TW426687B - A monoclonal antibodies to cause apoptosis on myeloid cells - Google Patents

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A7 42668 7 4 _ _B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關具有對骨髓樣細胞可誘發細胞自滅之特 性，做爲骨髓性白血病之治療藥極有用之新穎單株抗體及 其片段，以及可產生該單株抗體之融合瘤者。 以往，顆粒細胞集落刺激因子，例如基因重組型顆粒 細胞集落刺激因子（r G_ C S F )係主要做爲促進粒性 系細胞之分化，增殖之液性因子，此乃爲人所知者，惟在 小鼠之體內實驗中，已有報告指出，投予此r G_ C S F 時|不但會使骨髓造血亢進，在脾臟亦會引起骨髓外造血 ，在脾臟中會增殖以造血幹細胞爲主之全部造血先質細胞 。此脾臟中之骨髓外造血機作係被推測可能係因r G -C S F之刺激而使脾臓之造血微小環境起變化，因造血支 持活性亢進而產生造血所致。 在此，本發明人係爲探討此脾臟之造血功能，著眼於 連續投予r G_ C S F後之脾臟間質細胞，試以解析介著 間質細胞時r G — C S F所引起之造血功能亢進，自連續 投予r G_ C S F之小鼠脾臟確立造血間質細胞（C F — 1細胞），使用該造血間質細胞探討該造血支持活性，結 果確認試管中之集落刺激活性及在活體內之造血幹細胞支 持活性〔Blood ，8 0，1 9 1 4 ( 1 9 9 2 )〕。 惟此脾臟間質細胞雖有一部份以細胞株（C F — 1細 胞）已被確立，並已被檢討其細胞學上特性，但卻未被製 作出可識別該細胞表面抗原之特定抗體，當然其特性亦完 全未爲人所知。 爲此本發明人係根據如上述有關脾臟間質細胞上之發 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) "- 訂 經濟部中央梯隼局貝工消費合作社印裝 42668 7· A7 _B7_^_ 五、發明説明（2 ) 現與研究成果•以開發可識別此脾臟間質細胞的特定抗體 爲目標，再三深入研究，使用該脾臟間質細胞株做爲敏化 抗原，以製作單株抗體，結果獲得已往無前例之新穎單株 抗體》 對此所獲得之單株抗體之特性進行檢討之結果，很驚 奇地發現該單株抗體係具有可在骨髓樣細胞誘發細胞自滅 之特性者，遂而完成本發明* 本發明係以提供對於骨髓樣細胞具有可誘發細胞自滅 之特性，做爲骨髓性白血病之治療藥等極有用之新穎單株 抗體及其片段爲目的，並以提供可產生該軍株抗體之融合 瘤（h y b r i d 〇 m a )爲目的者。 經濟部中央樣準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之單株抗體係做爲可特異性地識別能引起骨髓 樣細胞（Myeloid cell)細胞自滅（apoptosis )〔該染 色質DNA會以染色質單體之單位被切斷（所謂梯子形成 )，結果致死細胞之現象，稱爲細胞自滅〕之抗原等的抗 體，具有可識別、鑑定此等抗原之功能者，或做爲具有可 在骨髓樣細胞中誘發細胞自滅之功能者極爲有用者。又> 骨髓樣細胞中係包含淋巴細胞以外之細胞，例如嗜中性白 血球、巨核細胞、骨髓胚細胞、骨髓細胞、肥大細胞、巨 噬細胞，單核細胞，母紅血球，本發明中所稱骨髓樣細胞 亦指與此等同意義者。以往具有對骨髓樣細胞可誘發細胞 自滅之特性者完全未被人所知，因此本發明之單株抗體係 可定義爲包括在骨髓樣細胞中具有可誘發細胞自滅之特性 的全部單株抗體在內。 本紙涑尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210 X 297公釐） -5 - 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 4266B7 , A7 B7五、發明説明（3 ) 該本發明之單株抗體係基本上可依以下方法製造。 即*本發明之單株抗體係例如使用投予r G — C S F 之動物脾臟間質細胞做爲敏化抗原*基本上應用一般之免 疫法使其免疫*應用一般細胞融合法予以細胞融合，應用 —般之選殖化法予以純種化即可以製作。 更具體言，製作本發明單株抗體的方法可以採用例如 使用經由本發明人等做爲培養細胞株所確立之投予r G — CSF之小鼠脾臟間質細胞之CF-1細胞〔Blood, Vo 1 .80，1914 (1992)〕，融合經該敏化抗 原免疫之晡乳動物的漿細胞（免疫細胞）與小鼠等晡乳動 物之骨髓細胞癣細胞，純種化所得融合細胞（融合瘤）， 自其中選別可以產生識別上述細胞株之本發明抗體，培養 該純種系後，回收目的之抗體的方法。惟本發明中該方法 僅爲其中之一例而已，例如這時做爲上述敏化抗原並不限 定爲使用上述C F - 1細胞而已，可以適當地使用依據該 C F - 1細胞所得之來自人脾臟間質細胞之細胞株，與上 述C F _ 1細胞時一樣，即可製作爲目的之結合於人類骨 髓樣細胞之單株抗體。 製作如上述之單株抗體的方法中，被上述敏化抗原所 免疫之哺乳動物並不特別限定，惟最好考慮適合於細胞融 合所使用之骨髓細胞瘤細胞等，通常較適於使用者有小鼠 ，老鼠，蒼鼠等。 其次*免疫則可以藉由一般方法，例如藉由腹腔內注 射等將上述C F - 1細胞等脾臟間質細胞投予晡乳動物進 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（2Ι0ΧΜ7公釐） ~ -〇 " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ." 訂

V 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 42668 7 ^ A7 B7 五、發明説明（4 ) 行。更具體言可以將以P B S或生理食鹽水等稀釋，懸濁 爲適量者每個月投數次予動物爲宜。免疫細胞以使用最後 一次投予上述細胞後所摘出之脾細胞爲宜。 其次|與上述免疫細胞所融合之另一母細胞的哺乳動 物骨髓細胞瘤細胞，較適宜者可使用已公知之各種細胞株 ，例如 P3(P3X63Ag8· 6 5 3 ) ( J. Immunol., 123-1548(1978)] 'P3-U 1 〔 Current Topics in Micro-biology and

Immunology >81 · 1—7 (1978) ] 'NS—1 C Eur. J. Immunol" 6 *511 — 519 (1976)〕 、MPC—11 〔Cell, 8， 405—415(1976 )〕、Sp2/0—Agl4〔 Nature， 2 7 6 ， 2 6 9 一 270 (1978)〕、F0〔J. I m m u η o 1 M e t h ， 35 ， 1-21 (1980) 〕、S194〔J. Exp. Med.，148，313 -323(1978)〕、及 R 2 1 0 〔 Nature， 277， 131—133 (1979 )〕等》 基本上言，上述免疫細胞與骨髓細胞瘤細胞之細胞融 合可以採用一般之方法，例如milstein等之方法〔 M e t h 〇 d s E n z y m ο 1 ，73，3 — 46 (1981)〕等施 行β 更具體言，上述細胞融合以例如在融合促進劑存在下 於一般之營養培養基中實施。融合促進劑可使用例如聚乙 二醇（PEG)，仙台病毒（HVJ)等，更可視其所需 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 7 C請先聞讀背面之注意事項再填寫本貫) -4

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 d2B68 7 # A7 B7 五、發明説明（5 ) 爲提?高融合效果適當地添加使用二甲亞碘（dimethyl sulfoxide )等補助劑。免疫細胞與骨髓細胞瘤細胞之使 用比率係例如對骨髓細胞瘤細胞而言，使用1〜1 〇倍左 右之免疫細胞爲宜。上述細胞融合使用之培養基可以使用 例如適於增殖上述骨髓細胞瘤細胞之R PM I — 1 6 4 0 培養基，MEM培養基*其他，如通常使用於此種細胞培 養之一般培養基，更可以併用牛胎兒血清（F B S )等血 清輔助液。 細胞融合係逋常在上述培養基內充分地混合所定量之 上述免疫細胞與骨髓細胞瘤細胞，在培養基中以約3 0〜 6 0% (W/V)濃度添加混合預先被加溫爲3 7 °C左右 之PEG溶液，例如平均分子量1000〜6000左右 之P E G，以進行細胞融合。繼而逐次添加適當之培養基 ，經離心分離除去上澄液，返覆操作，以形成目的之融合 瘤。 該融合瘤可以在一般之選擇性培養基，例如在HAT 培養基（含次黃嘌呤，胺基蝶呤及胸腺核Μ之培養基）培 養即可以被選擇出。該HA Τ培養基中之培養係被持續至 目的之融合瘤以外細胞（未融合細胞）死滅爲止所需之足 夠時間，通常繼續數日〜數週。繼而依一般之極限稀釋法 篩選可產生目的抗體之融合瘤及單一株化。 如上述所製作可產生本發明單株抗體之融合瘤係可在 一般之培養基中繼代培養者，又，可以在液態氮中長期保 存者。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 。 -〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -\a Τ 經濟部中央標準局男工消費合作社印製 426637 , A7 ___B7 五、發明説明（6 ) 自該融合瘤採取本發明單株抗體時可採用依常法培養 該融合瘤，自其培養上澄液取得之方法*或將融合瘤投予 適合於其之哺乳動物予以增殖，自其腹水取得之方法等， 可採用其中較適當之方法。前者方法係適於獲得高純度抗 體之方法，後者之方法係適於大量生產抗體之方法。 另外，依上述方法所得抗體可以應用鹽析法*凝膠過 濾法，親和色譜法等一般之精製手段，精製爲髙純度者。 本發明之單株抗體係只要爲具有後述實施例中具體表 示之固有特性，即只要具有對骨髓樣細胞可誘發細胞自滅 之功能者任何均可，只要具有該功能者即不論爲何種敏化 抗原均包含於本發明範圍，本發明之單株抗體係利用該特 性，可在治療骨髓性白血病等領域做爲有用之治療藥劑使 用者。 利用如上述之本發明單株抗體做爲可以特異性地識別 對骨髓樣細胞可誘發細胞自滅抗原的抗體，識別、鑑定此 等時，或利用該單株抗體之固有特性做爲骨髓性白血病治 療劑等使用時之具體系統之建立，其改變及應用等，係只 要爲應用斯業者自明之一般方法所實施者*在此均包含於 本發明範圍者8 圖面之簡單說明 第1闺係表示以免疫螢光分析（抗體不存在下之對照 C F — 1細胞）圖。 第2圖係經由免疫螢光分析之G S P S T - 1抗體與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS M4規格（210X297公釐）n 一 y - ---------β------tr------^ {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 426687( A7 B7 五、發明説明（7 ) CF — 1細胞之結合性圖。 第3圖係經由免疫螢光分析之BMAP—1抗體與 C F — 1細胞之結合性圖。 第4圓係藉由免疫螢光分析（抗體不存在下之對照骨 髓細胞）圖* 第5圖係藉由免疫螢光分析之G S P S T_ 1抗體與 骨髓細胞之結合性圖。 第6圖係藉由免疫螢光分析之BMAP—1抗體與骨 髓細胞結合性圖· 第7圖係藉由免疫螢光分析（抗體不存在下之對照） 圖。 第8圖係藉由免疫螢光分析之G S P S T— 1抗體與 NF S — 6 0細胞之結合性圖。 第9圖係藉由免疫螢光分析（以老鼠IgG1爲對照 )圖。 第1 0圄係藉由免疫螢光分析之BMAP — 1與 NFS — 60細胞之結合性圖。 第1 1圖係表示本發明單株抗體之細胞增殖抑制試驗 (B M A P - 1 )圖。 第1 2圖係表示本發明單株抗體之骨髓移植抑制試驗 (GSPST-1)圊。 第1 3圖係表示本發明單株抗體之骨髓移植抑制試驗 (B M A P - 1 )圖。 第1 4圖係說明投予本發明之單株抗體BMAP — 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -ιυ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 4 266 8 7 λ Α7 Β7 五、發明説明（8 ) 後第6天死滅之骨髓細胞（2)，抗體不存在下之對照（ 1 )圖〔以骨髓標本（生物之形態）之顯微鏡照片（H.E. 染色）（x4 00)表示〕。 第1 5圖係說明投予本發明之單株抗體BMAP — 1 時可看到之骨髓細胞D NA形成梯形之圖（電泳層析之照 片）。 第1 6圖係表示以TNF進行之細胞損傷試驗。

第1 7圖係表示單株抗體之細胞損傷試驗（BMAP -1 ) β 第1 8圖係表示藉由免疫螢光分析（老鼠I gG 2 a 爲對照）圖。 第19圖係藉由免疫螢光分析抗小鼠MHCcl ass I 抗體與BWV1細胞之結合性圖。 第2 0圖係以免疫螢光分析法分析圖（老鼠I gG 1 爲對照）。 第2 1圖係以免疫螢光分析BMAP — 1與BWV 1 細胞之結合性圖。 第2 2圖係顯示因F a b化BMAP — 1抗體所致骨 髓自滅誘發作用之說明圖。 圖中各符號表示 a :投予B M A P - 1之小鼠胸腺D N A ( 2 4小時 ) b :投予BMAP - 1之小鼠骨髓DNA (24小時 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210 X 297公釐）_ 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) '尊 、v9 4 2 668 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 A7 B? 五、發明説明（9 ) c:投予BMAP—1之小鼠骨髓DNA(8小時） d :投予BMAP — 1之小鼠骨髓DNA (4小時） e :未處理小鼠之骨髓DNA (骨髓細胞） f :分子量標識 . 以下根據參考例及實施例更具體說明本發明，惟本發 明並不受該等實施例所限制》 參考例，確立脾臟間質細胞株及其性質 (1 )確立脾臟間質細胞株 自投予 5 天 100iUg/kg rG — CSF 之 C 5 7 B L/6 J小鼠脾臟細胞的初代培養確立連續投予 rG — CSF之脾臟間質細胞》βΡ，投予rG — CSF後 於無菌條件下取出脾臟，以2 5 crrf塑膠燒瓶（Corning 公司製）培養6週，在37°C，5% C〇2恒溫箱中， 以添加有10%經熱鈍化之血清（FBS)(三光純藥公 司製，東京），：LOOU/mj?青黴素及 lOOjag/ mj?鏈撇素之Iscove改性Dulbecco培養基（I MDM )(Boehringer-Mannheim公司製）培養’每週換新一次 培養基。 使用0. 05%胰蛋白酶+0· 〇2%EDTA(

Sigma chemical 公司製），C a — Mg — free P B S 自 生育密集之培養基中分取附著性之細胞集落（間質細胞） 移至另一燒瓶中。每週約返覆1〜2次此繼代培養。初期 之繼代培養（第1〜1 0次）的細胞分裂率係1/4〜 1/8，其後比率係1/16〜1/32。大約第10次 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 12 - f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 426687 ‘ A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（10) 繼代培養後間質細胞已顯示成爲均質之擬纖維母細胞。依 上述方法在第2 0次繼代培養時採收間質細胞’使用極限 稀釋法重覆二次細胞篩選操作’確立爲間質細胞株（C F —1細胞株）。 繼而在添加1 0%熱鈍化FBS之5mJ? IMDM 的2 5 cirf燒瓶（康寧公司製）內維持培養此等細胞，每 隔5天以分裂率1/3 2繼代培養。另外，其他哺乳動物 亦可以確立出脾臟間質細胞株，例如人類時，可以用SV - 4 0腺病毒轉形細胞，即可以與上述一樣之方法確立人 脾臟間質細胞株〔J. Cell. Physiol., 1 4 8-2 4 5 (19 9 1)〕。 (2) CF - 1細胞之特性： 如上述做爲細胞株被確立之C F - 1細胞可以使用檩 準之細胞化學上手法測出鹼性磷酸酶，酸性磷酸酯，ys — 尿甘酸酶，α -乙酸某酚酯酶，及使用以下單株抗體及多 株抗體，藉由免疫酶組織化學測試檢討其特性：M a c I (Sero Tec·公司製）*第關連抗原（Dakopatts公司 製），I型膠原，m型膠原及纖維網蛋白（Chemi con International公司製），吞噬作用係使用膠乳珠粒（粒 徑1· 09从111，512瓜&公司製），又，分化爲脂肪細胞 之活性係以2 5 cm燒瓶培養至密集程度後，添加1 莫爾/公升之磷酸氫基可體松（Sigma公司製）培養4週 後予以檢討》 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 4 2 6 6 8 7 j A7 B7 五、發明説明（11 ) 結果獲知C F - 1細胞係對鹸性磷酸酶，第VE因子相 關抗原，Ma c I及吞噬作用爲陰性，惟對I型膠原，m 型膠原及纖維網蛋白係陽性。CF- 1細胞係含些微脂質 者，惟在1 Ο-0莫爾/公升之氫基可體松存在下培養4週 至大約密集時亦不會分化爲脂肪細胞。由此等數據獲知 C F - 1細胞係不具備上述脂肪細胞，巨噬細胞及血管內 皮細胞之特徵，所以可知來自與此等不同之間質細胞者》 (3)藉由CF—1細胞保持造血幹細胞 爲探討藉由C F - 1細胞是否可保持造血幹細胞，以 Till & Me Culloch之方法進行C F U_ S分析（脾集落 形成法）。即，照射900cGY(MBR-1520R ，Hitachi公司製，東京）於1 0隻1群之小鼠後，靜脈 注射骨髓單核細胞（BM細胞）（1. 〇xl〇5/隻， 5· 0Χ104/隻或2. 5Χ104/隻）及CF-1 細胞（1. 0Χ105/隻），計算第12天在脾臟內之 集落數做爲CFU_S (脾臟集落）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 結果同時移植骨髓單核細胞（BM細胞）與CF — 1 細胞於照射放射線之小鼠時，各BM細胞群均可以在脾臟 集落數上較不移植C F - 1細胞之小鼠有顯著增加（ 1 . 4〜1· 8倍），又，同時移植BM細胞與CF — 1 細胞之小鼠係移植後第12天之生存率亦較只單獨移植 BM細胞之小鼠更高，降低死亡率，由此可知造血幹細胞 確實可藉由C F- 1細胞被保持。 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS)A4规格UlOXW公釐）_ Μ _ 4 2668 7 _ A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、 發明説明（ 12) 1 1 實 施 例 1 1 1 製 作 單 株 抗 體 1 請' 1 1 ( 1 ) 敏 化抗 原 與 免疫 法 先 閱 1 1 使 用 上 述 參 考 例 所 得之 C F — 1 細 胞 做爲 敏 化抗 原 以 背 1 1 I 進 行 抗 原 之 敏 化 0 細 胞 株係 使 用1 0 % 牛 胎兒 血 清（ 之 注 意 1 1 I F B S 三 光 純 薬 公 司 製） Iscove 改 質 之 Du 1 bcco 培 養 事 項 再 1 1 基 ( I Μ D Μ ) ( Boeh ringer -Mannh e i m 公司 製 )做 爲 培 填 寫 本 養 基 » 於 5 % C 0 2 恆 溫箱 中 ，3 7 °c 溫 度條 件 下繼 代 培 頁 •S--· 1 1 養 〇 1 1 細 胞 係 經 1 m Μ Ε D T A ，P B s 處 理後 自培養燒 1 | 瓶 中 輕輕 地 吸 移 回 收 β 以約 1 x 1 0 7 個 / m 9. 之細 胞 數 訂 I 懸 網 濁 此 細 胞 於 1 m Μ Ε D T A 。P B s 中 使其浮 游， 免 疫 1 1 I W i a 士 SL 1* I m & m i C Η 系 老 鼠（ 7 週齡 * 雌 動物 繁殖研 究所 1 1 ) ο 初 次 免 疫 係 注射 1 m it 之 約1 X 1 0 7個 / m 細 胞 1 1 於 老 鼠 腹 腔 內 經 1 個 月後再追加 免疫 1 m H 之 約1 X 一Κ 1 1 0 7 個 / m il 細 胞 0 再每 隔 一個 月 以 1 m ί ] X ] ( )7 1 1 個 / m 細 胞追 加 數 次 免疫 > 確認 所免疫老鼠 抗 體與 C F 1 I — 1 細 胞 之 反 atf 應 性後 » 最後 再 以1 m lx 1 0 8 個 / I | m n 細 胞 予 以 最 後 免 疫 。最 後 免疫後第 3 天屠 殺 老鼠 取 出 \ 1 脾 臟 0 1 1 1 ( 2 ) 細 胞 融 合 1 1 1 細 切 白 1 隻 老 鼠取 出之 脾 臟後 * 離 心 沈澱游 離之 脾 細 1 1 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS >A4規格（210X297公釐〉—^

經濟部中央標準局貝工消費合作社印IL d 2 66 8 ί , A7 _____B7___ 五、發明説明（13 ) 胞1懸濁於I M D Μ培養基（Boehringer-Mannheim公司 製）中，使其浮游，充分地洗淨•另外，在含有1 〇%牛 胎兒血清（FB S，三光純薬公司製）之I MDM培養基 (Boehringer-Mannheim公司製）中培養小鼠骨髓細胞瘤 細胞株 Sp2/0 — Agl4〔Nature，276，269 —270(1978)〕，所得細胞亦以如上述IMDM 培養基洗淨後，將1 x 1 08個該細胞與2X 1 08個上 述脾細胞放入離心管徑混合，依常法（Clin. Exp. Immunol. , 42，458-462 (1980)〕以聚乙 二醇4000(半井化學公司製）進行細胞融合。 繼而在含有2 0%F B S之1 MDM培養基中分別於 9 6孔培養盤中注入所得融合細胞，於5 % C02恆溫箱 3 7 °C下培養，自第二天起慢慢地以HAT選擇培養基取 代繼續培養。 開始培養後每週二次分別以新之H A T培養基替代上 澄液，繼續培養保持其增殖。 其次依常法使用極限稀釋法篩選如上述所得融合細胞 。即，利用培養上述融合細胞之上澄液中抗體，調査其與 敏化抗原之結合性，依常法使用極限稀釋法僅篩選出對敏 化抗原具高結合性者。 (3 )篩選 使用流動細胞測儀（Flow cytometry)，依間接營光 抗體法篩選融合細胞（融合瘤）* 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）， ---------f------ίτ------> (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 42668 7 , A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（14) 篩選可產生目的抗體之純種系時係使用c F- 1細胞 做爲靶細胞。即，離心懸濁於反應緩衝液〔含2%F B S ，〇. 〇2%NaN3之PBS〕之細胞，以吸移管回收 後，使其浮游於1 〇 〇 α又融合細胞培養上澄液中（約1 父106個/100#芡），於4eC反應1小時*藉由上 述緩衝液洗淨一次後，加入F I TC檫識羊抗鼠I gG ( F G )抗體（Chemicon公司製）培養1小時。洗淨一次後 ，以流動細胞測儀（F A C S can, Bee ton D i ck i nson 公 司製）》 (4 )精製抗體 依常法培養上述（3 )所篩選融合細胞，依常法分離 ，精製培養上澄液中所產生之抗體。 即，自各培養孔中採收對上述敏化抗原具有髙抗體力 價之融合瘤，展開於組織培養塑膠盤（康寧公司製），於 5 % C 0 2 ，37 °C下繼代培養基，經增殖，依常法精製 ，得單株抗體 GSPST—l ，BMAP-1。 G S P S T - 1係將所得細胞經腹腔注入於十八碳烷 投予過之BALB/cAJ c 1— nu系裸鼠（8週齡， 雄，日本Kurea公司製），1〇〜14天後採取所產生之 腹水，以3 3%硫酸銨鹽析，藉由PBS渗析。又， BMA P - 1抗體則在含有1 〇%F B S之Iscove modified MEM培養基中大量培養，濃縮培養上澄液後，以 3 3%硫酸銨鹽析，以PBS滲析後，藉由蛋白質A層柱 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 426687 經濟部中央標率局員工消費合作社印装 A7 B7 五、發明説明（15 ) 組套（Amasham公司製）再次精製，藉由P B S進行透析 。另外，上述實施例中係做爲敏化抗原使用C F — 1細胞 時爲例表示，但使用其他具有造血幹細胞支持活性之間質 細胞亦可以同樣製作單株抗體，本發明係不限定包含於上 述單株抗體，亦包含與其具有同樣特性之全部單株抗體， 以及可產生該單株抗體之全部融合瘤者。 產生本發明單株抗體BMAP—1之融合瘤係以 Wistar Imamich系老鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞株S p 2 /0- Ag 1 4爲母細胞所製作之新穎融合細胞，依據布 達佩斯特條約寄存於國際上被承認之專利案微生物之國際 寄存機關之日本工業技術院生命工學工業技術研究所（ 1993年8月9日寄存），寄存號碼FERM B P -4382，命名爲BMAP - 1 (老鼠，小鼠融合瘤）。 台灣食品工業發展研究所（1 9 9 4年1 1月1 8日寄存 )，寄存號碼CCRC 960012。 (5 )抗體之性質 ①抗體之反應性 (對CF — 1細胞之反應性） 以免疫營光分析（I m m u η 〇 f 1 u 〇 r e s c e n c e a n a 1 y s i s ) 檢討如上述所得單株抗體GSPST-l，BMAP— 1 對於C F - 1細胞之反應性，結果示於第1圖〜第3圖。 在此第1圖係表示抗體不存在下之對照’第2圖係表示 GSPST - 1與CF — 1細胞之結合性，第3圖係表示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 18 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -*§ Γ 4 2668 7 . 經濟部中央標率局貝工消費合作杜印製 A7 B7_.—_五、發明説明（I6 ) BMAP-1與CF-1細胞之結合性的解析結果。又， 圖中縱座標係表示相對細胞數，橫座標係表示螢光強度。 由第1圖〜第3圖可知，單株抗體G S P ST— 1， BMAP - 1係對CF— 1細胞有結合性，可識別CF — 1細胞之表面抗原者。 (對骨髓細胞之反應性） 其次以流動細胞測儀（FAC Scan， Becton. Deckinson 公司製）檢討 GSPST-l ，BMAP-1 對正常骨髓細胞之反應性，結果示於第4圖〜第6圖。在 此圖4係表示抗體不存在下之對照，第5圖係表示 G SP ST - 1與骨髓細胞之結合性，第6圖係表示 BMA P — 1與骨髓細胞之結合性的分析結果》又，圖中 縱座標係表示相對細胞數，橫座標係表示螢光強度》 如第4圖〜第6圖表示，GSPST—1係完全不會 結合骨髓細胞，而BMAP — 1係可與全部之骨髓細胞結 合者。 (對骨髓性白血病細胞株（NF S-6 0 )之反應性） 藉由流動細胞測儀（F ACS can, Becton Deckinson 公司製）檢討 G S P S T - 1 及 BMA P — 1 對於 NF S — 6 0 細胞〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 82’6687-6691(1985)之反應性，結果 示於第7圊〜第10圖。在此第7圖係表示抗體不存在下 之對照，第8圖係表示GSP ST - 1與NF S — 6 0細 胞之結合性，第9圖係表示使用市販老鼠IgGl( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格{ 2!〇X297公釐）_ ^ _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) " 訂 4 4 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 4 2668 7 A7 B7 五、發明説明（17)

Zymed公司製）之對照，第1 0圖係表示BMAP與 NFS — 60細胞之結合性分析結果。又，圖中縱座標係 表示相對細胞數，橫座標係表示螢光強度》 如第7圖〜第10圊所示，獲知GSPST—1係不 與 NFS-60細胞反應·BMAP—1係會與NFS 一 6 0細胞結合。 (BMAP- 1對於NF S — 6 0細胞的抑制細胞增殖試 驗） 在 lOOmg/mJ? G-CSF 及 1〇-θΜ 環己隳胺 存在下，藉由ΜΤΤ分析法檢討BMAP — 1對NF S-60細胞之作用，結果示於第1 1圖。使用96孔之培養 盤，對4Χ103 /孔/100以又之NFS-60細胞 而言，BMAP—1 係以 0 ，10 ，10〇ng/m 芡’ 1 ，10 ，100只g/mj?濃度分別添加1〇紅5 /孔 ，二天後依MTT法測定活細胞數》結果如第11圖所示 ，藉由BMAP — 1可顯著抑制NF S - 6 0細胞增殖。 ②驗明抗體類型 其次，驗明單株抗體之I gG亞種之類型〔使用老鼠 Mono Ab-ID-Sp組套（Zymed公司製），以及生物素檩識 老鼠I g G 1抗體（Zymed公司製）〕，結果獲知 GSPST-1 係 IgG2a，BMAP — 1 係 igGl 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 2〇 - (請先聞讀背面之注-^項再填寫本頁) 尊

*1T 4 266 8 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（) ③骨髓移植抑制作用 其次，使用此等抗體進行骨傾移植抑制試驗，檢討其 特性，結果示於第1 2圖〜第1 3阖*由第1 2圖〜第 1 3圖可知，BMAP — 1係具有骨髓移植抑制作用，但 GSPST— 1卻未見其效果。即，對於故射線照射（ 900cGy)致死量之C57BL/6J小鼠，自尾靜 脈投予每隻 1.0X 1 55的骨髓細胞及單株抗體，觀察 脾臟集落之形成，得到如上述結果。又|第1 3圖之未予 處理係表示完全未投予如上述者。 第1 3圖所示，在骨髓移植抑制試驗中，BMAP — 1可以完全抑制移植係因爲此單株抗體被確認可以與骨髓 細胞反應引起細胞自滅所致。即，將BMAP — 1產生之 融合瘤投予裸鼠之腹腔內時，腹水開始稍貯蓄時期裸鼠即 死亡。又，對正常之C57BL/6J小鼠，每隻以50 /Z BMAP - 1靜脈內投予時則全部骨髓細胞均死滅，第 1 4圓所示顯微鏡照片可證實靜脈內投予BMAP — 1後 第6天骨髓細胞均死滅者。由此顯微鏡照片可知，不只淋 巴細胞，亦確認嗜中性白血球、巨核細胞、骨髓胚細胞、 骨髓細胞、肥滿細胞、巨噬細胞、單核細胞、母紅血球等 (所謂骨髓樣細胞）均已死滅。又，檢討每隻投予3 0 之BMAP — 1的小鼠骨髓細胞DNA，結果確認 BMA P - 1對骨髓細胞之上述反應係因細胞自滅所引起 者。 另外，針對BMAP — 1抗體，藉由胃蛋白酶（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐> _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) "· 訂 42668 A7 B7 五、發明説明（19 )

Sigma公司製）切斷其I gG之Fc區，F (ab 一）2 以GPC柱層精製後，對每隻C5 7BL/6 J鼠靜脈內 投與33. 5iig (相當於每隻完全I gG 50#g之 量），結果在骨髓中可看出骨髓細胞死滅。由此可知 BMA P - 1所引起之骨髓細胞死滅係無關於抗體依賴性 細胞損傷及補體依賴性細胞損傷者》 至於可引起細胞自滅之抗原，雖然已經有報告提到有 細胞表面蛋白質之F a s抗原，惟此F a s抗原係已確認 在胸腺、心臟、肝臟、肺、卵巢等有mRNA之表現’但 因爲在骨髓中幾乎檢査不出有該mRNA〔J. Immunol., 148，1274-1279(1992)〕，所以 BMAP — 1可識別之抗原與以往所知之F a s抗原完全 不同〇 經濟部中央標率局員工消費合作社印粟 (請先閱讀背面之注^項再填寫本頁) 另外，爲探知BMAP_ 1可識別之抗原是否爲 T N T受體（receptor )，使用可與TNT反應，會引起 細胞死滅之L — 9 2 9細胞，檢討BMAP — 1之作用》 小鼠T N F a ( Genzyme公司製）之最後濃度係爲〇 * 11，10，100pg/mJ2，1，10，lOOng ，liUg/mJ? ，BMAP — 1之最後濃度係爲0 > 10 * 100pg/mi? · 1 » 10 » 10〇ng/ mJ? ， 1 ， 10 以 g/mj?，添加 TNFa 及 BMAP — 1後第2天藉由MTT法測定L_9 2 9細胞之活細胞數 。結果如第16圓、17所示’ L 一 929細胞會因 TNFa而顯著減少，與之相比，BMAP—1不會受到 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 4 2 6 6 8 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 五、發明説明（2〇 ) L 一 9 2 9細胞之作用。因此可知BMAP_ 1可識別之 抗原並非爲TNF受體* 藉由流動細胞測儀（F A C Scan Becton Dickinson )檢討BMAP — 1可識別之抗原是否爲MHC classl 抗原，結果如第1 8圖〜第2 1圖所示》在此第1 8圖係 表示使用市販老鼠IgG2a ( Zymed公司製）之對照， 第19圊係表示抗小鼠MHC class I抗體（老鼠 I gG2a，BMA公司製）與BWV1細胞（BW 5 1 4 7細胞由來之小鼠淋巴瘤）之結合性，第2 0圖係 表示使用市販之老鼠I gGl ( Zymed公司製）之對照， 第2 1圖係表示BMAP — 1與BWV1細胞之結合性分 析結果。又，圖中縱座標係表示相對細胞數*橫座標係表 示螢光強度。結果BMA P_ 1雖不會識別BWV 1細胞 ，但MHC class I抗體係可與B W V 1細胞反應》 B M A Ρ — 1抗體之F a b化係藉由Immuno Pure Fab Preparation Kit (Bias公司製，USA )使 BMA P 一 1抗體進行木瓜蛋白酶消化，其後將Protein A ( AmpureTM PA Kit, Amasham 公司製）所夾雜之 Intact I gG及F c除去以進行F a b之精製*檢討使用此 F a b化BMAP — 1抗體之骨髓細胞自滅誘發作用。亦 即，在C57BL/6J鼠（日本Clare公司製），使 Fab 化 BMAP — 1 抗體以 300#g / head，2 0 0 从g/head，1 0 0仁g/head靜脈內投與，在2 4小時 後採取大腿骨，使用Apopu· TagTM (Oncore公司製）檢 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -23 - 426687 A7 _B7_ 五、發明説明（21 ) 討有無自滅作用。又’作爲對照係使鼠（rat) IgG (Cape 1公司製）以同樣方式以木瓜蛋白酶消化，投與 3 0 0卩g / head並檢討之。 結果如第22圖所示，在作爲對照之鼠I gG，無法 認定顯示DNA切斷（自滅作用）FITC(Y軸）之上 升，將Fab化BMAP — 1抗體以300卩g / head， 2 0 0从g / head，1 0 0紅g / head靜脈內投與之個體 ，可認定在用量依存性顯示自滅作用之FITC值明顯上 升。 由上述可以藉由實驗確認BMAP—1係具有對骨髓 樣細胞誘發細胞自滅之作用者，根據本發明人所知，如上 述以往從未有報告提及曾有單株抗體可以對骨髓樣細胞誘 發細胞自滅之例，具有該作用之單株抗體係本發明人首先 發現極具新穎性者。利用此BMAP - 1所代表之本發明 單株抗體可以對骨髓細胞誘發細胞自滅作用，因而可以推 測而知該單株抗體係可以致死對其抗原有髙表現之骨髓性 > 經濟部中央標举局貝工消費合作社印製 n n In nn J It i (請先聞讀背面之注$項再填窝本頁) 白血病細胞，所以本發明之對骨髓細胞誘發細胞自滅之單 株抗體係做爲骨髓性白血病治療藥極有用者。 以上以實施例表示具體說明本發明之單株抗體，惟本 發明中所稱對骨髓樣細胞可誘發細胞自滅之單株抗體係在 上述具體例中僅舉代表性者而已，並非僅限於此等，不論 爲何種敏化抗原只要以同樣方法製作，具有同樣特性之功 能的單株抗體應該均包括在內自不待賛言。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 42668 7 A7 B7 五、發明説明（22 ) 產業上之可利用性 本發明之單株抗體係做爲可以特異性地識別對骨髓樣 細胞可以誘發細胞自滅之抗原等的抗體，在識別、鑑定此 等抗原時極爲有用*同時還對骨髓樣細胞可以誘發細胞自 滅作用，所以 可利用該特性，在治療骨髓性白血病等之 領域中做爲極有用之治療藥劑等使用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) m- 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ μ _

Claims (1)

1. 42668 公告

   AS B8 C8 D8 、申請專利範圍 第83 1 1 0887號專利申請案 4 中文申請專利範圍修正本 民國89年1 1月修正 1 . 一種單株抗體 細胞表面抗原的1 A p ，而與骨髓球樣細胞結 細胞自滅（apoptosis 2 .如申請專利範 骨髓球樣細胞的細胞自 瘤（中華民國寄存號碼 BMAP — 1 (老鼠融 3.—種單株抗體 申請專利範圍第1或第 臟間質細胞之細胞表面 結合，並具有可誘發骨 apoptosis)特性者。 ，其特徵爲可識別脾臟間質細胞之 (Integrin Associated Protein) 合，並具有可誘發骨髓球樣細胞的 )特性者。 圍第1項之單株抗體，其具有誘發 滅（apoptosis)特性，且爲融合 :CCRC960012 ' 名稱： 合瘤））產生的單株抗體。 F(ab>)2片段，其特徵爲如 2項之單株抗體的片段，可識別脾 抗原的I AP，而與骨髓球樣細胞 髓球樣細胞的細胞自滅（ K i^i p^i^p IH9 , zr ^^^^1 UK n^i - , J. ^ 、-0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財4局8工消費合作社印製 木纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） 自I妗，〜1198“83, U 22 申請案號 i湖 I ""A83119 8 44 m 010785 申請曰期？ ilTtW7" A1 承辦人代碼： 大 類： I p c分類 案 由：10000 費 規 項 事 明 聲 主 受文者 新台带參件伍佰元整 一 d本案係有聞微生物。 □主張耰先權： 受理該申請案之國家(地區) 申請日： 申請案號數： 送 書 件

   s 一份 、本主6營 微案張自利说份外 生有優然事明一國任 物開先人業書可人_ 寄國權W登原暫申利 記本免請代 證係送者理 影外I 人 本國有經代 —文需驗爲 法者要C申 人V時認諳 一原通^者 或文知證^ 身说補之代 份明送國理 證書U籍委 正一。_或ft 反式法書 面二 影份 本0 存防之 機機證 搆密明 之之文 寄證件 存明。 證文 明件 文。 件 m 本 專利代理人 發 !毒 證份 明E 〃'宣圖说 發誓式明 明書一書 人一式一 與份二式 t%% 人$如 Ϊ 人 者 中 請 權 證 明 文 件 中 代表人 名中文 姓英文 I D 住、居所 姓名 I D 事務所 電 話 發明專利 請審查益准予「 經濟部中央標準局 發 明 專 利 中 請 (由本局填寫) (請先閲讀背面之注意事項再本頁各櫊) 住、居所 (事務所) 請 人 Ο 姓名或名稱 | 英 文 -1Τ -ρ37ρ1ηητ· __l-feTL 羅議 五 a^vrl:.:'y #

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   日本 國籍 ΙΛ號 721357 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X2?7公釐） 83. 8. 5,000 426687 第831 108 87號申請專利案日文申請專利範園修正本 民國89年11月修正 1·TG—CSF投与動物®脾臓間質細胞Φ細胞表面 抗原 t* 26¾ IAP ( Integrin Associated Protein )旮 認識L、骨髓球樣細胞t結合L、骨髓球樣細胞L 7 示卜一シ只（apoptosis )奁誘起1* 5特性奁有1~4乇 乂夕口一于小抗体《 2 ·骨備球樣細胞[:7术卜一シス（apoposis ) $·誘起f 冬特性旮有1*2>乇夕夕口一十瓜抗体拍、八κ -V (台湾寄託番号：CCRC960012、名称：BMAP _1(7 7卜 7Ά 八彳：/9卜"·— 7))1乙上。 T產生办乇/夕口一十少抗体BMAP - 1 T* * 4 請求項1記載©乇/夕口 抗体。 3 ·請求項1又丨±2記載口一于；1/抗体0)断片τ* ί)·^τ、脾臟間質細胞ο細胞表面抗原©ΙΑΡ奁認 識骨髓球樣細胞Κ 7水卜一 （apoptosis )奁 誘起t芒特性全有卞§乇/夕口一于小抗体Fiab'h断