CZ462199A3 - Povrchové antigeny a proteiny použitelné v prostředcích pro diagnostiku a prevenci Lymské boreliosy - Google Patents

Abstract

Nový izolovaný antigen Boirela burgdorferi sensu strictoje charakterizován relativní molekulovou hmotností 39,5 kDa. Tento antigenje exprimován in vitro spirochetami kmene B. burgdorferi sensu stricto. tento antigen indukuje tvorbu protilátek, které zabíjejí spirochety kmene B. burgdorferi sensu stricto in vitro prostřednictvím ADCK. Nové proteiny kazetového řetězce Borrelia nebo jejich fragmentyjsou také užitečné, stejnějako P39.5 protein, v diagnostice Lymské nemoci a v prostředcích pro léčbu a profylaxi Lymské nemoci.

Description

Povrchové antigeny a proteiny použitelné v prostředcích pro diagnostiku a prevenci Lymské boreliosy

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oblasti farmaceutických a diagnostických prostředků použitelných v diagnostice, léčbě a profylaxi Lymské boreliosy. Přesněji vynález obsahuje izolovaný přirozený povrchový antigen Borrelia a protilátky k tomuto antigenu pro použití v diagnostice, léčbě a profylaxi Lymské boreliosy.

Dosavadní stav techniky

Borrelia burgdorferi (sensu lato) je generický název, který zahrnuje několik druhů Borrelia spojených s - a pravděpodobně způsobujících - Lymskou boreliosu (Lymskou nemoc): B. burgdorferi (sensu stricto), B. garinii a B. afzelii. Toto onemocnění se přenáší kousnutím klíštěte různých druhů Ixodes přenášejících spirochetu. Hlavním reservoárem infekce ve Spojených Státech Amerických je white footed myš, Peromyscus leucopus, a infekce může být přenesena na mnoho savců včetně psů, koček a lidí (J.D. Donahue et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 36: 92-96 (1987); R.T. Green et al., J. Clin. Micro. 26: 648-653 (1988)). I přes přítomnost aktivní imunitní odpovědi persistuje onemocnění u pacientů po dobu mnoha let. Soudí se, že taková persistence je - alespoň částečně - důsledkem antigenní variace bakteriálních proteinů (J.R. Zhangf et al., Cell, 89: 275-285, (1997)).

Diagnostika Lymské nemoci u člověka a zvířat byla obtížná vzhledem k chybění definitivní sérologie vedoucí k rychlému a přesnému testování. Současné diagnostické testy mají nízkou

• · • · · · sensitivitu a specificitu, jak je ilustrováno nedávným výzkumem výkonosti laboratorní diagnostiky, který byl proveden Wisconsin State Laboratory of Hygiene (L. Bakken et al., J. Clin.

Microbiol 35: 537 (1997)). V oboru je potřeba jednoduchý, sensitivní a specifický diagnostický prostředek a způsob pro časnou detekci Lymské nemoci.

Publikace týkající se proteinů a polypeptidů Borrelia burgdorferi naznačily jejich použití jako diagnostických nebo farmaceutických činidel. Mezi takové proteiny a polypeptidy patří proteiny A a B zevního povrchu (OspA a OspB), flagellin, a další proteiny označené P21, P39, P66 a P83, podle jejich molekulové hmotnosti (A.G. Barbour et al., Infect. Immun. 45: 94-100 (1984); W.J. SImpson et al., J. Clin. Microbiol., 28: 1329-1337 (1990); K. Hansen et al., Infect. Immun. 56:

2047-2053 (1988); K. Hansen et al., Infect. J. Clin. Microbiol., 26: 338-346 (1988); B. Wilske et al., Zentral, Bakteriol. Parasitenkd. Infektionshkr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A., 263: 92-102 (1986); D.W. Dorward et al., J. Clin. Microbiol., 29: 1162-1170 (1991); publikovaná NTIS US patentová přihláška č. 485551; Evropská patentová přihláška č. 465204, publikovaná 8.1.1992; Mezinárodní patentová přihláška č. PCT/US91/01500, publikovaná 19.10.1991; Mezinárodní patentová přihláška č. PCT/EP90/02282, publikovaná 11.7.1991; Mezinárodní patentová přihláška č. PCT/DK89/00248, publikovaná 3.5.1990; Mezinárodní patentová přihláška č. W092/00055, publikovaná 9.1.1992).

Výhodným proteinem, který je kandidátem pro výrobu vakciny, je OspA (M. Phillip et al., J. Spirochetal and Thick-borne Diseases 3: 67-79 (1996)). Exprese OspA je nepřítomná nebo utlumená při přenosu spirochet ze střeva klíštěte do slinných žláz, jak je tomu při sání krve (A. DeSilva et al., J. Exp. Med. 183: 271-275 (1996)). Tento fenomen vytváří potenciální • · · · problémy, které mohou snižovat účinnost OspA vakciny.

Likvidace spirochet může probíhat pouze ve střevu klíštěte (A. DeSilva et al., výše) a ne při infekci obratlovce. Protože sliny Ixodes scapularis obsahují dekomplementační faktor (T. Mather et al., Ixodes saliva: vector competence for Borrelia burgdorferi and potential vaccine strategies, v VII International Congress on Lyme Borreliosis, San Francisco, CA (1996)), může likvidace spirochet ve střevě klíštěte probíhat mechanismem obsahujícím pouze protilátku a nikoliv komplement.

Ačkoliv mechanismus účinku protilátkami mediovaného usmrcení není zcela jasný, zdá se, že se jedná o mechanismus méně účinný, než je mechanismus zprostředkovaný protilátkou a komplementem dohromady (M. Sole et al., Infect. Immunol. 66: 2540-2546 (1998)). Tak je umožněn únik ze střeva těm spirochetám, které mají nízkou hustotu OspA na svém povrchu. Kromě toho, ačkoliv je pOspA protein přítomen u B. burgdorferi ve značném množství, pouze malá frakce OspA molekul je na zevním povrchu spirochety (D. Cox et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 7973-7978 (1996)) . Tak mohou malé změny v absolutním počtu povrchových molekul OspA způsobit významné odlišnosti ve stupni likvidace a mohou umožnit části spirochet přesun do slinných žláz .

OspA escape mutanty se snadno vyhnou usmrcení a pokud budou infekční pro obratlovce, způsobí ještě, další snížení účinnosti OspA vakciny. V klonálních populacích B. burgdorferi, které jsou kultivovány in vitro, je prevalence mutantů resistentních na usmrcení anti-OspA protilátkou v rozmezí 10a 10“² (A. Sadziene et al., J. Exp. Med. 176: 799-809 (1992)). Pokud jsou takové frekvence reprodukovány v sající larvě, ve které může počet spirochet dosáhnout průměrně 7848 během 15 hodin po zakousnutí (A. DeSilva et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 53: 397-404 (1995)), tak může být v jednom klíštěti přítomno několik mutantů. Mezi typické mutantní fenotypy patří fenotypy neexprimující ani OspA, ani OspB a často exprimující chimérickou molekulu složenou z N-terminálního fragmentu OspA fúzovaného na C-terminální fragment OspB. Tyto deleční mutanty byly nalezeny v mnoha kmenech B. burgdorferi (P. Rosa et al., Mol. Microbiol. 6: 3031-3040 (1992)) a v několika izolátech z klíšťat z Kalifornie (T. Schwan et al., J. Clin. Microbiol., 31: 3096-3108 (1993)). Chimérické (deleční) mutanty, které jsou schopné odolávat usmrcování anti-OspA protilátkou samotnou, jsou usmrcovány kombinací účinku protilátky a komplementu. Protože se zdá, že komplement je nefunkční v klíšťatech (T. Mather et al., výše) a OspA a také pravděpodobně jeho chimérická forma nejsou exprimovány v obratlovcích krátce po infekci, mohou OspA escape mutanty infikovat obratlovce. Dále, předpokládá se, že až 2% Ixodes klíšťat se pouze částečně nasaje a proto pokračují v hledání potravy (Y. Lobet, osobní sdělení). Pokud se taková klíšťata neúplně nasají na hostiteli infikovaném B. burgdorferi, tak budou mít spirochety ve slinných žlázách, které nebudou exprimovat OspA a proto budou snadno infikovat hostitele vakcinovaného OspA.

Nebyl pozorován žádný dosycovací efekt (M. Philipp et al., výše), ani se nepředpokládá při infekci OspA vakcinovaného hostitele spirochetou. Proto vyžaduje OspA vakcina opakované podání pro udržení účinného titru protilátek.

Proto existuje v oboru potřeba dalších a zlepšených metod a prostředků pro prevenci Lymské nemoci u lidí a zvířat, a pro léčbu Lymské nemoci.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obsahuje způsoby a prostředky pro

prevenci Lymské nemoci založené na spirochetálních antigenech, které jsou exprimovány na spirochetě během její přítomnosti v obratlovci. Takové způsoby a prostředky mohou být také použity pro léčbu Lymské nemoci.

V jednom aspektu předkládaný vynález obsahuje izolovaný povrchový antigen Borrelia burgdorferi sensu lato, který je exprimován spirochetou in vivo v obratlovci. Antigen, označený P39.5, je dále charakterizován relativní molekulovou hmotností 39,5 kDa. Fragmenty tohoto antigenu jsou také použitelné v prostředcích a způsobech podle předkládaného vynálezu.

V jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje nové polypeptidové/proteinové řetězce Borrelia kazety.

V ještě jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje sekvence nukleové kyseliny kódující P39.5 nebo jeho fragment, jako je P7-1, stejně jako sekvence nukleové kyseliny kódující jiné proteiny Borrelia kazety nebo jejich fragmenty. Tyto sekvence nukleové kyseliny zahrnují sekvence, které hybridizují na výše uvedené sekvence za přísných podmínek, alelické variace takových sekvencí a jejich deleční mutanty.

V ještě jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje nové proteiny obsahující fragmenty sekvence P39.5 proteinu nebo sekvence proteinové kazety popsané výše, volitelně fúsované na nebo smísené s druhým vybraným polypeptidem nebo proteinem, kterým může být protein mající až přibližně 90% identitu aminokyselinové sekvence s P39.5 nebo jinými Borrelia antigeny, jako je OspA, a proteiny nebo polypeptidy získanými z jiných mikroorganismů.

V ještě jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje nové proteinové prostředky obsahující proteinové sekvence antigenů popsaných výše nebo jejich fragmentů, volitelně smíseně s druhým vybraným polypeptidem nebo proteinem, kterým může být protein mající až přibližně 90% identitu aminokyselinové sekvence s P39.5 nebo jinými Borrelia antigeny, jako je OspA, a proteiny nebo polypeptidy získanými z jiných mikroorganismů.

V ještě jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje způsob pro rekombinantní výrobu výše uvedeného P39.5 proteinu, jeho fragmentů nebo fúsních proteinů obsahujících takové fragmenty, pomocí exprese DNA sekvence kódující protein, fragmen nebo fúsní protein ve vybrané hostitelské buňce, a potom pomocí izolace proteinu z této buňky. Hostitelské buňky transformované takovými DNA sekvencemi jsou také obsaženy v předkládaném vynálezu.

V ještě jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje izolovanou protilátku proti výše popsanému P39.5 antigenů, jeho fragmentům, proteinům nebo fragmentům kazetového řetězce nebo fúsním proteinům obsahujícím takové fragmenty. Tyto protilátky mohou být polyklonální. Předkládaný vynález také obsahuje způsob pro výrobu takových protilátek, který obsahuje imunizaci člověka nebo jiného zvířete izolovaným antigenem popsaným výše, nebo jedním jeho fragmentem nebo směsí jeho fragmentů nebo fúsním proteinem obsahujícím jeden nebo více fragmentů podle předkládaného vynálezu. Z takových imunizovaných zvířat mohou být připraveny jiné typy protilátek, například rekombinantní, monoklonálni, chimérické, humanizované atd.

V jiném aspektu vynález obsahuje terapeutický prostředek a způsoby pro léčbu lidí a/nebo zvířat postižených Lymskou nemocí. Terapeutický prostředek obsahuje protilátku nebo protein nebo fragment, jak byly popsány výše, a farmaceuticky přijatelný nosič.

• ·

V ještě jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje vakcinační prostředky a způsoby vakcinace lidí nebo zvířat proti Lymské nemoci za použití výše uvedených prostředků. Prostředky obsahují účinné množství alespoň jednoho antigenu Borrelia podle předkládaného vynálezu, například antigenu, který je exprimován in vitro spirochetami Borrelia, kde uvedený antigen má relaitvní molekulovou hmotnost 39500 Da, nebo jeho antigenního fragmentu, nebo fúsního proteinu obsahujícího takový fragment, nebo proteinu kazetového řetězce, a farmaceuticky přijatelný nosič. Vakcinační prostředek může obsahovat P39.5 protein, jeho fragmenty, fúsní proteiny nebo směsi proteinů, jak jsou popsány výše.

V ještě jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje vakcinační prostředky a způsoby vakcinace lidí nebo zvířat proti Lymské nemoci za použití prostředků obsahujících nukleové kyseliny, například DNA vakcin. Prostředky obsahují účinné množství DNA sekvence kódující alespoň jeden antigen Borrelia podle předkládaného vynálezu nebo jeho antigenní fragment, nebo fúsní protein obsahujícího takový fragment a farmaceuticky přijatelný nosič.

V ještě jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje způsob pro diagnostiku Lymské nemoci u lidí a zvířat. Tento způsob obsahuje krok inkubace antigenu nebo protilátky podle předkládaného vynálezu, který je výhodně běžným způsobem značen pro detekci, s vzorkem biologické kapaliny od člověka nebo zvířete, u které je prováděna diagnostika. V přítomnosti infekce B. burgdorferi se tvoří komplex antigen-protilátka. Potom se reakční směs analyzuje na přítomnost nebo na absenci těchto komplexů antigen-protilátka. V dalším provedení využívají diagnostické testy DNA sekvence, výhodně protismyslné sekvence, pro antigen nebo jeho fragmenty, a diagnostika je provedena podle

přítomnosti sekvencí v biologické kapalině od pacienta, na kterou tyto sekvence hybridizují. Mohou být použity jiné běžné testovací formáty využívající činidel podle předkládaného vynálezu.

V jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje kit pro detekci infekce B. burgdorferi ve vzorku od člověka nebo zvířete, který obsahuje alespoň jednu protilátku schopnou vazby na alespoň jeden antigen podle předkládaného vynálezu nebo na jeho antigenní fragment, nebo DNA sekvenci kódující jeden nebo více antigenů podle předkládaného vynálezu nebo její protismyslnou sekvenci. Protilátky a sekvence mohou být volitelně značeny pro detekci nebo může být detekční systém obsažen v kitu.

Další aspekty a výhody předkládaného vynálezu jsou popsány dále v podrobném popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je graf protilátkově dependentní, komplementem zprostředkované (ADKC) titrace spirochet kmenů B. burgdorferi JDI (o) , B31 ( ) a B. garinii kmene IP90 ( ) sérem získaným od makaka rhesus inokulovaného klíštětem nesoucím JDI spirochety.

Obr. 2 je schematické znázornění částí DNA sekvence nového P39.5 kódujícího jediného otevřeného čtecího rámce, který kóduje odvozený protein o 37,7 kDa. Tento DNA fragment je označen P7-1. Černě označený region je jedinečný region mezi přibližně párem baží 769 a párem baží 854 SEQ ID NO: 1. Region označený IA se rozkládá od páru baží 1 do páru baží 309 SEQ ID NO: 1, IB se rozkládá od páru baží 855 do páru baží 1189 SEQ ID NO: i.

Regiony ΙΑ a IB mají 70% identitu. Regiony IIA, který se rozkládá od páru baží 310 do páru baží 494 SEQ ID NO: 1 a IIB, který se rozkládá od páru bázi 595 do páru baží 769 SEQ ID NO:

1, mají 91% identitu. Regiony A, který se rozkládá od páru baží 208 do páni baží 309 SEQ ID NO: 1 a B, který se rozkládá od páru baží 495 do páru baží 595 SEQ ID NO: 1, mají 84% identitu. Regiony B a C, které se dohromady rozkládají od páru baží 1090 do páru baží 1189 SEQ ID NO: 1, mají 90% identitu.

Obr. 3 je sloupcový graf ilustrující in vitro usmrcování IP90 spirochet: plasmou opic infikovaných JDI spirochetami a opičím komplementem (sloupec 1); protilátkou ze stejné plasmy, která je afinitně přečištěna na přirozeném P39.5 a opičím komplementem (sloupec 2); stejnou protilátkou popsanou pro sloupec 2 bez komplementu (sloupec 3); komplementem samotným (sloupec 4); a BSK-H mediem samotným (sloupec 5). Chybové sloupce představují standardní odchylku průměru dvou měření.

Obr. 4 je sloupcový graf ilustrující ADCK spirochet kmene IP90 pomocí: plasmy od opic infikovaných B. burgdorferi JDI v ředění 1:10 (sloupce 1,5); séra od myší imunizovaných rekombinantní formou P7-1 (rP7-l) RiBi adjuvans v ředění 1:10 (sloupce 2, 6); a 1:50 (sloupec 3) ; a séra do myší imunizovaných Ribi adjuvans samotným (sloupce 4, 7). Opičí komplement byl použit v ADCK sloupců 1-4 a morčecí komplement v ADCK sloupců 5-7. Chybové sloupce představují standardní odchylku průměru dvou měření.

Obr. 5 je ilustrace řetězce silentních VLS kazet v řetězci DNA délky přibližně 8 kb, převzato z J.R. Zhang et al., Cell,

89: 275-285 (1997).

Obr. 6 je westernový přenos lyzátů spirochet B. burgdorferi • · • · · · • · kmenů JDI a B31 a B. garinii kmene IP90 vyvíjených se sérem opic inkulovaných jehlou (dráha 1) a klíštětem (dráha 2) spirochetami JDI a protilátky z posledního uvedeného séra afinitně zbavené celých živých JDI spirochet (dráha 3).

Označení pro seznam sekvencí

SEQ ID NO: 1 je sekvence nukleové kyseliny klonu 7-1.

SEQ ID NO: 2 je odvozená proteinová sekvence klonu 7-1.

SEQ ID NO: 3 je 5' konec sekvence nukleové kyseliny klonu 1-1.

SEQ ID NO: 4 je částečná sekvence nukleové kyseliny klonu 1-1, která se nachází ve středu sekvence nukleové kyseliny.

SEQ	ID	NO:	5	je 3 1	konec	sekvence	nukleové	kyseliny	klonu 1-1.
SEQ	ID	NO:	6	je 5'	konec	sekvence	nukleové	kyseliny	klonu 3-1.
SEQ	ID	NO:	7	je 3'	konec	sekvence	nukleové	kyseliny	klonu 3-1.
SEQ	ID	NO:	8	je 5'	konec	sekvence	nukleové	kyseliny	klonu 6-1.
SEQ	ID	NO:	9	je 3'	konec	sekvence	nukleové	kyseliny	klonu 6-1.
SEQ	ID	NO:	10	je 5	' konec	sekvence	nukleové	kyseliny	klonu 9-1.
SEQ	ID	NO:	11	je 5	1 konec	sekvence	: nukleové	kyseliny	klonu 12-1.
SEQ	ID	NO:	12	je 3	' konec	sekvence	nukleové	: kyseliny	klonu 12-1.
SEQ	ID	NO:	13	je částečná	sekvence	nukleové	kyseliny	získaná z

klonu 14, která po přidání na 5' konec klonu 7-1 (SEQ ID NO: l) tvoří větší fragment P39.5, t.j. P7-1. Prvních 6 5'-koncových baží je z plasmidového vektoru.

SEQ ID NO: 14 je odvozená proteinová sekvence SEQ ID NO: 13.

Předkládaný vynález obsahuje nový povrchový antigen Borrelia, P39.5, který je exprimován spirochetou během její přítomnosti v obratlovci (in vivo). Tento antigen je cílem pro komplementem zprostředkované zabíjení závislé na protilátkách (ADCK) in vitro. Tento nový antigen, jeho fragmenty, protilátky proti • ·

• · tomuto antigenu, sekvence nukleových kyselin kódující antigen a použití takových antigenů, protilátek a sekvencí nukleových kyselin v diagnostice, terapeutických a profylaktických prostředcích a způsobech pro léčbu nebo prevenci Lymské nemoci jsou výhodnější než použití jiných proteinů Borrelia a protilátek ve známých prostředcích a způsobech pro léčbu nebo prevenci Lymské nemoci.

I. P39.5 antigen podle předkládaného vynálezu

V jednom provedení obsahuje předkládaný vynález izolovaný Borrelia antigen, označený jako P39.5. Tento antigen je exprimován in vivo i in vitro spirochetami Borrelia, například spirochetami B. garinii kmene IP90. Tento antigen, nebo jeho homolog, je také exprimován in vivo spirochetami B. burgdorferi sensu stricto kmenů JDI, B31 a NT1. Tento antigen má molekulovou hmotnost 39,5 kDa u spirochet ID90 a je funkčně charakterizován schopností vyvolat tvorbu protilátek u zvířat během přirozené infekce spirochetami Borrelia. Tyto indukované protilátky zabíjejí IP90 spirochety ADCK in vitro. Indukovaná protilátka také zabíjí spirochety kmene NT B. burgdorferi sensu lato, což je kmen izolovaný z mozkomíšního moku pacientů ve Spojených Státech Amerických, ale který není dále charakterizovaný v širším komplexu druhů. Tento kmen byl získán od Dr. Patricia Coyle, State University of New York at Stony. Brook, New York.

Genový fragment označený 7-1 z B. burgdorferi sensu lato kmene (B. garinii kmene IP90) insertovaný do plasmidu pBluescript II byl transformován v E. coli a byl uložen v American Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland (ATCC) 27.6.1997 pod přírůstkovým číslem 98478. Při expresi tohoto genového fragmentu v E. coli, izolaci čistého proteinu a jeho použití jako imunogenu u myší je • · · · produkována protilátka, která reaguje s P39.5 IP90. Jiné genové fragmenty, označené 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 a 12-1, z Borrelia garinii kmene IP90 byly podobným způsobem insertovány v pBluescript II plasmidech, byly transformovány do E. coli a byly uloženy. Toto uložení bylo provedeno v ATCC 25.6.1998 nebo před tímto datem pod přírůstkovými č. pro 1-1, pro 3-1 pro 6-1, pro 9-1 a pro 12-1. Všechna uložení byla provedena podle požadavků Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Proceduře a plně splňují požadavky United States Patent and Trademark Office pro uložení pro patentové účely. Sekvence použitelné v předkládaném vynálezu mohou být získány z těchto depozit.

A. Sekvence nukleové kyseliny

Předkládaný vynález obsahuje savčí sekvence nukleové kyseliny kódující fragmenty P39.5. Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou izolovány z buněčných materiálů, se kterými jsou v přirozeném stavu spojeny. Jak je popsáno v příkladech provedení vynálezu, byl klonován a sekvenován segment o 1190 bp, který kóduje část kódujícího regionu genu pro P39.5 Borrelia. Obsahuje jeden otevřený čtecí rámec, který kóduje předpokládaný 37,7 kDa protein. Tato částečná DNA sekvence je popsána v SEQ ID NO: 13 a 1. SEQ ID NO: 13 je sekvence bezprostředně navazující na ve směru 5' na 1 bázi SEQ ID NO: 1. Tyto sekvence dohromady tvoří částečný protein kódovaný 1189 bp a tvořený přibližně 396 aminokyselinami. Sekvenovaný fragment je složen hlavně z hydrofilních domén, které obsahují vnitřních repetitivních regionů a jedinečný region mezi párem baží 627 a párem baží 712 SEQ ID NO: 1. Viz obr. 2, který ukazuje repetitivní sekvence a identifikuje homologie a procento identity takových sekvencí.

Když je v tomto textu protein a/nebo sekvence DNA definována procentem homologie nebo identity s identifikovanými sekvencemi, tak je pro výpočet procenta identitity nebo procenta podobnosti použit následující algoritmus: Smith-Watermanův algoritmus (J.F. Collins et al., 1988, Comput. Appl. Biosci. 4: 67-72; J.F. Collins et al., Molecular Sequence Comparison and Alignment (M.J, Bishop et al., vyd.), v Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK (1987), str. 417), a BLAST a FASTA programy (E.G.Shpaer et al., 1996. Genomics, 38: 179-191). Tyto práce jsou zde uvedeny jako odkaz.

Předkládaný vynález také obsahuje jiné fragmenty Borrelia nukleové kyseliny, například fragmenty kazetového řetězce, stejně jako fragmenty P39.5. Takové fragmenty jsou označeny jako 1-1 (který kóduje protein/peptid Pl-1), 3-1 (který kóduje protein/peptid P3-1), 6-1 (který kóduje protein/peptid P6-1) ,

9-1 (který kóduje protein/peptid P9-1) a 12-1 (který kóduje protein/peptid P12-1). Výhodně jsou takové fragmenty charakterizovány tím, že kódují biologicky aktivní část P39.5, například epitop. Obyčejně mají tyto oligonukleotidové fragmenty délku nejméně 15 nukleotidů. Nicméně mohou být v případě potřeby vybrány oligonukleotidové fragmenty různých délek. Takové fragmenty mohou být použity pro polymerasové řetězové reakce (PCR), například na bioptických vzorcích tkáně. Například, použitelné fragmenty DNA pro P39.5 a odpovídající sekvence jsou sekvence mezi bp 793-816 SEQ ID NO: 1 a bp 59-85 SEQ ID NO: 13. Jiné užitečné fragmenty jsou uvedeny na obr. 2. Fragmenty 1-1 zahrnují sekvence SEQ ID NO: 3, 4 a 5. Fragmenty 3-1 zahrnují sekvence SEQ ID NO: 6 a 7; fragmenty 6-1 zahrnují sekvence SEQ ID NO: 8 a 9. Fragment 9-1 zahrnuje sekvenci SEQ ID NO: 10. Fragmenty 12-1 zahrnují sekvence SEQ ID NO: 11 a 12. Kompletní sekvence 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 a 12-1 a jiné užitečné fragmenty mohou být snadno získány odborníky v oboru pomocí běžných technik sekvenování DNA aplikovaných na DNA uskladněnou v ATCC, jak je uvedeno výše.

DNA sekvence SEQ ID NO: 1 a 3-12, stejně jako uložený materiál identifikovaný výše, umožňuje odborníkům v oboru získání odpovídajících protismyslných řetězců těchto DNA sekvencí. Dále, pomocí známých technik je možno získat další genomové a cDNA sekvence, které sousedí s uvedenými DNA sekvencemi nebo příslušné RNA sekvence, jak je žádoucí. Podobně, dostupnoost SEQ ID NO: 1 a 3-12 a uloženého materiálu podle předkládaného vynálezu umožňuje získání jiných analogů P39.5, peptidů B. garinii a jejich fragmentů, pomocí sekvencí nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu jako sond v běžných technikách, například v polymerasové řetězové reakci. Alelické variace těchto sekvencí v druhu (t.j. sekvence obsahující některé odlišné nukleotidy v porovnání s nej častěji se vyskytující sekvencí v druhu, ale kódující stejný protein nebo protein se stejnou funkcí), jako jsou varianty P39.5 SEQ ID NO: 2, mohou být také snadno získány na základě znalosti sekvence podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález dále obsahuje sekvence nukleové kyseliny, které jsou schopné hybridizace za přísných podmínek (viz J.Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labor.atory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) na sekvence SEQ ID NO: 1, jejich protismyslné řetězce nebo jejich biologicky aktivní fragmenty. Příkladem vysoce přísných podmínek hybridizace je hybridizace při 2X SSC při 65 °C, po které následuje promytí v O,1X SSC při 65 °C po dobu 1 hodiny. Alternativním příkladem hybridizace za přísných podmínek jé 50% formamid, 4XSSC při 42 °C. Mohou být použity také středně přísné podmínky hybridizace, například hybridizace v 4XSSC při 55 °C,

9 • 9 99 9» ··

9 9 · 9 9 9 · * • 9 9 9 9···

99« 9 · 9999 9 · 99 po které následuje promytí v O,1XSSC při 37 °C po dobu 1 hodiny. Alternativním příkladem hybridizace za středně přísných podmínek je 50% formamid, 4XSSC při 30 °C.

Podle předkládaného vynálezu mohou být sekvence nukleové kyseliny modifikované. Za použití dat SEQ ID NO: 1 a 3-12 je možno za použití v oboru známých technik získat nebo synteticky nebo rekombinantně připravit jiné polynukleotidové sekvence nebo modifikované polynukleotidové sekvence kódující kompletní proteiny nebo jejich použitelné fragmenty podle předkládaného vynálezu. Mezi takové modifikace na úrovni nukleových kyselin patří například modifikace nukleotidové sekvence, které jsou silentní nebo které mění aminokyseliny, například pro zlepšení exprese nebo sekrece. Patří sem také alelické variace způsobené přirozenou degenerací genetického kódu.

Předkládaný vynález také obsahuje mutanty fragmentů P39.5 a sekvencí kazetového řetězce 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 a 12-1. Mezi takové mutanty patří amino-terminální, karboxy-terminální nebo interní delece, které v podstatě zachovávají antigenicitu kompletního P39.5 nebo jiných proteinů nebo fragmentů. Takové zkrácené, nebo deleční, mutanty mohou být exprimovány za účelem ovlivnění aktivity kompletního nebo přirozeného genu nebo genových fragmentů.

Tyto sekvence nukleové kyseliny jsou užitečné pro různé diagnostické, profylaktické a terapeutické účely. Výhodně jsou sekvence nukleové kyseliny pro vývoj diagnostických sond a protismyslných sond pro použití v detekci a diagnostice Lymské nemoci za použití různých známých testů na nukleové kyseliny, jako je například Northern a Southern blot analýza, polymerasová řetězová reakce (PCR) a jiné tes_zty známé v oboru. Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou také • · •· 9*9 9 užitečné v produkci P39.5 proteinů a homologů, stejně jako v produkci jiných proteinů B. garinii.

Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány běžným způsobem využívajícím polymerasové řetězové reakce nebo klonovacích technik, jako jsou techniky popsané v běžných učebnicích, například v Sambrook et al., výše.

Například, sekvence nukleové kyseliny pro antigen podle předkládaného vynálezu může být připravena nebo izolována z DNA B. garinii za použití DNA primerů a sond a PCR technik. Alternativně může být antigen získán z genové banky odvozené od celé genomové DNA B. garinii. Tyto sekvence, jejich fragmenty, jejich modifikace a kompletní sekvence mohou být připraveny rekombinantně za použití běžných technik genetického inženýrství nebo za použití technik chemické syntézy nebo PCR a za použití informací uvedených v předkládaném vynálezu.

B. Sekvence proteinů

Předkládaný vynález také obsahuje B. burgdorferi sensu lato proteiny, jako jsou proteiny a peptidy B. garinii, včetně P39.5 polypeptidů nebo proteinů, a peptidů/proteinů podle předkládaného vynálezu označených Pl-1, P3-1, P6-1, P9-1 a P12-1. Tyto proteiny neobsahují kontaminující proteiny nebo materiály, se kterými se vyskytují v přirozeném stavu. Protože byl přirozený P39.5 plně extrahován do detergentové fáze při Triton-X114 extrakci, jedná se pravděpodobně o lipoprotein.

P39.5 antigen má relativní molekulovou hmotnost 39500 daltonů, jak je měřeno westernovým přenosem (viz příklad 2 a obr. 6). V jednom provedení vynález obsahuje částečný P39.5 (SEQ ID NO: 2) polypeptid délky přibližně 354 aminokyselin, pravděpodobně lipoprotein, mající předpokládanou molekulovou hmotnost 37,7 kDa (t.j. fragment P7-1). Tato odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 2) má až 22% identitu se členy rodiny variabilního hlavního proteinu (Vmp) lipoproteinů zevního povrchu Borrelia hermsii (viz příklad 6). Má přibližně 50% identitu s

Vmp-podobnou sekvencí (vis) VlsE B. burgdorferi kmene B31 (J.-R. Zhang et al., výše) a s jinými vis sekvencemi B. burgdorferi (t.j. Vls-6 Genbank č. U76406 (53% identita v 190 aminokysleinách); VlsE Genbank č. U84553 (57% v 210 aminokyselinách); a U84566 (58% v 209 aminokyselinách); a U84555 (58% v 210 aminokyselinách)).

VlsE je část antigenu B. burgdorferi, která podléhá antigenní variaci mechanismem rekombinace, ve kterém je centrální fragment exprimované kopie (VlsE) rekombinován s fragmenty z řetězce 15 kazet umístěných proti směru kódujícího řetězce od exprimované kopie (J. Zhang, výše). Každá kazeta má délku přibližně 500 bp a celý řetězec zaujímá DNA o délce přibližně 8 kb. Jedním význačným rysem tohoto řetězce kazet je to, že v B. burgdorferi B31 jsou kazety uspořádány v téměř kontinuálním otevřeném čtecím rámci přerušeným pouze stop kodonem v kazetě vlsll a dvěma posuny rámce v kazetách vlsl4 a vlsl6. Viz například obr. 6, který je kopií podobného obrázku uvedeného v Zhang et al., výše.

Delší částečná proteinová sekvence P39.5 je připravena přímou fúsí částečné sekvence z klonu 14 (SEQ ID NO: 14) na 5’ konec sekvence SEQ ID NO: 2. Identifikace sekvence z klonu 14 jako sekvence 5' k sekvenci P7-1 vede k přesahu sekvencí mezi dvěma klony, ze kterých jsou tyto sekvence získány, kde tento přesah sekvencí ukazuje, že jsou součástí stejného otevřeného čtecího rámce. Proto po Leu (aminokyselina 47 SEQ ID NO: 14) bezprostředně následuje Lys (aminokyselina 1 SEQ ID NO: 2) v odvozené aminokyselinové sekvenci P39.5.

Předkládaný vynález obsahuje částečnou DNA a odvozené aminokyselinové sekvence několika fragmentů, které se zdají být částí kazetového řetězce B. garinii IP90. Tyto fragmenty, které mohou obsahovat 7-1, jsou pojmenovány 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 a 12-1, a mají délku mezi 1 a 2 kb. Každá z nich exprimuje peptid (z lacZ promotoru pBluescript), který odpovídá velikosti insertu a který reaguje s protilátkou z infikovaných opic. Žádný z 5'-konců těchto fragmentů (SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 10 a 11) neobsahuje hydrofobní vedoucí sekvenci nebo konsensuální sekvenci pro signální peptidasu II takového typu, který je charakteristický pro bakteriální lipoproteiny. Tyto fragmenty musí být proto částí kazetového řetězce IP90 a pravděpodobně kazetového řetězce B31 a jsou v čtecím rámci. Tyto vls-podobné proteiny jsou identifikovány částečnými 5’ a 3' sekvencemi (viz například SEQ ID NO: l, 3, 5 až 12). Odborník v ooboru může, za použití běžných technik, jako je PCR, snadno použít částečné 5' a 3' sekvence a DNA sekvence, které jsou zde uvedeny (nebo DNA knihovnu) B. garinii nebo materiály uložené v ATCC pro každý protein kazetového řetězce uvedený výše, pro identifikaci jejich kompletních sekvencí. Takové techniky jsou za použití zde uvedené informace snadné a nevyžadují zbytečné experimentování.

Antigeny podle předkládaného vynálezu mohou být charakterizovány imunologickými testy, včetně například westernovým přenosem, stanovením molekulové hmotnosti pomocí biofyzíkálních měření, jako je SDS-PAGE/barvení, HPLC a podobně, testů využívajících protilátek, testů využívajících rozpoznávání T-buňkami, MHC vazebných testů, a testů využívajících přenosu imunitní ochrany nebo imunitní patologie přenosem buněk, proteinů nebo protilátek.

Proteinový P39.5 povrchový antigen podle předkládaného vynálezu (stejně jako jeho přirozené varianty nebo analogy v jiných druzích Borrelia nebo jiných Vls-podobných proteinů identifikovaných v předkládaném vynálezu) může být izolován ve formě kompletního intaktního proteinu nebo polypeptidu nebo jeho fragmentu. V jednom provedení je P39.5 izolován imunoblotovým postupem podle jeho molekulové hmotnosti, jak je popsáno dále v příkladu 5. Takovou izolací se získá antigen ve formě v podstatě prosté jiného proteinového nebo neproteinového materiálu, pocházejícího z mikroorganismu nebo klíšťového vektoru.

Molekuly obsahující polypeptidy a antigeny Borrelia podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány ze spirochet a mohou být dále přečištěny za použití různých běžných technik, včetně: kapalinové chromatografie na normální nebo na reversní fázi, za použití HPLC, FPLC a podobně; afinitní chromatografie (za použití anorganických ligandů nebo monoklonálních protilátek); vylučovací chromatografie; chromatografie s imobilizovanýmí chelaty kovů,· gelové elektroforesy a podobně. Odborník v oboru může vybrat nejvýhodnější techniky pro izolaci a přečištění, bez toho, že by se odchýlil od rozsahu předkládaného vynálezu.

Alternativně mohou být aminokyselinové sekvence P39.5 nebo jiných proteinů Borrelia podle předkládaného vynálezu připraveny rekombinantně pomocí běžných technik genového inženýrství (viz například Sambrook et al., výše, a podrobný popis přípravy proteinů uvedený dále).

i. Analogy/modifikované antigeny

Předkládaný vynález také obsahuje analogy nebo modifikované verze P39.5 proteinu nebo vls-podobných proteinů Pl-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 a P12-1. Obvykle se takové analogy odlišují od přesně identifikovaných proteinů pouze jednou až čtyřmi změnami kodonu. Příklady zahrnují polypeptidy s malými aminokyselinovými variacemi od ilustrovaných aminokyselinových sekvencí například P7-1 (SEQ ID NO: 2) , konkrétně konzervativními substitucemi aminokyselin. Konzervativní substituce aminokyselin jsou ty

substituce, které proběhnou ve skupině aminokyselin, které mají podobné vedlejší řetězce a chemické vlastnosti. Vynález také obsahuje homology proteinů podle předkládaného vynálezu, které jsou charakterizovány tím, že mají alespoň 85% identitu se SEQ ID NO: 2 nebo se sekvencemi vis-podobných proteinů. Za použití sekvencí podle předkládaného vynálezu může odborník v oboru snadno získat kompletní P7-1 nebo P7-1 homology a analogy, stejně jako kompletní vis-podobné 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 a 12-1 proteinové homology a analogy z jiných bakteriálních druhů.

Antigen podle předkládaného vynálezu může být také modifikován tak, aby byla zvýšena jeho imunogenicita. Antigen může být například navázán na chemickou sloučeninu nebo imunogenní nosiče, s podmínkou, že tyto sloučeniny neinterferuji s požadovanou biologickou aktivitou antigenu nebo nosiče. Pro přehled některých obecných úvah týkajících se takových vazeb viz Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, vyd. E. Harlow and D. Lané (1988). Použitelné imunogenní nosiče jsou v oboru známé a patří mezi ně například přílipkový hemokyanin (KLH); hovězí sérový albumin (BSA); ovalbumin; PPD (přečištěný proteinový derivát tuberkulinu); červené krvinky; tetanický toxoid; cholerový toxoid; agarosové korálky; aktivované uhlí; nebo bentonit. Použitelné chemické sloučeniny pro vazbu jsou například dinitrofenolové skupiny nebo kyselina arsonilová.

Antigen může být také modifikován jinými technikami, jako je například denaturace teplem a/nebo SDS.

ii. Fragmenty/deleční mutanty

Předkládaný vynález dále obsahuje další fragmenty P39.5 polypeptidu, P7-1 peptidu nebo jiných vis-podobných proteinů.

• ·

Takové fragmenty jsou charakterizovány tím, že mají biologickou aktivitu podobnou biologické aktivitě kompletního proteinu, včetně například schopnosti indukovat tvorbu protilátek proti kauzálnímu agens Lymské nemoci. Tyto fragmenty mohou být připraveny nebo získány v jakékoliv délce, včetně tak malé délky, jako je 5-8 aminokyselin. Takové fragmenty mohou představovat epitop nebo protein.

Vnitřní repetitivní sekvence P39.5 (viz obr. 2) naznačují, že tento protein, podobně jako OspA, může podléhat homologní rekombinaci v Borreliích, která může vést ke vzniku mutantů exprimujících zkrácené, částečně deletované verse genu. Proto může být P7-1 protein (SEQ ID NO: 2) podle předkládaného vynálezu modifikován tak, že jsou připraveny deleční mutanty, například pomocí zkrácení na amino- nebo karboxylovém konci, nebo eliminací jedné nebo více aminokyselin. Deleční mutanty P7-1 připravené homologní rekombinaci jeho repetitivních sekvencí (obr. 2) jsou také obsahem předkládaného vynálezu, stejně jako DNA sekvence kódující tyto mutanty. U některých delečních mutantů jsou deletovány části P39.5 kódujícího regionu, popsaného výše, například regiony IIA, IIB a B.

Deleční mutanty P39.5 antigenů, které jsou, podobně jako P39.5 a nikoliv jako OspA, exprimovány in vivo, jsou pravděpodobně usmrceny po infikování obratlovce. Většina OspA delečních mutantů unikne usmrcení anti-OspA protilátkou za nepřítomnosti komplementu, ale jsou usmrceny společným působením protilátky a komplementu. Protoře anti-OspA protilátka zabíjí spirochety ve střevu klíštěte (kde je OspA exprimován, ale kde není pravděpodobně komplement aktivní), mohou OspA deleční mutanty uniknout anti-OspA protilátce vyvolané OspA vakcinou. Naopak, protože je P39.5 exprimován in vivo, kde je přítomen komplement i anti-P39.5 protilátka, nemohou P39.5 deleční • · ·« ···· ·· ·· mutanty uniknout vakcině založené na P39.5.

Další modifikované fragmenty P39.5, Pl-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 a P12-1 mohou být připraveny jakoukoliv běžnou technikou a takto může být zlepšena jejich produkce, může být zlepšena stabilita proteinu nebo jiné jeho charakteristiky, například vazebná aktivita nebo biologická dostupnost, nebo mohou být upraveny jiné charakteristiky proteinu. Další užitečné fragmenty těchto polypeptidů mohou být připraveny odborníky pomocí známých technik, jako je deleční mutagenese a exprese.

iii. Fúsní nebo multimerní proteiny a prostředky

P39.5 protein podle předkládaného vynálezu, nebo jeho fragmenty, stejně jako vls-podobné proteiny kazetového řetězce a jejich fragmenty mohou být také připraveny - za použití běžných technik genového inženýrství - jako části větších a/nebo multimerních proteinů nebo proteinových prostředků. Antigeny podle předkládaného vynálezu mohou být v kombinaci s proteiny zevního povrchu B. burgdorferi, jako je OspA, OspB, OspC, stejně jako s BmpA, B, C, nebo mohou být různé fragmenty zde popsaných antigenů kombinovány mezi sebou. V takových kombinacích může být antigen ve formě fúsního proteinu. Antigen podle předkládaného vynálezu může být volitelně fúsován na vybraný polypeptid nebo protein, například na Borreliové antigeny OspA, OspB, OspC,

BmpA, BmpB, BmpC, jiné Borreliové antigeny a na proteiny nebo polypeptidy získané z jiných mikroorganismů. Například může být antigen nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu fúsován na svém N-konci nebo C-konci na OspA polypeptid, nebo na OspB polypeptid, nebo na OspC polypeptid, nebo na nonOspA non-OspB polypeptid, nebo na jejich kombinace. Mezi OspA a OspB polypeptidy, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, patří polypeptidy známé v oboru (viz například PCT/US91/04056) a jejich varianty. Mezi non-OspA non-OspB polypeptidy, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, patří polypeptidy podle předkládaného vynálezu a polypeptidy známé v oboru, včetně OspC proteinu B. burgdorferi, bičíkového proteinu a jeho fragmentů, jiných proteinů B. burgdorferi a jejich fragmentů a non-B. burgdorferi proteinů a jejich fragmentů.

Ještě jiný fúsní protein podle předkládaného vynálezu je připraven expresí molekuly DNA tvořené DNA sekvencí pro P39.5 nebo jejím fragmentem, která je fúsovaná na DNA fragmenty, které jsou homologní (25-95% identita) ss P39.5. Jedním příkladem takové proteinu je protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, na kterou jsou fúsovány aminokyselinové fragmenty které jsou až z 95% identické s touto sekvencí. Tyto fragmenty mohou být insertovány v jakémkoliv pořadí a mohou obsahovat repetitivní sekvence, jako jsou sekvence uvedené na obr. 2. Tyto dlouhé řetězce DNA, které tvoří jeden otevřený čtecí rámec, mohou být konstruovány z homologu P39.5, včetně P39.5, nebo mohou být získány z přirozených dlouhých otevřených čtecích rámců, jako jsou čtecí rámce jednoho z proteinů vis kazety. Proteiny vis kazety z B. garinii (například proteiny označené Pl-1, P3-1, P6-1, P9-1 a/nebp P12-1) mohou být fúsovány na sebe navzájem a/nebo mohou být insertovány do DNA sekvence P39.5 nebo P7-1, což vede ke vzniku velké DNA molekuly, která exprimuje protein, který může stimulovat protilátky s různou specificitou.

Tyto fúsní proteiny obsahující různé polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou připraveny pro použití ve způsobech a prostředcích podle předkládaného vynálezu. Tyto fúsní proteiny nebo multimerní proteiny mohou být připraveny rekombinantně nebo mohou být syntetizovány chemicky. Mohou také obsahovat polypeptidy podle předkládaného vynálezu fúsované nebo navázané • · · · na jiné než aminokyselinové skupiny, jako jsou lipidy nebo uhlovodany. Dále, antigeny podle předkládaného vynálezu mohou být použity v kombinaci s jinými vakcinačními činidly proti Borreliím, které byly dříve popsány v oboru, stejně jako s jinými druhy vakcinačních činidel odvozenými od jiných virů. Takové proteiny jsou účinné v prevenci, léčbě a diagnostice Lymské nemoci, která je způsobena širokým spektrem izolátů B. burgdorferi.

Proteinový prostředek, který může být výhodnou alternativou k fúsním proteinům popsaným výše, je kokteil (t.j. prostá směs) obsahující různé P39.5 proteiny nebo fragmenty, nebo různé směsi proteinů kazetového řetězce podle předkládaného vynálezu. Takové směsi těchto proteinů nebo jejich antigenních fragmentů budou pravděpodobně užitečné ve vyvolání tvorby protilátek proti B. garinii.

iv. Soli

Antigen podle předkládaného vynálezu může být také použit ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Vhodné kyseliny a zásady, které mohou tvořit soli s polypeptidy podle předkládaného vynálezu, jsou dobře známé v oboru a patří mezi ně organické a anorganické kyseliny a zásady.

II. Způsoby pro přípravu antigenů a sekvencí nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu

A. Exprese in vitro

Pro výrobu rekombinantního P7-1 a/nebo jiných proteinů kazetového řetězce nebo jiných fragmentů P39.5 podle předkládaného vynálezu jsou DNA sekvence podle předkládaného • · vynálezu insertovány do vhodného expresního systému. Výhodně je připravena rekombinantní molekula nebo vektor, ve kterém je polynukleotidová sekvence kódující vybraný protein, například P7-1, operativně navázána na sekvenci kontrolující heterologní expresi, která umožní expresi proteinu. V oboru je známo mnoho typů vhodných expresních vektorů pro expresi proteinů. Takové vektory jsou vybrány z mnoha běžných typů vektorů, včetně hmyzích, například bakulovirových, kvasinkových, mykotických, bakteriálních nebo virových expresních systémů. Jiné vhodné expresní vektory známé v oboru mohou být také použity pro tento účel. Způsoby pro získání takových vektorů jsou v oboru dobře známé, viz například J.Sambrook et al., Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Miller et al., Genetic Engineering 8: 277-298 (Plenům Press 1986) a odkazy citované v těchto publikacích.

Vhodnými hostitelskými buňkami nebo buněčnými liniemi pro transfekci těmito způsoby jsou bakteriální buňky. Výhodně je alespoň P39.5 protein, o kterém se soudí, že je lipoproteinem (viz příklad 5) - vybraný protein exprimován v bakterii, která má buněčný mechanismus pro vazbu lipidů. Tento expresní systém je zejména výhodný tehdy, je-li protein exprimovaný pro použití ve vakcině nebo při terapii. Například různé kmeny E. coli (např. HB101, MC1061 a kmeny použité v následujících příkladech), jsou dobře známé jako hostitelské buňky v oblasti biotechnologií. V těchto způsobech mohou být také použity různé kmeny B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces a jiné bakterie.

Mnoho kmenů kvasinek známých v oboru je také vhodných pro použití jako hostitelských buněk pro expresi polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Jiné houby mohou být také použity jako expresní systémy. Ačkoliv kvasinky mohou také lipidovat proteiny, může být charakter lipidace odlišný od bakteriální

lipidace, t.j. odlišný od přirozeného proteinu.

Mohou být použity savčí buňky, jako jsou lidské 293 buňky, ovariální buňky čínského křečka (CHO), opičí COS-1 buněčná linie nebo myší 3T3 buňky získané ze Swiss, Balb-c nebo NIH myší.

Jinou vhodnou savčí buněčnou linií je CV-1 buněčná linie. Ještě jiné vhodné savčí hostitelské buňky, stejně jako metody pro transfekci, kultivaci, amplifikaci, skríning, produkci a přečištění jsou známé v oboru (viz například Gething and Sambrook, Nátuře 293: 620-625 (1981), nebo Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5 (7): 1750-1759 (1985) nebo Howley et al. , U.S: patent č. 4419446) .

Alternativně mohou být použity hmyzí buňky, jako jsou buňky Spodoptera frugipedera (Sf9).

Předkládaný vynález obsahuje způsob pro produkci rekombinantních Borreliových proteinů, například P7-1 nebo jiných proteinů kazetového řetězce, který obsahuje transfekci například běžnými způsoby jako je elektroporace - hostitelských buněk alespoň jedním expresním vektorem obsahujícím polynukleotid podle předkládaného vynálezu pod kontrolou sekvence regulující transkripci. Transfektováná nebo transformovaná hostitelská buňka je potom kultivována za podmínek umožňujících expresi proteinu. Exprimovaný protein je potom odebrán, izolován a volitelně přečištěn z buněk (nebo z kultivačního media, pokud je exprimován extracelulárně) vhodnými způsoby známými v oboru.

Například mohou být proteiny izolovány v solubilní formě po lýze buněk, nebo mohou být extrahovány za použití známých technik, například extrakce guanidinchloridem. Pokud je to vhodné, mohou být proteiny nebo jejich fragmenty podle • · předkládaného vynálezu produkovány jako fúsní proteiny. Takovými fúsními proteiny jsou fúsní proteiny popsané výše. Alternativně může být vhodné produkovat fúsní proteiny pro zesílení exprese proteinu ve vybrané hostitelské buňce, pro zlepšení přečištění, nebo pro sledování přítomnosti vybraného proteinu, například P7-1, ve tkáních, buňkách nebo v buněčných extraktech. Vhodné fúsní partnery pro proteiny podle předkládaného vynálezu j sou v oboru dobře známé a patří mezi ně, mimo jiné, S-galaktosidasa, glutathion-S-transferasa a poly-histidin.

B. Exprese in vivo

Alternativně, pokud je žádoucí, aby byl P7-1 nebo jiný protein kazetového řetězce podle předkládaného vynálezu (ač kompletní, nebo jeho fragment) exprimován in vivo, například pro indukci protilátek nebo jako DNA vakcina, tak může být odborníkem v oboru vybrán vhodný vektor pro přenos genu.

Příklady vektorů pro in vivo genový přenos jsou dostupné z akademických nebo komerčních zdrojů a zahrnují například adeno-asociovaný virus (mezinárodní patentová přihláška č. PCT/US91/03440), adenovirové vektory (M. Kay et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 2353 (1994); S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92: 883 (1993)), nebo jiné virové vektory, jako jsou různé poxviry, viry vakcinie a podobně. Způsoby pro inserci vybraného genu, například P7-1, a pro získání in vivo exprese kódovaného proteinu, jsou v oboru dobře známé.

III. Protilátky podle předkládaného vynálezu

Předkládaný vynález také obsahuje protilátky schopné rozpoznání a vazby na izolované nebo modifikované nebo multimerní antigeny podle předkládaného vynálezu, včetně protilátek získaných pomocí směsi takových antigenů nebo jejich fragmentů. Tyto protilátky jsou užitečné v diagnostice Lymské nemoci a v terapeutických prostředcích pro léčbu lidí a/nebo zvířat pozitivních na Lymskou nemoc nebo vykazujících příznaky Lymské nemoci. Protilátky jsou užitečné v diagnostice buď samostatně, nebo v kombinaci s protilátkami k jiným antigenům podle předkládaného vynálezu, stejně jako v kombinaci s protilátkami proti jiným známým antigenům B. burgdorferi. Tyto protilátky jsou také užitečné v prostředcích pro pasivní imunizaci.

Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou připraveny běžnými prostředky za použití izolovaných, rekombinantních nebo modifikovaných antigenů podle předkládaného vynálezu, nebo za použití směsí takových antigenů nebo jejich antigenních fragmentů. Například, polyklonální protilátky jsou připraveny běžnou stimulací imunitního systému vybraného zvířete nebo člověka izolovaným antigenem nebo směsí antigenních proteinů nebo peptidů podle předkládaného vynálezu, po které imunitní systém produkuje protilátky proti těmto antigenům a potom jsou tyto protilátky získány z krve nebo jiné biologické kapaliny zvířete nebo člověka.

Například je protilátka podle předkládaného vynálezu připravena tak, že obratlovci je podán antigen nebo antigenní prostředek podle předkládaného vynálezu, například P7-1. Výhodně je jako imunogen použita rekombinantní verze P7-1 (rP7-l).

Vhodná polyklonální protilátka proti P7-1 antigenů zabíjí IP90 spirochety in vitro způsobem zprostředkovaným komplementem závislým na protilákách (ADCK) , bez ohledu na to, zda byla protilátka získána: (1) afinitním přečištěním, ve kterém je jako irnunoabsorbent použit přirozený P39.5 antigen IP90 spirochet (jak je separován pomocí westernová přenosu; viz obr. 6) a jako zdroj protilátek je použito antisérum získané při infekci makaků • · • · · · rhesus spirochetami JDI; nebo (2) imunizací myší rekombinantním P7-1 z IP90 (ΓΡ7-1).

Tak je protilátka podle předkládaného vynálezu izolována afinitním přečištěním antiséra získaného při infekci obratlovce, například makaka rhesus, spirochetami JDI, za použití přirozeného P39.5 antigenu IP90 nebo jednoho nebo více proteinů kazetového řetězce jako imunoabsorbentu. Podobně je protilátka podle předkládaného vynálezu izolována imunizací myší přečištěným, rekombinantním antigenem podle předkládaného vynálezu, nebo přečištěným, izolovaným přirozeným P39.5. Také mohou být připraveny monoklonální protilátky (MAb). Hybridomní buněčné linie exprimující vybrané MAb jsou připraveny známými technikami, viz např. Kohler and Milstein a mnoha známými modifikacemi těchto technik. Podobně vysoké titry protilátek jsou získány při použití známých rekombinantních technik pro monoklonální nebo polyklonální protilátky vyvinuté k těmto antigenům (viz například PCT patentová přihláška č.

PCT/GB85/00392; Britská patentová přihláška č. GB2188638A; Amit et al., Science 233: 747-753 (1986); Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); PCT patentová přihláška č. PCT/W090/07861; a Riechmann et al., Nátuře 332: 323-327 (1988); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1988)a).

Za použití zde uvedených objevů může odborník vyrobit chimérické, humanizované nebo plně lidské protilátky proti P39.5 nebo proteinům kazety nebo jejich fragmentům, za použití známých technik pro manipulaci s komplementaritu určujícími regiony zvířecích nebo lidských protilátek k antigenu podle předkládaného vynálezu. Viz například E. Mark and Padlin, Humanization of Monoclonal Antibodies, kapitola 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, svazek 113, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag (June,

1994) .

Alternativně jsou antigeny seskupeny do multiantigenních komplexů (viz například Evropská patentová přihláška 0339695, publikovaná 2.11.1989), nebo jsou použity jako prostá směs antigenních proteinů/peptidů a jsou použity pro vyvolání vysokých tirů protilátek schopných vazby na vybrané antigeny v biologických tekutinách infikovaných zvířat nebo lidí.

Dále obsahuje předkládaný vynález anti-idiotypové protilátky (Ab2) a anti-anti-idiotypové protilátky (Ab3). Ab2 jsou specifické pro cíl, na který se váží anti-P39.5 protilátky podle předkládaného vynálezu a Ab3 jsou podobné P39.5 protilátkám (Abl) ve vazebných specificitách a biologických aktivitách (viz například M. Wettendorff et al., Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies, v Idiotypic Network and Diseases, ed. J. Cerny and J. Hiernaux, J. Am. Soc. Microbiol., Washington DC, str. 203-229 (1990)). Tyto anti-idiotypové a anti-anti-idiotypové protilátky jsou produkovány technikami dobře známými v oboru. Takové anti-idiotypové protilátky (Ab2) mohou mít vnitřní vzhled P39.5, proteinů kazety nebo jejich fragmentů a jsou použitelné pro stejné účely jako P39.5, proteiny kazety nebo jejich fragmenty.

Obecně jsou polyklonální antiséra, monoklonální protilátky a jiné protilátky, které se váží na vybrané antigeny (Abl) užitečné pro identifikaci epitopů P39.5 nebo proteinů kazety vhodných pro separaci P39.5 (nebo proteinů kazety) a jejich analogů z kontaminujícího materiálu v živé tkáni (například v chromatografické koloně a podobně) a jsou nástrojem pro výzkum a výchozím materiálem zásadním pro vývoj jiných typů protilátek popsaných výše. Anti-idiotypové protilátky (Ab2) jsou užitečné pro vazbu stejného cíle a proto mohou být použity místo původního antigenu, například P39.5, pro indukci imunitní odpovědi. Ab3 jsou užitečné pro stejné účely jako Abl. Výše uvedené protilátky jsou také užitečné jako nástroje pro výzkum a jako složky pro separaci P39.5 nebo jiných proteinů kazety, například z kontaminujícího materiálu.

Pro použití v diagnostických testech jsou protilátky asociovány s běžnými značkovacími činidly, která jsou schopna, samostatně nebo v kombinaci s jinými prostředky nebo sloučeninami, vyvolat detekovatelný signál. Pokud je v diagnostických metodách použita více než jedna protilátka, tak jsou značkovací činidla vhodně interaktivní pro dosažení detekovatelněho signálu. Nejlépe je možno značkovací činidlo detekovat vizuálně, například kolorimetricky. V oboru jsou popsány různé enzymové systémy, které dávají kolorimetrický signál v testu. Příkladem je glukosa-oxidasa (využívající glukosu jako substrát), která uvolňuje peroxid. Peroxidasa, která reaguje s peroxidem a donorem vodíku jako je například tetramethylbenzidin (TMB), produkuje oxidovaný TMB, který se projeví modrým zbarvením. Jiným příkladem je křenová peroxidasa (HRP) a nebo alkalická fosfatasa (AP) a hexokinasa společně s glukosa-6-fosfat dehydrogenasou, které reagují s ATP, glukosou a NAD+ za vzniku - kromě jiných sloučenin - NADH, který je detekován jako zvýšená absorbance při vlnové délce 340 nm. Dalšími značícími systémy, které mohou být použity ve způsobech podle předkládaného vynálezu, jsou systémy detekovatelné jinými prostředky, například mohou být místo enzymů použity barvené latexové mikročástice (Bangs Laboratories, Indiana), které obsahují barvivo a které tvoří konjugaty s protilátkami a vyvolávají vizuální signál ukazující na přítomnost komplexů. Ještě dalšími značkovacími činidly jsou fluorescentní sloučeniny, radioaktivní sloučeniny nebo prvky. Detekovatelná značkovací činidla pro navázání na protilátky použitelné v diagnostických testech podle předkládaného vynálezu mohou být snadno vybrána z mnoha kompozic a jsou snadno dostupná pro odborníky v oboru diagnostických testů. Způsoby a polypeptidy podle předkládaného vynálezu nejsou omezeny na určité detekovatelné značkovací činidlo nebo na určitý značkovací systém.

IV. Diagnostické způsoby a testy

Předkládaný vynález také obsahuje způsoby pro diagnostiku Lymské nemoci. Tyto diagnostické způsoby jsou použitelné pro lidi nebo pro zvířata s klinickými příznaky Lymské nemoci nebo s podezřením na Lymskou nemoc.

V jednom provedení obsahuje diagnostický test detekci přítomnosti přirozených protilátek proti P39.5, které jsou tvořeny imunitním systémem infikovaného člověka nebo zvířete v jeho biologických tekutinách a které jsou schopné vazby na antigeny podle předkládaného vynálezu nebo na jejich kombinace. Tento test obsahuje krok inkubace P39.5 antigenu nebo antigenu kazetového řetězce podle předkládaného vynálezu se vzorkem biologické tekutiny od pacienta. Protilátky přítomné v tekutině v důsledku infekce B. burgdorferi budou tvořit s antigenem komplex antigen-protilátka. Potom je reakční směs analyzována na přítomnost nebo nepřítomnost komplexů antigen-protilátka. Krok analýzy reakční směsi obsahuje kontaktování reakční směsi se značeným specifickým vazebným partnerem pro protilátku.

V podobném provedení obsahuje diagnostický test detekci přítomnosti přirozených protilátek proti Pl-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 a/nebo P12-1, které jsou tvořeny imunitním systémem infikovaného člověka nebo zvířete v jeho biologických tekutinách a které jsou schopné vazby na antigeny podle předkládaného vynálezu nebo na jejich kombinace. Tento test obsahuje krok inkubace jednoho, nebo lépe směsi antigenů podle předkládaného vynálezu se vzorkem biologické tekutiny od pacienta. Protilátky přítomné v tekutině v důsledku infekce B. burgdorferi budou tvořit s antigenem komplex antigen-protilátka. Potom je reakční směs analyzována na přítomnost nebo nepřítomnost komplexů antigen-protilátka. Krok analýzy reakční směsi obsahuje kontaktování reakční směsi se značeným specifickým vazebným partnerem pro protilátku.

V jednom provedení testu je přečištěný antigen, jeho fragment nebo směs antigenů elektro- nebo bodově nanesen na nitrocelulosový papír. Potom je biologická tekutina (například sérum nebo plasma) inkubována s antigenem obsaženým ve skvrnách a protilátka v biologické tekutině se nechá navázat na antigeny. Navázaná protilátka je potom detekována standardními imunoenzymatickými technikami.

V jiném provedení testu jsou latexové korálky konjugovány na antigen podle předkládaného vynálezu. Potom se biologická tekutina inkubuje s konjugatem korálek/protilátka, čímž vzniká reakční směs. Reakční směs se potom analyzuje na přítomnost protilátek.

V jiném provedení obsahuje diagnostický způsob podle předkládaného vynálezu detekci přítomnosti přirozeného P39.5 nebo antigenů kazetového řetězce ve spojení s Borrelia patogenem v biologických kapalinách zvířete nebo člověka infikovaného patogenem. Tento způsob obsahuje krok inkubace protilátky podle předkládaného -vynálezu (produkované například podáním vhodného lidského a/nebo zvířecího antigenů podle předkládaného vynálezu, vhodně značeného pro detekci) se vzorkem biologické tekutiny od člověka nebo od zvířete, u kterého je prováděna diagnostika. V • · přítomnosti infekce člověka nebo zvířete Borrelií se tvoří komplex antigen-protilátka (proběhne specifická vazba). Potom se nadbytek značené protilátky odstraní a reakční směs se analyzuje na přítomnost nebo nepřítomnost komplexů antigen-protilátka a na množství značkovacího činidla asociovaného s těmito komplexy.

Testy využívající proteinový antigen podle předkládaného vynálezu mohou být heterogenní (t.j. vyžadující krok separace) nebo homogenní. Pokud je test heterogenní, může být použito mnoha separačních postupů, včetně centrifugace, filtrace, chromatografie nebo magnetismu.

Jedním výhodným testem pro vyšetřování krevních přípravků nebo jiných fyziologických nebo biologických tekutin je enzymový-imunosorbentní test (ELISA). V ELISA je obvykle izolovaný antigen podle předkládaného vynálezu adsorbován na povrch mikrotitrační jamky přímo nebo přes záchytnou matrici (například protilátku). Zbývající vazebná místa pro protein jsou potom blokována vhodným činidlem, například hovězím sérovým albuminem (BSA), teplem inaktivovaným normálním kozím sérem (NGS) nebo BLOTO (pufrovaným roztokem odtučněného mléka obsahujícím též konzervační činidla, sole a činidla snižující pěnivost). Jamka je potom inkubována s biologickým vzorkem podezřelým z toho, že obsahuje specifickou protilátku proti B. burgdorferi. Vzorek může být použit neředěný_r ale častěji je ředěný, obvykle v v pufrovaném roztoku obsahujícím malé množství (0,1-5,0% hmotnosti) proteinu, jako je BSA, NGS nebo BLOTTO. Po inkubaci dostatečně dlouhé pro proběhnutí specifické vazby se jamka vypláchne pro odstranění nenavázaného proteinu a potom se inkubuje se značeným anti-lidským imunoglobulinem (a Hulg) nebo se značenými protilátkami proti jiným druhům, například psům. Značkovací činidlo může být vybráno z mnoha enzymů, včetně křenové peroxidasy (HRP), E-galaktosidasy, • 4 alkalické fosfatasy a glukosa oxidasy, jak byly popsány výše. Opět se nechá uběhnout dostatečná doba pro proběhnutí specifické vazby, potom se jamka znovu vypláchne pro odstranění nenavázaného konjugatu a přidá se substrát pro enzym. Potom proběhne vývoj zabarvení a optická densita obsahu jamky se měří vizuálně nebo přístrojově.

Dále, MAb nebo jiné protilátky podle předkládaného vynálezu, které jsou schopny vazby na antigen, mohou být navázány na ELISA plotny. V jiné diagnoostické technice je biologická kapalina inkubována s plotnou s navázanou protilátkou a ta je promyta. Detekce jakéhokoliv komplexu antigen-protilátka a kvalitativní měření značené MAb se provede běžným způsobem, popsaným výše.

Jinými použitelnými testovacími formáty jsou filtrační víčka a ponorné tyčinky. V prvním testu je protilátka podle předkládaného vynálezu fixována na filtrační nálevku s fritou na vstupním víčku. Biologická kapalina nebo vzorek (5 ml) se nechá projít přes filtr. Pokud je antigen přítomen (například při infekci B. burgdorferi), tak se naváže na filtr a je potom vizualizován pomocí druhé protilátky/detektoru. Tyčinkový test obsahuje fixování antigenu na filtru, který je potom ponořen do biologické kapaliny, sušen a vyšetřován pomocí detektorové molekuly.

Jiné diagnostické testy mohou využívat antigen nebo jeho fragmenty jako nukleokyselinové sondy nebo protismyslné sekvence, které mohou identifikovat přítomnost infekce v biologické kapalině hybridizací na komplementární sekvence produkované patogenem v biologických kapalinách. Takové techniky, jako je PCR, Northern nebo Southern hybridizace atd., j sou v oboru dobře známé.

·· ·♦ · ft · · * · · «

Odborníkům v oboru bude jasné, že jakýkoliv z mnoha běžných typů testů, zejména imunotestů nebo testů využívajících nukleové kyseliny, může být navržen tak, že využívá izolované antigeny nebo protilátky nebo jejich sekvence nukleových kyselin nebo protismyslné sekvence podle předkládaného vynálezu pro detekci Borreliové infekce u zvířat a u lidí. Předkládaný vynález není tedy omezen výběrem typu testu a zahrnuje použití všech typů testů, které jsou v oboru známé.

V. Diagnostické kity

Pro snadné použití mohou být činidla pro ELISA nebo jiné testy podle předkládaného vynálezu ve formě kitu. Takové kity jsou použitelné pro diagnostiku infekce Borreliemi v lidském nebo zvířecím vzorku. Takové diagnstické kity obsahují antigen podle předkládaného vynálezu a/nebo alespoň jednu protilátku schopnou vazby na antigen podle předkládaného vynálezu, nebo sekvenci nukleové kyseliny kódující takový antigen, nebo její protismyslnou sekvenci. Alternativně mohou takové kity obsahovat jednoduchou směs takových antigenů nebo sekvencí nebo prostředky pro přípravu takových prostých směsí.

Kity mohou obsahovat mikrotitrační plotny, na které byly předem absorbovány Borreliové antigenní proteiny nebo protilátky nebo sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, různá ředidla a pufry, značené konjugaty pro detekci specificky navázaných antigenů nebo protilátek nebo nukleových kyselin a jiná činidla generující signál, jako jsou substráty pro enzymy, kofaktory a chromogeny. Další složky těchto kitů mohou být snadno určeny odborníkem v oboru. Takovými složkami mohou být polyklonální nebo monoklonálni zachycovací protilátky, antigeny podle předkládaného vynálezu nebo směs dvou nebo více protilátek, přečištěné nebo semi-přečištěné extrakty těchto antigenů jako standardy, Mab detektorové protilátky, anti-myší nebo anti-lidské protilátky s konjugovanou indikátorovou molekulou, ELISA plotny připravené pro absorpci, indikátorové diagramy pro kolorimetrická srovnání, rukavice na jedno použití, dekontaminační nástroje, aplikátorové tyčinky nebo kontainery, a zkumavku pro přípravu vzorku. Takové kity jsou snadno použitelným, účinným prostředkem pro diagnostiku Borreliové infekce v klinické laboratoři.

VI. Terapeutické prostředky

Antigeny, protilátky, sekvence nukleové kyseliny nebo protismyslné sekvence podle předkládaného vynálezu, samostatně nebo v kombinaci s jinými antigeny, protilátkami, sekvencemi nukleové kyseliny nebo protismyslnými sekvencemi, mohou být dále použity v terapeutických prostředcích a způsobech pro léčbu Lymské nemoci u člověka nebo u zvířat. Například může být takový prostředek připraven tak, že obsahuje nosič nebo ředidlo a jednu nebo více protilátek proti P7-1 nebo proteinu kazetového řetězce podle předkládaného vynálezu. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče usnadňují podání proteinů, ale musí být fyziologicky inertní a/nebo neškodné.

Nosiče mohou být vybrány odborníkem v oboru. Příklady nosičů jsou sterilní salinický roztok, laktosa, sacharosa, fosforečnan vápenatý, želatina, dextran, agar, pektin, podzemnicový olej, olivový olej, sesamový oolej a voda. Dále, nosiče nebo ředidla mohou obsahovat materiál zpomalující vstřebávání, jako je glycerolmonostearat nebo glycerodistearat, samostatně nebo v kombinaci s voskem. Kromě toho mohou být použity prostředky se zpomaleným uvolňováním obsahující polymery.

Volitelně mohou takové prostředky také obsahovat běžné • · · · farmaceutické přísady, jako jsou konzervační činidla nebo chemická stabilizační činidla. Výhodnými přísadami, které mohou být použity v terapeutických prostředcích společně s protilátkami, jsou například kasaminokyseliny, sacharosa, želatina, fenolová červeň, N-Z amin, difosforečnan draselný, laktosa, laktalbuminový hydrolyzát a sušené mléko.

Předpokládá se, že v redukci nebo eliminaci příznaků Lymské nemoci mohou být také kromě protilátek podle předkládaného vynálezu účinná jiná činidla, například antibiotika nebo imunostimulační činidla nebo cytokinová regulační činidla. Činidla, která mohou být použita pro potlačení nebo inhibici imunosupresiv uvolňovaných klíštětem nebo spirochetou mohou také podpořit přirozenou imunitu infikovaného člověka nebo zvířete. Proto mohou být tato činidla použita v terapeutických prostředcích podle předkládaného vynálezu společně. Vývoj terapeutických prostředků obsahujících taková činidla bude odborníkům v oboru jasný.

Ve způsobu podle předkládaného vynálezu mohou být lidé nebo zvířata trpící Lymskou nemocí léčeni tak, že jim je podáno účinné množství takového terapeutického prostředku. Účinné množství může být mezi přibližně 0,05 a přibližně 1000 /zg/ml protilátky podle předkládaného vynálezu. Vhodná dávka může být přibližně 1,0 ml pro taková účinná množství. Takový prostředek může být podán 1 až 3 denně po dobu 1 až 12 dnů. Nicméně, vhodné dávkování musí být určeno ošetřujícím lékařem nebo veterinářem podle věku, pohlaví, hmotnosti a celkového zdravotního stavu pacienta. Výhodně je takový prostředek podán parenterálně, výhodně intramuskulárně nebo subkutáně. Nicméně, prostředek může být také připraven pro podání jakýmkoliv jiným vhodným způsobem, včetně orálního nebo lokálního.

• · • ·

VII. Vakcinační prostředky

Žádný z potenciálních problémů známých v oboru nevzniká při použití vakciny založené na antigenu, který je exprimován v obratlovci. Zlepšená vakcina založená na povrchovém antigenu určená pro prevenci Lymské nemoci u lidí a jiných zvířat je získána za použití P39.5 antigenu podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla. Tento vakcinační prostředek může obsahovat jednu nebo více izolovaných, rekombinantních, modifikovaných nebo multimerních forem P39.5 antigenu podle předkládaného vynálezu, nebo jejich směsi. Podobně mohou být v takových prostředcích použity soli antigenních proteinů.

V jiném provedení je prostředek podle předkládaného vynálezu založen na jiných antigenech kazetového řetězce, t.j. Pl-1,

P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 a P12-1. Vynálezce předpokládá, že mechanismus antigenní variace, kterému podléhá vlsE antigen, má zásadní význam pro přežívání spirochet v obratlovci. V předkládaném vynálezu překonává nová vakcinační metoda obranné mechanismy spirochet tak, že imunizuje hostitele velkou frakcí epitopů, které jsou exprimovány na kazetovém řetězci, který je zdrojem variací. Toto umožňuje jedinečná skutečnost, že většina tohoto kazetového řetězce je ve čtecím rámci. Vynálezci ilustrovaly tento koncept, jak je popsán v příkladech uvedených dále, imunizací hostitele antigenem kazetového řetězce, P7-1, a indukcí protilátek, které zabíjejí spirochety. Tak obsahuje metoda vakcinace podle předkládaného vynálezu podání několika nebo všech klonovaných a přečištěných proteinů uvedených výše hostiteli, kde tyto proteiny jsou odvozeny z antigenně nepodobných částí IP90 kazetového řetězce. Ačkoliv může být z takových proteinů připraveno mnoho imunogenních prostředků, v současné době se doporučuje pro tento účel prostá směs dvou nebo více proteinů kazetového řetězce nebo jejich peptidových fragmentů.

Kombinace antigenu podle předkládaného vynálezu s jinými antigeny B. burgdorferi, jako jsou OspA, OspB, OspC proteiny, BmpA, B, C nebo D proteiny nebo jejich fragmenty, jsou také obsahem předkládaného vynálezu.

Příklady nosičů jsou popsány výše pro terapeutické prostředky. Volitelně mohou vakciny obsahovat také adjuvans, konzervační činidla, chemická stabilizační činidla a jiné antigenní proteiny. Obvykle jsou stabilizační činidla, adjuvans a konzervační činidla optimalizována tak, aby měl prostředek nej lepší účinnost u člověka nebo zvířete. Příklady vhodných konzervačních činidel jsou chlorbutanol, sorbat draselný, kyselina sorbová, oxid siřičitý, propangalat, parabeny, ethylvanilin, glycerin, fenol a parachlorfenol.

Jedna nebo více z popsaných složek vakciny může být smísena nebo adsorbována na běžné adjuvans. Adjuvans je použito pro přilákání leukocytů nebo pro zesílení imunitní odpovědi. Mezi taková adjuvans patří například Ribi, anorganický olej a voda, hydroxid hlinitý, Amphigen, Avridin, L12l/skvalen, D-laktid-polylaktid/glykosid, pluronické polyoly, muramyl dipeptid, mrtvé Bordetelly a saponiny, jako j-e QuilA. Dále, vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu může obsahovat jiné, non-B. burgdorferi antigeny, včetně Bordetella bronchiseptica, psího parvoviru, viru psinky, vztekliny, Leptosporidia, psího coronaviru a psího adenoviru. Tyto prostředky mohou také obsahovat další vakcinační antigeny pocházející z jiných druhů, například coronavirus koček atd.

Předkládaný vynález také obsahuje profylaktickou metodu • · obsahující podání účinného množství takového prostředku člověku nebo zvířeti. Antigenní prostředky obsahující P39.5 a/nebo proteiny kazetového řetězce jsou podány v účinném množství, to znamená je podáno takové množství antigenu, které je při daném způsobu podání účinné z hlediska vakcinace, t.j. vyvolá protektivní imunitu. Vhodná množství antigenu mohou být určena odborníkem v oboru podle požadované úrovně imunitní odpovědi. Obyčejně však obsahuje vakcinační prostředek mezi 1 ng a 1000 mg antigenu, lépe 0,05 /zg až 1 mg antigenu na ml. Vhodné dávky vakcinačních prostředků podle předkládaného vynálezu budou snadno určeny odbrníkem v oboru. Obyčejně jsou vhodné dávky mezi 0,1 a 5 ml vakcinačního prostředku. Dávka může být snadno určena odborníkem v oboru, podle toho, zda se jedná o léčbu člověka nebo zvířete a podle věku, hmotnosti a celkového zdravotního stavu.

Obyčejně bude vakcina podána jednou za sezónu. Každou klíšéovou sezónu, obvykle na jaře, by měla být podána dosycovací dávka. Vakcina může být podána jakýmkoliv vhodným způsobem. Výhodným způsobem je parenterální podání, zejména intramuskulámí a podkožní. Také orální způsob podání je výhodný. Způsoby podání mohou být podle potřeby kombinovány nebo upraveny.

Dále může být vakcinou DNA vakcina, která obsahuje DNA sekvenci pro P7-1 nebo její fragment, sekvenci pro jiný protein kazetového řetězce nebo její fragment, volitelně pod kontrolou regulačních sekvencí. DNA kódující antigen může být nesena na vektoru, například na virovém vektoru. Obvykle obsahuje vhodná vektorová terapie mezi 1 x 10'³ pfu až l x 10¹² pfu na dávku. Nicméně, dávkování, doba podání a způsob podání těchto prostředků mohou být určeny odborníkem v oboru. Při stanovení dávky, načasování a způsobu podání imunogenních nebo vakcinačních prostředků podle předkládaného vynálezu je třeba brát v úvahu faktory jako je věk a fyzický stav vakcinovaného jedince.

VIII. Vyhledávání a vývoj léků

Proteiny, protilátky a polynukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro vyhledávání a vývoj chemických sloučenin nebo proteinů, které jsou použitelné jako terapeutika nebo vakciny pro léčbu nebo diagnostiku nebo prevenci Lymské nemoci. Například, sloučenina, která se váže na P39.5 a která blokuje jeho biologickou aktivitu, může být užitečnou složkou léků pro léčbu nebo prevenci Lymské nemoci.

Zde popsaný způsob může být také aplikován na fragmenty P39.5. Podobně, sloučenina, která se váže na na protein kazetového řetězce nebo jeho fragment a která blokuje jeho biologickou aktivitu, může být užitečnou složkou léků pro léčbu nebo prevenci Lymské nemoci.

Vhodné testovací metody mohou být vybrány odborníkem v oboru. Pokud je to žádoucí ve vybraném testu, může být vybraný antigen, například P39.5, imobilizován přímo nebo nepřímo /například pomocí protilátky proti P39.5) na vhodném povrchu, například v ELISA testu. Takové imobilizační povrchy jsou dobře známé. Například mohou být použity smáčivé inertní korálky.

Alternativně může být vybraný antigen, například P39.5, použit ve skríningových testech, které nevyžadují imobilizaci, například při skríningu kombinatoriálních knihoven. Existují testy a techniky pro skríning a vývoj léků schopných vazby na antigen podle předkládaného vynálezu, například P39.5. Mezi tyto testy patří použití fágového zobrazovacího systému pro expresi antigenních proteinů a použití kultury transfektovaných E. coli nebo jiných mikroorganismů pro produkci proteinů pro vazebné

• · · · < · studie s potenciálními vazebnými sloučeninami. Viz například techniky popsané v G. Cesarini, FEBS Letters 307(1): 66-70 (červen 1992); H. Gram et al., J. Immunol. Meth. 161: 169-176 (1993); C. Summer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3756-3760 (květen 1992), které jsou zde uvedeny jako odkaz.

Mohou být použity jiné vhodné techniky pro skríning léčiv využívající proteiny, protilátky nebo polynukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu. Například, metoda pro identifikaci sloučenin, které se specificky váží na protein podle předkládaného vynálezu, například P39.5, může obsahovat kroky kontaktování vybraného P39.5 proteinu s testovanou sloučeninou a umožnění vazby testované sloučeniny na P39.5; a určení množství testované sloučeniny, která se navázala na P39.5 protein. Taková metoda může obsahovat inkubaci testované sloučeniny a P39.5 proteinu imobilizovaného na pevném nosiči. Podobné metody mohou být použity pro proteiny kazetového řetězce.

Obvykle se povrch obsahující imobilizovaný ligand uvede do kontaktu s roztokem obsahujícím protein a vazba se měří pomocí vhodného detekčního systému. Vhodným detekčním systémem je například konjugat streptavidinu-křenové peroxidasy, přímá konjugace značkovací sloučeniny, například fluoresceinu. Další systémy j sou dobře známé odborníkům v oboru. · Vynález není omezen použitým detekčním systémem.

Jiný způsob pro identifikaci sloučenin, které se specificky váží na P39.5 nebo na jiné proteiny podle předkládaného vynálezu může obsahovat krok kontaktování proteinu, například P39.5, imobilizovaného na pevném nosiči, s testovanou sloučeninou a proteinovou sekvencí, která je receptorem pro P39.5, která se váže na P39.5 protein; a dalším krokem je stanovení množství receptorů, který se navázal na P39.5 protein. Inhibice vazby normálního proteinu testovanou sloučeninou ukazuje na vazbu testované sloučeniny na P39.5 protein. Podobné metody mohou být použity pro proteiny kazetového řetězce.

Proto se předpokládá, že předkládaný vynález poskytuje sloučeniny schopné interakce s P39.5 nebo jeho fragmenty a/nebo s proteiny kazetového řetězce nebo jejich fragmenty, kde tyto sloučeniny jsou schopné zvýšit nebo snížit biologickou aktivitu těchto proteinů. Takové sloučeniny spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Kdekoliv - výše nebo dále - je zmíněn P39.5 protein, může být nahrazen proteinem P7-1 nebo jakýmkoliv jiným proteinem kazetového řetězce.

Následující příklady ilustrují výhodné metody pro získání proteinových antigenů podle předkládaného vynálezu a přípravu testů a prostředků podle předkládaného vynálezu. Tyto příklady ukazují, že P39.5 antigen podle předkládaného vynálezu je užitečný pro diagnostiku nebo profylaxi Lymské nemoci a že může zlepšit sérologii Lymské nemoci. Tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Bakteriální kmeny Borrelia a protilátky

A. Bakteriální kmeny

JDI kmen B. burgdorferi sensu stricto (J. Piesman et al., J. Clin. Microbiol. 25: 557-558 (1987) a T.G. Schwan et al., J. Clin. Microbiol., 27: 1734-1738 (1989)) byly získány od Center for Disease Control and Prevention a byly uchovávány ve zmrazeném stavu při nízkém počtu pasáží (< 7). B31 je také kmen

B. burgdorferi sensu stricto a je získaný z CDC a je uchováván způsobem popsaným výše. IP90 je kmen B. garinii, který byl také získán z CDC.

Organismy B. burgdorferi byly kultivovány při 34 °C v BSK-H kultivačním mediu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

B. Opičí protilátky

Živé spirochety byly inkubovány se sérovými protilátkami z opic makak rhesus, které byly infikovány B. burgdorferi kmenem JDI za použití nymf klíštěte I. scapularis. Nenavázané protilátky byly promyty od spirochet a navázané protilátky byly odstraněny pufrem s nízkým pH. Opičí protilátky byly získány ze tří zdrojů:

a) od opic makak rhesus infikovaných B. burgdorferi kmene JDI inokulací jehlou;

b) od opic makak rhesus infikovaných B. burgdorferi kmene JDI pomocí JD-1 infikovaných nymf Ixodes scapularis;

c) afinitním přečištěním živých spirochet využívajícím jako výchozí materiál antisérum, které bylo získáno od zvířat inokulovaných klíštětem, za použití následující techniky: Objem 800 μΐ ředěného (1/40 v BSK-H mediu), teplem inaktivovaného séra odbraného od 3 zvířat inokulovaných klíštětem se inkubovalo s 1 x 10® živých bakterií při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Po inkubaci se vzorky centrifugovaly při 13000 x g po dobu 15 minut při 4 °C. Potom se supernatan readsorboval ještě dvakrát způsobem popsaným výše. Bakteriální peleta, která se získala po první adsorpci, se třikrát promyla BSK-H pro odstranění nenavázaných protilátek. Po posledním výplachu se peleta resuspendovala v 400-500 μΐ 0,2 M glycinu-HCl, pH 2,2, 0,5 M NaCl a provedla se centrifugace. Supernatant se odebral a pH se upravilo na 7,00 přidáním 2,0 M Tris baze.

i

Příklad 2: Předběžná identifikace P39.5 IP90

Protilátky z příkladu 1, části B, reagovaly se skvrnami při western přenosu úplných extraktů z JDI, B31 a IP90 spirochet. Skvrny ve western přenosu byly připraveny následujícím způsobem: antigenní přípravky byly podrobeny elektroforese na 15% akrylamidových mini gelech (10 x 10 x 0,1 cm) s 5% akrylamidovým zakládacím gelem. 20 μΐ lyzátu obsahujícího 7 x 10® solubilizovaných bakterií nebo 25 μg proteinu (měřeno podle OD při 280 nm) se umístilo do každé dráhy (celá preparativní dráha je rovna 16 jednotlivým drahám; proto bylo na každý preparativní gel umístěno 400 μ% proteinu) . Elektroforesa byla provedena za použití minigelového přístroje (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA) při konstantním proudu 23 mA, s pufry podle U. Laemmli, Nátuře 227: 680-685 (1970). Pro imunoblotting byly proteiny z polyakrylamidových gelů přenášeny elektricky na nitrocelulosový papír (Schleicher and Schuell, Keene, NH) přes noc při konstantním napětí 22 V v Mighty Smáli transfer jednotce (Hoeffer Scientifics Instruments, San Francisko, CA) , jak je popsáno v H. Towbin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979) . Účinnost přenosu byla hodnocena barvením části nitrocelulosy koloidním zlatém (Integrated Separation Systems). Nitrocelulosové membrány byly blokovány 3% odtučněným práškovým mlékem (Carnation) připraveným v PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (Integrated Separation Systems) (PBS-T) po dobu dvou hodin při pokoj ové teplotě.

Po blokování byly membrány umístěny v Miniblotter 45 (Immunogenetics, Cambridge, MA) podle návodu výrobce, a do kanálů Miniblotter bylo zavedeno 110 μΐ každého vzorku séra ředěného 1/50 PBS-T a za třepání se nechala probíhat po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě interakce s nitrocelulosovými membránami. Po inkubaci se pro promytí membrán PBS-T použil vodní komorový systém. V tomto bodě se Miniblotter rozložil a membrány se vyjmuly. Zbytek inkubace byl proveden v malých miskách. Po promytí se membrány inkubovaly po dobu 1 hodiny s biotynylovánými anti-lidskými IgM (specifickými pro μ řetězec) a IgG (specifickými pro τ řetězec) protilátkami (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ředěnými 1/200 v PBS-T. Biotynylované protilátky byly sondovány komplexem avidin/biotynylovaná křenová peroxidasa (Vector) připraveným podle návodu výrobce. Jako chromogen byl použit

4-chlor-l-naftol (Sigma). Barevná reakce byla ukončena promytím membrán destilovanou vodou.

Byl připraven Western blot (Obr. 6) lyzátů ze spirochet B. burgdorferi kmenů JDI a B31 a B. garinii kmene IP 90 vyvíjených se sérem od opic inokulovaných jehlou a klíštětem spirochetami JDI a protilátkami ze druhého uvedeného séra, ze kterého byly afinitně odstraněny celé živé JDI spirochety. Afinitně přečištěná protilátka rozpoznávala čtyři antigeny na western blotech kompletních lyzátů ze spirochet B. burgdorferi JDI. Antigeny byly označeny PÍ (relativní molekulová hmotnost (Mr) 39-40000), P2 (Mr 35-37000), P3 (Mr 22-24000) a P4 (Mr 18-19000). Tyto antigeny byly také rozpoznávány, jak se předpokládalo, sérem od zvířat inokulovaných jehlou a sérem od opic inokulovaných klíštětem. Kromě toho, tento western blot také ukázal, že afinitně přečištěné protilátky rozpoznávají to, co se jeví jako Pl, P2 a P4 na spirochetách B31 a to, co se jeví jako Pl (ale s o něco vyšší relativní molekulovou hmotností) na B. garinii, stejně jako další antigen s vyšší relativní molekulovou hmotností. Tyto dva poslední uvedené antigeny byly také exklusivně rozpoznávány sérem od zvířat inokulovaných jehlou a sérem od opic inokulovaných klíštětem. Pl byl identifikován jako P39, také známý jako BmpA. Podobný antigen identifikovaný na IP90 spirochetách byl prozatímně identifikován • · jako P39.5 a byl ukázán na Western blotech popsaných výše.

Příklad 3: Komplementem zprostředkované na protilátkách závislé zabíjení JDI, B31 a IP90 spirochet

Sérum od opic inokulovaných klíštětem bylo použito v ADCK testu provedeném následujícím způsobem. Vzorky B. burgdorferi se nechají rychle rozmrazit při 37 °C, kultivují se do dosažení střední log fáze (přibližně 3 dny, 1-2 χ 10⁷ spirochet/ml) , centrifugují se při 8000 x g po dobu 20 minut, resuspendují se v BSK-H mediu a počítají se. ADCK test se provede dvojmo v 96-jamkových kultivačních plotnách (Costar). Celkem 5-6 x 10^s spirochet ve 25 μΐ BSK-H media se přidá do každé jamky obsahující 50 μΐ teplem-inaktivovaného (56 °C, 30 minut) séra ředěného 1:10 ve stejném mediu. Plotny se inkubují při 34 °C ve směsi plynů 3% C0₂, 5% 0₂ a N₂ po dobu 20 minut před přidáním 25 μΐ komplementu (normální opičí sérum). Po 18-24 hodinách inkubace za stejných podmínek se mikroskopicky kvantifikuje celkový počet mrtvých (nepohyblivých) a živých (pohyblivých) bakterií. Ekvivalence mezi nepohyblivostí a smrtí v podobném testu byla určeny dříve (M. Ayditung et al., výše). Zabíjení bylo považováno za signifikantní, pokud % mrtvých spirochet přesáhlo 3-krát hodnotu průměrného % usmrcení pozorovaného za přítomnosti normálního séra.

Test ADCK byl proveden se spirochetami B. burgdorferi kmenů JDI a B31 a B. garinii kmene IP90, za použití séra od zvířat, která byla inokulována klíštětem nesoucím JDI spirochety. Jak ukazuje příklad 2, rozpoznává toto sérum pouze dva antigeny na IP90 blotech, jeden s relativní molekulovou hmotností podobnou hmotnosti PÍ a jeden s vyšší relativní molekulovou hmotností.

Jak je uvedeno na obr. 1, všechny tři kmeny spirochet byly zabíjeny sérem, což ukazuje, že alespoň jeden antigen přítomný na IP90 Western blotech byl cílem pro ADCK.

Příklad 4: Identifikace P39.5

Byla zkoumána identita domnělého BmpA (P39) proužku na IP90 Western blotech. Western blot lyzátů JDI a IP90 se vyvíjel s anti-flagelinovou monoklonální protilátkou (Mab); anti-P39 Mab; anti-P39 polyklonální protilátkou; anti-P35 Mab; anti-BmpD polyklonální protilátkou; a sérem od dvou opic inokulovaných klíštětem nesoucím JDI spirochety. V komparativní Western blot analýze JDI a IP90 antigenů, které byly zpracovány na stejném gelu, reagovaly oba antigenní extrakty s anti-flagelinovou Mab H9724. Nicméně, anti-BmpA Mab reagovala pouze s JDI BmpA a sérum od opic imunizovaných rekombinantním BmpA z JDI reagovalo silně s JDI skvrnou, jak bylo předpokládáno, ale velmi slabě s BmpA antigenem z IP90. Kromě toho, vzorky séra získané od dvou opic infikovaných JDI reagovaly se stejnými dvěma antigeny jako dříve na IP90 blotu a příležitostně byl získán další (slabší) proužek vyšší molekulové hmotnosti. Proužek nižší molekulové hmotnosti odpovídá skutečně větší molekule než je BmpA z IP90, jak je identifikováno anti-BmpA polyklonální protilátkou.

Proužek vyšší molekulové hmotnosti odpovídá pravděpodobně flagellinu a má stejnou molekulovou hmotnost jako proužek IP-90, který reagoval s MAb H9724.

Monoklonální protilátka namířená protii P35 z JDI reagovala s touto molekulou na JDI skvrně, ale ne na IP90 skvrně, zatímco myší polyklonální antisérum namířené proti JDI BmpD reagovalo s BmpD jako JDI, tak IP90, ačkoliv BmpD proužek IP90 byl velmi slabý. Tak nebyl antigen IP90, který může být cílem pro ADCK ani BmpA, ani BmpD ani P35. Potom byl tento antigen označen jako

P39.5.

Potom byla provedena westernová analýza lyzátů JDI a IP90 spirochet inkubovaných se sérem z opic inokulovaných klíštětem nesoucím JDI; opičím polyklonálním antisérem proti P39; myší Mab H9724 proti flagellinu; opičí anti-P39.5 protilátkou získanou afinitním přečištěním ze séra opice inokulované klíštětem s JDI; a myší anti-rekombinantní P7-1 (rP7-l). Pro identifikaci P93.5 na Western blotech lyzátů JDI byla anti-P39.5 protilátka vytvořená v opicích infikovaných JDI afinitně přečištěna za použití nitrocelulosových membrán, které měly na sobě navázaný P39.5 z ID90. Jak bylo předpokládáno, protilátka reagovala s P39.5 antigenem na Western blotu lyzátů ID90, ale překvapivě nereagovala na JDI skvrně. Tento výsledek naznačuje, že P39.5 JDI buď nebyl exprimován in vitro, nebo byl exprimován slabě, protože nebyl detekovatelný afinitně přečištěnou anti-P39.5 protilátkou na JDI skvrnách, nebo byl exprimován in vitro JDI tak, že nebyl reaktivní s protilátkou proti P39.5 IP90, která byla afinitně přečištěna.

JDI spirochety musí exprimovat P39.5 in vivo v množstvích dostatečných pro imunogenicitu tohoto proteinu, protože jinak by nebyla vyvolána tvorba anti-P39.5 protilátky, která byla afinitně přečištěna. Ve výše uvedené Western blot analýze byla pozice BmpA ukázána jeho reakcí s anti-BmpA polyklonálním antisérem a pozice flagellinu byla ukázána reakcí této molekuly S MAb H9724.

Takto byl identifikován nový Borrelinový antigen, který je hojně exprimován in vitro B. garinii kmene IP90 a in vivo B. burgdorferi sensu stricto kmenem JDI. Tento antigen, P39.5, byl cílem pro ADCK spirochet kmene ID90.

• ·

Příklad 5: Klonování P39.5

A. Klonování v bakteriofágu

Knihovna náhodně nastříhané celkové DNA z B. garinii IP90 byla konstruována v lambdaZAPII bakteriofágovém vektoru (Stratagene, La Jolla, CA) a byla vyšetřována souborem plasmy odebrané od opic makak rhesus infikovaných JDI kmenem B. burgdorferi. Vzorky plasmy použité pro soubor plasmy byly vybrány tak, že obsahovaly protilátku, která rozpoznávala pouze P39.5, domnělý flagellin a 1 nebo 2 další neidentifikované proužky s vyšší molekulovou hmotností, které byly pozorovány na některých Western blotech IP90.

Po několika kolech vyšetřování bylo 11 klonů zapracováno do pBluescript fagemidu (Stratagene), rekombinantní plasmidy byly přečištěny a byly použity pro transformaci buněk SURE kmenu E. coli. Z každého původního klonu bylo vybráno několik transformantů, byla potvrzena přítomnost insertu a jeden takový transformant z každého klonu byl kultivován, byla provedena indukce exprese, lýza a analýza Western blotem s původní plasmou. Jedenáct klonovaných fragmentů hybridizovalo navzájem při tečkové hybridizaci.

Jeden z jedenácti klonů (označený 7-1) byl vybrán pro nadměrnou expresi a přečištění na základě silné reaktivity exprimovaného proteinu s plasmatickými protilátkami. Insert 7-1 měl délku 950 bp.

Bylo potvrzeno, že exprimovaný protein je antigenně identický, nebo zkříženě reaktivní, s P39.5, protože protilátka z původního vzorku plasmy, která byla afinitně přečištěna za použití klonu jako imunoabsorbens, reagovala s P39.5 na Western blotu lyzátu B. garinii. Byla provedena Western blot analýza lyzátů IP90 spirochet s plasmou opic infikovaných spirochetami JDI; s protilátkami ze stejné plasmy afinitně přečištěnými s rekombinantními antigeny exprimovanými klonem 1-1 B. garinii a klonem 7-1 B. garinii. Ve skvrně byla prokázána reaktivita IP90 lyzátu s opičí plasmou. Byla prokázána reaktivita IP90 lyzátu s protilátkou afinitně přečištěnou s rekombinantním 1-1 proteinem a s protilátkou afinitně přečištěnou s rekombinantním 7-1 proteinem.

Byla získána částečná DNA sekvence pro P7-1 (SEQ ID NO: 1). Přibližně 950 bp bylo získáno z klonu 7-1. Dalších 140 kb po směru kódujícího řetězce bylo získáno z klonu 14 (SEQ ID NO:

13). DNA fragment tvořený 5' SEQ ID NO: 13 sekvence a SEQ ID NO: 1 sekvence má délku 1189 bp a je zobrazen na obr. 2. Obsahuje jediný otevřený čtecí rámec, který kóduje odvozený protein o 37.7 kDa. Nižší obsah alaninu v tomto proteinu vede k nižší molekulové hmotnosti. Protože průměrná molekulová hmotnost aminokyselin tohoto proteinu je 95, chybí přibližně 57 bp kompletního kódujícího regionu. Protože nebyla zjištěna žádná hydrofobní vedoucí sekvence a protože P39.5 má charakteristiky rozpustnosti jako lipoproteiny (viz dále), tak se předpokládá, že P7-1 je antigenně zkříženě reaktivní s P39.5, ale není kompletním P39.5.

Data jiné než odvozené aminokyselinové sekvence P7-1 (SEQ ID NO: 14 a 2) naznačují, že P39.5 je lipoprotein. Za prvé, přirozená forma P39.5 přítomná v extraktech celých buněk spirochet IP90 je plně extrahovatelná, t.j. lze jí získat v detergentové fázi při separaci Tritonem X114. Za druhé, většina jeho sekvence je složena z hydrofilních domén, velmi podobných OspA, a musí být exprimován na zevním povrchu, protože je cílem pro protilátku. Za třetí, % identity s několika členy Vmpl4 rodiny lipoproteinů Borrelia hermsii je významné, například 22% s Vmp4, 19% s Vmp23, 18% s Vmpl7 a 17% s Vmp21. Tyto sekvence jsou dostupné v GENBANK databasy.

Zajímavým rysem jeho nukleotidové sekvence je přítomnost několika vnitřních repetitivních regionů, které jsou uvedeny na obr. 2. Bloky IA a IB mají 70% identitu. Blok Ha je téměř z 91% identický s IIB, a bloky A, B a C mají identitu mezi 84% a 90%. Jako černý blok je označen jedinečný vnitřní region. Je jasné, že taková molekula bude náchylná k homologní rekombinaci, stejné, jaká je pozorována mezi OspA a OspB geny, které mají homologické regiony (P. Rosa et al., výše). Nicméně, takové potenciální únikové mutanty nemohou uniknout kombinovanému působení protilátky a komplementu, jak je uvedeno v odkazu týkajícího se OspA (Sole et al., výše).

B. Exprese a přečištění rekombinantního P7-1 za použití

QIAEXPRESS™ systému

Qiaexpress™ systém od Qiagen, lne. (Chatsworth, CA) má výhodu vysoké afinity šesti následujících histidinových zbytků pro dvojvazné kationty jako je Ni. Ten je konjugován na kyselinu nitril-trioctovou (NTA), která je potom navázána na agarosu. Protože afinitní smyčka je velmi krátká (minimálně 6 zbytků), může být ponechána ve fúsním proteinu bez závažných následků z hlediska antigenních vlastností proteinu. 6xHis afinitní smyčka může být inkorporována jak na C-, tak na N-konci. Jsou dostupné různé vektory (pQE vektory) pro kontrakci obou typů fúzí.

Rekombinanty byly nejprve vyšetřovány na přítomnost očekávaných insertů v plasmidech. Potom následovala Western blot analýza pro potvrzení exprese v těchto rekombinantech. Western bloty byly vyvíjeny buď se sérem od kontrolních myší

infikovaných spirochetami odpovídajícího kmene, nebo s myší protilátkou, která specificky detekuje MRGS(His)6 epitop (Qiagen), což je afinitní koncová sekvence přítomná v některých pQE vektorech (pro N-terminální fúze). Stejně sensitivní alternativou je použití konjugatu Ni-NTA-alkalická fosfatasa, který je také dostupný od Qiagen.

Buňky E. coli obsahující fúsní konstrukt byly kultivovány do střední-log fáze, byla provedena indukce 0,3 mM IPTG po dobu 3 hodin, buňky byly peletovány, promyty jednou Sonication pufrem (50 mM NaP0₄, pH 8,0, 300 mM NaCl) a byly skladovány přes noc při -20 °C. Další den byly buňky resuspendovány v Sonication pufru a byly sonikovány na ledu za použití 15sekundových pulsů po dobu celkem 2 minut. Ihned po sonikaci byl přidán inhibitor serin-proteasy PMSF (fenyl-methyl-sulfonidfluorid) pro prevenci degradace takovými proteasami. Buněčná drť. byla odstraněna centrifugací a supernatant byl přenesen do nové zkumavky. Po středně dlouhém době byla Ni-NTA pryskyřice promyta jedenkrát 10 objemy zkumavky (cv) Sonication pufrem. Fúsní protein se nechal navázat na Ni-NTA pryskyřici během 1 hodiny ve zkumavce. Pryskyřice se centrifugovala a supernatant se odstranil. Pryskyřice se resuspendovala v 10 cv Sonication pufru, nalila se do kolony a promyla se 3-krát 10 cv stejného pufru a potom 3-10 cv Wash pufru (50 mM NaPO^, pH 6,3, 300 mM NaCl). Nakonec byl fúsní protein eluován 10 cv elučního pufru (50 mM NaPO₄, pH 4,5, 300 mM NaCl) a frakce byly odebrány. Frakce byly testovány na obsah proteinu a frakce s nejvyšší koncentrací proteinu byly shromážděny a byly neutralizovány na pH 7,0 dibazickým NaPO₄. Byla vypočítána koncentrace proteinu v souborném vzorku a alikvota byla zpracována na SDS-PA gelu a bylo provedeno barvení stříbrem pro ověření čistoty. Obvyklý výtěžek byl 4-5 mg/litr kultury.

· 9 ··

Příklad 6: In vitro protektivní potenciál P7-1 u opic

Anti-P7-1 protilátka byla přečištěna ze stejné plasmy, která byla použita pro vyšetřování DNA knihovny, pomocí absorpce na a výplachu kyselinou z nitrocelulosových proužků, které obsahovaly rekombinantní P7-1 protein (rP7-l), jak byl exprimován z klonu 7-1. Monospecificita protilátky byla potvrzena Western blotem, jak je popsán v příkladech 2 a 4, a protilátka byla použita v testu na ADCK, jak je popsán v příkladu 3.

Frakce mrtvých IP90 spirochet po 24-hodinové inkubaci s afinitně přečištěnou anti-P7-l protilátkou byla 55% (obr. 3, sloupec 2). Protilátka byla rekonstituována v koncentraci ekvivalentní ředění 1:10 této koncentrace v plasmě. Schopnost zabíjení byla srovnatelná se zabíjením pozorovaným při ředění stejné plasmy 1:10 (67%, obr. 3, sloupec 1). Komplement byl pro zabíjení zásadní, protože pouze 12% spirochet bylo usmrceno za jého absence (obr. 3, sloupec 3). Zabíjení v přítomnosti opičího kómplementu samostatně bylo o něco vyšší, než je obvyklé, s hodnotou 25% (obr. 3, sloupec 4), zatímco nejčastější hodnota byla 10-15%, i pro JDI spirochety (M. Ayditung et al., Infect. Immunol. 62: 4929-4937 (1994)) . V BSK-H mediu samotném bylo usmrceno pouze 12% spirochet (sloupec 5).

Tyto výsledky naznačují, že protilátka k rekombinantnímu P7-1 (fragmentu P39.5) antigenů IP90, jejíž tvorba byla vyvolaná u opic během přirozené infekce JDI spirochetami, může usmrcovat JDI spirochety prostřednictvím ADCK.

Tyto pokusy prokazují protektivní potenciál P7-1 a tvoří základ pro výběr tohoto antigenů jako kandidáta pro vakcinu.

• 9

99 · · 9

Příklad 7: Protektivní potenciál P7-1 u myší

Tento příklad ukazuje, že myši mohou být přímo imunizovány rekombinantním P7-1. Myší protilátky připravené imunizací myší rP7-l a Ribi adjuvans byly schopné zabíjet až 60% IP90 spirochet in vitro komplementem zprostředkovaným zabíjením závislým na protilátkách (ADCK). Pro přímější hodnocení protektivního potenciálu P7-1 byl DNA fragment klonu 7-1 subklonován v pQE jak je popsáno v příkladu 5 a exprimovaný protein byl přečištěn v miligramových množstvích a byl použit pro imunizaci C3H/HeJ myší. Myším byly podány 4 injekce rekombinantního P7-1 po 30 μg v 0,2 ml Ribi R-700 adjuvans (Ribi ImmunoChem Research, lne., Hamilton, MT) . R700 se skládá z 0,25 mg/ml skvalenu (hexamethyltetrakosahexan) a 2 μΐ/ml monooleatu (Tween 80). Injekce byly podány intraperitoneálně s odstupem 3 týdnů. Dva týdny po poslední imunizaci byla myším odebrána krev, specificita vyvolané protilátky byla potvrzena westernovým přenosem za použití celých extraktů IP90 spirochet jako antigenu a vzorky séra byly shromážděny.

Sérum od myší imunizovaných Ribi adjuvans samotným nerozpoznávalo žádné antigeny na IP90 skvrnách. Sérum od myší imunizovaných rP7-l a Ribi rozpoznávalo, jak bylo předpokládáno, P39.5 proužek na IP90 lyzátech, ale také slabší proužek o něco výše než byl 41 kDa flagellinový proužek a stejně tak proužek o vyšší molekulové hmotnosti. Zajímavé je, že tato stejná myší protilátka rozpoznávala 41 kDa proužek na westernových přenosech lyzátů JDI a také antigen s o něco vyšší molekulovou hmotností.

Tyto výsledky se liší od výsledků získaných s afinitně přečištěnou anti-rP7-l protilátkou od opic v předešlém příkladu pravděpodobně z toho důvodu, že afinita myší protilátky se nechala dozrát mnohem déle (12 týdnů) než afinita opičí « « protilátky (4-5 týdnů). V důsledku toho byla její vazebná afinita vyšší, ale specificita nižší a mohla se proto vázat na zkříženě reaktivní, ale neidentické epitopy.

Po další dosycovací injekci bylo od myší, od kterých byla získána anti-P7-l protilátka, která usmrcovala 60% IP90 spirochet ADCK in vitro, získáno antisérum, které usmrcovalo 100% spirochet ve stejném pokusu. Kromě toho, stejné antisérum usmrcovalo 50% spirochet kmene NT1 (kmen ještě neurčený, ale pravděpodobně sensu stricto, který byl izolován z mozkomíšního moku pacientů na východě Spojených Států Amerických). Naopak, žádné spirochety kmene JDI nebyla zabíjeny in vitro (ADCK) ani in vivo, v pokusu infekce myší imunizovaných rP7-l a Ribi adjuvans klíštětem.

ADCK bylo hodnoceno jak s opičím, tak s morčecím komplementem. Normální morčecí sérum (od Sigma Chemical CO., St. Louis, MO) bylo použito jako zdroj komplementu v případě morčecího komplementu. Stejná opičí plasma od zvířat infikovaných JDI B. burgdorferi bylo použito jako pozitivní kontrola. V ředění 1:10 tato plasma zabíjela 57% IP90 spirochet po 24-hodinové inkubaci (obr. 3, sloupec 1). Myší antisérum k rP39.5 zabíjelo 73,5% spirochet v ředění 1:10 a 60,5% spirochet při ředění 1:50 (sloupce 2 a 3, v příslušném pořadí). Sérum od myší imunizovaných Ribi adjuvans samotným zabíjelo 21% spirochet (sloupec 4). Morčecí komplement byl v ADCK testu méně účinný. Frakce 37% spirochet byla usmrcena pozitivní kontrolní plasmou při ředění 1:10 (sloupec 5), zatímco myší anti-P39.5 antisérum ve stejném ředění zabíjelo 48% spirochet v přítomnsoti morčecího komplementu (sloupec 6). Frakce 12% spirochet byla usmrcena v přítomnosti séra myší imunizovaných Ribi adjuvans samotným v ředění 1:10 (sloupec 7). Zajímavé je, že pouze 6% JDI spirochet bylo usmrceno při inkubaci s 1:10 ředěním myšího anti-rP39.5 ·· ·· 4· ·· ·· ···· 9 9 4 4 f « · » · · · » » ······· 94 4 4 4 9 4 4 antiséra, což se nelišilo od použití kontrolního séra (není uvedeno). Proto představují proužky rozpoznané na JDI skvrné nepravou zkříženou reaktivitu, ale ne JDI P39.5.

Příklad 8: Diagnostické použití P7-1 u lidí vzorků lidského séra bylo získáno od Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 4 z těchto vzorků byly od dárců bez anamnesy Lymské nemoci, kteří nikdy nebydleli v oblastech s endemickým výskytem této nemoci. Dalších 15 vzorků bylo od pacientů, kteří žili v oblastech endemických pro Lymskou nemoc a s výjimkou jednoho byly serologicky pozitivní podle kriterií doporučených CDC. Tato kriteria stanoví, že pacienti musí být pozitivní v sensitivním ELISA testu na Lymskou nemoc a musí mít také pozitivní IgM nebo IgG na analýze westernovým přenosem tak, že alespoň dva z následujících tří proužků jsou přítomny v pozitivních IgM skvrnách (24, 39 nebo 41 kDa) a pět z následujících deseti proužků je pozitivních na IgG skvrnách (18, 21, 28, 30, 39, 41, 45, 58, 66 a 93 kDa).

Test, založený na detekci IgG protilátky inkubací vzorků séra ředěného 1:200 s nitrocelulosovými proužky, na které byl elektricky přenesen přečištěný P39.5 antigen, a na následné detekci navázané protilátky imunoenzymatickými metodami popsanými v příkladu 2, dával následující výsledky. Čtyři vzorky séra od dárců bez anamnesy Lymské nemoci, kteří nikdy nebydleli v oblastech s endemickým výskytem této nemoci, neměly detekovatelnou anti-P39.5 protilátku. Z 15 vzorků bylo 14 pozitivních. Jediný negativní vzorek byl ten, který také nesplňoval kriteria protilátek doporučená CDC. Proto je jednoduchý postup založený na P39.5 antigenu jako sondě pro anti-B.burgdorferi protilátku - podle počátečního hodnocení sensitivní a specifický stejně jako komplexnější dvoustupňová

metoda, která je v současnosti doporučována CDC.

V jiném diagnostickém testu byl antigenní protein exprimovaný z 7-1 DNA fragmentu, rP7-l, testován jako sonda pro časnou serologickou diagnostiku Lymské nemoci u opic makak rhesus. Vzorky séra získané od tří párů opic makak rhesus infikovaných třemi různými kmeny B. burgdorferi B31, JDI a NT1, v příslušném pořadí, obsahovaly detekovatelnou protilátku k přečištěnému rP7-l ve 2 týdnu infekce, jak bylo detekováno Western blotem.

IgM a IgG protilátky byly testovány simultáně. Tyto výsledky naznačují, že protilátka k P7-1 se objevuje časně při infekci, bez ohledu na kmen B. burgdorferi, který způsobil tvorbu protilátky.

Sensitivita protilátkově detekce byla znovu hodnocena Western blotem, jak bylo uvedeno výše, s baterií 43 vzorků lidského séra získaných od CDC. Tento pokus byl proveden jako slepý. CDC vzorky byly získány od pacientů s klinickou diagnosou Lymské nemoci, která splňovala přísná CDC kriteria. Ze 43 vzorků klinicky pozitivních pacientů bylo 34 popsáno jako pozitivních CDC, podle Dresslerových kriterií (Dressler. F. et al., 1993, J. Infect. Dis. 167: 392-40), za použití westernová přenosu testu od MarDx Diagnostics. Inc., (Lyme Disease MarBlot). Při diagnostice westernovým testem založeným na P7-1 antigenu byl pozitivní stejný počet vzorků (34), ačkoliv negativní a pozitivní výsledky neodpovídaly vždy v obou testech. Proto má Western blot test založený na P7-1, ve kterém je nebo není detekován jeden proužek a který je proto snadněji interpretovatelný, stejnou sensitivitu jako nejprováděnéjší, obtížně interpretovatelný diagnostický test pro Lymskou nemoc, který je v současnosti na trhu.

V testu na antigenní specificitu bylo ze 12 vzorků od «· ·· ·♦ • · · * ···· * • · · · · · « · · * · »·· ·· · *·· pacientů se syfilis 11 negativních v testu, i přes skutečnost, že všechny vzorky obsahovaly protilátky zkříženě reagující s různými antigeny na westernových přenosech antigenů celých B. burgdorferi. Jediný vzorek séra, který byl pozitivní, byl od pacienta, který měl také HIV infekci a několik infekcí souvisejících s AIDS.

Příklad 9: Proteiny kazetového řetězce

Jak bylo uvedeno výše, aminokyselinová sekvence odvozená od nukleotidové sekvence 7-1 fragmentu je přibližně z 50% identická s VlsE B31 kmene B. burgdorferi, což je část antigenu B. burgdorferi, která podléhá antigenní variaci mechanismem rekombinace, při kterém je centrální fragment exprimované kopie (VlsE) rekombinován s fragmenty řetězce 15 kazet umístěných proti směru kódujícího řetězce od exprimované kopie (J. zhang, výše).

Bylo klonováno několik DNA fragmentů, které se zdají být částí kazetového řetězce B. garinii IP90. Kromě 7-1 jsou tyto fragmenty, označené 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 a 12-1 délky l až 2 kb. Při expresi v rekombinantní formě, v podstatě stejným způsobem, jako je popsán pro P7-1 (od lacZ promotoru pBluescript), exprimuje každý fragment kazetového řetězce peptid, jehož velikost je přiměřená velikosti insertu a který reaguje s protilátkou od infikovaných opic. Žádný z 5' konců těchto fragmentů neobsahuje hydrofobní vedoucí sekvenci nebo konsensuální sekvenci pro signální peptidasu II jakéhokoliv typu, který je charakteristický pro bakteriální lipoproteiny. Tyto fragmenty musí být proto součástí kazetového řetězce IP90 a pravděpodobně kazetového řetězce B31 a jsou v čtecím rámci. DNA sekvence 5' a 3' konců (přibližně 100-500 bp) každého fragmentu jsou uvedeny v SEQ ID NO: 3 až 12. Povšimněte si, že v SEQ ID ·· ·· *· ·» »· ·· • · · · ···· · * * · • · · · · »< «· • ···· ··«<«· • · · · » · « » v ···· ···· ·· ···* ·· ··

NO: 10 je uveden pouze 5' konec fragmentu 9.

Antigenicita těchto fragmentů byla analyzována dvěma způsoby. Za prvé, reaktivita Western blotů fragmentů se vzorky séra odebíranými od opic makak rhesus byla studována po dobu 48 týdnů po inokulaci klíštětem s B. burgdorferi JDI. Proteiny exprimované fragmenty 9-1 a 7-1 reagovaly predominantně se vzorky séra odebranými mezi týdny 2 a 24 po infekci (PI) (časné reaktivní proteiny), proteiny exprimované fragmenty 3-1 a 6-1 reagovaly predominantně se vzorky séra odebranými mezi týdny 24 a 48 po infekci (pozdní reaktivní proteiny) a proteiny z fragmentů 1-1 a 12-1 měly uniformní reaktivitu během celého 48-týdeního období. Tyto výsledky ukazují, že každý klonovaný fragment obsahoval jedinečné epitopy.

Pro potvrzení této domněnky byl vytvořen sérový soubor za použití vzorků séra použitého v analýze westernovým přenosem popsané výše a alikvota tohoto časového souboru byla pre-inkubována s nadbytkem přečištěného antigenu exprimovaného z 7-1 (rP7-l). V tomto způsobu nebyla anti-P7-l protilátka, která byla přítomna v půlu séra dále dostupná pro reakci s P7-1 antigenem na westernových přenosech. Nicméně, tento sérový soubor byl dále schopen reagovat s proteiny exprimovanými z jiných DNA fragmentů, s výjimkou 12-1. Protože 12-1 je pozdní reaktant, tak je možné, že protilátky k domnělým jedinečným epitopům 12-1 mohou být vyředěny v sérovém souboru. Všechny výše uvedené fragmenty byly subklonovány do pQE vektoru pro expresi za použití běžných technik, jak byly popsány výše pro P7-1.

Vynálezci vytvořili teorii, že mechanismus antigenní variability, kterému podléhá IP90 P39.5 antigen díky své homologii s vlsE antigeny B31, naznačuje, že tento antigen má zásadní významn pro přežívání spirochet v obratlovci. Proto jsou způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu navrženy tak, aby překonávaly tento obranný mechanismus spirochet imunizací hostitele velkou frakcí epitopů, které jsou exprimovány na kazetovém řetězci, který je zdrojem těchto variací. Toto umožňuje jedinečná skutečnost, že většina tohoto kazetového řetězce je v rámečku. Proto, jak bylo uvedeno výše, obsahuje způsob vakcinace podání několika nebo všech přečištěných proteinů uvedených výše hostiteli, kde uvedené proteiny jsou získány z antigenně nepodobných částí IP90 kazetového řetězce. Viz, například, výsledky získané při podání P7-1 hostiteli, kdy byly indukovány protilátky, které zabíjely spirochety.

Všechny výše uvedené citace a patenty jsou zde uvedeny jako odkazy. Výše uvedený popis zahrnuje různé modifikace a variace předkládaného vynálezu a tyto modifikace a variace budou zřejmé odborníkům v oboru. Takové modifikace a variace prostředků a způsobů podle předkládaného vynálezu patří do rozsahu připojených patentových nároků.

• ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Administrátore of Tulane Educational Fund

Philipp, Mario T.

(ii) Název vynálezu: Povrchové antigeny a proteiny použitelné v prostředcích pro diagnostiku a prevenci Lymské boreliosy (iii) Počet sekvencí: 14 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: Howson and Howson (B) Ulice: Spring House Corporate Cntr., P.O.Box 457 (C) Město: Spring House (D) Stát: Pennsylvania (E) Země: USA (F) ZIP: 19477 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (Ýi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: WO (B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(vii) Předchozí data přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: US 60/051271 (B) Datum podání: 30.6.1997 (viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Bak, Mary E.

(B) Registrační číslo: 31215 (C) Reference/číslo rejstříku: TUL2APCT (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 215-540-9200 (B) Fax: 215-540-5818 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1047 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...1047 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:

AAG AAT

AAT GAT Asn Asp

CAT His 5

GAT Asp

AAT CAT AAG GGG ACT GTT AAG AAT GCT GTT

48

Lys 1

Asn

Asn

His

Lys

Gly 10

Thr

Val

Lys

Asn

Ala 15

Val

GAT

ATG

GCA

AAG

GCC

GCT

GAG

GAA

GCT

GCA

AGT

GCT

GCA

AGT

GCT

GCT

96

Asp

Met

Ala

Lys

Ala

Ala

Glu

Glu

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

20

25

30

ACT

GGT

AAT

GCA

GCG

ATT

GGG

GAT

GTT

GTT

AAG

AAT

AGT

GGG

GCA

GCA

144

Thr

Gly

Asn

Ala

Ala

Ile

Gly

Asp

Val

Val

Lys

Asn

Ser

Gly

Ala

Ala

35

40

45

GCA

AAA

GGT

GGT

GAG

GCG

GCG

AGT

GTT

AAT

GGG

ATT

GCT

AAG

GGG

ATA

192

Ala

Lys

Gly

Gly

Glu

Ala

Ala

Ser

Val

Asn

Gly

Ile

Ala

Lys

Gly

Ile

50

55

60

AAG

GGG

ATT

GTT

GAT

GCT

GCT

GGA

AAG

GCT

GAT

GCG

AAG

GAA

GGG

AAG

240

Lys

Gly

Ile

Val

Asp

Ala

Ala

Gly

Lys

Ala

Asp

Ala

Lys

Glu

Gly

Lys

65

70

75

80

TTG

GAT

GCT

ACT

GGT

GCT

GAG

GGT

ACG

ACT

AAC

GTG

AAT

GCT

GGG

AAG

288

Leu

Asp

Ala

Thr

Gly

Ala

Glu

Gly

Thr

Thr

Asn

Val

Asn

Ala

Gly

Lys

85

90

95

TTG

TTT

GTG

AAG

AGG

GCG

GCT

GAT

GAT

GGT

GGT

GAT

GCA

GAT

GAT

GCT

336

Leu

Phe

Val

Lys

Arg

Ala

Ala

Asp

Asp

Gly

Gly Asp

Ala

Asp

Asp

Ala

100

105

110

GGG

AAG

GCT

GCT

GCT

GCG

GTT

GCT

GCA

AGT

GCT

GCT

ACT

GGT

AAT

GCA

384

Gly

Lys

Ala

Ala

Ala

Ala

Val

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Thr

Gly

Asn

Ala

115

120

125

GCG

ATT

GGA

GAT

GTT

GTT

AAT

GGT

GAT

GTG

GCA

AAA

GCA

AAA

GGT

GGT

432

Ala

Ile

Gly

Asp

Val

Val

Asn

Gly Asp

Val

Ala

Lys

Ala

Lys

Gly

Gly

130

135

140

GAT

GCG

GCG

AGT

GTT

AAT

GGG

ATT

GCT

AAG

GGT

ATA

AAG

GGG

ATT

GTT

480

Asp

Ala

Ala

Ser

Val

Asn

Gly

Ile

Ala

Lys

Gly

Ile

Lys

Gly

Ile

Val

145

150

155

160

GAT

GCT

GCT

GAG

AAG

GCT

GAT

GCG

AAG

GAA

GGG

AAG

TTG

AAT

GCT

GCT

528

Asp

Ala

Ala

Glu

Lys

Ala

Asp

Ala

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Asn

Ala

Ala

165

170

175

GGT

GCT

GAG

GGT

ACG

ACT

AAC

GCG

GAT

GCT

GGG

AAG

TTG

TTT

GTG

AAG

576

Gly

Ala

Glu

Gly

Thr

Thr

Asn

Ala

Asp

Ala

Gly

Lys

Leu

Phe

Val

Lys

180

185

190

AAT

GCT

GGT

AAT

GTG

GGT

GGT

GAA

GCA

GGT

GAT

GCT

GGG

AAG

GCT

GCT

624

Asn

Ala

Gly

Asn

Val

Gly

Gly

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Gly

Lys

Ala

Ala

195 200 205

GCT Ala

GCG Ala 210

GTT GCT

GCT GTT Ala Val

AGT Ser 215

GGG Gly

GAG Glu

CAG ΑΤΑ TTA

AAA GCG ATT

GTT Val

672

Val

Ala

Gin

Ile

Leu 220

Lys Ala

Ile

CAT

GCT

GCT

AAG

GAT

GGT

GGT

GAG

AAG

CAG

GGT

AAG

AAG

GCT

GCG

GAT

720

His

Ala

Ala

Lys

Asp

Gly

Gly

Glu

Lys

Gin

Gly

Lys

Lys

Ala

Ala

Asp

225

230

235

240

CGT

ACA

AAT

CCC

ATT

GAC

GCG

GCT

ATT

GGG

GGT

GCG

GGT

GAT

AAT

GAT

768

Arg

Thr

Asn

Pro

Ile

Asp

Ala

Ala

Ile

Gly

Gly

Ala

Gly

Asp

Asn

Asp

245

250

255

GCT

GCT

GCG

GCG

TTT

GCT

ACT

ATG

AAG

AAG

GAT

GAT

CAG

ATT

GCT

GCT

816

Ala

Ala

Ala

Ala

Phe

Ala

Thr

Met

Lys

Lys

Asp

Asp

Gin

Ile

Ala

Ala

260

265

270

GCT

ATG

GTT

CTG

AGG

GGA

ATG

GCT

AAG

GAT

GGG

CAA

TTT

GCT

TTG

AAG

864

Ala

Met

Val

Leu

Arg

Gly

Met

Ala

Lys

Asp

Gly

Gin

Phe

Ala

Leu

Lys

275

280

285

GAT

GCT

GCT

GCT

GCT

CAT

GAA

GGG

ACT

GTT

AAG

AAT

GCT

GTT

GAT

ATA

912

Asp

Ala

Ala

Ala

Ala

His

Glu

Gly

Thr

Val

Lys

Asn

Ala

Val

Asp

Ile

290

295

300

ATA

AAG

GCT

GCT

GCG

GAA

GCT

GCA

AGT

GCT

GCA

AGT

GCT

GCT

ACT

GGT

960

Ile

Lys

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Thr

Gly

305

310

315

320

AGT

GCA

GCA

ATT

GGG

GAT

GTT

GTT

AAT

GGT

AAT

GGA

GCA

ACA

GCA

AAA

1008

Ser

Ala

Ala

Ile

Gly

Asp

Val

Val

Asn

Gly

Asn

Gly

Ala

Thr

Ala

Lys

325

330

335

GGT

GGT

GAT

GCG

AAG

AGT

GTT

AAT

GGC

ATT

GCT

AAG

GGA

1047

Gly

Gly

Asp

Ala

Lys

Ser

Val

Asn

Gly

Ile

Ala

Lys

Gly

340

345

(2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 349 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2:

Lys Asn Asn Asp His Asp Asn His Lys Gly Thr Val Lys Asn Ala Val

5 10 ¹⁵

Asp Met Ala Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala ^{25 30}

Thr Gly Asn Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Lys Asn Ser Gly Ala Ala 35 40 45

-

Ala

Lys 50

Gly Gly Glu Ala

Ala 55

Ser Val Asn Gly

Ile 60

Ala

Lys

Gly

Ile

Lys

Gly

Ile

Val

Asp

Ala

Ala

Gly

Lys

Ala

Asp

Ala

Lys

Glu

Gly

Lys

•

65

70

75

80

Leu

Asp

Ala

Thr

Gly

Ala

Glu

Gly

Thr

Thr

Asn

Val

Asn

Ala

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Phe

Val

Lys

Arg

Ala

Ala

Asp

Asp

Gly

Gly

Asp

Ala

Asp

Asp

Ala

100

105

110

Gly

Lys

Ala

Ala

Ala

Ala

Val

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Thr

Gly

Asn

Ala

115

120

125

Ala

Ile

Gly Asp

Val

Val

Asn

Gly

Asp

Val

Ala

Lys

Ala

Lys

Gly

Gly

130

135

140

Asp

Ala

Ala

Ser

Val

Asn

Gly

Ile

Ala

Lys

Gly

Ile

Lys

Gly

Ile

Val

145

150

155

160

Asp

Ala

Ala

Glu

Lys

Ala

Asp

Ala

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Asn

Ala

Ala

165

170

175

Gly

Ala

Glu

Gly

Thr

Thr

Asn

Ala

Asp

Ala

Gly

Lys

Leu

Phe

Val

Lys

180

185

190

Asn

Ala

Gly

Asn

Val

Gly

Gly

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Gly

Lys

Ala

Ala

195

200

205

Ala

Ala

Val

Ala

Ala

Val

Ser

Gly

Glu

Gin

Ile

Leu

Lys

Ala

Ile

Val

210

215

220

His

Ala

Ala

Lys

Asp

Gly

Gly

Glu

Lys

Gin

Gly

Lys·

Lys

Ala

Ala

Asp

225

230

235

240

Arg

Thr

Asn

Pro

Ile

Asp

Ala

Ala

Ile

Gly

Gly

Ala

Gly Asp

Asn

Asp

245

250

255

Ala

Ala

Ala

Ala

Phe

Ala

Thr

Met

Lys

Lys

Asp

Asp

Gin

Ile

Ala

Ala

260

265

270

Ala

Met

Val

Leu

Arg

Gly

Met

Ala

Lys

Asp

Gly

Gin

Phe

Ala

Leu

Lys

275

280

285

Asp

Ala

Ala

Ala

Ala

His

Glu

Gly

Thr

Val

Lys

Asn

Ala

Val

Asp

Ile

290

295

300

Ile

Lys

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Thr

Gly

305

310

315

320

Ser

Ala

Ala

Ile

Gly

Asp

Val

Val

Asn

Gly

Asn

Gly

Ala

Thr

Ala

Lys

325

330

335

Gly

Gly

Asp

Ala

Lys

Ser

Val

Asn

Gly

Ile

Ala

Lys

Gly

340 345 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 283 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:

GCCGCTGGAT	GGTGGTGAGA	AGCAGGGTAA	GAAGGCTGCG	GATCGTACAA	ATCCCATTGA	60
CGCGGCTATT	GGGGGTGCGG	GTGATAATGA	TGCTGCTGCG	GCGTTTGCTA	CTATGAAGAA	120
GGATGATCAG	ATTGCTGCTG	CTATGGTTCT	GAGGGGAATG	GCTAAGGATG	GGCAATTTGC	180
TTTGAAGGAT	GCTGCTGCTG	CTCATGAAGG	GACTGTTAAG	AATGCTGTTG	ATATAATAAA	240
GGCTGCTGCG	GAAGCTGCAA	GTGCTGCAAG	TGCTGCTACT	GGT		283

(2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 233 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:

TTTATTATAT CAACAGATTC TTAACAGTCC CTTCATGAGC AGCAGCAGCA TCCTTCAAAG 60

CAAATTGCCC ATCCTTAGCC ATTCCCCTCA GAACCATAGC AGCAGCAATC TGATCATCCT 120

TCTTCATAGT AGCAAACGCC GCAGCAGCAT CATTATCACC CGCACCCCCA ATAGCCGCGT 180

CAATCGGATT TGTACGATCC GCAGCCTTCT TACCCTGCTT CTCACCACCA TCC

233 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 194 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:

CCGTGCAAGC	TGGGTTGAAG	AAGGTTGGGG	ATGTTGTTAA	GAA.TAGTGAG	GCAAAAGATG	60
GTGATGCGGC	GAGTGTTAAT	GGGATTGCTA	AGGGGATAAA	GGGGATTGTT	GATGCTGCTG	120
AGAAGGCTGA	TGCGAAGGAA	GGGAAGTTGG	TATGTGGCTG	GTGCTGCTGG	TGAAACTAAC	180
AAGGAAGCGG	CCGC					194

(2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 369 párii basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

GCGGCCGCTT	GAGGAAGCTG	CAAGTGCTGC	AAGTGCTGCT	ACTGGTAATG	CAGCGATTGG	60
GGATGTTGTT	AAGAATAGTG	GGGCAGCAGC	AAAAGGTGGT	GAGGCGGCGA	GTGTTAATGG	120
GATTGCTAAG	GGGATAAAGG	GGATTGTTGA	TGCTGCTGGA	AAGGCTGATG	CGAAGGAAGG	180
GAAGTTGGAT	GCTACTGGTG	CTGAGGGTAC	GACTAACGTG	AATGCTGGGA	AGTTGTTTGT	240
GAAGAGGGCG	GCTGATGATG	GTGGTGATGC	AGATGATGCT	GGGAAGGCTG	CTGCTGCGGT	300
TGCTGCAAGT	GCTGCTACTG	GTAATGCAGC	GATTGGAGAT	GTTGTTAATG	GTGATGTGGC	360

AAAACAAAA

369 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 142 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

AAGGATGGTG ATGATAAGCA GGGTAAGAAG GCTGAGGATG CTACAAATCC GATTGACGCG 60

GCTATTGGGG GTGCAGGTGC GGGTGCTAAT GCTGCTGCGG CGTTTAATAA TATGAAGAAG 120

GATGATCAGA TTGAGCGGCC GC ¹⁴² (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 210 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

GGTGAAACTA ACAAGGATGC TGGGAAGTTG TTTGTGAAGA AGAATGGTGA TGATGGTGGT 60

GATGCAGGTG ATGCTGGGAA GGCTGCTGCT GCGGTTGCTG CTGTTAGTGG GGAGCAGATA 120

TTAAAAGCGA TTGTTGATGC TGCTAAAGAT GGTGATAAGA CGGGGGTTAC TGATGTAAAG 180

GATGCTACAA ATCCGATTGA CGCGGCTATT 210 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 236 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

TATATAATAA AGGCTGCTGC GAAGCTGCAA GTGCTGCAAG TGCTGCTACT	GGTAGTGCAG	60
CAATTGGGGA TGTTGTTAAT GGTAATGGAG CAACAGCAAA AGGTGGTGAT	GCGAAGTGTT	120
AATGGGATTG CTAAGGGGAT AAAGGGGATT GTTGATGCTG CTGAGAAGGC	TGATGCGAAG	180
GAAGGGAAGT TGGATGTGGC TGGTGATGCT GGTGAAACTA ACAAGGAAGC	GGCCGC	236

(2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 199 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

ATGAGAGGAT CTCATCACCA TCACCATCAC ACGGATCCCC CGGGCTGCAG GAATTCGCGG 60

CCGCTGAAGG CTGATGCGAA GGAAGGGAAG TTGGATGTGG CTGGTGCTGC TGGTGAAACT 120

AACAAGGATG CTGGGAAGTT GTTTGTGAAG AAGAATAATG AGGGTGGTGA AGCAAATGAT 18 0

GCTGGGAAGG CTGCTGCTG 199 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 272 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

GCCGCTGGAT GATCAGATTG CTGCTGCTAT GGTTGTGAGG GGAATGGCTA AGGATGGGCA GTTTGCTTTG AAGGATGATG CTGCTAAGGA TGGAGATAAA ACGGGGGTTG CTGCGGATGT GAAAATCCGA TTGACGCGGC TATTGGGGGT GCGGATGCTG ATGCTGCGGC GTTTAATAAG GAGGGGATGA AGAAGGATGA TCAGATTGCT GCTGCTATGG TTCTGAGGGG AATGGCTAAG

GATGGGCAGT TTGCTTTGAC GAATAATGCT GC (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 289 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

ACTGTTAAGA ATGCTGTTGA TATAATAAAG GCTGCTGCGG AAGCTGCAAG TGCTGCAAGT

GCTGCTACTG GTAGTGCAGC AATTGGGGAT GTTGTTAATG GTAATGGAGC AACAGCAAAA

GGTGGTGATG CGAAGAGTGT TAATGGGATT GCTAAGGGGA TAAAGGGGAT TGTTGATGCT

GCTGAGAAGG CTGATGCGAA GGAAGGGAAG TTGGATGTGG CTGGTGATGC TGGTGAAACT

AACAAGGATG CTGGGAAGTT GTTTGTGAAG AACAATGGTA ATGAGGGTA

120

180

240

272

120

180

240

289 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 142 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 2...142

(xi)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

13

G CCG

CTT

ACA AAT

CCG ATT GAC

GCG

GCT

ATT

GGG

GGG

AGT

GCG

GAT

46

Pro

Leu

Thr Asn

Pro Ile Asp

Ala

Ala

Ile

Gly

Gly

Ser

Ala

Asp

1

5

10

15

CGT AAT GCT GAG GCG Arg Asn Ala Glu Ala

TTT Phe

GAT AAG ATG

AAG Lys 25

AAG GAT GAT

CAG ATT

GCT Ala

94

Asp Lys

Met

Lys

Asp

Asp

Gin

Ile 30

20

GCT

GCT

ATG

GTT

CTG

AGG

GGA

ATG

GCT

AAG

GAT

GGG

CAG

TTT

GCT

TTG

142

Ala

Ala

Met

Val

Leu

Arg

Gly

Met

Ala

Lys

Asp

Gly

Gin

Phe

Ala

Leu

35

40

45

(2) Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 47 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 14:

Pro 1

Leu

Thr

Asn

Pro 5

Ile

Asp

Ala

Ala

Ile 10

Gly

Gly

Ser

Ala

Asp Arg 15

Asn

Ala

Glu

Ala 20

Phe

Asp

Lys

Met

Lys 25

Lys

Asp

Asp

Gin

Ile 30

Ala Ala

Ala

Met

Val 35

Leu

Arg

Gly

Met

Ala 40

Lys

Asp

Gly

Gin

Phe 45

Ala

Leu

Claims (65)

1. Sekvence nukleové kyseliny kódující P39 která je izolována od buněčných materiálů, v přirozeném stavu.

5 nebo jeho fragment, se kterými je spojena

2. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 1, která má ATCC přírůstkové č. 98478.

3. Sekvence nukleové kyseliny kódující P39.5 nebo jeho fragment, která je vybraná ze skupiny skládající se z:

(a) SEQ ID NO: i; (b) SEQ ID NO: 3; (c) SEQ ID NO: 4; (d) SEQ ID NO: 5; (e) SEQ ID NO: 6; (f) SEQ ID NO: 7; (g) SEQ ID NO: 8; (h) SEQ ID NO: 9; (i) SEQ ID NO: 10; (j) SEQ ID NO: 11; (k) SEQ ID NO: 12; (1) SEQ ID NO: 13;

(m) sekvence, která hybridizuje na jakoukoliv ze sekvencí (a) až (1) za přísných podmínek hybridizace;

(n) alelická varianta jakékoliv ze sekvencí (a) až (m);

(o) fragment jakékoliv ze sekvencí (a) až (m);

(p) deleční mutant sekvence (a).

4. Izolovaný P39.5 protein, který je exprimován in vitro Borrelia spirochetami a který má relativní molekulovou hmotnost 39500 daltonů.

• ·

Ίξ,

9 99 9

5. Protein podle nároku 4, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z:

(a) SEQ ID NO: 2;

(b) SEQ ID NO: 13;

(c) fragmentu sekvence (a) nebo (b);

(d) analogu (a) nebo (b) charakterizovaného tím, že má alespoň 80% homologii se SEQ ID NO: 2 nebo 14; a (e) homologu (a) nebo (b) charakterizovaného tím, že má alespoň 80% homologii se SEQ ID NO: 2 nebo 14.

6. Rekombinantní protein vybraný ze skupiny skládající se z:

(a) proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo 14 nebo jeho analogu, homologu nebo fragmentu;

(b) fúsního proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo 14 nebo její analog, homolog nebo fragment fušovaný na druhý protein;

(c) fúsního proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo 14, na kterou jsou přidány fragmenty mající až 95% identitu se SEQ ID NO: 2 nebo 14.

(d) delečního proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo 14 s delecí jedné nebo více aminokyselin.

7. Vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující P39.5 nebo jeho fragment pod kontrolou vhodných regulačních sekvencí.

8. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 7.

9. Způsob rekombinantní exprese genu pro P39.5 nebo jeho fragmentu vyznačující se tím, že obsahuje krok kultivace rekombinantních hostitelských buněk transformovaných sekvencí nukleové kyseliny pro P39.5 nebo její fragment za podmínek umožňujících expresi genu.

9 » ·♦ ·♦ II

10. Způsob rekombinantní exprese P39.5 proteinu nebo jeho polypeptidového nebo peptidového fragmentu vyznačuj ící se t í m, že obsahuje krok kultivace rekombinantních hostitelských buněk transformovaných sekvencí nukleové kyseliny kódující uvedený protein nebo fragment za podmínek umožňujících expresi proteinu nebo peptidu.

11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok izolace uvedeného exprimovaného proteinu z uvedených buněk nebo uvedeného buněčného media.

12. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedený P39.5 protein je fúsní protein.

13. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedený P39.5 protein je deleční mutantní protein.

14. Způsob přípravy P39.5 proteinu nebo jeho fragmentu vyznačující se tím, že obsahuje chemickou syntézu uvedeného proteinu nebo jeho fragmentu.

15. Diagnostické činidlo vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny vybranou ze skupiny skládaj ící se z:

(a) sekvence nukleové kyseliny kódující P39.5, která je izolovaná od buněčného materiálu, se kterým je v přirozeném stavu asociována;

(b) SEQ ID NO: 1 nebo sekvence komplementární k této sekvenci; (c) SEQ ID NO: 3 nebo sekvence komplementární k této sekvenci; (d) SEQ ID NO: 4 nebo sekvence komplementární k této sekvenci; (e) SEQ ID NO: 5 nebo sekvence komplementární k této sekvenci; (f) SEQ ID NO: 6 nebo sekvence komplementární k této sekvenci; (g) SEQ ID NO: 7 nebo sekvence komplementární k této sekvenci;

«< ·9 ·· ·· • « · « ···· • · » · ·

(h) SEQ ID NO: 8 nebo sekvence : komplementární : k této ; sekvenci; (i) SEQ ID NO: 9 nebo sekvence : komplementární : k této í sekvenci; (j) SEQ ID NO: 10 nebo sekvence komplementární k této sekvenci; (1) SEQ ID NO: 11 nebo sekvence komplementární k této sekvenci; (m) SEQ ID NO: 12 nebo sekvence kompl ement ární k této sekvenci; (n) SEQ ID NO: 13 nebo sekvence komplementární k této sekvenci;

(ο) sekvence, která hybridizuje na jakoukoliv ze sekvencí (a) až (n) za přísných podmínek hybridizace;

(p) alelická varianta jakékoliv ze sekvencí (a) až (o) ;

(q) fragment jakékoliv ze sekvencí (a) až (o) mající délku alespoň 15 nukleotidů;

(r) deleční mutant sekvence (a), (b) nebo (n); a (s) sekvence kódující P39.5 nebo její fragment fúsované na sekvenci kódující druhý protein;

a detekovatelnou sondu navázanou na uvedené sekvence.

16. Izolovaná protilátka proti P39.5 nebo jeho fragmentu.

17. Protilátka podle nároku 16 připravená tak, že protein nebo fragment vybraný ze skupiny skládající se z P39.5, P7-1, Pl-1, P3-1, P6-1, P9-1 a P12-1 je podán obratlovci, kde uvedená protilátka je schopna zabíjení IP90 spirochet in vitro prostřednictvím komplementem zprostředkovaného zabíjení závislého na protilátkách.

18. Protilátka podle nároku 16 izolovaná imunizací uvedeného hostitele proteinem podle nároku 6.

19. Protilátka podle nároku 16 vybraná ze skupiny skládající se z chimérické protilátky, humanizované protilátky, monoklonální protilátky a polyklonální protilátky.

20. Protilátka izolovaná afinitním přečištěním antiséra získaného • · • · · · během infekce opic makak rhesus JDI spirochetami, za použití P39.5 proteinu Borrelia nebo jeho fragmentu jako imunoabsorbens.

21. Antiidiotypová protilátka specifická pro protilátku podle nároku 16.

22. Diagnostické činidlo vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 16 a detekovatelnou sondu.

23. Vakcinační prostředek vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství P39.5 proteinu, fúsního proteinu nebo jeho fragmentu, a farmaceuticky přijatelný nosič.

24. Prostředek podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedený fragment je vybrán ze skupiny skládající se z P7-1, Pl-1, P6-1, P9-1 a P12-1.

25. Prostředek podle nároku 23 vyznačuj ící se tím, že obsahuje alespoň jeden jiný antigen B. burgdorferi nebo jeho fragment.

26. Prostředek podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedený druhý antigen je vybrán ze skupiny skládající se z OspA, OspB, OspC, BmpA, BmpB, BmpC, BmpD a jejich fragmentů a variant.

27. Prostředek podle nároku 23 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden další protein nebo jeho fragment, který má sekvenci homologickou se sekvencí P39.5 nebo jeho fragmentu.

28. Prostředek podle nároku 23 vyznačující se tím, že obsahuje směs jednotlivých proteinů.

29. Prostředek podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedený P39.5 protein nebo jeho fragment a uvedený jiný , antigen jsou ve formě fúsního proteinu.

30. Způsob vakcinace lidí nebo zvířat proti Lymské nemoci vyznačující se tím, že uvedeným lidem nebo zvířatům se podá prostředek obsahující účinné množství prostředku podle nároku 23.

31. Způsob diagnostiky Lymské borreliosy u lidí nebo zvířat vyznačující se tím, že obsahuje kroky inkubace anti-P7-l nebo anti-P39.5 antigenů nebo jeho homologu s vzorkem biologické tekutiny od člověka nebo zvířete, u kterého má být provedena diagnostika, při které se v přítomnosti B. burgdorferi tvoří komplex antigen-protilátka, a potom analyzování uvedeného vzorku tekutin na přítomnost uvedeného komplexu.

32. Terapeutický prostředek použitelný v léčbě lidí nebo zvířat s Lymskou nemocí vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu anti-P39.5 nebo anti-P7-l protilátku a vhodný farmaceutický nosič.

33. Způsob léčby Lymské nemoci u obratlovců vyznačuj ící se t i m, že obsahuje podání účinného množství prostředku podle nároku 32.

34. Kit pro diagnostiku infekce B. burgdorferi u lidí nebo zvířat vyznačující se tím, že obsahuje P39.5 protein nebo jeho fragment nebo anti-P39.5 protilátku podle nároku 16.

35. Vakcina použitelná v profylaxi Lymské nemoci vyznačující se tím, že obsahuje povrchový antigen, který je exprimován spirochetou při její přítomnosti v • · obratlovci.

36. Způsob identifikace sloučenin, které se specificky váží na P39.5 nebo jeho fragment vyznačující se tím, že obsahuje kroky kontaktování uvedeného P39.5 proteinu nebo jeho fragmentu s testovanou sloučeninou a umožnění vazby testované sloučenina na P39.5; a určení množství testované sloučeniny, která se navázala na P39.5.

37. Sloučenina identifikovaná způsobem podle nároku 36.

38. Sekvence nukleové kyseliny kódující protein kazetového řetězce Borrelia nebo jeho fragment, která je izolována od buněčných materiálů, se kterými je spojena v přirozeném stavu a která je vybrána ze skupiny skládající se z 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 a 12-1.

39. Protein kazetového řetězce Borrelia nebo jeho fragment, který je izolován od buněčných materiálů, se kterými je spojen v přirozeném stavu a který je vybrán ze skupiny skládající se z Pl-i, P3-1, P6-1, Py-i a P12-1.

40. Vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující protein kazetového řetězce Borrelia nebo jeho fragment pod kontrolou vhodných regulačních sekvencí.

41. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 40.

42. Způsob rekombinantní exprese genu pro protein kazetového řetězce Borrelia nebo jeho fragmentu vyznačující se tím, že obsahuje krok kultivace rekombinantních hostitelských buněk transformovaných sekvencí nukleové kyseliny kazetového řetězce B. garinii nebo jejím fragmentem za podmínek umožňujících expresi uvedené sekvence.

43. Způsob rekombinantní exprese proteinu kazetového řetězce B. garinii nebo jeho peptidového fragmentu vyznačuj ící se t í m, že obsahuje krok kultivace rekombinantních hostitelských buněk transformovaných sekvencí nukleové kyseliny kódující uvedený protein nebo jeho fragment za podmínek umožňujících expresi proteinu nebo peptidu.

44. Způsob podle nároku 43 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok izolace uvedeného exprimovaného proteinu z uvedených buněk nebo uvedeného buněčného media.

45. Způsob podle nároku 43 vyznačující se tím, že uvedený protein kazetového řetězce Borrelia je fúsní protein nebo deleční mutantní protein.

46. Způsob přípravy proteinu kazetového řetězce B. garinii nebo jeho peptidového fragmentu vyznačující se tím, že obsahuje chemickou syntézu uvedeného proteinu nebo jeho f ragmentu.

47. Izolovaná protilátka proti proteinu kazetového řetězce B. garinii.

48. Protilátka podle nároku 47 připravená tak, že protein kazetového řetězce B. garinii nebo fragment je podán obratlovci.

49. Protilátka podle nároku 48 izolovaná afinitním přečištěním antiséra získaného během infekce opic makak rhesus JDI spirochetami, za použití proteinu kazetového řetězce Borrelia j ako imunoabsorbens.

50. Protilátka podle nároku 47 izolovaná imunizací uvedeného hostitele proteinem podle nároku 39 nebo směsí proteinů uvedeného kazetového řetězce.

51. Protilátka podle nároku 47 vybraná ze skupiny skládající se z chimérické protilátky, humanizované protilátky, monoklonální protilátky a polyklonální protilátky.

52. Antiidiotypová protilátka specifická pro protilátku podle nároku 47.

53. Diagnostické činidlo vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 47 a detekovatelnou sondu.

54. Vakcinační prostředek vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství alespoň jednoho proteinu kazetového řetězce Borrelia, fúsního proteinu nebo jeho fragmentu, a farmaceuticky přijatelný nosič.

55. Prostředek podle nároku 54 vyznačující se tím, že obsahuje směs různých proteinů kazetového řetězce Borrelia nebo jejich fragmentů.

56. Prostředek podle nároku 54 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden jiný antigen B. burgdorferi nebo jeho f ragment.

57. Prostředek podle nároku 56 vyznačující se tím, že uvedený druhý antigen je vybrán ze skupiny skládající se z OspA, OspB, OspC, BmpA, BmpB, BmpC, BmpD a jejich fragmentů a variant.

58. Prostředek podle nároku 54 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden další protein nebo jeho fragment, kterýma sekvenci homologickou se sekvencí P39.5.

59. Způsob vakcinace lidí nebo zvířat proti Lymské nemoci vyznačující se tím, že uvedeným lidem nebo zvířatům se podá prostředek obsahující účinné množství prostředku podle nároku 54.

60. Způsob diagnostiky Lymské borreliosy u lidí nebo zvířat vyznačující se tím, že obsahuje kroky inkubace protilátky proti proteinu kazetového řetězce Borrelia se vzorkem biologické tekutiny od člověka nebo zvířete, u kterého má být provedena diagnostika, při které se v přítomnosti B. burgdorferi tvoří komplex antigen-protilátka, a potom analyzování uvedeného vzorku tekutin na přítomnost uvedeného komplexu.

61. Terapeutický prostředek použitelný v léčbě lidí nebo zvířat s Lymskou nemocí vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu protilátku proti proteinu kazetového řetězce Borrelia, nebo fragment takové protilátky, a vhodný farmaceutický nosič.

62. Způsob léčby Lymské nemoci u obratlovců vyznačuj ící se t i m, že obsahuje podání účinného množství prostředku podle nároku 61.

63. Kit pro diagnostiku infekce B. burgdorferi u lidí nebo zvířat vyznačující se tím, že obsahuje protein kazetového řetězce Borrelia nebo protilátku proti takovému proteinu.

64. Způsob identifikace sloučenin, které se specificky váží na protein kazetového řetězce Borrelia nebo jeho fragment vyznačující se tím, že obsahuje kroky kontaktování uvedeného proteinu nebo jeho fragmentu s testovanou sloučeninou a umožnění vazby testované sloučeniny na protein kazetového řetězce Borrelia nebo jeho fragment; a určení množství testované sloučeniny, která se navázala na uvedený protein nebo fragment.

65. Sloučenina identifikovaná způsobem podle nároku 64.

• · · • · ·

1/6 ► · · ’ ' py průměrné % usmrcených spirochet