DE68918440T2 - Verfahren zur transformation von menschlichen b-lymphocyten. - Google Patents
Verfahren zur transformation von menschlichen b-lymphocyten.Info
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Humanzellen, die monoklonale Antikörper exprimieren können und in vitro wachsen können, eine transformierte Humanzelle, die einen mit Epstein-Barr-Virus infizierten humanen B-Lymphozyten umfaßt und ein aktiviertes ras-Gen enthält, ein Verfahren zum Erzeugen humaner monoklonaler Antikörper, einen humanen monoklonalen Antikörper und ein Verfahren zum Herstellen differenzierter humaner B-Zellen.
- Seit seiner Einführung im Jahr 1975 hat das gut bekannte Verfahren von Köhler und Milstein (Nature 256: 495, 1975) zur Herstellung von Maus-Hybridomzellen es möglich gemacht, große Mengen Antigen-spezifischer monoklonaler Maus-Antikörper zu erzeugen, die für eine Anzahl von Anwendungen in Forschung, Diagnostik und Therapie nützlich sind. Die Maus- Hybridomzellen, die ursprünglich durch die Fusion von Antikörper-erzeugenden Zellen (B-Lymphozytenzellen, im folgenden als B-Zellen bezeichnet) mit malignen, transformierten B-Zellen (in vivo transformierten Myelomzellen von Mäusen, die an einem Myelom oder Plasmazytom erkrankt sind) erzeugt werden, können große Mengen monoklonaler Antikörper mit vorbestimmten Spezifitäten erzeugen.
- Bei Verwendung des Verfahrens von Köhler und Milstein werden eine B-Zelle und eine Plasmazytomzelle beispielsweise unter Verwendung von Polyethylenglycol, Lysolecithin oder Sendai- Virus als Zellfusionierende Mittel fusioniert. In den fusionierten Zellen muß ein Selektierbarer Marker vorhanden sein, um sie aus Parentalzellen und anderen Nicht-Hybridomzellen aussondern zu können. Beispielsweise ist der Plasmazytomfusionspartner im allgemeinen für ein Enzym defizient (z.B. Hypoxanthin-Guanosyl-Phosphoribo-Transferase (HGPRT)), das für das Wachstum der fusionierten Zelle in bestimmten Medien (Hypoxanthin-, Aminopterin- und Thymidin-enthaltendes Medium oder HAT-Medium) notwendig ist. Diese Enzymdefizienz ermöglicht es, die resultierenden Hybride aufgrund ihrer Fähigkeit, in einem solchen Medium zu wachsen, auszuwählen. Dies stellt sicher, daß nur B-Zell:Plasmazytom-Zellhybride gewonnen werden, da keine der Parentalzellen (und keine B-Zell:B-Zellhybride oder Plasmazytom:Plasmazytomzellhybride) in den selektivem Medium überleben können.
- Mit dem Verfahren nach Köhler und Milstein erzeugte Maus- Antikörper sind im allgemeinen für die Verabreichung als therapeutische Mittel in vivo an humane Subjekte, beispielsweise, um eine passive Immunität gegen ein infektiöses Agens zu verleihen, ungeeignet. Die Erstreckung der Hybridomtechnologie von Köhler und Milstein auf die Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper ist beschränkt gewesen, was im wesentlichen beruht auf: (1) dem Fehlen guter humaner Plasmazytomzellen zur Verwendung als Fusionspartner; (2) der niedrigen Frequenz von Zellfusionsereignissen ("Fusionseffizienz"); und (3) der relativen Seltenheit von in menschlichem Blut zirkulierenden B-Zellen, die spezifische Antikörper gegen Antigene von Interesse erzeugen (und den inhärenten Schwierigkeiten bei der Isolierung solcher Zellen). Diese Faktoren machen es schwierig, Hybridomzelllinien zu erhalten, die humane monoklonale Antiköper einer vorbestimrnten Spezifität ausscheiden.
- Casali et al. (Science 234: 476-479, 1986) haben ein Verfahren offenbart, das einen Fortschritt hin zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper-produzierender Zellen darstellt. Normale B-Zellen, die aus peripherem humanen Blut erhalten worden waren, wurden auf ihre Spezifität gegen ein gegebenes Antigen unter Verwendung fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)) vorselektioniert. Positiv ausgewählte Klone wurden dann in vitro durch Infektion solcher Zellen mit Epstein-Barr-Virus (EBV) als lymphoblastoide Zellen etabliert. Die EBV-infizierten Zellen erzeugten Antigen-spezifische humane monoklonale Antiköper. Das Verfahren von Casali et al. hat jedoch mehrere signifikante Nachteile, die seine Nützlichkeit beeinträchtigen: (1) die Menge der monoklonalen Antikörper, die von den Zellen gemäß Casali et al. erzeugt werden, ist relativ gering, und (2) die Antigen-erzeugenden Zellen sind relativ instabil und einige Klone beenden die Antikörperproduktion vorzeitig. Weiterhin erfordert die Aufrechterhaltung der Produktion Antigen-spezifischer Antikörper eine wiederholte Klonierung der Zellen, was ein zeitraubendes und ineffizientes Verfahren in Anbetracht der niedrigen klonogenen (d.h., Wachstums-) Eigenschaften der resultierende Lymphoblastoiden oder lymphoblastoiden Zelllinien (LCL) ist; (3) die Erzeugung und Reinigung der monoklonalen Antikörper in großem Maßstab ist angesichts der langen Verdoppelungszeit und umfangreichen Serumerfordernisse der LCL ineffizient; und (4) die mit diesem Verfahren erzeugten LCL können nicht als Tumore in Tieren wachsengelassen werden. Ein solches Tumorzellwachstum erlaubt die Amplifikation und Reinigung von Antikörpern aus Aszitesflüssigkeit, ein effizientes Verfahren für die Antikörper produktion in großem Maßstab, das für die Herstellung von monoklonalen Maus-Antikörpern weithin verwendet wird. Schließlich kommt das Verfahren nach Casali et al. nicht ohne die Identifizierung einer für ein bestimmtes Antigen spezifischen humanen B-Zelle aus.
- Die gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung 041803, eingereicht am 23.04.1987 von Riccardo Dalla-Favera, offenbart ein Verfahren zur Erzeugung von humanen, monoklonale Antikörper erzeugenden Zellen. Spezifische B-Lymphozyten werden unter Verwendung des Verfahrens von Casali et al. (s.o.) selektioniert, mit Epstein-Barr-Virus (EBV) infiziert und mit aktivierten c-myc-DNA-Sequenzen transfiziert. Die resultierenden Zellen sind tumorigen (d.h., sie können in halbfestem Medium und in Tieren, beispielsweise Ratten oder Mäusen, wachsen) und klonogen und erzeugen monoklonale Antikörper einer vorbestimmten Spezifität. Es wurde jedoch festgestellt, daß diese Zellen immer noch relativ geringe Mengen Antikörper erzeugen, weil die transfizierten lymphoblastoiden Zellen keine Differenzierung durchgemacht haben.
- Lombardi et al. (Cell 49, Seiten 161 bis 170, (1987)) beziehen sich auf die gleichen EBV-infizierten, myc-transformierten B-Zellen wie USSN 041803 (s.o.), die keine Differenzierung durchgemacht haben, wie durch zytologische und histologische Eigenschaften, die für undifferenzierte B-Zell- lymphome typisch sind, gezeigt wird. Solche Zellen sind aufgrund der Tatsache, daß sie nicht differenziert sind, Erzeuger monoklonaler Antikörper in nur geringem Umfang und haben alle Nachteile der in dem vorangehenden Absatz diskutierten Zellen.
- Jonak et al. (Advanced Drug Delivery Reviews, 2 (1988) 207-228) berichten über humane Transfektanten, die in einem späteren Stadium der Differenzierung immortalisiert wurden und einen Plasmazytom-ähnlichen Zellphenotyp aufwiesen. Die Transfektanten wurden durch Stimulieren/Aktivieren von humanen pheripheren Blutlymphozyten sowohl mit spezifischen Antigenen als auch Mitogen und anschließende Transfektion mit hunianer Tumor-DNA oder definierten Onkogenen erzeugt. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein alternatives Verfahren zum Erzeugen transformierter differenzierter humaner B-Zellen zur Verfügung zu stellen, die zur Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper fähig sind.
- Weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine transformierte lymphoblastoide Zelle zur Verfügung zu stellen, die als Fusionspartner bei der Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper nützlich ist.
- Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine transformierte lymphoblastoide Zelle zur Verfügung zu stellen, die die Eigenschaften der Proliferation, Differenzierung und Antikörpererzeugung in hohem Ausmaß aufweist.
- Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue humane Zelllinie zu erzeugen, die mit Epstein-Barr-Virus infizierte humane B-Zellen umfaßt und mindestens eine exogene aktivierte K-, N- oder H-ras-Onkogen-DNA-Sequenz hat.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und eine Zellinie zum Erzeugen humaner monoklonaler Antikörper zur Verfügung. Entsprechend einer Ausführungsform können humane B-Zellen, die einen gegen ein spezifisches Antigen gerichteten Antikörper erzeugen, isoliert werden. Die isolierten humanen B-Zellen werden durch Infektion mit EBV immortalisiert und mit einem aktivierten ras-Gen (bevorzugt unter Verwendung eines geeigneten Vektors) transformiert (Transformation ist der Prozeß des Einführens von DNA in Zellen).
- Die immortalisierten humanen B-Zellen umfassen maligne Transformanten, die eine terminale Differenzierung in Plasmazellen durchmachen. Diese klonogenen, tumorigenen Zellen sind zum Erzeugen großer Mengen humaner monoklonaler Antikörper wirksam.
- In einer besonderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen humaner, monoklonale Antikörper erzeugender Zellen zur Verfügung, die in Kultur wachsen können, wobei das Verfahren die Schritte des Infizierens humaner B-Zellen, die Antikörper einer gewünschten Spezifität erzeugen, mit Epstein-Barr-Virus, das Transformieren der Epstein-Barr-Virus-infizierten humanen B-Zellen mit einem Vektor, der ein aktiviertes ras-Gen enthält, umfaßt.
- In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalten transformierter humaner B-Zellen zur Verfügung, umfassend die Schritte des Infizierens humaner B-Lymphozyten mit Epstein-Barr-Virus, Gewinnen der Epstein-Barr-Virus-infizierten humanen B-Lymphozyten, Transformieren der virusinfizierten B-Lymphozyten mit einem aktivierten ras-Vektor und Gewinnen der transformierten humanen B-Lymphozyten. Die so transformierten Zellen können als Fusionspartner für Zellfusionen mit nicht transformier ten humanen B-Zellen, die mit einem Antigen sensibilisiert worden sind, um einen Antikörper mit gewünschter Spezifität zu erzeugen, verwendet werden.
- In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung transformierte Humanzellen zur Verfügung, umfassend einen mit Epstein-Barr-Virus infizierten humanen B-Lymphozyten, wobei die Zelle DNA-Segmente enthält, die für einen selektierbaren genetischen Marker kodieren, und ein aktiviertes ras-Gen in geeigneter Orientierung und korrektem Leseraster.
- Dieser und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann im Licht der vorliegenden Beschreibung, der Ansprüche und der Zeichnungen offensichtlich sein.
- Figur 1 ist eine Northern-Blot-Analyse der ras-Erzeugung von Zellen, die mit erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren infiziert worden sind, und enthält weiterhin schematische Darstellungen der in dem Blot verwendeten Sonden.
- Figur 2 ist eine Zeichnung, die die Kinetik der Antikörpererzeugung von erfindungsgemäß transformierten B-Zellen zeigt.
- Figur 3 ist eine Reihe von Zeichnungen, die die erhöhte Expression von Plasmazell-spezifischen Antigenen in erfindungsgemäß transformierten Zellen zeigt.
- Figur 4 ist eine Autoradiographie, die den Einbau von Thymidin in Zellen, die ras-Onkogene exprimieren, zeigt.
- Jedwede in der Beschreibung zitierte Literatur und Patentanmeldung wird in ihrer Gesamtheit durch Verweis hier einbezogen.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen transformierter Humanzellen. Das Verfahren ist besonders nützlich zum Transformieren normaler humaner B-Zellen in maligne, transformierte, differenzierte, monoklonale Antikörper erzeugende Zellen. Dies ist wichtig und unerwartet, da es bis jetzt nicht als möglich angesehen worden war, lebensfähige, humane, transformierte, vollständig differenzierte B-Zellen unter Verwendung von in vitro-Manipulationen herzustellen.
- Während herkömmliche Hybridomzellen das Produkt eines Fusionsereignisses unter Verwendung einer transformierten lymphoblastoiden Zelle und einer normalen B-Zelle sind, erfordert das erfindungsgemäße Verfahren in einer Ausführungsform nur die genetische Manipulation einer normalen humanen B-Zelle. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können transformierte humane B-Zellen, die zur Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper jeder gewünschten Spezifität fähig sind, leicht erhalten werden.
- In einer Ausführungsform involviert das erfindungsgemäße Verfahren das Auswählen von humanen B-Zellen, die Antikörper gegen ein spezifisches Antigen erzeugen, das vorbestimmt sein kann. Die ausgewählten B-Zellen werden dann mit Epstein-Barr-Virus (EBV) infiziert. Die EBV-infizierten B-Zellen werden dann behandelt, so daß sie ein aktiviertes ras-Onkogen (z.B. H-, N- oder K-ras-Onkogen) aufnehmen und exprimieren. Das Ergebnis ist eine relativ hohe Inzidenz von Zellen, die spezifische monoklonale Antikörper erzeugen und fähig sind, in vitro auf halbfesten Medien oder in vivo in Tieren zu wachsen.
- Das oben beschriebene Verfahren wird daher verwendet, um humane transformierte B-Zellen, die Antikörper einer vorbestimmten Antigenspezifität ausscheiden, zu erzeugen.
- In einer weiteren Ausführungsform werden B-Zellen aus einem Patienten isoliert, von dem bekannt ist, daß er Antikörper, die gegen ein spezifisches Antigen gerichtet sind, erzeugt. Die B-Zellen werden mit EBV immortalisiert und ingesamt mit einem aktivierten ras-Gen transformiert. Spezifische immortalisierte, ras-transformierte, monoklonale Antikörper erzeugende Zellen werden dann identifiziert und unter Verwendung des Verfahrens von Casali et al., siehe oben, isoliert.
- Bei Verwendung einer der oben beschriebenen Ausführungsformen ist die Häufigkeit, mit der die gewünschten EBV-infizierten, ras-transformierten LCL erhalten werden, im Vergleich zu der, die bei Verwendung der Zellfusion gemäß der traditionellen Köhler und Milstein-Technik (s.o.) erhältlich ist, stark erhöht. Die Trasformationseffizienz beträgt bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ungefähr 1 x 10&supmin;¹ bis 1 x 10&supmin;² (d.h., 1 bis 10 %), während die Effizienz des Köhler und Milstein-Verfahrens ungefähr 1 x 10&supmin;&sup6; (d.h., 0,0001 %) beträgt. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt daher eine mehrere Größenordnungen umfassende Verbesserung der Effizienz zur Verfügung.
- In einer weiteren Ausführungsform kann das oben beschriebene Infektions-Transformationsverfahren auf humane B-Zellen angewendet werden, die nicht auf die Erzeugung von spezifischen Antikörpern vorselektioniert sind (die aber nichtsdestoweniger die erforderliche biochemische Maschinerie enthalten und Antikörper erzeugen und ausscheiden). Nach Infektion und ras-Transformation werden solche B-Zellen alle Eigenschaften transformierter B-Zellen haben, d.h., die Fähigkeit, ras (oder die unten diskutierten Mutationen) zu überexprimieren, die Fähigkeit, in halbfesten Medien und in Tieren zu wachsen, sowie die Fähigkeit, Antikörper auszuscheiden. Solche infizierten/transformierten B-Zellen können als Fusionspartner zusammen mit spezifische Antikörper ausscheidenden B-Zellen als Fusionspartner verwendet werden, um Hybridome unter Verwendung herkömmlicherer Verfahren (so wie beispielsweise dem gut bekannten Verfahren nach Köhler und Milstein, das oben zitiert ist, oder anderer Hybridomtechnologie) zu erzeugen. Eine solche Zellinie, bezeichnet CB 33 ras II, ist bei der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 10011 hinterlegt worden.
- Für die Verwendung als Fusionspartner wird die immortalisierte, ras-transformierte B-Zelle bevorzugt zuerst auf eine Enzymdefizienz (unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren) ausgewählt, beispielsweise HGPRT, das oben erwähnt ist. Wie in der oben erwähnten Maus-Plasmazytomzelle, die im Köhler und Milstein-Verfahren verwendet wird, erlaubt dies die Selektion von Hybridomen, die monoklonale Antikörper erzeugen, aufgrund ihrer Fähigkeit, in HAT-Medium zu wachsen.
- Spezifische monoklonale Antikörper, die durch die erfindungsgemäßen Hybridome erzeugt werden, können aus den Überständen der Antikörper-erzeugenden Zellen gewonnen werden und unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren gereinigt werden, beispielsweise durch Ammoniumsulfatausfällung, Protein-A-Sepharose-Chromatographie, Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) und/oder Kombinationen dieser Verfahren.
- EBV-infizierte B-Zellen weisen Eigenschaften auf, die in der Mitte zwischen normalen humanen Zellen und malignen tumorigenen humanen Zellen liegen. Die EBV-infizierten B-Zellen (LCL) weisen die Fähigkeit auf, in Gewebekultur in Gegenwart Serum-haltigen Mediums unbegrenzt zu wachsen. Ihnen fehlt jedoch die Fähigkeit, Kolonien zu erzeugen, wenn sie in halbfestem Medium (Agar) wachsen, und sie sind unfähig zum Wachstum in suszeptiblen Wirten, beispielsweise Mäusen oder Ratten. Daher umfaßt das erfindungsgemaße Verfahren das Transformieren immortalisierter (z.B. EBV-infizierter) humaner B-Zellen mit einem Vektor, der der Rezipientenzelle die Fähigkeit zur Differenzierung (d.h., zum Erwerb der Fähigkeiten differenzierter B-Zellen) verleiht und darüber hinaus bevorzugt eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: (a) die Fähigkeit, in halbfesten Medien oder Tieren zu wachsen und (b) die Fähigkeit, hohe Spiegel bestimmter Genprodukte zu exprimieren. Ein ein aktiviertes ras-Gen enthaltender Vektor (im folgenden "aktivierter ras-Vektor") kann einer Zielzelle all diese Eigenschaften verleihen.
- Die Umwandlung normaler Säugerzellen in den transformierten Zustand ist gewöhnlich mit der Aktivierung von einem oder mehreren Onkogenen verbunden. Beispielsweise ist das H-ras- Gen der Teil des Genomes des Harvey-Sarkom-Virus, der für die Fähigkeit des Virus verantwortlich ist, eine Vielzahl von Tumoren innerhalb von Wochen nach der Injektion des Virus in frisch geschlüpfte Hühner zu induzieren. Eine Zelle kann daher durch ein Virus transformiert werden, indem sie das virale Onkogen, beispielsweise K-ras, erhält. Eine Zelle kann außerdem durch Überexpression eines anscheinend normalen Genes, beispielsweise N-ras, transformiert werden, was zu höheren beobachteten Konzentrationen des Expressions produktes des Genes (und jeden Genes, das mit dem normalen Gen ko-exprimiert wird) führt, oder durch Mutation (s.u.). Es ist festgestellt worden, daß das ras-Gen in einigen Fällen multipler Myelome und in vielen anderen humanen malignen Erkrankungen aktiviert ist. Ras-Gene sind in Säugetieren, Vögeln, Insekten, Mollusken, Pflanzen, Pilzen und Hefen identifiziert worden.
- Ras-Gene kodieren unabhängig von der Spezies ihrer Herkunft für Proteine, die mit der Plasma-Membran assoziiert sind, Guanin-Nukleotide binden und GTPase-(Guanosin-Triphosphatase-)Aktivität haben. Es wird angenommen, daß ras-Proteine an der Signaltransduktion über zelluläre Membranen beteiligt sind. Obwohl ein aktiviertes ras-Gen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, kann jedes aktivierte Onkogen (oder andere Gen), das immortalisierte B-Zellen dazu veranlassen kann, zu reifen Plasmazellen zu differenzieren, verwendet werden.
- Mit anderen Worten wäre ein Gen, das die immortalisierten B-Zellen dazu veranlaßt, zu reifen Plasmazellen zu differenzieren (während ihre Fähigkeit - wenn solche B-Zellen bereits diese Fähigkeit haben - Antikörper auszuscheiden, erhalten bleibt), für das erfindungsgemäße Verfahren nützlich. Dabei ist natürlich ein Gen bevorzugt, das (wie im Fall des ras-Onkogenes) außerdem der transformierten Antikörper-ausscheidenden Zelle (oder einem Hybridom, das mit einer erfindungsgemäß transformierten Zelle hergestellt ist) mindestens eine der folgenden Eigenschaften verleiht: (1) die Fähigkeit, in Tieren zu wachsen, (2) die Fähigkeit, auf halbfestem Medium zu wachsen, und/oder (3) die Fähigkeit, große Mengen von Antikörpern zu exprimieren.
- Die EBV-infizierten/ras-transformierten erfindungsgemäßen Zellen erzeugen monoklonale Antikörper, weisen eine relativ kurze Verdoppelungszeit (in der Größenordnung von ungefähr 36 Stunden) auf, sind in halbfesten Medien klonogen und im Tierexperiment tumorigen. Die in vitro-Transformation (d.h., die Erzeugung von klonogenen und tumorigenen Zellen) von humanen B-Lymphozyten durch ein aktiviertes ras-Gen ist zuvor nicht durchgeführt worden.
- Normale humane B-Zellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können aus humanem peripheren Blut unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, isoliert werden. Die isolierten B-Zellen können unter Verwendung des Verfahrens von Casali et al., s.o., auf ihre Fähigkeit ausgewählt werden, gegen jedes beliebige Antigen gerichtete Antikörper zu erzeugen, wie im Beispiel 5, unten, beschrieben ist (oder nicht so ausgewählt - wie unten unter Bezugnahme auf eine alternative Ausführungsform beschrieben werden wird). Sobald humane B-Zellen, die gegen ein spezifisches Antigen gerichtete Antikörper erzeugen, isoliert worden sind, werden sie mit EBV (erhalten durch Kultivieren der EBV-infizierten Krallenaffenleukozytenzellinie B95-8, erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC Rockville, MD) als ATCC CRL 1612) nach gut bekannten Verfahren infiziert, wie in Beispiel 2, unten, gezeigt wird. Die für die Infektion erforderliche Menge an EBV ist die Menge, die zu einer erfolgreichen Infektion führen wird, oder ungefähr eine transformierende Einheit pro Zelle, wie unten beschrieben.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden vor der EBV-Infektion die Spezifische Antikörper erzeugenden humanen B-Zellen (die aus dem peripheren Blut erhalten worden sind) durchmustert. Die reifen B-Zellen, die IgG erzeugen, werden identifiziert und segregiert. Die IgG-erzeugenden BZellen führen zu Antikörpern, die eine höhere Affinität für spezifische Antigene haben. Die isolierten IgG-erzeugenden B-Zellen sind für die Verwendung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt.
- Von den meisten EBV-infizierten B-Zellen, die untersucht worden sind, ist festgestellt worden, daß sie IgM erzeugen. IgG-erzeugende B-Zellen können jedoch leicht selektioniert werden, da sie Differenzierungs-assoziierte Oberflächenmarker, beispielsweise PCA-1, B-1 (kommerziell erhältliche Antikörper gegen diese Marker können von Coulter Immunology, Hilleah, Florida, erhalten werden) und OKT10 (kommerziell erhältliche Antikörper gegen OKT10 können von Ortho Diagnostics erhalten werden), aufweisen, die selektiv identifiziert werden können, wie in Beispiel 4, unten, gezeigt.
- Nachdem die B-Zellen immortalisiert worden sind, wird eine wirksame Menge eines aktivierten ras-Genes in diese LCL eingeführt, wie unten diskutiert. Eine effektive Menge eines aktivierten ras-Genes ist die Menge oder der Titer, der mindestens das erste der drei folgenden Ziele erreicht: a) Diffenzierung der B-Zellen; b) Transformation der B-Zellen zum "malignen" Phenotyp; und c) Erzeugung hoher Spiegel des ras-Expressionsproduktes (und Produkte ko-exprimierter Gene) durch die B-Zellen. Ein aktiviertes ras-Gen ist als ein ras-Gen (z.B. H-, N- oder K-ras) definiert, das ein mutiertes Genprodukt oder einen konstitutiven (d.h., nicht regulierten) hohen Spiegel des normalen (nicht mutierten) ras-Proteins exprimiert. Es ist festgestellt worden, daß hohe Spiegel des normalen Proteins oder bestimmter Mutationen im kodierenden Bereich (siehe unten) dieses Proteines eine uneingeschränkte Zellteilung in Humanzellen induzieren. Für die Zwecke dieser Erfindung kann das ras-Gen "aktiviert" werden durch:
- (1) Mutation von "beschränkenden" Sequenzen, die im Gen vorhanden sind; oder
- (2) Insertion von "Enhancer"-Elementen benachbart zum Gen; oder
- (3) eine Kombination dieser beiden Verfahren.
- Jede Technik zum Einführen von DNA in eukaryontische Zellen kann für die Transformation von Säugerzellen mit Vektormaterial verwendet werden. Gut bekannte Verfahren zum Einführen von DNA in Säugerzellen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf retrovirale Vektoren, Mikroinjektion, Calciumphosphatpräzipitation, DEAE-Dextranprotoplastenfusion oder Elektroporation. Retrovirale Vektoren sind wegen der hohen Effizienz des Gentransfers (nahe 10 %) bevorzugt. Andere Verfahren können effizienter sein, wenn verschiedene Zelltypen verwendet werden, wie im Stand der Technik gut bekannt ist. Das effizienteste Verfahren zur Verwendung mit einem gegebenen Zelltyp kann durch Routineexperimente bestimmt werden.
- Die Mikroinjektion involviert die direkte Injektion von Vektoren in den Kern von eukaryontischen Zellen (wie in Capecchi, M.R. Cell 22: 479-488, 1980, beschrieben). Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß es eine ausgeklügelte Maschinerie für die Abgabe sehr kleiner Volumen (Nanoliter) und einen Experimentator mit beträchtlicher technischer Erfahrung erfordert.
- Die DEAE-Dextra-vermittelte Protoplastenfusion beruht auf einem Fusionsereignis zwischen der Rezipientenzelle und einem Bakterium, das den interessierenden Vektor trägt (Sandri-Goldin, R.M. et al. Mol. Cell Biol. 1: 743-752, 1981).
- Die Calciumphosphatpräzipitation induziert die Aufnahme von DNA (oder Vektor) in Zellen (Graham, F.L. et al., Virology 52: 456-467, 1973). Der Vektor wird dann in den Kern dieser Zellen transloziert.
- Bei der Elektroporation wird eine Zellsuspension einem kurzen elektrischen Impuls ausgesetzt, der zum Transfer der DNA in die Zellen führt (Potter, H.L. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 81: 7161-7165, 1984). Es wird angenommen, daß der DNA-Eintritt über lokale Bereiche eines reversiblen Membranabbaus (oder Poren) geschieht, die durch das externe elektrische Feld erzeugt werden.
- Die in den unten gegebenen Beispielen verwendeten aktivierten ras-Vektoren, bezeichnet mit SVNras und raszip6, werden mit üblichen Klonierungsverfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie in Beispiel 3 beschrieben erzeugt. Die retroviralen Vektoren sind wegen ihrer hohen Gentransfereffizienz bevorzugt. Die Verwendung des raszip6-Vektors für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist besonders bevorzugt, weil dieser retrovirale Vektor mit einem hohen viralen Titer erhältlich ist, wodurch ein effizienterer Gentransfer möglich ist. Obwohl spezifische Beispiele von Vektoren, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, hier gezeigt werden, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß viele verschiedene Konstruktionen verwendet werden können, vorausgesetzt, sie verleihen der transformierten (zuvor immortalisierten) Zelle die Fähigkeit, vollständig zu differenzieren und bevorzugt außerdem die Fähigkeit, in halbfestem Medium zu wachsen und einen hohen Spiegel des normalen Proteins oder eines mutierten Genproduktes zu erzeugen.
- Um für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich zu sein, muß ein Vektor die folgenden minimalen Erfordernisse erfüllen: (1) er muß ein aktiviertes ras-Gen (oder ein anderes Gen, wie oben beschrieben) enthalten; und (2) er muß in humanen Zellen konstitutiv (d.h. nicht reguliert) exprimieren können.
- Darüber hinaus ist der Einbau eines selektierbaren genetischen Markers in den retroviralen Vektor für die Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Dies erlaubt die effiziente Selektion der EBV-infizierten, erfolgreich ras-transformierten Zellen. In diesem Selektionsverfahren sind nur EBV-ras-Zellen in der Lage, zu wachsen, während alle anderen Zellen (z.B. nicht transformierte EBV-infizierte B-lymphoblastoide Zellen) abgetötet werden. Selektierbare genetische Marker, die in den erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden können, umfassen (als nicht beschränkendes Beispiel) die Resistenz gegen eine antibiotische Substanz, z.B. Neomycin, das Antibiotikum G418 (eine Variante von Neomycin) , oder Hygromycin, oder Resistenz gegen irgendeine andere Substanz, die den tranfizierten Zellen einen selektiven Vorteil verschafft. Tatsächlich kann jeder selektierbare genetische Marker, der in Säugerzellen exprimiert werden kann, für die Durchführung der Erfindung verwendet werden. Humane lymphoblastoide Zellen können durch Einbau eines Genes, das die Aktivität von G418 inhibiert, gegen dieses Antibiotikum resistent gemacht werden.
- Obwohl hier spezifische retrovirale Vektoren für die Verwendung zur Durchführung der vorliegenden Erfindung offenbart werden, ist die Durchführung der Erfindung nicht auf diese Vektoren beschränkt. Unter den weiteren Vektoren, die zur Durchführung der Erfindung verwendet werden können, sind Plasmidvektoren mit den oben beschriebenen gewünschten Eigenschaften, die zur Integration in das Wirtszellgenom fähig sind (solche Plasmide können im Einklang mit im Stand der Technik gut bekannten Verfahren konstruiert werden) oder andere retrovirale Vektoren (wie in Cepko et al. Cell 37; 1053 (1985) beschrieben).
- Das aktivierte humane ras-Gen, das in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurde aus dem Harvey-Sarkom-Virus isoliert und ist von der ATCC (Hinterlegungsnummer 41013, American Type Culture Collection, Rockville, MD) erhältlich. Es kann jedoch jedes aktivierte ras-Gen verwendet werden. Im Säugergenom sind bereits 3 ras-Gene identifiziert worden. Diese werden mit H-ras-1, K-ras-2 und N-ras bezeichnet (beschrieben in Barbacid, M. Ann. Rev. Biochem. 56: 779-827, 1987). Die Vektoren, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sollten die Fähigkeit haben, das oben diskutierte mutierte Genprodukt zu erzeugen und/oder hohe Spiegel des normalen ras-Genproduktes, das für die Transformation von EBV-infizierten B-Zellen zu voll differenzierten, tumorigenen B-Zellen erforderlich ist. Die Aktivierung des ras-Genes kann (i) durch Mutation einer spezifischen DNA-Sequenz des Genes, die zur Produktion eines anomalen Proteines führt, und/oder (ii) durch die Insertion einer exogenen "Enhancer"-Sequenz in die Vektor-DNA in Nachbarschaft zum ras-Gen erreicht werden, was zur Überproduktion eines normalen Proteines führt. Enhancersequenzen sind unter anderem aus dem Genom bestimmter Tumorviren (wie z.B. dem Affenvirus 40 (SV40), Banerji et al., Cell 27: 299, 1981) und Retroviren (Llucin et al., Cell 22: 705, 1983) und aus dem Genom von normalen Säugerzellen (beispielsweise Immunglobulingen-Enhancer, wie beschrieben von Church et al., Nature 313: 798, 1985) isoliert worden. Von diesen Sequenzen ist festgestellt worden, daß sie die Expression benachbarter Gene erhöhen, und ihre Gegenwart in den erfindungsgemäßen ras-Vektoren führt zu einer deregulierten Expression. Die Gegenwart von Glycin in Position 12 des ras-Proteines scheint für die regulierte Expression des ras-Proteines notwendig zu sein. Substitution von Gly¹² durch irgendeinen anderen Aminosäurerest (mit Ausnahme von Prolin) führt zur onkogenen Aktivierung dieser Moleküle. Zusätzlich führen Mutationen in den Kodons 13, 59 oder 61 (und anderen) ebenfalls zur onkogenen Aktivierung (wie beschrieben in Barbacid, M., Ann. Rev. Biochem. 56: 779-827, 1987). Das deregulierte und/oder mutierte ras-Gen wird als "aktiviert" bezeichnet. Jedes für die Aktivierung des humanen ras-Genes geeignete Verfahren kann für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.
- Die vorliegende Erfindung wird unten in speziellen Beispielen beschrieben, die die Erfindung veranschaulichen sollen, ohne ihren Schutzumfang zu beschränken.
- Das unten beschriebene Verfahren ist für die anfängliche B-Zell-Selektion aus Blut oder geeigneten Blutfraktionen ver- wendet worden.
- Aus gesunden Männern und Frauen erhaltenes Blut wurde auf ein Gradientenmedium aufgetragen, um Lymphozyten abzutrennen (Pharmacia, Piscataway, NJ). Monozyten wurden von anderen mononukleären Zellen durch zwei Inkubationszyklen bei 37ºC in 150 cm² Gewebekulturflaschen aus Kunststoff entfernt. Die mononukleäre Fraktion wurde auf Eis mit roten Blutzellen aus Schafen (SRBC), die mit AET (2-Aminoethylisothioroniumbromidhydrobromid) (Sigma, St. Louis, MO) behandelt worden waren, inkubiert, um Rosettenbildung zuzulassen. Nach Auftragen der gesamten SRBC-mononukleären Fraktion auf einen Gradienten aus einem Lymphozyten-abtrennenden Medium wurden nicht-erythrozytäre rosettenbildende Zellen (d.h., nicht T-Zellen) gewonnen. Die nicht anhaftende, keine Rosetten bildende Fraktion setzte sich aus mindestens 50 % B-Zellen, weniger als 1 % Monozyten und unterschiedlichen Mengen anderer Lymphozyten zusammen.
- EBV wurde aus Kulturflüssigkeit von B95-8-Krallenaffenlymphomzellen (ATCC Nr. CRL 1612) erhalten, die in Gegenwart von 1,62 x 10&supmin;&sup8; M 4-Phorbol-12-β-myristat-13-α-acetat (TPA, Sigma Fine Chemical Company, St. Louis, MO) inkubiert worden waren. Die Viruspräparation hatte einen Titer von 5 x 10&sup5; transformierenden Einheiten pro ml, wobei eine Einheit die minimale Menge ist, mit der 10&sup4; gereinigte humane B-Zellen virustransformiert werden. Lymphozyten in einer Konzentration von 1 x 10&sup6; pro ml wurden dem EBV-haltigen Medium von B85-9-Zellen bei einer Multiplizität der Infektion von einer transformierenden Einheit pro Zelle ausgesetzt.
- Die EBV-infizierten Zellen wurden dann 3 bis 4 Wochen in Kulturmedium (RPMI 1640, GIBCO, Grand Island, New York), enthaltend 10 % fötales Kälberserum, kultiviert, so daß das Virus diese Zellen immortalisieren konnte.
- Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten retroviralen Vektoren, SVNras und raszip6, wurden wie folgt konstruiert.
- SVNras (beschrieben in Souyri et al., Virology 158: 69-78, 1987) wurde vom Vektor SVX (konstruiert wie in Capeko et al., Cell 37: 1053-1062, 1984 beschrieben) abgeleitet. Der SVNras-Vektor besteht aus den folgenden Elementen zwischen den langen terminalen Wiederholungen (long terminal repeats: LTR) des Maloney Maus Leukämievirus (deren Sequenz in Hoffmann et al., J. Virol. 44: 144-153, 1982, beschrieben ist): dem für die virale Verpackung notwendigen Bereich, den 5'- und 3'-Spleiß-Signalen, einer für Neomycin-Resistenz kodierenden DNA-Sequenz, Replikationsursprüngen vom SV40-Virus und dem Plasmid pBR322 und einem aktivierten N-ras-Gen. Das aktivierte N-ras-Gen wurde in eine einzelne BamHI-Stelle in SVX anstelle der fehlenden retroviralen gag-pol-Sequenzen eingesetzt.
- Raszip6 wurde konstruiert, indem das virale H-ras-Gen (Kartenpositionen 4000 bis 4710, Dhar et al., Science 217: 934-937) in die BamHI-Stelle von SVX (Capko et al., s.o.) eingesetzt wurde. Die biologischen Eigenschaften von raszip6 sind beschrieben worden (Dotto et al., Nature 318: 472-475, 1985).
- In dem im folgenden wiedergegebenen Beispiel wurden die biologischen Wirkungen aktivierter H-ras- und N-ras-Onkogene in den gleichen Zielzellen untersucht. Diese Onkogene induzierten maligne Transformationen in LCL und führten zusätzlich zu dramatischen Veränderungen des Phenotyps, der die terminale Differenzierung von Lymphoblasten zu Plasmazellen involvierten.
- Ein aktiviertes H-ras-Allel, abgeleitet vom Harvey-Sarkom- Virus (wie beschrieben in Dhar, R. et al., Science 817: 934, 1982), oder ein humanes N-ras-Allel, aktiviert durch eine Mutation im Kodon 12 (wie beschrieben in Souyri et al., Virology 158: 69, 1987) wurden in LCL eingeführt, die aus normalem Nabelschnur (Cord)-Blut (Linie CB33) oder aus adultem peripheren Blut (Linie UH3) abgeleitet waren, indem amphotrope retrovirale Vektoren, die das G418-Resistenz- (neo)-Gen als selektierbaren Marker enthielten (s.o. und Figur 1), verwendet wurden. Ein Vektor (pKneo), der nur das G418-Resistenzgen enthielt, wurde als Kontrolle verwendet. Nach der Infektion wurden die Zellen insgesamt auf antibiotische Resistenz selektioniert, oder, um die Selektion von unabhängig infizierten Klonen sicherzustellen, sie wurden in begrenzender Verdünnung plattiert, gefolgt von antibiotischer Selektion individueller Klone. Unter Verwendung eines dieser Protokolle wurden 2 bis 3 Wochen nach der Infektion Zellinien etabliert und die Gegenwart von klonal verschiedenen viralen Integrationsstellen durch Southern Blot Analyse (nicht gezeigt) bestätigt.
- Die Expression Retrovirus-kodierter Gene in infizierten LCL wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Figur 1 gezeigt. Aus CB33-Zellen (Spur 1), pKneo-infizierten CB33-Zellen (Spur 2), raszip6-infizierten CB33-Zellen (Spur 3) und SVNras-infizierten CB33-Zellen (Spur 4) wurde RNA extrahiert, mit dem gut bekannten Guanidinisothiocyanat-Verfahren gereinigt, in 0,9 % Agarose-2,2 M Formaldehydgelen elektrophoretisiert, auf Nitrozellulosefilter übertragen und mit den angegebenen Sonden hybridisiert. Eine schematische Darstellung der verwendeten retroviralen Vektorsonden und der erwarteten hybridisierenden Transkripte ist in Figur 1 ebenfalls gezeigt. Eine Northern-Blot-Hybridisierungsanalyse zeigte die Gegenwart viraler ras-Gene innerhalb der viralen Transkripte in Genomgröße (Figur 1).
- Ein Beweis für phenotypische Änderungen in allen Zellpopulationen, die entweder H- oder N-ras-Onkogene tragen, manifestierte sich sofort im erhöhten zellulären Volumen und einer gesteigerten Tendenz, an Kunststoff anzuhatten. Die lichtmikroskopische morphologische Untersuchung von Zellen, die durch eine routinemäßige zytochemische Giemsa-Färbung hergestellt wurden, die im Stand der Technik gut bekannt ist, zeigte, daß sowohl parentale als auch kontrollinfizierte CB33- und UH3-Zellen die typische Morphologie EBV-immortalisierter lymphoblastoider Zellen (kleines Zellvolumen, hohes Verhältnis von Kern zu Zytoplasma, multiple prominente Nucleoli) beibehielten. Im Gegensatz dazu zeigte eine signifikante Fraktion (> 80 %) von Zellen, die ras-Onkogene tragen, einen morphologischen Beweis für eine Plasmazelldifferenzierung einschließlich einer Zunahme des Zytoplasmas, einer exzentrischen Anordnung des Kerns mit dem Auftreten eines einzelnen prominenten Nukleolus und einer Zunahme der Anzahl und Größe zytoplasmatischer Einschlüsse. Die übrigen Zellen zeigten einen relativ weniger reifen, aber immer noch plasmazytoiden Phenotyp (siehe unten und Figur 4). In Figur 4 sind die reifen, Plasmazytoiden Zellen die großen, leichter schattierten Zellen, die in Figur 4b vorherrschend sind. Die weniger reifen Zellen sind die dunkleren, kleineren Zellen, die in Figur 4a vorherrschend sind.
- Als nächstes wurde ein Beweis für die Plasmazelldifferenzierung durch Analyse der Immunglobulinausscheidung und der Expression von Oberflächenzellmarkern, die mit der terminalen Differenzierung von B-Zellen zu Plasmazellen assoziiert sind (wie beschrieben in Foon, K.A., und Todd III, R.F., Blood 68: 1, 1986), gesucht.
- Die Zellen wurden 3-fach in einer Konzentration von 2 x 10&sup4; pro Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen plattiert, die Überstände wurden nach 2, 4 und 6 Tagen geerntet und auf Gegenwart von IgM mit einem ELISA-Test unter Verwendung von mit alkalischer Phosphatase verbundenem Antikörper gegen humanes IgM untersucht. In keiner der infizierten Zellinien wurde eine IgA- oder IgG-Ausscheidung nachgewiesen (das ist konsistent mit der Tatsache, daß die parentalen lymphoblastoiden Zellen nicht auf eine IgG-Ausscheidung selektioniert waren). Die Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt (die Abszisse gibt die Tage nach dem Plattieren an).
- In Figur 2 bezeichnen Rauten die Zellinien, die mit dem pKneo-Virus (Kontrolle) infiziert sind, und Quadrate bezeichnen Zellinien, die mit dem raszip6-Virus infiziert sind. Jede Kurve gibt Daten von Zellinien wider, die aus verschiedenen Infektionsereignissen abgeleitet sind. Die durchgezogenen Linien repräsentieren Daten von Zellinien, die aus der Infektion und Selektion der gesamten Zellen abgeleitet sind. Unterbrochene Linien repräsentieren Daten von Zellinien, die das Produkt einer Selektion von Klonen waren.
- In allen Zellpopulationen, die ras-Onkogene tragen, gab es eine merkliche Zunahme der Ausscheidung von IgM bis zu einem Maximum einer 15-fachen Zunahme über die infizierten Kontrollzellen (Figur 2). Diese Zunahme der IgM-Ausscheidung war in allen Onkogen-exprimierenden Zellen einschließlich sowohl der insgesamt als auch der klonal infizierten Zellen nachweisbar. Diese Zellen erzeugten zwischen 10 ug und 100 ug Antikörper pro ml Kulturflüssigkeit.
- Die Zelloberflächenexpression von Linien-, Differenzierungs- und Aktivierungs-spezifischen Antigenen wurde unter Verwendung monoklonaler Antikörper mit indirekter Immunfluoreszenz und durchflußzytometrischer Analyse untersucht. Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt.
- In Figur 3 wurden pKneo-infizierte (gepunktete Linien, neo) und raszip6-infizierte (durchgezogene Linien, ras) CB33-LCL mittels indirekter Immunfluoreszenz markiert und mittels Zytofluorometrie unter Verwendung der in Gotch, F. in Leukocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens, A.J. McMichael, Oxford Press, Oxford, 1987, beschriebenen Reihe monoklonaler Antikörper (MoAbs) analysiert. Repräsentative Daten wurden unter Verwendung des MoAb MOPC-21 (eine Isotyp-identische Negativkontrolle, Reihe a) , MoAb TS-1-22 (verwendet als Kontrolle mit Spezifität für ein Antigen, LFA-1 [CD11a], dessen Expression nicht verändert ist, Reihe b), MoAb PCA-1 (Reihe c) und MoAb OKT10 (Reihe d) erhalten. Analoge Ergebnisse wurden erhalten, wenn N-ras-Onkogene exprimierende LCL analysiert wurden.
- Unter vielen untersuchten Markern wurden die signifikantesten und konsistentesten Veränderungen bei der Expression der OKT10(CD38)- und PCA-1-Antigene beobachtet, wie sich sowohl in einer Zunahme des Prozentsatzes Antikörper-reaktiver Zellen als auch einer Zunahme der Antigendichte in LCL, die entweder H- oder N-ras-Onkogene exprimieren, manifestierte (Figur 3). Es ist bekannt, daß die Expression dieser beiden Antigene mit der Plasmazelldifferenzierung zunimmt.
- Ras-Onkogen exprimierende Zellen wurden dann auf mit einer neoplastischen Transformation assoziierte Wachstumseigen schaften analysiert. Zuerst wurde die Fähigkeit dieser Zellen, in weichem Agar Kolonien zu bilden, getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1, unten, gezeigt. TABELLE 1 IN VITRO-KLONIERUNGSEFFIZIENZ UND IN VIVO-TUMORIGENIZITÄT VON MIT RETROVIRALEN KONSTRUKTEN INFIZIERTEN LCL ZELLINIE KLONIERUNGSEFFIZIENZ TUMORIGENIZITÄT Tumoren/Injektion Latenz n.g. = nicht getestet n.a. = nicht anwendbar
- (x): Als positive Kontrolle verwendete Burkitt-Lymphomzelllinie.
- (*): Mit einem c-myc-Onkogen transformierte CB33-LCL.
- (&spplus;): Aus der Gesamtinfektion und -selektion abgeleitete LCL.
- (#): Aus der Selektion in begrenzter Verdünnung abgeleitete LCL-Klone.
- Wie aus Tabelle 1, oben, ersichtlich ist, scheint die Expression sowohl der H- als auch der N-ras-Onkogene sowohl den CB33- als auch den UH3-LCL eine mäßige, doch konsistent nachweisbare klonogene Fähigkeit unter Bedingungen zu verleihen, unter denen von parentalen oder infizierten Kontrollzellen keine Kolonien gebildet werden. Als ein zweiter Test für den malignen Phenotyp wurde die Fähigkeit von ras-Onkogenen exprimierenden LCL und Kontroll-LCL untersucht, Tumoren in vivo zu bilden, wenn sie subkutan in thymische Nacktmäuse injiziert wurden.
- LCL, die mutierte ras-Gene exprimierten, waren tumorigen, wobei subkutane Tumoren 2-3 Wochen nach Injektion auftraten (Tabelle 1) . Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß ras-Onkogene einen relativ schwachen, jedoch eindeutigen und konsistent identifizierbaren transformierten Phenotyp auf LCL übertragen.
- Das Verhältnis zwischen Proliferation und terminaler Differenzierung in den ras-Onkogene enthaltenden LCL wurde dann untersucht. Man könnte sich 2 Szenarien vorstellen. Erstens könnten ras-Onkogene die unkontrollierte Proliferation stimulieren, die mit dem stochastischen (d.h., zufälligen) Eintritt in einen terminalen Differenzierungsweg assoziiert ist, was zu einer heterogenen Population von Zellen einschließlich sowohl sich selbst erneuernder als auch terminal differenzierender, proliferativ ruhiger Subpopulationen führt. Alternativ könnte die ras-Onkogen-Expression terminal differenzierten Zellen eine proliferative Kapazität verleihen, was zu einer phenotypisch homogenen Population führen würde, die sich aus reifen, proliferierenden Elementen zusammensetzt. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die DNA-Replikation auf der Ebene der einzelnen Zelle durch autoradiographische Bestimmung der [³H]-Thymidinaufnahme untersucht. Die Ergebnisse sind in Figur 4 gezeigt. In Figur 4 wurde (³H]-Thymidin (1 uC/ml) zum Wachstumsmedium von mit pKneo-infizierten (Reihe a) und raszip6-infizierten (Reihe b) UH3-LCL zugefügt, die dann nach 24 Stunden geerntet und mittels Zytozentrifugation auf Objektträger übertragen wurden. Die Objektträger wurden mit NTB-2-Emulsion (Eastman Kodak, Rochester, NY) überzogen, 12 Tage bei 4ºC exponiert, entwickelt, mit Giemsa-Reagenz gegengefärbt und der Thymidineinbau bestimmt. Das Auszählen von 200 Zellen aus diesem Experiment zeigte 61 % positive (5 Granula/Kern) Zellen in pKneo-infizierten UH3-LCL und 22 % positive Zellen in raszip6-infizierten UH3-LCL. Ein in CB33 LCL durchgeführtes analoges Experiment zeigte 60 % und 39 % positive Zellen für pKneo-infizierte bzw. raszip6-infizierte LCL.
- Wie in Figur 4 gezeigt, wiesen die das ras-Onkogen exprimierenden Zellen ein heterogenes Muster auf, wobei der Thymidineinbau auf die kleineren, unreiferen Elemente beschränkt ist und praktisch keine DNA-Replikation in den reiferen, größeren Elementen nachgewiesen wurde. Obwohl diese Ergebnisse dem oben beschriebenen ersten Szenario zu entsprechen scheinen, blieb die Möglichkeit offen, daß die beobachtete Heterogenität eine Folge der klonalen Variationen von Zellen, die verschiedene Mengen des ras-Onkogenes exprimieren, war. Um diese Frage direkt anzugehen, wurden klonogene Zellen, nämlich Zellen, die aus Kolonien in halbfestem Medium (Tabelle 1, s.o.) gewonnen worden waren, untersucht, um festzustellen, ob sie auf die Selbsterneuerung beschränkt waren oder ob sie außerdem fähig waren, differenzierte Nachkommen zu erzeugen. Nach erneutem Ausplattieren in halbfestem Medium zeigten diese Zellen keine erhöhte klonogene Fähigkeit, während sie schnell reife Nachkommen erzeugten, wenn sie in Flüssigkultur wachsengelassen wurden (nicht gezeigt). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß die ras-Onkogen-Expressin in LCL sowohl die Selbsterneuerung als auch den stochastisch bestimmten Eintritt in einen Weg, der zu terminal differenzierten, ruhenden Plasmazellen führt, stimuliert.
- Die oben vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, daß ras-Onkogene sowohl ein anhaltendes Wachstum durch Kooperation mit EBV bei der Transformation von LCL stimulieren können als auch die terminale Differenzierung auslösen können, die in EBV-infizierten B-Zellen normalerweise blockiert ist. Die Differenzierung scheint eher einen spezifischen Effekt der ras-Onkogen-Expressin darzustellen als eine Konsequenz der gesteigerten Proliferation, da die Expression von c-myc-Onkogenen in LCL analoge Veränderungen des Wachstums verursachte, während keine Differenzierung beobachtet wurde (nicht gezeigt).
- B-Zellen, die wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert worden sind, können auf ihre Spezifität hin durchmustert werden, wie in Casali, P. et al. (s.o.) beschrieben. Ungefähr 1 x 10&sup6; B-Zellen werden 35 Minuten in eisgekühlter steriler ausgewogener Salzlösung nach Hanks ohne Ca²&spplus; oder Mg²&spplus; und ohne Phenolrot, mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA-HBSS) und angemessenen Mengen biotinyliertem Antigen, inkubiert. Typischerweise wird 1 mg/ml Antigen in 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,8) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in Gegenwart von 1 Nanogramm d-Biotin-N-hydroxysuccinimidester 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen können mit kaltem BSA-HBSS gewaschen werden und dann mit FITC (Fluoreszein-isothiocyanat) Avidin (FITC-Avidin) (1,56 x 10&supmin;&sup7; M) in kaltem BSA-HBSS für 45 Minuten reagieren. Eine kleine Probe B-Zellen (10&sup6;) wird gleichzeitig mit BSA-HBSS ohne biotinyliertes Antigen inkubiert und mit FITC-Avidin unter ähnlichen Bedingungen reagieren gelassen. Nach einem weiterem Waschen mit kaltem BSA-HBSS werden Zellen aus beiden Proben in einer Dichte von 10&sup6; Zellen pro ml im gleichen Medium resuspendiert und zu verschiedenen Zeiten einem Becton und Dickinson Modell 440 FCS mit einem 488 Argon-Laser (Becton und Dickinson, Mountain View, CA) zugeführt. In Gegenwart von biotinyliertem Antigen und FITC-Avidin fluoreszierende Zellen werden identifiziert und isoliert.
- Normale humane B-Zellen werden wie in Beispiel 1, oben, beschrieben, isoliert, mit EBV wie in Beispiel 2, oben, immortalisiert und transformiert mit einem retroviralen Vektor mit einem aktivierten ras-Gen wie in Beispiel 4. Erfolgreiche Transformanten werden durch ihre Resistenz gegen G418 selektioniert. Vollständig differenzierte, G418-resistente Transformanten werden wie in Beispiel 4, oben, isoliert.
- Die vollständig differenzierten, ras-transformierten LCL werden auf Wachstum in geeigneten selektiven Medien (z.B. 6-Thioguanosin enthaltenden Medien) selektioniert. Gegenüber einem Wachstum in diesen Medien resistente LCL können auf Wachstum in HAT-Medium selektioniert werden, weil ihnen ein funktionelles Gen für HGPRT fehlt.
- IgG-ausscheidende normale humane B-Zellen, die gegen ein spezifisches Antigen (z.B. HIV gp41) gerichtete Antikörper ausscheiden, werden wie in Beispiel 5, oben, aus einem HIV- seropositiven Patienten isoliert. Diese B-Zellen werden mit den mutagenisierten, immortalisierten, vollständig differenzierten, ras-transformierten LCL, die oben beschrieben sind, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren fusioniert. Die HAT-resistenten (HGPRT Minus) Zellen werden wie unten beschrieben als Fusionspartner verwendet.
- Die Fusionen werden bevorzugt in Gegenwart von 50 % (w/v) Propylenglycol (M.G. 1500, Sigma Chemical, St. Louis, MO) durchgeführt. Nach der Fusion werden die Zellen in mit 10 % fötalem Rinderserum supplementierten Kulturmedium resuspendiert und über Nacht in Gewebekulturschalen mit 6 Vertiefungen plattiert. Am nächsten Tag werden die Zellen einmal gewaschen und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden plattiert.
- Erfolgreiche Fusionen werden auf Resistenz gegen G418 und Wachstum in HAT-Medium durchmustert. Hybridome, die gegen HIV gp41 gerichtetes IgG ausscheiden, werden wie im Beispiel 5, oben, identifiziert und isoliert.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die obenstehenden Beispiele veranschaulicht. Wie der Fachmann anerkennen wird, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese speziellen Beispiele beschränkt, sondern ist empfänglich für Hinzufügungen, Deletionen und Substitutionen, ohne vom Geist der Erfindung und/oder dem Umfang der folgenden Ansprüche abzuweichen.
Claims (18)
1. Verfahren zum Herstellen von Humanzellen, die monoklonale
Antikörper exprimieren können und in vitro wachsen können,
welches das Immortalisieren von humanen B-Zellen, die
Antikörper einer gewünschten Spezifizität exprimieren, durch
Infektion mit Epstein-Barr-Virus, das Transformieren der
immortalisierten humanen B-Zellen mit einem Vektor, der ein
Gen enthält, das den Zellen die Fähigkeit zur
Differenzierung verleiht, wobei das Gen ein aktiviertes ras-Gen ist,
und das Auswählen immortalisierter Transforinanten, die den
Antikörper ausscheiden, umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gen den Zellen
außerdem die Fähigkeit verleiht, auf halbfesten Medien oder
in Tieren zu waChsen, und die Antikörper-erzeugende
Fähigkeit der Zellen steigert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend das Transformieren
der Humanzellen mit einer zur Transformation wirksamen Menge
des Vektors.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Auswahlschritt das
Auswählen von Epstein-Barr-infizierte- humanen B-Zellen,
die den ras-Vektor exprimieren, umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vektor einen
retroviralen Vektor umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der retrovirale Vektor
ein aus der aus SVNras und raszip6 bestehenden Gruppe
ausgewählter
Angehöriger ist.
7. Verfahren zum Erhalten transformierter humaner B-Zellen,
umfassend das Immortalisieren humaner B-Lymphozyten durch
Infektion mit Epstein-Barr-Virus, das Transformieren der
immortalisierten B-Lymphozyten mit einem Vektor, der ein Gen
enthält, das den Zellen die Fähigkeit zur Differenzierung
verleiht, wobei das Gen ein aktiviertes ras-Gen ist, und das
Gewinnen der immortalisierten differenzierten Transformanten.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Gen den Zellen
außerdem die Fähigkeit zum Wachstum auf halbfesten Medien oder in
Tieren verleiht.
9. Transformierte Humanzelle, umfassend einen mit Epstein-
Barr-Virus infizierten humanen B-Lymphozyten, wobei die Zelle
DNA-Segmente enthält, die für einen selektierbaren genetischen
Marker kodieren, und ein aktiviertes ras-Gen in geeigneter
Orientierung und korrektem Leseraster.
10. Transformierte Humanzelle nach Anspruch 9, wobei das
humane ras-Gen am Kodon 12 mutiert ist.
11. Zelle nach Anspruch 10, die humane monoklonale Antikörper
ausscheidet.
12. Transformierte Humanzelle, die eine mit Epstein-Barr-Virus
infizierte humane B-Zelle umfaßt und ein aktiviertes ras-Gen
enthält.
13. Verfahren zum Erzeugen humaner monoklonaler Antikörper,
das umfaßt
- das Immortalisieren einer humanen B-Zelle durch
Infektion mit Epstein-Barr-Virus,
- das Transformieren der immortalisierten B-Zelle, so
daß in die Zelle ein Gen eingebaut wird, das der
Zelle die Fähigkeit zur Differenzierung verleiht,
wobei das Gen ein aktiviertes ras-Onkogen ist, das
Verschmelzen der Transformante mit einem B-Zellen-
erzeugenden Antikörper mit einer vorbestimmten
Spezifität, wodurch eine Hybridzelle erzeugt wird, die die
Fähigkeit zur Erzeugung des Antikörpers hat; das
Kultivieren der Hybridzelle unter Antikörper-erzeugenden
Bedingungen und das Gewinnen des Antikörpers.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Gen der Zelle
außerdem die Fähigkeit zum Wachstum auf halbfesten Medien und in
Tieren verleiht.
15. Humane monoklonale Antikörper erzeugende Zelle, umfassend
das Fusionsprodukt einer Epstein-Barr-Virus-infizierten
rastransformierten B-Zelle und einer humane Antikörper
erzeugenden B-Zelle, oder die Nachkommen eines solchen
Fusionsproduktes.
16. Verfahren zum Herstellen differenzierter humaner B-Zellen,
umfassend:
- das Transformieren einer durch Infektion mit Epstein-
Barr-Virus immortalisierten humanen B-Zelle, so daß
in die B-Zelle ein Gen eingebaut wird, das der Zelle
die Fähigkeit zur Differenzierung verleiht, wobei das
Gen ein aktiviertes ras-Onkogen ist, und das
Wiedergewinnen einer differenzierten immortalisierten B-Zelle.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Gen der Zelle
außerdem die Fähigkeit zum Wachstum auf halbfesten Medien und in
Tieren verleiht.
18. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die differenzierte
immortalisierte B-Zelle humane monoklonale Antikörper
ausscheidet.
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