킴에 의해 제조된 면역 혈청이 상기 내부-유형 변이체 또는 아유형을 발현하는 생 보렐리아의 표면에 결합할 수 있는 기능성 항체를 함유하는지를 확인하는 것이었다.

본 연구를 위해, 풀링된 마우스 면역 혈청은 70마리의 암컷 C3H 마우스를 0일, 14일 및 28일째에 0.3㎍의 3개-성분 다가 orig OspA 백신으로 3회 면역화시킴에 의해 제조한다. 42일째에 마우스에서 채혈하고 혈청을 수득하고 풀링한다. 이어서 상기 풀링된 면역계를 사용하여 항체가 생 보렐리아의 표면에 결합하는 것에 대해 시험한다. 보렐리아 배양물을 1:100에서 2회, 면역 혈청 풀 또는 대조군 정상의 마우스 혈청으로 항온처리하고 항-OspA 항체의 상기 세균으로의 결합을 측정하는 보렐리아의 형광 강도는 상기 본원에 기재된 바와 같은 FACS 분석에 의해 모니터링한다.

본 발명은 본 발명의 수행을 위한 특정 양태를 포함하는 것으로 밝혀지거나 제안된 특정 양태의 관점에서 기재된다. 기재된 발명의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 취지에서 벗어남이 없이 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명은 특정 양태와 연계하여 기재되었지만, 이것은 청구된 바와 같은 발명이 상기 특정 양태로 지나치게 제한되지 말아야하는 것으로 이해되어야만 한다. 실제로, 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형이 당업자에게 자명하고 하기의 특허청구범위의 취지내에 있는 것으로 의도된다.

<110> CROWE, et al. <120> CHIMERIC OSPA GENES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 31315/44557A2 <150> 61/334,901 <151> 2010-05-14 <160> 173 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 1 catatgcgtc tgttgatcgg ctttgctctg gcgctggctc tgatcggctg cgcacagaaa 60 ggtgctgagt ctattggttc cgtttctgta gatctgcccg gtgaaatgaa ggttctggtg 120 agcaaagaaa aagacaagaa cggcaagtac gatctcatcg caaccgtcga caagctggag 180 ctgaaaggta cttctgataa aaacaacggc tctggtgtgc tggagggcgt caaaactaac 240 aagagcaaag taaagcttac gatctctgac gatctcggtc agaccacgct ggaagttttc 300 aaagaggatg gcaagaccct cgtgtccaaa aaagtaactt ccaaagacaa gtcctctacg 360 gaagaaaaat tcaacgaaaa aggtgaggtg tctgaaaaga tcatcaccat ggcagacggc 420 acccgtcttg aatacaccgg tattaaaagc gatggtaccg gtaaagcgaa atatgttctg 480 aaaaacttca ctctggaagg caaagtggct aatgataaaa ccaccttgga agtcaaggaa 540 ggcaccgtta ctctgagcat gaatatctcc aaatctggtg aagtttccgt tgaactgaac 600 gacactgaca gcagcgctgc gactaaaaaa actgcagcgt ggaattccaa aacttctact 660 ttaaccatta gcgttaacag caaaaaaact acccagctgg tgttcactaa acaagacacg 720 atcactgtgc agaaatacga ctccgcaggc accaacttag aaggcacggc agtcgaaatt 780 aaaacccttg atgaactgaa aaacgcgctg aaataagctg agcggatcc 829 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu 85 90 95 Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr 100 105 110 Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu 115 120 125 Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Met Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr 130 135 140 Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Val Leu Lys 145 150 155 160 Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp Lys Thr Thr Leu Glu 165 170 175 Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Met Asn Ile Ser Lys Ser Gly 180 185 190 Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys 195 200 205 Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Val 210 215 220 Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe Thr Lys Gln Asp Thr Ile 225 230 235 240 Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu Gly Thr Ala 245 250 255 Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu Lys 260 265 270 <210> 3 <211> 832 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 3 catatgcgtc tgttgatcgg ctttgctctg gcgctggctc tgatcggctg cgcacagaaa 60 ggtgctgagt ctattggttc cgtttctgta gatctgcccg gtggcatgac cgttctggtc 120 agcaaagaaa aagacaaaaa cggtaaatac agcctcgagg cgaccgtcga caagcttgag 180 ctgaaaggca cctctgataa aaacaacggt tccggcaccc tggaaggtga aaaaactaac 240 aaaagcaaag tgaaactgac cattgctgat gacctcagcc agaccaaatt cgaaattttc 300 aaagaagatg ccaaaacctt agtatccaaa aaagtgaccc tgaaagacaa gtcctctacc 360 gaagaaaaat tcaacgaaaa gggtgaaacc tctgaaaaaa ccatcgtaat ggcaaatggt 420 acccgtctgg aatacaccga catcaaaagc gatggctccg gcaaagccaa atacgttctg 480 aaagacttca ccctggaagg caccctcgct gccgacggca aaaccacctt gaaagttacc 540 gaaggcactg ttgttttaag catgaacatc ttaaaatccg gtgaaatcac cgttgcgctg 600 gatgactctg acaccactca ggccactaaa aaaaccggca aatgggattc taacacttcc 660 actctgacca tcagcgtgaa ttccaaaaaa actaaaaaca tcgtgttcac caaagaagac 720 accatcaccg tccagaaata cgactctgcg ggcaccaacc tcgaaggcaa cgcagtcgaa 780 atcaaaaccc tggatgaact gaaaaacgct ctgaaataag ctgagcggat cc 832 <210> 4 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Gly Met Thr Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Tyr Ser Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Gln Thr Lys Phe 85 90 95 Glu Ile Phe Lys Glu Asp Ala Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr 100 105 110 Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu 115 120 125 Thr Ser Glu Lys Thr Ile Val Met Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu Tyr 130 135 140 Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Tyr Val Leu Lys 145 150 155 160 Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys Thr Thr Leu 165 170 175 Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser Met Asn Ile Leu Lys Ser 180 185 190 Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Ser Asp Thr Thr Gln Ala Thr 195 200 205 Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Asn Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser 210 215 220 Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn Ile Val Phe Thr Lys Glu Asp Thr 225 230 235 240 Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu Gly Asn 245 250 255 Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu Lys 260 265 270 <210> 5 <211> 829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 5 catatgcgtc tgttgatcgg ctttgctttg gcgctggctt taatcggctg tgcacagaaa 60 ggtgctgagt ctattggttc cgtttctgta gatctgcccg ggggtatgaa agttctggta 120 agcaaagaaa aagacaaaaa cggtaaatac agcctgatgg caaccgtaga aaagctggag 180 cttaaaggca cttctgataa aaacaacggt tctggcaccc tggaaggtga aaaaactaac 240 aaaagcaaag taaagcttac tattgctgag gatctgagca aaaccacctt tgaaatcttc 300 aaagaagatg gcaaaactct ggtatctaaa aaagtaaccc tgaaagacaa gtcttctacc 360 gaagaaaaat tcaacgaaaa gggtgaaatc tctgaaaaaa ctatcgtaat ggcaaatggt 420 acccgtctgg aatacaccga catcaaaagc gataaaaccg gcaaagctaa atacgttctg 480 aaagacttta ctctggaagg cactctggct gctgacggca aaaccactct gaaagttacc 540 gaaggcactg ttactctgag catgaacatt tctaaatccg gcgaaatcac cgttgcactg 600 gatgacactg actctagcgg caataaaaaa tccggcacct gggattctga tacttctact 660 ttaaccatta gcaaaaacag ccagaaaact aaacagctgg tattcaccaa agaaaacact 720 atcaccgtac agaactataa ccgtgcaggc aatgcgctgg aaggcagccc ggctgaaatt 780 aaagatctgg cagagctgaa agccgctttg aaataagctg agcggatcc 829 <210> 6 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp Leu Ser Lys Thr Thr Phe 85 90 95 Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr 100 105 110 Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu 115 120 125 Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Met Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu Tyr 130 135 140 Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Val Leu Lys 145 150 155 160 Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys Thr Thr Leu 165 170 175 Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Met Asn Ile Ser Lys Ser 180 185 190 Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Thr Asp Ser Ser Gly Asn Lys 195 200 205 Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser Asp Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile 225 230 235 240 Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn Ala Leu Glu Gly Ser Pro 245 250 255 Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Lys Ala Ala Leu Lys 260 265 270 <210> 7 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 7 catatggcac agaaaggtgc tgagtctatt ggttccgttt ctgtagatct gcccggtgaa 60 atgaaggttc tggtgagcaa agaaaaagac aagaacggca agtacgatct catcgcaacc 120 gtcgacaagc tggagctgaa aggtacttct gataaaaaca acggctctgg tgtgctggag 180 ggcgtcaaaa ctaacaagag caaagtaaag cttacgatct ctgacgatct cggtcagacc 240 acgctggaag ttttcaaaga ggatggcaag accctcgtgt ccaaaaaagt aacttccaaa 300 gacaagtcct ctacggaaga aaaattcaac gaaaaaggtg aggtgtctga aaagatcatc 360 accatggcag acggcacccg tcttgaatac accggtatta aaagcgatgg taccggtaaa 420 gcgaaatatg ttctgaaaaa cttcactctg gaaggcaaag tggctaatga taaaaccacc 480 ttggaagtca aggaaggcac cgttactctg agcatgaata tctccaaatc tggtgaagtt 540 tccgttgaac tgaacgacac tgacagcagc gctgcgacta aaaaaactgc agcgtggaat 600 tccaaaactt ctactttaac cattagcgtt aacagcaaaa aaactaccca gctggtgttc 660 actaaacaag acacgatcac tgtgcagaaa tacgactcca acggcaccaa cttagaaggc 720 acggcagtcg aaattaaaac ccttgatgaa ctgaaaaacg cgctgaaata agctgagcgg 780 atcc 784 <210> 8 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Met Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu 1 5 10 15 Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly 20 25 30 Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr 35 40 45 Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Thr Asn 50 55 60 Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr 65 70 75 80 Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val 85 90 95 Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly 100 105 110 Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Met Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu 115 120 125 Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Val Leu 130 135 140 Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp Lys Thr Thr Leu 145 150 155 160 Glu Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Met Asn Ile Ser Lys Ser 165 170 175 Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr 180 185 190 Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser 195 200 205 Val Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe Thr Lys Gln Asp Thr 210 215 220 Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu Gly Thr 225 230 235 240 Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu Lys 245 250 255 <210> 9 <211> 787 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 9 catatggcac agaaaggtgc tgagtctatt ggttccgttt ctgtagatct gcccggtggc 60 atgaccgttc tggtcagcaa agaaaaagac aaaaacggta aatacagcct cgaggcgacc 120 gtcgacaagc ttgagctgaa aggcacctct gataaaaaca acggttccgg caccctggaa 180 ggtgaaaaaa ctaacaaaag caaagtgaaa ctgaccattg ctgatgacct cagccagacc 240 aaattcgaaa ttttcaaaga agatgccaaa accttagtat ccaaaaaagt gaccctgaaa 300 gacaagtcct ctaccgaaga aaaattcaac gaaaagggtg aaacctctga aaaaaccatc 360 gtaatggcaa atggtacccg tctggaatac accgacatca aaagcgatgg ctccggcaaa 420 gccaaatacg ttctgaaaga cttcaccctg gaaggcaccc tcgctgccga cggcaaaacc 480 accttgaaag ttaccgaagg cactgttgtt ttaagcatga acatcttaaa atccggtgaa 540 atcaccgttg cgctggatga ctctgacacc actcaggcca ctaaaaaaac cggcaaatgg 600 gattctaaca cttccactct gaccatcagc gtgaattcca aaaaaactaa aaacatcgtg 660 ttcaccaaag aagacaccat caccgtccag aaatacgact ctgcgggcac caacctcgaa 720 ggcaacgcag tcgaaatcaa aaccctggat gaactgaaaa acgctctgaa ataagctgag 780 cggatcc 787 <210> 10 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Met Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu 1 5 10 15 Pro Gly Gly Met Thr Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly 20 25 30 Lys Tyr Ser Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr 35 40 45 Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys Thr Asn 50 55 60 Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Gln Thr Lys 65 70 75 80 Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Ala Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val 85 90 95 Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly 100 105 110 Glu Thr Ser Glu Lys Thr Ile Val Met Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu 115 120 125 Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Tyr Val Leu 130 135 140 Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys Thr Thr 145 150 155 160 Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser Met Asn Ile Leu Lys 165 170 175 Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Ser Asp Thr Thr Gln Ala 180 185 190 Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Asn Thr Ser Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn Ile Val Phe Thr Lys Glu Asp 210 215 220 Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu Gly 225 230 235 240 Asn Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu Lys 245 250 255 <210> 11 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 11 catatggcac agaaaggtgc tgagtctatt ggttccgttt ctgtagatct gcccgggggt 60 atgaaagttc tggtaagcaa agaaaaagac aaaaacggta aatacagcct gatggcaacc 120 gtagaaaagc tggagcttaa aggcacttct gataaaaaca acggttctgg caccctggaa 180 ggtgaaaaaa ctaacaaaag caaagtaaag cttactattg ctgaggatct gagcaaaacc 240 acctttgaaa tcttcaaaga agatggcaaa actctggtat ctaaaaaagt aaccctgaaa 300 gacaagtctt ctaccgaaga aaaattcaac gaaaagggtg aaatctctga aaaaactatc 360 gtaatggcaa atggtacccg tctggaatac accgacatca aaagcgataa aaccggcaaa 420 gctaaatacg ttctgaaaga ctttactctg gaaggcactc tggctgctga cggcaaaacc 480 actctgaaag ttaccgaagg cactgttact ctgagcatga acatttctaa atccggcgaa 540 atcaccgttg cactggatga cactgactct agcggcaata aaaaatccgg cacctgggat 600 tctgatactt ctactttaac cattagcaaa aacagccaga aaactaaaca gctggtattc 660 accaaagaaa acactatcac cgtacagaac tataaccgtg caggcaatgc gctggaaggc 720 agcccggctg aaattaaaga tctggcagag ctgaaagccg ctttgaaata agctgagcgg 780 atcc 784 <210> 12 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Met Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu 1 5 10 15 Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly 20 25 30 Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr 35 40 45 Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys Thr Asn 50 55 60 Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp Leu Ser Lys Thr Thr 65 70 75 80 Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val 85 90 95 Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly 100 105 110 Glu Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Met Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu 115 120 125 Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Val Leu 130 135 140 Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys Thr Thr 145 150 155 160 Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Met Asn Ile Ser Lys 165 170 175 Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Thr Asp Ser Ser Gly Asn 180 185 190 Lys Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser Asp Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser 195 200 205 Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr 210 215 220 Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn Ala Leu Glu Gly Ser 225 230 235 240 Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Lys Ala Ala Leu Lys 245 250 255 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 14 tcggggctgg cttaactatg 20 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 15 gcttccggct cgtat 15 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 16 gcttccggct cgtatgttgt 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 17 ttatgctagt tattgctcag cg 22 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 18 ttcccctcta gaaataattt tgt 23 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 19 ggaattccat atgcgtctgt tgatcggct 29 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 20 ttggtgcctg cggagtcg 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 21 aatacgactc cgcaggcacc 20 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 22 ctgggatccg ctcagcttat ttca 24 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 23 cgtgcgtacc atatggcaca gaaaggtgct gagtct 36 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 24 Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 25 Lys Glu Lys Asp Lys Asn 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 26 Lys Thr Asn Lys Ser Lys 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Lys Glu Lys Asn Lys Asp 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Lys Glu Lys Asp Lys Asp 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Lys Ala Asp Lys Ser Lys 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Lys Thr Asp Lys Ser Lys 1 5 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 31 catatgcgtc tgttgatcgg ctttgctctg gcgctggctc tgatcggctg cgcacagaaa 60 <210> 32 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 32 catatggcac agaaa 15 <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gln Lys <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Met Ala Gln Lys 1 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 35 gcaaaaacag ccagaaaact aaacagctgg tattcaccaa agaaaacact 50 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 36 gcaaaaacag ccagaaaact aaacagctgg g 31 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 37 aattcaaaca gctggtattc accaaagaaa acact 35 <210> 38 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 38 gatcactgtg cagaaatacg actccaacgg caccaactta gaaggcacgg cagtc 55 <210> 39 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 39 gatcactgtg cagaaatacg actccgcagg caccaactta gaaggcacgg cagtc 55 <210> 40 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 40 gatcactgtg cagaaatacg actccggcac caacttagaa ggcacggcag tc 52 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 41 cgactccgca ggcaccaa 18 <210> 42 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 42 atgagattat taataggatt tgctttagcg ttagctttaa taggatgtgc acaaaaaggt 60 gctgagtcaa ttggatccgt ttcagtagat ttgcctggtg aaatgaaagt tcttgtaagc 120 aaagaaaaag acaaaaacgg caagtacgat ctaattgcaa cagtagacaa gcttgagctt 180 aaaggaactt ctgataaaaa caatggatct ggagtacttg aaggcgtaaa aactaacaaa 240 agtaaagtaa aattaacaat ttctgacgat ctaggtcaaa ccacacttga agttttcaaa 300 gaagatggca aaacactagt atcaaaaaaa gtaacttcca aagacaagtc atcaacagaa 360 gaaaaattca atgaaaaagg tgaagtatct gaaaaaataa taacaatggc agacggaacc 420 agacttgaat acacaggaat taaaagcgat ggaactggaa aagctaaata tgttttaaaa 480 aattttactc ttgaaggaaa agtagctaat gataaaacaa cattggaagt aaaagaagga 540 accgttactt taagtatgaa tatttcaaaa tctggggaag tttcagttga acttaatgac 600 actgacagta gtgctgctac taaaaaaact gcagcttgga attcaaaaac ttctacttta 660 acaattagtg ttaacagcaa aaaaactaca caacttgtgt ttactaaaca agacacaata 720 actgtacaaa aatacgactc caacggtacc aatttagaag gcacagcagt cgaaattaaa 780 acacttgatg aacttaaaaa cgctttaaaa taa 813 <210> 43 <211> 826 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 43 atgcgtctgt tgatcggctt tgctctggcg ctggctctga tcggctgcgc acagaaaggt 60 gctgagtcta ttggttccgt ttctgtagat ctgcccggtg aaatgaaggt tctggtgagc 120 aaagaaaaag acaagaacgg caagtacgat ctcatcgcaa ccgtcgacaa gctggagctg 180 aaaggtactt ctgataaaaa caacggctct ggtgtgctgg agggcgtcaa aactaacaag 240 agcaaagtaa agcttacgat ctctgacgat ctcggtcaga ccacgctgga agttttcaaa 300 gaggatggca agaccctcgt gtccaaaaaa gtaacttcca aagacaagtc ctctacggaa 360 gaaaaattca acgaaaaagg tgaggtgtct gaaaagatca tcaccatggc agacggcacc 420 cgtcttgaat acaccggtat taaaagcgat ggtaccggta aagcgaaata tgttctgaaa 480 aacttcactc tggaaggcaa agtggctaat gataaaacca ccttggaagt caaggaaggc 540 accgttactc tgagcatgaa tatctccaaa tctggtgaag tttccgttga actgaacgac 600 actgacagca gcgctgcgac taaaaaaact gcagcgtgga attccaaaac ttctacttta 660 accattagcg ttaacagcaa aaaaactacc cagctggtgt tcactaaaca agacacgatc 720 actgtgcaga aatacgactc cgcaggcacc aacttagaag gcacggcagt cgaaattaaa 780 acccttgatg aactgaaaaa cgcgctgaaa taagctgagc ggatcc 826 <210> 44 <211> 818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 44 atatgagatt attaatagga tttgctttag cgttagcttt aataggatgt gcacaaaaag 60 gtgctgagtc aattggatcc gtttcagtag atttacctgg tggaatgaca gttcttgtaa 120 gtaaagaaaa agacaaagac ggtaaataca gtctagaggc aacagtagac aagcttgagc 180 ttaaaggaac ttctgataaa aacaacggtt ctggaacact tgaaggtgaa aaaactgaca 240 aaagtaaagt aaaattaaca attgctgatg acctaagtca aactaaattt gaaattttca 300 aagaagatgc caaaacatta gtatcaaaaa aagtaaccct taaagacaag tcatcaacag 360 aagaaaaatt caacgaaaag ggtgaaacat ctgaaaaaac aatagtaaga gcaaatggaa 420 ccagacttga atacacagac ataaaaagcg atggatccgg aaaagctaaa gaagttttaa 480 aagactttac tcttgaagga actctagctg ctgacggcaa aacaacattg aaagttacag 540 aaggcactgt tgttttaagc aagaacattt taaaatccgg agaaataaca gttgcacttg 600 atgactctga cactactcag gctactaaaa aaactggaaa atgggattca aatacttcca 660 ctttaacaat tagtgtgaat agcaaaaaaa ctaaaaacat tgtatttaca aaagaagaca 720 caataacagt acaaaaatac gactcagcag gcaccaatct agaaggcaac gcagtcgaaa 780 ttaaaacact tgatgaactt aaaaacgctt taaaataa 818 <210> 45 <211> 831 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 45 atatgcgtct gttgatcggc tttgctctgg cgctggctct gatcggctgc gcacagaaag 60 gtgctgagtc tattggttcc gtttctgtag atctgcccgg tggcatgacc gttctggtca 120 gcaaagaaaa agacaaaaac ggtaaataca gcctcgaggc gaccgtcgac aagcttgagc 180 tgaaaggcac ctctgataaa aacaacggtt ccggcaccct ggaaggtgaa aaaactaaca 240 aaagcaaagt gaaactgacc attgctgatg acctcagcca gaccaaattc gaaattttca 300 aagaagatgc caaaacctta gtatccaaaa aagtgaccct gaaagacaag tcctctaccg 360 aagaaaaatt caacgaaaag ggtgaaacct ctgaaaaaac catcgtaatg gcaaatggta 420 cccgtctgga atacaccgac atcaaaagcg atggctccgg caaagccaaa tacgttctga 480 aagacttcac cctggaaggc accctcgctg ccgacggcaa aaccaccttg aaagttaccg 540 aaggcactgt tgttttaagc atgaacatct taaaatccgg tgaaatcacc gttgcgctgg 600 atgactctga caccactcag gccactaaaa aaaccggcaa atgggattct aacacttcca 660 ctctgaccat cagcgtgaat tccaaaaaaa ctaaaaacat cgtgttcacc aaagaagaca 720 ccatcaccgt ccagaaatac gactctgcgg gcaccaacct cgaaggcaac gcagtcgaaa 780 tcaaaaccct ggatgaactg aaaaacgctc tgaaataagc tgagcggatc c 831 <210> 46 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 46 catatgagat tattaatagg atttgcttta gcgttagctt taataggatg tgcacaaaaa 60 ggtgctgagt caattggatc cgtttcagta gatttacctg gtggaatgaa agttcttgta 120 agtaaagaaa aagacaaaga tggtaaatac agtctaatgg caacagtaga aaagcttgag 180 cttaaaggaa cttctgataa aaacaacggt tctggaacac ttgaaggtga aaaaactgac 240 aaaagtaaag taaaattaac aattgctgag gatctaagta aaaccacatt tgaaatcttc 300 aaagaagatg gcaaaacatt agtatcaaaa aaagtaaccc ttaaagacaa gtcatcaaca 360 gaagaaaaat tcaacgaaaa gggtgaaata tctgaaaaaa caatagtaag agcaaatgga 420 accagacttg aatacacaga cataaaaagc gataaaaccg gaaaagctaa agaagtttta 480 aaagacttta ctcttgaagg aactctagct gctgacggca aaacaacatt gaaagttaca 540 gaaggcactg ttactttaag caagaacatt tcaaaatccg gagaaataac agttgcactt 600 gatgacactg actctagcgg caataaaaaa tccggaacat gggattcaga tacttctact 660 ttaacaatta gtaaaaacag tcaaaaaact aaacaacttg tattcacaaa agaaaacaca 720 ataacagtac aaaactataa cagagcaggc aatgcgcttg aaggcagccc agctgaaatt 780 aaagatcttg cagagcttaa agccgcttta aaataa 816 <210> 47 <211> 829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 47 catatgcgtc tgttgatcgg ctttgctttg gcgctggctt taatcggctg tgcacagaaa 60 ggtgctgagt ctattggttc cgtttctgta gatctgcccg ggggtatgaa agttctggta 120 agcaaagaaa aagacaaaaa cggtaaatac agcctgatgg caaccgtaga aaagctggag 180 cttaaaggca cttctgataa aaacaacggt tctggcaccc tggaaggtga aaaaactaac 240 aaaagcaaag taaagcttac tattgctgag gatctgagca aaaccacctt tgaaatcttc 300 aaagaagatg gcaaaactct ggtatctaaa aaagtaaccc tgaaagacaa gtcttctacc 360 gaagaaaaat tcaacgaaaa gggtgaaatc tctgaaaaaa ctatcgtaat ggcaaatggt 420 acccgtctgg aatacaccga catcaaaagc gataaaaccg gcaaagctaa atacgttctg 480 aaagacttta ctctggaagg cactctggct gctgacggca aaaccactct gaaagttacc 540 gaaggcactg ttactctgag catgaacatt tctaaatccg gcgaaatcac cgttgcactg 600 gatgacactg actctagcgg caataaaaaa tccggcacct gggattctga tacttctact 660 ttaaccatta gcaaaaacag ccagaaaact aaacagctgg tattcaccaa agaaaacact 720 atcaccgtac agaactataa ccgtgcaggc aatgcgctgg aaggcagccc ggctgaaatt 780 aaagatctgg cagagctgaa agccgctttg aaataagctg agcggatcc 829 <210> 48 <211> 829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 48 ggatccgctc agcttatttc agcgcgtttt tcagttcatc aagggtttta atttcgactg 60 ccgtgccttc taagttggtg cctgcggagt cgtatttctg cacagtgatc gtgtcttgtt 120 tagtgaacac cagctgggta gtttttttgc tgttaacgct aatggttaaa gtagaagttt 180 tggaattcca cgctgcagtt tttttagtcg cagcgctgct gtcagtgtcg ttcagttcaa 240 cggaaacttc accagatttg gagatattca tgctcagagt aacggtgcct tccttgactt 300 ccaaggtggt tttatcatta gccactttgc cttccagagt gaagtttttc agaacatatt 360 tcgctttacc ggtaccatcg cttttaatac cggtgtattc aagacgggtg ccgtctgcca 420 tggtgatgat cttttcagac acctcacctt tttcgttgaa tttttcttcc gtagaggact 480 tgtctttgga agttactttt ttggacacga gggtcttgcc atcctctttg aaaacttcca 540 gcgtggtctg accgagatcg tcagagatcg taagctttac tttgctcttg ttagttttga 600 cgccctccag cacaccagag ccgttgtttt tatcagaagt acctttcagc tccagcttgt 660 cgacggttgc gatgagatcg tacttgccgt tcttgtcttt ttctttgctc accagaacct 720 tcatttcacc gggcagatct acagaaacgg aaccaataga ctcagcacct ttctgtgcgc 780 agccgatcag agccagcgcc agagcaaagc cgatcaacag acgcatatg 829 <210> 49 <211> 832 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 49 ggatccgctc agcttatttc agagcgtttt tcagttcatc cagggttttg atttcgactg 60 cgttgccttc gaggttggtg cccgcagagt cgtatttctg gacggtgatg gtgtcttctt 120 tggtgaacac gatgttttta gtttttttgg aattcacgct gatggtcaga gtggaagtgt 180 tagaatccca tttgccggtt tttttagtgg cctgagtggt gtcagagtca tccagcgcaa 240 cggtgatttc accggatttt aagatgttca tgcttaaaac aacagtgcct tcggtaactt 300 tcaaggtggt tttgccgtcg gcagcgaggg tgccttccag ggtgaagtct ttcagaacgt 360 atttggcttt gccggagcca tcgcttttga tgtcggtgta ttccagacgg gtaccatttg 420 ccattacgat ggttttttca gaggtttcac ccttttcgtt gaatttttct tcggtagagg 480 acttgtcttt cagggtcact tttttggata ctaaggtttt ggcatcttct ttgaaaattt 540 cgaatttggt ctggctgagg tcatcagcaa tggtcagttt cactttgctt ttgttagttt 600 tttcaccttc cagggtgccg gaaccgttgt ttttatcaga ggtgcctttc agctcaagct 660 tgtcgacggt cgcctcgagg ctgtatttac cgtttttgtc tttttctttg ctgaccagaa 720 cggtcatgcc accgggcaga tctacagaaa cggaaccaat agactcagca cctttctgtg 780 cgcagccgat cagagccagc gccagagcaa agccgatcaa cagacgcata tg 832 <210> 50 <211> 829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 50 ggatccgctc agcttatttc aaagcggctt tcagctctgc cagatcttta atttcagccg 60 ggctgccttc cagcgcattg cctgcacggt tatagttctg tacggtgata gtgttttctt 120 tggtgaatac cagctgttta gttttctggc tgtttttgct aatggttaaa gtagaagtat 180 cagaatccca ggtgccggat tttttattgc cgctagagtc agtgtcatcc agtgcaacgg 240 tgatttcgcc ggatttagaa atgttcatgc tcagagtaac agtgccttcg gtaactttca 300 gagtggtttt gccgtcagca gccagagtgc cttccagagt aaagtctttc agaacgtatt 360 tagctttgcc ggttttatcg cttttgatgt cggtgtattc cagacgggta ccatttgcca 420 ttacgatagt tttttcagag atttcaccct tttcgttgaa tttttcttcg gtagaagact 480 tgtctttcag ggttactttt ttagatacca gagttttgcc atcttctttg aagatttcaa 540 aggtggtttt gctcagatcc tcagcaatag taagctttac tttgcttttg ttagtttttt 600 caccttccag ggtgccagaa ccgttgtttt tatcagaagt gcctttaagc tccagctttt 660 ctacggttgc catcaggctg tatttaccgt ttttgtcttt ttctttgctt accagaactt 720 tcataccccc gggcagatct acagaaacgg aaccaataga ctcagcacct ttctgtgcac 780 agccgattaa agccagcgcc aaagcaaagc cgatcaacag acgcatatg 829 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 51 tttctgtgcg cagccgatca gagccagcgc cagagcaaag ccgatcaaca gacgcatatg 60 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 52 tttctgtgcc atatg 15 <210> 53 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 53 agtgttttct ttggtgaata ccagctgttt agttttctgg ctgtttttgc 50 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 54 aattcccagc tgtttagttt tctggctgtt tttgc 35 <210> 55 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 55 gtataccgtg tctttccacg actcagataa ccaaggcaaa gacatctaga cgggccactt 60 tacttccaag accactcgtt tctttttctg ttcttgccgt tcatgctaga gtagcgttgg 120 cagctgttcg acctcgactt tccatgaaga ctatttttgt tgccgagacc acacgacctc 180 ccgcagtttt gattgttctc gtttcatttc gaatgctaga gactgctaga gccagtctgg 240 tgcgaccttc aaaagtttct cctaccgttc tgggagcaca ggttttttca ttgaaggttt 300 ctgttcagga gatgccttct ttttaagttg ctttttccac tccacagact tttctagtag 360 tggtaccgtc tgccgtgggc agaacttatg tggccataat tttcgctacc atggccattt 420 cgctttatac aagacttttt gaagtgagac cttccgtttc accgattact attttggtgg 480 aaccttcagt tccttccgtg gcaatgagac tcgtacttat agaggtttag accacttcaa 540 aggcaacttg acttgctgtg actgtcgtcg cgacgctgat ttttttgacg tcgcacctta 600 aggttttgaa gatgaaattg gtaatcgcaa ttgtcgtttt tttgatgggt cgaccacaag 660 tgatttgttc tgtgctagtg acacgtcttt atgctgaggt tgccgtggtt gaatcttccg 720 tgccgtcagc tttaattttg ggaactactt gactttttgc gcgactttat tcgactcgcc 780 tagg 784 <210> 56 <211> 787 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sythetic nucleotide <400> 56 gtataccgtg tctttccacg actcagataa ccaaggcaaa gacatctaga cgggccaccg 60 tactggcaag accagtcgtt tctttttctg tttttgccat ttatgtcgga gctccgctgg 120 cagctgttcg aactcgactt tccgtggaga ctatttttgt tgccaaggcc gtgggacctt 180 ccactttttt gattgttttc gtttcacttt gactggtaac gactactgga gtcggtctgg 240 tttaagcttt aaaagtttct tctacggttt tggaatcata ggttttttca ctgggacttt 300 ctgttcagga gatggcttct ttttaagttg cttttcccac tttggagact tttttggtag 360 cattaccgtt taccatgggc agaccttatg tggctgtagt tttcgctacc gaggccgttt 420 cggtttatgc aagactttct gaagtgggac cttccgtggg agcgacggct gccgttttgg 480 tggaactttc aatggcttcc gtgacaacaa aattcgtact tgtagaattt taggccactt 540 tagtggcaac gcgacctact gagactgtgg tgagtccggt gatttttttg gccgtttacc 600 ctaagattgt gaaggtgaga ctggtagtcg cacttaaggt ttttttgatt tttgtagcac 660 aagtggtttc ttctgtggta gtggcaggtc tttatgctga gacgcccgtg gttggagctt 720 ccgttgcgtc agctttagtt ttgggaccta cttgactttt tgcgagactt tattcgactc 780 gcctagg 787 <210> 57 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 57 gtataccgtg tctttccacg actcagataa ccaaggcaaa gacatctaga cgggccccca 60 tactttcaag accattcgtt tctttttctg tttttgccat ttatgtcgga ctaccgttgg 120 catcttttcg acctcgaatt tccgtgaaga ctatttttgt tgccaagacc gtgggacctt 180 ccactttttt gattgttttc gtttcatttc gaatgataac gactcctaga ctcgttttgg 240 tggaaacttt agaagtttct tctaccgttt tgagaccata gattttttca ttgggacttt 300 ctgttcagaa gatggcttct ttttaagttg cttttcccac tttagagact tttttgatag 360 cattaccgtt taccatgggc agaccttatg tggctgtagt tttcgctatt ttggccgttt 420 cgatttatgc aagactttct gaaatgagac cttccgtgag accgacgact gccgttttgg 480 tgagactttc aatggcttcc gtgacaatga gactcgtact tgtaaagatt taggccgctt 540 tagtggcaac gtgacctact gtgactgaga tcgccgttat tttttaggcc gtggacccta 600 agactatgaa gatgaaattg gtaatcgttt ttgtcggtct tttgatttgt cgaccataag 660 tggtttcttt tgtgatagtg gcatgtcttg atattggcac gtccgttacg cgaccttccg 720 tcgggccgac tttaatttct agaccgtctc gactttcggc gaaactttat tcgactcgcc 780 tagg 784 <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 58 agtgttttct ttggtgaata ccagctgttt g 31 <210> 59 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 59 tatgcgtctg ttgatcggct ttgctctggc gctggctctg atcgg 45 <210> 60 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 60 ctgcgcacag aaaggtgctg agtctattgg ttccgtttct gtagatctgc 50 <210> 61 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 61 ccggtgaaat gaaggttctg gtgagcaaag aaaaagacaa gaacggcaag 50 <210> 62 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 62 tacgatctca tcgcaaccgt cgacaagctg gagctgaaag gtacttctga 50 <210> 63 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 63 taaaaacaac ggctctggtg tgctggaggg cgtcaaaact aacaagagca aagtaa 56 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 64 agctttactt tgctcttgtt agttttgacg ccctccagca 40 <210> 65 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 65 caccagagcc gttgttttta tcagaagtac ctttcagctc cagcttgtcg 50 <210> 66 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 66 acggttgcga tgagatcgta cttgccgttc ttgtcttttt ctttgctcac 50 <210> 67 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 67 cagaaccttc atttcaccgg gcagatctac agaaacggaa ccaatagact 50 <210> 68 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 68 cagcaccttt ctgtgcgcag ccgatcagag ccagcgccag agcaaagccg atcaacagac 60 gca 63 <210> 69 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 69 agcttacgat ctctgacgat ctcggtcaga ccac 34 <210> 70 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 70 gctggaagtt ttcaaagagg atggcaagac cctcgtgtcc aaaaaagtaa 50 <210> 71 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 71 cttccaaaga caagtcctct acggaagaaa aattcaacga aaaaggtgag 50 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 72 gtgtctgaaa agatcatcac catggcagac ggcacccgtc 40 <210> 73 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 73 ttgaatacac cggtattaaa agcgatggta c 31 <210> 74 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 74 catcgctttt aataccggtg tattcaagac gggtgccgtc tgccatg 47 <210> 75 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 75 gtgatgatct tttcagacac ctcacctttt tcgttgaatt tttcttccgt 50 <210> 76 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 76 agaggacttg tctttggaag ttactttttt ggacacgagg gtcttgccat 50 <210> 77 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 77 cctctttgaa aacttccagc gtggtctgac cgagatcgtc agagatcgta 50 <210> 78 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 78 cggtaaagcg aaatatgttc tgaaaaactt cactctgga 39 <210> 79 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 79 aggcaaagtg gctaatgata aaaccacctt ggaagtcaag gaaggcaccg 50 <210> 80 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 80 ttactctgag catgaatatc tccaaatctg gtgaagtttc cgttgaactg 50 <210> 81 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 81 aacgacactg acagcagcgc tgcgactaaa aaaactgcag cgtgg 45 <210> 82 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 82 aattccacgc tgcagttttt ttagtcgca 29 <210> 83 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 83 gcgctgctgt cagtgtcgtt cagttcaacg gaaacttcac cagatttgga 50 <210> 84 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 84 gatattcatg ctcagagtaa cggtgccttc cttgacttcc aaggtggttt 50 <210> 85 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 85 tatcattagc cactttgcct tccagagtga agtttttcag aacatatttc gctttaccgg 60 tac 63 <210> 86 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 86 aattccaaaa cttctacttt aaccattagc gttaacagca aaaaa 45 <210> 87 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 87 actacccagc tggtgttcac taaacaagac acgatcactg tgcagaaata 50 <210> 88 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 88 cgactccaac ggcaccaact tagaaggcac ggcagtcgaa attaaaaccc 50 <210> 89 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 89 ttgatgaact gaaaaacgcg ctgaaataag ctgagcg 37 <210> 90 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 90 gatccgctca gcttatttca gcgcgttttt cagttcatca agggttttaa tttcgactgc 60 c 61 <210> 91 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 91 gtgccttcta agttggtgcc gttggagtcg tatttctgca cagtgatcgt 50 <210> 92 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 92 gtcttgttta gtgaacacca gctgggtagt ttttttgctg ttaacgctaa 50 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 93 tggttaaagt agaagttttg g 21 <210> 94 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 94 tatgcgtctg ttgatcggct ttgctttggc gctggcttta atcggctg 48 <210> 95 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 95 tgcacagaaa ggtgctgagt ctattggttc cgtttctgta gatctgcccg 50 <210> 96 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 96 ggggtatgaa agttctggta agcaaagaaa aagacaaaaa cggtaaatac 50 <210> 97 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 97 agcctgatgg caaccgtaga aaagctggag cttaaaggca cttctgataa 50 <210> 98 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 98 aaacaacggt tctggcaccc tggaaggtga aaaaactaac aaaagcaaag taa 53 <210> 99 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 99 agctttactt tgcttttgtt agttttttca ccttcca 37 <210> 100 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 100 gggtgccaga accgttgttt ttatcagaag tgcctttaag ctccagcttt 50 <210> 101 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 101 tctacggttg ccatcaggct gtatttaccg tttttgtctt tttctttgct 50 <210> 102 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 102 taccagaact ttcatacccc cgggcagatc tacagaaacg gaaccaatag 50 <210> 103 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 103 actcagcacc tttctgtgca cagccgatta 30 <210> 104 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 104 aagccagcgc caaagcaaag ccgatcaaca gacgca 36 <210> 105 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 105 agcttactat tgctgaggat ctgagcaaaa ccacctttga aatcttc 47 <210> 106 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 106 aaagaagatg gcaaaactct ggtatctaaa aaagtaaccc tgaaagacaa 50 <210> 107 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 107 gtcttctacc gaagaaaaat tcaacgaaaa gggtgaaatc 40 <210> 108 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 108 tctgaaaaaa ctatcgtaat ggcaaatggt ac 32 <210> 109 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 109 aaggtggttt tgctcagatc ctcagcaata gta 33 <210> 110 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 110 agagttttgc catcttcttt gaagatttca 30 <210> 111 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 111 atttttcttc ggtagaagac ttgtctttca gggttacttt tttagatacc 50 <210> 112 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 112 catttgccat tacgatagtt ttttcagaga tttcaccctt ttcgttga 48 <210> 113 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 113 ccgtctggaa tacaccgaca tcaaaagcga taaaaccggc aaagctaa 48 <210> 114 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 114 atacgttctg aaagacttta ctctggaagg cactctggct gctgacggca 50 <210> 115 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 115 aaaccactct gaaagttacc gaaggcactg ttactctgag catgaacatt 50 <210> 116 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 116 tctaaatccg gcgaaatcac cgttgcactg gatgacactg actctagcgg 50 <210> 117 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 117 caataaaaaa tccggcacct gggattctga tacttctact ttaaccatta 50 <210> 118 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 118 gcaaaaacag ccagaaaact aaacagctgg g 31 <210> 119 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 119 gcttttgatg tcggtgtatt ccagacgggt ac 32 <210> 120 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 120 ccttccagag taaagtcttt cagaacgtat ttagctttgc cggttttatc 50 <210> 121 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 121 cagtgccttc ggtaactttc agagtggttt tgccgtcagc agccagagtg 50 <210> 122 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 122 cagtgcaacg gtgatttcgc cggatttaga aatgttcatg ctcagagtaa 50 <210> 123 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 123 tcagaatccc aggtgccgga ttttttattg ccgctagagt cagtgtcatc 50 <210> 124 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 124 aattcccagc tgtttagttt tctggctgtt tttgctaatg gttaaagtag aagta 55 <210> 125 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 125 aattcaaaca gctggtattc accaaagaaa acactatcac cgtac 45 <210> 126 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 126 agaactataa ccgtgcaggc aatgcgctgg aaggcagccc 40 <210> 127 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 127 ggctgaaatt aaagatctgg cagagctgaa agccgctttg aaataagctg agcg 54 <210> 128 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 128 gatccgctca gcttatttca aagcggct 28 <210> 129 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 129 ttcagctctg ccagatcttt aatttcagcc gggctgcctt ccagcgcatt 50 <210> 130 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 130 gcctgcacgg ttatagttct gtacggtgat agtgttttct ttggtgaata ccagctgttt 60 g 61 <210> 131 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 131 tatgcgtctg ttgatcggct ttgctctggc gctggctctg atcggctg 48 <210> 132 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 132 cgcacagaaa ggtgctgagt ctattggttc cgtttctgta gatctgcccg 50 <210> 133 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 133 gtggcatgac cgttctggtc agcaaagaaa aagacaaaaa cg 42 <210> 134 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 134 gtaaatacag cctcgaggcg accgtcgaca 30 <210> 135 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 135 agcttgtcga cggtcgcctc gaggctgtat ttaccgtttt tgtctttttc tttgct 56 <210> 136 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 136 gaccagaacg gtcatgccac cgggcagatc tacagaaacg 40 <210> 137 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 137 gaaccaatag actcagcacc tttctgtgcg cagccgatca gagccagcgc 50 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 138 cagagcaaag ccgatcaaca gacgca 26 <210> 139 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 139 agcttgagct gaaaggcacc tctgataaaa acaacggttc cggcaccctg 50 <210> 140 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 140 gaaggtgaaa aaactaacaa aagcaaagtg aaactgacca ttgctgat 48 <210> 141 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 141 gacctcagcc agaccaaatt cgaaattttc aaagaagatg ccaaaacctt 50 <210> 142 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 142 agtatccaaa aaagtgaccc tgaaagacaa gtcctctacc gaagaaaaat 50 <210> 143 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 143 tcaacgaaaa gggtgaaacc tctgaaaaaa ccatcgtaat ggcaaatggt ac 52 <210> 144 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 144 catttgccat tacgatggtt ttttcaga 28 <210> 145 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 145 ggtttcaccc ttttcgttga atttttcttc ggtagaggac 40 <210> 146 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 146 ttgtctttca gggtcacttt tttggatact aaggttttgg catcttcttt 50 <210> 147 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 147 gaaaatttcg aatttggtct ggctgaggtc atcagcaatg gtcagtttca 50 <210> 148 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 148 ctttgctttt gttagttttt tcaccttcca gggtgccgga 40 <210> 149 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 149 accgttgttt ttatcagagg tgcctttcag ctca 34 <210> 150 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 150 ccgtctggaa tacaccgaca tcaaaagcga tggctccggc aaagccaa 48 <210> 151 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 151 atacgttctg aaagacttca ccctggaagg caccctcgct gccgacgg 48 <210> 152 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 152 caaaaccacc ttgaaagtta ccgaaggcac tgttgtttta ag 42 <210> 153 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 153 catgaacatc ttaaaatccg gtgaaatcac cgttgcgctg 40 <210> 154 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 154 gatgactctg acaccactca ggccactaaa aaaaccggca aatgggattc 50 <210> 155 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 155 taacacttcc actctgacca tcagcgtg 28 <210> 156 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 156 aattcacgct gatggtcaga gtggaagtgt tagaatccca tttgccg 47 <210> 157 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 157 gtttttttag tggcctgagt ggtgtcagag tcatccagcg caacggtgat ttcac 55 <210> 158 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 158 cggattttaa gatgttcatg cttaaaacaa cagtgccttc ggtaactttc 50 <210> 159 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 159 aaggtggttt tgccgtcggc agcgagggtg ccttccaggg 40 <210> 160 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 160 tgaagtcttt cagaacgtat ttggctttgc cggagccatc 40 <210> 161 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 161 gcttttgatg tcggtgtatt ccagacgggt ac 32 <210> 162 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 162 aattccaaaa aaactaaaaa catcgtgttc accaaagaag acaccatcac cg 52 <210> 163 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 163 tccagaaata cgactctgcg ggcaccaacc tcgaaggcaa cgcagtcgaa 50 <210> 164 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 164 atcaaaaccc tggatgaact gaaaaacgct ctgaaataag ctgagcg 47 <210> 165 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 165 gatccgctca gcttatttca gagcgttttt cagttcatcc agggttttga tttcgactgc 60 gttgccttcg a 71 <210> 166 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 166 ggttggtgcc cgcagagtcg tatttctgga cggtgatggt gtcttctttg 50 <210> 167 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 167 gtgaacacga tgtttttagt ttttttgg 28 <210> 168 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 168 atgaaaaaat atttattggg aataggtcta atattagcct taatagcatg taagcaaaat 60 gttagcagcc ttgacgagaa aaacagcgtt tcagtagatt tgcctggtga aatgaaagtt 120 cttgtaagca aagaaaaaaa caaagacggc aagtacgatc taattgcaac agtagacaag 180 cttgagctta aaggaacttc tgataaaaac aatggatctg gagtacttga aggcgtaaaa 240 gctgacaaaa gtaaagtaaa attaacaatt tctgacgatc taggtcaaac cacacttgaa 300 gttttcaaag aagatggcaa aacactagta tcaaaaaaag taacttccaa agacaagtca 360 tcaacagaag aaaaattcaa tgaaaaaggt gaagtatctg aaaaaataat aacaagagca 420 gacggaacca gacttgaata cacaggaatt aaaagcgatg gatctggaaa agctaaagag 480 gttttaaaaa actttactct tgaaggaaaa gtagctaatg ataaagtaac attggaagta 540 aaagaaggaa ccgttacttt aagtaaaaat atttcaaaat ctggggaagt ttcagttgaa 600 cttaatgaca ctgacagtag tgctgctact aaaaaaactg cagcttggaa ttcaaaaact 660 tctactttaa caattagtgt taacagcaaa aaaactacac aacttgtgtt tactaaacaa 720 gacacaataa ctgtacaaaa atacgactcc gcaggtacca atttagaagg cacagcagtc 780 gaaattaaaa cacttgatga acttaaaaac gctttaaaat ag 822 <210> 169 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 169 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 65 70 75 80 Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln 85 90 95 Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp Lys Val 165 170 175 Thr Leu Glu Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 180 185 190 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 195 200 205 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe Thr Lys Gln 225 230 235 240 Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu 245 250 255 Gly Thr Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu 260 265 270 Lys <210> 170 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 170 atgaaaaaat atttattggg aataggtcta atattagcct taatagcatg taagcaaaat 60 gttagcacgc ttgatgaaaa aaatagcgtt tcagtagatt tacctggtgg aatgacagtt 120 cttgtaagta aagaaaaaga caaagacggt aaatacagtc tagaggcaac agtagacaag 180 cttgagctta aaggaacttc tgataaaaac aacggttctg gaacacttga aggtgaaaaa 240 actgacaaaa gtaaagtaaa attaacaatt gctgatgacc taagtcaaac taaatttgaa 300 attttcaaag aagatgccaa aacattagta tcaaaaaaag taacccttaa agacaagtca 360 tcaacagaag aaaaattcaa cgaaaagggt gaaacatctg aaaaaacaat agtaagagca 420 aatggaacca gacttgaata cacagacata aaaagcgatg gatccggaaa agctaaagaa 480 gttttaaaag actttactct tgaaggaact ctagctgctg acggcaaaac aacattgaaa 540 gttacagaag gcactgttgt tttaagcaag aacattttaa aatccggaga aataacagtt 600 gcacttgatg actctgacac tactcaggct actaaaaaaa ctggaaaatg ggattcaaat 660 acttccactt taacaattag tgtgaatagc aaaaaaacta aaaacattgt atttacaaaa 720 gaagacacaa taacagtaca aaaatacgac tcagcaggca ccaatctaga aggcaacgca 780 gtcgaaatta aaacacttga tgaacttaaa aacgctttaa aataa 825 <210> 171 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 171 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Thr Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Gly Met Thr Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys 65 70 75 80 Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Gln 85 90 95 Thr Lys Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Ala Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Thr Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys 165 170 175 Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser Lys Asn Ile 180 185 190 Leu Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Ser Asp Thr Thr 195 200 205 Gln Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Asn Thr Ser Thr Leu 210 215 220 Thr Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn Ile Val Phe Thr Lys 225 230 235 240 Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu 245 250 255 Glu Gly Asn Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala 260 265 270 Leu Lys <210> 172 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 172 atgaaaaaat atttattggg aataggtcta atattagcct taatagcatg taagcaaaat 60 gttagcagcc ttgatgaaaa aaatagcgtt tcagtagatt tacctggtgg aatgaaagtt 120 cttgtaagta aagaaaaaga caaagatggt aaatacagtc taatggcaac agtagaaaag 180 cttgagctta aaggaacttc tgataaaaac aacggttctg gaacacttga aggtgaaaaa 240 actgacaaaa gtaaagtaaa attaacaatt gctgaggatc taagtaaaac cacatttgaa 300 atcttcaaag aagatggcaa aacattagta tcaaaaaaag taacccttaa agacaagtca 360 tcaacagaag aaaaattcaa cgaaaagggt gaaatatctg aaaaaacaat agtaagagca 420 aatggaacca gacttgaata cacagacata aaaagcgata aaaccggaaa agctaaagaa 480 gttttaaaag actttactct tgaaggaact ctagctgctg acggcaaaac aacattgaaa 540 gttacagaag gcactgttac tttaagcaag aacatttcaa aatccggaga aataacagtt 600 gcacttgatg acactgactc tagcggcaat aaaaaatccg gaacatggga ttcagatact 660 tctactttaa caattagtaa aaacagtcaa aaaactaaac aacttgtatt cacaaaagaa 720 aacacaataa cagtacaaaa ctataacaga gcaggcaatg cgcttgaagg cagcccagct 780 gaaattaaag atcttgcaga gcttaaagcc gctttaaaat aa 822 <210> 173 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 173 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys 65 70 75 80 Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp Leu Ser Lys 85 90 95 Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys 165 170 175 Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile 180 185 190 Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Thr Asp Ser Ser 195 200 205 Gly Asn Lys Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser Asp Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys Glu 225 230 235 240 Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn Ala Leu Glu 245 250 255 Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Lys Ala Ala Leu 260 265 270 Lys

Claims (1)

1. ＯＳＰＡ 키메라의 용도.

Images