ES2276474T3 - Peptidos metilados, homologos del smd, que reaccionan con los anticuerpos de los sueros de seres vivos afectados con lupus eritematoso sistemico. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA OBTENER CIERTOS PEPTIDOS QUE CONTIENEN ARGININAS METILADAS, QUE VAN SEGUIDAS POR UN RESIDUO DE GLICINA, Y QUE CONSTITUYEN DETERMINANTES INMUNOGENICOS DE ANTICUERPOS PRESENTES EN LOS SUEROS DE PACIENTES CON LUPUS ERYTHEMATOSUS SISTEMICO, O EL VIRUS DE EPSTEIN - BARR, Y CARACTERIZADO PORQUE LA METILACION ES REQUISITO PREVIO PARA LA REACCION CON DICHOS ANTICUERPOS. LA INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE AL USO DE LOS CITADOS PEPTIDOS PARA EL DIAGNOSTICO Y EL TRATAMIENTO DEL LUPUS ERYTHEMATOSUS SISTEMICO Y ENFERMEDADES RELACIONADAS, ASI COMO DE ENFERMEDADES EN LAS QUE ESTE IMPLICADO EL VIRUS DE EPSTEIN - BARR.

Description

Péptidos metilados, homólogos del SmD, que reaccionan con los anticuerpos de los sueros de seres vivos afectados con lupus eritematoso sistémico.

La presente invención se refiere a un método para producir ciertos péptidos que contienen argininas metiladas que son seguidas por un residuo de glicina y que constituyen determinantes inmunogénicos de los anticuerpos presentes en los sueros de pacientes con lupus eritematoso sistémico, donde la metilación es un requisito previo para la reacción con dichos anticuerpos. La invención también se refiere al uso de dichos péptidos para el diagnóstico del lupus eritematoso sistémico.

Antecedentes de la invención

El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune, en la cual el paciente desarrolla anticuerpos que reaccionan con muchos tejidos de su propio cuerpo. Los anticuerpos dominantes son dirigidos contra componentes del núcleo celular, con epítopes que pueden ser encontrados en el ADN, y en proteínas que constituyen pequeñas partículas de ribonucleoproteínas (snRNPs).

La primera prueba de laboratorio diseñada para esta enfermedad fue la prueba celular de LE (lupus eritematoso). Esta prueba tiene que ser repetida muchas veces, antes de que resulte en una reacción positiva en aproximadamente 90% de las personas con lupus eritematoso sistémico. La prueba celular de LE, tampoco, es específica para el lupus, y puede ser positiva en hasta el 20% de las personas con artritis reumatoide, en algunos pacientes con otras condiciones reumáticas como el síndrome de Sjögren o esclerodermia, en pacientes con hepatopatías, y en personas que toman medicamentos como hidralacina y procainamida. La prueba ANA, que detecta anticuerpos contra antígenos nucleares, es más específica para el lupus que la prueba LE, y es positiva en muchos pacientes que padecen de lupus eritematoso sistémico. Al igual que ocurre con la prueba de LE, una ANA positiva no es diagnóstico de lupus debido a que la prueba también puede ser positiva en personas con esclerodermia, dermatomiositis, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren, en pacientes tratados con ciertos medicamentos, o en pacientes padeciendo de mononucleosis infecciosa, hepatopatías, malaria, etc.

Por estas razones y debido a que las pruebas añadidas son costosas, han sido desarrolladas nuevas pruebas que son muy útiles en el diagnóstico del SLE. Estas incluyen la prueba de anticuerpo anti-ADN, la prueba de anticuerpo anti-Sm, la prueba de anticuerpo anti-RNP, la prueba de anticuerpo anti-Ro, y las pruebas que miden los niveles de complemento del suero. Con frecuencia, el diagnóstico correcto dependerá de la interpretación de muchas pruebas y síntomas separados.

El antígeno Sm es una estructura macromolecular compleja que consiste en 8 proteínas (B, B', D1, D2, D3, E, F, G) asociadas a las series U de pequeñas moléculas de ARN. El SmBB' y el SmD son considerados los principales componentes antigénicos del complejo (para consulta vea S.O. Hoch. 1989). Sin embargo el SmBB' muestra reactividad cruzada con los anticuerpos anti-RNP, por consiguiente el SmD es considerado el autoantígeno más específico para Sm (W.J. van Venrooij y otros, 1991).

El ADNc del SmD ha sido aislado a partir de una biblioteca de linfocitos B humanos con sondas de oligonucleótidos sintéticos, diseñadas sobre la base de la secuencia N terminal del SmD (Rokeach y otros, 1988). Posteriormente, fue mostrado que el producto de transcripción in vitro podría ser inmunoprecipitado por IgG anti-Sm. Desde entonces la proteína D ha sido caracterizada bien como un doblete denominado D y D' (Andersen y otros, 1990) o como tres polipéptidos denominados D1 (16 kDa), D2 (16.5 kDa) y D3 (18 kDa) (Lehmeier y otros, 1990), siendo D1 idéntica al SmD clonado por Rokeach y otros (1988). La secuencia de D2 y D3 es sustancialmente diferente de D1.

Durante años, diferentes grupos de investigación han informado sobre el uso del SmD recombinante y de péptidos derivados del SmD y han publicado datos contradictorios. Rokeach y otros (1992a) expresaron SmD1 en E. coli y en S. cerivisiae, pero en contraste con la reactividad del SmD natural de las células HeLa, la mayoría de los sueros anti-SmD de pacientes limita el SmD1 recombinante a un nivel no significativamente mayor que el del suero humano normal. No obstante, el mismo grupo (Rokeach y otros, 1992b) ha realizado el mapeo del epítope basado en múltiples funciones entre el gen TrpE y los fragmentos de la secuencia que codifica el SmD, expresados en E. coli. Surgieron dos patrones de reactividad anti-Sm: epítopes discontinuos fueron encontrados dispersos por todo el antígeno, y un epítope dominante fue localizado en el término C, desde el aminoácido 87 hasta el 119 (Rokeach y otros, 1992b). Hiepe y otros describieron péptidos SmD comprendiendo 35-45 AA que son capaces de aglutinar auto-anticuerpos debido a la formación de un epítope conformacional (EP 0776906 A). Usando péptidos sintéticos, Barakat y otros (1990) demostraron que el término N (péptido 1-20) y el péptido 44-67 podrían ser usados como una sonda valiosa para el diagnóstico del SLE a pesar de que sus resultados no coincidieron con la reactividad anti-SmD obtenida por el ensayo tradicional (patente EP-B-0491014). Usando una estrategia similar, Sabbatini y otros (1993a) han identificado un epítope dominante en la región C terminal del SmD1 (aa95-aa119) que confirma los resultados de Rokeach y otros (1992b), pero oponiéndose a los resultados obtenidos por Barakat y otros (1990). El trabajo más reciente sobre el mapeo del epítope del SmD1 por medio de péptidos sintéticos (James y otros 1994) mostró que 8 de 9 sueros SmD positivos (positivos a la precipitina) son reactivos con los octapéptidos 92-112l que abarcan la secuencia. Un epítope adicional, claramente reactivo con 7 de 9 sueros SmD positivos fue colocado en la región del aminoácido 82-90. Finalmente, un epítope similar al del SmD fue identificado recientemente por Rivkin y otros (1994) y consiste en una repetición (homóloga al término C) del dipéptido (Gly-Arg)_{9}. En contraste con la especificidad al SLE de los anticuerpos anti-Sm, el epítope definido es reconocido también por pacientes con otras enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjögren). La proteína de fusión \beta-galactosidasa en E. coli del epítope mencionado anteriormente fue reactiva con 35% de los sueros del SLE, pero solo 6 de esos 32 sueros positivos fueron reactivos con la proteína SmD natural indicando que la proteína de fusión es menos específica que la proteína SmD natural. Viceversa, solo cuatro de los ocho sueros de SmD reaccionaron con la proteína de fusión. Sin embargo, debería ser señalado que el SmD fue expresado también como una proteína de fusión \beta-galactosidasa completa en E. coli (Wagatsuma y otros 1993), pero que ese antígeno SmD recombinante no fue reconocido por los sueros de los pacientes, a pesar de que todos los sueros reconocieron el antígeno Sm natural de 16 kDa en el Western blot.

En conclusión, ninguno de los péptidos sintéticos descritos ni la proteína recombinante completa o partes de la molécula resultaron en una inmunoreactividad idéntica a la reactividad obtenida con el SmD natural.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar péptidos que tienen una gran reactividad para los anticuerpos presentes en sueros de pacientes con lupus eritematoso sistémico.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para obtener dichos péptidos.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos de generación de anticuerpos específicamente reactivos con péptidos de dichos péptidos, imitando así a dichos péptidos.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para generar anticuerpos anti-idiotipo específicamente reactivos con los anticuerpos antes mencionados.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un kit diagnóstico para el lupus eritematoso sistémico.

Todos estos objetivos de la presente invención son alcanzados por las siguientes realizaciones de la presente invención.

De acuerdo con su realización principal la presente invención se refiere a péptidos que contienen menos de 50 aminoácidos, que comprenden al menos un dímero del tipo XG, donde la X representa un residuo de arginina metilada, y que es capaz de reaccionar con anticuerpos, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dichos anticuerpos, y donde dichos anticuerpos están presentes en sueros de pacientes con lupus eritematoso sistémico, o mononucleosis infecciosa, recurrente o crónica, o ciertos cánceres que están relacionados con la infección con virus de Epstein-Barr, tal como el linfoma de Burkitt o el carcinoma nasofaríngeo.

De acuerdo con otra realización la presente invención también se refiere a un péptido y/o una estructura química que comprende cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente, fusionado a una molécula de enlace. La presente invención se refiere también a péptidos que comprenden y/o consisten en repeticiones tándem de al menos dos de cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente, o péptidos ramificados que comprenden al menos uno de los péptidos mencionados anteriormente.

De acuerdo con una realización más específica la presente invención se refiere a un método para producir cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente, por síntesis química clásica, donde las argininas metiladas son sustituidas por residuos de argininas no metiladas en ciertos pasos durante la síntesis química. La presente invención se refiere también a métodos para producir cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente, donde la secuencia primaria de aminoácido es producida por síntesis química clásica, y donde los residuos de arginina que preceden a los residuos de glicina son metilados posteriormente contactando dichos péptidos con una proteína arginina metiltransferasa. La presente invención también se refiere a un método para la producción de cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente que comprende los siguientes pasos: (i) transformar un hospedero celular apropiado con un vector recombinante en el que es insertado un ácido polinucleico que comprende la secuencia que codifica para dicho péptido bajo el control de los elementos reguladores apropiados de forma tal que dicho péptido o una proteína que comprende dicho péptido sea expresado y/o segregado, (ii) cultivar dicho hospedero celular transformado en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína o dicho péptido y que permitan una metilación parcial u óptima de las argininas presentes en dicho péptido, y (iii) cosechar dicho péptido. La presente invención también se refiere a un método para producir cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente que comprende los siguientes pasos: (i) transformar un hospedero celular apropiado con un vector recombinante en el que es insertado un ácido polinucleico que comprende la secuencia que codifica para dicho péptido bajo el control de los elementos reguladores apropiados de forma tal que dicho péptido o una proteína que comprende dicho péptido sea expresado y/o segregado, (ii) cultivar dicho hospedero celular transformado en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína o dicho péptido, (iii) cosechar dicha proteína o dicho péptido, y (iv) metilar los residuos de arginina de dicha proteína o de dicho péptido contactando con una proteína arginina metiltransferasa. De acuerdo con una realización más específica la presente invención también se refiere a cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, donde dicha célula hospedera es un hospedero bacteriano o levadura o cualquier otra célula hospedera eucariota la cual es transformada preferiblemente con un báculovirus recombinante.

De acuerdo con una realización preferida la presente invención también se refiere a un anticuerpo desarrollado después de la inmunización con cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente, con dicho anticuerpo siendo específicamente reactivo con las formas metiladas de dicho péptido, y con dicho anticuerpo siendo preferiblemente un anticuerpo monoclonal. La presente invención también se refiere a un anticuerpo anti-idiotipo desarrollado después de la inmunización con cualquier anticuerpo como es definido anteriormente, con dicho anticuerpo anti-idiotipo siendo específicamente reactivo con dicho anticuerpo, imitando así la forma metilatada de cualquier péptido mencionado anteriormente, y con dicho anticuerpo siendo preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

De acuerdo con una realización más específica la presente invención también se refiere a una molécula de inmunotoxina que comprende y/o que consiste en una molécula de reconocimiento celular siendo un péptido como el definido anteriormente, o un anticuerpo como el definido anteriormente, unido covalentemente a la molécula de toxina o un fragmento activo de la misma.

La presente invención también se refiere a un kit diagnóstico para ser usado en la detección del lupus eritematoso sistémico, donde dicho kit comprende al menos uno de los péptidos o anticuerpos mencionados anteriormente, y con dicho péptido o anticuerpo estando posiblemente unido a un soporte sólido. Más preferiblemente dicho kit está comprendiendo un rango de dichos péptidos o dichos anticuerpos, posiblemente en combinación con SmD1 o SmD3 o Sm69 natural metilada y SmD1 o SmD3 o Sm69 recombinante no metilada, donde dichos péptidos son añadidos en lugares específicos en un substrato sólido. Más preferiblemente dicho soporte sólido es una banda membranosa y dichos polilpéptidos son acoplados a la membrana en forma de líneas paralelas. Tiene que ser entendido que ciertos péptidos, o anticuerpos como los definidos con anterioridad, alternativamente, no están unidos a un soporte sólido sino que son proporcionados en la solución aglutinante para ser usados como competidores y/o para bloquear otros anticuerpos que están presentes en los sueros de pacientes con enfermedades autoinmunes que no sean el SLE, disminuyendo o eliminando así la posible reacción cruzada y/o unión inespecífica.

Hemos demostrado por primera vez que modificaciones secundarias bien definidas (en su mayoría N^{G},N^{G}-dimetilarginina) están presentes en los residuos de Arg del péptido C terminal, que están seguidos por un residuo de glicina. Además, hemos obtenido evidencias de que el péptido C terminal solo puede mostrar una inmunoreactividad casi idéntica a la inmunoreactividad del SmD natural, si estos residuos de arginina son metilados. Estas dimetilargininas presentes en las nueve posiciones Arg del término C, han sido demostradas por primera vez en la molécula del SmD1 natural. En el SmD2 no fue recuperada dimetilarginina mientras en el término C del SmD3 los cuatro motivos RG en el término C fueron encontrados nuevamente siendo dimetilados.

El aminoácido N^{G},N^{G}-dimetilarginina es el resultado de una modificación post-translacional que parece ocurrir predominantemente en las proteínas de unión al ARN (Najbauer, 1933). Estas proteínas nucleares son modificadas enzimáticamente por una proteína nuclear metilasa l (S-adenosil-metionina: proteína-arginina N-metiltransferasa, E.C.2.1.1.23; Rajpurohit, y otros, 1994). La especificidad estructural de esta enzima parece ser un péptido que contiene arginina con glicina en la posición de flanqueo C como fue mostrado mediante la evaluación de substrato con péptidos sintéticos (Rawal, 1995). No obstante, en el mismo estudio fue demostrado que la molécula completa también desempeña un papel importante aunque muy desconocido en el proceso de metilación. De manera interesante, este proceso de metilación celular puede ser imitado in vitro con metilasa 1 purificada como fue ilustrado con la proteína de RNP nuclear heterogénea recombinante A1 (Rajpurohit, y otros 1994).

A partir de nuestros resultados, podemos de esta forma concluir que en la inmunoreactividad del SmD, están involucrados al menos 2 epítopes. Uno de los epítopes aparentemente está presente en la molécula del SmD1 recombinante y no puede ser asignado a un epítope linear (mapeo del epítope del SmD1 recombinante de E. coli, datos no mostrados). Esto concuerda con el epítope discontinuo descrito por Rokeach y otros (1992b). El epítope localizado en el término C por mapeo del epítope con fragmentos de fusión de E. coli (Rokeach y otros, 1992b; Rivkin y otros, 1994) y con péptidos sintéticos (Sabbatini y otros, 1993a; James y otros, 1994) bien podría ser explicado por el trabajo de Rivkin y otros (1994). El último grupo ha demostrado que una repetición del dipéptido (Gly-Arg)_{9} es reconocido por el 35% de los sueros de pacientes de SLE pero también por el 15% de los sueros de otras enfermedades autoinmunes. Este resultado contrasta con la alta especificidad al SLE de los anticuerpos anti-Sm. De hecho, la especificidad del péptido SmD1 no modificado C terminal no ha sido completamente investigada por Rokeach (1992b) ni por James y otros (1994). Solo Sabbatini (1993a) describió una cierta especificidad a la enfermedad para el péptido sintético C terminal. Por un lado, Rivkin ha mostrado que de 32 sueros positivos para el péptido (Gly-Arg)_{9}, solo 6 sueros son positivos con el SmD natural. Por otro lado, de los sueros SmD positivos identificados en Western blot, solo la mitad de ellos son reactivos con el péptido no modificado C terminal (Rivkin: 4/8; Rokeach 9/19: Sabbatini: 5/9). Basado en estos resultados puede ser concluido que la inmunoreactividad del péptido no modificado C terminal no se corresponde bien con el SmD natural y es menos específico al SLE que el SmD natural. En contraste, nuestros resultados muestran que 15 de los 17 sueros SmD positivos son inmunoreactivos con el péptido dimetilado C terminal mientras solo un suero reacciona con el péptido no modificado C terminal. Los 2 sueros que no reconocen el péptido dimetilado C terminal son inmunoreactivos con el SmD recombinante total y son aparentemente monoespecíficos al epítope discontinuo.

En conclusión, el SmD1 natural contiene nueve argininas dimetiladas en el término C y esta modificación desempeña un papel crucial en la inmunoreactividad específica al SLE de los antígenos SmD.

De acuerdo con su realización principal la presente invención se refiere a péptidos que contienen residuos de arginina que están seguidos inmediatamente por un residuo de glicina, y donde al menos un residuo de arginina es metilado o dimetilado en un aminogrupo terminal del grupo guanidino del residuo de arginina, y donde esta metilación es un requisito previo para que el pétptido sea reconocido por anticuerpos, que caracterizan ciertas enfermedades. Los anticuerpos que están reaccionando específicamente con este tipo de péptidos pueden ser encontrados en los sueros de pacientes con lupus eritematoso sistémico.

Son descritos péptidos que imitan inmunológicamente a los determinantes inmunogénicos de proteínas del organismo reconocidas por el sistema inmune en pacientes que padecen de lupus eritematoso. Un aspecto importante de tales péptidos es el hecho de que las argininas seguidas por una glicina son metiladas. Ha sido demostrado que un péptido (SmD1) contiene un tramo de 9 residuos consecutivos de arginina-glicina, donde cada arginina es metilada y donde esa metilación es necesaria para el reconocimiento específico por parte de los anticuerpos presentes en los sueros de pacientes que padecen de lupus eritematoso. Ha sido demostrado que un segundo péptido (SmD3) contiene residuos aislados de arginina-glicina, donde la arginina es metilada. También, ha sido demostrado que un tercer péptido (Sm69) contiene varios dominios caracterizados por varios residuos de arginina-glicina, donde la arginina es dimetilada. Por lo tanto se prevé que la presencia de una arginina dimetilada, seguida por una glicina puede ser suficiente para el reconocimiento específico por parte de algunos anticuerpos presentes en los sueros de pacientes con lupus eritematoso. Por consiguiente la invención se refiere a aquellos péptidos donde al menos un residuo de arginina es seguido por una glicina, donde el residuo de arginina es metilado, y donde esta metilación es necesaria para el reconocimiento específico por parte de anticuerpos.

El término "péptido" como es usado a lo largo de la especificación y las reivindicaciones se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; por tanto, oligopéptidos, polipéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de "péptido". Este término tampoco se refiere a o excluye las modificaciones post-expresión del péptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos en la definición están, por ejemplo, péptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, PNA, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en el arte, tanto que ocurren de forma natural como que ocurren de forma no natural.

Siempre que sea usada la expresión "péptido que contiene menos de 50 aminoácidos", esta debería ser interpretada en un sentido amplio, como un medio para circunscribir una versión esencialmente truncada de las proteínas inmunoreactivas completas que todavía comprende el dominio altamente reactivo caracterizado por la presencia de residuos de arginina metilada. Estos péptidos tienen una longitud de preferiblemente 40, 30, 25, 20 ó menos aminoácidos. La presente invención también se refiere a péptidos que tienen una longitud de 50, 60 ó más aminoácidos sin comprender toda la longitud de la proteína natural. Es por un propósito práctico de la síntesis de péptidos que son definidos péptidos que contienen menos de 50 aminoácidos.

Con "determinante inmunogénico" es entendido, aquellos agrupamientos químicos comprendiendo una secuencia de aminoácido primaria, y modificaciones secundarias de los residuos de aminoácidos en cierta disposición tridimensional, que en su conjunto determinan la reactividad específica del antígeno completo para un anticuerpo desarrollado. Tal anticuerpo también puede reconocer diferentes agrupamientos químicos, que son entonces calificados para "imitar inmunológicamente" al determinante inmunogénico.

Cuando se dice que las modificaciones secundarias de un péptido son "necesarias" o "cruciales", o son un "requisito previo" para reaccionar con un anticuerpo, la ausencia de dichas modificaciones secundarias resultará en un péptido cuya constante de disociación para la interacción con dicho anticuerpo será al menos dos órdenes de magnitud mayor que la constante de disociación para la interacción entre dicho anticuerpo y el péptido donde están presentes las modificaciones secundarias, preferiblemente tres órdenes de magnitud mayor, y más preferiblemente cuatro órdenes de magnitud mayor.

El término "reacción crazada" se refiere a la reacción de un antígeno con anticuerpos desarrollados contra otro antígeno o anticuerpos que son encontrados en sueros de pacientes con diferentes enfermedades.

El término "arginina metilada" como es usado a lo largo de la especificación y las reivindicaciones subsiguiente es usado en un sentido amplio y se refiere a cualquier forma metilada. Más preferiblemente el término metilada se refiere a una forma dimetilada de la arginina en la cual un grupo amino del grupo guanidino del residuo de arginina es sustituido por uno o dos grupos metilo. El término "metilación" se refiere al proceso que resulta en dichas formas de arginina.

De acuerdo con una realización más específica la presente invención se refiere a aquellos péptidos que contienen residuos de arginina metilada que están precediendo residuos de glicina, donde dicha metilación es crucial para la interacción de gran afinidad con anticuerpos que son encontrados en sueros de pacientes con enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico.

La presente invención también se refiere a aquellos péptidos donde los dobletes arginina-glicina son repetidos, al menos una vez, y más preferiblemente 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 u 8 veces, y aún más preferiblemente 9 veces, como es el caso con el antígeno antinuclear SmD-1 natural, y donde al menos un residuo de arginina que precede un residuo de glicina es metilado, preferiblemente dimetilado, con dicha metilación siendo necesaria para la reacción específica con anticuerpos, por ejemplo con anticuerpos encontrados en sueros de pacientes con SLE.

En una realización más específica, la presente invención se refiere a un péptido que está caracterizado por la secuencia de aminoácido GRGRGRGRGRGRGRGRGRG (SEQ ID NO 16) donde al menos una y preferiblemente cada arginina es metilada, preferiblemente dimetilada y aún más preferiblemente dimetilada de una manera asimétrica, imitando así al determinante immunogénico principal de la parte C terminal del antígeno antinuclear SmD1.

En una realización más específica, la presente invención se refiere a un péptido que está caracterizado por la secuencia de aminoácido DVEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR (SEQ ID NO 17) donde al menos una y preferiblemente cada arginina que precede una glicina, es metilada, preferiblemente dimetilada y aún más preferiblemente dimetilada de una manera asimétrica, imitando así al determinante inmunigénico principal de la parte C terminal del antígeno antinuclear SmD1.

En una realización más específica, la presente invención se refiere a un péptido que está caracterizado por la secuencia del aminoácido ARGRGRGMGRG (SEQ ID NO 18) donde al menos una y preferiblemente cada arginina es metilada, preferiblemente dimetilada y aún más preferiblemente dimetilada de una manera asimétrica, imitando así al determinante inmunigénico principal de la parte C terminal del antígeno antinuclear SmD3.

En una realización más específica, la presente invención también se refiere a un péptido que está caracterizado por la secuencia del aminoácido KAQVAARGRGRGMGRGNIFQKRR (SEQ ID NO 19) donde al menos una y preferiblemente cada arginina que precede a una glicina es metilada, preferiblemente dimetilada y aún más preferiblemente dimetilada de una manera asimétrica, imitando así al determinante inmunigénico principal y sus bordes de la parte C terminal del antígeno antinuclear SmD3.

De acuerdo con una realización más específica, la presente invención también se refiere a un péptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GGQQDRGGRGRGGGGGYNRSSGGYEPRGRGGGTGGTGGMGGSDRGG (SEQ ID NO 20) o GGQQDRGGRGRGGGGGYN (SEQ ID NO 21) o SGGYEPRGRGGGRGGRGGMGGSDRGG (SEQ ID NO 22) o DFNRGGGNGRGGRGRGG (SEQ ID NO 23) o DFNRGGGNGRGGRGRGGPMGRGGYGGGGS (SEQ ID NO 24) o GGYDRGGYRGRGGDRGGFRGGRGGGDRGGFG (SEQ ID NO 25) o GDDRRGRGGYDRGG (SEQ ID NO 26) o GGYRGRGGDRGGFRGGRGGGDRGGFG (SEQ ID NO 27) donde al menos una y preferiblemente cada arginina que precede a una glicina es metilada, preferiblemente dimetilada y aún más preferiblemente dimetilada de una manera asimétrica, imitando así al determinante inmunogénico principal y a sus bordes de la parte C terminal del antígeno antinuclear Sm69.

De acuerdo con una realización más específica, la presente invención se refiere a un péptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos DNHGRGRGRGRGRGGG (SEQ DI NO 28) o GGRGRGGSGGRGRGG (SEQ DI NO 29) o ERARGRGRGRGE (SEQ ID NO 30) donde al menos una y preferiblemente cada arginina que precede a una glicina es metilada, preferiblemente dimetilada y aún más preferiblemente dimetilada de una manera asimétrica.

La presente invención también se refiere a estructuras moleculares en las que al menos una parte representa un péptido o anticuerpo como es definido anteriormente. Tales estructuras moleculares pueden resultar de la fusión de péptidos de la presente invención con péptidos y/o proteínas y/u otras moléculas que están caracterizadas además porque las mismas específicamente interactúan con otros péptidos y/o proteínas y/o estructuras moleculares, permitiendo el marcado y/o la unión del polipéptido y/o de la proteína fusionada a tipos específicos de tejidos o de células o que permiten la purificación de dichas estructuras moleculares debido a la presencia de por ejemplo 4, ó 5 ó 6 residuos consecutivos de histidina, o

- son citotóxicas para células T y/o células B tales como la toxina del cólera, o

- permiten el etiquetado por medio de un marcador radioactivo o fluorescente o enzimático o inmunogold.

También puede ser deseable en ciertas instancias unir dos o más péptidos en una estructura péptida, o crear péptidos ramificados. Una ventaja de esta disposición es bien conocida en el arte y se refiere al diagnóstico. Cuando los anticuerpos son usados en un ensayo para detectar los antígenos presentes, repeticiones tándem o péptidos ramificados de los antígenos pueden aumentar la cantidad de antígenos inmovilizados presentados a los anticuerpos e incrementar así la sensibilidad del ensayo. La sensibilidad puede ser aumentada exponencialmente cuando los antígenos inmovilizados son usados junto con una concentración específica de esos antígenos en una forma soluble, induciendo así la formación de inmunoprecipitados antígenos entrelazados. Una segunda ventaja se refiere a la terapia. La deposición de complejos autoinmunes auto-antígenos en varios tejidos es un paso importante hacia la adquisición de una condición patológica. Usualmente es aceptado que la causa principal de dicha deposición es la insuficiente depuración de la sangre por el hígado de los complejos inmuno-antígenos debido al pequeño tamaño de dichos complejos. La administración de las repeticiones tándem o de las formas ramificadas de dichos péptidos podría aumentar el tamaño de los complejos inmuno-antígenos formados, e incrementar así la depuración y de esta forma disminuir la deposición de dichos complejos.

La presente invención también se refiere a las formas circularizadas de dichos péptidos, siendo la ventaja bien conocida en el arte, y refiriéndose a una afinidad incrementada de un péptido conformacionalmente limitado en comparación con las formas enrolladas de manera más aleatoria de los péptidos lineares.

Con el objetivo de ajustar las características negativas eventuales de los péptidos reivindicados, tales como degradación rápida, solubilidad, efectos citotóxicos y así sucesivamente, la persona experta será capaz de diseñar sustituciones de aminoácidos conservativas así como no conservativas, o sustituciones con aminoácidos no naturales, PNA etc… Usualmente estas serán responsables de menos del 35% de una secuencia específica. Tales péptidos también incluyen péptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en el arte, tanto que ocurren de forma natural como las que ocurren de forma no natural. Puede ser adecuado en casos donde los péptidos SmD u otros péptidos antigénicos de la presente invención son altamente polimórficos, variar uno o más de los aminoácidos de manera tal que se imiten mejor los diferentes epítopes de varias cepas virales, o que sean reconocidos por anticuerpos en los sueros de pacientes con SLE u otras enfermedades autoinmunes.

La presente invención también se refiere a cualquiera de los análogos de los péptidos de la presente invención.

El término "análogo" como es usado a lo largo de la descripción o de las reivindicaciones para describir las proteínas o los péptidos de la invención presente, incluye cualquier proteína o péptido que tiene una secuencia de residuo de aminoácido sustancialmente idéntica a una secuencia específicamente mostrada aquí en la cual uno o más residuos han sido conservativamente sustituidos con un residuo biológicamente equivalente. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo hidrofílico por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparaginas, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro. Ejemplos de mutaciones permisibles de acuerdo con la presente invención pueden ser encontrados en la Tabla 4.

TABLA 4 Panorámica de las sustituciones de aminoácidos que pudieran formar la base de análogos (mutantes) como es definido anteriormente

Aminoácidos	\hskip4cm	Grupos sinónimos
Ser (S)		Ser, Thr, Gly, Asn
Arg (R)		Arg, His, Lys, Glu, Gin
Leu (L)		Leu, Ile, Met, Phe, Val, Tyr
Pro (P)		Pro, Ala, Thr, Gly
Thr (T)		Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln
Ala (A)		Ala, Pro, Gly, Thr
Val (V)		Val, Met, Ile, Tyr, Phe, Leu, Val
Gly (G)		Gly, Ala, Thr, Pro, Ser
IIe (I)		Ile, Met, Leu, Phe, Val, Ile, Tyr
Phe (F)		Phe, Met, Tyr, Ile, Leu, Trp, Val
Tyr (Y)		Tyr, Phe, Trp, Met, Ile, Val, Leu
Cys (C)		Cys, Ser, Thr, Met
His (H)		His, Gln, Arg, Lys, Glu, Thr
Gln (Q)		Gln, Glu, His, Lys, Asn, Thr, Arg
Asn (N)		Asn, Asp, Ser, Gln
Lys (K)		Lys, Arg, Glu, Gln, His
Asp (D)		Asp, Asn, Glu, Gln
Glu (E)		Glu, Gln, Asp, Lys, Asn, His, Arg
Met (M)		Met, Ile, Leu, Phe, Val

La frase "sustitución conservativa" también incluye el uso de residuos derivados químicamente en lugar de un residuo no derivado siempre que la proteína o el péptido resultante sean biológicamente equivalentes a la proteína o el péptido de la invención.

"Derivados químicos" se refiere a una proteína o un péptido que tiene uno o más residuos derivados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional o de péptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en el arte, tanto que ocurren de forma natural como las que ocurren de forma no natural. Los ejemplos de moléculas derivadas, incluyen pero no se limitan a, aquellas moléculas en las que han sido derivados grupos aminos libres para formar hidrocloruro de amina, grupos sulfonilo p-tolueno, grupos carbonbenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden ser derivados para formar sales, ésteres de metilo y etilo y otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden ser derivados para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno imidazol de histidina puede ser derivado para formar N-imbencilhistidina. También incluidos como derivados químicos están aquellas proteínas o péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos que ocurren de forma natural de los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo: 4-hidroxipolina puede ser sustituida por prolina; 5-hidroxilisina puede ser sustituida por lisina; 3-metilhistidina puede ser sustituida por histidina; homoserina puede ser sustituida por serina; y carnitina puede ser sustituida por lisina. Los péptidos de la presente invención pueden incluir también cualquier proteína o péptido que tiene una o más adiciones y/o supresiones o residuos relacionados con la secuencia de un péptido cuya secuencia es mostrada aquí, siempre que el péptido sea biológicamente equivalente a las proteínas o los péptidos de la invención.

Además, grupos de aminoácidos o grupos químicos adicionales pueden ser añadidos al término amino o carboxilo con el fin de crear un "brazo de enlace" a través del cual los péptidos pueden ser unidos convenientemente a un portador. El brazo de enlace será al menos un aminoácido y podrán ser tantos como hasta 60 aminoácidos pero lo frecuente será de 1 a 10 aminoácidos. La naturaleza de la unión a una fase sólida o a un portador puede ser no covalente así como covalente. Los posibles arreglos de esta naturaleza están bien descritos en el arte. Aminoácidos naturales tales como la histidina, la cisteína, la lisina, la tirosina, el ácido glutámico, o el ácido aspártico pueden ser añadidos al término amino o al término carboxilo para proporcionar grupos funcionales para el acoplamiento a una fase sólida o a un portador. Sin embargo, otros grupos químicos tales como, por ejemplo, la biotina y el ácido tioglicólico, pueden ser añadidos a los términos lo cual dotará a los péptidos de las propiedades químicas o físicas deseadas. Los términos de los péptidos también pueden ser modificados, por ejemplo, mediante acetilación de N terminal o amidación del terminal carboxy. En cada instancia, el péptido será preferiblemente tan pequeño como sea posible mientras sigue manteniendo sustancialmente toda la sensibilidad del péptido más grande.

Los péptidos de la invención, y particularmente los fragmentos, pueden ser preparados por síntesis química clásica. La síntesis puede ser llevada a cabo en solución homogénea o en fase sólida. Por ejemplo, la técnica de síntesis en solución homogénea que puede ser usada es la descrita por Houbenweyl en el libro titulado "Methode der organischen chemie" (Método de la química orgánica) editado por E. Wunsh, vol. 15-I y II. THIEME, Stuttgart 1974. Los polipéptidos de la invención también pueden ser preparados en fase sólida de acuerdo con los métodos descritos por Atherton y Shepard en su libro titulado "Solid phase peptide synthesis" (IRL Press, Oxford, 1989). Las formas metiladas de los péptidos reivindicados pueden ser obtenidas sustituyendo los derivados de la arginina metilada por los derivados de la arginina normal durante la síntesis química clásica, o contactando los péptidos no metilados después de la síntesis con una enzima de la proteína arginina metil-transferasa de cualquier origen eucariótico.

Los polipétidos de acuerdo con esta invención también pueden ser preparados por medio de técnicas de ADN recombinante como fue descrito por Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) mediante la inserción de una secuencia de ácido polinucleico que codifica los péptidos reivindicados o parte de los péptidos reivindicados en un vector apropiado y que transforma un hospedero adecuado con dicho vector. Este vector de expresión recombinante comprende un ácido polinucleico o una parte del mismo como es definido anteriormente, enlazado operativamente a elementos de control de transcripción y traducción procariota, eucariota o viral. Además esta secuencia puede estar enlazada operativamente a secuencias que permiten la secreción de los péptidos reivindicados. El término "vector" puede comprender un plásmido, un cósmido, un fago o un virus o un organismo transgénico. Particularmente útiles pueden ser el BCG o los vectores adenovirales, así como los virus recombinantes avipox.

Los péptidos recombinantes pueden ser metilados in vitro, contactando los péptidos expresados y/u segregados con una proteína arginina metil-transferasa de cualquier origen eucariótico, o in vivo seleccionando el hospedero apropiado, como levadura, o cualquier célula eucariótica, y más preferiblemente usando el sistema de transformación del báculovirus.

La presente invención no excluye la opción de usar proteínas adicionales como las proteínas BTG1 y TIS21 que han demostrado ser esenciales para la metilación in vivo (como una proteína co-expresada) o ser requeridas para la metilación óptima in vitro (Lin y otros, 1996), o cualesquiera otras proteínas, péptidos o sustancias químicas que pueden optimizar el nivel de metilación.

También cualquiera de los métodos de purificación conocidos para los péptidos recombinantes puede ser usados para la producción de los péptidos recombinantes de la presente invención.

La presente invención también se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende un ácido polinucleico o una parte del mismo como fue definido anteriormente, enlazado operativamente a elementos de control de transcripción y traducción procariota, eucariota o viral.

En general, dicho vector recombinante comprenderá una secuencia del vector, una secuencia del promotor procariota o eucariota o viral apropiada seguida por una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido como fue definido anteriormente, con dicho vector recombinante permitiendo la expresión y/o secreción de uno cualquiera de los polipéptidos como fue definido anteriormente en un hospedero procariota, o eucariota o en mamíferos vivos al ser inyectado como ADN desnudo.

También cualquiera de los métodos de purificación conocidos para las proteínas recombinantes puede ser utilizado para la producción de los polipéptidos recombinantes de la presente invención.

El término "vector" puede comprender un plásmido, un cósmido, un fago, o un virus o un animal transgénico. Particularmente útil para el desarrollo de vacunas puede ser el BCG o los vectores adenovirales, así como virus recombinantes de avipox.

La presente invención también se refiere a un método para la producción de polipétidos recombinantes como fue definido anteriormente, comprendiendo:

-

Transformación de un hospedero celular apropiado con un vector recombinante, en el cual un ácido polinucleico o parte del mismo de acuerdo a como fue definido anteriormente ha sido insertado bajo el control de elementos reguladores apropiados,

-

cultivar dicho hospedero celular transformado bajo condiciones que permitan la expresión y/o secreción de dicha inserción, y,

-

cosechar dicho polipéptido.

El término "expresado de manera recombinante" usado en el contexto de la presente invención se refiere al hecho de que las proteínas de la presente invención son producidas por métodos de expresión recombinante siendo este en procariotas, o eucariotas inferiores o superiores como será abordado en detalles más adelante.

El término "eucariota inferior" se refiere a células hospederas como la levadura, los hongos y similares. Las eucariotas inferiores son por lo general (pero no necesariamente) unicelulares. Las eucariotas inferiores preferidas son las levaduras, particularmente especies dentro de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris), Hansenula (por ejemplo Hansenula polimorfa), Yarowia, Schwaniomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces y similares. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y K. lactis son los hospederos de levaduras más comúnmente utilizados, y son hospederos fúngicos convenientes.

El término "procariotas" se refiere a los hospederos tales como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o Streptomyces. Estos hospederos también están contemplados dentro de la presente invención.

El término "eucariota superior" se refiere a células hospederas derivadas de animales superiores, tales como mamíferos, reptiles, insectos, y similares. Las células hospederas eucariotas superiores preferidas actualmente son derivadas del hámster chino (por ejemplo CHO), del mono (por ejemplo COS y células Vero), del riñón del hámster recién nacido (BHK), del riñón de cerdo (PK15), de las células 13 de riñón de conejo (K13), de la línea celular 143 B del osteosarcoma humano, de la línea celular humana HeLa y de las líneas celulares del hepatoma humano como Hep G2, y de las líneas celulares de insectos (por ejemplo Spodoptera frugiperda). Las células hospederas pueden ser proporcionadas en cultivos en frascos o suspensión, cultivos de tejido, cultivos de órganos y similares. Alternativamente las células hospederas pueden ser también animales transgénicos.

El término "polinucleotido recombinante" o "ácido nucleico" concibe un polinucleotido o ácido nucleico de origen genómico, ADNc, semisintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado a todo o a una parte de un polinucleotido al cual está asociado en la naturaleza, (2) está enlazado a un polinucleotido que no sea al que está enlazado en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza.

El término "células hospederas recombinantes", "células hospederas", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares", y otros tales términos que denotan microorganismos o líneas celulares eucariotas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refiere a células que pueden ser o han sido, usadas como recipientes para un vector recombinante u otros polinucleotidos de transferencia, e incluye la descendencia de la célula original que ha sido transfectada. Es entendido que la descendencia de una célula parental simple puede no ser necesariamente totalmente idéntica en morfología o en el complemento genómico o del ADN total al genitor original debido a mutación natural, accidental o deliberada.

El término "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos dentro de una célula; es decir, capaz de replicarse por su propia cuenta.

El término "vector" es un replicón que comprende además secuencias que proporcionan replicación y/o expresión de un marco de lectura abierta deseado.

El término "secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias codificadoras a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difieren en dependencia del organismo hospedero; en procariotas, tales secuencias de control incluyen usualmente el promotor, el sitio de unión del ribosoma, los sitios de empalme y los terminadores; en eucariotas, usualmente, tales secuencias de control incluyen los promotores, los sitios de empalme, los terminadores y, en algunos casos, los potenciadores. El término "secuencias de control" está concebido para incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes que rigen la secreción.

El término "promotor" es una secuencia de nucleótidos que está compuesta por secuencias de consenso que permiten la unión de la ARN polimerasa con el ADN molde de manera tal que la producción de mARN se inicie en el sitio normal de iniciación de la transcripción para el gen estructural adyacente.

La expresión "operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "operativamente enlazada" a una secuencia codificadora esta ligada de tal forma que la expresión de la secuencia codificadora es lograda bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

Los ácidos polinucleicos que codifican los péptidos de la presente invención y que están insertados en la secuencia del vector pueden ser unidos a una secuencia señal. Dicha secuencia señal puede ser la de cualquier fuente, por ejemplo la secuencia líder de la IgG o del activador plasminógeno tisular (tpa) para la expresión en células de mamíferos, o la secuencia del factor de apareamiento \alpha para la expresión dentro de células de levadura.

Una variedad de vectores puede ser usada para obtener los péptidos de la presente invención. Las eucariotas inferiores como las levaduras y las cepas mutantes de glicosilación son normalmente transformadas con plásmidos, o son transformadas con un virus recombinante. Los vectores pueden replicarse dentro del hospedero independientemente, o pueden integrarse al genoma de la célula hospedera.

Las eucariotas superiores pueden ser transformadas con vectores, o pueden ser infectadas con un virus recombinante, por ejemplo un virus recombinante de vaccinia. Las técnicas y los vectores para la inserción de ADN foráneo dentro del virus de la vaccinia son bien conocidos en el arte, y utilizan, por ejemplo recombinación homóloga. Una amplia variedad de secuencias promotoras virales, posiblemente secuencias terminadoras y secuencias de adición poli(A), posiblemente secuencias potenciadoras y posiblemente secuencias amplificadoras, todas requeridas para la expresión de mamíferos, están disponibles en el arte. La vaccinia es particularmente preferida debido a que la vaccinia detiene la expresión de las proteínas de la célula hospedera. La vaccinia es también muy preferida ya que permite la expresión de los péptidos f.i. de la presente invención en células o individuos que están inmunizados con el virus vivo de la vaccinia recombinante. Para la vacunación de humanos el Virus Modificado de Ankara (AMV) y el avipox son vectores particularmente útiles.

También son conocidos vectores de transferencia de expresión de insectos derivados del báculovirus virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), que es un vector de expresión viral colaborador independiente. Los vectores de expresión de este sistema usan usualmente el promotor fuerte del gen de la polihedrina viral para activar la expresión de genes heterólogos. Diferentes vectores así como métodos para la introducción del ADN heterólogo dentro del sitio deseado del báculovirus están a disposición del experto en el arte para la expresión del báculovirus. También son conocidas en el arte diferentes señales para la modificación post-translacional reconocida por las células de insectos.

La presente invención también se refiere a una célula hospedera transformada con un vector recombinante como fue definido anteriormente.

La presente invención también se refiere a anticuerpos que son desarrollados específicamente contra los péptidos de la presente invención, preferiblemente contra aquellos péptidos donde las argininas que preceden un residuo de glicina son metiladas. Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Para preparar anticuerpos un animal hospedero es inmunizado usando los péptidos de la presente invención en un portador farmacéuticamente aceptable, donde al menos una de las argininas que precede al residuo de glicina de dichos péptidos es metilada. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos nocivos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son por lo general macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como las proteínas, los polisacáridos, los ácidos polilácticos, los ácidos poliglicólicos, los aminoácidos poliméricos, los aminoácidos copoliméros; y partículas inactivas de virus. Estos portadores son bien conocidos por aquellos con habilidades ordinarias en el arte.

Los adyuvantes preferidos para potenciar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: hidróxido de aluminio (alum), N-acetil-muramil-L-teronil-D-isoglutamina (thr-MDP) como se encuentra en la Patente U.S. No. 4,606,918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-analil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa, y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión escualeno/Tween 80 al 2%. Cualquiera de los 3 componentes MPL, TDM o CWS también puede ser usado solo o combinado 2 por 2. Adicionalmente, pueden ser usados adyuvantes como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o SAF-1 (Syntex). Además, el Adyuvante de Freund Completo (CFA) y el Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) pueden ser usados para aplicaciones no humanas y con fines de investigación.

Las composiciones inmunogénicas por lo general contendrán vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agua, solución salina, glicerina, etanol, etc. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras de pH, preservantes, y similares, pueden ser incluidos en tales vehículos.

Por lo general, las composiciones inmunogénicas son preparadas como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o como suspensiones; también pueden ser preparadas formas sólidas adecuadas para la solución en, o la suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede ser emulsionada o encapsulada en liposomas para potenciar el efecto adyuvante. Las proteínas también pueden ser incorporadas a Complejos de Estimulación Inmune conjuntamente con saponinas, por ejemplo Quil A (ISCOMS).

Las composiciones inmunogénicas usadas para desarrollar los anticuerpos comprenden una "cantidad suficiente" o "una cantidad inmunológicamente efectiva" de los péptidos de la presente invención, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, según sea necesario. "Cantidad inmunológicamente efectiva", significa que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es efectiva para provocar una respuesta inmune y para desarrollar los anticuerpos, como fue definido anteriormente. Esta cantidad varía en dependencia de la salud y la condición física del individuo, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo primate no humano, primate, conejo, etc.), la capacidad del sistema inmunológico de cada individuo para sintetizar los anticuerpos, la inmunogenicidad del péptido antigénico, y su modo de administración, y otros factores relevantes. Es esperado que la cantidad esté presente en un rango relativamente amplio que pueda ser determinado a través de ensayos de rutina. Usualmente, la cantidad variará de 0.01 a 1000 \mug/dosis, más particularmente de 0.1 a 100 \mug/dosis.

Las composiciones inmunogénicas son convencionalmente administradas por vía parenteral, usualmente por inyección, por ejemplo, de manera subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros métodos de administración incluyen formulaciones orales y supositorios. El tratamiento de dosificación puede ser un cronograma de dosis única o un cronograma de dosis múltiples. La vacuna puede ser administrada junto con otros agentes inmunoreguladores.

El suero o plasma hospedero es recolectado siguiendo un intervalo de tiempo apropiado para proporcionar una composición que comprende anticuerpos que reaccionan con los péptidos de la presente invención. La fracción de gammaglobulina o los anticuerpos IgG pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante el uso de sulfato de amonio saturado o DEAE Sephadex, u otras técnicas conocidas por aquellos expertos en el arte. Los anticuerpos están sustancialmente libres de muchos de los efectos colaterales adversos que pueden estar asociados a otros agentes antivirales tales como medicamentos, para el tratamiento de la mononucleosis infecciosa, crónica, o recurrente. Tales anticuerpos también pueden ser usados para diagnosticar ciertas enfermedades, tales como linfoma de Burkitt, donde ha estado implicado el virus Epstein-Barr.

El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de una sustancia para provocar una respuesta humoral y/o celular, ya sea sola o al ser enlazada a un portador, en presencia o ausencia de un adyuvante.

Los anticuerpos de la invención reivindicada también pueden ser monoclonales que son preparados con dicho anticuerpo siendo específicamente reactivos con cualquiera de dichos péptidos, y con dicho anticuerpo siendo preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser producidos por cualquier hibridoma responsable de ser formado de acuerdo con los métodos clásicos a partir de las células esplénicas de un animal, particularmente de un ratón o una rata, inmunizado contra los péptidos reivindicados de la presente invención por una parte, y de células de una línea celular de mieloma por otra, y a ser seleccionada por la capacidad del hibridoma de producir los anticuerpos monoclonales que reconocen las formas metiladas de los péptidos que han sido inicialmente usados para la inmunización de los animales.

Los anticuerpos involucrados en la invención pueden ser identificados con una etiqueta apropiada del tipo enzimático, fluorescente, o radioactivo.

Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con esta realización preferida de la invención pueden ser versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de ratón hechas por medio de tecnología de ADN recombinante, a partir de partes del ratón y/o de secuencias de ADN genómico humano que codifica para las cadenas H y L o a partir de clones de ADNc que codifican para las cadenas H y L.

Alternativamente los anticuerpos monoclonales de acuerdo con esta realización preferida de la invención pueden ser anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos de acuerdo con la presente realización de la invención también pueden ser derivados de linfoncitos de sangre periférica humana de pacientes con SLE o cualquier otra enfermedad autoinmune o con mononucleosis infecciosa, o recurrente o crónica. Tales anticuerpos monoclonales humanos son preparados, por ejemplo, mediante repoblación de linfoncitos de la sangre periférica humana (PBL) en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) (para una consulta reciente, vea Duchosal y otros, 1992) o mediante exploración por selección de linfocitos transformados del virus Epstein Barr de individuos infectados o vacunados para detectar la presencia de células B reactivas por medio de los antígenos de la presente invención.

La presente invención también se refiere a los anticuerpos anti-idiotipo que son desarrollados a partir de la inmunización con un anticuerpo como fue definido anteriormente y que específicamente reacciona con dichos anticuerpos, imitando así los péptidos de la presente invención. Los métodos para la producción de los anticuerpos monoclonales anti-idiotipo, que son bien conocidos en el arte, han sido descritos, por ejemplo, por Gheuens y MacFarlin (1982).

La presente invención también se refiere a versiones truncadas o versiones de una cadena simple de los anticuerpos y anticuerpos anti-idiotipos como fue definido anteriormente, que han conservado su especificidad original para reaccionar con los antígenos.

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La presente invención también se refiere a proteínas o péptidos que imitan los anticuerpos como fue definido anteriormente tales como microproteínas que pueden ser obtenidas por despliegue en fago o el dominio altamente variable de un anticuerpo recombinante como el obtenido por exploración por selección después de la clonación del repertorio.

La presente invención también se refiere a un método para detectar anticuerpos que específicamente reaccionan con los péptidos o anticuerpos anti-idiotipo de la presente invención, presentes en una muestra biológica, que comprende:

(i)

contactar la muestra biológica a ser analizada para detectar la presencia de dichos anticuerpos con un péptido o anticuerpo anti-idiotipo como es definido anteriormente,

(ii)

detectar el complejo inmunológico formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido o anticuerpo anti-idiotipo.

La presente invención también se refiere a un método inverso para detectar los péptidos y/o los anticuerpos anti-idiotipo de la presente invención con anticuerpos presentes en una muestra biológica que específicamente reacciona con formas metiladas de dichos péptidos y/o anticuerpos anti-idiotipo que imitan tales péptidos, que comprende:

(i)

contactar la muestra biológica a ser analizada para detectar la presencia de dichos péptidos o anticuerpos anti-idiotipo con los anticuerpos como fue definido anteriormente,

(ii)

detectar el complejo inmunológico formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido o anticuerpo anti-idiotipo.

Los métodos como fue definido anteriormente, pueden ser usados en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes como un lupus eritematoso sistémico.

De acuerdo con una realización específica, la presente invención se refiere al desarrollo de una técnica de diagnóstico que permite la diferenciación entre aquellas enfermedades autoinmunes en las que los anticuerpos característicos a menudo reaccionan de forma cruzada con el mismo antígeno, resultado así en un diagnóstico difícil y lento. Tal técnica de diagnóstico puede ser obtenida mediante el uso simultáneo de diferentes antígenos, metilados y no metilados, y al menos dos epítopes, una forma metilada y una no metilada de cualquiera de los anticuerpos anti-idiotipos y/o péptidos reivindicados de la presente invención.

La presente invención también se refiere a un kit diagnóstico para ser usado en la detección de la presencia de dichos anticuerpos, dicho kit comprendiendo al menos un péptido o un anticuerpo anti-idiotipo o una microproteína como fue definido anteriormente, con dicho péptido o anticuerpo anti-idiotipo o microproteína estando preferiblemente unido a un soporte sólido.

La presente invención también se refiere a un kit diagnóstico para determinar el tipo de enfermedad autoinmune, dicho kit comprendiendo al menos un péptido o un anticuerpo anti-idiotipo o una microproteína como fue definido anteriormente, con dicho péptido o anticuerpo anti-idiotipo o microproteína estando preferiblemente unido a un soporte sólido.

La presente invención también se refiere a un kit diagnóstico como fue definido anteriormente, dicho kit comprendiendo un rango de dichos péptidos y/o anticuerpos anti-idiotipo o microproteína que están unidos a ubicaciones específicas en un substrato sólido.

La presente invención también se refiere a un kit diagnóstico como fue definido anteriormente, donde dicho soporte sólido es una banda membranosa y dichos péptidos y/o anticuerpos anti-idiotipo o microproteínas son acoplados a la membrana en forma de líneas paralelas.

Los métodos de inmunoensayo de acuerdo con la presente invención pueden utilizar por ejemplo antígenos oligoméricos simples o específicos, antígenos diméricos, así como combinaciones de antígenos oligoméricos simples o específicos. Los péptidos de la presente invención pueden ser empleados virtualmente en cualquier formato de ensayo que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos que caracterizan una cierta enfermedad o infección. Un rasgo común de todos esos ensayos es que el péptido o el anticuerpo anti-idiotipo o la microproteína antigénicos son contactados con el componente corporal que se sospecha que contiene los anticuerpos en condiciones que permiten al antígeno unirse a cualquier anticuerpo presente en el componente. Tales condiciones usualmente serán la temperatura fisiológica, el pH y la resistencia iónica usando un exceso de antígeno. La incubación del antígeno con el espécimen es seguida por la detección de complejos inmunes compuestos del antígeno.

El diseño de los inmunoensayos está sujeto a un gran número de variación, y muchos formatos son conocidos en el arte. Los protocolos pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos, o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos involucran el uso de anticuerpos o péptidos etiquetados; las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moléculas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas, o coloreadas. También son conocidos ensayos que amplifican las señales a partir del complejo inmune; ejemplos de los cuales son los ensayos que utilizan biotina y avidina o estreptavidina, e inmunoensayos etiquetados con enzimas y mediados, tales como los ensayos ELISA.

El inmunoensayo puede ser, sin limitación, en un formato heterogéneo u homogéneo, y de un tipo estándar o competitivo. En un formato heterogéneo, el péptido o anticuerpo anti-idiotipo o la microproteína está usualmente unido a un soporte o matriz sólida para facilitar la separación de la muestra del péptido o del anticuerpo anti-idiotipo o de la microproteína después de la incubación. Ejemplos de soportes sólidos que pueden ser usados son la nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o de pozo de microtítulo), el cloruro de polivinilo (por ejemplo, en hojas o pozos de microtítulo), el látex de poliestireno (por ejemplo, en perlas o placas de microtítulo, fluoruro de polivinilo (conocido como Immunolon^{TM}), el papel diazotado, las membranas de nailon, las perlas activadas, y las perlas de Proteína A. Por ejemplo, placas de microtítulo Dynatech Immunolon^{TM} 1 o Immunolon^{TM} 2 o perlas de poliestireno de 0.25 pulgadas (Bolas de Plástico de Precisión) pueden ser usadas en el formato heterogéneo. El soporte sólido que contiene los péptidos antigénicos o los anticuerpos anti-idiotipo o las microproteínas es usualmente lavado después de separarlo de la muestra de prueba, y antes de detectar los anticuerpos unidos. Ambos formatos estándar y competitivo son conocidos en el arte.

En un formato homogéneo, la muestra de prueba es incubada con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo, esto puede ser bajo condiciones que precipitarán cualquiera de los complejos antígeno-anticuerpo o anticuerpo anti-idiotipo-anticuerpo o microproteína-anticuerpo que son formados. Ambos formatos estándar y competitivo para esos ensayos son conocidos en el arte. Por ejemplo, para caracterizar el SLE o lupus eritematoso sistémico en el formato estándar, es monitoreada directamente la cantidad de anticuerpos SLE en los complejos antígeno-anticuerpo. Esto puede ser realizado determinando si un segundo tipo de anticuerpos etiquetados anti-xenogenéticos (por ejemplo anti-humano) que reconocen un epítope en el primer tipo de anticuerpos SLE se unirá debido a la formación del complejo. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos SLE en la muestra es deducida monitoreando el efecto competitivo en la unión de una cantidad conocida del anticuerpo etiquetado (u otro ligando que compite) en el complejo. La detección de los anticuerpos SLE para el diagnóstico del SLE es usada como una ilustración. Siempre que el término "anticuerpos SLE" es empleado a lo largo de la descripción, esto no debería ser considerado como limitante. De la misma forma, las otras enfermedades autoinmunes son diagnosticadas mediante la detección de otros anticuerpos, y la mononucleosis es diagnosticada mediante la detección de los anticuerpos anti virus Epstein-Barr.

Los complejos formados que comprenden el anticuerpo SLE (o en el caso de ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpos que compiten) son detectados por cualquiera de un número de técnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, los anticuerpos SLE no etiquetados en el complejo pueden ser detectados usando un conjugado de anti-Ig xenogenético acomplejado con una etiqueta (por ejemplo una etiqueta de enzima).

En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o aglutinación la reacción entre los antígenos SLE y el anticuerpo SLE forman una red que se precipita de la solución o suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si no está presente el anticuerpo SLE en el espécimen de prueba, no se forma ningún precipitado visible.

Actualmente, existen tres tipos específicos de ensayos de aglutinación de partículas (PA). Estos ensayos son usados para la detección de anticuerpos para varios antígenos al ser impregnados en un soporte. Un tipo de este ensayo es el ensayo de hemoaglutinación usando células de sangre roja (RBCs) que son sintetizadas adsorbiendo pasivamente el antígeno (o el anticuerpo) hacia la RBC. La adición de anticuerpos antígenos específicos presentes en el componente corporal, si lo hay, provoca que las RBCs impregnadas con el antígeno purificado se aglutinen.

Para eliminar reacciones potenciales no específicas en el ensayo de la hemoaglutinación, pueden ser usados dos portadores artificiales en lugar de la RBC en la PA. Los más comunes de estos son las partículas de látex. Sin embargo, también pueden ser usadas partículas de gelatina. Los ensayos utilizando cualquiera de estos portadores están basados en la aglutinación pasiva de las partículas impregnadas con antígenos purificados.

Los péptidos antigénicos de la presente invención usualmente serán presentados en forma de un kit para ser usado en estos inmunoensayos. El kit normalmente contendrá en recipientes separados el péptido antigénico o el anticuerpo anti-idiotipo, las formulaciones (positivas y/o negativas) del anticuerpo control, el anticuerpo etiquetado cuando el formato de ensayo requiere el mismo y los reactivos que generan la señal (por ejemplo sustrato de enzima) si la etiqueta no genera directamente una señal. El péptido antigénico o el anticuerpo anti-idiotipo puede estar ya unido a la matriz sólida o separado con reactivos para unirlo a la matriz. Instrucciones (por ejemplo, escritas, grabadas, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo normalmente serán incluidas en el kit.

La fase sólida seleccionada puede incluir perlas poliméricas o de vidrio, nitrocelulosa, micropartículas, micropozos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo y perlas magnéticas. El compuesto que genera la señal puede incluir una enzima, un compuesto luminiscente, un cromógeno, un elemento radioactivo y un compuesto quimioluminiscente. Los ejemplos de enzimas incluyen la fosfatasa alcalina, la peroxidasa del rábano y la beta galactosidasa. Los ejemplos de compuestos potenciadores incluyen la biotina, la antibiotina y la avidina. Los ejemplos compuestos potenciadores que unen miembros incluyen la biotina, la antibiotina y la avidina. Para bloquear los efectos de las sustancias similares al factor reumatoide, la muestra de prueba está sujeta a condiciones suficientes para bloquear el efecto de las sustancias similares al factor reumatoide. Estas condiciones comprenden contactar la muestra de prueba con una cantidad de por ejemplo anti-IgG humana para formar una mezcla, e incubar la mezcla durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un producto de mezcla de reacción sustancialmente libre de la sustancia similar al factor reumatoide.

La presente invención se refiere particularmente a un formato de inmunoensayo en el que varios péptidos de la invención son acoplados a una membrana en forma de líneas paralelas. Este formato de ensayo es particularmente ventajoso para permitir una discriminación entre las enfermedades autoinmunes separadas. Los antígenos que son inmovilizados en la membrana estarán preferiblemente en forma metilada y no metilada de poli(Arg-Gly), combinada con SmD1 y/o SmD3 y/o Sm69 naturales y así metiladas, y SmD1 y/o SmD3 y/o Sm69 recombinante no metilada.

Leyendas de las Figuras

Figura 1: Perfil HPLC del hidrolizado Endo-Lys.

Figura 2: Immunopunto de fracciones de HPLC con sueros de 5 pacientes y 1 suero de control.

Figura 3: Immunopunto del péptido C terminal (C-term mod) y sin dimetilarginina (C-term nt mod), y de la proteína (báculo SmD, coli SmD) recombinante y natural (nativa). Las bandas fueron incubadas con suero anti-SmD (+) positivo y un suero de control (-).El teñido de la proteína total (Aurodina) fue realizada en la tercera banda.

Figura 4: LIA con el péptido C terminal (dimetil arginina) modificado (fracción 15 del hidrolizado EndoLys-C, línea 1 en la banda), y el péptido C terminal no modificado (fracción 8 del hidrolizado EndoLys-C, línea 2 en la banda), ambos aplicados en iguales cantidades (60 ng). Adicionalmente, 7, 15 y 30 ng del SmD1 recombinante de células de insectos infectados con báculovirus o E. coli (resp. 4,5,6 y 7,8,9) así como 15 y 30 ng de una mezcla del SmD (nativo) purificado en gel fueron aplicados a las bandas. El teñido de la proteína total (Aurodina) fue realizada en la primera banda. Las bandas fueron incubadas con (A) un panel de sueros anti-SmD positivos seleccionados por INNO-LIA ANA a partir de sueros ANF positivos, (B) un panel de sueros anti-SmD positivos seleccionados por INNO-LIA ANA a partir de un cohorte de pacientes de SLE diagnosticados de acuerdo con los criterios de la ACR, (C) sueros seleccionados a partir de pacientes MCTD (panel de control) y (D) sueros seleccionados a partir de sueros ANF negativos (panel de control). No fue observada reactividad con sueros de los paneles de control.

Ejemplos Ejemplo 1 Sueros

Sueros Sm positivos fueron obtenidos del Departamento de Reumatología de la clínica de la Universidad en Ghent, Bélgica (Dr. De Keyser y Dr. Veys). Esos sueros fueron identificados mediante la técnica de blot por difusión en microgel (MDB) usando extracto del timo de conejo (Zeus, Bayer, Raritan, USA) como sustrato (De Keyser y otros, 1990). La Sm positividad fue definida por una inmunoreacción positiva en la misma posición de peso molecular (aproximadamente 14 kDa) que el suero de referencia \alpha-SmD.

Ejemplo 2 Aislamiento del SmD nativo

Las partículas de snRNP son purificadas a partir de extractos nucleares de HeLa mediante cromatografía de inmuno-afinidad (R. Lührmann, Marburg, Alemania).

Las partículas de snRNP son recibidas en 20 mM Hepes/KOH, pH 7.9 - 250 a 420 mM de NaCl - glicerol
5% - MgCl_{2} 1.5 M - 0.2 mM de EDTA - 0.5 mM de DTE - 0.5 mM de PMSF. El SmD es aislado a partir de esas partículas como fue descrito por Lehmeier y otros (1990) con algunas modificaciones. De forma resumida, en un primer paso, los snRNP son concentrados en un concentrador centricon (30K centriperp, Amicon) para un volumen total de 5-10 mg/ml. Posteriormente, los snRNP son disueltos en tampón de muestra Laemmli, separados en un gel de preparación Laemmli al 15% (1 cm de grosor, 14 cm de pozo; carga de proteína 3 mg) y teñido con Azul Brillante Coomassie.

La banda del SmD de 14 kDa (conteniendo SmD1, SmD2 y SmD3) es cortada del gel, enjuagada en agua y cortada en cubos de 1 mm^{3}. Las proteínas son extraídas del gel de poliacrilamida en el dispositivo BioRad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los CoomassieBB y SDS residuales son eliminados de las proteínas electro-extraídas mediante extracción del par iónico (precipitación de la proteína secada con acetona/ácido acídico/trietilamina/agua: 85/5/5/5). La bolita es disuelta en ureum 6M, de ácido acético (glacial) 0.1 M y neutralizada inmediatamente con Tris-HCL 1.5 M.

La concentración de la proteína es determinada por el método MicroBCA (Pierce, EE.UU.), es obtenido un rendimiento promedio de 80 \mug SmD/mg snRNP.

Ejemplo 3 Expresión del SmD1 como fusión mTNF corta en E. coli y purificación de la proteína de fusión

La secuencia que codifica el SmD1 (357 bp) fue aislada de un clone de ADNc comprado a Organon Technika como un fragmento PCR de 367 bp usando pfu polimerasa (Tm: 55ºC). Este fragmento PCR fue cortado con BamHI y XbaI e insertado en el vector pIGFHIII de expresión del corte de BamHI/XbaI. Este vector de expresión fue transformado en la cepa de expresión de E. coli SG4044(pcl857). La inducción de esta combinación vector/cepa a 37ºC mostró una fuerte señal de \pm18 kDa en geles teñidos con CBB y en Western blot. Una vez realizado el análisis de localización la proteína probó estar presente en la fracción soluble. No pudo ser observada ninguna disolución proteolítica significativa. Las células bacterianas derivadas de un cultivo de tres litros fueron suspendidas en buffer de lisis (10 mM de Tris- 100 mM de KCl pH 6.8) hasta 3 veces la cantidad de células húmedas. Previo a la lisis mediante una prensa de French, fueron adicionados ácido \varepsilon-aminocaprónico, DTT, y PMSF a la concentración de 25 mM, 1 mM y 2 mM respectivamente. La suspensión de las células fue forzada dos veces a través de la prensa de French y la presión fue mantenida a 14000 psi. Antes de la centrifugación, el lisado fue diluido con buffer de lisis (5 veces el peso de la célula húmeda) y fue centrifugado durante 20 minutos a 27000 g a 4ºC. Guanidina HCl fue añadida al sobrenadante a una concentración final de 4.5 M. La proteína de fusión recombinante, que contiene una etiqueta His, fue purificada en un solo paso mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos (Ni-IMAC sefarosa). La cromatografía fue realizada a temperatura ambiente. La columna fue cargada con un volumen de 1 columna de NiCl_{2} (5 mg/ml), lavada con agua y equilibrada con un buffer A (Guanidina HCl 6 M, fosfato de sodio 0.1 M, TritonX100 al 0.05%, pH 6.5). Las proteínas fueron cargadas en sefarosa quelante de Ni^{2+} Pharmacia, Suecia; aproximadamente 18 mg de proteína/ml de gel) y la columna fue lavada con 4 volúmenes de lecho del buffer A. El SmD1 fue extraído con un gradiente lineal del buffer B (Guanidina
HCl 6 M, fosfato de sodio 0.1 M, TritonX100 al 0.05%, pH 3.5) y la proteína extraída entre 70% y 90% del buffer B.

Ejemplo 4 Expresión del SmD1 como fusión mTNF corta en el sistema báculoviral y purificación de la proteína de fusión

El gen de ADNc que codifica para la proteína de fusión mTNF-His6-hSmD fue aislado del plásmido de expresión bacteriano pIGFHIIIhSmD (vea el ejemplo 3) como un fragmento DraI-XbaI de 520 bp, e insertado en el plásmido pVL1393 de transferencia del báculo abierto de BamHI (llenado en)-XbaI, resultando en el plásmido de transferencia recombinante pVLTNFH6hSmD (vea la Fig. 2). El gen de fusión está aquí bajo control transcripcional del promotor fuerte de polihedrina del báculovirus. El vector de transferencia del báculo pVmTNFH6hSmD1 fue usado para generar báculovirus mTNF-His6-hSmD1 recombinante siguiendo el enfoque de transfección de baculogold (Pharmingen, San Diego, EE.UU.). La infección de las células de Spodoptera frugiperda (Sf9) con el virus recombinante resultó en la expresión de una proteína de 18 kDa que fue reconocida en el Western blot por un anticuerpo monoclonal específico para el SmD (Progen, Heidelberg, Alemania, datos no mostrados). No fue factible el empleo del lisado de la célula para probar la especificidad de diferentes sueros humanos debido a que una reacción muy inespecífica de fondo de los sueros humanos con las proteínas báculovirales enmascaró el posible reconocimiento del SmD específico. La proteína de fusión del SmD fue purificada por tanto mediante purificación con Ni-IMAC como se describió previamente con una adaptación: después de la prensa de French, el lisado de la célula fue precipitado y redisuelto en el buffer A (vea el ejemplo 3).

Ejemplo 5 Análisis de masa y secuencia del SmD1 natural, de E. coli, y báculoviral

El SmD natural electro-extraído de extractos nucleares de HeLa inmovilizados en una membrana PVDF en un dispositivo ProSpin (Perkin Elmer, California, EE.UU.) fue sometido a una digestión endoLys-C para obtener datos detallados de la secuencia de péptidos internos. La membrana fue incubada con 100 mM de Tris pH 8.2, TritonX-100 hidrogenado al 1%, 1 mM de K_{3}-EDTA, acetonitrilo al 10% y 0.5 \mug de enzima. La digestión fue realizada durante toda la noche a 37ºC. La mezcla de péptido fue separada en una columna de C4 Vydac HPLC (usando un gradiente de solvente B al 10-70%: acetonitrilo al 70%/TFA al 0.1%) y una tasa de flujo de 0.2 ml/min. Los picos del péptido extraído fueron recuperados manualmente. En el péptido 25-mer C terminal del SmD1 se secuenciaron nueve residuos de dimetilarginina, solo las dos últimas argininas eran no modificadas. La posición de N^{G}, N^{G}-dimetilarginina en el cromatograma de la secuencia fue confirmado mediante la aplicación del aminoácido puro modificado (Sigma, San Luis, EE.UU.) como estándar. Esta modificación estuvo ausente en el SmD1 recombinante de E. coli (revelado en el curso del secuenciamiento de los péptidos generados por endo-GluC) implicando que la modificación, resultante de la acción de la metiltransferasa, no ocurre en E. coli.

Esta conclusión fue confirmada mediante el análisis de masa del SmD1 recombinante de E. coli. Esta proteína, que es extraída en un solo pico cuando se realiza la cromatografía de fase inversa, fue analizada mediante electrospray en un espectrómetro de masa de cuatro polos Bio-Q equipado con una fuente iónica de electrospray (Fisons). El \mul de la solución de muestra que contiene 20 pmol en acetonitrilo al 50% - ácido acético al 1% fue analizado. Fue realizada la calibración de las lecturas con 50 pmol de mioglobina de corazón de caballo. La muestra contenía 3 masas: 17,435 Da, 17,305 Da, y 16,992 Da que corresponden respectivamente a la proteína de tamaño completo, la proteína sin la metionina N terminal, y la proteína que carece del Met N terminal y la Arg-Arg C terminal. A partir de estos resultados, se puede concluir que el SmD1 recombinante de E. coli purificado es la molécula intacta, no modificada y que la carencia de inmunoreactividad específica del SmD1 recombinante no es debida a la pérdida del término C.

El análisis de masa del SmD1 recombinante báculoviral mostró un resultado heterogéneo: uno de los mayores picos de masa (17,297 Da) pudiera ser asignado a la proteína no modificada que carece de metionina N terminal mientras dentro de los picos menores las masas de 17,629 y 17,711 podrían ser asignadas tentativamente a la presencia de 7 y 10 dimetilargininas.

Ejemplo 6 Mapeo del epítope de la báculo SmD1

La proteína de fusión del báculo SmD1 fue disuelta con EndoGlu-C como sigue: 300 \mug de proteína precipitada con TCA fueron disueltos en 50 \mul de 100 mM de buffer de acetato de NH_{4} pH 4.3. La enzima EndoGlu-C (Boehringer, Mannheim, Alemania) fue añadida en una proporción de 1/100 y la mezcla fue incubada durante toda la noche a 26ºC. El hidrolizado fue posteriormente secado al vacío (SpeedVac), redisuelto en TFA al 0.1% - ácido acético al 20% y los péptidos fueron separados en una columna HPLC de fase inversa (C_{4}-Vydac). Los picos del péptido fueron recuperados manualmente. Fue seguido un enfoque similar para una digestion EndoLys-C (Boehringer, Mannheim, Alemania) del báculo SmD1 con las siguientes modificaciones: la proteína es disuelta en 50 \mul de 100 mM de Tris-HCl, pH 8, acetonitrilo al 10%, 10 mM de K_{3}EDTA, y la enzima es agregada en una proporción de 1/120.

Las fracciones de HPLC fueron secadas al vacío y disueltas en acetonitrilo al 10%, 50 mM de buffer carbonatado pH 9.6. De cada fracción se motearon 2 \mul en una membrana de nailon ABC (Pall, NY). Después de moteadas, las membranas fueron bloqueadas durante 1 hora en caseína al 0.5% en PBS a lo cual fue añadido 0.25 glicina al 0.1%. Posteriormente, las membranas son incubadas durante toda la noche con suero (1/100) en caseína al 0.5% en PBS suplementado con Triton X705 y 2.03 g/L de MgCl_{2}.6H_{2}O. Las membranas fueron lavadas tres veces durante 3 minutos en PBS, Tween20 al 0.05% e incubadas con anti-IgG humana (1/8000) conjugado con fosfatasa alcalina. La reacción inmune fue visualizada mediante la adición de NBT/BCIP en una solución de 1/500.

Las fracciones derivadas de endoGlu-C fueron incubadas con un suero positivo y un suero de control. Fue revelada una fuerte inmunoreacción con la fracción 17. El secuenciamiento de la fracción 15 mostró que esta fracción contenía el péptido C terminal en el cual el motivo RG está dimetilado. El análisis de masa de la fracción 8 mostró que esta fracción contenía el péptido C terminal sin las argininas modificadas. El análisis de las fracciones ubicadas entre 8 y 17 indicó que esas fracciones contienen el péptido C terminal en el cual los 5 motivos RG finales son dimetilados mientras los 4 primeros motivos RG son parcialmente monometilados. Esto puede ser concluido a partir de una diferencia de masa de 14 entre las fracciones.

Las fracciones derivadas de EndoLys-C (Fig. 1) fueron incubadas separadamente con 6 sueros positivos y un suero de control. En 5 de los 6 sueros positivos, una señal significativamente superior que el suero de control fue limitada a la fracción 15 lo cual fue identificado tanto por secuenciamiento como por análisis de masa como el péptido C terminal con dimetilarginas. Una vez más, el análisis de masa indicó que las fracciones 8 a 14 corresponden a las formas no metiladas y menos metiladas del péptido C terminal.

Estos resultados fueron confirmados aislando de manera selectiva el péptido no modificado y el modificado de un hidrolizado endoLys-C de preparación del SmD1 báculo. En la Figura 1 puede ser apreciado que la fracción 8 con el péptido SmD1 no modificado contenía menos material que la fracción 15 con el péptido dimetilado. Por consiguiente es posible que la reactividad exclusiva del péptido modificado fuera debido a las diferentes cantidades de péptido modificado y no modificado que son transferidas en el experimento dot-blot (Fig. 2). Para excluir tales variaciones cuantitativas, los péptidos fueron analizados en un experimento dot-spot como fue descrito. Sin embargo, en este experimento fueron aplicadas iguales cantidades (basadas en la determinación de la proteína BCA) de ambos péptidos, péptido modificado y no modificado. Para la comparación, el SmD natural total, el SmD1 de E. coli recombinante y el báculoviral fueron aplicados en cantidades comparables en el inmunopunto (Fig. 3). Finalmente los péptidos fueron aplicados en un experimento de inmunoensayo lineal (Polet y otros, Clinical Chemistry, 37, 1991) (Fig. 4). De nuevo iguales cantidades (60 ng) de péptidos SmD1 modificados y no modificados fueron aplicadas a una membrana de nailon. La cantidad de péptido unida fue visualizada mediante teñido coloidal de la proteína (Aurodye, Amersham, Buckinghanshire, Reino Unido; Fig. 4). Adicionalmente, 30, 15 y 7 ng del SmD1 recombinante de células de insectos infectados con báculovirus o E. coli así como una mezcla de SmD1, SmD2 y SmD3 purificados en gel fueron aplicados a las bandas. Estas fueron probadas después con 21 sueros anti-Sm de pacientes que eran inmunoreactivos a una mezcla de SmD1, SmD2 y SmD3 de HeLa. Seis (29%) de esos sueros anti-Sm de los pacientes dieron señales significativas con el péptido modificado D1, mientras el péptido no modificado no reaccionó con ninguno de los 21 sueros probados. Un conjunto independiente de sueros brasileños anti-Sm (n=93) mostró un tasa de reactividad similar con el péptido modificado (4/14 sueros anti-Sm; 29%). Estos experimentos sustentan nuestra hipótesis de que hay al menos 2 epítopes involucrados en la inmunoreactividad del SmD natural: un epítope está presente en la molécula del SmD total recombinante de E. coli mientras un epítope adicional está ubicado en el término C (90-119) de la molécula del SmD1. La presencia de dimetilargininas en este péptido es crucial para el reconocimiento por parte de los sueros de los pacientes.

Referencias

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\newpage

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(1) GENERAL INFORMATION:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

APPLICANT:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME: INNOGENETICS N.V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

STREET: INDUSTRIEPARK ZWIJNAARDE 7, BOX 4

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CITY: GHENT

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

COUNTRY: BELGIUM

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

POSTAL CODE (ZIP): B-9052

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELEPHONE: 00 32 2 241 07 11

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 00 32 2 241 07 99

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITLE OF INVENTION: METHYLATED, SMD HOMOGOGOUS PEPTIDES, REACTIVE WITH THE ANTI- BODIES FROM SERA OF LIVING BEINGS AFFECTED WITH SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NUMBER OF SEQUENCES: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

COMPUTER READABLE FORM:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

MEDIUM TYPE: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTER: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

CURRENT APPLICATION DATA: APPLICATION NUMBER: PCT/EP98/05518

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 19 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..19

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa}

\sac{Gly Xaa Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 11 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..11

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Met Gly Xaa Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 17 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..17

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Gln Val Ala Ala Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Met Gly Xaa Gly}

\sac{Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 38 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..38

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Val Glu Pro Lys Val Lys Ser Lys Lys Arg Glu Ala Val Ala Gly}

\sac{Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly}

\sac{Xaa Gly Gly Pro Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 16 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..16

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asn His Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 15 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION: 1..15

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Xaa Gly Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Xaa Gly Xaa Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 12 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION: 1..12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Arg Ala Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 46 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..46

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gln Gln Asp Xaa Gly Gly Xaa Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Gly}

\sac{Tyr Asn Xaa Ser Ser Gly Gly Tyr Glu Pro Xaa Gly Xaa Gly Gly Gly}

\sac{Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Met Gly Gly Ser Asp Xaa Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 18 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION: 1..18

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gln Gln Asp Xaa Gly Gly Xaa Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Gly}

\sac{Tyr Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 26 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..26

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Gly Tyr Glu Pro Xaa Gly Xaa Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa}

\sac{Gly Gly Met Gly Gly Ser Asp Xaa Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 17 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..17

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Phe Asn Xaa Gly Gly Gly Asn Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Xaa Gly}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 29 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..29

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Phe Asn Xaa Gly Gly Gly Asn Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Xaa Gly}

\sac{Gly Pro Met Gly Xaa Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 38 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..38

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asp Asp Xaa Xaa Gly Xaa Gly Gly Tyr Asp Xaa Gly Gly Tyr Xaa}

\sac{Gly Xaa Gly Gly Asp Xaa Gly Gly Phe Xaa Gly Gly Xaa Gly Gly Gly}

\sac{Asp Xaa Gly Gly Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 14 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..14

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asp Asp Xaa Xaa Gly Xaa Gly Gly Tyr Asp Xaa Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 26 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

FEATURE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NAME/KEY: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCATION:1..26

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTHER INFORMATION:/product= "X stands for a mono- or dimethylated arg"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Tyr Xaa Gly Xaa Gly Gly Asp Xaa Gly Gly Phe Xaa Gly Gly}

\sac{Xaa Gly Gly Gly Asp Xaa Gly Gly Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 19 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg}

\sac{Gly Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 38 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Val Glu Pro Lys Val Lys Ser Lys Lys Arg Glu Ala Val Ala Gly}

\sac{Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly}

\sac{Arg Gly Gly Pro Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH:1 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Met Gly Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 23 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Gln Val Ala Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Met Gly Arg Gly}

\sac{Asn Ile Phe Gln Lys Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 46 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gln Gln Asp Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly}

\sac{Tyr Asn Arg Ser Ser Gly Gly Tyr Glu Pro Arg Gly Arg Gly Gly Gly}

\sac{Arg Gly Gly Arg Gly Gly Met Gly Gly Ser Asp Arg Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 18 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gln Gln Asp Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly}

\sac{Tyr Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 26 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Gly Tyr Glu Pro Arg Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg}

\sac{Gly Gly Met Gly Gly Ser Asp Arg Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 17 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Phe Asn Arg Gly Gly Gly Asn Gly Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 29 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Phe Asn Arg Gly Gly Gly Asn Gly Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly}

\sac{Gly Pro Met Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 38 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asp Asp Arg Arg Gly Arg Gly Gly Tyr Asp Arg Gly Gly Tyr Arg}

\sac{Gly Arg Gly Gly Asp Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly}

\sac{Asp Arg Gly Gly Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 14 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asp Asp Arg Arg Gly Arg Gly Gly Tyr Asp Arg Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 26 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Tyr Arg Gly Arg Gly Gly Asp Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly}

\sac{Arg Gly Gly Gly Asp Arg Gly Gly Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 16 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 15 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SEQUENCE CHARACTERISTICS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LENGTH: 12 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TYPE: amino acid

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEDNESS: single

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGY: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

MOLECULE TYPE: protein

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HYPOTHETICAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu}

Claims (22)

1. Péptido que contiene menos de 50 aminoácidos, que comprende al menos un dímero del tipo XG, donde X representa un residuo de arginina, mono o dimetilada en el grupo de la cadena lateral N-guanidino, dicho péptido siendo capaz de reaccionar específicamente con anticuerpos específicos del lupus eritematoso sistémico, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dicho anticuerpo de manera que un péptido que carece de tal modificación tendrá una constante de disociación para la interacción con un anticuerpo específico del lupus eritematoso sistémico al menos cien veces mayor que la de un péptido metilado que tiene la misma secuencia primaria y dicho péptido no es seleccionado del grupo que consistente en

(i)

GKGXLL, GXGXGXG, SSSQXG o GNFGGGXGGGFGG y X es N^{G}-monometilado o N^{G}-N^{G}-dimetilado; o

(ii)

GXGL, GKGXGL, GKGXHL, GKGXFL, GDGXGL o CGKGXGLC cíclico y X es N^{G}-monometilado.

2. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácido GXGXGXGXGXGXGX
GXGXG (SEQ ID NO 1) o, AXGXGXGMGXG (SEQ ID NO 2) o, KAQVAAXGXGXGMGXGN (SEQ ID N 3) o, DVEPKVKSKKREAVAGXGXGXGXGXGXGXGXGXGGPRR (SEQ ID NO 4)o, DNHGXGXGXGXGXGGG (SEQ ID NO 5) o, GGXGXGGSGGXGXGG (SEQ ID NO 6) o, ERAXGXGXGXGE (SEQ ID NO 7) o, GGQQDXG
GXGXGGGGGYNXSSGGYEPXGXGGGXGGXGGMGGSDXGG (SEQ ID NO 8) o, GGQQDXGGXGXGGGGG
YN (SEQ ID NO 9) o, SGGYEPXGXGGGXGGXGGMGGSDXGG (SEQ ID NO 10) o, DFNXGGGNGXGGXGXG
G (SEQ ID NO 11) o, DFNXGGGNGXGGXGXGGPMGXGGYGGGGS (SEQ ID NO 12) o, GDDXXGXGGYDXG
GYXGXGGDXGGFXGGXGGGDXGGFG (SEQ ID NO 13)o, GDDXXGXGGYDXGG (SEQ ID NO 14) o, GGYX
GXGGDXGGFXGGXGGGDXGGFG (SEQ ID NO 15)

3. Péptido y/o estructura química que comprende cualquiera de los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, fusionado con una molécula de enlace.

4. Péptido circularizado que comprende al menos uno de los péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3.

5. Péptido que comprende y/o que consiste en repeticiones tándem de al menos dos de cualquiera de los péptidos de las reivindicaciones 1 a la 4.

6. Péptido ramificado que comprende al menos uno de los péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5.

7. Método para producir un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6, donde la secuencia de aminoácidos primaria es producida por síntesis química clásica, y donde los residuos de arginina que preceden los residuos de glicina son posteriormente metilados contactando dichos péptidos con una proteína arginina metiltransferasa.

8. Método para producir un péptido que contiene menos de 50 aminoácidos, que comprende al menos un dímero del tipo XG, donde X representa un residuo de arginina, mono o dimetilada en el grupo de la cadena lateral N-guanidino, dicho péptido siendo capaz de reaccionar específicamente con anticuerpos específicos del lupus eritematoso sistémico, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dicho anticuerpo de manera que un péptido que carece de tal modificación tendrá una constante de disociación para la interacción con un anticuerpo específico del lupus eritematoso sistémico al menos cien veces mayor que la de un péptido metilado que tiene la misma secuencia primaria, caracterizado porque dicho péptido es producido mediante síntesis química clásica y dicha arginina metilada es sustituida por un residuo de arginina no metilada durante la síntesis química.

9. Método para producir un péptido que contiene menos de 50 aminoácidos, que comprende al menos un dímero del tipo XG, donde X representa un residuo de arginina, mono o dimetilada en el grupo de la cadena lateral N-guanidino, dicho péptido siendo capaz de reaccionar específicamente con anticuerpos específicos del lupus eritematoso sistémico, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dicho anticuerpo de manera que un péptido que carece de tal modificación tendrá una constante de disociación para la interacción con un anticuerpo específico del lupus eritematoso sistémico al menos cien veces mayor que la de un péptido metilado que tiene la misma secuencia primaria,

dicho método comprendiendo los siguientes pasos:

-

transformar una célula hospedera eucariota con un vector recombinante en la cual un ácido polinucleico es insertado que comprende la secuencia que codifica para dicho péptido bajo el control de los elementos reguladores apropiados de forma tal que dicho péptido o una proteína que comprende dicho péptido es expresada y/o segregada,

\newpage

-

cultivar dicha célula hospedera transformada bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteína o péptido y que permitan una mutilación parcial u óptima de las argininas presentes en dicho péptido,

-

cosechar dicho péptido.

10. Método para producir un péptido que contiene menos de 50 aminoácidos, que comprende al menos un dímero del tipo XG, donde X representa un residuo de arginina, mono o dimetilada en el grupo de la cadena lateral N-guanidino,

dicho péptido siendo capaz de reaccionar específicamente con anticuerpos específicos del lupus eritematoso sistémico, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dicho anticuerpo de manera que un péptido que carece de tal modificación tendrá una constante de disociación para la interacción con un anticuerpo específico del lupus eritematoso sistémico al menos cien veces mayor que la de un péptido metilado que tiene la misma secuencia primaria,

dicho método comprendiendo los siguientes pasos:

-

transformar una célula hospedera eucariota con un vector recombinante en la cual un ácido polinucleico es insertado que comprende la secuencia que codifica para dicho péptido bajo el control de los elementos reguladores apropiados, de forma tal que dicho péptido o una proteína que comprende dicho péptido es expresada y/o segregada,

-

cultivar dicha célula hospedera transformada bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteína o de dicho péptido,

-

cosechar dicha proteína o dicho péptido,

-

metilar los residuos de arginina de dicha proteína o de dicho péptido contactando con una proteína arginina metiltransferasa.

11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, donde dicha célula hospedera es levadura o cualquier otra célula hospedera eucariota la cual es preferiblemente transformada con un báculovirus recombinante.

12. Un anticuerpo desarrollado después de la inmunización con un péptido que contiene menos de 50 aminoácidos, que comprende al menos un dímero del tipo XG, donde X representa un residuo de arginina, mono o dimetilada en el grupo de la cadena lateral N-guanidino, dicho péptido siendo capaz de reaccionar específicamente con anticuerpos específicos del lupus eritematoso sistémico, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dicho anticuerpo de manera que un péptido que carece de tal modificación tendrá una constante de disociación para la interacción con un anticuerpo específico del lupus eritematoso sistémico al menos cien veces mayor que la de un péptido metilado que tiene la misma secuencia primaria, con dicho anticuerpo siendo específicamente reactivo con las formas metiladas de dicho péptido.

13. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. Anticuerpo anti-idiotipo desarrollado después de la inmunización con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, con dicho anticuerpo anti-idiotipo siendo específicamente reactivo con el anticuerpo de la reivindicación 12, imitando así el péptido metilado.

15. Anticuerpo anti-idiotipo de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

16. Una molécula de inmunotoxina que comprende y/o que consiste en molécula de reconocimiento celular siendo

-

un péptido que contiene menos de 50 aminoácidos, que comprende al menos un dímero del tipo XG, donde X representa un residuo de arginina, mono o dimetilada en el grupo de la cadena lateral N-guanidino, dicho péptido siendo capaz de reaccionar específicamente con anticuerpos específicos del lupus eritematoso sistémico, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dicho anticuerpo de manera que un péptido que carece de tal modificación tendrá una constante de disociación para la interacción con un anticuerpo específico del lupus eritematoso sistémico al menos cien veces mayor que la de un péptido metilado que tiene la misma secuencia primaria, o

-

un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, o

-

un anticuerpo anti-idiotipo de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15,

donde dicha molécula de reconocimiento celular está unida covalentemente a una molécula de toxina o a un fragmento activo de la misma.

17. Uso de

-

un péptido que contiene menos de 50 aminoácidos, que comprende al menos un dímero del tipo XG, donde X representa un residuo de arginina, mono o dimetilada en el grupo de la cadena lateral N-guanidino, dicho péptido siendo capaz de reaccionar específicamente con anticuerpos específicos del lupus eritematoso sistémico, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dicho anticuerpo de manera que un péptido que carece de tal modificación tendrá una constante de disociación para la interacción con un anticuerpo específico del lupus eritematoso sistémico al menos cien veces mayor que la de un péptido metilado que tiene la misma secuencia primaria, o

-

un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, o

-

un anticuerpo anti-idiotipo de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15,

o una composición del mismo para la preparación de un kit diagnóstico para la detección del lupus eritematoso sistémico.

18. Un kit diagnóstico para la detección del lupus eritematoso sistémico, dicho kit comprendiendo

-

al menos un péptido que contiene menos de 50 aminoácidos, que comprende al menos un dímero del tipo XG, donde X representa un residuo de arginina, mono o dimetilada en el grupo de la cadena lateral N-guanidino, dicho péptido siendo capaz de reaccionar específicamente con anticuerpos específicos del lupus eritematoso sistémico, con dicha metilación siendo crucial para la reacción entre dicho péptido y dicho anticuerpo de manera que un péptido que carece de tal modificación tendrá una constante de disociación para la interacción con un anticuerpo específico del lupus eritematoso sistémico al menos cien veces mayor que la de un péptido metilado que tiene la misma secuencia primaria, o

-

un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, o

-

un anticuerpo anti-idiotipo de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15,

19. Un kit diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicho péptido o anticuerpo está unido a un soporte sólido.

20. Un kit diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 19, dicho kit comprendiendo un rango de dichos péptidos o dichos anticuerpos, posiblemente en combinación con el SmD1 o SmD3 metilado nativo y el SmD1 o SmD3 recombinante no metilado, donde dichos péptidos son unidos a ubicaciones específicas en un substrato sólido.

21. Un kit diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 20, donde dicho soporte sólido es una banda membranosa y dichos polipéptidos o anticuerpos están acoplados a la membrana en forma de líneas paralelas.

22. Un kit diagnóstico de acuerdo con las reivindicaciones 18 a la 21 donde ciertos péptidos no son unidos a un soporte sólido sino que son proporcionados en una solución aglutinante para ser usados como competidores y/o para bloquear otros anticuerpos que estén presentes en los sueros de los pacientes con enfermedad autoinmune que no sea el SLE, disminuyendo o eliminando así la posible reacción cruzada y/o unión inespecífica.