DE69434097T2

DE69434097T2 - Apoptose induzierender monoklonaler antikörper

Info

Publication number: DE69434097T2
Application number: DE69434097T
Authority: DE
Inventors: Naoshi Gotemba-shi FUKUSHIMA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2014-09-03
Also published as: ZA946767B; US6759043B2; AU692466B2; WO1995006748A1; FI960567A0; SK25596A3; TW426687B; US6267959B1; EP0721015B1; PL181783B1; DE69434097D1; UA50708C2; EP0721015A4; US20010001712A1; US20030147894A1; RU2202615C2; KR100241863B1; ATE280835T1; CN1130405A; SK281964B6

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen monoklonalen Antikörper, der über die Eigenschaft verfügt, Apoptosis an Knochenmarkzellen hervorzurufen und der als Medikament für granulozytäre Leukämie verwendbar ist, und betrifft Fragmente davon sowie Hybridome, die den monoklonalen Antikörper erzeugen.
Da die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung Antigene erkennen und identifizieren, die Apoptosis von Myeloidzellen speziell hervorrufen und selbst ebenfalls die Eigenschaft besitzen, die Apoptosis von Myeloidzellen hervorzurufen, können sie als Medikament verwendet werden, das auf dem Gebiet der Arzneimittel für granulozytäre Leukämie anwendbar ist.
Einschlägiger Stand der Technik
Granulozytenkolonien stimulierende Faktoren, wie beispielsweise rekombinante Granulozytenkolonie stimulierende Faktoren (rG-CSF), als humorale Faktoren bekannt geworden, die Differenzierung und Proliferation von granulozytären Zellen zu stimulieren und es ist in einem Versuch in Mäusen in vivo berichtet worden, dass die Verabreichung von rG-CSF die Hämopoese des Knochenmarks verstärkt und darüber hinaus eine extramedulläre Hämopoese in der Milz zum Proliferieren von hämopoetischen Stammzellen und aller hämopoetischer Präkursorzellen in der Milz bewirkt. Man hat außerdem geglaubt, dass es sich um einen extramedullären hämopoetischen Mechanismus in der Milz handelt, das die Hämopoese in Folge von milzbedingten hämopoetischen Modifikationen in der Mikroumgebung nach der Stimulierung von rG-CSF zur Verstärkung des hämopoetischen Potentials auftritt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher bekannten stromalen Milzzellen rG-CSF im Hinblick auf die Klärung des hämopoetischen Potentials in der Milz verabreicht und eine hämopoetische Stromazellen-Linie (CF-1-Zellen) aus der Milz einer Maus mit verabreichten rG-CSF ermittelt in dem Versuch der Analyse der Verstärkung des hämopoetischen Potentials durch Stromazellen mit rG-CSF und haben den potentiellen Einfluss auf Hämopoese unter Verwendung der hämopoetischen Stromazellen untersucht und als Ergebnis die Kolonie stimulierenden Aktivitäten in vitro und die unterstützende Kraft von hämopoetischen Stammzellen in vivo erkannt (Blood, 80, 1914, (1992)).
Obgleich allerdings einige der stromalen Milzzellen als eine Zelllinie aufgestellt worden sind (CF-1-Zellen) und deren zytologische Charakteristik untersucht worden ist, sind bisher keine den spezifischen Antikörper erkennende Oberflächenantigene dargestellt worden und deren Charakteristik ist bis jetzt kaum bekannt geworden.
Damit haben sich die Erfinder der vorliegenden Erfindung mit eingehenden Untersuchungen im Hinblick auf die Entwicklung spezifischer Antikörper befasst, die zum Erkennen von stromalen Milzzellen auf der Grundlage der vorgenannten Informationen über stromale Milzzellen und der Ergebnisse dieser Untersuchungen in der Lage sind und haben monoklonale Antikörper unter Verwendung der stromalen Milzzelllinien als Antigen für die Immunisierung verwendet und als Ergebnis neuartiger monoklonaler Antikörper erhalten, die bisher noch nicht veröffentlicht wurden.
Und als Ergebnis der Untersuchung der Eigenschaften der erhaltenen monoklonalen Antikörper haben die Erfindung überraschend festgestellt, dass sie über die Eigenschaft verfügen, Apoptosis von Knochenmarkzellen hervorzurufen, was zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung geführt hat.
Yonehara, S. et al., J. Exp. Med., (1989) 169: 1747–1756, haben die Isolierung eines Hybridoms beschrieben, das einen monoklonalen Antikörper (Anti-Fas) erzeugt, von dem man sagt, dass er auf verschiedene Humanzellen zytolytisch ist. Die zelltötende Wirksamkeit des Anti-Fas-monoklonalen Antikörpers wurde als von der zytolytischen Wirksamkeit von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) als nicht unterscheidbar beschrieben. Allerdings haben J. Ogasawara, et al., Nature (1993) 364: 806–809, demonstriert, dass die Leber, nicht jedoch irgend ein anderes Gewebe, Bereiche der focalen Hämorrhagie und Nekrose zeigt, wenn Gewebesektionen von Mäusen histologisch 2 Stunden nach Injektion des Fas-Antikörpers untersucht wurden. Dieses würde nahelegen, dass das Anti-Fas-Antigen keine Apoptose an Knochenmarkzellen hervorruft. R. Watanable- Fukunaga, et al., J. Immunol. (1992) 148: 1274–1279, haben bestätigt, dass das Fas-Antigen im Thymus exprimiert ist, nicht jedoch in Milz- oder Knochenmarkzellen.
Offenbarung der Erfindung
Es ist Ziel und Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuartigen monoklonalen Antikörper zu schaffen, der über die Eigenschaft verfügt, Apoptosis an Knochenmarkzellen hervorzurufen und als Medikament für die granulazytäre Leukämie verwendbar ist; sowie Fragmenten davon und darüber hinaus ein den monoklonalen Antikörper erzeugendes Hybridom.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist in bemerkenswerter Weise als Antiköper verwendbar, der Antigene erkennt, die Apoptosis von Knochenmarkzellen hervorrufen (auch bezeichnet als Selbstzerstörung der Zellen, ein Phänomen, bei dem eine nukleare Chromatin-DNA an einer Nukleosom-Einheit (sogenannte Leiterbildung) abgebaut wird und so zum Tod von Zellen führt), und der eine Funktion zu deren Identifizierung hat oder eine Funktion, Apoptosis von Knochenmarkzellen hervorzurufen. Im Übrigen sind in Knochenmarkzellen andere Zellen als Lymphoidzellen einbezogen, wie beispielsweise neutrophile Zellen, Megakaryozyten, Myeloblasten, Myelozyten, Mastzellen, Makrophagen, Monozyten und Erythroblasten. Bisher ist noch kein monoklonaler Antikörper bekannt gewesen, der über die Eigenschaft verfügt, Apoptose an Knochenmarkzellen hervorzurufen.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann grundsätzlich entsprechend der nachfolgenden Ausführung dargestellt werden.
In diesem Sinne kann der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von stromalen Milzzellen als Antigene zur Immunisierung dargestellt werden, die von einem Tier abgenommen werden, dem rG-CSF verabreicht wurde, Immunisieren nach einer üblichen Methode der Immunisierung, Zellfusion der immunisierten Zellen nach einer üblichen Methode der Zellfusion und Klonen der fusionierten Zellen nach einer üblichen Methode des Klonens.
Als eine Methode zum Darstellen des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung lässt sich vorzugsweise eine Methode exemplifizieren, die die Verwendung von CF-1-Zellen umfasst, von stromalen Milzzellen eines Tiers, dem rG-CSF verabreicht wurde, das von den Erfindern der vorliegenden Erfindung als eine Zelllinienkultur aufgestellt wurde, und zwar ist das Antigen (Blood, Bd. 80, 1914 (1992)), fusionieren. Von Plasmazellen (Immunozyt) eines mit dem Antigen mit Knochenmarkzellen von einem Säugetier immunisierten Säugers, wie beispielsweise eine Maus; Klonen der erhaltenen fusionierten Zellen (Hybridoma), Auswählen von Klonen, die Antikörper erzeugen, der die vorgenannte Zelllinie unter ihnen erkennt und diese in Kultur nehmen, um den gewünschten Antikörper zu gewinnen. Die Methode ist jedoch lediglich ein Beispiel, wobei in diesem Fall beispielsweise nicht nur die vorgenannten CF-1-Zellen, sondern auch Zelllinien, die von stromalen Milzzellen des Menschen abgenommen wurden, entsprechend dem Fall von CF-1-Zellen erhalten werden und als die Antigene verwendet werden können, um Antikörper darzustellen, die an die gewünschten Human-Knochenmarkzellen in der gleichen Weise binden wie im Fall der vorgenannten CF-1-Zellen.
In dem Verfahren zum Darstellen derartiger monoklonaler Antikörper sind die mit dem vorgenannten Antigen zu immunisierenden Säuger nicht speziell beschränkt, wobei es bevorzugt ist, eine Auswahl unter Berücksichtigung der Eignung mit Knochenmarkzellen zu treffen, die in der Zellfusion verwenden werden sollen: vorzugsweise eine Maus, eine Ratte und ein Hamster, die verwendet werden.
Die Immunisierung wird nach einer üblichen Methode ausgeführt, beispielsweise durch Verabreichen von stromalen Milzzellen, wie beispielsweise die vorgenannten CF-1-Zellen, durch Injektion in die Bauchhöhle eines Säugers. Spezieller erfolgt die Verabreichung von einer vorzugsweise verdünnt mit oder in Suspension einer geeigneten Menge von PBS oder einer isotonischen Natriumchlorid-Lösung an ein Tier monatlich mehrere Male. Vorzugsweise verwendet man Milzzellen, die nach der letzten Verabreichung der vorgenannten Zellen als Immunozyten entnommen wurden.
Als eine Knochenmarkzelle eines Säugers als die andere Wirtszelle, die mit den vorgenannten Immunozyten fusioniert werden soll, können bevorzugt verschiedene bekannte Zellen verwendet werden, einschließlich: P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol., 123, 1548 (1978)), p3-U1 (Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81, 1–7 (1978)), NS-1 (Eur. J. Immunol., 6, 511–519 (1976)), MPC-11 (Cell, 8, 40515 (1976)), Sp2/0-Ag14 (Nature, 276, 269–270 (1978)), FO (J. Immunol. Meth., 35, 1–21 (1980)), S194 (J. Exp. Med., 148, 313–323 (1978)) und R210 (Nature, 277, 131–133 (1979)).
Die Zellfusion des vorgenannten Immunozyt und einer Myelomzelle kann grundsätzlich nach einer üblichen Methode ausgeführt werden, beispielsweise eine Methode von Milstein et al. (Methods Enzymol., 73, 3–46 (1981)).
Spezieller lässt sich die vorgenannte Zellfusion beispielsweise in einem üblichen Nährmedium in Gegenwart eines die Fusion beschleunigenden Mittels ausführen. Als ein die Fusion beschleunigendes Mittel können beispielsweise Polyethylenglykol (PEG) und Sendai Virus (HVJ) und darüber hinaus Adjuvantien nach Erfordernis in geeigneter Weise zugegeben werden, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid, um den Fusionseffekt zu verstärken. Hinsichtlich der Anteile von Immunozyten und Myelomzellen werden die ersteren vorzugsweise in einer Menge von 1–10-fach in Bezug auf die Letzteren verwendet. Beispiele für ein in der vorgenannten Zellfusion verwendetes Medium schließen ein RPMI-1640-Medium ein und ein MEM-Medium, das für die Proliferation der vorgenannten Myelomzelle geeignet ist, sowie andere Medien, die üblicherweise für die Aufzucht dieser Art von Zellen verwendet werden, und darüber hinaus ein ergänzendes Serum, wie beispielsweise fötales Rinderserum (FBS), die gemeinsam verwendet werden können.
Die Zellfusion wird ausgeführt, indem vorgeschriebene Mengen der vorgenannten Immunozyten und der Myelomzellen in dem vorgenannten Medium unter Zugabe einer PEG-Lösung gemischt werden, die bis etwa 37°C vorgewärmt wurde, beispielsweise PEG mit einer mittleren relativen Molekülmasse in der Größenordnung von 1.000 bis 6.000, das dem Medium zugegeben wird und normalerweise bei einer Konzentration von etwa 30 bis 60% (Gew./Vol.), wonach diese gemischt werden. Sodann können die gewünschten Hybridoma durch Wiederholen der Operationen des Zugebens der entsprechenden Medien in der Reihenfolge und Zentrifugieren der Reaktionsmischung und Entfernen der Überstände erzeugt werden.
Diese Nybridomas werden durch Kultivieren in einem selektiven Medium selektiert, wie beispielsweise einem HAT-Medium (Medium, ergänzt mit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin). Die Kultur in dem HAT-Medium wird für eine ausreichende Dauer fortgesetzt, damit andere Zellen als die gewünschten Hybridoma (nicht fusionierte Zellen) absterben können, und zwar üblicherweise für die Dauer mehrerer Tage bis zu mehreren Wochen. Anschließend können das Screening und Monoklonen der Hybridoma unter Erzeugung der gewünschten Antikörper nach einer üblichen Grenzwert-Verdünnung ausgeführt werden.
Die dargestellten Hybridoma, die die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung erzeugen, können in einem üblichen Medium subkultiviert und über längere Zeitdauer in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.
Um die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung von den Hybridomas auszusondern, kann eine Methode eingesetzt werden, die das Kultivieren der Hybridoma nach einer üblichen Methode umfasst und deren Gewinnung aus den Überständen, oder es kann eine Methode zur Anwendung gelangen, die das Verabreichen eines Hybridoms an einem entsprechenden Säuger umfasst, um dieses zu proliferieren und von seinem Ascites zu erhalten. Die Erstere eignet sich zum Erhalten von Antikörpern mit hoher Reinheit und die Letztere eignet sich für die Massenerzeugung von Antikörpern.
Darüber hinaus können die nach den vorstehend ausgeführten Verfahren erhaltenen Antikörper bis zu einem hohen Grad unter Einsatz üblicher Reinigungsmethoden gereinigt werden, wie beispielsweise einer Methode des Aussalzens, der Gelfiltration und der Affinitätschromatographie.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann jeder beliebige monoklonale Antikörper sein, so lange er über die spezifische Eigenschaft verfügt, die speziell in dem nachfolgenden Beispiel beschrieben wird, nämlich die Eigenschaft, Apoptosis von Knochenmarkzellen hervorzurufen, sowie die des Erkennens eines Antigens, das mit Hilfe der stromalen Milzzellen eines Tieres exprimiert ist, die ebenfalls durch den monoklonalen Antikörper BMAP-1 erkannt wird, der von dem Hybridom FERM BP-4382 erhalten werden kann.
Unter Einsatz der vorgenannten Eigenschaft, kann der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung als Medikament für granulozytäre Leukämie verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1 eine Analyse (eine Kontrolle in Abwesenheit eines Antikörpers, CF-1-Zelle) nach der Immunfluoreszenz;
2 eine Analyse der Bindungseigenschaften des GSPST-1-Antikörpers an CF-1-Zellen nach der Immunfluoreszenz;
3 eine Analyse der Bindungseigenschaft des BMAP-1-Antikörpers an CF-1-Zellen nach der Immunfluoreszenz;
4 eine Analyse (eine Kontrolle in Abwesenheit eines Antikörpers, Knochenmarkzelle) nach der Immunfluoreszenz;
5 eine Analyse der Bindungseigenschaften des GSPST-1-Antikörpers an Knochenmarkzellen nach der Immunfluoreszenz;
6 eine Analyse der Bindungseigenschaften des BMAP-1-Antikörpers an Knochenmarkzellen nach der Immunfluoreszenz;
7 eine Analyse (eine Kontrolle in Abwesenheit eines Antikörpers, NFS-60) nach der Immunfluoreszenz;
8 die Bindungseigenschaften des GSPST-1-Antikörpers an NFS-60-Zellen nach der Immunfluoreszenz;
9 eine Analyse (eine Kontrolle entsprechend Ratten-IgG1, NFS-60) nach der Immunfluoreszenz;
10 die Bindungseigenschaften des BMAP-1-Antikörpers an NFS-60-Zellen nach der Immunfluoreszenz;
11 einen Assay auf den monoklonalen Antikörper (BMAP-1) zum Hemmen der NFS-60-Zellproliferation;
12 einen Assay auf den monoklonalen Antikörper (GSPST-1) zum Hemmen der Knochenmarktransplantation;
13 einen Assay auf den monoklonalen Antikörper (BMAP-1) zum Hemmen der Knochenmarktransplantation;
14 eine erläuternde Übersicht (Mikrophotographie (gefärbt mit H. E.) von Knochenmarkproben (400-fach)), die tote Knochenmarkzellen (2) 6 Tage nach Verabreichung des monoklonalen Antikörpers BMAP-1 der vorliegenden Erfindung zeigt sowie die Kontrolle (1) in Abwesenheit des Antikörpers;
15 eine erläuternde Übersicht (Migration – nach der elektrophoretischen Chromatographie), die die Leiterbildung der DNA von Knochenmarkzellen zeigt, die beobachtet werden, wenn der monoklonale Antikörper BMAP-1 der vorliegenden Erfindung verabreicht wird;
16 einen Zytotoxizitätsassay unter Verwendung von L929-Zellen durch TNFα;
17 einen Zytotoxizitätsassay durch den monoklonalen Antikörper (BMAP-1);
18 eine Analyse (eine Kontrolle nach Ratten-IgG2a, BWV1) nach der Immunfluoreszenz;
19 die Bindungseigenschaften des Anti-Maus-MHC, Klasse I-Antikörpers an BWV1-Zellen nach der Immunfluoreszenz;
20 eine Analyse (eine Kontrolle nach der Ratten-IgG1, BWV1) nach der Immunfluoreszenz;
21 die Bindungseigenschaften des BMAP-1-Antikörpers an BWV1-Zellen nach Immunfluoreszenz.
Erläuterung der Symbole

a: DNA des Thymus einer Maus, der BMAP-1 verabreicht wurde (24 Stunden);
b: DNA des Knochenmarks einer Maus, der BMAP-1 verabreicht wurde (24 Stunden);
c: DNA des Knochenmarks einer Maus, der BMAP-1 verabreicht wurde (8 Stunden);
d: DNA des Knochenmarks einer Maus, der BMAP-1 verabreicht wurde (4 Stunden);
e: DNA des Knochenmarks einer nichtbehandelten Maus (Knochenmarkzellen);
f: Molekulargewichtsmarker.

Als nächstes wird die vorliegende Erfindung detaillierter in Bezug auf ein Referenzbeispiel und ein Beispiel beschrieben, wobei die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf das Beispiel beschränkt ist.
Referenzbeispiel
Herstellung der stromalen Milzzellen und deren Charakteristik
1) Herstellung stromaler Milzzellen
Es wurde eine stromale Milzzellenlinie aus der primären Kultur der Milzzellen einer C57BL/6J-Maus hergestellt, der rG-CSF 100 Mikrogramm/kg für 5 Tage verabreicht wurden. Diese Milz wurde nach der Verabreichung von rG-CSF unter keimfreien Bedingungen entnommen, in einer 25 cm²-Kunststoffflasche (Corning Co.) für 6 Wochen kultiviert sowie in einem Isocove's modifizierten Dulbecco-Medium (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.) mit 10% wärmeaktiviertem fötalen Rinderserum (FBS) (Sanko Junyaku, Tokyo), 100 U/ml Penicillin und 100 Mikrogramm/ml Streptonycin in einem Inkubator unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂, wobei das Medium zweimal wöchentlich gegen frisches Wachstumsmedium ausgewechselt wurde.
In der konfluenten Kultur wurden anhaftende Zellpopulationen (Stromazellen) aus dem Kolben unter Verwendung von 0,05% Trypsin plus 0,02 EDTA (Sigma Chemical Co.) in Ca-, Mg-freiem PBS geerntet und in neue Flaschen übertragen. Diese Passagen wurden näherungsweise einmal oder zweimal wöchentlich wiederholt. In den ersten Passagen (erste bis zehnte Passage) betrug das Aufspaltungsverhältnis der Zellen 1/4 bis 1/8 und anschließend 1/16 bis 1/32. Die Stromazellen wurden nach ungefähr der zehnten Passage homogen und fibroblastoid.
Bei der zwanzigsten Passage wurden diese Stromazellen entsprechend der vorstehenden Beschreibung geerntet und zum Zellklonen unter Anwendung der Methode der Grenzwert-Verdünnung weitergeleitet, wobei das Zellklonen zweimal wiederholt wurde, um eine Stromazellenlinie herzustellen (CF-1-Zelllinie).
Anschließend wurden diese Zellen in 5-ml IMDM, ergänzt mit 10% wärmeinaktiviertes FBS in einen 25 cm²-Kolben (Corning Co.) gehalten und alle 5 Tage bei einem Aufspaltverhältnis von 1/32 subkultiviert. Stromale Milzzelllinien ließen sich aus anderen Tieren als der Maus herstellen, wie beispielsweise stromale Human-Milzzelllinien, die unter Anwendung der gleichen Methode hergestellt werden können, wie sie vorstehend beschrieben wurde, indem die Zellen mit einem SV-40-Adenovirusvektor transformiert werden (J. Cell. Physiol., 148, 245 (1991)).
2) Charakteristik von CF-1-Zellen
CF-1-Zellen wurden als eine Zelllinie entsprechend der vorstehenden Beschreibung hergestellt und auf alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, beta-Glucuronidase, alpha-Naphthylacetat-Esterase und Öl-rot-O unter Anwendung von zytochemischen Standardmethoden untersucht. Die CF-1-Zellen wurden auch mit Hilfe der immunenzymatischen Histochemie unter Verwendung der folgenden monoklonalen und polyklonalen Antikörper charakterisiert: macI (Sero Tec.); Faktor VIII-bezogenes Antigen (Dakopatts) und Kollagen Typ I, Kollagen Typ III und Fibronektin (Chemicon International Inc.). Phagozytose wurde mit Hilfe der Aufnahme von Latexkügelchen (Partikeldurchmesser: 1,09 Mikrometer; Sigma) getestet und die Fähigkeit von CF-1-Zellen zur Umwandlung zu Adipozyten durch Exponierung an 10^–6 Mol/l Hydrocortisonphosphat (Sigma) in einer 25 cm²-Flasche für 4 Wochen nach der konfluenten Kultur.
Als Ergebnis waren die CF-1-Zellen auf alkalische Phosphatase, Faktor VIII-bezogenen Antigen, macI und Phagozytose negativ, während sie auf Kollagen Typ I, Kollagen Typ III und Fibronektin positiv waren. Es wurden keine CF-1-Zellen zu Adipozyten im Verlaufe von 4 Wochen in einer konfluenten Kultur mit 10^–6 Mol/l Hydrokortison umgewandelt, obgleich CF-1-Zellen lediglich Spuren von Lipid hatten. Anhand dieser Daten haben CF-1-Zellen nicht die Charakteristik von Prä-Adipozyten, Makrophagen und Endothelzellen, weshalb es offensichtlich wurde, dass sie von Stromazellen kamen, die anders als sie waren.
3) Haltung von hämopoetischen Stammzellen durch CF-1-Zellen
Um zu untersuchen, ob hämopoetische Stammzellen von CF-1-Zellen gehalten werden oder nicht, wurden CFU-S-Assays (Assays von koloniebildenden Milzzellen) mit Hilfe der Technik von Till und McCulloch ausgeführt. Es wurden 10 Mäuse pro Gruppe mit 900 cGy (MBR-1520R; Hitachi, Tokyo) bestrahlt und erhielten intravenös mononukleäre Knochenmarkzellen (BM-Zellen) (1,0 × 10⁵/Kopf, 5,0 × 10⁴/Kopf oder 2,5 × 10⁴/Kopf) und CF-1-Zellen (1,0 × 10⁵/Kopf), und es wurden Kolonien in der Milz am 12. Tag als CFU-S-Klone (Milzkolonien) gezählt.
Wenn als Ergebnis mononukleare Knochenmarkzellen (BM-Zellen) und CF-1-Zellen in eine bestrahlte Maus transplantiert wurden, nahm die Zahl der Milzkolonien jeder Gruppe von BM-Zellen signifikant (zwischen 1,4 bis 1,8-fach) im Vergleich zur Maus ohne CF-1-Zellen zu, wobei am 12. Tag nach der Transplantation die Überlebensraten der mit BM-Zellen und CF-1-Zellen transplantierten Mäuse höher waren als diejenigen mit BM-Zellen allein, was eine geringe Sterberate zeigt, womit offensichtlich wird, dass hämopoetische Stammzellen von CF-1-Zellen gehalten werden.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die Ausführungsform der Erfindung wird nachfolgend detaillierter beschrieben.
Beispiel
Herstellung monoklonaler Antikörper
1) Antigene und Immunisierung
Die Immunisierung wurde unter Verwendung von CF-1-Zellen ausgeführt, die in dem vorstehenden Referenzbeispiel als Antigene erhalten wurden. Die Zellen wurden in einem Inkubator unter der Bedingung von 5% CO₂ und 37°C und unter Verwendung von Isocove's modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS; Sanko Junyaku) als Medium kultiviert.
Die Zellen wurden mit wurden mit 1 mMol EDTA/PBS behandelt und aus der Kulturflasche durch Pipettieren entnommen. Die Zellen wurden in 1 mMol EDTA/PBS mit einer Zellzahl von etwa 1 × 10⁷/ml suspendiert und einer Wister Imamich-Rate (7 Wochen alt, weiblich; Animal Breeding Research Laboratory) verabreicht. Es wurde 1 ml Zellen von etwa 1 × 10⁷/ml in die Bauchhöhle der Ratte bei der anfänglichen Immunisierung injiziert und 1 ml Zellen von etwa 1 × 10⁷/ml zusätzlich einen Monat später verabreicht. Darüber hinaus wurden zusätzlich mehrere Male in Abständen von einem Monat 1 ml Zellen von etwa 1 × 10⁷/ml verabreicht, wobei nach dem das Reaktionsvermögen zwischen dem Antikörper der immunisierten Ratte und den CF-1-Zellen erkannt war, 1 ml Zellen von 1 × 10⁸/ml als letzte Immunisierung verabreicht. 3 Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Ratte zur Entnahme der Milz getötet.
3) Zellfusion
Nach der Entnahme der Milz aus der Ratte wurde diese zerkleinert (PBS-ergänzt mit 2% FBS und 0,02% NaN₃) zentrifugiert und in Form von Pellets gewonnen und sodann in 100 Mikroliter der Überstände der Hybridoma-Kultur (etwa 1 × 10⁶/100 Mikroliter) suspendiert und für 1 Stunde bei 4°C umgesetzt. Nachdem sie mit dem vorgenannten Puffer einmal gewaschen wurden, wurde ein FITC-markierter Ziegen-Anti-Ratten-IgG (FC)-Antikörper (Chemicon) zugesetzt und für 1 Stunde inkubiert. Nachdem sie einmal gewaschen wurden, wurden sie mit Hilfe der Zytofluorimetrie analysiert (FACScan, Becton Dickinson).
4) Reinigung der Antikörper
Die in der unter 3) vorstehend beschriebenen Weise gescreenten fusionierten Zellen wurden mit Hilfe einer üblichen Prozedur kultiviert und Antikörper in den Überständen erzeugt und mit Hilfe einer üblichen Prozedur abgetrennt und gereinigt.
Sodann wurden die Hybridome aus den Mulden mit hohen Antikörper-Titern zu den Antigenen gewonnen, in einer Gewebekultur-Kunststoffschale (Corning Co.) ausgestrichen und unter der Bedingung von 5% CO₂ und 37°C kultiviert, vermehrt und mit Hilfe einer üblichen Prozedur gereinigt, um monoklonale Antikörper GSPST-1 und BMAP-1 zu erhalten.
In Bezug auf GSPST-1 wurden die erhaltenen Zellen in die Bauchhöhle einer rasierten Maus (8 Wochen alt, männlich, Nippon Kurea) injiziert. Die erzeugte Ascites wurde nach 10 bis 14 Tagen gewonnen, ausgesalzen mit 33% Ammoniumsulfat und mit PBS dialysiert. In Bezug auf BMAP-1-Antikörper wurde diese in einem großen Maßstab in Iscove's modifizierten MEM-Medium, ergänzt mit 10% FBS kultiviert und die Überstände eingeengt, mit 33% Ammoniumsulfat ausgesalzen, mit PBS dialysiert, wiederum mit Hilfe eines Protein A-Säulenkits (Amersham) gereinigt und mit PBS dialysiert. Im übrigen wurde in dem vorgenannten Beispiel der Fall beschrieben, in welchem die CF-1-Zellen als Antigene zur Immunisierung verwendet wurden, wobei es jedoch möglich ist, einen monoklonalen Antikörper in der gleichen Weise auch im Fall der Verwendung anderer Stromazellen herzustellen, die eine unterstützende Wirkung von hämopoetischen Stammzellen haben, wobei die vorliegende Erfindung nicht auf die vorgenannten monoklonalen Antikörper beschränkt ist, sondern alle monoklonalen Antikörper mit der gleichen Charakteristik und alle die monoklonalen Antikörper erzeugenden Hybridoma einbezogen sind.
Ein Hybridom, das den monoklonalen Antikörper BMAP-1 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erzeugt, ist eine neuartige fusionierte Zelle, hergestellt aus einer Wister Imamich-Ratten-Milzzelle und einer Maus-Myelom-Zelllinie SP2/0-Ag14 als Wirtszellen die am 9. August 1993 unter dem Namen BMAP-1 (Ratte-Maus-Hybridom) mit der Zugriffsnummer FERM-4382 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Japan (Adresse: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japan) der internationalen Hinterlegungsbehörde nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt wurde.
5) Eigenschaften von Antikörpern
(i) Reaktionsvermögen von Antikörpern
Reaktionsvermögen auf CF-1-Zellen
Die Ergebnisse der Untersuchung des Reaktionsvermögens der erhaltenen monoklonalen Antikörper GSPST-1 und BMAP-1 auf CF-1-Zellen mit Hilfe der Immunfluoreszenzanalyse sind in 1 bis 3 gezeigt. 1 zeigt hier die Ergebnisse der Analyse der Kontrolle bei Abwesenheit eines Antikörpers, 2 die Ergebnisse der Analyse der Bindungseigenschaften von GSPST-1 an CF-1-Zellen und 3 die Ergebnisse der Analyse der Bindungseigenschaften von BMAP-1 an CF-1-Zellen. In den Zeichnungen zeigen die vertikalen Achsen relative Zahlen der Zellen und die senkrechten Achsen die Intensität der Fluoreszenz.
Wie aus 1 bis 3 ersichtlich, hat sich erwiesen, dass monoklonale Antikörper GSPST-1 und BMAP-1 über Eigenschaften des Bindens an CF-1-Zellen verfügen und Oberflächenantigene von CF-1-Zellen erkennen.
Reaktionsvermögen auf Knochenmarkzellen
Die Ergebnisse der Analyse des Reaktionsvermögens von GSPST-1 und BMAP-1 auf normale Knochenmarkzellen anhand der Zytofluoremetrie (FACScan, Becton Dickinson) sind in 4 bis 6 gezeigt. 4 zeigt hierin die Ergebnisse der Analyse der Kontrolle bei Abwesenheit eines Antikörpers und 5 die Ergebnisse der Analyse der Bindungseigenschaften von GSPST-1 an Knochenmarkzellen sowie 6 die Ergebnisse der Analyse der Bindungseigenschaften von BMAP-1 an Knochenmarkzellen. In den Zeichnungen zeigen die vertikalen Achsen die relative Zahl der Zellen und die horizontalen Achsen die Intensität der Fluoreszenz.
Wie in 4 bis 6 gezeigt wird, hat sich bestätigt, dass GSPST-1 insgesamt nicht an Knochenmarkzellen bindet und das BMAP-1 die Eigenschaft des Bindens an allen Knochenmarkzellen hat.
Reaktionsvermögen zur granulozytären Leukämie-Zelllinie (NFS-60)
Die Ergebnisse der Analyse des Reaktionsvermögens von GSPST-1 und BMAP-1 auf NFS-60-Zellen (Proc. Natl. Acad. Soc. USA, 82, 6687–6691 (1985)) sind anhand der Zytofluorimetrie (FACScan, Becton Dickinson) in 7 bis 10 gezeigt. 7 zeigt hierin die Ergebnisse der Analyse der Kontrolle bei Abwesenheit eine Antikörpers, 8 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Bindungseigenschaften von GSPST-1 auf NFS-60-Zellen, 9 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Kontrolle unter Verwendung von Ratten IgG1 auf dem Markt (Zymed) und 10 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Bindungseigenschaften von BMAP-1 auf NFS-60-Zellen. In den Zeichnungen zeigen die vertikalen Achsen die relativen Zahlen der Zellen und die horizontalen Achsen die Intensität der Fluoreszenz.
Wie aus 7 bis 10 zu entnehmen ist, hat sich erwiesen, dass GSPST-1 nicht mit NFS-60-Zellen reagiert und dass BMAP-1 die Eigenschaft des Bindens an NFS-60-Zellen hat.
Assay auf BMAP-1 in Bezug auf die Hemmung der Proliferation von NFS-60-Zellen
Die Ergebnisse der Untersuchung der Wirkung von BMAP-1 auf NFS-60-Zellen in Gegenwart von G-CSF 100 ng/ml und Cyclohexylimid 10^–9 Mol mit Hilfe der Methode des MTT-Assays sind in 11 gezeigt. Unter Verwendung von Kulturplatten mit 96 Mulden wurden 10 Mikroliter/Mulde BMAP-1-Lösung mit Konzentrationen von 0, 10, 100 ng/ml und 1, 10, 100 Mikrogramm/ml zu 4 × 10³/Mulde/100 Mikroliter von NFS-60-Zellen gegeben sowie 2 Tage nachdem die Zahl der Lebendzellen mit Hilfe der MTT-Methode gemessen wurde. Wie in 11 gezeigt wird, hat sich erwiesen, dass die Proliferation von NFS-60-Zellen durch BMAP-1 merklich gehemmt wird.
(ii) Typisieren von Antikörpern
Als Nächstes ist als Ergebnis des Typisierens der Unterklasse von IgG der erhaltenen monoklonalen Antikörper (Verwendung eines Ratten-Mono-Ab-ID-.Sp-Kits (Zymed) und eines Biotin-markierten Maus-anti-Ratten-IgG1-Antikörpers (Zymed)) gezeigt, dass GSPST-1 IgG2a ist und dass BMAP-1 IgG1 ist.
(iii) Wirksamkeit zum Hemmen der Knochenmark-Transplantation
Als Nächstes wurde ein Test zur Hemmung der Knochenmark-Transplantion unter Verwendung dieser Antikörper zur Untersuchung ihrer Charakteristik ausgeführt. Die Ergebnisse sind in 12 und 13 gezeigt. Wie in 12 und 13 gezeigt ist, ist, obgleich BMAP-1 über die Wirkung des Hemmens der Knochenmark-Transplantation verfügt, diese Wirkung in GSPST-1 nicht festgestellt worden. Die vorgenannten Ergebnisse wurden durch Verabreichen von 1,0 × 10⁵/Kopf Knochenmarkzellen und monoklonalen Antikörpern an C57BI/6J-Mäusen, bestrahlt mit einer fötalen Stahlungsdosis (99 cGy) durch die Schwanzvenen und durch Zählen der Zahl der Milzkolonien erhalten. Im Übrigen zeigt 13 "nicht behandelt" den Fall ohne Verabreichung von Knochenmarkzellen.
Wie in 13 gezeigt ist, hat sich bestätigt, dass, da BMAP-1 mit Knochenmarkzellen unter Herbeiführung von Apoptose reagiert, der monoklonale Antikörper die Transplantation in dem Test bei Hemmung der Knochenmark-Transplantation vollständig hemmt. Das heißt, wenn ein Hybridom produzierenden BMAP-1 in die Bauchhöhle einer nackten Maus verabreicht wird, diese zu dem Zeitpunkt starb, wenn ihr Ascites in geringer Menge aufgehalten wurde. Darüber hinaus hat sich ergeben, dass alle Knochenmarkzellen durch die intravenöse Verabreichung von 50 Mikrogramm/Kopf BMAP-1 an einer normalen C57BI/6J-Maus abstarben, wobei in 14 eine Mikrophotographie gezeigt wird, die die Tatsache bestätigt, dass Knochenmarkzellen 6 Tage nach intravenöser Verabreichung von BMAP-1 abstarben. Wie aus der Mikrophotographie ersichtlich wird, ist beobachtet worden, dass nicht nur Lymhoidzellen, sondern auch neutrophile Zellen, Megakaryozyten, Myeloblasten, Myelozyten, Mastzellen, Macrophagen, Monozyten und Erythroblasten (sogenannte Myeloidzellen) abstarben. Darüber hinaus ist als Ergebnis der Untersuchung der DNAs der Knochenmarkzellen einer Maus mit verabreichten 30 Mikrogramm/Kopf BMAP-1 offensichtlich eine Leiterbildung beobachtet worden, wie in 15 gezeigt wird, und nachgewiesen worden, dass die vorgenannte Reaktion von BMAP-1 auf Knochenmarkzellen auf Apoptose zurückzuführen ist.
Die FC-Region des IgG des BMAP-1-Antikörpers wurde mit Pepsin (Sigma) abgebaut und mit Hilfe einer GPC-Säule als F(ab^–)2 gereinigt und 33,5 Mikrogramm/Kopf (entsprechend 50 Mikrogramm/Kopf des gesamten IgG) an einer C57BL/6J-Maus intravenös verabreicht und als Ergebnis davon festgestellt, dass Knochenmarkzellen in dem Knochenmark abstarben. Auf Grund der vorgenannten Tatsache ist offensichtlich geworden, dass weder Antikörperabhängige Zellzytotoxizität noch Komplement-abhängige Zell-Zytotoxizität an dem Zelltod von Knochenmarkzellen durch BMAP-1 teilnehmen.
Als ein Antigen, das Apoptose hervorruft, ist das Fas-Antigen von Zelloberflächenprotein veröffentlicht worden und im Zusammenhang mit dem Fas-Antigen sind Expressionen von mRNA's von diesen in dem Thymus erkannt worden, Herz, Leber, Lungen und Ovarien, wobei jedoch nur weniger mRNA's von diesem im Knochenmark nachgewiesen wurden (J. Immunol., 148, 1274–1279 (1992)), womit offensichtlich wird, dass Antigene, die von BMAP-1 erkannt werden, von dem konventionellen bekannten Fas-Antigen verschieden sind.
Um darüber hinaus klarzustellen, ob ein von BMAP-1 erkanntes Antigen ein TNF-Rezeptor sein würde oder nicht, wurde die Funktion von BMAP-1 unter Verwendung von L-929-Zellen untersucht, die mit TNF unter Herbeiführung von Zelltod reagieren. Die Endkonzentrationen eines Maus-TNFalpha (Genzyme) betrugen 0, 1, 10, 100 pg/ml, 1, 10, 100 ng/ml und 1 Mikrogramm/ml, während diejenigen von BMAP-1 0, 10, 100 pg/ml, 1, 10, 100 ng/ml und 1, 10 Mikrogramm/ml betrugen, und die Zahl der Lebendzellen von L-929-Zellen wurden mit Hilfe der MTT-Methode am zweiten Tag nach der Zugabe des TNFalpha und des BMAP-1 gemessen. Wie in 16 und 17 gezeigt wird, hatte, während L-929-Zellen durch TNFalpha deutlich vermindert wurden, als Ergebnis davon BMAP-1 keinen Einfluss auf L-929-Zellen. Damit ist offensichtlich geworden, dass ein von BMAP-1 erkanntes Antigen kein TNF-Rezeptor ist.
Die Ergebnisse der Untersuchung mit Hilfe der Zytofluorometrie (FACScan, Becton Dickinson), ob von BMAP-1 erkannte Antigene Antigene der MHC-Klasse I sein würden oder nicht, sind in 18 bis 21 gezeigt. 18 zeigt hier die Ergebnisse der Analyse der Kontrolle unter Verwendung von Ratten-IgG1 (Zymed), 19 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Bindungsei genschaften des Antimaus-MHC-Klasse I-Antikörpers (Ratten-IgG2a, BMA) auf BWV1-Zellen (Maus-Lymphom, abgenommen von BW5147-Zellen), 20 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Kontrolle unter Verwendung von Ratten-IgG1 (Zymed) und 21 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Bindungseigenschaften von BMAP-1 an BWV1-Zellen. In den Zeichnungen zeigen die vertikalen Achsen die relativen Zahlen der Zellen und die horizontalen Achsen die Intensität der Fluoreszenz. Als Ergebnis erkannte BMAP-1 keine BWV!-Zellen, jedoch reagierte der MHC-Klasse I-Antikörper mit BWV1-Zellen.
Wie vorstehend beschrieben wurde, ist experimentell bestätigt worden, dass BMAP-1 über die Funktion der Herbeiführung von Apoptose von Myeloidzellen verfügt, und nach Kenntnis der Erfinder der vorliegenden Erfindung ist bisher kein monoklonaler Antikörper veröffentlicht worden, der über die Eigenschaft verfügt, Apoptose von Myeloidzellen herbeizuführen, weshalb monoklonale Antikörper, die über eine solche Funktion verfügen, neuartig sind. Da davon ausgegangen wird, dass die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, die durch BMAP-1 repräsentiert sind, den Tod granulozytärer Leukämiezellen bewirken können, deren Expression von Antigenen als stark angesehen wird, und zwar durch Nutzung der Funktion der Apoptose des monoklonalen Antikörpers auf Knochenmarkzellen, ist der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung als Medikament für granulozytäre Leukämie verwendbar.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind speziell in Bezug auf das vorstehende Beispiel beschrieben worden. Die monoklonalen Antikörper, die über die Eigenschaft verfügen, Apoptose von Myeloidzellen gemäß der vorliegenden Erfindung hervorzurufen, lassen sich durch solche exemplifizieren, wie sie als spezielle Beispiele vorstehend erwähnt wurden, die jedoch nicht darauf beschränkt sind und alle monoklonalen Antikörper einbezogen sein können, die die gleiche Charakteristik und Funktion haben, die in der gleichen Weise hergestellt wurden, wie hierin vorstehend beschrieben wurde, und zwar unabhängig von der Art der zur Immunisierung verwendeten Antigene.

Claims

Monoklonaler Antikörper mit der Eigenschaft, Apoptose von Knochenmarkzellen hervorzurufen, und der erhalten werden kann, indem als Antigene zur Immunisierung stromale Milzzellen verwendet werden, die von einem Tier abgenommen werden, dem rG-CSF verabreicht wurde, wobei der monoklonale Antikörper ein Antigen erkennt, das durch stromale Milzzellen eines Tieres exprimiert wird, welches Antigen ebenfalls durch einen monoklonalen Antikörper BMAP-1 erkannt wird, der von dem Hybridom FERM BP-4382 erhalten werden kann.
F(ab)₂-Fragmente eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1, wobei die Fragmente die Eigenschaft haben, Apoptose von Knochenmarkzellen hervorzurufen.
Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 erzeugt.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der hergestellt wird, indem als Antigene zur Immunisierung stromale Milzzellen des Menschen verwendet werden.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der hergestellt wird, indem als Antigene zur Immunisierung stromale Milzzellen des Menschen verwendet werden, die mit SV-40-Adenovirus-Vektor transformiert sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 4 und einen pharmazeutisch zulässigen Träger.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der BMAP-1 ist und der von dem Hybridom FERM BP-4382 erhalten werden kann.
Hybridom nach Anspruch 3, das FERM BP-4382 ist.