JP6965417B2 - Ospaキメラおよびそのワクチンでの使用法 - Google Patents
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Description
et al., N. Engl. J. Med. 339: 209-15,1998); 非特許文献2(Sigal et al., N. Engl. J. Med. 339:216-22, 1998); erratum in: N. Engl. J. Med. 339:571, 1998)。完全にプロセシングされたOspAのアミノ末端は、タンパク質
を細菌膜の外表面に固着させる3つの脂肪−アシル鎖で翻訳後修飾されたシステイン残基である(非特許文献3(Bouchon et al., Anal. Biochem. 246: 52-61, 1997))。OspAの脂質付加は分子を安定化することが報告されており(Luft, 私信)、強いアジ
ュバントが存在しない場合の防御に必須である(非特許文献4(Erdile et al., Infect. Immun. 61: 81-90, 1993))。アミノ末端脂質膜アンカーを欠くタンパク質の可溶な組換え形態は、凝集マウスモノクローナル抗体のFabフラグメントと共結晶化されOspAの構造を決定し、これは21の逆平行β鎖、続いて単一α−へリックスを含むことが示された (非特許文献5(Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:3584-9, 1997))。
6(Gern et al., Vaccine 15:1551-7, 1997))。7つの主要なOspA血清型がヨーロッパ分離株中で認識されている(指定血清型1〜7、非特許文献7(Wilske et al., J. Clin. Microbiol. 31:340-50, 1993))。OspA血清型は種と相関し;血清型1はB.ブルグドルフェリs.s.に対応し、血清型2はB.アフゼリに対応し、および血清型3〜7はB.ガリニに対応する。
り主に与えられるが、スピロヘータのマダニ腸上皮の内膜上の受容体への付着をブロックする抗体もまた効果的であり得る(非特許文献9(Pal et al., J. Immunol. 166: 7398-403, 2001))。
Aにおける免疫学的に重要な高頻度可変ドメインを同定するために使用され、LA−2エピトープがアミノ酸203−257に位置づけされている(非特許文献11(Ding et al., J. Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000);非特許文献12(Luft et al. J Infect Dis. 185 (Suppl. 1): S46-51, 2002))。
当技術分野では、米国、欧州、および他の場所に存在するボレリアの様々な種に対し広い防御を提供することができるOspAワクチンの開発が必要である。下記開示は、そのようなワクチンの明細を記載する。
(項目1)
配列番号1、3、および5で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
(項目2)
配列番号1、3、および5で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列から構成される単離核酸分子。
(項目3)
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子:
(a)配列番号1、配列番号3、または配列番号5で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列;および
(b)(a)に相補的なヌクレオチド配列。
(項目4)
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子:
(a)配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
(b)(a)に相補的なヌクレオチド配列。
(項目5)
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子:
(a)配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25の保存的アミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(b)配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25の保存的アミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c)配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25の保存的アミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(d)配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸のCおよび/またはN末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(e)配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端トランケーション、またはN末端トランケーションから選択される1〜25のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;ならびに
(f)(a)−(e)のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
(項目6)
配列番号7、9、および11で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
(項目7)
配列番号7、9、および11で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列から構成される単離核酸分子。
(項目8)
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子:
(a)配列番号7、配列番号9、または配列番号11で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列;および
(b)(a)に相補的なヌクレオチド配列。
(項目9)
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子:
(a)配列番号8、配列番号10、または配列番号12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
(b)(a)に相補的なヌクレオチド配列。
(項目10)
下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子:
(a)配列番号8、配列番号10、または配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25の保存的アミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(b)配列番号8、配列番号10、または配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25の保存的アミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c)配列番号8、配列番号10、または配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25の保存的アミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(d)配列番号8、配列番号10、または配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸のCおよび/またはN末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(e)配列番号8、配列番号10、または配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端トランケーション、またはN末端トランケーションから選択される1〜25のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;ならびに
(f)(a)−(e)のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
(項目11)
項目1〜10のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
(項目12)
項目11に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目13)
真核細胞である、項目12に記載の宿主細胞。
(項目14)
原核細胞である、項目12に記載の宿主細胞。
(項目15)
項目12に記載の宿主細胞を、ポリペプチドを発現させるのに好適な条件下で培養し、任意で前記ポリペプチドを培養物から単離することを含む、ポリペプチドを生成させるプロセス。
(項目16)
項目1〜10のいずれか一項に記載の核酸分子または項目11に記載のベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
(項目17)
項目1〜10のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも2つおよび薬学的に許容される担体を含み、前記核酸分子は異なるヌクレオチド配列を有する組成物。
(項目18)
配列番号1、3、および5で示されるヌクレオチド配列の組み合わせを含む、項目17に記載の組成物。
(項目19)
配列番号2、4、および6で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目20)
配列番号2、4、および6で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成される単離ポリペプチド。
(項目21)
少なくとも200のアミノ酸残基を有し、配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目22)
配列番号8、10、および12で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目23)
配列番号8、10、および12で示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成される単離ポリペプチド。
(項目24)
少なくとも200のアミノ酸残基を有し、配列番号8、配列番号10、または配列番号12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目25)
項目19〜24のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
(項目26)
項目19〜24のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも2つおよび薬学的に許容される担体を含み、前記ポリペプチドは異なる配列を有する組成物。
(項目27)
配列番号2、4、および6で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの組み合わせを含む、項目26に記載の組成物。
(項目28)
項目16〜18および25〜27のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物。
(項目29)
項目16〜18および25〜27のいずれか一項に記載の組成物および医薬担体を含み、細胞表層タンパク質(Osp)Aタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を誘導する、免疫原性組成物。
(項目30)
項目16〜18および25〜27のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含み、ボレリアに特異的に結合する抗体の産生を誘導する、免疫原性組成物。(項目31)
項目16〜18および25〜27のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含み、ボレリアを中和する抗体の産生を誘導する、免疫原性組成物。
(項目32)
ボレリアは、ボレリアブルグドルフェリセンスラトである、項目30または31に記載の組成物。
(項目33)
ボレリアは、ボレリアアフゼリ、ボレリアガリニまたはボレリアブルグドルフェリセンスストリクトである、項目30または31に記載の組成物。
(項目34)
ボレリアは、ボレリアジャポニカ、ボレリアアンダーソニ、ボレリアビセッティ、ボレリアシニカ、ボレリアツルジ、ボレリアタヌキイ、ボレリアバライシアナ、ボレリアルジタニエ、ボレリアスピエルマニ、ボレリアミヤマトイまたはボレリアロネスタルである、項目30または31に記載の組成物。
(項目35)
項目28〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む、ワクチン組成物。
(項目36)
項目35に記載のワクチン組成物を少なくとも第2のワクチン組成物と共に含む、混合ワクチン。
(項目37)
前記第2のワクチン組成物は、マダニ媒介疾患に対して防御する、項目36に記載の混合ワクチン。
(項目38)
前記マダニ媒介疾患は、ロッキー山紅斑熱、バベシア症、回帰熱、コロラドダニ熱、ヒト単球エーリキア症(HME)、ヒト顆粒球エーリキア症(HGE)、南部ダニ関連発疹病(STARI)、野兎病、ダニ麻痺、ポワッサン脳炎、Q熱、クリミアコンゴ出血熱、キタウクゾーン病、ボタン熱、またはダニ媒介脳炎である、項目37に記載の混合ワクチン。
(項目39)
前記第2のワクチン組成物は下記からなる群より選択されるワクチンである、項目37に記載の混合ワクチン:ダニ媒介脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、およびロッキー山紅斑熱ワクチン。
(項目40)
前記第2のワクチン組成物は、ボレリア感染またはライム病に対する免疫化に適合する季節的免疫化スケジュールを有する、項目36に記載の混合ワクチン。
(項目41)
被験体において免疫学的応答を誘導するための方法であって、項目28〜34のいずれか一項に記載の組成物を被験体に、免疫学的応答を誘導するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
(項目42)
前記免疫学的応答は、抗OspA抗体の産生を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法であって、項目35または36に記載のワクチン組成物を前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
(項目44)
項目19〜24のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
(項目45)
被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法であって、項目44に記載の抗体またはそのフラグメントを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
(項目46)
被験体においてボレリア感染またはライム病を防止または治療するための方法であって、項目28〜34のいずれか一項に記載のワクチン組成物で哺乳類を免疫化することにより生成された抗体またはそのフラグメントを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止または治療するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
(項目47)
前記抗体またはそのフラグメントは、過免疫血清、過免疫血漿、またはその精製免疫グロブリン画分である、項目46に記載の方法。
(項目48)
被験体においてボレリア感染またはライム病を受動的に防止するための方法であって、項目28〜34のいずれか一項に記載のワクチン組成物で哺乳類を免疫化することにより生成された抗OspA抗体またはそのフラグメントを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止するのに有効な量で投与する工程を含み、前記抗体またはそのフラグメントは精製免疫グロブリン調製物または免疫グロブリンフラグメント調製物である、方法。(項目49)
被験体においてボレリア感染またはライム病を防止ための方法であって、項目28〜34のいずれか一項に記載のワクチン組成物で被験体を免疫化した後生成された抗OspAモノクローナル抗体またはそのフラグメントを前記被験体に、ボレリア感染またはライム病を防止するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
(項目50)
前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントはヒト化される、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記モノクローナル抗体はF237/BK2である、項目49に記載の方法。
別記されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。下記参考文献は、当業者に本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を提供する: Singleton, et al.,
DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE
GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)。
AA アミノ酸
Amp アンピシリン
bp 塩基対
B.アフゼリ ボレリアアフゼリ
B.ブルグドルフェリ ボレリアブルグドルフェリ
B.ガリニ ボレリアガリニ
DNA デオキシリボ核酸
dNTP デオキシヌクレオチド三リン酸
E.coli 大腸菌
GC含量 グアニンおよびシトシン塩基を含む配列のパーセンテージ
hLFA−1 ヒト白血球機能関連抗原−1
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
IP 知的所有権
IPTG イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド
Kan カナマイシン
kDa キロダルトン
LB ルリアブロス
Lip B 細胞表層タンパク質B由来のリーダー配列
Mab モノクローナル抗体
OD 光学密度
OspA 細胞表層タンパク質A
OspB 細胞表層タンパク質B
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
RNA リボ核酸
s.l. センスラト
s.s. センスストリクト
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SMK 大腸菌のための増殖培地(ケトグルタル酸ソルビトール培地)tRNA 転移リボ核酸
WCB ワーキングセルバンク
Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、m
RNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと同じ意味で使用される。
sOspA 1/2251)、配列番号3(lipB sOspA 6/4)、または配列番号5(lipB sOspA 5/3)のヌクレオチド配列を含む「OspA核酸」、あるいは、別の態様では配列番号2(lipB sOspA 1/2251)、配列番号4(lipB sOspA 6/4)、または配列番号6(lipB sOspA 5/3)のアミノ酸配列を含む「OspAポリペプチド」を示す。配列番号7、9、および11の核酸配列はlipB リーダー配列(MRLLIGFALALALIG(配列番号13)をコードする核酸配列を欠いている。加えて、配列番号7、9、および11の核酸配列は、配列番号2、4および6におけるlipBリーダー配列のカルボキシ末端に存在するシステイン残基の代わりに、配列番号8、10、および12のアミノ末端のメチオニン残基をコードする。
1) アラニン(A)、グリシン(G);
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4) アルギニン(R)、リシン(K);
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7) セリン(S)、スレオニン(T);および
8) システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい)。
Pharmaceutical Sciences (1980)において開示される。そのような部分を分子に結合するための手順は、当技術分野ではよく知られている。例えば、いくつかの態様では、OspA誘導体はインビボでタンパク質により長い半減期を与える化学修飾を有するOspA分子である。1つの実施形態では、ポリペプチドは、当技術分野で知られている水溶性ポリマの付加により修飾される。関連する実施形態では、ポリペプチドはグリコシル化、ペグ化、および/またはポリシアリル化により修飾される。
ズム; Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443, 1970の相同性アライメントアルゴリズム; Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似法の調査;これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI
におけるGAP, BESTFIT, FASTA, およびTFASTA)、または目視検査(一般的にはAusubel
et al., 上記を参照されたい)。パーセント配列相同性および配列類似性を決定する
ために好適なアルゴリズムの別の例は、BLASTアルゴリズムであり、これはAltschul
et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載される。BLAST分析を実
施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である。パーセント配列相同性の計算に加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計分析を実施する(例えば、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい)。
Biology、Elsevier、(1986); およびChu et al.、Gene、13:197 (1981)を参照されたい。そのような技術は、1つ以上の外因性DNA部分を好適な宿主細胞に導入するために使用することができる。
いくつかの態様では、本発明は、ライム病またはボレリア感染の防止におけるキメラOspA分子およびこれらの分子を含む組成物を含む。ライム病はまた、ボレリア症またはライムボレリア症として当技術分野で知られており、よって、これらの用語は全て本発明に含まれる。同様に、本発明は、本明細書で記載されるキメラOspA分子を投与することを含むライム病を防止または治療する方法を含む。ライム病、またはボレリア症はボレリア属に属する少なくとも3つの種のグラム陰性スピロヘータ細菌により引き起こされる感染症である。少なくとも13のボレリア種が発見されており、そのうちの3つがライム関連であることが知られている。ライム病を引き起こすボレリア種はまとめてボレリアブルグドルフェリセンスラトとして知られており、多大な遺伝的多様性を示す。ボレリアブルグドルフェリセンスラト群は、おそらく大多数の症例の原因である3つの密接に関連する種から構成される。ボレリアブルグドルフェリセンスストリクトは、米国におけるライム病の主因である(しかし、欧州でも存在する)が、ボレリアアフゼリおよびボレリアガリニがほとんどの欧州の症例を引き起こす。いくつかの研究はまた、ボレリア種(例えば、ボレリアビセッティ、ボレリアスピエルマニ、ボレリアルジタニエ、およびボレリアバライシアナ)が時として、ヒトに感染し得ることを提示している。これらの種は疾患の重要な原因であると考えられないが、これらの種に対する免疫原性防御もまた、本発明に含まれる。
様々な態様では、本発明は、ライム病またはボレリア感染の防止および治療におけるボレリアのキメラOspA分子およびこれらの分子を含む組成物を含む。このスピロヘータはマダニから哺乳類に伝染されるので、温度および/または哺乳類宿主特異シグナルにより上方制御されるいくつかのボレリア細胞表層タンパク質が、過去10年にわたって同定されている。
1/2(配列番号168(核酸)および169(アミノ酸));OspA血清型6および4(lipB sOspA 6/4(配列番号3(核酸)および4(アミノ酸)ならびにorig sOspA 6/4(配列番号170(核酸)および171(アミノ酸));ならびにOspA血清型5および3(lipB sOspA 5/3(配列番号5(核酸)および6(アミノ酸)ならびにorig sOspA5/3(配列番号172(核酸)および173(アミノ酸))由来の防御エピトープを有するOspA分子をコードするように設計された。キメラOspA遺伝子は合成オーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて作成された。これらの組換えタンパク質は、一定の態様では、高収率および純度で生成され、様々な態様では、所望の活性を最大化し、望ましくない活性を最小化するように操作される。
様々な態様では、本発明は、ボレリアのキメラOspA核酸およびポリペプチド分子を含む。本発明のOspA核酸は、配列番号1(lipB sOspA 1/2251)、配列番号3(lipB sOspA 6/4)、配列番号5(lipB sOspA 5/3)、配列番号7(sOspA 1/2251)、配列番号9(sOspA 6/4)、配列番号11(sOspA 5/3)、配列番号168(orig sOspA 1/2)、配列番号170(orig sOspA 6/4)、または配列番号172(orig sOspA 5/3)で示されるヌクレオチド配列、または配列番号2(lipB
sOspA 1/2251)、配列番号4(lipB sOspA 6/4)、配列番号6(lipB sOspA 5/3)、配列番号8(sOspA 1/2251)、配列番号10(sOspA 6/4)、配列番号12(sOspA 5/3)、配列番号169(orig sOspA 1/2)、配列番号171(orig sOspA 6/4)、または配列番号173(orig sOspA 5/3)で示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、から本質的に構成され、またはから構成される核酸分子を含む。
sOspAポリヌクレオチドであり、配列番号2、4、および6はlipB sOspAポリペプチドである。
lipB sOspA 1/2251
lipB sOspA 5/3
sOspA 1/2251
sOspA 6/4
sOspA 5/3
Orig sOspA 1/2
Orig sOspA 6/4
Orig sOspA 5/3
1/2)、配列番号170(orig sOspA 6/4)、または配列番号172(orig sOspA 5/3)で示されるヌクレオチド配列と約70パーセント、または約71、72、73、74、75、76、77、78、もしくは79パーセント、または約80パーセント、または約81、82、83、84、85、86、87、88、もしくは89パーセント、または約90パーセント、または約91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99パーセント同一であり、またはヌクレオチド配列は、配列番号2(lipB sOspA 1/2251)、配列番号4(lipB sOspA 6/4)、配列番号6(lipB sOspA 5/3)、配列番号8(sOspA 1/2251)、配列番号10(sOspA 6/4)、配列番号12(sOspA
5/3)、配列番号169(orig sOspA 1/2)、配列番号171(orig sOspA 6/4)、または配列番号173(orig sOspA 5/3)で示されるポリペプチド配列と約70パーセント、または約71、72、73、74、75、76、77、78、もしくは79パーセント、または約80パーセント、または約81、82、83、84、85、86、87、88、もしくは89パーセント、または約90パーセント、または約91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99パーセント同一であるポリペプチドをコードする。
12:387 (1984);Genetics Computer Group, University of Wisconsin,Madison,
WI, BLASTP, BLASTN,およびFASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))が挙げられるが、これらに限定されない。BLASTXプログラムは全
米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)、および他の供給元(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al.,上記 (1990))から公的に入手可能である。よく知られているSmith Watermanアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用される。
Group、University of Wisconsin、Madison、WI)を用いると、パーセント配列相同性が決定される2つのポリペプチドは、それらの個々のアミノ酸の最適な対応(アルゴリズムにより決定される「対応スパン」)のために整列される。ギャップオープニングペナルティ(これは平均ダイアゴナルの3倍として計算される;「平均ダイアゴナル」は、用いられる比較マトリクスのダイアゴナルの平均である;「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリクスにより、各々の完全アミノ酸対応に対して割り当てられるスコアまたは数のことである)およびギャップエクステンションペナルティ(これは通常、ギャップオープニングペナルティの10分の1である)、ならびにPAM250またはBLOSUM62などの比較マトリクスが、このアルゴリズムと共に使用される。標準比較マトリクス(PAM250比較マトリクスに関してはDayhoff et
al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978);BLOSUM
62比較マトリクスに関してはHenikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992)を参照されたい)もまた、アルゴリズムよって使用される。
アルゴリズム:Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970);
比較マトリクス:BLOSUM 62、Henikoff et al., 上記 (1992);
ギャップペナルティ:12
ギャップ長ペナルティ:4
類似性の閾値:0
アルゴリズム: Needleman et al., 上記 (1970);
比較マトリクス:対応=+10、非対応=0
ギャップペナルティ:50
ギャップ長ペナルティ:3
、September、1997で示されるものが当業者によって使用される。特定の選択は当業者に
明らかであり、実施される特定の比較、例えばDNA対DNA、タンパク質対タンパク質、タンパク質−対DNA;さらに、比較がある配列対間か(この場合、GAPまたはBestFitが一般的に好ましい)、1つの配列と大きな配列データベース間か(この場合、FASTAまたはBLASTAが好ましい)に依存する。
6/4)、配列番号12(sOspA 5/3)、配列番号169(orig sOspA 1/2)、配列番号171(orig sOspA 6/4)、または配列番号173(orig sOspA 5/3)のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の保存的および/または非保存的修飾となる。
5/3)、配列番号169(orig sOspA 1/2)、配列番号171(orig sOspA 6/4)、または配列番号173(orig sOspA 5/3)のアミノ酸配列への保存的修飾(およびコードするヌクレオチドへの対応する修飾)は、天然由来OspAポリペプチドのものと類似する機能および化学特性を有するOspAポリペプチドを生成させる。対照的に、OspAポリペプチドの機能および/または化学特性における実質的な修飾は、(a)置換領域での分子バックボーンの構造、例えば、シートまたはらせん形構造、(b)標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは(c)側鎖の嵩の維持に対する効果が著しく異なる配列番号2(lipB sOspA 1/2251)、配列番号4(lipB sOspA 6/4)、配列番号6(lipB sOspA 5/3)、配列番号8(sOspA 1/2251)、配列番号10(sOspA 6/4)、配列番号12(sOspA 5/3)、配列番号169(orig sOspA 1/2)、配列番号171(orig sOspA 6/4)、または配列番号173(orig sOspA 5/3)のアミノ酸配列の置換を選択することにより達成される。
1) 疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2) 中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
3) 酸性:Asp、Glu;
4) 塩基性:His、Lys、Arg;
5) 鎖の方向に影響を与える残基:Gly、Pro;および
6) 芳香族:Trp、Tyr、Phe。
105-131。一定のアミノ酸で、類似した疎水性親水性指標またはスコアを有する他のア
ミノ酸を置換してもよく、これは類似した生物活性を保持し続けることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化を加える際、一定の態様では、疎水性親水性指標が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、他の態様では、±1以内であるものが特に好ましく、様々な態様では、±0.5以内であるものが特により好ましい。
例示的なアミノ酸置換が表2で示される。
れたい。短い、線形エピトープを認識する抗体は、変性タンパク質を使用する分析および診断用途、例えばWesternブロッティングにおいて特に有用である。Tobin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-4356 (1979)を参照されたい。短いペプチドに
対する抗体は、場合によっては、天然コンホメーションのタンパク質も認識し、よって、例えば、ELISAにより、または免疫沈降研究において、タンパク質発現およびタンパク質単離をモニタリングするのに、溶液中のOspAタンパク質を検出する際に有用である。
核酸分子は、OspAポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、限定はされないが、組換えDNA方法および化学合成を含む様々な方法で容易に得ることができる。
Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY (1994)で示され
るものである。以下で示される説明に従い実施される組換え発現技術は、様々な態様では、これらのポリヌクレオチドを生成させ、コードされたポリペプチドを発現するために従われる。例えば、OspAポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することにより、当業者は容易に大量の所望のヌクレオチド配列を生成させることができる。配列はその後、検出プローブまたは増幅プライマーを作製するために使用され得る。その代わりに、OspAポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクター挿入することができる。発現ベクターを適切な宿主に導入することにより、コードされた1つまたは複数のOspAポリペプチドまたはOspAポリペプチドが、いくつかの態様では、大量に生成される。
Acids Res. 17:10191-202, 1989; Lakey et al., Infect. Immun. 68:233-8,
2000)。当業者に知られている他の方法が同様に使用される。
されたい。
Edition. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。1つの態様では、pUC18は全ての中間工程のためのクローニングベクターとして使用され、というのも、ベクターpET30aよりもこのプラスミドを使用した方が遺伝子操作および配列決定がより容易になるからである。主要特徴は特に、塩基対149〜469のLacZ αペプチドをコードするlacZ遺伝子フラグメント(塩基対507でのlacプロモーター)、塩基対1629〜2486のアンピシリン耐性決定基をコードするbla遺伝子(塩基対2521でのblaプロモーター)、塩基対867での複製開始点および塩基対185〜451の複数のクローニング部位である(図12)。
の態様では、pET30a(Novagen)が最終の完全OspA遺伝子インサートのための発現ベクターとして使用される。pETベクターでは、遺伝子は、T7プロモーターの制御下でクローニングされ、発現は宿主細胞にT7RNAポリメラーゼ源を提供することにより誘導される(T7 RNAポリメラーゼ源が供給されるまで発現は起こらない)。主要特徴は、塩基対4048〜4860でのカナマイシン耐性をコードする遺伝子(kan)、826−1905のlacI遺伝子塩基対、塩基対4956−5411でのF1複製開始点および塩基対158〜346の複数のクローニング部位である(図13)。
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい。追加の態様では、Maniatis(上記)マニュアルの公開から当技術分野で使用される宿主細胞もまた本発明で
使用される。
Chemical Co., Rockford, IL (1984)において記載されているものを用いて調製さ
れる。そのようなポリペプチドはアミノ末端のメチオニンと共に、またはなしで合成される。化学的に合成されたOspAポリペプチドは、いくつかの態様では、ジスルフィド架橋を形成するためのこれらの参考文献において示される方法を用いて酸化される。化学的に合成されたOspAポリペプチドは組換えで生成された、または天然起源から精製された対応するOspAポリペプチドに匹敵する生物活性を有することが予測され、よって、組換えOspAポリペプチドと同じ意味で使用される。核酸およびポリペプチドを生成するための多くの追加の方法が当技術分野で知られており、それらの方法は、OspAポリペプチドを生成させるために使用することができることは認識される。
OspAポリペプチドの化学修飾誘導体は、本明細書において下記で説明される開示が与えられれば、当業者により調製される。OspAポリペプチド誘導体は、ポリペプチドに自然に付着された分子の型または位置のいずれかが異なるように修飾される。誘導体は、いくつかの態様では、1つ以上の自然に付着された化学基の欠失により形成される分子を含む。配列番号2、4、6、8、10、12、169、171、または173のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはOspAポリペプチド変異体は、1つの態様では、1つ以上のポリマの共有結合により修飾される。例えば、選択されるポリマは、典型的には水溶性であり、よって、これが付着されたタンパク質は、水性環境、例えば生理環境で沈殿しない。ポリマの混合物は好適なポリマの範囲に含まれる。一定の態様では、最終製品調製物の治療用途のために、ポリマは薬学的に許容される。
Francis et al., Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992);EP0154316号;EP0401384および米国特許第4,179,337号。例えば、ペグ化は、本明細書で記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子(または類似の反応性水溶性ポリマ)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。アシル化反応では、選択されるポリマ(複数可)は、単一の反応性エステル基を有しなければならない。還元的アルキル化では、選択されるポリマ(複数可)は、単一の反応性アルデヒド基を有しなければならない。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド(耐水性である)、またはそのモノC1−C10アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である(米国特許第5,252,714号を参照されたい)。
本発明のいくつかの態様は、免疫原性組成物およびワクチンを含む。本発明の免疫原性キメラOspA分子は組み合わされて抗原(複数可)として使用され、被験体において抗OspA免疫応答を誘発する(すなわち、ワクチンとして作用する)。例示的な免疫原性OspAポリペプチド(配列番号2、4、6、169、171、および173)は、組み合わされて送達され、ボレリアの血清型1−6のいずれか1つ以上に対し、より一般的には、本明細書で記載されるボレリアの多くの他の種に対し免疫応答を誘発する。免疫応答はまた、本発明のOspAポリペプチドをコードするプラスミドベクターの送達(すなわち、「ネイキッドDNA」の投与)により上昇させることができる。いくつかの態様では、OspA核酸分子(配列番号1、3、5、168、170、および172)は注射により、リポソームを介して、または本明細書で記載される他の投与手段により送達される。免疫化されるとすぐに、被験体は、ボレリアの血清型1−6のOspAタンパク質に対し、およびボレリアの他の種に対し増大した免疫応答を誘発する。
患者)の弱った免疫を克服し、または特定の「危険群」(例えば、限定はされないが、非常に若いまたは高齢)の免疫原性を改善するために使用される。アジュバントの免疫増強効
果は、様々な場合において、防御反応を与える最終製剤中で必要とされる抗原の量の減少につながる(すなわち、用量節約)。
を産生するハイブリドーマ細胞株もまた提供される。
(1990))。
本明細書で記載されるOspAキメラポリペプチドを被験体に投与するために、OspAポリペプチドは、1つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物中で製剤化される。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という句は、以下で記載されるように、当技術分野でよく知られている経路を用いて投与された場合、アレルギーまたは他の有害反応を生成させない分子部分および組成物を示す。「薬学的に許容される担体」は、任意のおよび全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。いくつかの態様では、組成物は、水または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成する。そのような溶媒和物もまた、含まれる。
いてより詳細に記載される。有効用量は通常、1回の投与あたり0.01mg〜1000mg/kg体重の範囲内にある。
投与される免疫原性組成物またはワクチン組成物の有用な用量は、薬物の作用を調節する様々な因子、例えば、被験体の年齢、状態、体重、性別および食餌、全ての感染の重症度、投与時間、投与方法、および他の臨床学的因子によって変動する。
追加の態様として、本発明は、被験体への投与のための使用を容易にするようにパッケージされた、被験体にOspAポリペプチド(複数可)を投与するための1つ以上の医薬製剤を含むキットを含む。
本発明の範囲に含まれる。
本発明の追加の態様および詳細は、下記実施例から明らかになるであろう。これらの実施例は、制限するものではなく、むしろ例示であることが意図される。
OSPAワクチン製剤の決定のための欧州ボレリアブルグドルフェリセンスラト株由来のOSPAの配列解析(分子疫学)
研究の目的は、欧州用のライム病OspAワクチンのための好適な製剤を決定することがであった。研究は、B.ブルグドルフェリセンスラトの大きな様々な株コレクション由来のOspA遺伝子の配列解析(分子疫学)(これは十分に欧州の広い地理的カバレッジを表す)、疾患と関連する様々な臨床症候群、およびライム病と関連する3つ病原性遺伝種(B.アフゼリ、B.ガリニおよびB.ブルグドルフェリss)の各々を基本とした。ライム病は、ボレリアブルグドルフェリセンスラトにより引き起こされ、これは、総計13遺伝種を含み、そのうちの3つ(B.アフゼリ、B.ガリニおよびB.ブルグドルフェリ ss)がヒトにおいて病原体であると認識されている。
脂質付加されたOSPAをコードする合成OSPA遺伝子の構築のための戦略
研究の目的は、レシピエントをこれらのいくつかのボレリア株のいずれかにより引き起こされるライム病から防御するワクチンを製造するために、ボレリアのいくつかの株から脂質付加されたOspAキメラコンストラクトを調製することであった。一般的な戦略を図1にまとめて示し、下記で説明する。
ZYA−argF)U169 deoR(F80dlacD(lacZ)M15](Gibco BRL)を、全ての中間クローニング工程に対して使用した。この株は、大腸菌株K12、遺伝子工学で最も広く使用される宿主に由来する。株はamp−であり、アンピシリン耐性遺伝子(amp)を含むベクターにより形質転換体の選択が可能である。大腸菌HMS174(DE3)を発現のための宿主として選択した。大腸菌HMS174(DE3)宿主細胞[遺伝子型:F− recA1 hsdR(rk12 −mk12 +) RifR (DE3)](Novagen)を、最終クローニング工程のために使用した。株はkan−であり、カナマイシン耐性遺伝子(kan)を含むベクターにより形質転換体の選択が可能である。
単一コロニーを使用して、5ml改変LBブロス(5.5gNaCl、5g酵母抽出物、10g大豆ペプトン(動物または遺伝的に修飾された植物源から入手されなかった)−1lの水あたり)に播種した。培養物を濁るまでインキュベートし、その後、培養物を予熱改変LBブロスで希釈して、25mlの体積とした。培養物を、0.2〜0.6のOD600nmに到達するまで(40−60分)さらにインキュベートし、希釈して125mlの体積とし、500mlフラスコに移し、0.6のOD600nmに到達するまでインキュベートした。培養物を5分間、氷浴中穏やかに振盪させることにより直ちに冷却し、細胞を直接ペレット化し(Beckman遠心機、4000rpmで10分)、TfBI緩衝液(Teknova Hollister、CA)(30mMK−アセテート、50mM MnCl2、100mM KCL、10mM CaCl2 15%グリセロール)で注意深く洗浄し、5mlのTfBII (10mM Na−MOPS、75mM CaCl2、10mM KCL、15%グリセロール)に再懸濁させ、氷上で15分間保持した。細胞をその後、ピペットでとり100μlアリコートとし、直接ドライアイス中で急速凍結させた。
3つの合成OSPA遺伝子を血清型1および2 OspA(lipB sOspA 1/2)、血清型6および4 OspA(lipB sOspA 6/4)ならびに血清型5および3 OspA(lipB sOspA 5/3)由来の防御エピトープを有するOspA分子をコードするように設計した。各新規OspA遺伝子(脂質付加)に対し、4つの組の30−60塩基対のオリゴヌクレオチドを合成した(表4−6を参照されたい)。図16−18は、公開された配列から予測されたヌクレオチド配列と整列させたコンストラクトの各々に対するコドン最適化配列を示す)。各オリゴヌクレオチド組は、8−12の相補的なオーバーラップオリゴヌクレオチドから構成された。各組からのオリゴヌクレオチドを、別々の実験で、共にアニールさせ、いずれかの端に特異的な制限酵素認識部位を有する二本鎖DNAフラグメント、すなわちフラグメントN−H(Nde I−Hind III)、H−K(Hind III−Kpn I)、K−E(Kpn I−EcoR I)およびE−B(EcoR I−BamH I)を生成させた。
個々の合成OspA遺伝子を構成するのに必要とされる4つのフラグメントの各々を、独立してpUC18にクローニングさせ、大腸菌宿主DH5αにトランスフォームさせた(図1を参照されたい)。
I−BamH IフラグメントのpUC18へのクローニングが可能になった。その後の、挿入フラグメントのKpn I、EcoR IおよびBamH Iによる消化により、フラグメントが生成し、これらはその後、Pvu IIにより消化された。Pvu II消化フラグメント(Kpn I−Pvu IIおよびPvu II−BamHI)をその後、Kpn IおよびBamH Iで切断されたpUC18ベクターDNAとのトリプル連結で使用され、Kpn I−BamH Iフラグメントが生成した。
次の工程では、個々の合成OspA遺伝子を構築するのに必要とされる4つのフラグメントの各々を、pUC18ベクターから切除し、単一工程で、pUC18ベクターに再クローニングし、全長OspA遺伝子を作製した(図1を参照されたい)。
全長OspA遺伝子がpUC18において確認された時点で、OspA遺伝子をその後、制限酵素NdeIおよびBamH Iを用いてpET−30a発現ベクターにサブクローニングし、大腸菌宿主HMS174(DE3)にトランスフォームさせた。
DNAリガーゼを用いて連結させ、連結生成物を、大腸菌HMS174(DE3)(Novagen)のコンピテント細胞にトランスフォームさせた。形質転換体をカナマイシン(30μg/ml)を含むLBプレート上に蒔いた。単一コロニーをPCRにより、プライマー5’−TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG−3’(配列番号17)および5’−TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT−3’(配列番号18)を用いてスクリーニングした。PCR産物を、アガロースゲルに適用し、電気泳動的に分離した。正確なサイズ(約1kb)の生成物を産生したコロニーをその後一晩中培養物を設定するために使用し、これからミニプレップDNAを、QIAGENプラスミド精製キットを用い、製造者プロトコルに従い単離した。配列を再び、(プライマー5’−TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG−3’(配列番号17)および5’−TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT−3’(配列番号18)、それぞれ、bp65−86および395−373を使用して)確認し、コロニーを発現試験のために選択した。
単一のアミノ酸をlipB sOspA 1/2コンストラクトにおいて変化させ、すなわち251位のアミノ酸アラニンを、アスパラギン残基に変化させ、免疫原性を増強させた。アミノ酸変化は、PCRにより導入した。最初に、PCRを外部順方向プライマーおよび内部逆方向プライマーを用いて設定し、導入されたアミノ酸変化を有する約730bpの生成物を産生させた(図15を参照されたい)。第2に、PCRを、内部順方向プライマーおよび外部逆方向プライマーを用いて設定し、導入されたアミノ酸変化を有する100bpの生成物を産生させた。2つのPCR産物は、配列がオーバーラップしており、その後、外部順方向および外部逆方向プライマーによる最終PCR反応において鋳型DNAとして使用され、導入されたアミノ酸変化を含む最終全長OspA生成物が産生された。
Tris−HCl(pH 8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2]、200μM dNTP、1.25U Amplitaq DNAポリメーゼ、および400nMの各プライマー対(プライマー対5’−GGA ATT CCA TAT GCG
TCT GTT GAT CGG CT(配列番号19)&5’−TTG GTG CCT GCG GAG TCG(配列番号20)およびプライマー対5’−AAT ACG ACT CCG CAG GCA CC(配列番号21)&5’−CTG−GGA TCC GCT CAG CTT ATT TCA(配列番号22))を含むPCR反応を設定した。PCR反応を、下記条件を用いて設定した;94℃で5分、35x(94℃で30秒、48℃で30秒、72℃で1分30秒)、続いて72℃で5分の浸漬および4℃で維持。反応により2つの別個のオーバーラップ生成物が産生し、2つの生成物を、外部プライマー5’−GGA ATT CCA TAT GCG TCT GTT GAT
CGG CT(配列番号19)および5’−CTG−GGA TCC GCT CAG
CTT ATT TCA(配列番号22)(Nde IおよびBamH Iに対する制限部位を組み入れた)を使用する、第3のPCR反応において鋳型DNAとして使用した。反応条件は、94℃で60秒、続いて35サイクル(30秒 94℃、60秒 49℃、90秒 72℃)、続いて72℃で5分とした。増幅産物を、QiaQuick精製キット(Qiagen)を用いて製造者の仕様書に従い精製し、生成物をNde IおよびBamH Iで消化させ、Nde IおよびBamH Iで切断されたpET30aベクターDNAに連結させた。連結生成物を、大腸菌DH5αのコンピテント細胞にトランスフォームさせた。形質転換体をカナマイシン(30μg/ml)を含むLBプレート上に蒔いた。単一コロニーを、PCRにより、プライマー5’−TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG−3’(配列番号17)および5’−TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT−3’(配列番号18)を用いてスクリーニングした。PCR産物をアガロースゲルに適用し、電気泳動的に分離した。正しいサイズ(約1kb)の生成物を産生したコロニーをその後一晩中培養物を設定するために使用し、これからミニプレップDNAを、QIAGENプラスミド精製系を用い、製造者プロトコルに従い単離した。配列を(プライマー5’−TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG−3’(配列番号17)および5’−TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT−3’(配列番号18)を使用して)確認し、得られたコンストラクトを、大腸菌HMS174(DE3)コンピテント細胞にトランスフォームさせ、得られた陽性形質転換体を、lipB sOspA 1/2251と命名した。
コンストラクトを、lipBリーダー配列を用いて調製したが、これには脂質部分が典型的にはアミノ末端システイン残基で付着されている。組換え脂質付加OspAの実験的試験は、脂質部分の存在を確認した。しかしながら、lipBリーダー配列を含まないコンストラクトもまた調製した。lipBリーダー配列を含まないコンストラクトは、PCR増幅により、3つのlipBコンストラクト(pET30a中)の各々から、リーダー配列をコードする核酸配列を有さず、システイン残基のためのコドンがメチオニン残基のためのコドンと置換されている、769−771bpの最終生成物を作製するように選択されたプライマーを使用して作製させた。
選択したコロニーを、それらの個々の新規OspAタンパク質を発現する能力に対して試験した。各場合において、単一コロニーを使用してカナマイシン(30μg/ml)を含むLBブロスに播種し、37℃で1〜5時間、OD(600nm)値が0.6超、1未満に到達するまで、インキュベートした。この時点で、培養物の1試料を保持し(誘導されていない試料を表す)、培養物の残りを1mMの最終濃度となるまでIPTGを添加することにより誘導させた。誘導されていない試料(1ml)を遠心分離し、ペレットを保持し、−20℃で貯蔵した。誘導された培養物を、さらに3時間増殖させ、その後、1mlの試料を取り、OD(600nm)を測定し、試料を遠心分離し、ペレットを保持し、−20℃で貯蔵した。
初代細胞を3つの脂質付加されたコンストラクトの各々および3つの脂質付加されていないコンストラクトの各々に対し調製した。初代細胞は、個々のOspAを発現するpET30aプラスミドを有する大腸菌細胞(HMS174(DE3))を含んだ。初代細胞の調製では、個々のストック由来の単一のコロニーをカナマイシン(30μg/ml)およびリファンピシン(200μg/ml)を含むプレートから採取し、これを使用して500μlのSMK培地(SOP8114)に播種し、一晩中インキュベートした。100μlのこの培養物をその後使用して、100mlのSMK培地に播種し(2通り)、培養物を17〜20時間、37℃で振盪しながらインキュベートした。滅菌グリセロールをその後、培養物に、最終濃度15%で添加し、材料を500μl量のアリコートでピペットでとり、60アンプルとし、よって、60アンプルの初代細胞を得、これを直接−80℃で貯蔵した。
脂質付加された1/2251OSPA(lipB sOSPA1/2251)の説明
この研究の目的は、血清型1および2を含む新規OspA抗原、脂質付加された1/2251 OspA(lipB sOspA 1/2251)を設計することであった。LipB sOspA 1/2251は、血清型2配列(株Pko、GenBank Accession No.S48322)の遠位部に融合された血清型1 OspA配列(株B31、GenBank Accession No.X14407)の近位部を含む。2型血清型にユニークな配列の開始は、216位のリシン(K)残基である。コンストラクトは、元々、251位のアミノ酸アラニン(A)をコードするように設計された。しかしながら、コンストラクトはその後、PCRにより、アスパラギン(N)残基(Pkoから公表された配列中の実際の残基)をコードするように変化され、免疫原性が増強され、lipB sOspA 1/2251と命名された。
● 分子の近位部(アミノ酸161〜185)における、推定関節炎誘発性エピトープ(Gross et al., 1998)、hLFA−1(YVLEGTLTA)(配列番号24)の、血清型2 OspA配列(株Pko;GenBank Accession No.S48322)由来の等価配列(イタリック体およびフランキング配列で示される):hLFA−1エピトープとは異なる配列による置換;
● OspBリーダー配列(図2のアミノ酸1〜15)および先行技術を回避するための様々な置換。44および46位のアスパラギン(N)およびアスパラギン酸(D)残基は、それぞれ、アスパラギン酸(D)およびアスパラギン(N)で置換され、配列KEKDKN(配列番号25)が生成された。78および79位のアラニン(A)およびアスパラギン酸(D)残基は、それぞれ、スレオニン(T)およびアスパラギン(N)により置換され、配列KTNKSK(配列番号26)が生成された;
● 国際特許公開第WO02/16421A2号(Luft&Dunn)に記載される安定化突然変異。例えば、メチオニン(M)がアミノ酸136でアルギニン(R)に取って代わり(R139M);チロシン(Y)がアミノ酸157でグルタミン酸(E)に取って代わり(E160Y);メチオニン(M)がアミノ酸186でリシン(K)に取って代わった(K189M);ならびに
● 追加の安定化突然変異。例えば、スレオニン(T)がアミノ酸173でバリン(V)に取って代わった(開示のaa176)。推定関節炎誘発性エピトープ(161−185位)の、B.ブルグドルフェリ配列をB.アフゼリ配列で置換することによる除去は、アミノ酸173と174の間の水素結合を妨害した(開示のaa176と177)。これは、防御モノクローナル抗体への結合を減少させた(105.5およびLA−2(Jiang et al., J. Immunol. 144: 284-9, 1990; Golde et al., Infect. Immun. 65: 882-9, 1997; およびDing et al., J. Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000)
。173位で、バリン(V)の代わりに、スレオニン(T)が導入されると水素結合が回復し、防御モノクローナル抗体105.5およびLA2への反応性が増加した。
脂質付加された6/4 OspA(lipB sOSPA 6/4)の説明
この研究の目的は、血清型4および6を含む新規OspA抗原、脂質付加されたsOspA 6/4 OspA(lipB sOspA 6/4)を設計することであった。LipB sOspA 6/4は、血清型4配列(株pTroB;GenBank Accession No.I40089)の遠位部に融合された血清型6 OspA配列(株K48、GenBank Accession No.I40098)の近位部を含む。型4血清型にユニークな配列の開始は、217位のアスパラギン(N)残基である。二次特徴を、図4でのlipB sOspA 6/4のアノテートされたアミノ酸配列において示し、下記を含む:
● 国際特許出願第WO02/16421A2(LuftおよびDunn)号で記載される安定化突然変異:アミノ酸136でのアルギニン(R)の代わりのメチオニン(M)、アミノ酸157でのグルタミン酸(E)の代わりのチロシン(Y)、およびアミノ酸187でのリシン (K)の代わりのメチオニン(M);ならびに
● 上記lipB sOspA 1/2251のように、OspBリーダー配列が使用され(図4のアミノ酸1〜15)、アミノ酸16−25は、OspB(GenBank Accession No.X74810)由来の配列と同一である。
脂質付加された5/3 OspA(lipB sOspA 5/3)の説明
この研究の目的は、血清型3および5を含む新規OspA抗原、脂質付加されたsOspA 5/3 OspA(lipB sOspA 5/3)を設計することであった。LipB sOspA 5/3は、配列番号5および6で示されるように修飾を有する、血清型3配列(株PBr;Genbank Accession No.X80256、B.ガリニOspA 遺伝子)の遠位部に融合された血清型5 OspA配列[Database Accession No.emb|X85441|BGWABOSPA、B.ガリニOspA遺伝子(WABSou sub株)]の近位部を含む。型3血清型にユニークな配列の開始は、216位のアスパラギン(D)残基である。二次特徴を、図6でのlipB sOspA 5/3のアノテートされたアミノ酸配列において示し、これは下記を含む:
● 国際特許出願第WO02/16421A2(LuftおよびDunn)号で記載される安定化突然変異:アミノ酸136でのアルギニン(R)の代わりのメチオニン(M)、アミノ酸157でのグルタミン酸(E)の代わりのチロシン(Y)、およびアミノ酸187でのリシン(K)の代わりのメチオニン(M);ならびに
● 上記lipB sOspA 1/2251およびlipB sOspA 6/4のように、OspBリーダー配列が使用され(図6のアミノ酸1〜15)、アミノ酸16−25は、OspB(GenBank Accession No.X74810)由来の配列と同一である。
大腸菌における高レベル発現のためのコドン使用頻度の最適化
大腸菌においてめったに使用されないコドンの存在が、外来遺伝子の高レベル発現を妨げる可能性があることが知られているので、使用率の低いコドンは、大腸菌において高度に発現される遺伝子により使用されるコドンと置換させた。新規OspA遺伝子のヌクレオチド配列は、高度に発現されたクラスII、大腸菌遺伝子(Guerdoux-Jamet et. al.,
DNA Research 4:257-65,1997)の中で最もしばしば見いだされるコドン(好ましいコ
ドン)を使用するように設計された。新規OspA遺伝子間のコドン使用頻度、および高度に発現したクラスII大腸菌遺伝子に対するデータを表7および8にまとめて示す。tRNA分子が律速となる可能性が低い、より頻度の低いアミノ酸に対するデータ(表7)を、最もしばしば起こるアミノ酸に対するデータ(表8)と別々に示す。
lipBリーダー配列を含まないコンストラクトもまた調製した。2組のコンストラクト(脂質付加された、および脂質付加されていない)が、発酵槽における生成の容易さを評価するために(バイオマス、安定性、生成収率、など)、どれくらい容易に異なる型の抗原を精製することができるか評価するために、それらの生物学的特性(安全性プロファイルおよび防御能力)を比較するために、必要である。
抗原目的のための新規組換えOspA遺伝子の発現/生成のために、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼにより制御された大腸菌発現系(Studier et al., J. Mol. Biol. 189:113-30、1986)を使用した。この発現系では、新規OspA遺伝子を、pETシリーズプラスミドの1つ(例えば、pET30a)中の複数のクローニング部位にクローニングさせた。外来遺伝子の発現は、バクテリオファージT7プロモーター(大腸菌RNAポリメラーゼにより認識されない)の制御下にあるので、発現はT7 RNAポリメラーゼ源に依存する。この酵素は、組換えプラスミドが適切な発現宿主、例えば大腸菌HMS174(DE3)(T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む)中に移行された時に提供される。染色体に取り込まれたT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現は、lacUV5プロモーターの制御下にあり、これはイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)またはラクトースの付加によりスイッチオンすることができる(すなわち、誘導される)(図10を参照されたい)。結果として、外来遺伝子の発現はまた、インデューサー分子の付加により調節される。
単一の組換えOspA抗原(ROSPA 1/2)は、B.ブルグドルフェリs.s.およびB.アフゼリによる感染に対し防御する
この研究の目的は、OspA血清型1および2の防御特性を保持するように設計された単一の組換え抗原(rOspA 1/2;配列番号2(lipB sOspA 1/2251)を含むポリペプチド)が、マウスをB.ブルグドルフェリs.s.(OspA血清型1)またはB.アフゼリ(OspA血清型2)のいずれかによる感染に対し防御する抗体応答を誘導することができるかを決定することであった。追加のrOspA抗原の含有は、rOspA 1/2抗原により提供される防御免疫に対し拮抗効果を有さなかったこを示す証拠が提供される。
外来病原体の導入の危険を排除するために、相補的なオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドを使用して、共に連結されベクターpET30aにクローニングされたDNAフラグメントを作製し、配列を確認した。このアプローチにより、コドン使用頻度を、OspA遺伝子を発現するために使用される大腸菌宿主HMS174 (DE3)に対し最適化させることが可能になった。新規遺伝子は、血清型−2配列(アミノ酸219〜273、株PKo;Accession NumberS48322)の遠位部に融合された血清型−1 OspA配列(アミノ酸29〜218、株B31;GenBank Accession Number X14407)の近位部に基づく。B.ブルグドルフェリ株B31由来の25アミノ酸フラグメント(aa164〜188)を、B.アフゼリ株PKo由来の配列(aa164〜188)と置換した。というのは、B31 OspA(aa165−173)のこの領域は、hLFA−1エピトープ(aa332−340)を含む領域に高度に関連するからである。脂質付加されたタンパク質の発現を最適化するために、リーダー配列および最初の11アミノ酸を含むN末端配列を、OspB(株B31;GenBank Accession NumberX74810)から誘導した。rOspA1/2分子の免疫原性およびコンホメーション安定性を改善するために他の特定のアミノ酸変化を実施し、rOspA 1/2(lipB sOspA 1/2251)の配列を配列番号2で設定する。
異なるOspA抗原を発現する、ボレリアの2つの種による感染を防止する単一の組換えOspA抗原(rOspA 1/2)の能力を、0.2%(w/v)水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いて製剤化した精製OspA抗原(0.1μgまたは0.03μg用量)により皮下に(0および28日)免疫化したC3H/HeJマウスにおいて評価した。マウスをブースター免疫化後2週間で、皮内注射(針誘発;7x104細胞)または感染の自然経路(マダニ誘発)のいずれかにより誘発した。後者の実験では、8匹の幼虫マダニを、マウス1匹あたりに適用し、5日まで摂食させた。幼虫は、ライム病がよく見られる地域であるBudweis(チェコ共和国)近辺で収集した。これらのマダニの大多数が、PCRにより摂食させていないマダニを試験することにより決定されるようにB.アフゼリに感染した。マウスの感染状態を4週間後に決定した。マダニ誘発実験では、ボレリアの存在は、培養(膀胱)により、およびリアルタイムPCR(心臓)によるボレリアDNAの検出により確認した。動物実験を動物実験に関するオーストリアの法律および国際ガイドライン(AAALACおよびOLAW)に従い実施し、動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)による再調査を受け、オーストリア規制当局による承認を受けた。免疫原性。rOspA 1/2抗原に対する抗体応答(μg IgG/ml)をELISAにより、rOspA 1/2をコーティング抗原として、規定されたIgG含量を有するOspA特異的モノクローナル抗体(室内調製)を標準として使用して決定した。
針誘発実験では、表面露出リポタンパク質VlsEタンパク質中の保存エピトープ(C6 ELISA;Immunetics(登録商標)C6 Lyme ELISA(商標)からのコートプレート)またはOspA免疫源以外のボレリア抗原(Westernブロッティング)に対する抗体の存在を、感染の診断に使用した。Westernブロッティングは、B.ブルグドルフェリs.s.株ZS7から調製した細胞可溶化物を使用した。というのも、これが誘発生物であったからである。動物は、両方のアッセイにおいて陽性であった場合、感染したと見なした。
可能であれば、感染生物を培養し、OspA配列および推定アミノ酸配列を、OspA
残基38−262(B.アフゼリVS461、GenBank Accession Number Z29087)に対して決定した。この情報を、OspA参照配列と比較し、よって、OspA型およびボレリア種を推測することができる。単一のOspA血清型を発現する種では、種に対する株型に対するOspA配列を、参照、例えば、B.アフゼリVS461またはB.バライシアナVS116(GenBank Accession Number Z29087;AF095940)として選択した。B.ガリニは複数のOspA型を有するので、OspA遺伝子型3−7に対するOspA配列を使用した(すなわち、株PBr、PTrob、WABSou、TlsIおよびT25;それぞれ、GenBank Accession Number X80256、X80186、X85441、X85440およびX80254)。リアルタイムPCRに基づくタイピングでは、GenBankに預けられた124B.ブルグドルフェリs.l.種のOspA遺伝子の配列アライメントを血清型特異的配列に対して検査し、好適なプライマー−プローブ組み合わせを、Primer Express 3.0(Applied Biosystems)を用いて設計した。全てのアッセイはABI Prism(登録商標)7900HT配列決定ユニットで、普遍的サイクリング条件を用いて実施した。
低用量の2つの異なるロットのrOspA 1/2抗原で免疫化したマウスはすべて、ELISAにより決定されるように免疫源に特異的なIgG抗体を発現した。水酸化アルミニウムを含むワクチン製剤緩衝液で処理した対照マウスでは抗体は検出されなかった。この免疫応答のB.ブルグドルフェリs.s.、血清型−1 OspAをコードする種による感染を防止する能力を評価するために、マウスに、B.ブルグドルフェリs.s.株ZS7の7x104細胞を皮内注射した。アジュバントを含む緩衝液で処理した対照マウスは全て、C6 ELISAおよびWesternブロッティングにより示されるように、感染の血清学的証拠を示した。rOspA 1/2抗原で免疫化したマウスは感染せず、これらのマウス由来の血清はどちらのアッセイでも陰性であった。アジュバントとして水酸化アルミニウムと共に製剤化し、2つの用量免疫化レジメンで投与した場合、0.03μgという少量のrOspA 1/2抗原が病原性B.ブルグドルフェリs.s.株ZS7による針誘発に対し100%防御を与えた(P<0.0001、Fisher直接両側検定)。
rOspA 1/2抗原による免疫化の、B.アフゼリ、血清型2 OspAをコードする種による感染を防止する能力を評価するために、マウスを、2つの別々の実験で、同じ上記針誘発実験で使用したのと抗原ロットおよび研究設計を用いて免疫化した。しかしながら、この場合、免疫化マウスは、主にB.アフゼリに感染したことが知られている野生マダニ(幼虫)により誘発した。これらの野生マダニのB.ブルグドルフェリs.l.をマウスに伝染させる能力は、非免疫化対照動物を誘発することにより確認した。
2つの異なるOspA血清型(1および2)由来の防御要素を含むように設計された単一の組換え細胞表層タンパク質A(OspA)抗原は、マウスを、B.ブルグドルフェリセンスストリクト(OspA血清型1)またはB.アフゼリ(OspA血清型2)のいずれかによる感染に対して防御する抗体応答を誘導することができた。B.ブルグドルフェリs.s.株ZS7による感染に対する防御は、針誘発モデルにおいて証明された。B.アフゼリ種に対する防御は、野生マダニを使用するマダニ誘発モデルで見られた。両方のモデルにおいて、0.03μgという少量の抗原が、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いる2つの用量免疫スケジュールで投与すると、標的とされる種に対する完全防御を提供するのに十分であった。予想されるように、この新規抗原により認められる防御は、抗原がB.ガリニおよびB.バライシアナ株による感染に対し防御を提供することができないことから証明されるように、他のボレリア種に及ばなかった。この原理研究の証拠は、防御エピトープの情報は、より少ないOspA抗原を必要とする有効な遺伝子組換えワクチンの合理的設計のために使用することができることを証明し、このアプローチが、世界的利用のためのOspAワクチンの開発を促進し得ることを示唆する。
この研究の目的は、ボレリアブルグドルフェリセンスストリクトOspA型1株を使用する針誘発モデルにおいて、rOspA 1/2抗原により免疫化されたマウスに対する防御の関連要因を確立することであった。分析したパラメータは、生ボレリアの表面に結合する、またはボレリアの増殖を阻害する抗OspA抗体の効力であった。
このアッセイでは、OspA型1を発現するB.ブルグドルフェリs.s.株B31を、補体活性化を防止するためにEDTAの存在下、室温で誘発前マウス血清と共に固定希釈(1:100)でインキュベートした。洗浄して非結合抗体を除去した後、細胞表面に特異的に結合した抗体を、処理細胞をr−フィコエリトリン結合抗マウスIgポリクローナル抗体とインキュベートすることにより標識した。その後、赤色蛍光を発し、よって、検出を増強するDNA染色(LDS−751)を使用し、細菌をその後、フローサイトメトリー(FACSCalibur、Beckton−Dickinson)により分析した。細胞表面に付着された抗体分子の数と相関する蛍光強度を、少なくとも2,000個体ボレリアに対し記録し、蛍光強度(MFI)の平均を計算した。正常マウス血清は抗体の非特異的表面結合の程度を評価するための陰性対照として機能し、OspA血清型1特異的mAbは、OspA型の同一性を確認し、細菌培養における細胞のOspA発現レベルを確認するための陽性対照として機能した。
誘発前血清の、ボレリアの増殖を阻害する効力を測定するために、OspA型1を発現するB.ブルグドルフェリs.s.株B31を33℃で段階希釈の熱不活性化誘発前または非免疫マウス血清(陰性対照)の存在下、補体(正常モルモット血清)の存在下培養した。非免疫血清と共にインキュベートした対照培養物中の細菌を十分増殖させた場合、顕微鏡的に決定されるように、正確な細胞カウントは、フローサイトメトリー分析により実施した。細胞培養物を、明確な数の蛍光標識ビーズを含む溶液と混合し、DNA染料をボレリア細胞を蛍光標識するために添加した。試料を、100ビーズがカウントされるまでFACSCaliburフローサイトメーターを用いて処理し、ビーズを規定するゲートにおけるイベント数を、ボレリアを規定するゲートにおけるものと比較することにより絶対細胞濃度を計算した(細胞/ml)。細菌増殖を50%阻害した血清希釈を、NMS対照と比較して計算し、GI−50力価として報告した。標準血清調製物を使用して異なるアッセイ間で力価を正規化した。測定した血清パラメータの分布を感染および防御動物間で、ノンパラメトリックマンホイットニーU検定(Graphpad Prism Vers.5.0)により比較した。
マウス抗OSPA抗体が生ボレリアの表面に結合するまたはその増殖を阻害する効率は、B.アフゼリ型2株を使用するマダニ誘発に対する防御と相関する
この研究の目的は、マダニ誘発モデルにおいてキメラOspA 1/2抗原で免疫化したマウスの防御の関連要因を確立することであったが、この場合、マウスに感染させるためにチェコ共和国のBudweisから収集した野生マダニを使用することによる自然感染経路を使用する。この流行地由来の幼虫マダニは、主にB.アフゼリに感染するので、B.アフゼリOspA型2株誘発を提供すると考えられる。実施例10で示されるように、分析したパラメータは、生ボレリアの表面に結合する、またはボレリアの増殖を阻害する抗OspA抗体の効力であり、これらはどちらもボレリアブルグドルフェリs.s.による針誘発に対しよく相関することが示された。よって、この研究は、B.アフゼリ、欧州において最も顕著なヒト疾患関連遺伝種の自然感染に対する防御の関連要因として2つのパラメータを使用する適用性を拡大するように機能する。
このアッセイでは、OspA型2を発現するB.アフゼリ株Arconを、補体活性化を防止するためにEDTAの存在下、室温で誘発前マウス血清と共に固定希釈(1:100)でインキュベートした。洗浄して非結合抗体を除去した後、細胞表面に特異的に結合した抗体を、処理細胞をr−フィコエリトリン結合抗マウスIgポリクローナル抗体とインキュベートすることにより標識した。アッセイにおけるその後の工程はすべて、実施例10で記載されるものと類似した。正常マウス血清は非特異的抗体結合のための陰性対照として機能した。高力価マウス血清は3成分rOspAワクチン製剤に対し産生され、OspA血清型2特異的mAbsと共に、陽性対照として機能し、OspA血清型特異性および細菌培養物における細胞のOspA発現レベルが確認された。
誘発前血清の、ボレリアの増殖を阻害する効力を測定するために、OspA型2を発現するボレリア、B.アフゼリ株Arconを33℃で段階希釈の熱不活性化誘発前または非免疫マウス血清(陰性対照)の存在下、補体なしで培養した。非免疫血清と共にインキュベートした対照培養物中の細菌を十分増殖させた場合、顕微鏡的に決定されるように、正確な細胞カウントは、フローサイトメトリー分析により実施した。細菌をカウントするために使用する手順は、実施例10において増殖阻害アッセイにおいて前に記載したものに類似した。細菌増殖を50%阻害した血清希釈を、NMS対照と比較して計算し、GI−50力価として報告した。標準血清調製物を使用して異なるアッセイ間で力価を正規化した。
測定した血清パラメータの分布を感染および防御動物間で、ノンパラメトリックマンホイットニーU検定(Graphpad Prism Version 5.0)により比較した。
0.003pgのrOspA 1/2で3回免疫化し、8匹の野生マダニで誘発させた20匹の動物のうち、7/20(35%)が感染したことが見いだされた。マダニ入手可能性が制限されているため、非免疫化マウスの対照群を誘発することによる、誘発の正確な感染率を決定することができなかった。しかしながら、この誘発は本研究の目的のために要求されず、典型的には70−80%の感染率が、Budweisからの野生マダニによる誘発実験において達成されている。
この研究では、誘発時のマウス血清中の機能的抗体含量と1匹のマウスあたり8匹のマダニを適用する野生マダニ誘発による感染に対する防御の間には統計学的に有意の相関が存在することが示される。OspA型2を発現する生ボレリアのFACSに基づく蛍光強度測定は、細菌を誘発前血清と固定希釈でインキュベートした後に実施した細胞表面に付着された抗OspA抗体分子の数を反映し、防御と最もよく相関した。増殖阻害力価もまた、防御とよく相関した。効率的な死滅のために補体が必要とされるボレリアブルグドルフェリs.s.株とは対照的に、rOspA1/2抗原は、補体が存在しなくても、ボレリア増殖を効果的に阻害する抗体を誘導した。
6/4およびrOspA 5/3)でマウスを免疫化した後に生成される免疫応答は、ワクチン内に存在する相同OspA型1−6(実施例16を参照されたい)以外に、今まで試験された型1、2、3、5、および6の型内変異体(またはサブタイプ)全てに(実施例15を参照されたい)およびさらに異種OspA型に対する機能的免疫応答を誘導することを示すことが可能であった。
3つの抗原(1/2、6/4、および5/3)を含む多価組換えOSPA製剤はマウスにおいて高度に免疫原性である
多価OspAワクチン(rOspA 1/2、rOspA 5/3、およびrOspA
6/4)をマダニ誘発モデルにおいて評価した。OspA血清型1および2(配列番号2)、OspA血清型6および4(配列番号4)、ならびにOspA血清型5および3(配列番号6)由来の防御エピトープを含む3つの組換えOspA抗原を1つのワクチン内で組み合わせた。
5/3、およびrOspA 6/4)で皮下に免疫化した。マダニ誘発を、上記本明細書で記載されるように、Budweis、チェコ共和国由来のマダニを用いて実施した。野生マダニのB.ブルグドルフェリs.l.をマウスに伝染させる能力は、非免疫化対照動物を誘発することにより確認した。誘発させたマウスの感染状態は、Westernブロッティング、リアルタイムPCR、および培養により決定した。
表面結合(MFI)および増殖阻害(GI−50力価)はどちらも、針誘発(B.ブルグドルフェリs.s.)モデル(実施例10)およびマダニ誘発(B.アフゼリ)マウスモデル(実施例11)において良好な防御の関連要因であることが示されているので、本研究は、ワクチンの有効性を調査するために有効なインビボ防御モデルがない、B.ガリニOspA血清型3−6に対する3成分キメラrOspA抗原ワクチン製剤により等価な機能的免疫応答が誘導されるかどうかを決定するために着手した。
10匹の雌C3H/HeJマウスの群を皮下に3回(0日、14日、28日)、rOspA−1/2、rOspA−6/4およびrOspA−5/3)の1:1:1混合物により、3つの異なる用量で(1用量あたり1、0.1、0.03μgタンパク質)、0.2%Al(OH)3をアジュバントとして併用して免疫化した。血清を40日に採った血液試料から生成させた。
このアッセイでは、OspA型1−6を発現する6つの代表的なボレリア株(B.ブルグドルフェリセンスストリクトB31/OspA−1;B.アフゼリArcon/OspA−2;B.ガリニPBr/OspA−3;B.ガリニDK6/OspA−4;B.ガリニW/OspA−5;およびB.ガリニKL11/0spA−6)のインビトロで増殖させた培養物を、ピーク力価マウス血清のプールによる固定希釈(1:100)で、室温で、補体活性化を防止するためにEDTAの存在下でインキュベートした。その後の洗浄、ラベリング、検出および分析手順は、実施例10で記載されるものと類似した。正常マウス血清は、抗体の非特異的結合のための陰性対照として機能した。
誘発前血清がボレリアの増殖を阻害する効力を測定するために、OspA型1−6を発現する6つの代表的な株(B31、Arcon、PBr、DK6、W、およびKL11)を、33℃で、熱不活性化ピーク力価血清プールまたは非免疫マウス血清(陰性対照)の段階希釈の存在下培養した。B31を補体(モルモット血清)の存在下で培養し、他の5つの株は補体なしで試験した。再び、増殖阻害アッセイを実施例10で記載されるように実施した。標準血清調製物を使用して、異なるアッセイ間の力価を正規化した。
3成分ワクチンの1:100希釈での異なる免疫化用量群(1用量あたり1.0、0.1および0.03μgタンパク質)由来の3つの血清プールを用いて試験した場合、50〜200の範囲のMFI値を有する強い蛍光染色が、6つ全てのボレリア株に対し観察された(図21)。3つの用量群由来の血清プールをそれらの細菌増殖を阻害する能力に対して試験した場合、3成分ワクチンはまた、6つ全てのOspA型株に対し、1000(型4株、0.03μg用量)〜20,000(型6株)の範囲の強いGI−50力価を誘導したことが見いだされた。
まとめると、これらの結果はrOspA抗原が高度に免疫原性であり、大量の機能的抗体を誘導し、これは生ボレリアの表面に結合し、ボレリアの増殖を阻害することができることを証明する。試験した6つの株の間のカバレッジは、高い蛍光強度および高い増殖阻害力価が検出され、OspA型1および2で観察されたレベルに匹敵するので完全であった。要するに、この研究で示される結果は、3成分rOspAワクチン(1/2+5/3+6/4)により誘導された抗体応答は、Al(OH)3と製剤化された場合、OspA型1−6を発現する株による感染を防止し、これは、疫学調査が示しているように、理論的には欧州および北米においてヒト疾患を引き起こす分離株の99%をカバーし、よって、ライムボレリア症を防止するのに非常に有効である。
3成分ワクチン(OSPA 1/2、OSPA 6/4、およびOSPA 5/3)を含むワクチンは、OspA型1−6を発現するボレリアを最適にカバーするために要求される
この研究の目的は、rOspAライムボレリア症ワクチンの単一および多成分製剤により誘導された機能的表面結合および/または増殖阻害抗体の免疫原性および交差株カバレッジを、再び、抗OspA抗体の生ボレリアの表面に結合するおよびインビトロでのボレリアの増殖を阻害する効率を防御の関連要因として使用して、調査、比較することであった。
1群あたり10匹の雌マウス(C3H)を、0.1μgの、rOspA 1/2抗原、rOspA 6/4抗原、またはrOspA 5/3抗原を含む単一成分ワクチン;0.1μgの、1/2+5/3抗原、1/2+6/4抗原、または5/3+6/4抗原両方を含む2成分ワクチン;または0.1μgの、3つ全ての1/2+5/3+6/4抗原の組み合わせをアジュバントととして0.2%AI(OH)3と共に含む3成分ワクチンにより、刺激−ブースターレジメンで免疫化した。ワクチン接種を、200μlの用量体積を使用して、0、14および28日に皮下に実施した。42日に、個々の血液試料をマウスから取り、血清を生成させた。
表面結合アッセイのわずかに修正したバージョンを使用して、抗OspA IgGの生ボレリアの表面に結合する効率を決定した。明確なMFI力価を有する血清プールの段階希釈を分析で含み、標準曲線を作製し、これから、試験血清の相対力価を、非線形回帰曲線を用いて補間した後に読み取った。OspA型1−6を発現する個々の株に対する標準血清のMFI力価は、ボレリアの蛍光強度が正常マウス血清で観察される蛍光強度を少なくとも3倍超える最高希釈として規定された。全ての定量は2通りで実施した。
ボレリアOspA型1−6を、多価rOspAワクチンの設計および構築のための基礎として選択したが、型1、2、3、5、および6のOspAタンパク質変異体を発現するボレリアもまた単離されている。これらの変異体は、同じ型内にあると分類されるが、わずかに変化したヌクレオチド遺伝子配列およびアミノ酸タンパク質配列を有する。よって、型内変異体またはサブタイプがOspA型1、2、3、5、および6の間に存在する(図24を参照されたい)。OspA型4では、型内変異体またはサブタイプがまだ観察されていない。
3成分キメラrOspAワクチンは、C3Hマウスにおいて、OspA型1、2、3、5、および6の全ての型内変異体またはサブタイプに対して機能的、表面結合抗体を誘導する。
多価OSPAワクチン製剤は、OSPA型1−6を発現するものに加えてボレリアの他の型に対する防御を提供する
この研究の目的は、3成分キメラrOspA抗原ワクチン製剤(3つ全てのキメラ抗原1/2、6/4、および3/5を含む)が相同OspA型1−6以外のOspA型を発現するボレリアに対しても防御を提供することができるかを決定することであった。40C3Hマウスを3回、0.3μgの3成分ワクチンで、0、14および28日に免疫化した。42日に、マウスを出血させ、血清プールを作製し、これを使用して、異種OspA型を発現する株に対する表面結合および増殖阻害の効率を評価した。
多価キメラrOspA製剤の防御効率を調査する過程中、モノクローナル抗体が(F237/BK2)が、rOspA−1/2およびrOspA−6/4を含む2成分rOspAワクチンに対して生成された。F237/BK2は、抗OspA ELISAにより、これまで調査した全てのOspA型(OspA型1−7)、ならびに3つのキメラrOspA抗原(rOspA−1/2、rOspA−5/3およびrOspA−6/4)に結合することが示された。そのような結果から、F237/BK2が全てのOspA分子上で見られる共通エピトープを認識することが示される。さらに、予備的エピトープマッピング研究は、この共通エピトープは分子のより可変性の低いN末端半分(すなわち、アミノ酸130のN末端)に位置し、そこではOspA配列相同性が最も普通に観察されることを示す。
この研究は、3成分キメラrOspAワクチンが型特異的および広い交差防御免疫応答の両方を誘導することができることを示す。
この研究の目的は、それぞれ、血清型1および2、6および4、ならびに5および3を含む追加の新規OspA抗原を設計することであった。3つの合成OspA遺伝子(配列番号168(orig sOspA 1/2)、170(orig sOspA 6/4)、および172(orig sOspA 5/3))を、ボレリアのOspA血清型1および2(orig sOspA 1/2)、OspA血清型6および4(orig sOspA 6/4)ならびにOspA血清型5および3(orig sOspA 5/3)に由来する防御エピトープを有するOspAポリペプチド分子をコードするように設計した。これらの分子の一次アミノ酸配列(それぞれ、配列番号169、171、および173)を表1で提供する。これらの配列はオリジナルキメラコンストラクトを含み、すなわち変異およびコドン最適化を有さない。
3つの抗原(1/2、6/4、および5/3)を含む多価組換えOSPA製剤は、マウスにおいて免疫原性である
コドン最適化および変異を有さないオリジナルコンストラクト製剤(orig OspA 1/2、orig OspA 5/3、およびorig OspA 6/4)を含む多価OspAワクチンを、マダニ誘発モデルにおいて評価する。OspA血清型1および2(配列番号169)、OspA血清型6および4(配列番号171)、ならびにOspA血清型5および3(配列番号173)由来の防御エピトープを含む3つの組換えOspA抗原を1つのワクチン内で組み合わせる。
3成分ワクチン(ORIG OSPA 1/2、ORIG OSPA 6/4、およびORIG OSPA 5/3)を含むワクチンは、OSPA型1−6を発現するボレリア株に結合し、その増殖を阻害する高レベルの機能的抗OspA抗体を誘導する
実施例13で示される結果は、3成分rOspAワクチン(lipB sOspA 1/2+lipB sOspA 5/3+lipB sOspA 6/4)により誘導される抗体応答は、Al(OH)3と共に製剤化された場合、OspA型1−6を発現する株による感染を阻害し、よって、ライムボレリア症を防止するのに有効である。よって、本研究は、等価な機能的免疫応答がキメラオリジナル(orig)OspA抗原(Orig
sOspA 1/2+Orig sOspA 5/3+Orig sOspA 6/4)を含む3成分OspAワクチンにより誘導されるかを決定するために実施される。
10匹の雌C3H/HeJマウスの群を皮下に3回(0日、14日、28日)、Orig sOspA 1/2+Orig sOspA 5/3+Orig sOspA 6/4)の1:1:1混合物により、3つの異なる用量で(1用量あたり1、0.1、0.03μgタンパク質)、0.2%Al(OH)3をアジュバントとして併用して免疫化する。血清を40日に採った血液試料から生成させる。
このアッセイでは、OspA型1−6を発現する6つの代表的なボレリア株(B.ブルグドルフェリセンスストリクトB31/OspA−1;B.アフゼリArcon/OspA−2;B.ガリニPBr/OspA−3;B.ガリニDK6/OspA−4;B.ガリニW/OspA−5;およびB.ガリニKL11/0spA−6)のインビトロで増殖させた培養物を、ピーク力価マウス血清のプールによる固定希釈(1:100)で、室温で、補体活性化を防止するためにEDTAの存在下でインキュベートする。その後の洗浄、ラベリング、検出および分析手順は、実施例10および13で記載されるものと類似する。正常マウス血清は、抗体の非特異的結合のための陰性対照として機能する。
誘発前血清がボレリアの増殖を阻害する効力を測定するために、OspA型1−6を発現する6つの代表的な株(B31、Arcon、PBr、DK6、W、およびKL11)を、33℃で、熱不活性化ピーク力価血清プールまたは非免疫マウス血清(陰性対照)の段階希釈の存在下培養する。B31を補体(モルモット血清)の存在下で培養し、他の5つの株は補体なしで試験する。増殖阻害アッセイを実施例10および13で記載されるように実施する。標準血清調製物を使用して、異なるアッセイ間の力価を正規化する。
3成分ワクチンの1:100希釈での異なる免疫化用量群(1用量あたり1.0、0.1および0.03μgタンパク質)由来の3つの血清プールを用いて試験した場合、蛍光染色を6つ全てのボレリア株に対し測定する。
3成分ワクチン(OSPA 1/2、OSPA 6/4、およびOSPA 5/3)を含むワクチンは、OSPA型1−6を発現するボレリアを最適にカバーするために要求される
この研究の目的は、Orig sOspAライムボレリア症ワクチンの単一および多成分製剤により誘導された機能的表面結合および/または増殖阻害抗体の免疫原性および交差株カバレッジを、抗OspA抗体の生ボレリアの表面に結合するおよびインビトロでのボレリアの増殖を阻害する効率を防御の関連要因として使用して、調査、比較することである。
1群あたり10匹の雌マウス(C3H)を、0.1μgの、Orig sOspA 1/2抗原、Orig sOspA 5/3抗原、またはOrig sOspA 6/4抗原を含む単一成分ワクチン;0.1μgの、1/2+5/3抗原、1/2+6/4抗原、または5/3+6/4抗原両方を含む2成分ワクチン;または0.1μgの、3つ全ての1/2+5/3+6/4抗原の組み合わせをアジュバントとして0.2%AI(OH)3と共に含む3成分ワクチンにより、刺激−ブースターレジメンで免疫化する。ワクチン接種を、200μlの用量体積を使用して、0、14および28日で皮下に実施する。42日に、個々の血液試料をマウスから取り、血清を生成させる。
上記表面結合アッセイのわずかに修正したバージョンを使用して、抗OspA IgGの生ボレリアの表面に結合する効率を決定する。明確なMFI力価を有する血清プールの段階希釈を分析で含み、標準曲線を作製し、これから、試験血清の相対力価を、非線形回帰曲線を用いて補間した後に読み取る。OspA型1−6を発現する個々の株に対する標準血清のMFI力価は、ボレリアの蛍光強度が正常マウス血清で観察される蛍光強度を少なくとも3倍超えると決定される最高希釈として規定される。全ての定量は2通りで実施する。
この研究の目的は、3成分多価orig OspAワクチン(orig sOspA 1/2、orig sOspA 6/4、およびorig sOspA 5/3)でマウスを免疫化することにより生成された免疫血清が、これらの型内変異体またはサブタイプを発現する生ボレリアの表面に結合することができる機能的抗体を含むことを確認することであった。
Claims (13)
- 免疫原性組成物であって、以下:
(1)以下からなる群から選択される核酸分子:
(a)配列番号1もしくは配列番号7で示されるヌクレオチド配列と少なくとも91パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号1もしくは配列番号7で示されるヌクレオチド配列と少なくとも91パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;
(b)配列番号1もしくは配列番号7で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号1もしくは配列番号7を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;
(c)配列番号1もしくは配列番号7で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる核酸分子、ここで、配列番号1もしくは配列番号7の核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;
(d)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも91パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも91パーセントの配列同一性を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;
(e)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の置換を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;
(f)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;
(g)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;
(h)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸のCおよび/またはN末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸のCおよび/もしくはN末端トランケーションを有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;
(i)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端トランケーション、またはN末端トランケーションから選択される1〜25のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端トランケーションもしくはN末端トランケーションから選択される1〜25のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る;ならびに
(j)(a)−(i)のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子;
(2)以下からなる群から選択される核酸分子:
(a)配列番号3もしくは配列番号9で示されるヌクレオチド配列と少なくとも91パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号3もしくは配列番号9で示されるヌクレオチド配列と少なくとも91パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(b)配列番号3もしくは配列番号9で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号3もしくは配列番号9を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(c)配列番号3もしくは配列番号9で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる核酸分子、ここで、配列番号3もしくは配列番号9の核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(d)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも91パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも91パーセントの配列同一性を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(e)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の置換を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(f)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(g)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(h)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸のCおよび/またはN末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸のCおよび/もしくはN末端トランケーションを有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(i)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端トランケーション、またはN末端トランケーションから選択される1〜25のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端トランケーションもしくはN末端トランケーションから選択される1〜25のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;ならびに
(j)(a)−(i)のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子;
(3)以下からなる群から選択される核酸分子:
(a)配列番号5もしくは配列番号11で示されるヌクレオチド配列と少なくとも91パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号5もしくは配列番号11で示されるヌクレオチド配列と少なくとも91パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(b)配列番号5もしくは配列番号11で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号5もしくは配列番号11を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(c)配列番号5もしくは配列番号11で示される配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる核酸分子、ここで、配列番号5もしくは配列番号11の核酸分子によってコードされるポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(d)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも91パーセントの配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも91パーセントの配列同一性を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(e)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の置換を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(f)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の挿入を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(g)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸の内部欠失を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(h)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸のCおよび/またはN末端トランケーションを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、1〜25のアミノ酸のCおよび/もしくはN末端トランケーションを有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;
(i)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端トランケーション、またはN末端トランケーションから選択される1〜25のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ここで、配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端トランケーションもしくはN末端トランケーションから選択される1〜25のアミノ酸の修飾を有するポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る;ならびに
(j)(a)−(i)のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子;
(4)アジュバント;ならびに、
(5)薬学的に許容される担体
を含み、ここで該核酸分子は、異なるヌクレオチド配列を有する、免疫原性組成物。 - 免疫原性組成物であって、以下:
(1)ポリペプチドであって、以下:
(a)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも91パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;ならびに
(c)配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなる群より選択され、ここで、配列番号2もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列、または、それに対して少なくとも91パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアブルグドルフェリおよびボレリアアフゼリに対して防御し得る、ポリペプチド;
(2)ポリペプチドであって、以下:
(a)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも91パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;ならびに
(c)配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなる群より選択され、ここで、配列番号4もしくは配列番号10で示されるアミノ酸配列、または、それに対して少なくとも91パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る、ポリペプチド;
(3)ポリペプチドであって、以下:
(a)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも91パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;ならびに
(c)配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなる群より選択され、ここで、配列番号6もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列、または、それに対して少なくとも91パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、免疫原性を有し、かつ、ワクチンとしてボレリアガリニに対して防御し得る、ポリペプチド;
(4)アジュバント;ならびに、
(5)薬学的に許容される担体
を含み、ここで該ポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する、免疫原性組成物。 - 請求項1または2に記載の免疫原性組成物であって、該組成物は、
(a)細胞表層タンパク質(Osp)Aタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を誘導する特性を有する、組成物;
(b)ボレリアに特異的に結合する抗体の産生を誘導する特性を有する、組成物;および
(c)ボレリアを中和する抗体の産生を誘導する特性を有する、組成物
からなる群より選択される、免疫原性組成物。 - 請求項3に記載の免疫原性組成物であって、
(a)ボレリアは、ボレリアブルグドルフェリセンスラトである;
(b)ボレリアは、ボレリアアフゼリ、ボレリアガリニまたはボレリアブルグドルフェリセンスストリクトである;あるいは
(c)ボレリアは、ボレリアジャポニカ、ボレリアアンダーソニ、ボレリアビセッティ、ボレリアシニカ、ボレリアツルジ、ボレリアタヌキイ、ボレリアバライシアナ、ボレリアルジタニエ、ボレリアスピエルマニ、ボレリアミヤモトイまたはボレリアロネスタルである、
免疫原性組成物。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む、ワクチン組成物。
- 請求項5に記載のワクチン組成物を少なくとも第2のワクチン組成物と共に含む、混合ワクチン。
- 前記第2のワクチン組成物は、マダニ媒介疾患に対して防御する、請求項6に記載の混合ワクチン。
- 前記マダニ媒介疾患は、ロッキー山紅斑熱、バベシア症、回帰熱、コロラドダニ熱、ヒト単球エーリキア症(HME)、ヒト顆粒球エーリキア症(HGE)、南部ダニ関連発疹病(STARI)、野兎病、ダニ麻痺、ポワッサン脳炎、Q熱、クリミアコンゴ出血熱、キタウクゾーン病、ボタン熱、またはダニ媒介脳炎である、請求項7に記載の混合ワクチン。
- 前記第2のワクチン組成物は下記からなる群より選択されるワクチンである、請求項7に記載の混合ワクチン:ダニ媒介脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、およびロッキー山紅斑熱ワクチン。
- 前記第2のワクチン組成物は、ボレリア感染またはライム病に対する免疫化に適合する季節的免疫化スケジュールを有する、請求項6に記載の混合ワクチン。
- 免疫学的応答を誘導するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 前記免疫学的応答は、抗OspA抗体の産生を含む、請求項11に記載の組成物。
- ボレリア感染またはライム病を防止または治療するための、請求項5に記載のワクチン組成物または請求項6〜10のいずれか一項に記載の混合ワクチン。
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