BRPI0804859A2 - peptìdeos sintéticos para a obtenção de polìmero proteìco para imunização contra leishmaniose, produtos e seus usos - Google Patents
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Abstract
As leishmanioses são doenças endêmicas em diversos países no mundo. Atualmente, estima-se que cerca de 370 milhões de pessoas encontram-se expostas aos riscos de infecção e que 12 milhões sejam clinicamente afetadas pela doença. A presente invenção refere-se a dois peptídeos sintéticos antigênicos (epitopos/mimotopos), selecionados e sintetizados pelas técnicas de phage display e spot synthesis, e ao processo de obtenção de polímero protéico obtido através da conjugação destes peptídeos. O antígeno polimérico formado por esses peptídeos sintéticos foi capaz de induzir proteção contra Leishmaniose Visceral (LV) e oferecer diagnóstico específico para a sua detecção. Além disso, a invenção também compreende o uso desse polímero protéico, a composição vacinal com ele produzida, método de vacinação, método de diagnóstico da doença e kit diagnóstico.
Description
PEPTÍDEOS SINTÉTICOS PARA A OBTENÇÃO DE POLÍMERO PROTEÍCOPARA IMUNIZAÇÃO CONTRA A LEISHMANIOSE, PRODUTOS E SEUS
USOS
A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de peptídeosantigênicos (epitopos ou mimotopos), previamente selecionados pelas técnicasde spot synthesis (síntese peptídica múltipla) e phage display (expressão depeptídeos na superfície de fagos), modificados quimicamente e posteriorformação de polímeros proteícos compostos por esses peptídeos sintéticoscapazes de induzir proteção contra Leishmaniose Visceral (LV) e oferecerimunodiagnóstico específico para a sua detecção.
As leishmanioses são doenças endêmicas em diversos países nomundo. Atualmente, estima-se que cerca de 370 milhões de pessoasencontram-se expostas aos riscos de infecção e que 12 milhões sejamclinicamente afetadas pela doença.
A forma visceral da doença ocorre devido a infecções causadas pelasespécies Leishmania donovani e L infantum em países do Velho Mundo e pelaespécie L. chagasi nas Américas (DESJEUX, P. Leishmaniasis. Public healthaspects and control. Clin. Dermatol., v. 14, p.: 417-442, 1996.). A espécie L.amazonensis pode causar um amplo espectro de formas clínicas deleishmanioses, que abrangem desde lesões cutâneas simples à doençavisceral.
A espécie Leishmania chagasi possui ampla distribuição geográfica nasAméricas, sendo encontrada no Brasil, na Argentina, Colômbia, Bolívia, ElSalvador, Guatemala, Honduras, México, Paraguai e Venezuela. Em seu ciclode transmissão, o cão é considerado o principal reservatório doméstico doparasita, sendo a doença canina considerada mais importanteepidemiologicamente em relação à doença humana, devido à elevadaprevalência da infecção canina, quando comparada aos casos humanosregistrados. Cães infectados, mesmo quando assintomáticos, podemapresentar grande quantidade de parasitas na pele, o que favorece a infecçãodo inseto vetor e, conseqüentemente, a transmissão para o homem (TESH, R.Control of zoonotic visceral leishmaniasis: is it time to change strategies? Am.J. Med. Hyg., v. 52, p. 287-292, 1995).
Vacinas contra as leishmanioses são de difícil desenvolvimento e, por isso,ainda raras. Uma vacina canina encontra-se disponível, denominada deLeishmune®. Esta utiliza como ativo vacinai um complexo antigênicopurificado, incluindo proteínas, que corresponde ao complexo Fucose-ManoseLigante (FML), presente na superfície do parasita, de acordo com o pedido depatente nacional no. PI 9302386-3, intitulada "Composição contendo frações decélulas de Leishmania, denominadas antígeno FML "fucose mannose ligand"ou "ligante de fucose-manose", uso do antígeno FML e de suas subtrações ecomponentes para as aplicações em imunodiagnóstico específico daLeishmaniose Visceral (LV) humana e animal, para aplicações em vacinação,tratamento ou imunoterapia contra a leishmaniose visceral humana e canina".A Leishmune® tem como característica primária a indução de respostahumoral. O cão vacinado desenvolve rapidamente resposta por meio daprodução de anticorpos específicos contra o parasita. Alguns testesapresentados em trabalhos utilizando a referida vacina demonstram que elaprotege cerca de 86% dos animais vacinados, quando inseridos em áreasendêmicas. Os dados destes estudos foram questionados pela comunidadecientífica, bem como pela indústria, uma vez que os animais controle selocalizavam em cidade distinta da que alocou os animais vacinados. Outraimportante falha do teste citado foi a presença de cães, nos dois grupos,utilizando coleiras impregnadas com repelentes de insetos. O parasita étransmitido pela picada de um inseto, e se o contato com o inseto vetor éimpedido pelo uso de coleiras repelentes, o cão não está realmente exposto aodesafio natural preconizado. Com base nos dados acima, é questionável opercentual de proteção descrito. Desta forma, outros estudos foram executadose alguns estão em execução, a pedido do órgão regulador em saúde pública.
Em particular, no que tange à Saúde Pública, é sabido que, porregulamentação da OMS, animais soropositivos devem ser sacrificados. Estamedida é adotada pelo Ministério da Saúde do Brasil. Uma vez vacinado com oproduto acima citado, o animal desenvolverá elevada resposta imunológicabaseada na produção de anticorpos específicos contra o parasita, tornando-sesoropositivo. O diagnóstico preconizado pelos órgãos públicos é o sorológico,por ser barato e de fácil execução, podendo ser aplicado em todas as regiõesdo país, sem maior ônus. Os cães vacinados seguindo-se à risca tal medidadeverão ser sacrificados.
A não diferenciação, por métodos tradicionais, de animais infectadosdaqueles apenas vacinados gera um grande problema para a saúde pública.Os donos de animais vacinados apresentam a carteira de vacinação eimpedem que este seja sacrificado. Levando-se em conta que em cada 100animais vacinados cerca de 14 podem vir a se tornar infectados, causando oaumento de possíveis reservatórios domésticos para a leishmaniose. Outraquestão importante está relacionada aos inquéritos epidemiológicos realizadospelo Ministério da Saúde, que constituem uma importante forma deidentificação da evolução da doença em diferentes regiões. Este inquéritobaseia-se, em parte, nos resultados sorológicos de cães. Com o advento davacinação pela Leishmune®, os resultados obtidos não são reais, pois animaissoropositivos podem ter sido apenas vacinados e não infectados. Por meio deexames que detectam a presença do parasita, tais como a Reação em Cadeiada Polimerase (PCR) e imunocitoquímica, é possível diferenciar os cãessoropositivos devido à vacinação ou à infecção. No entanto, a execução destesexames exige técnicas aprimoradas, equipamentos e reagentes de elevadocusto, além de técnicos capacitados, para garantir fidelidade dos resultados. APCR é realizada em clínicas particulares, seu uso em saúde pública é de difícilimplantação e de elevado custo financeiro.
Adicionalmente, a Leishmune® apresenta elevado custo de produção,chegando ao mercado a preços que impossibilitam o acesso da maioria dapopulação ao produto. O Brasil, sabidamente, possui uma larga faixa de suapopulação com baixa renda e este público não tem acesso ao produto citado.Sendo uma doença em expansão em diferentes regiões do País, torna-se cadavez mais importante adotar medidas que impeçam a continuidade datransmissão do parasita, principalmente a infecção de cães, que habitamdomicílios e peri-domicílios. O possível uso deste produto em campanhas desaúde pública terá elevado custo, além dos problemas já citados. Assim, aLeishmune® contrasta com as medidas de controle adotadas para a epidemiavigente interferindo nos inquéritos epidemiológicos sobre o critério de sacrifíciode cães soropositivos e, ainda, sendo de elevado custo para uso na saúdepública.
Já o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) também édificultado por vários fatores, tais como a ocorrência de manifestações clínicascomuns a outras doenças, a variedade de sintomatologia que os animaisdesenvolvem, a ausência de lesões características nos estágios iniciais dadoença e a baixa especificidade e/ou sensibilidade dos testes sorológicosutilizados (ROURA, X.; SÁNCHEZ, A.; FERRER, L. Diagnosis of canineleishmaniasis by a polymerase chain reaction technique. Vet. Rec, V. 144, P.:262-264, 1999).
As análises histológicas, utilizando fragmentos da pele ou doslinfonodos, são necessárias para a confirmação da LVC, entretanto, deve-seprocurar dissociar as alterações histo-patológicas, como a inflamação ougranuloma, de um diagnóstico positivo da doença (KEENAN, C.N.,HENDRICKS, L.D., LIGHTNER, L, WEBSTER H.K., JOHNSON A.J. Visceralleishmaniasis in a German shepherd dog. I. Infection, clinicai disease andclinicai pathology. Vet. Pathol., v. 21, p. 74-79, 1984; TAFURI, Wg.LI.; TAFURI,W.L; GENARO, O; MICHALICK, M.M.S.; FRANÇA-SILVA, J.C.; MAYRINK, W.;NASCIMENTE, E. Histophatological and immunohistochemical study of type 3and type 4complement receptors in the liver and spleen of dogs naturally andexperimentally infected with Leishmania (Leishmania) chagasi. Rev. Inst. Med.Trop., v. 38, p. 81-88, 1996e; TAFURI, Wg. L; DE OLIVEIRA, M.R.; MELO,M.N.; TAFURI, W.L. Canine visceral leishmaniasis: a remarkablehisthophatologic picture of one case reported from Brazil. Vet. Parasito/., v. 96,p. 203-212, 2001).
O teste parasitológico, com a detecção e identificação do parasita apartir de biópsias de tecidos e/ou aspirados da medula óssea, é o métodoconclusivo para o diagnóstico da doença. Entretanto, é considerado um métodototalmente invasivo.Outras técnicas laboratoriais, tais como a imuno-histoquímica e a PCRnão têm a praticidade de serem empregadas em triagens de campo (FERRER,L; AISA, M.J.; ROURA, X.; PORTÚS, M. Serological diagnosis and treatmentof canine leishmaniasis. Vet. Rec, v. 136, p. 514-516, 1995.; TAFURI, Wg.L;SANTOS, R.L.; ARANTES, R.M.E.; GONÇALVES, R.; MELO, M.N.;MICHALICK, M.S.M.; TAFURI, W.L. An alternative immunohistochemicalmethod for detecting Leishmania amastigotes in paraffin-embedded caninetissues. J. Immunol. Meth., v. 292, p. 17-23, 2004).
Os testes sorológicos utilizados no diagnóstico laboratorial da LVC visamà detecção de anticorpos e/ou antígenos específicos ao parasita. Nestes casos,as técnicas mais utilizadas são a reação de imunofluorescência indireta (RIFI),a análise de imunoabsorção por ligação enzimática (ELISA), o teste deaglutinação direta (DAT) e o Western-Blot (MANCIANTI, F.; PEDONESE, F.;POLI, A. Evaluation of dot enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) forthe serodiagnosis of canine leishmaniasis as compared with indirectimmunofluorescence assay. Vet Parasitol., v. 65, p. 1-9, 1996.; CARVALHO,F.A.A.; CHAREST, H.; TAVARES, C.A.P.; MATLASHEWSKI, G.; VALENTE,E.P.; RABELLO, A.; GAZZINELLI, R.T.; FERNANDES, A.P. Diagnosis ofamerican visceral leishmaniasis in humans and dogs using the recombinantLeishmania donovani A2 antigen. Diag. Microbiol. Infect. Dis., v. 43, p.: 289-295, 2002; DA COSTA, R.T.; FRANÇA, J.C.; MAYRINK, W.; NASCIMENTO,E.; GENARO, O.; CAMPOS-NETO, A. Standardization of a rapideimmunochromatographic test with the recombinant antigens K39 and K26 forthe diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans. Royal Soe. Trop. Med.Hyg., v. 97, p. 678-682, 2003; TAVARES, C.A.; FERNANDES, A.P.; MELO,M.N. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Exp. Rev. Molec. Diagn., v. 3, p.:657-667, 2003; ALMEIDA, M.A.O.; JESUS, E.E.V.; SOUSA-ATTA, M.L.B.;ALVES L.C.; BERNE, M.E.A., ATTA, A.M. Clinicai and serological aspects ofvisceral leishmaniasis in Northeast Brazilian dogs naturally infected withLeishmania chagasi. Vet. Parasitol., v. 127, p. 227-232, 2005; BOARINO, A.;SCALONE, A.; GRADONI, L; FERROGLIO, E.; VITALE, F.; ZANATTA, R.;GIUFFRIDA, M.G.; ROSATI, S. Development of recombinant chimeric antigenexpressing immunodominant B epitopes of Leishmania infantum forserodiagnosis of visceral leishmaniasis. Clin. Diagn. Lab. Immunol., v. 12, p.647-653, 2005; METTLER, M.; GRIMM, F.; CAPELLI, G.; CAMP, H.;DEPLAZES, P. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays, animmunofluorescent-antibody test, and two rapid tests (immunochromatographic-dipstick and gel tests) for serological diagnosis of syntomatic and asyntomaticLeishmania infections in dogs. J. Clin. Microbiol., v. 43, p. 5515-5519, 2005; DASILVA, E.S.; VAN DER MEIDE, W.F.; SCHOONE, G.J.; GONTIJO, C.M.F.;SCHALLIG, H.D.F.H.; BRAZIL, R.P. Diagnosis of canine leishmaniasis in theendemic area of Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil by parasite, antibody andDNA detection assays. Vet. Res. Communic, v. 30, p. 637-643, 2006).Entretanto, tais técnicas apresentam sensibilidade e/ou especificidade variáveise, nos estágios iniciais da doença, em animais clinicamente curados ou emcães saudáveis, porém, residentes em áreas endêmicas da doença, osmesmos podem apresentar resultados falseados (FERRER, L; AISA, M.J.;ROURA, X.; PORTÚS, M. Serological diagnosis and treatment of canineleishmaniasis. Vet. Rec, v. 136, p. 514-516, 1995; TAVARES, C.A.;FERNANDES, A.P.; MELO, M.N. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Exp.Rev. Molec. Diagn., v. 3, p.: 657-667, 2003).
Deve-se ressaltar a especificidade comprometida dos testes quando osmesmos são utilizados em áreas endêmicas de outras doenças, tambémcomuns em nosso meio, tais como doença de Chagas, babesiose, dentreoutras (FERRER, L; AISA, M.J.; ROURA, X.; PORTÚS, M. Serologicaldiagnosis and treatment of canine leishmaniasis. Vet. Rec, v. 136, p. 514-516,1995; MANCIANTI, F.; PEDONESE, F.; POLI, A. Evaluation of dot enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) for the serodiagnosis of canineleishmaniasis as compared with indirect immunofluorescence assay. VetParasito!., v. 65, p. 1-9, 1996; TAVARES, CA; FERNANDES, A.P.; MELO,M.N. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Exp. Rev. Molec. Diagn., v. 3, p.:657-667,2003).
As medidas adotadas pela OMS para o controle da LVC baseiam-se naidentificação dos animais infectados, seguida do seu sacrifício, no combate aosvetores flebotomíneos e no tratamento dos casos humanos. Entretanto, taismedidas não têm se mostrado muito eficazes no controle da doença(GRIMALDI JR, G.; TESH, R.B. Leishmaniasis of the New World: currentconcepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev., v. 6, p. 230-250, 1993).
O tratamento clínico da LVC, independente do fármaco utilizado, não éviável como medida de controle da doença, pois têm custo elevado e,freqüentemente, cães tratados e clinicamente curados apresentam recidivas,permanecendo como fontes de infecção para o vetor, além de aumentar o riscode seleção de linhagens resistentes a tais fármacos, com sérias implicaçõespara o tratamento dos casos humanos (GRAMICCIA M, GRADONI L. Thecurrent status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control IntJ Parasitol. 35(11-12): 1169-80, 2005).
Tal fato, associado à letalidade da leishmaniose visceral (LV) humana naausência do tratamento, levou a OMS a preconizar a eliminação de cãesinfectados ou daqueles que se portarem como soropositivos nos testesimunológicos de triagem para os antígenos de Leishmania como medida decontrole da infecção pelos órgãos de Saúde Pública.
A proteção à re-infecção alcançada, em modelos murinos, após a curada leishmaniose cutânea causada pela espécie L. major tem sido a alavancapreconizada pela OMS para estimular o desenvolvimento de vacinas quepossam ser empregadas como uma medida de controle efetivo da doença(WHO, 1993).
Formas vivas atenuadas de parasitas, extratos antigênicos totais ousolúveis, antígenos semi-purificados ou purificados e, mais atualmente,proteínas recombinantes e plasmídeos de DNA vêm sendo utilizados emdiferentes protocolos experimentais como candidatos à vacina (BUTTON, L.L.and McMASTER, W.R. Molecular cloning of the major surface antigen ofLeishmania. J. Exp. Med., v. 167, p.: 724-729, 1988; FERNANDES, A.P.;HERRERA, E.C.; MAYRINK, W.; GAZZINELLI, R.T.; LIU, W.Y.; COSTA, C.A.;TAVARES, C.A.P.; MELO, M.N.; MICHALICK, M.S.M.; GENTZ, R.;NASCIMENTO, E. Immune responses induced by a Leishmania (Leishmania)amazonensis recombinant antigen in mice and lymphocytes from vaccinatedsubjects. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, v. 39, p.:70-78, 1997.; SJÕLANDER,A.; BALDWIN, T.M.; CURTIS, J.M.; HANDMAN, E. Induction of a Th1 immuneresponse and simultaneous lack of activation of a Th2 response are required forgeneration of immunity to leishmaniasis. J. Immunol., v. 160, p.: 3949-3957,1998; SKEIKY, Y.A.W.; KENNEDY, M.; KAUFMAN, D.; BORGES, M.M.;GUDERIAN, J.A.; SCHOLLER, J.K.; OVENDALE, P.J.; PICHA, K.S.;MORRISSEY, P.J.; GRABSTEIN, K.H.; CAMPOS-NETO, A.; REED, S.G. LeIF:a recombinant Leishmania protein that induces an IL-12-mediated Th1 cytokineprofile. J. Immunol., v. 161, p.: 6171-6179, 1998; WEBB, J.R.; CAMPOS-NETO,A.; OVENDALE, P.J.; MARTIN, T.I.; STROMBERG, E.J.; BADARO, R.; REED,S.G. Human and murine immune responses to a novel Leishmania majorrecombinant protein encoded by members of a multicopy gene family. Infect.Immun., v. 66, p.: 3279-3289, 1998; PIEDRAFITA, D.; XU, D.; HUNTER, D.;HARRISON, R.A.; LIEW, F.Y. Protective immune responses induced byvaccination with an expression genomic library of Leishmania major. J.Immunol., v. 163, p.: 1467-1472, 1999; STÀGER, S.; SMITH, D.F.; KAYE, P.M.Immunization with a recombinant stage-regulated surface protein fromLeishmania donovani induces protection against visceral leishmaniasis. J.Immunol., v. 165, p.: 7064-7071, 2000; Fragaki et al., 200 FRAGAKI, K.;SUFFIA, I.; FERRUA, B.; ROUSSEAU, D.; LE FICHOUX, Y.; KUBAR, J.Immunisation with DNA encoding Leishmania infantum protein papLe22decreases the frequency of parasitemic episodes in infected hamsters. Vaccine,v. 19, p.: 1701-1709, 2001; OLIVEIRA DA SILVA, V.; BORJA-CABRERA, G.P.;PONTES, N.N.C.; SOUZA, E.P.; LUZ, K.G.; PALATNIK, M.; SOUZA, C.B.P. Aphase III trial of efficacy of the FML-vaccine against canine kalazar in anendemic area of Brazil (São Gonçalo do Amaranto, RN). Vaccine, v. 19, p.:1082-1092, 2001; RAFATI, S.; SALMANIAN, A.H.; TAHERI, T.; VAFA, M.;FASEL, N. A protective cocktail vaccine against murine cutaneousleishmaniasis with DNA encoding cysteine proteinases of Leishmania major.Vaccine, v. 19, p.: 3369-3375, 2001; STREIT, J.A.; RECKER, T.J.; FILHO, F.G.;BEVERLEY, S.M.; WILSON, M.E. Protective immunity against the protozoanLeishmania chagasi is induced by subclinical cutaneous infection with virulentbut not avirulent organisms. J. Immunol., v. 166, p.: 1921 -1929, 2001).
Portanto, procura-se desenvolver novos antígenos que apresentemmaior sensibilidade e, principalmente, maior especificidade em relação àquelesatualmente disponíveis visando à obtenção de um diagnóstico laboratorialespecífico para as leishmanioses, que também possam ser utilizados comocandidatos a vacinas contra essa importante doença, de forma a se conseguirmaior eficácia no controle da infecção por Leishmania.
Até o presente momento, nenhum processo de obtenção de potenciaisimunógenos contra a infecção por Leishmania spp. utilizou os métodos dephage display e spot synthesis. O processo biotecnológico de síntese depolipeptídeos artificiais através dos métodos de phage display e spot synthesistem sido empregado com finalidades diversas como, por exemplo, omapeamento de interações proteína-proteína (BIALEK, K.; SWISTOWSKI, A.;FRANK, R. Epitope-targeted proteome analysis: towards a large-scaleautomated protein-protein-interaction mapping utilizing synthetic peptide arrays.Anal Bioanal Chem., v. 376, p.: 1006-1013, 2003) e identificação de epitopos emimotopos para anticorpos específicos (REINEKE, U.; IVASCU, C;SCHLIEF.M.; LANDGRAF, C; GERICKE, S.; ZAHN, G.; HERZEL, H.;VOLKMER-ENGERT, R.; SCHNEIDER-MERGENER, J. Identification of distinctantibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomlygenerated sequences. J. Immunol. Methods, v. 267, p.: 37-51, 2002.).
As técnicas de phage display e spot synthesis são muito menosonerosas em relação àquelas normalmente empregadas para a produção deproteínas recombinantes, pois apresentam um rendimento final mais elevadoem relação às técnicas de purificação convencionais, além de serem de maiorfacilidade de realização técnica e, por esses motivos, mais úteis nas triagensde grande escala (NOYA, O.; PATARROYO, M.E.; GUZMAN, F.; ALARCONDE NOYA, B.; Immunodiagnosis of parasitic diseases with synthetic peptides.Curr. Prot. Peptide Sei., v. 4, p. 299-308, 2003).Algumas patentes encontradas no estado da técnica revelam tecnologiasdesenvolvidas no intuito de apresentar produtos de imunização contra aleishmaniose e diagnosticar a doença, como segue abaixo.
A patente EP1371375A1, intitulada "Vaccine to protect animais againstLeishmania", se refere ao uso da proteína P36, ou fragmento da mesma,oriunda de Leishmania infantum envolvendo um sistema de expressão, atravésde vírus Vaccinia recombinante ou através de plasmídeo pRSET-B para induziruma resposta imunológica celular do tipo Th1 no organismo alvo.
A patente EP1372705A, intitulada "Leishmania vaccines", refere-se a umsistema de vacina de DNA envolvendo um vetor que expressa o gene A2 deLeishmania donovani, além de adjuvantes biologicamente aceitáveis capazesde recrutar resposta imune no organismo no qual a vacina é administrada, alémdo método de sua administração.
A patente EP1395282A1, intitulada "Vaccine complex for preventing ortreating leishmaniasis", refere-se a um complexo imunomodulador específicocomposto de antígenos de excreção/secreção de Leishmania e suaadministração em infecções do parasita nos mamíferos, particularmente emhomens, felinos e eqüídeos.
A patente EP1422238A2, intitulada "Leishmania antigens for use in thetherapy and diagnosis of leishmaniasis", envolve o uso de polipeptídeos quecontém pelo menos uma porção imunogênica de antígenos de Leishmania paracomposição de vacinas, compostos farmacêuticos e as seqüências denucleotídeos necessárias para a produção de tais polipeptídeos, que podemser empregados na profilaxia, diagnóstico e tratamento da doença.
A patente EP1615663A1, intitulada "Agent for treating Leishmaniainfections", consiste na utilização de vetores de expressão de drogas paraserem utilizadas contra a infecção por Leishmania e na obtenção de umavacina. Esta invenção emprega o imunógeno P36 LACK em conjunto com ogene para a proteína Antioxidante Tiol-específico (TSA), o gene para a proteína11 de membrana de cinetoplastídeos (KMP11) e o antígeno GP63 deLeishmania infantum para a produção de resposta imune.A patente US20040235772A1, intitulada "DNA expression construct forthe treatment of infections with leishmaniasis", se refere a uma invenção quecompreende uma vacina baseada no imunógeno p36 e em um vetor deexpressão contendo uma porção cassete de dupla fita, contendo o geneexpresso. Este vetor de DNA recombinante pode ser ligado a um oligopeptídeopara aumentar a eficiência de transfecção.
O pedido de patente WO200864181A2, intulado "Canine LeishmaniaseVaccine", descreve o uso de uma vacina obtida a partir de uma proteína demembrana de Leishmania (KMP11) que previne a implantação e a difusão doparasita em órgãos internos, ao induzir resposta imune contra Leishmania.
O pedido de patente WO2006097642A2 intulado "Compositioncomprenant Ia région N-terminale cThistone H2B de Leishmania- Utilisation pourinduire une réponse immunitaire". Esse pedido descreve um polipetídeoantigênico constituído de um fragmento de uma histona H2B de Leishmaniacapaz de conferir imunização contra a leishmaniose.
A patente EP0679259B1 intitulada "Diagnosis of leishmaniasis" descreveum método de diagnóstico (na forma de kit) para pacientes com suspeita deleishmaniose, onde um antígeno conhecido (K39), preferencialmente com umpolipeptídeo (Gp63), é testado para reatividade com anticorpos do sujeito teste.
Embora existam várias produtos para vacinação contra a leishmaniose,as mesmas apresentam os seguintes problemas: possuem alto-custo e algunsmétodos de vacina baseados em DNA têm o inconveniente do potencial deintegração ou de recombinação gênica das seqüências exógenas com o DNAdo hospedeiro mamífero. Já os testes para diagnóstico de leishmaniosepresentes no mercado possuem baixa especificidade e podem fornecerresultados falsos positivos.
Para solucionar estes problemas, a presente tecnologia propõe o uso deum antígeno proteíco totalmente sintético, constituído de peptídeospreviamente selecionados pelas técnicas de phage display e spot syntesis,para a obtenção de um imunógeno capaz proteger cães através da indução deuma resposta celular contra a leishmaniose visceral e um método dediagnóstico utilizando o produto acima. A presente invenção permite aobtenção em grande quantidade e a baixo custo do polímero antigênico e,ainda, um diagnóstico preciso e sem falsos positivos para a doença, uma vezque as imunizações não induzem resposta humoral frente ao parasita.
O processo de obtenção utiliza, inicialmente, a técnica do phage displaypara a seleção de inúmeros peptídeos imunogênicos que após uma outra etapade seleção por spot-synthesis e posterior síntese e polimerizacao química sãocapazes de induzir a proteção e ser utilizada como vacina. A técnica de phagedisplay é uma técnica utilizada para a seleção in vitro na qual uma proteína oupeptídeo é geneticamente fundido a proteínas de superfície de um bacteriófagofilamentoso, resultando na expressão de uma proteína heteróloga na superfíciedo capsídeo viral. A inserção de seqüências de nucleotídeos nos fagos é feitaem uma região pré-determinada do genoma viral e permite a construção deuma biblioteca conformacional (SMITH, G.P. Filamentous fusion phage: novelexpression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science,v. 228, p.: 1315-.1317, 1985.).
Esta biblioteca possui uma população de ligantes em potencial. Cadamembro da biblioteca apresenta uma forma distinta de peptídeo e, portanto,diferentes capacidades de interação deste com a molécula alvo. Fagos queapresentam em sua superfície peptídeos com especificidade de ligaçãodesejada podem ser selecionados há partir da biblioteca através da ligaçãocom uma molécula imobilizada em uma superfície e a seqüência do peptídeoselecionado pode ser deduzida da seqüência do DNA do fago (SCOTT, J.K.;SMITH, G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, v.249, p.: 386-390, 1990.).
Esta técnica possibilita a expressão de um grande número (maior que1011) de peptídeos ou proteínas na superfície de fagos (SIDHU, S.S.;LOWMAN, H.B.; CUNNINGHAM, B.C.; WELLS, J.A. Phage Display forselection of novel bindings peptides. Methods in Enzymology, v. 63, p.: 328-333, 2000.). Quanto maior o número de formas representadas na biblioteca,mais facilmente será encontrado um ligante específico (POSNER, R.G.; FAY,S.P.; DOMALEWSKI, M.D.; SKLAR, L.A. Continuous spectrofluorometricanalysis of formyl peptide receptor ternary complex interactions. Mol. Pharm., v.45, p.: 65-73,1994).
A partícula viral do bacteriófago M13 é composta por cinco proteínasestruturais denominadas de P3, P6, P7, P8 e P9. No fago selvagem,encontram-se cerca de 2.800 cópias da P8. Nas extremidades do capsídeo,encontram-se de 3 a 5 cópias das demais proteínas estruturais. A P7 e P9encontram-se na extremidade distai enquanto que a P3 e P6 estão na proximal.
A incorporação de proteínas exógenas na superfície dos fagos é feita pelafusão destas às proteínas estruturais. As duas principais proteínas utilizadaspara este fim são a P8 e P3. A P3 é necessária para o reconhecimento einfecção da célula e é a principal proteína estrutural para a apresentação deproteínas exógenas. A P8 é responsável por cerca de 99% da massa molecularda proteína do fago.
Quando comparadas a outras bibliotecas de expressão, os sistemasutilizando fagos filamentosos apresentam algumas vantagens. Uma delasbaseia-se no fato de que fagos filamentosos não lisam as células infectadas, oque possibilita a separação de partículas virais do conteúdo intracelular,eliminando-se muito da reatividade cruzada com proteínas celulares. Outravantagem desta estratégia é a seleção de epitopos descontínuos, significandoser possível selecionar um mimotopo (GEYSEN, H. M.; RODDA, S.J.; MASON,T.J. A priori delineation of a peptide witch mimics a discontinuous antigenicdeterminant. Mol. Immunol., v. 23, p.: 709-715, 1986).
Para o desenvolvimento dos peptídeos sintéticos, foram utilizadasamostras de soro de cães com leishmaniose visceral ativa para a seleção declones de bacteriófagos expressando peptídeos de interesse, específicos aosanticorpos presentes nas amostras de soro dos cães.
Anticorpos da classe IgG foram purificados a partir das amostras de soroeutilizados nos ciclos de bio-seleção (bio-pannings) utilizados na técnica dephage display.
Através deste processo é possível obter dois peptídeos sintéticos e opolímero protéico resultante da conjugação dos mesmos sendo este produtobastante eficaz para imunização e diagnóstico da leishmaniose. Estespeptídeos sintéticos, 11H e 12A, foram conjugados covalentemente por meiodos resíduos de aminoácidos de lisina (lys), inseridos em suas seqüênciaspeptídicas. A ligação dos peptídeos foi otimizada com a utilização deglutaraldeído, que serviu como um ligante adicional (ou "braço") entre ospeptídeos sintéticos.
A tecnologia acima citada pode ser melhor compreendida, de forma nãolimitante, através dos exemplos abaixo:
Exemplo 1. Reatividade dos clones de fagos após os três ciclos de seleção
Após os três ciclos de bio-seleção (b\o-pannings 1, 2 e 3), foi feita umaELISA tipo sanduíche para se verificar o aumento da afinidade entre os clonesselecionados e amplificados e as imunoglobulinas anti-L chagasi (Figura 01).As imunoglobulinas utilizadas no experimento foram as mesmas usadas naseleção inicial dos fagos, nos ciclos de bio-panning.
Pode-se observar que a reatividade dos clones de fagos foi maior nopanning 3 (P3) sugerindo que, após cada ciclo, a especificidade dos clonesamplificados foi aumentada.
Exemplo 2. Seleção individual dos clones de fagos
A análise individual da reatividade dos clones selecionados no P3 foirealizada através de uma ELISA tipo sanduíche. Foram sensibilizadas duasplacas de ELISA com o pool de IgGs anti-L. chagasi, purificadas a partir dasamostras de soro dos cães com LV (na concentração de 10 ug/mL). Comocontrole negativo, foi usado o sobrenadante de cultura de fagos silvestres.
O objetivo desta etapa é individualizar e selecionar apenas os clonescom as maiores reatividades. Na análise da figura 02, pode-se observar umaelevada variabilidade na reação de ELISA dos clones de fagos individuaisfrente ao extrato protéico solúvel de L. chagasi.
Os clones que apresentaram leitura de absorbância com valores iguaisou maiores a 0,8 (Abs de 492nm), foram considerados positivos.
Dos cerca de 190 clones selecionados, 25 deles mostraram-se positivos.Tais clones foram então utilizados para serem testados frente àsimunoglobulinas de cães saudáveis e daqueles com doença de Chagas.Exemplo 3. Especificidade dos clones positivos frente às imunoglobulinaspurificadas de cães saudáveis.
Os 25 clones considerados reativos com IgGs de cães com LV foramanalisados em relação à sua reatividade com IgGs de cães saudáveis. Oresultado, representado na figura 03, demonstra que nenhum dos 25 clonespositivos apresentou reatividade considerada significante frente aos anticorpospurificados a partir de amostras de soro de cães saudáveis.
Exemplo 4. Especificidade dos clones positivos frente às IgGs de cães comdoença de Chagas
A especificidade dos 25 clones positivos foi verificada novamenteatravés do ensaio de ELISA, na qual as placas de ELISA foram sensibilizadascom anticorpos IgGs purificados de cães infectados com Trypanosoma cruzi.(na concentração de 10 ug/mL).
A figura 04 demonstra que a reatividade dos 25 clones selecionados emrelação às IgGs anti-T. cruzi foi baixa, alcançando, na maioria dos clones,absorbancia de 0.1 até a alguns valores em torno de 0.5. O que demostra aespecificidade deste polímero sintético no diagnóstico preciso da leishmaniose.
Os clones que apresentaram elevada reatividade (>1.4) em relação aosanticorpos IgGs anti-Lchagasi e baixa reatividade (<0.2) em relação aosanticorpos anti-T. cruzi foram selecionados. Dessa forma, 3 clones(denominados de 3B, 11H e 12A) foram selecionados para o seqüenciamento eposterior realização de ensaios imunológicos.
Exemplo 5. Imunoensaios com os peptídeos sintetizados, ligados à membranade celulose
O DNA dos 3 clones descritos acima foram individualmente extraídos,quantificados, seqüenciados e, após determinação da estrutura primária dospeptídeos correspondentes, estes foram sintetizados (spot-syntesis) sobre umamembrana de celulose (com 7 repetições de cada peptídeo). As membranas decelulose contendo os peptídeos imobilizados foram então submetidos àimunoensaios de spof-ELISA, com a utilização de amostras de soros de cãescom LV e de soros de cães saudáveis (Figura 06).Pode-se observar que apenas os clones 11H e 12A apresentaramreatividade em relação às amostras de soro de cães com LV. O peptídeo 3Bnão apresentou reação frente às amostras de soro e, dessa forma, não mais foiutilizado nos experimentos.
Exemplo 6. Síntese e purificação dos peptídeos em fase sólida
Uma vez verificada a reatividade dos peptídeos 11H e 12A, frente aanticorpos de animais portadores de LVC os mesmos foram sintetizados nasua forma solúvel usando o método de síntese em fase sólida, estratégia F-moc.
Os peptídeos foram purificados por cromatografia em fase reversautilizando a coluna Sephasil Peptide C18 - Shimadzu (volume 4.24 ml_,diâmetro 0.46 cm e altura 15 cm) acoplada a sistema de HPLC.
O perfil cromatográfico de um dos peptídeos apresentou um picoprincipal quando foi utilizado um gradiente de acetronitrila que variou de 0 a25% de acetronitrila em 75 minutos. O perfil cromatográfico está representadona figura 06. Os picos principais foram liofilizados e sua análise foi realizadapor espectrometria de massa, para confirmação da massa molecular dospeptídeos (figura 07).
Exemplo 7. Análise por eletroforese em gel de policrilamida a 15% dospeptídeos sintetizados e polimerizados com glutaraldeído
Os polipeptídeos 11H e 12 A foram acoplados da seguinte forma:Foram adicionados uma miligrama de peptídeo 11 H + 1 miligrama do peptídeo12 A+1000 ul de PBS 1x. Adicionou-se 1 ml_ de solução de glutaraldeído a 1%(980 uL de PBS + 20ul_ de glutaraldeído a 25%). Gotejou-se a solução deglutaraldeído a 1%, a temperatura de 4°C e agitou-se com velocidadeconstante por 1 hora. Interrompeu-se a reação utilizando-se solução de NaBH4(10mg para cada 1 ml_), por 1 hora, sob agitação constante e à temperatura de4°C. Dialisou-se em membrana de diálise (de 3000 kDa) overnight sob agitaçãoa 4°C com PBS 1X. O polímero foi então dosado pelo método de Bradford.
Para a polimerização dos peptídeos 11H e 12A, foram acrescidos 2 resíduosde aminoácidos (lisina e tirosina) em cada peptídeo. O acréscimo dos doisaminoácidos na posição C-terminal de cada peptídeo possibilita também adosagem dos peptídeos e do polímero formado, assim como a ligação com asplacas de ELISA (Figura 08).
Na análise por eletroforese em gel de policrilamida 15%, pode-seobservar que o polímero composto pelos peptídeos 11H e 12A apresentou umamassa molecular aproximada entre 25-40 KDa (Figura 09).
Exemplo 8. Avaliação da eficiência do polímero como imunógeno
A eficácia protetora induzida pela imunização com o polímero formadopelos dois peptídeos sintetizados com os resíduos adicionais de lisina e tirosinafoi avaliada em camundongos BALB/c contra a infecção desafio com L.amazonensis.
Na avaliação do desenvolvimento das lesões (figura 10), pode-seobservar que os animais imunizados com o polímero composto pelos peptídeos11H e 12A apresentaram redução significativa no tamanho dos edemas,quando comparados aos grupos controles. Na avaliação da carga parasitária,pode-se observar (figura 11) que os animais imunizados com o polímeroapresentaram redução significativa na carga recuperada de parasitas, emrelação aos grupos controles, que não apresentaram diferenças entre si.
Dessa forma, pôde-se observar a concordância entre os resultadosobtidos na avaliação do tamanho médio das lesões e na carga parasitária dosanimais imunizados com o polímero composto pelos peptídeos 11H e 12A edos animais dos grupos controle. Estes resultados indicaram a eficácia dospeptídeos polimerizados, mesmo tendo sido selecionados a partir de amostrasde soro de cães infectados com L. chagasi, em conferir proteção heterólogacontra L. amazonensis.
Na avaliação da resposta imune celular, foi realizada a determinaçãodos níveis de IFN-gama, IL-4 e IL-10 nos sobrenadantes de cultura celular dosesplenócitos dos animais imunizados e/ou desafiados.
Pode-se observar, pela análise da Figura 12, que os animais dos gruposcontrole apresentaram, antes e após a infecção desafio, uma baixa produçãode IFN-y utilizando os peptídeos sintéticos ou o extrato protéico solúvel de L.amazonensis (SLALA) como antígenos estimuladores das células.Nos animais imunizados com os peptídeos polimerizados, observou-seque seus esplenócitos produziram níveis elevados de IFN-y, antes e após odesafio, quando estimulados tanto com os polímero, quanto com o SLALA. Aprodução observada foi significativamente maior após o desafio, em relaçãoaos níveis obtidos antes da infecção, utilizando o polímero ou o SLALA comoantígenos sensibilizadores.
Na avaliação dos níveis de IL-4 e IL-10 nos sobrenadantes das culturasde esplenócitos, pode-se observar que, antes da infecção desafio, os níveisdessas citocinas foram similares nos grupos avaliados, utilizando-se o polímeroou o SLALA como antígenos estimuladores (Figura 13).
Após o desafio, os animais que receberam PBS produziram níveissignificativamente maiores de IL-4 e IL-10 em relação aos animais imunizadoscom o adjuvante de Freund ou com o polímero associado ao adjuvante (Figura14), utilizando-se o SLALA como antígeno estimulador.
Comparando-se os níveis destas citocinas entre os grupos adjuvantes epolímero mais adjuvante, verificou-se que os níveis de IL-4 foram similaresentre os dois grupos. Entretanto, na avaliação dos níveis de IL-10, pode-seobservar que tal citocina encontra-se com valores médios significativamentemaiores no grupo adjuvante, em relação aos animais imunizados com opolímero, utilizando-se o extrato protéico do parasita como antígenoestimulador das células esplênicas.
A produção de anticorpos foi também avaliada nos animais imunizadoscom o polímero, antes e após a infecção desafio com L. amazonensis.
Pode-se observar, pela análise da Figura 15, que, utilizando-se o SLALAcomo antígeno sensibilizador das placas de ELISA, pode-se observar que,antes da infecção desafio, os animais de todos os grupos apresentaram baixosníveis de IgG total, lgG1 e lgG2a. Entretanto, após o desafio, observou-se queos animais dos grupos PBS e adjuvante produziram níveis de lgG1, específicosao parasita, significativamente maiores em relação aos níveis de lgG2a (Figura15). Os níveis de anticorpos IgG total, lgG1 e lgG2a específicos aos peptídeos11H e 12A permaneceram baixos, antes e após a infecção desafio.Os resultados apresentados indicam que a o polímero composto pelospeptídeos sintéticos 11H e 12A induziu o desenvolvimento de uma respostaimune Th1, que se correlaciona com o perfil de resposta imune observado nofenótipo de proteção contra as leishmanioses, tanto no modelo murino, quantoem cães assintomáticos e/ou resistentes à infecção (Pinelli et al., 1994;Quinnell et al., 2001; Santos-Gomes et al., 2002).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 01- Reatividade dos fagos dos pannings 1, 2 e 3. Sensibilização daplaca de ELISA com 10 mg/ml de IgG policlonal anti-L. chagasi e incubaçãocom 1x1010 fagos eluídos dos pannings 1, 2 e 3 (P1, P2 e P3). Como controlenegativo, fagos silvestres, que não expressam peptídeos de interesse, foramutilizados nos ensaios.
Figura 02- ELISA tipo sanduíche para a individualização dos clones de fagos.Sensibilização da placa de ELISA com 5 ug/ml de IgGs anti-L. chagasi eincubação com 50 ul do sobrenadante de cultura de K91 infectada com osfagos de interesse e, no controle negativo, 50 ul de sobrenadante de cultura deK91 infectadas com fagos silvestres.
Figura 03- Especificidade dos clones positivos frente às IgGs de cãessaudáveis. Sensibilização da placa de ELISA com 10 ug/ml de IgGs de cãessaudáveis e incubação com 50 ul de sobrenadante de bactérias K91 infectadacom os fagos de interesse. Como controle positivo, a placa foi sensibilizadacom o pool de IgGs anti-L. chagasi e incubada com 50 ul do sobrenadante deum dos fagos positivos.
Figura 04- Especificidade dos clones positivos frente às IgGs de cão anti-T.cruzi: clone 2 (peptídeo 11H), clone 16 (peptídeo 12 A) e clone 18 (peptídeo3B). Sensibilização da placa de ELISA com 10 ug/ml de IgGs de cãeschagásicos e incubação com 50 ul de sobrenadante de cultura de K91infectada com os fagos selecionados. As barras de cor preta representamreação dos clones com IgGs de cães com LV; as barras maleadas representama reação dos clones em relação às IgGs anti-T. cruzi.
Figura 05- Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana decelulose com amostras de soro de cães com LV. Pools de soros positivos (A) enegativos (B) foram usados na diluição 1:250. Foi empregado o anticorpo anti-IgG de cão, conjugado à peroxidase, na diluição de 1:500.Figura 06- Perfil de eluição dos peptídeos sintéticos em coluna de fase reversaC18 e sistema de HPLC.
Figura 07- Análise por espectrometria de massa dos picos purificados.
Figura 08- Polimerização dos peptídeos 1H e 12A. Os peptídeos 11H e 12Aforam acoplados utilizando-se uma solução de glutaraldeido a 1%. Este écapaz de interagir com as lisinas e o grupo amino das cisteínas formando umaligação covalente.
Figura 09- Eletroforese dos peptídeos polimerizados em gel de poliacrilamidaSDS-PAGE a 15%, corado pela prata. Alíquotas de 20 ul foram separadas emgel de policrilamida 15% em condições não-redutoras e posteriormente coradaspela prata. Canaleta (A) 10 ug do polímero 11H-12A; canaleta (B) 20 ug depolímero e, na canaleta e (C), o padrão de baixo peso molecular (5 ug).
Figura 10- Avaliação do tamanho médio das lesões nas patas infectadas decamundongos BALB/c imunizados com o polímero, após a infecção desafiocom L. amazonensis. No painel A, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante eC3=polímero e adjuvante. No painel B, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante,C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante,C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALAe adjuvante.
Figura 11- Quantificação de parasitas nas patas de camundongos BALB/cimunizados com peptídeos sintéticos, após cerca de 9 semanas da infecçãodesafio com L. amazonensis. No painel A, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante eC3=polímero e adjuvante. No painel B, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante,C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante,C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALAe adjuvante.
Figura 12- Produção de IFN-v pelos esplenócitos de camundongos BALB/cimunizados, antes e após a infecção desafio com L. amazonensis. No painel A,temos: C1=PBS, C2=Adjuvante e C3=polímero e adjuvante. No painel B,temos: C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante, C4=polímero nãorelacionado e adjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A eadjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante. A estimulação dos esplenócitos foirealizada com 50 ug/ml de SLALA ou com 10 ug/ml do polímero, sendoincubadas por 48 horas a 37° C e 5% de C02.
Figura 13- Produção de IL-4 e IL-10 pelos esplenócitos de camundongosBALB/c imunizados com o polímero, antes da infecção desafio com L.amazonensis. No painel A, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante e C3=polímero eadjuvante. No painel B, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero eadjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante, C5=polímero 11H eadjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante. Aestimulação dos esplenócitos foi realizada com 50 ug/ml de SLALA ou com 10ug/ml do polímero, sendo incubadas por 48 horas a 37° C e 5% de C02.Figura 14- Produção de IL-4 e IL-10 pelos esplenócitos de camundongosBALB/c imunizados com o polímero, antes e após a infecção desafio com Lamazonensis. A e B) C1=PBS, C2=Adjuvante e C3=polímero e adjuvante. EmC, D, E e F, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante,C4=polímero não relacionado e adjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante,C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante. A estimulaçãodos esplenócitos foi realizada com 50 ug/ml de SLALA ou com 10 ug/ml dopolímero, sendo incubadas por 48 horas a 37° C e 5% de CO2.
Figura 15- Produção de IgG total, lgG1 e lgG2a nos animais imunizados, cercade 9 semanas após a infecção desafio com L. amazonensis. C1=PBS,C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado eadjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, emC7=SLALA e adjuvante. Sensibilização das placas de ELISA com 1,0 ug/ml doextrato protéico solúvel de L. amazonensis (SLALA) e incubação com asamostras de soro de camundongos, na diluição de 1:100.
Claims (12)
1. PEPTÍDEO SINTÉTICO caracterizado por ser Seq. ID n° 1 e por serimunogênico contra Leishmania.
2. PEPTÍDEO SINTÉTICO caracterizado por ser Seq. ID n° 2 e por serimunogênico contra Leishmania.
3. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE POLÍMERO PROTEICO caracterizadopela conjugação dos peptídeos sintéticos Seq. ID n° 1 e Seq. ID n° 2, atravésdo emprego de glutaraldeído, como promotor de ligação entre resíduos delisina presentes em ambos os peptídeos.
4. POLÍMERO PROTEICO caracterizado por conter os peptídeos sintéticosSeq. ID n° 1 e Seq. ID n° 2 conjugados.
5. POLÍMERO PROTEICO, de acordo com reivindicação 4, caracterizado porser compreendido por diferentes números de repetições e combinações dospeptídeos Seq. ID n° 1 e Seq. ID n° 2.
6. POLÍMERO PROTEICO, de acordo com reivindicação 4, caracterizado porser compreendido entre 25 a 40 kDa.
7. USO DO POLÍMERO PROTEICO caracterizado por ser em uma composiçãovacinai contendo o polímero protéico preconizado na reivindicação 4.
8. COMPOSIÇÃO VACINAL caracterizado por conter o polímero protéicopreconizado na reivindicação 4 como componente imunógeno contraleishmaniose em mamíferos e estimular resposta imune do tipo Th1.
9. COMPOSIÇÃO VACINAL, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopor conter um adjuvante como imunoestimulante.
10. MÉTODO DE VACINAÇÃO caracterizado pela administração dacomposição vacinai preconizada na reivindicação 8 poder ser por viaintramuscular, subcutânea, intranasal, oral.
11. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO PARA LEISHMANIOSE caracterizado porempregar o polímero protéico preconizado na reivindicação 4 em um ensaiotipo ELISA para a detecção da leishmaniose.
12. KIT PARA DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com areivindicação 11, caracterizado por constituir um suporte sólido contendo opolímero protéico preconizado na reivindicação 4, amostra de material biológicoe demais reagentes a fim de possibilitar o diagnóstico para a leishmaniose.Seq. ID n°: 01Características da seqüência:a) tamanho: 14 aminoácidosb) Tipo: peptídeoc) Topologia: lineard) Nome: 11HLys Tyr lie Cys Ala Arg Gln Asp Pro Ala Gly Asn Cys Ser 14Seq. ID n°: 02Características da seqüência:a) tamanho: 14 aminoácidosb) Tipo: peptídeoc) Topologia: lineard) Nome: 12ALys Tyr Lys Cys Pro Ser lie Pro Gly Ala Vai Leu Cys Vai 14
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