JPH09508891A

JPH09508891A - 自己免疫疾患の治療におけるナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤の使用

Info

Publication number: JPH09508891A
Application number: JP7514592A
Authority: JP
Inventors: ワインバーグ，ジェイ．，ブライス
Original assignee: デュークユニバーシティメディカルセンター
Priority date: 1993-11-17
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 1997-09-09
Also published as: EP0729356A1; WO1995013805A1; CA2176747A1; AU1209995A

Abstract

(57)【要約】本発明は、リューマチ様関節炎、インシュリン依存性真性糖尿病、全身性エリテマトーデス及び糸球体腎炎などの自己免疫疾患を治療又は予防する方法であって、ナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤又はナイトリックオキサイドスカベンジャーの有効量をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】自己免疫疾患の治療におけるナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤の使用発明の背景ＭＲＬ−１ｐｒ／１ｐｒ系マウスは、ヒトの自己免疫疾患のモデルとして研究されてきた。この系統のマウスは、リンパ節疾患、自己抗体産生ならびに腎炎、血管炎および関節炎を含む炎症発現を特徴とする自然発生自己免疫疾患を発症する（エル・ハングら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン１５５巻１６９０−１７０１頁（１９８２年）；アール・エイ・アイゼンバーグら、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・リューマトロジー７巻Ｓ３５−Ｓ４０頁（１９８９年））。免疫機能の異常は、構成マクロファージクラスＩＩ抗原発現の増加、分離腎、リンパ節および脾臓細胞におけるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６濃度の上昇ならびにマクロファージ「活性化」の増大状態をも含む。これらの疾患は発症は、マウス染色体１９上のＦａｓ細胞自滅遺伝子の単一遺伝子突然変異（１ｐｒ）およびＭＲＬ系からの背景遺伝子の両者の結果である。疾患発症に寄与するＭＲＬの遺伝子は同定されていないが、腎疾患に寄与する２個の座が、マウス染色体７および１２の領域に地図化されている。種々の型の細胞が産生する多機能分子であるＮＯ（ナイトリックオキサイド、 nitric oxide）は、ナイトリックオキサイドシンターゼ（nitric oxide synthas e:ＮＯＳ）という酵素の作用によってＬ−アルギニンからＬ−シトルリンとＮＯへの変換により生ずる。ＮＯは、平滑筋の弛緩を促進し、神経伝達物質として作用し、微生物および腫瘍細胞の静止および／または溶解を惹き起こし、および造血細胞の機能と分化を調節することが指摘されている。またＮＯは、強力な前炎症作用を有する。ＮＯは、炎症組織の血管の透過性を増加する可能性がある。また、疼痛は炎症の重要な特性の一つである。現在既に、数種のグループが、ＮＯが炎症における疼痛の伝達において役割をはたしていることを証明した。ヒトに対するＮＯ含有溶液の皮内注射は、その部位における用量に相関した疼痛発症を惹き起こした（エイチ・ホルシューゼンおよびジェイ・オー・アーント、ニューロサイエンス・レターズ１６５巻７１−７４頁（１９９４年））。すなわち、炎症の間違いない症状である疼痛は、ＮＯにより誘発され得る。またＮＯは、細胞によるＴＮＦおよびＩＬ−１産生増加を惹き起こし、細胞の過酸化水素産生能力を増加することが示されている。また、ウサギおよびヒトの軟骨細胞は、ＮＯを産生し、種々のサイトカインおよび細菌生産物に応答して誘導可能なナイトリックオキサイドシンターゼ（ｉＮＯＳ）を発現することが示されている。ＮＯはラットにおける免疫複合体血管炎の重要な伝達物質である（エム・エス・ミュリガンら、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー１０７巻１１５９−１１６２頁（１９９２年））。ある研究者らは、モルモットの炎症性腸疾患（エム・ジェイ・ミラーら、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピー２６４巻１１−１６頁（１９９３年））ならびにマウスまたはラットの誘発腎炎（アール・ファラリオら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサイアティー・オブ・ネフロロジー４巻１８４７−１８５４頁（１９９４年））におけるＮＯの役割を指摘した。また、炎症性疾患のヒト以外のモデルにおける研究から、ＮＯが実験的誘発ぶどう膜炎に関与することが確認された（ディー・ジェイ・パークスら、アーカイブス・オブ・オフタルモロジー１１２巻５４４−５４６頁（１９９４年））。さらに、関節炎をもつヒトの研究から、ＮＯがヒトの関節炎に重要な役割を果たすことが証明された。ファレルらは、炎症性関節炎（リューマチ様関節炎および骨関節炎）の患者で、関節液および血清中においてＮＯの代謝物質である亜硝酸塩の濃度が上昇していることを示した（エイ・ジェイ・ファレルら、アナルス・オブ・リューマティック・ディジージズ５１巻１２１９−１２２２頁（１９９２年））。リューマチ様関節炎の患者は、関節液および血清中のニトロチロシン濃度が上昇していた（エイチ・カウルおよびビー・ハリウエル、フェブス・レターズ３５０巻９−１２頁（１９９４年））。細胞由来ＮＯは、スーパーオキシド（Ｏ₂・−）と反応してペルオキシニトライト（ＯＮＯＯ−）を生成し、ついでこれが、細胞および組織に対する強い傷害および破壊能力をもつ分子であるヒドロキシルラジカルを自然に生じ得る。別の研究者は、炎症ラットモデルにおいて、ペルオキシニトライトが前炎症性であることを示した（ディー・ラクミレビッチら、ガストロエンテロロジー１０５巻１６８１−１６８８頁（１９９３年））。ニトロチロシンは、チロシンにペルオキシニトライトが作用して生成し、それはＮＯの存在に関する安定な「足跡」または「航跡」であるように思える（ジェイ・エス・ベックマンら、メソッズ・イン・エンジモロジー２３３巻２２９−２４０頁（１９９４年））。ヒトの血管のじゅく状斑において、マクロファージおよび炎症がニトロ化された蛋白質と関連があることが（抗ニトロチロシン抗体を使用して）見いだされ（ジェイ・エス・ベックマンら、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−ザイラー３７５巻８１−８８頁（１９９４年））、ヒトにおいてニトロチロシンがインビボで生成することの追加的証拠をもたらした。発明の概要本発明は、それを必要とする患者に、有効量のナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤またはナイトリックオキサイドスカベンジャー(nitric oxide scaven ger)を、好ましくは腸内経由で投与することを含む、リューマチ様関節炎、インシュリン依存性真性糖尿病、全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎のような自己免疫疾患を治療または予防する方法に関するものである。図面の簡単な説明図は、Ｎ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニン（ＮＭＭＡ）で治療するかまたは非処置のままのＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスにおける病理学的特徴のスコアを示す棒グラフである。発明の詳細な説明ここに、ナイトリックオキサイドの濃度が、自己免疫疾患、特にリューマチ様関節炎、インシュリン依存性真性糖尿病、全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎のような慢性疾患の発現に関係づけられた。インビボでナイトリックオキサイドを合成することが知られているナイトリックオキサイドシンターゼの阻害剤またはナイトリックオキサイドスカベンジャーは、自己免疫疾患の予防または治療に有用で有り得る（ジルクソンら、アース・リューム３６巻（補遺）Ｓ２１９頁、１９９３年（９月））。本発明で使用し得るナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤は当該技術分野で既知のものであり、アミノグアニジン、Ｎ^G−アミノ−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G− メチル−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−ニトロ−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルおよびＮ^G−イミノエチル−Ｌ−オルニチンのような基質類似体、ジフェニレンヨードニウム、ヨードニウムジフェニルおよびジ−２− チエニルヨードニウムの様なフラビン蛋白質結合剤、カルシノイリン、トリフルオロペラジン、Ｎ−（４−アミノブチル）−５−クロロ −２−ナフタレンスルホンアミドおよびＮ−（６−アミノヘキシル）−１−ナフタレンスルホンアミドの様なカルモジュリン結合剤、一酸化炭素の様なヘム結合剤、２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジンの様なテトラヒドロビオプテリン枯渇剤または類似体ならびにコルチコステロイド、ＴＧＦ−β^C−１、−２、３、インターロイキン−４、インターロイキン−１０およびマクロファージ不活性化因子（ナタン、ザ・ファセブ・ジャーナル６巻、１９９２年９月、３０５１−３０６４頁）の様な誘導阻害剤を含む。好ましいのは、ナイトリックオキサイドシンターゼの基質類似体である、Ｎ^G−アミノ−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−メチル−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−ニトロ−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルおよびＮ^G−イミノエチル−Ｌ−オルニチンである。特に好ましいのは、Ｎ^G−アミノ−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−メチル−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G −ニトロ−Ｌ−アルギニンおよびアミノグアニジンである。最も好ましいのは、Ｎ^Gメチル−Ｌ−アルギニンである。薬学的に許容されうる塩類もまた、投与することができる。適当な塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨー化水素酸塩、硫酸塩および酢酸塩のような酸塩、ならびにアミン塩、アンモニウム塩、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩のような塩基との塩が含まれる。ナイトリックオキサイドスカベンジャーは、ヘモグロビン（ワンら、ライフ・サイエンシズ４９巻５５−６０頁（１９９１年）およびコバラミン（シー・ジー・ラヤナヤガムら、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー１０８巻３−５頁（１９９３年）；ジェイ・ザタラインら、クリニカル・リサーチ４１巻７８３Ａ頁（１９９３年））のような、インビボでナイトリックオキサイドと反応する化合物である。上記の化合物は、当該技術分野で既知であり、市販されている。本発明で請求される化合物は、単独でまたは適当な医薬組成物の形で投与することができる。投与方法は、腸内経由、非経口または局所適用のような当該技術分野で既知のものである。腸内経由が好ましく、経口投与が特に好ましい。適当な医薬用担体を使用することができ、これには水、塩の溶液、アルコール類、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロースまたは澱粉のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘稠パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。医薬製剤は滅菌することができ、所望により、例えば滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用塩類、緩衝剤、香味料、着色剤および／または芳香物質などのような有効成分と反応して分解しない補助剤と混合することができる。非経腸適用の場合、特に適当なのは注射可能な、好ましくは油性もしくは水性の滅菌液剤、および懸濁剤、乳剤、または座剤を含む植え込み剤である。アンプルは、便利な単位用量である。経口適用は、好ましくはカプセル、錠剤および／または液体製剤の形で投与される。単位形態用量が好ましい。局所適用は、液剤、ジェルまたはクリームの形で投与することができる。特定の症例における活性化合物の実際の量は、例えば使用する具体的化合物、処方した特定の組成物、投与法ならびに患者の年齢、体重および症状により異なることに注意すべきである。特定の患者に対する用量は、通常の考慮（例えば、適当な慣用の薬理学的プロトコルによる）により通常の熟練者が決定することができる。さらに、この発明を以下に示す実施例により説明する。実施例亜硝酸塩／硝酸塩排泄マウスをメタボリズムケージに（１ケージ３頭づつ）収容し、脱イオン蒸留殺菌水および所定のアルギニンと硝酸塩の無含有食餌で飼育した。尿を、細菌の増殖を阻害するためイソプロパノール中に集めた。尿中亜硝酸塩／硝酸塩濃度を、既報（ディー・エル・グランジャーら、ジャーナル・オブ・イムノロジー１４６巻１２９４頁（１９９１年））のように分光光度法により定量した。測定は二連または三連で行った。尿中蛋白質を、ブラッドフォードアッセイにより測定した。ついで総硝酸塩排泄を、濃度および尿量に基づいて計算した。硝酸塩無含有食餌をとる動物では、尿中亜硝酸塩／硝酸塩排泄はＮＯの内因性産生を正確に反映する。種々の系統のマウスにおけるＮＯ産生を定量するために、我々は、基本条件下で毎日集めた尿を分析した。３月齢において１０日間にわたり分析したところ、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスは、Ｃ３Ｈ系マウスよりも多く亜硝酸塩／硝酸塩を排泄する。同様に６週齢で始まる期間について分析したところ、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスは、年齢とともにＢ６系マウスよりも高濃度の亜硝酸塩／硝酸塩を排泄する。高亜硝酸塩／硝酸塩排泄は、ほぼ１０ないし１２週齢で蛋白尿排泄と平行して始まる。水に入れたＮＭＭＡ５０ｍＭをＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスに経口投与すると、高濃度亜硝酸塩／硝酸塩排泄が減少した。ＮＭＭＡはＮＯＳの特異的阻害剤であるから、このことは亜硝酸塩／硝酸塩がこの酵素の産生物であることを意味する。ＭＲＬ−＋／＋（１頭当たり１日０．８μモル）およびＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ（１頭当たり１日１．２μモル）系（各群マウス３頭）の５月齢マウスにおける亜硝酸塩／硝酸塩排泄レベルは正常であった。これらの結果は、ｌｐｒ遺伝子それ自体もＭＲＬ遺伝的背景を有するものも亜硝酸塩排泄上昇に充分なものでなく、ｌｐｒ遺伝子とＭＲＬ背景の遺伝的要因の両者が必要であることを示す。インビトロにおけるナイトリックオキサイド産生およびナイトリックオキサイドシンターゼ含量脾臓、肝臓、腎臓、リンパ節および腹腔の各細胞を集め、１００μＭフェニルメチルスルフォニルフルオリド、５μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌキモスタチンおよび５μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含む緩衝液−プロテアーゼ阻害剤カクテルに入れ、ドライアイスエタノールスラリー中で急速冷凍した。ついで、これらの組織細胞を、くり返し凍結・解凍サイクル中に乳棒により破壊した。遠心分離後細胞質ゾルを集め、既知の方法（ディー・エス・ブレットおよびエス・エイチ・スナイダー、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユーエスエイ８６巻９０３０頁（１９８９年）；ピー・エイ・シャーマンら、バイオケミストリー３２巻１１６００頁（１９９３年）））の修正法を使用して蛋白質およびＮＯＳ活性を測定した。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００μＭ−ＮＡＤＰＨ、１ｍＭジチオスレイトール、１０μＭ−ＦＡＤ、１００μＭテトラヒドロビオプテリンおよび１０μＭ−Ｌ−アルギニンを含むものであった。我々は、グアニジノの位置にトリチウムでラベルしたＬ−アルギニンを使用した（製品番号ＮＥＣ４５３、デラウェア州ウイルミントン、ニュー・イングランド・ニュクレアー）。試料３０μｌを、総量５０μｌの反応混合物中に入れて用いた。試料は、２連または３連で行った。正常ＢＡＬＢ系マウスから得た腹腔内マクロファージは、エンドトキシンまたはＩＦＮ−γ単独で処理したとき亜硝酸塩／硝酸塩産生の増加を示さなかったが、それらの組み合わせでは産生を著しく増加した。対照的に、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た腹腔マクロファージは、エンドトキシンおよびネズミＩＦＮ−γ単独処理およびエンドトキシンとＩＦＮ−γの組み合わせ処理において応答が増加した。組織ｉＮＯＳｍＲＮＡの発現が増加しているかどうかを決定するため、ＲＮＡをＢＡＬＢおよびＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの器官から抽出した後、ノザーン分析によりｉＮＯＳｍＲＮＡの発現を試験した。ｉＮＯＳｍＲＮＡ（大きさはほぼ４．７キロベース）は、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの腎臓および脾臓組織にみられたが、ＢＡＬＢ系マウスの同じ器官にはみられなかった。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系およびＢＡＬＢ系マウスの種々の組織および細胞を抽出し、¹⁴Ｃ−Ｌ−アルギニン（グアニジノの位置をラベル）を¹⁴Ｃ−Ｌ−チトルリンに変換するそれらの能力について分析した。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た腹腔マクロファージおよび脾臓抽出物は、ＢＡＬＢ系マウスから得たものよりも大きなＮＯＳ活性を示したが、腎臓抽出物では活性に変化がなかった。我々は、ウサギ抗マウスｉＮＯＳ抗体を用いた免疫蛍光法分析により、ＢＡＬＢ系マウスから得た脾臓、肝臓およひ腎臓においてＮＯＳ抗原の発現を認めず、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た肝臓および腎臓でも認めなかった。しかし、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た脾臓はＮＯＳ抗原を含む細胞を多数示した。モルモットの単特異的抗ラット誘導可能ＮＯＳ抗体を用いたときも同様な知見が得られた。ウサギ抗マウスｉＮＯＳ抗体を使用した免疫沈降法およびイムノブロット法により組織抽出物についてｉＮＯＳ抗原を分析した場合、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た脾臓および腎臓組織抽出物は容易に検出できる抗原を含んでいたが、ＢＡＬＢ系マウスの器官から得た抽出物中には抗原は検出されなかった。ＮＭＭＡ処理８週齢のＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの群に、滅菌蒸留脱イオン水または５０ｍＭ−ＮＭＭＡ含有水を、自由に摂らせた。ＮＭＭＡはカルビオケム（カリフォルニア州サンディエゴ）およびオウエン・グリフィス博士（ウイスコンシン州ミルウオーキー）から得た。両マウス群を上記所定の硝酸塩無含有食で維持した。１週間間隔でマウスをメタボリズムケージに入れ、２４時間収集尿を得た。尿中亜硝酸塩／硝酸塩を上記のように測定し、尿蛋白質をブラッドフォードアッセイ（バイオラド、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。１０週間の処理後、マウスから採血し、屠殺して腎臓と膝関節を取り出した。血清抗ＤＮＡ活性を、既報のＥＬＩＳＡ法で定量した。腎臓をパラフィン中に包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。膝関節を葉酸中で脱灰し、パラフィン中に包埋し、切片にし、染色した。ついでスライドを、群の由来を「知らない」病理学者が検査した。各検体中に存在する腎臓および膝関節疾患を前に示したように計量した。略述すると、糸球体を、高細胞充実性（０ −４）、高小葉性（０−４）、半月（０−４）および壊死（０−４）について分級した。ついで、糸球体疾患に関するこれらの特性の等級を加えることにより、スコアを導き出した。正常ＢＡＬＢ系マウスから得た腎臓は、通常スコア０−１であった。腎臓の切片中に中寸法の血管が存在する場合、血管炎が認められた。滑膜のスコアは、滑膜増殖（０−３）と滑膜下炎症（０−３）の等級を加えて導き出した。正常ＢＡＬＢ系マウスから得た膝関節は、通常スコア０−０．５であった。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの群に、２回蒸留の蒸留水（ｎ＝１０）または５０ｍＭ−ＮＭＭＡ含有水を、８週令から自由に摂らせた。両マウス群に所定の硝酸塩無含有食を与えた。マウスを合計１０週間処理した。両群のマウスは臨床的に正常に見えた。しかし、ＮＭＭＡ群のマウス２頭は、処理３週の間に死亡し、分析用に７頭のＮＭＭＡ群マウスが残った。これら２頭のマウスと４週間ＮＭＭＡを投与した対応マウスを詳細な剖検（慎重な組織学的検査ならびに血清、尿および器官の培養）に付したが、微生物感染の証拠またはその他の死を招く明かな原因は見つからなかった。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスに対する飲料水に入れたＮＭＭＡの投与は、亜硝酸塩／硝酸塩排泄（および推定によるとナイトリックオキサイド産生）を効果的にブロックした。また、ＮＭＭＡを投与したマウスは対照マウスより蛋白質の排泄が顕著に少なかった。この差異は、処理の５週目に明らかになった。２群のマウスから得たマウスの腎臓および膝関節の病理学的検査により、ＮＭＭＡ処置群のマウスで疾患が顕著に少ないことが明らかになった。腎スコアで測定した腎疾患および滑膜スコアで測定した関節炎は、何れも対照群に比較してＮＭＭＡ群で顕著に少なかった。関節疾患および腎疾患にみられた差異は、統計学的な差異（マン−ホイットニーＵ検定によりそれぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０２）であるが、抗ＤＮＡ抗体濃度ではそうでない。ＮＭＭＡ処置マウスでは糸球体増殖が微小か全くなかったが、対照マウスでは１例以外全て顕著な糸球体増殖と高小葉化を示した。全てのｌｐｒ類遺伝子マウス（糸球体腎炎を起こさないＣ３Ｈ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスを含む）の腎臓にみられた慢性間質リンパ球浸潤が、対照およびＮＭＭＡ処置マウスの両者に、同定度で存在した。総発生率３０％で、非処置ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの腎臓に中寸法血管炎が出現した。対照群のマウスから得た腎臓の３／１０に、弱ないし中度（１−２＋）の中寸法血管炎が存在した。ＮＭＭＡ処置群の腎臓の１／７に弱い血管炎がみられた。２群の血管炎に統計的差異はなかったが、血管炎をもつ少数のマウスが、この炎症の特性に対するＮＭＭＡの効果について明確な結論を得るの困難にしている。滑膜増殖は、ＮＭＭＡ処置マウスで顕著に減少した。ＮＭＭＡ処置群の７頭のマウス中わずか３頭が、弱ないし中度の滑膜増殖と滑膜炎症を伴う異常膝関節を示したのに対し、対照の水群の全１０頭のマウスがある程度の滑膜増殖および滑膜炎症を示した。１８週齢で２群について測定した血清抗２重鎖ＤＮＡ濃度は、本質的に同等であった（図面参照）。ニトロソヘモグロビン生成ＮＯ−Ｈｂは、ＮＯとヘモグロビンのヘム基中の鉄との相互作用により生成する（エイ・イー・ヒューオーら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ１８２巻１５１−１５７頁（１９９２年）；エル・アール・ジェイ・カンチレナら、ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディシン１２０巻９０２−９０７頁（１９９２年））。種々の年齢のＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た全血を、ニトロソヘモグロビン（ＮＯ−Ｈｂ）の存在について分析した。血液試料を抗凝固処理後、ブリューカーＥＳＰ３００分光光度計を使用して７７°Ｋで電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）により試験した（ダブリュー・チャミュリトラットら、モレキュラー・ファーマコロジー４６巻３９１−３９７頁（１９９４年））。表１は、ＥＰＲ単位の平均値± ＳＥＭを示す（ｎ＝試験動物数）。疾患マウスの血液中のＮＯ−Ｈｂ量に、年齢に依存した増加がみられた。ＮＯ−Ｈｂ濃度は、疾患のない同年齢の対照マウスに較べてＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスで高かった。差異は、統計的に有意（分析した全年齢でｐ＜０．０５）であった。ＮＯ−Ｈｂの存在は、自己免疫性腎炎および関節炎をもつマウスにおいてＮＯが過剰発現されていることを示す別の重要な徴候である。上記の研究は、これらのマウスにおける蛋白質（ヘモグロビン）のＮＯ−媒介修飾を証明した。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスにおいて疾患組織がＮＯにより修飾されたかどうかを決定するために、正常ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０週齢）およびＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウス（２０週齢）から得た腎臓を電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）により試験した。これらの組織について、対照マウスのスペクトルをＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスのそれから減じたところ、得られた曲線は容易に検出できるｇ＝２．０４のＮＯ−非ヘム鉄チロシンのシグナルおよびＮＯ −ヘム（おそらくＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの腎臓にトラップされた血液による）の典型的スペクトルを示した（ダブリュー・チャミュリトラットら、モレキュラー・ファーマコロジー４６巻３９１−３９７頁（１９９４年））。対照の腎臓がこれらのＮＯ−蛋白質シグナルをもたず、このことは、ニトロソ化された非ヘム蛋白質が観察されたマウスの重大な腎臓病理の原因として関係づけられるかも知れないことを意味する点に注意することが重要である。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た腎臓における蛋白質のニトロ化上記のように、ＮＯは、スーパーオキシドと反応して高反応性かつ組織破壊性の分子であるペルオキシニトライトを生成する可能性がある。以前に、ＭＲＬ− ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た細胞が過酸化水素、スーパーオキシド（エイ・ピー・ダン−ブら、ジャーナル・オブ・イムノロジー１３８巻１７５７−１７６１頁（１９８７年））およびナイトリックオキサイド（ジェイ・ビー・ワインバーグら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン１７９巻６５１− ６６０頁（１９９４年））のような反応性酸素種を過剰生産し得ることが示された。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスもまた破壊分子であるペルオキシニトライトを過剰生産するとの証拠を探すために、研究が行われた（ジェイ・エス・ベックマンら、メソッズ・イン・エンジモロジー２３３巻２２９−２４０頁（１９９４年））。）ペルオキシニトライトは蛋白質中のチロシン残基のニトロ化を惹き起こすので、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの疾患腎臓におけるペルオキシニトライトの存在の証拠を検出するために、単特異性、ポリクローナル抗チロシン抗体を使用した。イムノブロット分析を、２０週齢の正常（ＢＡＬＢ／ｃ）およびＭＲＬ− ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの腎臓から得た蛋白質抽出物について行った。腎臓組織をガラス乳棒でホモゲナイズした。可溶性抽出物中の蛋白質（１レーン当たり１００μｇ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース（０．４５μｍ、ノベックス）に移した。非結合部位を、ＴＢＳ（２０ｍＭトリス、５００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、２５℃で６０分間１％脱脂ドライミルクとインキュベートすることによりブロックした。膜を、１％ミルク／ＴＢＳ中、２５℃で一夜、ポリクローナル抗ニトロチロシン抗体（０．２５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。１％ミルク／ＴＢＳ中でヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（バイオ−ラド）（１：２０００）希釈液とインキュベートし、ついで増強化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）検出（アマシャム）を行うことにより、免疫反応性を可視化した。対照マウス４個体の腎臓から得たイムノブロットは、抗体と反応する蛋白質バンドを１個しか示さなかったが、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの腎臓から得たイムノブロットはこれと同じバンドに加えて４個の他の著明なバンドを示した。このことは、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスにおいてインビボで発生したＮＯがペルオキシニトライトに変換され、ついでこのペルオキシニトライトが腎臓蛋白質中のチロシン残基をニトロ化することを示す。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスの腎臓中のカタラーゼ活性２０週齢の正常（ＢＡＬＢ／ｃ）およびＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た腎臓中のカタラーゼ含量を分析した。ペルオキシニトライトまたはＮＯはカタラーゼ活性を分解し得る。カタラーゼは、２４０ｎｍにおける吸収で知り得る過酸化水素の消失により測定した（アール・エフ・ビーアズおよびアール・ダブリュー・サイザー、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー１９５巻１３３頁（１９５２年））。表２に示す数値は、単位／蛋白質ｍｇで示した多連試料の平均値±ＳＥＭである。表２は、対照マウスから得た腎臓が高濃度のカタラーゼを含むがＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得たカタラーゼ濃度は極めて低いことを示す。カタラーゼを測定するための別の型の分析法として、我々は腎臓から得た蛋白質抽出物を研究した。まず、これをＰＡＧＥに付し、ついで西洋わさびペルオキシダーゼおよび水素ペルオキシダーゼとジアミノベンジジンを含む燐酸緩衝液中にゲルを浸漬した。可溶性抽出物（２５μｇ／レーン）を６％自然ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に付した。０．１ｍＭ−ＥＤＴＡおよび５０μｇ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼを含むｐＨ７．０の５０ｍＭ燐酸ナトリウム中に、２５℃で４５分間ゲルを浸漬することにより、カタラーゼ活性を示すバンドを可視化した。Ｈ₂Ｏ₂ を最終濃度５．０ｍＭになるように加え、ゲルをさらに１５分間インキュベートした。水でざっとすすいだ後、５０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中で０．５ｍｇ／ｍｌのジアミノベンジジン塩酸塩の添加により染色の発色を開始した。結果は、４頭の異なるＢＡＬＢ／ｃ系対照マウスから得た腎臓が大量のカタラーゼを含んでいたのに対し、２頭のＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスからの腎臓は著しく減少したカタラーゼ濃度をもつことを明らかに示した。しかし、マウスを経口的にＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンでインビボ処置しておくと（上記ＮＭＭＡ処置参照）、３頭の異なるＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスから得た腎臓のカタラーゼレベルは正常（対照マウスのものと同等）であった。これは、（ＮＯまたはペルオキシニトライトの作用により阻害され得る）カタラーゼ活性が、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ系マウスで著しく低いこと、およびカタラーゼのＮＯ（またはペルオキシニトライト）媒介減少がＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンのインビボ投与でブロックされることを示す。ヒトにおける研究関節炎を患うヒトが、滑膜中に発現されたｉＮＯＳ蛋白質をもつかどうかを決定するために、マウスモノクローナル抗ｉＮＯＳ抗体（トランスダクション・ラボラトリーズ・インコーポレイテッドから購入）を使用して免疫蛍光法によりこれらの組織を研究した。進行関節炎の患者から関節置換手術の時に摘出した６個の滑膜試料中、３名のリューマチ様関節炎患者中２名および３名の骨関節炎患者中の１名でｉＮＯＳ抗原が検出された。これらの研究は、患者がｉＮＯＳを含む滑膜をもつこと、およびｉＮＯＳがリューマチ様関節炎の患者の滑膜で過剰発現され得ることを示す。均等物当該技術分野における熟練せる者は、本明細書に具体的に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を、単なる通常の実験的手法を用いて認識し又は確認することができる。このような均等物は下記の請求の範囲に包含されるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年６月７日【補正内容】９．ナイトリックオキサイドスカベンジャーの有効量を患者に投与することを含んでなる、その患者の自己免疫疾患を治療又は予防する方法。１０．自己免疫疾患がリューマチ様関節炎、インシュリン依存性真性糖尿病、全身性エリテマトーデス及び糸球体腎炎からなる群より選択されるものである、請求項９記載の方法。１１．自己免疫疾患がリューマチ様関節炎である請求項１０記載の方法。１２．自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである請求項１記載の方法。１３．自己免疫疾患の治療又は予防における使用などの治療用の使用を目的とするナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤。１４．Ｎ^G−メチル−Ｌ−アルギニンの有効量を患者に投与することを含んでなる、その治療を必要とする該患者の全身性エリテマトーデスを治療する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/195 ＡＥＤ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 31/195 ＡＥＤ 31/215 ＡＢＧ 9455−4Ｃ 31/215 ＡＢＧ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤の有効量を患者に投与することを含んでなる、その患者の自己免疫疾患を治療又は予防する方法。２．自己免疫疾患がリューマチ様関節炎、インシュリン依存性真性糖尿病、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus）及び糸球体腎炎からなる群より選択されるものである、請求項１記載の方法。３．自己免疫疾患がリューマチ様関節炎である、請求項２記載の方法。４．投与方法が腸内経由である、請求項３記載の方法。５．投与方法が非経口的である、請求項３記載の方法。６．ナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤がＮ^G−アミノ−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−メチル−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−ニトロ−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−ニトロ −Ｌ−アルギニンメチルエステル、Ｎ^G−イミノエチル−Ｌ−オルニチン及びアミノグアニジンからなる群より選択されるものである、請求項４記載の方法。７．ナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤がＮ^G−メチル−Ｌ−アルギニンである、請求項６記載の方法。８．Ｎ^G−メチル−Ｌ−アルギニンの有効量を患者に投与することを含んでなる、その治療を必要とする該患者のリューマチ様関節炎を治療する方法。９．ナイトリックオキサイドスカベンジャーの有効量を患者に投与することを含んでなる、その患者の自己免疫疾患を治療又は予防する方法。１０．自己免疫疾患がリューマチ様関節炎、インシュリン依存性真性糖尿病、全身性エリテマトーデス及び糸球体腎炎からなる群より選択されるものである、請求項９記載の方法。１１．自己免疫疾患がリューマチ様関節炎である、請求項１０記載の方法。１２．Ｎ^G−メチル−Ｌ−アルギニンの有効量を患者に投与することを含んでなる、その治療を必要とする該患者のリューマチ様関節炎を治療する方法。１３．自己免疫疾患の治療又は予防における使用などの治療用の使用を目的とするナイトリックオキサイドシンターゼ阻害剤。