HU222989B1

HU222989B1 - Apoptózist kiváltó monoklonális ellenanyagok

Info

Publication number: HU222989B1
Application number: HU9600206A
Authority: HU
Inventors: Naoshi Fukushima
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 2004-01-28
Also published as: NO960684L; HUT74594A; US6267959B1; AU7546694A; CA2169950A1; RU2202615C2; EP0721015A1; US20010001712A1; NO960684D0; US20030147894A1; AU692466B2; CZ294359B6; US6759043B2; TW426687B; US5840344A; SK25596A3; UA50708C2; ATE280835T1; PL181783B1; HU9600206D0

Abstract

A találmány tárgyát mieloid sejtek apoptózisát kiváltani képesmonoklonális ellenanyagok képezik. A találmány tárgyát képezik továbbáa találmány szerinti ellenanyagok fragmensei, valamint a találmányszerinti ellenanyagokat termelő hibridóma sejtek is. ŕ

Description

A találmány tárgyát olyan új monoklonális ellenanyagok képezik, melyeknek mieloid sejtek vonatkozásában apoptózist kiváltó sajátságuk van, és ezért felhasználhatók mielocitikus leukémia kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények hatóanyagaként. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti monoklonális ellenanyagok fragmensei, valamint a találmány szerinti monoklonális ellenanyagokat termelő hibridóma sejtek.

Mivel a találmány szerinti monoklonális ellenanyagok képesek felismerni és azonosítani a mieloid sejteken specifikusan apoptózist okozó antigéneket, és képesek mieloid sejtek apoptózisát kiváltani, a találmány szerinti ellenanyagok ezen sajátságuk alapján alkalmasak mielocitikus leukémia kezelésére használt gyógyászati készítmények hatóanyagaként történő felhasználásra.

A granulocita-kolóniastimuláló faktorokat - például a rekombináns granulocita-kolóniastimuláló faktorokat (rG-CSF) - elsősorban olyan humorális faktorként ismerik, melyek képesek a granulocita sejtek differenciálódását és proliferációját stimulálni, és közzétettek egy olyan kísérleti eredményt is, mely szerint egerekben in vivő az rG-CSF adagolása fokozza a csontvelő hematopoiézisét, és ezenfelül figyelemre méltó extramedulláris hematopoiézist vált ki a lépben, miáltal a lépben található hematopoietikus törzssejtek és valamennyi hematopoietikus prekurzorsejt proliferálni kezd. A lépben végbemenő extramedulláris hematopoiézis mechanizmusáról az az elképzelés alakult ki, hogy a hematopoiézis a lépben található hematopoietikus mikrokömyezet módosulásainak következménye, melyeket az idéz elő, hogy az rG-CSF stimuláló hatása következtében fokozódik a hematopoietikus potenciál.

Az elmondottak értelmében célul tűztük ki, hogy rG-CSF-fel kezelt stromális lépsejteket használjunk fel a lépben található hematopoietikus potenciál vizsgálatához. Előállítottunk egy hematopoietikus stromális sejtvonalat (CF-l-sejtek) egy olyan egér lépéből, melyet rG-CSF-fel kezeltünk, azzal a céllal, hogy vizsgálni tudjuk a hematopoietikus potenciál fokozódását rG-CSFfel kezelt stromális sejtek hatására. Megvizsgáltuk a hematopoietikus stromális sejtek hematopoiézisre kifejtett hatását, és azt találtuk, hogy az ilyen sejteknek in vitro klónstimuláló hatásuk van, in vivő pedig a hematopoietikus törzssejteket védő potenciált hoznak létre [Blood, 80, 1914 (1992)].

Bár sikerült előállítani egy stromális lépsejtekből származó sejtvonalat (CF-l-sejtek) és ezen sejtvonal citológiai sajátságait is megvizsgáltuk, mindeddig nem állítottak elő olyan specifikus ellenanyagot, amely képes felismerni az ilyen sejtek sejtfelszíni antigénjeit, és ezért ezen sejtfelszíni antigének sajátságai alig ismertek.

Célul tűztük ki tehát, hogy a stromális lépsejtekről rendelkezésünkre álló fenti információk felhasználásával olyan specifikus ellenanyagokat állítsunk elő, melyek képesek a stromális lépsejteket felismerni. A találmány szerinti megoldás megvalósítása során a fenti stromális lépsejtvonalat immunizáláshoz antigénként használtuk fel, és ily módon mindeddig ismeretlen típusú ellenanyagokat állítottunk elő.

Az előállított monoklonális ellenanyagok sajátságait vizsgálva meglepő módon azt találtuk, hogy az előállított ellenanyagok képesek mieloid sejtek apoptózisát okozni.

A találmány tárgyát képezi tehát egy új típusú monoklonális ellenanyag, mely képes mieloid sejtek apoptózisát kiváltani, képes kötődni egy, a FERM BP-4382 számon letétbe helyezett hibridóma által termelt BMAP-I jelű ellenanyag által szintén felismert antigénhez, és felhasználható mielocitikus leukémia kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény hatóanyagaként.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti ellenanyagok fragmensei, valamint a találmány szerinti ellenanyagokat termelő hibridóma sejtvonalak.

A találmány szerinti monoklonális ellenanyagok rendkívül hatásosan képesek felismerni a mieloid sejtek apoptózisát kiváltó antigéneket [az apoptózist másképpen a sejtek önpusztításának is nevezik, ezt a jelenséget az idézi elő, hogy a nukleoszóma egység megemészti a nukleáris kromatin-DNS-t (úgynevezett létraképződés), ami a sejtek pusztulását eredményezi], és így a találmány szerinti ellenanyagok alkalmasak mieloid sejtek azonosítására és mieloid sejtek apoptózisának kiváltására. A „mieloid sejtek” kifejezés alatt esetenként nemcsak limfoid sejteket értenek, hanem neutrofil sejteket, megakariocitákat, mieloblasztokat, mielocitákat, oszlopsejteket („mást” sejteket), makrofágokat, monocitákat és eritroblasztokat is, és a leírásban használt értelemben a „mieloid sejtek” kifejezést szintén ebben az értelemben használjuk. Mind ez idáig nem volt ismeretes olyan monoklonális ellenanyag, amely képes lett volna mieloid sejtek apoptózisát kiváltani, és ezért a találmány tárgyát képezi valamennyi olyan monoklonális ellenanyag, amely képes mieloid sejtek apoptózisát kiváltani.

A találmány szerinti ellenanyagokat lényegében az alábbiakban közöltek szerint lehet előállítani.

A találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk például oly módon, hogy immunizáláshoz ellenanyagként valamely rG-CSF-fel kezelt állat stromális lépsejtjeit alkalmazzuk, az ilyen sejtekkel önmagában ismert módon immunizálást hajtunk végre, majd az immunizált sejteket önmagában ismert eljárással sejtfúziónak vetjük alá, és önmagában ismert klónozási eljárással a fuzionált sejteket megklónozzuk.

A találmány szerinti ellenanyagok előállításának egy előnyös példájaként megemlíthetjük azt az eljárást, mely szerint valamely rG-CSF-fel kezelt állatból származó stromális lépsejtekként az általunk előállított CF-1-sejtvonalat alkalmazzuk mint antigént [Blood: 80,1914 (1992)], az ezzel az antigénnel immunizált emlősből származó plazmasejteket (immunocitákat) valamely emlős - például egér - mielomasejtjeivel fúzionáltatjuk, az így előállított fuzionált sejteket (hibridómákat) klónozzuk, kiválasztjuk azokat a kiónokat, melyek találmány szerinti ellenanyagokat termelnek, mely ellenanyagok képesek a fenti sejtvonalat felismerni, és a kiválasztott kiónokat tenyésztjük, majd a tenyészet2

HU 222 989 Bl bői az ellenanyagokat előállítjuk. Ez az ismertetett eljárás azonban a találmány szerinti megoldásnak csak egy megvalósítási módja, és az eljárásban például nemcsak a fent említett CF-1-sejteket alkalmazhatjuk, hanem használhatunk antigénként olyan humán stromális lépsejteket, melyeket a CF-1-sejtekkel analóg módon állítottunk elő, és ily módon előállíthatunk olyan találmány szerinti ellenanyagokat is, melyek képesek humán mieloid sejtekhez kötődni, a fenti CF-1-sejtek esetén leírtakhoz hasonlóan.

A találmány szerinti monoklonális ellenanyagok előállításának vonatkozásában az immunizálandó emlős kiválasztásában nincsenek különös megkötöttségek, előnyös azonban a kiválasztáskor figyelembe venni a sejtfúzióban alkalmazni kívánt mielomasejtekkel való összeférhetőséget, és előnyös egeret, patkányt vagy hörcsögöt alkalmazni.

Az immunizálást önmagában ismert eljárás szerint végezzük, például oly módon, hogy a stromális lépsejteket - például a fenti CF-1-sejteket - az emlős hasi üregébe juttatjuk injektálással. Közelebbről, a lépsejteket előnyösen PBS-oldattal vagy izotóniás nátrium-kloridoldattal hígítva vagy abban felszuszpendálva havonta néhány alkalommal juttatjuk be az immunizálni kívánt emlősbe. Immunocitaként előnyösen a fenti sejtekkel végzett utolsó immunizálás után kinyert lépsejteket alkalmazzuk.

A fenti immunocitákkal végrehajtandó sejtfúzió másik szülői sejtjeként előnyösen valamely ismert emlőseredetű mielomasejtvonalat alkalmazzuk, például: p3(P3X63Ag8.653)-sejteket [J. Immunoi.: 123, 1548 (1978)], p3-Ul-sejteket [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)], NS-l-sejtek [Eur. J. Immunoi.: 6, 511 (1976)], MPC-ll-sejteket [Cell: 8, 405 (1976)], Sp2/0-Agl4-sejteket [Natúré: 276, 269 (1978)], FO-sejteket [J. Immunoi. Meth.: 35, 1 (1980)], S194-sejteket [J. Exp. Med.: 148, 313 (1978)] vagy R210-sejteket [Natúré: 277, 131 (1979)].

A fenti immunociták és a mielomasejtek fúzióját lényegében önmagában ismert eljárás szerint hajthatjuk végre [például Milstein és munkatársai eljárásai szerint: Methods Enzymol.: 73, 3 (1981)].

Közelebbről, a fenti sejtfúziót végrehajthatjuk például önmagában ismert táptalajban, fúziógyorsító ágens jelenlétében. Fúziógyorsító ágensként alkalmazhatunk például polietilénglikolt (PEG) és Sendai-vírust (HVJ), és alkalmazhatunk továbbá olyan adjuvánsokat, mint például a dimetil-szulfoxid, melyeket kívánt esetben a fúziós effektus fokozása érdekében alkalmazhatunk. A fúzió végrehajtása során az immunociták és a mielomasejtek arányáról elmondható, hogy az előbbi előnyösen 1-10-szer akkora mennyiségben van jelen, mint az utóbbi. A fenti sejtfúzió során alkalmazható táptalajként megemlíthetjük például az RPMI-1640-táptalajt, valamint a MEM-táptalajt, melyek alkalmasak a fenti mielomasejtek proliferációjának kiváltására, valamint alkalmazhatunk egyéb önmagában ismert táptalajokat is, melyek alkalmasak az ilyen típusú sejtek tenyésztésére, és alkalmazhatunk további adalék anyagokat is, például magzati borjúsavót (FBS).

A sejtfúziót úgy hajtjuk végre, hogy a fenti immunociták és mielomasejtek előre meghatározott mennyiségeit összekeverjük a fenti táptalajban, az elegyhez körülbelül 37 °C-ra előmelegített PEG-oldatot adunk, például 1000-6000 közötti átlagos molekulasúlyú PEGből készült oldatot, 30-60 vegyes% koncentrációban, majd a sejteket kevertetjük. Ezután egymást követő lépésekben alkalmas táptalajt adunk a sejtekhez, a sejteket lecentrifúgáljuk, majd a felülúszót eltávolítjuk, és ezen lépések többszöri ismétlésével kialakítjuk a találmány szerinti hibridómákat.

A találmány szerinti hibridómákat önmagában ismert szelektív táptalajban történő tenyésztés útján szelektáljuk, alkalmazhatunk például HAT-táptalajt (olyan táptalaj, amely ki van egészítve hipoxantinnal, aminopterinnel és timidinnel). A HAT-táptalajban történő tenyésztést addig folytatjuk, amíg a találmány szerinti hibridómákon kívül minden más sejt (nem fuzionáló sejtek) elpusztul, az ehhez szükséges idő általában néhány nap és néhány hét közötti. Ezt követően önmagában ismert határhígításos analízis útján a találmány szerinti ellenanyagokat termelő hibridómákat szubklónozzuk.

Az előállított találmány szerinti ellenanyagokat termelő hibridómákat tovább tenyészthetjük önmagában ismert táptalajban, majd folyékony nitrogénben hosszú ideig tárolhatjuk őket.

A találmány szerinti hibridómákból a találmány szerinti monoklonális ellenanyagokat önmagában ismert eljárás szerint állíthatjuk elő, mely eljárás szerint a hibridómákat önmagában ismert módon tenyésztjük, majd az ellenanyagokat a tenyészetek felülúszójából kinyerjük, de eljárhatunk úgy is, hogy a hibridómákat egy alkalmas emlősbe juttatjuk szaporítás céljából, majd az alkalmazott emlősből aszciteszt izolálunk. Az elsőként ismertetett eljárás alkalmas nagy tisztaságú ellenanyagok előállítására, a második eljárás pedig elsősorban az ellenanyagok nagy mennyiségben történő termelésére használható.

Továbbá, a fenti eljárással előállított ellenanyagokat tovább tisztíthatjuk, önmagában ismert tisztítási lépések alkalmazásával, mint például a kisózásos eljárás, a gélszűrés és az affinitáskromatográfia.

A találmány szerinti ellenanyag lehet bármely olyan ellenanyag, amely rendelkezik egy specifikus sajátsággal, melyet részletesen a későbbi példában fogunk ismertetni, azaz képes mieloid sejtek apoptózisát kiváltani, és valamennyi olyan ellenanyag, mely ezzel a sajátsággal bír, a találmány tárgyát képezi, függetlenül az előállításkor alkalmazott antigén milyenségétől. A találmány szerinti ellenanyagok a fenti sajátság alapján alkalmasak mielocitikus leukémia kezelésére használható gyógyászati készítmény előállítására.

Természetesen a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazása is a találmány tárgyát képezi, például olyan specifikus rendszer előállítására, amely alkalmas mieloid sejtek apoptózisát okozó antigének azonosítására és felismerésére, vagy olyan gyógyászati készítmény előállítására, mely a találmány szerinti ellenanyagok specifikus sajátságának kihasználásával alkalmas mielocitikus leukémia kezelésére, és a találmány tárgyát képezik a fenti alkalmazások módosított változatai is,

HU 222 989 Bl azaz minden olyan alkalmazás, mely során a találmány szerinti ellenanyagokat szakember számára ismert eljárásban alkalmazzák.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán immunfluoreszcenciás analízis eredményeit láthatjuk (kontroll: ellenanyag nélkül, CF-1-sejtek).

A 2. ábrán egy immunfluoreszcenciás kísérlet eredményeit láthatjuk, melyben a GSPST-1-ellenanyag kötődési sajátságait vizsgáltuk CF-1-sejtek vonatkozásában.

A 3. ábrán egy immunfluoreszcenciás kísérlet eredményeit láthatjuk, melyben a BMAP-l-ellenanyag kötődési sajátságait vizsgáltuk CF-1-sejtek vonatkozásában.

A 4. ábrán immunfluoreszcenciás analízis eredményeit láthatjuk (kontroll: ellenanyag nélkül, csontvelősejtek).

Az 5. ábrán egy immunfluoreszcenciás kísérlet eredményeit láthatjuk, melyben a GSPST-1-ellenanyag kötődési sajátságait vizsgáltuk csontvelősejtek vonatkozásában.

A 6. ábrán egy immunfluoreszcenciás kísérlet eredményeit láthatjuk, melyben a BMAP-l-ellenanyag kötődési sajátságait vizsgáltuk csontvelősejtek vonatkozásában.

A 7. ábrán immunfluoreszcenciás analízis eredményeit láthatjuk (kontroll: ellenanyag nélkül, NFS-60-sejtek).

A 8. ábrán egy immunfluoreszcenciás kísérlet eredményeit láthatjuk, melyben a GSPST-1-ellenanyag kötődési sajátságait vizsgáltuk NFS-60-sejtek vonatkozásában.

A 9. ábrán immunfluoreszcenciás analízis eredményeit láthatjuk (kontroll: patkányIgGl alkalmazásával, NFS-60).

A 10. ábrán immunfluoreszcenciás analízis eredményeit láthatjuk (kontroll: ellenanyag nélkül, NFS-60).

All. ábrán egy vizsgálati eljárás eredményeit láthatjuk, mellyel a BMAP-1 monoklonális ellenanyag NFS-60-sejtek proliferációjának gátlására kifejtett hatását vizsgáltuk.

A 12. ábrán egy vizsgálati eljárás eredményeit láthatjuk, amellyel a GSPST-1-ellenanyag csontvelő-átültetésre kifejtett gátlóhatását vizsgáltuk.

A 13. ábrán egy vizsgálati eljárás eredményeit láthatjuk, amellyel a BMAP-l-ellenanyag csontvelő-átültetésre kifejtett gátlóhatását vizsgáltuk.

A 14. ábrán egy H. E.-festett csontvelősejtekről készített mikrofotográfiát (X400) láthatunk, amelyen láthatók az elpusztult csontvelősejtek (2) a találmány szerinti BMAP-l-ellenanyag beadását követő 6. napon, valamint láthatók a kontrollsejtek (1), mely esetben ellenanyag beadása nem történt.

A 15. ábrán egy migrációs fotót láthatunk, melyet elektroforetikus kromatográfia során készítettünk, és amelyen látható a csontvelősejtekben megfigyelhető DNS-létraképződés, amely a találmány szerinti BMAP-l-ellenanyag beadásának következtében alakul ki.

A 16. ábrán a TNFa L929-sejtekre kifejtett citotoxicitásának aktivitását vizsgáló eljárás eredményeit láthatjuk.

A 17. ábrán a BMAP-1 monoklonális ellenanyag citotoxicitásának vizsgálati eredményeit láthatjuk.

A 18. ábrán egy immunfluoreszcenciás analízis eredményeit láthatjuk (kontroll: patkány-IgG2a, BWV1).

A 19. ábrán egy immunfluoreszcenciás vizsgálat eredményeit láthatjuk, amelyből a I. MHC-osztályba tartozó antiegér-ellenanyag BWV1-sejtek iránti kötési sajátságai láthatók.

A 20. ábrán egy immunfluoreszcenciás analízis eredményét láthatjuk (kontroll: patkányIgGl, BWV1).

A 21. ábrán egy immunfluoreszcenciás vizsgálat eredményeit láthatjuk, amely a BMAP-l-ellenanyag BWVl-sejtek iránti kötődési sajátságait mutatja.

Az ábrákon az alábbi rövidítéseket alkalmaztuk: a: BMAP- 1-gyel kezelt egér thymusából származó

DNS (24 óra elteltével), b: BMAP-1-gyel kezelt egér csontvelejéből származó DNS (24 óra elteltével), c: BMAP- 1-gyel kezelt egér thymusából származó DNS (8 óra elteltével), d: BMAP-l-gyel kezelt egér thymusából származó DNS (4 óra elteltével), e: kezeletlen egér csontvelejéből származó DNS (csontvelősejtek), f: molekulatömeg-marker.

Az alábbiakban a találmány szerinti megoldást egy referenciapélda és egy példa segítségével részletesebben ismertetni fogjuk, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

Referenciapélda

Stromális lépsejtek előállítása és sajátságaik leírása

1. Stromális lépsejtek előállítása

A stromális lépsejtvonalat egy 5 napon keresztül 100 pg/kg dózisban rG-CSF-fel kezelt C57BL/6J egér lépsejtjeinek primer tenyészetéből állítottuk elő. Közelebbről, a lépet az rG-CSF-kezelés után csíramentes környezetben eltávolítottuk, a lépsejteket 25 cm²-es műanyag lombikban tenyésztettük (Corning Co.) hat héten

HU 222 989 Bl keresztül, 10% hőinaktivált magzati borjúsavóval (FBS; Sanko Junyaku, Tokió) kiegészített, 100 e/ml penicillint és 100 pg/ml sztreptomicint tartalmazó Iscoveféle módosított Dulbecco-táptalajban (IMDM; Boehringer Co.), inkubátorban, 5% CO₂-atmoszférában 37 °C-on, és a táptalajt hetente kétszer friss táptalajra cseréltük.

A konfluens tenyészetből az adherens sejtpopulációkat (stromális sejtek) kinyertük a lombikból, 0,05% tripszint és 0,02% EDTA-t (Sigma Chemical Co.) tartalmazó Ca- és Mg-mentes PBS-oldat alkalmazásával, és a kinyert sejteket új lombikokba vittük át. Ezt a passzálást hetente közelítőleg egyszer vagy kétszer elvégeztük. A korai passzálások során (1-10. passzálások) a sejtek hasadási aránya 1/4 és 1/8 közötti volt. Ezt követően pedig ez az arány 1/16 és 1/32 közé esett. A stromális sejtek homogénekké és fibroblasztoidokká váltak körülbelül a 10. passzálást követően.

A 20. passzálást követően a stromális sejteket begyűjtöttük a fent leírtak szerint, és határhígításos eljárással klónozásnak vetettük alá őket. A klónozást kétszer megismételtük, és így állítottuk elő a stromális sejtvonalat (CF-l-sejtvonal).

Ezt követően ezeket a sejteket 25 cm²-es lombikban (Corning Co.) 5 ml 10% hőinaktivált FBS-t tartalmazó IMDM-táptalajban tenyésztettük tovább, és a tenyészetet 5 naponta egyszer átoltottuk, 1/32 hasadási aránnyal. Stromális lépsejtvonalat elő lehet állítani más állatból is, nemcsak egérből, előállíthatunk például humán stromális lépsejtvonalat a fent leírtak szerint, oly módon, hogy a sejteket SV40 adenovírusvektorral transzformáljuk [J. Cell. Physiol.: 148, 245 (1991)].

2. Az CF-l-sejtek sajátságai

A fentiek szerint kialakított CF-1-sejtvonalat megvizsgáltuk alkalikus foszfatáz, savas foszfatáz, β-glükuronidáz, α-naftil-acetát-észteráz aktivitás vonatkozásában, valamint megfestettük O-olajvörössel, önmagában ismert citokémiai eljárások alkalmazásával. A CF-1sejteket immunenzimatikus hisztokémiai módszerekkel is jellemeztük, az alábbi monoklonális és poliklonális ellenanyagok felhasználásával: macl-hez kötődő ellenanyagok (Sero Tec.); VHI. faktorral kapcsolt antigénhez kötődő ellenanyagok (Dakopatts); I. és III. típusú kollagénhez és fibronektinhez kötődő ellenanyagok (Chemicon International Inc.). A fagocitózist latexfelvétel alapján vizsgáltuk (a részecskék átmérője 1,09 pm volt; Sigma), és a CF-l-sejtek adipocitákká való átalakulási képességét 10~⁶ mol/1 hidrokortizon-foszfátos (Sigma) kezeléssel vizsgáltuk, 25 cm²-es lombikban, a konfluens tenyészet kialakulását követően 4 héten keresztül.

A vizsgálatok során a következő eredményeket kaptuk: a CF-l-sejtek negatívnak bizonyultak alkalikusfoszfatáz-aktivitás, nyolcadik faktorral kapcsolt antigén, mac-I és fagocitózis vonatkozásában, és pozitívnak bizonyultak I. és III. típusú kollagén és fibronektin vonatkozásában. A CF-l-sejtek konfluens tenyészetben 10~⁶ mol/1 hidrokortizon hatására 4 hét alatt nem alakultak át adipocitákká, bár a CF-l-sejtek csak nyomnyi mennyiségben tartalmaztak lipidet. A fenti eredményekből megállapíthatjuk, hogy a CF-l-sejtek nem rendelkeznek a preadipociták, makrofágok vagy endothelsejtek sajátságaival, és ezért nyilvánvaló, hogy a fentiektől különböző stromális sejtekből származnak.

3. Hematopoietikus törzssejtek fenntartása CF-lsejtek alkalmazásával

Annak eldöntésére, hogy a hematopoietikus törzssejtek fenntarthatók-e CF-l-sejtek alkalmazásával vagy nem, CFU-S vizsgálati eljárásokat hajtottunk végre (léperedetű klónképző sejtek vizsgálata), Till és McCulloch eljárása szerint. Csoportonként 10 egeret sugároztunk be 900 cGy dózissal (MBR-1520R; Hitachi, Tokió), és intravénásán mononukleáris csontvelősejteket injektáltunk az egerekbe (BM-sejteket; l,0xl0⁵/kísérleti állat, 5,0xlO⁴ kísérleti állat vagy 2,0xlO⁴ kísérleti állat mennyiségben), valamint CF-l-sejteket is beinjektáltunk (1,0 χ 10⁵/kísérleti állat mennyiségben), és a 12. napon megszámoltuk a lépben kialakult kiónokat, ezeket tekintettük CFU-S-klónnak (lépklónok).

A fenti vizsgálat eredményeként azt találtuk, hogy amennyiben mononukleáris csontvelősejteket (BMsejtek) és CF-l-sejteket besugárzott egerekbe transzplantáltunk, a lépsejtklónok száma minden egyes BMsejtcsoportban jelentősen növekedett (1,4-1,8-szeres mértékben) a CF- 1-sejteket nem kapott kontrollegerekhez viszonyítva, és a transzplantációt követő 12. napon a túlélési arány magasabb volt azok között az egerek között, melyeket mind BM-sejtekkel, mind CF-1sejtekkel transzplantáltunk, mint azok között az egerek között, melyek kizárólag BM-sejteket kaptak, az elhalálozási arány alacsonynak bizonyult, az elmondottakból tehát világossá vált, hogy a CF-l-sejtek alkalmasak a hematopoietikus törzssejtek fenntartására.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módját.

Példa

Monoklonális ellenanyagok előállítása

1. Antigének és immunizálás

Az immunizálást antigénként a fenti referenciapélda szerint előállított CF-l-sejteket alkalmazva végeztük. A sejteket inkubátorban tenyésztettük 5%-os CO₂-atmoszférában 37 °C-on, Iscove-féle módosított Dulbecco-táptalajban (IMDM; Boehringer Mannheim Corp.), amely tartalmazott 10% magzati boíjúsavót is (FBS; Sanko Junyaku).

A sejteket 1 mmol/1 EDTA/PBS oldattal kezeltük, és a tenyésztőlombikban pipettázással nyertük ki őket. A sejteket 1 mmol/l-es EDTA/PBS oldatban felszuszpendáltuk, körülbelül 1 χ 10⁷/ml koncentrációban, majd Wistar-Imamich-patkányokba juttattuk azokat (a patkányok 7 hetes nőstények voltak; Animál Breeding Research Laboratory). Az első immunizálási lépésben a patkányok hasüregébe 1 ml körülbelül 1 x 10⁷/ml-es koncentrációjú sejtszuszpenziót juttattunk, majd 1 hónappal később újabb 1 ml 1 χ 10⁷/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót adtunk be a patkányoknak. Ezt követően 1 hónapos időközönként még néhányszor körülbelül 1 ml 1 χ 10⁷/ml koncentrációjú sejtszuszpenzióval immunizáltuk a patkányokat, és miután ki lehetett mutatni, hogy az immunizált patkányokból származó ellenanyag reagál a CF-15

HU 222 989 Bl sejtekkel, végső immunizálásként 1 χ 10⁸/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót juttattunk a kísérleti állatba. A végső immunizálást követően 3 nappal a patkányokat elpusztítottuk, és lépőket eltávolítottuk.

2. Sejtfúzió

A lépet - miután a patkányból eltávolítottuk - feldaraboltuk, és az izolált lépsejteket centrifugáltuk, IMDMtáptalajban (Boehringer Mannheim Co.) felszuszpendáltuk, majd alaposan megmostuk őket. Másrészt, az Sp2/0-Agl4 jelű egérmieloma-sejtvonal [Natúré: 276, 269 (1978)] tenyésztése útján előállított sejteket, melyekből 10% magzati boíjúsavóval (FBS; Sanko Junyaku) kiegészített IMDM-táptalaj van (Boehringer Mannheim Corp.), sejtszuszpenziót készítettünk, a fenti IMDMtáptalajban a fentiek szerint mostuk, majd lxlO⁸mielomasejtet és 2 χ 10⁸ fentiek szerint előállított lépsejtet egy centrifúgacsőben összekevertünk, és a sejtfúziót polietilénglikol-4000 (Nakarai Kagaku) alkalmazásával önmagában ismert eljárás szerint hajtottuk végre [Clin. Exp. Immunoi.: 42, 458 (1980)].

Ezt követően az előállított fuzionált sejteket 96 mélyületű tálcába szélesztettük, 20% FBS-sel kiegészített IMDM-táptalajban, majd a sejteket inkubátorban tenyésztettük 37 °C-on, 5% CO₂-atmoszférában. A sejteket a következő napon fokozatosan átvittük szelektív HAT-táptalajba, majd tovább tenyésztettük őket.

A tenyésztés kezdetét követően a felülúszókat hetente kétszer új HAT-táptalajra cseréltük, és ily módon a proliferációt fenntartva folytattuk a tenyésztést.

A következő lépésben az előállított fuzionált sejteket önmagában ismert eljárás szerint határhígításos analízissel klónoztuk. Közelebbről, az önmagában ismert határhígításos eljárás alkalmazásával csak azokat a kiónokat klónoztuk tovább, melyek által termelt ellenanyagok erősen kötődtek az antigénekhez. A fuzionált sejtek tenyészeteinek felülúszóiban található ellenanyagok kötődési sajátságait vizsgáltuk.

3. Szűrővizsgálat

A fuzionált sejtek (hibridómák) szűrővizsgálatát áramlási citometriával végeztük, indirekt fluoreszcens ellenanyag alkalmazásán alapuló vizsgálati eljárással.

A találmány szerinti ellenanyagokat termelő kiónok szűrővizsgálatát célsejtekként CF-1-sejtek alkalmazásával végeztük. Közelebbről, a reakciópufferben (2% FBS-sel és 0,02% NaN₃-mal kiegészített PBS) felszuszpendált sejteket lecentrifúgáltuk, majd a sejteket tartalmazó üledéket kinyertük, és újra felszuszpendáltuk azokat 100 μί hibridóma tenyészet-felülúszóban (körülbelül 1χ10⁶/100 μί), és a reakciót egy órán keresztül 4 °C-on végeztük. Miután a sejteket egyszer mostuk a fenti pufferrel, FITC-cel jelölt kecske-antipatkány IgG (FC)-ellenanyaggal (Chemicon) reagáltattuk a sejteket egy órán keresztül. A sejteket ezután ismét egyszer mostuk, majd áramlási citometriával analizáltuk őket (FACScan, Becton Dickinson).

4. Az ellenanyagok tisztítása

A 3. pont szerint kiválasztott fuzionált sejteket önmagában ismert eljárás szerint tenyésztettük, és a felülúszókban található termelődött ellenanyagokat önmagában ismert eljárás szerint izoláltuk és tisztítottuk.

Közelebbről, az antigén vonatkozásában magas ellenanyag-titerű mélyületekből kinyertük a hibridómákat, azokat szövettenyésztő műanyag tálcákra szélesztettük (Corning Corp.), majd a sejteket 37 °C-on 5%-os CO₂-atmoszférában tenyésztettük, proliferálni engedtük őket, majd önmagában ismert eljárás szerint tisztítottuk az ellenanyagokat, ily módon előállítva a GSPST-1 és BMAP-1 jelű ellenanyagokat.

A GSPST-1-ellenanyag esetén úgy jártunk el, hogy az előállított sejteket BALB/cAJcl-nu jelű csupasz egerek hasüregébe juttattuk (8 hetes hím egereket alkalmaztunk; Nippon Kurea). A termelődött aszciteszt 10-14 nap múlva izoláltuk, 33% ammónium-szulfáttal kisóztuk, és PBS-sel szemben dializáltuk. A BMAP-1ellenanyag esetén a sejteket nagy mennyiségben tenyésztettük 10% FBS-t tartalmazó Iscove-féle módosított MEM-táptalajban, a felülúszókat betöményítettük, 33% ammónium-szulfáttal kisóztuk, PBS-sel szemben dializáltuk, és protein-A-oszlopon tisztítottuk (Amersham), majd PBS-sel szemben dializáltuk. Az ismertetett példában az immunizáláshoz antigénként CF-1sejteket alkalmaztunk, lehetséges azonban hasonló módon más monoklonális ellenanyagokat is előállítani úgy, hogy antigénként más stromális sejteket alkalmazunk, melyek rendelkeznek hematopoietikus törzssejteket védő potenciállal, a találmány tárgya tehát nem korlátozódik a fent megadott monoklonális ellenanyagokra, hanem oltalmi igényünk kiterjed mindazon monoklonális ellenanyagokra, melyek az ismertetett ellenanyagokkal azonos sajátságúak, valamint mindazokra a hibridóma sejtekre, melyek ilyen monoklonális ellenanyagokat termelnek.

A találmány szerinti BMAP jelű monoklonális ellenanyagokat termelő hibridóma sejtek újonnan előállított fuzionált sejtek, melyeket szülői sejtekként Wistar-Imamich-patkányok lépsejtjeiből és az SP2/02Agl4 jelű egérmieloma-sejtvonal sejtjeiből állítottunk elő, és az előállított sejtvonalat 1993. augusztus 9-én BMAP-1 (patkány-egér hibridóma) jelzéssel letétbe helyeztük a „National Institute of Biosciense and Humán Technologies, Agency of Industries of Science and Technology” intézetnél Japánban (cím: 13 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japán), ahol a FERM BP-4382 deponálási számot kapta. A megjelölt intézet a Budapesti Szerződés szerinti letétbe helyezési hatóság.

5. Az ellenanyagok sajátságai

i) Az ellenanyagok reaktivitása (CF-1-sejtekkel szembeni reaktivitás)

A GSPST-1 és BMAP-1 jelű monoklonális ellenanyagok CF-1-sejtekkel szembeni reaktivitását immunfluoreszcenciás analízissel vizsgáltuk, és a vizsgálat eredményeit az 1-3. ábrákon láthatjuk. Az 1. ábrán egy ellenanyag hiányában végrehajtott kontrolikísérlet eredményeit láthatjuk, a 2. ábrán a GSPST-l-sejtek CF-1sejtekkel szembeni kötődési sajátságainak analízisét mutatjuk be, a 3. ábrán pedig egy olyan kísérlet eredményeit láthatjuk, amelyben a BMAP-1-ellenanyag CF-l-sejtekkel szembeni kötődési sajátságait analizáltuk. Az ábrákon látható grafikonokon a függőleges tengelyen a sejtek

HU 222 989 Bl relatív számát tüntettük fel, a vízszintes tengelyeken pedig a fluoreszcencia intenzitását.

Az 1-3. ábrák alapján világosan látható, hogy a GSPST-1 és BMAP jelű monoklonális ellenanyagok kötődnek CF-1-sejtekhez, és a CF-1-sejteken található felszíni antigéneket ismerik fel.

(Csontvelősejtekkel szembeni reaktivitás)

A 4-6. ábrákon olyan áramlási citometriás (FACSsan, Becton Dickinson) kísérletek eredményeit láthatjuk, melyekkel a GSPST-1- és BMAP-l-ellenanyagok reaktivitását analizáltuk normális csontvelősejtekkel szemben. A 4. ábrán ellenanyag nélkül végrehajtott kontrollkísérlet eredményeit láthatjuk, az 5. ábra a GSPT-l-ellenanyag csontvelősejtekkel szembeni reaktivitását vizsgáló kísérlet eredményeit mutatja, a 6. ábrán pedig egy olyan analízis eredményeit láthatjuk, amellyel a BMAP-l-ellenanyag csontvelősejtekkel szembeni reaktivitását vizsgáltuk. A függőleges tengelyeken a relatív sejtszámot, a vízszintes tengelyeken pedig a fluoreszcencia intenzitását tűntettük fel.

A 4-6. ábrákon látható, hogy a GSPST-l-ellenanyag egyáltalán nem kötődik csontvelősejtekhez, a BMAP-l-ellenanyag viszont valamennyi csontvelősejthez kötődik.

(Az NFS-60 jelű mielocitikus leukémia-sejtvonallal szembeni reaktivitás)

A 7-10. ábrákon a GSPST-1- és BMAP-l-ellenanyagok NFS-60-sejtekkel [Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 82, 6687 (1985)] szembeni reaktivitásának áramlási citometriás (FACScan, Becton Dickinson) analízisét láthatjuk. A 7. ábrán ellenanyagok nélkül végrehajtott kontrollkísérlet eredményeit láthatjuk, a 8. ábra a GSPST-l-ellenanyag NFS-60-sejtekkel szembeni kötődési sajátságai analízisének eredményeit mutatja, a

9. ábrán a kontroll analízisét láthatjuk kereskedelmi forgalomban beszerezhető patkány-IgGl-ellenanyagok (Zymed) alkalmazásával, a 10. ábrán pedig a BMAP-lellenanyag NSF-60-sejtekkel szembeni reaktivitásának analízisét láthatjuk. A függőleges tengelyeken a relatív sejtszámot, a vízszintes tengelyeken pedig a fluoreszcencia intenzitását tüntettük fel.

A 7-10. ábrák vizsgálata alapján látható, hogy a GSPST-l-ellenanyag nem reagál NSF-60-sejtekkel, a BMAP-l-ellenanyag azonban kötődik az NFS-60sejtekhez.

(A BMAP-l-ellenanyag NFS-60-sejtek proliferációját gátló hatásának vizsgálata)

All. ábrán egy olyan kísérlet eredményeit láthatjuk, amelyben a BMAP-l-ellenanyag NFS-60-sejtekkel szembeni reaktivitását vizsgáltuk 100 ng/ml GCSF és ÍO^-9 mol/1 cikloheximid jelenlétében, MTT vizsgálati eljárás alkalmazásával. A kísérlet végrehajtása során 96 mélyületű tenyésztőtálcákat alkalmaztunk, a mélyületekbe 10 μΐ/mélyület mennyiségben 0,10, 100 ng/ml és 1,10,100 pg/ml koncentrációban, valamint 4 χ 10³/mélyület/100 μΐ NFS-60-sejtet, majd két nap elteltével meghatároztuk az élősejtek számát az MTT-eljárás alkalmazásával. All. ábrán látható, hogy a BMAP-l-ellenanyag jelentős mértékben gátolta az NFS-60-sejtek proliferációját.

ii) Az ellenanyagok típusának meghatározása

Az előállított monoklonális ellenanyagok IgGalosztályának meghatározásával [patkány „mono AbID-Sp” reagenskészlet (Zymed) és biotinjelölt egér-antipatkány IgG-1-ellenanyag (Zymed) alkalmazásával] világossá vált, hogy a GSPST-l-ellenanyag az IgG2a-, a BMAP-l-ellenanyag pedig az IgG-1-alosztályba tartozik.

iii) Csontvelő-átültetést gátló hatás

Az előállított ellenanyagok sajátságainak további vizsgálata során meghatároztuk az ellenanyagok csontvelő-átültetést gátló hatását. A kísérletek eredményeit a 12. és 13. ábrán láthatjuk. Amint az a 12. és 13. ábrán látható, a BMAP-l-ellenanyag gátolta a csontvelő-átültetést, a GSPST-1-ellenanyagnak ilyen hatása nem volt. Közelebbről a fenti eredményeket úgy értük el, hogy fatális dózissal besugárzott (900 cGy) C57BL/6Jegerekbe 1,0 χ 10⁵/kísérleti állat mennyiségben csontvelősejteket és monoklonális ellenanyagokat juttattunk be az állatok farki vénáján keresztül, majd megszámoltuk a lépklónokat. A 13. ábrán a „kezeletlen” jelölés olyan kísérlet eredményeit jelzi, melyben csontvelősejtek beadása nem történt meg.

Amint az a 13. ábrán látható, a BMAP-1 monoklonális ellenanyag teljes mértékben gátolja a transzplantációt az alkalmazott csontvelő-transzplantációs kísérletben, ami megerősítette azt a tényt, hogy a BMAP-lellenanyag oly módon reagál a csontvelősejtekkel, hogy kiváltja azok apoptózisát. Közelebbről, amennyiben csupasz egerek hasüregébe BMAP-l-ellenanyagot termelő hibridóma sejteket juttattunk, az egér elpusztult, amikor benne kis mennyiségű aszcitesz halmozódott fel. Ezenfelül azt is kimutattuk, hogy amennyiben normális C57BL/6J-egerekbe kísérleti állatonként 50 pg BMAP-l-ellenanyagot juttattunk be intravénásán, az valamennyi csontvelősejt pusztulását okozta. A 14. ábrán egy mikrofotográfíát láthatunk, amely alátámasztja azt a tényt, hogy a BMAP-l-ellenanyag intravénás bejuttatását követő 6. napon a csontvelősejtek már elpusztultak. A mikrofotográfiáról látható, hogy nemcsak a limfoid sejtek, hanem a neutrofilek, megakariociták, mieloblasztok, mielociták, oszlopsejtek, makrofágok, monociták és eritroblasztok (úgynevezett mieloid sejtek) is kipusztultak. Ezenfelül 30 pg/kísérleti állat mennyiségben BMAP-ellenanyaggal kezelt egerek csontvelősejtjei DNS-ének vizsgálatával létraképződést tudtunk kimutatni, amint az a 15. ábrán látható, amiből az következik, hogy a BMAPl-ellenanyag által kiváltott fenti reakció a csontvelősejtek vonatkozásában apoptózis következménye.

A BMAP-l-IgG Fc-régióját pepszinnel (Sigma) emésztettük, és GPC-oszlop alkalmazásával F(ab’)₂fragmenseket izoláltunk, majd a tisztított ellenanyagfragmensből C57BL/6J-egerekbe intravénásán 33,5 pgot juttattunk be kísérleti állatonként (ami teljes IgG-re nézve 50 pg/kísérletiállat-mennyiségnek felel meg). Azt találtuk, hogy a beadást követően a csontvelőben elpusztultak a csontvelősejtek. A fenti tények alapján egyértelmű, hogy a BMAP-l-ellenanyag által kiváltott csontvelősejt-pusztulásban nem játszik szerepet sem el7

HU 222 989 Bl lenanyagfüggő sejtes citotoxicitás, sem pedig komplementfiiggő sejtes citotoxicitás.

A sejtfelszíni fehérjék Fas-antigénjéről kimutatták, hogy képes apoptózist kiváltani. Az Fas-antigén mRNS-ének expresszióját kimutatták thymusban, szívben, májban, tüdőben és petefészekben, de a csontvelőben csak kis mennyiségben detektáltak Fas-mRNS-t [J. Immunoi.: 148, 1274 (1992)]. Az elmondottakból egyértelmű, hogy a BMAP-1-ellenanyag által felismert antigének különböznek a már ismertté vált Fas-antigéntől.

Továbbá, annak érdekében, hogy eldönthessük, vajon a BMAP-1-ellenanyag által felismert antigén TNFreceptor-e, megvizsgáltuk a BMAP-1-ellenanyag hatását L929-sejtek alkalmazásával, melyek a TNF-fel sejtpusztulást kiváltó reakcióba lépnek. A kísérletben alkalmazott egér-TNFa (Genzyme) végkoncentrációk a következők voltak: 0, 1, 10, 100 pg/ml, 1, 10, 100 ng/ml és 1 pg/ml, a BMAP-1-ellenanyag végkoncentrációi pedig a következők voltak: 0, 10, 100 pg/ml, 1, 10, 100 ng/ml és 1,10 pg/ml. Az élő L929-sejtek számát az MTT-eljárás alkalmazásával határoztuk meg a TNFa és BMAP-1 hozzáadását követő második napon. A kísérletek eredményeiből kitűnt, ahogy az a 16-17. ábrákon is látható, hogy a TNFa lényegesen csökkentette az L929-sejtek számát, a BMAP-1-ellenanyag azonban nem hatott az L929-sejtekre. Az elmondottak alapján egyértelmű, hogy a BMAP-1-ellenanyag által felismert antigén nem TNF-receptor.

A 18-21. ábrákon olyan áramlási citometriás (FACScan, Becton Dickinson) kísérletek eredményeit láthatjuk, melyekkel azt vizsgáltuk, hogy a BMAP-1ellenanyag által felismert antigének I. MHC-osztályba tartozó antigének-e. A 18. ábrán a kontroll analízisét láthatjuk patkány-IgGl (Zymed) alkalmazásával, a 19. ábrán egy olyan kísérlet eredményeit láthatjuk, amelyben az antiegér-MHC-I-ellenanyag (patkány-IgG2a, BMA) reaktivitását vizsgáltuk BWV1-sejtekkel szemben (BW5147-sejtekből származó egérlimfómasejtek), a 20. ábrán a kontroll analízisének eredményeit láthatjuk patkány-IgGl (Zymed) alkalmazásával, a 21. ábra pedig egy olyan analízis eredményeit mutatja, amellyel a BMAP-1-ellenanyag reaktivitását vizsgáltuk BWV1sejtekkel szemben. A függőleges tengelyeken a relatív sejtszámot, a vízszintes tengelyeken pedig a fluoreszcencia intenzitását ábrázoltuk. Az eredményekből látható, hogy a BMAP-1-ellenanyag nem kötődött a BWV1-sejtekhez, az MHC-I-ellenanyagok azonban reagáltak a BWVl-sejtekkel.

A fent leírtak értelmében egyértelmű kísérleti bizonyítékokat szolgáltattunk arra, hogy a BMAP-l-ellenanyagok a mieloid sejtek apoptózisának kiváltásával fejtik ki hatásukat. Tudomásunk szerint mindeddig nem állítottak elő olyan monoklonális ellenanyagot, amely képes lett volna mieloid sejtek apoptózisát kiváltani, és ezért az általunk leírt ilyen sajátságú monoklonális ellenanyagok újak, és mi állítottunk elő ilyen ellenanyagokat elsőként. Mivel a BMAP-1-ellenanyag által reprezentált monoklonális ellenanyagokról feltehető, hogy képesek mielocitikus leukémiasejtek - mely sejtekről feltételezik, hogy nagy mennyiségben expresszálnak antigéneket - pusztulását okozni csontvelősejtek apoptózisát kiváltó sajátságuk révén, ezért a találmány szerinti mieloid sejtek apoptózisát kiváltam képes ellenanyagok alkalmasak mielocitikus leukémia kezelésére használható gyógyászati készítmények előállítására.

A találmány szerinti ellenanyagok egy előnyös megvalósítási módját részletesen ismertettük a fenti példában. A találmány szerinti ellenanyagok képesek mieloid sejtek apoptózisát kiváltani, az ilyen ellenanyagok közül néhányat a fenti példákban bemutattunk, de oltalmi igényünk nemcsak a konkrétan ismertetett ellenanyagokra teijed ki, hanem magában foglalja valamennyi monoklonális ellenanyagot, melyeknek az ismertetettekkel azonos sajátságaik vannak, és velük azonos módon állíthatók elő, az immunizáláshoz alkalmazott antigéntől függetlenül.

Mivel a találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyagok alkalmasak mieloid sejtek apoptózisát okozó antigéneket specifikusan felismerő és azonosító ellenanyagokként történő felhasználásra, és emellett rendelkeznek mieloid sejtek apoptózisát kiváltó sajátsággal, a találmány szerinti ellenanyagok felhasználhatók mielocitikus leukémia kezelésére alkalmas gyógyszerek előállítására, fent ismertetett sajátságaik alapján.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Monoklonális ellenanyag, amely képes felismerni egy, a FERM BP-4382 számon letétbe helyezett hibridóma által termelt BMAP-1 jelű ellenanyag által szintén felismert antigént, és képes csontvelősejtek apoptózisát kiváltani.
2. Monoklonális ellenanyag F(ab)₂-fragmense, amely ellenanyag képes felismerni egy, a FERM BP-4382 számon letétbe helyezett hibridóma által termelt BMAP-1 jelű ellenanyag által szintén felismert antigént, és képes csontvelősejtek apoptózisát kiváltani.
3. Hibridóma sejt, amely olyan monoklonális ellenanyagot termel, amely képes felismerni egy, a FERM BP-4382 számon letétbe helyezett hibridóma által termelt BMAP-1 jelű ellenanyag által szintén felismert antigént, és képes csontvelősejtek apoptózisát kiváltani.
4. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, amely antigénként humán léperedetű stromális sejt alkalmazásával lett előállítva.
5. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, amely antigénként SV-40 adenovírusvektorral transzformált humán léperedetű stromális sejt alkalmazásával lett előállítva.
6. Gyógyászati készítmény, amely az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyagot vagy a 2. igénypont szerinti F(ab)₂-fragmenst és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
7. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, amely a FERM BP-4382 számon letétbe helyezett hibridóma által termelt BMAP-1 jelű ellenanyag.
8. A 3. igénypont szerinti hibridóma, amely a FERM BP-4382 számon letétbe helyezett hibridóma.