DE10129863A1

DE10129863A1 - Immortalisierte Zellinien des Nebenhodenepithels und deren Verwendung

Info

Publication number: DE10129863A1
Application number: DE2001129863
Authority: DE
Inventors: Richard Ivell; Katrin Kaeppler-Hanno; Christiane Kirchhoff; Ralph Telgmann
Original assignee: IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Current assignee: IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2003-03-27

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Zellinien epididymalen Ursprungs sowie deren Verwendung zur Erforschung der Funktion des Nebenhodens und zur Entwicklung von Medikamenten, insbesondere von Medikamenten zur Behandlung der männlichen Infertilität und von Verhütungsmitteln.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige Zellinien epididymalen Ursprungs sowie deren Verwendung zur Erforschung der Funktion des Nebenhodens, sowie zur Entwicklung und Zytotoxitätsprüfung von Medikamenten.
Neue pharmakologische Wirkstoffe und die Überprüfung der Toxizität entsprechender Verbindungen werden zunehmend über weitgehend automatisierte "high-throughput Screening"-Verfahren (nachfolgend HTS) identifiziert und analysiert (Slater, K., Current Opinion in Biotechnology, 2001, Vol. 12: 70-74; Goldberg, A. M., (Herausg.) In Vitro Toxicology: Mechanisms and New Technology, Vol. 8, Liebert NY). Diese Verfahren ermöglichen es, eine Vielzahl von Wirkstoffen mit therapeutischem Potential paralell auf Mikrotiterplatten zu analysieren. Sowohl für die Bestimmung der Aktivität als auch für die Bestimmung der Toxizität der potentiellen Wirkstoffe werden vermehrt zelluläre Testsysteme verwendet. Für die Durchführung entsprechender Screening-Verfahren werden eine Vielzahl von Zellen eines Zelltyps benötigt.
Die Epididymis oder der Nebenhoden spielt für die männliche Fruchtbarkeit eine entscheidende Rolle (Yanagimachi, 1994; The physiology of repoduction, 2nd ed. 189-317) Beim Menschen besteht die Epididymis aus einem einzigen, etwa 5 m langen Kanal oder Duktus, der sehr stark mäanderartig aufgewunden ist. Die im Hoden (Testis) gebildeten, funktionell noch unreifen Spermien werden zur Epididymis transportiert und während einer zwei bis drei Tage dauernden Passage einem Reifungsprozess unterzogen, in dessen Verlauf sie unter anderem ihre gerichtete Beweglichkeit, ihre Fähigkeit zur Kapazitation und zur Akrosomenreaktion erlangen.
Die genaue Funktion der einzelnen Bestandteile der Epididymis ist allerdings bislang ungeklärt. Das Verständnis dieser Funktionen ist aber eine entscheidende Voraussetzung dafür, in den Reifungsprozeß der Spermien in der Epididymis eingreifen zu können. Ein solcher Eingriff kann beispielsweise zur Behebung männlicher Infertilität sowie zur Kontrazeption erforderlich sein.
Im Stand der Technik ist versucht worden, mittels Primärzellkulturen, d. h. mittels Zellen, die direkt aus der Epididymis gewonnen werden, die Funktion der Epididymis zu untersuchen (Orgebin-Crist et al., 1976, Cell Tissue Res. 167, 515-525; Klinefelter & Hamilton 1984, J. Androl. 5, 243-258; Byers et al., 1985, J. Reprod. Fertil. 7, 401-411; Moore et al., 1992, Fertil. Steril. 58, 776-783; Raczek et al., 1994, Epithelial Cell. Biol. 3, 126-136; Pera et al., 1996, Endocrinology, 137, 4451-4459; Chen et al., 1998, Tissue Cell 30, 1-13; Klinefelter et al., 1982, Biol. Reprod. 26, 885-901; Finaz et al., 1991, J. Reprod. Fert. 91, 617-625; Carballada and Saling, 1997, J. Reprod. Fertil. 110, 171-181; Kirchhoff et al., 2000, Mol. Reprod. Fertil. 56, 26-33). Dabei wurden primär Nager-, aber auch humane und canine Zellen eingesetzt (Moore et al., 1992; Pera et al., 1996).
Ein wesentlicher Nachteil dieser Primärkulturen besteht darin, daß die Zellen nur eine beschränkte Lebensdauer aufweisen, und nach wenigen Proliferationsschritten absterben.
Die einzigen im Stand der Technik beschriebenen epididymalen Zellinien stammen von undifferenzierten fötalen Zellen ab, und sind damit für die oben genannten Zwecke nicht verwendbar (Coleman & Harris, 1991, J. Cell Sci. 98(Pt), 85-89). Gegenüber einer Verwendung tierischer Zellen bestand im Stand der Technik das Vorurteil, daß derartige Zellinien nur bedingt zur Untersuchung der menschlichen Epididymis geeignet sind, da im Falle der Epididymis eine hohe Spezies-Spezifität besteht. Resultate aus Expermimenten mit Tierzellen gelten daher als auf den Menschen nur schlecht übertragbar (Töpfer-Petersen et al., 1995).

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht daher darin, Mittel bereitzustellen, mit denen die Funktion der Epididymis im Menschen untersucht werden kann, mit denen Wirkstoffe identifiziert werden können, welche die Funktion der Epididmis gezielt beeinflussen und mit denen die Toxizität von Wirkstoffen auf die Epididymis bestimmt werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch immortalisierte Zellinien epididymalen Ursprungs gelöst, die durch Immortalisierung von Primärkulturen epididymaler Zellen eines Säugetiers erhältlich sind.

Überraschenderweise hat es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß derartige Zellinien ein Proteinspektrum aufweisen, daß demjenigen von Zellen aus epididymalen Primärkulturen sehr ähnlich ist (siehe Beispiel 2). Diese Zellen können daher als Modell für die Erforschung der Funktion der menschlichen Epididymis dienen.

Die erfindungsgemäßen Zellinien können aus Zellen des Epithels des epididymalen Duktus eines Säugetiers gewonnen werden. Die Epididymis eines beliebigen Säugetiers kann als Quelle für die Zellen der Primärkultur verwendet werden, vorzugsweise werden jedoch Zellen von Menschen, Mäusen, Ratten, Schweinen oder Hunden verwendet, wobei Zellen vom Menschen oder vom Hund besonders bevorzugt sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Zellen aus der Epididymis adulter Säugetiere gewonnen, da diese bereits in voll differenziertem Zustand vorliegen.

Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, Zellen der Epididymis zu isolieren, die polar wachsen. Bei den der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Untersuchungen hat es sich gezeigt, dass polares Wachstum der Zellen für den Erfolg der Immortalisierung von Bedeutung ist.

Die Immortalisierung der Zellen kann nach beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren erfolgen. Gute Ergebnisse wurden durch Immortalisierung mittels Transduktion und dem Large T-Antigen des SV40 erzielt.

Die erfindungsgemäß immortalisierten Zellinien behalten die wesentlichen Eigenschaften der primären Epididymis-Zellen. Die Zellen der Zellinie weisen ein Expressionsmuster auf, das für Epididymis-Zellen typisch ist. Zellen der erfindungsgemäßen Zellinien exprimieren beispielsweise epitheliale Cytokeratine, nuklearen Androgen-Rezeptor, PEA3-Transkriptionsfaktor, CE1, CE4 und/oder CE5/CE52. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß die Zellen der immortalisierten Zellinie CE1 und CE4 exprimieren.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung immortalisierte Zellinien die caninen Ursprungs sind und aus der Gruppe bestehend aus DSM ACC 2499 (Laborbezeichnung IMCE 3), DSM ACC 2500 (Laborbezeichnung IMCE 7), DSM ACC 2501 (Laborbezeichnung IMCE 12), DSM ACC 2502 (Laborbezeichnung IMCE 20), DSM ACC 2503 (Laborbezeichnung IMCE 28) und DSM ACC 2504 (Laborbezeichnung IMCE 29) ausgewählt wurden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Immortalisierung von Zellen epididymalen Ursprungs, bei denen man epididymale Zellen eines Säugetiers gewinnt, daraus Primärkulturen anlegt und diese immortalisiert. Vorzugsweise werden die Zellen vom Epithel des epididymalen Duktus gewonnen. Die Verwendung von Zellen von Menschen, Mäusen, Ratten, Schweinen oder Hunden ist besonders bevorzugt. Besondere Vorteile ergeben sich, wenn die Immortalisierung an den in Primärkultur polar wachsenden Zellen vorgenommen wird.

Die Immortalisierung kann nach im Stand der Technik üblichen Verfahren erfolgen, vorzugsweise wird jedoch durch Transduktion mit dem Large T-Antigen des SV40 immortalisiert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellinie zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Steigerung oder Hemmung der Fruchtbarkeit des Mannes und die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellinien zur Analyse der Funktion der Epididymis.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Ko-Kultur der erfindungsgemäßen Zellen mit Spermien zur in vitro Reifung der Spermien. Für diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden epididymale oder testikuläre Spermien in Serum-freier Ko-Kultur mit den erfindungsgemäßen Zellen eingesetzt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform richtet stellt die vorliegende Erfindung Screening-Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Steigerung oder Hemmung der Fruchtbarkeit des Mannes zur Verfügung, bei denen man die Aktivität der Wirkstoffe auf eine erfindungsgemäße immortalisierte Zellinie analysiert. Die Erfindung umfasst auch Screening-Verfahren zur Bestimmung der Toxizität von Wirkstoffen, bei denen man die Toxizität der Wirkstoffe auf eine erfindungsgemäße Zellinie bestimmt.

Halb- oder Vollautomatische Screening-Verfahren, die auch als HTS-Verfahren bezeichnet werden, werden üblicherweise auf Mikrotiter-Platten mit mindestens 96 Vertiefungen durchgeführt. Diese Screening-Verfahren ermöglichen es erstmals, die die Aktivität jedes Wirkstoffs einer Wirkstoff-Bibliothek, die beispielsweise mehr als 10³ Wirkstoffe, vorzugsweise mehr als 10⁴ Wirkstoffe, aufweisen kann, auf Zellen epididymalen Ursprungs zu bestimmen.

Die Screening-Verfahren werden vorzugsweise so durchgeführt, daß man in einem ersten Schritt die Aktivität der Wirkstoffe zur Steigerung oder Hemmung der Fruchtbarkeit des Mannes bestimmt und in einem zweiten Schritt die Toxizität der Wirkstoffe auf eine Zellinie bestimmt. Aus der Kombination der Daten lassen sich die Wirkstoffe mit der größten Aktivität und geringsten Toxizität ermitteln.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffes, bei dem man einen Wirkstoff mittels einem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren identifiziert und den Wirkstoff anschließend synthetisch oder rekombinant herstellt.

Schließlich betrifft die Erfindung Verfahren zur in-vitro Analyse der Aktivität eines Promotors, bei dem man ein Gen unter der Kontrolle des zu analysierenden Promotors in einer der erfindungsgemäßen Zellinien exprimiert. Verfahren zur in-vitro Analyse der Aktivität eines Promotors sind im Stand der Technik weit verbreitet. Die erfindungsgemäßen Zellinien ermöglichen erstmals die Durchführung dieser Analyse- und der oben beschriebenen Screening-Verfahren.

Die Erfindung wird im Folgenden durch Figuren und Beispiele erläutert.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Morphologie der IMCE-("immortalized canine epididymis")Populationen, durch Phasenkontrastmikroskopie dargestellt.

1. a)-f) Epitheloide Zell-Phänotypen, die in Monolayern wachsen, bei denen man die rhomboide, Kopfsteinpflaster-ähnliche Form (a, d, e, f: IMCE Nr. 3, 20, 28, 29) von der länglichen, spindelartigen Form (b, c: IMCE Nr. 7, 12) unterscheiden kann.
2. g)-h) Spindelförmige IMCE-Populationen Nr. 7 und 12, die auf Glasträgern wachsen, bilden Multilayer, Zyst- oder Tubulär- ähnliche Strukturen, die von dem Boden wegragen, und Adhäsions- unabhängig wachsen.

Fig. 2 Positive indirekte Cy2-Immunofluoreszenz der Cytokeratine beweist die epitheliale Herkunft der IMCE-Populationen.

1. a)-f) Cytoskeletale Filamente umgeben perinukleäre Regionen als Netzwerk bei IMCE Nr. 3, 7, 12, 20, 28 und 29.
2. Kryosektionen durch den caninen Corpus Epididymis zeigen, daß sich diese Cytokeratine auf das Epithel des epididymalen Duktus beschränken und dienten als Kontrolle. Der Maßstab stellt 54 µm dar.

Fig. 3 Lokalisierung von AR-Protein in IMCE-Linien Nr. 3, 7, 12, 20, 28 und 29, dargestellt mittels positiven Immunoperoxydase-staining. Eine Immunocytochemie von permeabilisierten Zellen unter Verwendung des PG21-polyklonalen Antikörpers (Prins et al. 1991), der gegen die N-therminalen 12 Aminosäuren des nukleären AR gerichtet ist, zeigte, daß sich die Färbung in den Zellnuklei konzentriert. Die Anzahl der untersuchten Populationen ist in der oberen linken Ecke dargestellt.

Fig. 4 RT-PCR-Analyse der AR-Transkripte in cDNA-Präparaten aus Gesamt-RNA von caninen epididymalem Gewebe der IMCE- Klone Nr. 3, 7, 12, 20, 28 und 29. AR-spezifische 380 bp-Amplifikate wurden in jeder Population identifiziert. Ep = canines epididymales Gewebe-Kontrolle; C = H₂O-Kontrolle; M = 100 Basenpaar-Leiter.

Fig. 5 RT-PCR-Analyse der Transkriptionsfaktoren PEA3, ERα und ERβ in cDNA-Präparationen von caninen Geweben und IMCE-Linien

a) Spalten 1-8: Ein 410-Basenpaar PEA3-spezifisches Amplifikat wurde in der caninen Epididymis und in den klonalen Zellinien erhalten, wenn auch in verschiedenen Mengen. 1 = Nr. 7, 2 = Nr. 12, 3 = Nr. 20, 4 = Nr. 28, 5 = Nr. 29, 6 = canine epididymale cDNA, 7 = PEA3 cDNA-Plasmidklon, 8 = epididymale cDNA vom Kaput der Ratte.
b) 950-Basenpaar ERα-spezifisches und 750-Basenpaar ERβ- spezifisches Amplifikat wurde in Kontrollgewebe (Spalte 9: Canines Ovar) und auch in verschiedenen IMCE-Populationen erhalten.

Fig. 6 Northern Blot-Analyse des CE-Expressionsmusters in Kurzzeit-Primärkulturen. Epididymale epitheliale Zellen wurden von Tag 0 bis Tag 4 von Kulturen mit (+A) und ohne (-A) Androgen-Supplementierung des Mediums gewonnen. Zwei Blots mit Gesamt-RNA (5 µg pro Spalte), die von parallelen Kulturen extrahiert worden war, wurden mit multiplen Proben hybridisiert. Die oberen zwei Tafeln zeigen die nachfolgenden Hybridisierungen eines Blots mit DIG-markierten CE-Proben, von denen jede gleichzeitig gegen zwei mRNAs gerichtet ist. CD1 dient als Kontrolle für gleiche Beladung und gleiches Blotten. Die drei unteren Tafeln zeigen den zweiten Blot nach nachfolgenden Hybridisierungen mit verschiedenen CE-Proben, wie angegeben. Dieser Blot wurde abschließend mit einer 18S-Kontrollprobe rehybridisiert, um gleichmäßiges Beladen und Blotten zu zeigen.

Fig. 7 Northern Blot-Analyse der CE1 und CE4 mRNA-Expression in 18 verschiedenen IMCE-Populationen (bezeichnet durch die Klonnummern). 5 µg pro Spalte Gesamt-RNA wurden geladen und die Blots wurden mit einer kombinierten CE1/CE4/DIG-markierten Probe hybridisiert. Verglichen mit epididymalen Gewebskontrollen und mit den frühen Primärkulturen (vgl. Fig. 6) waren die Mengen an CE1-mRNA reduziert, während die CE4-mRNA-Mengen stark angestiegen waren. 10 µg Gesamt-RNA wurden pro Spalte geladen.

Fig. 8 RT-PC-Analyse der IMCE-Klonen zur Bestimmung der CE5-mRNA-Expression. Ein klares CE5-spezifisches bp-Amplifikat wurde in cDNAs von allen IMCE-Populationen nach 30 Zyklen erhalten, während CE7-cDNA in den immortalisierten Zellen fast nicht detektierbar war. Maximale Mengen an CE5-cDNA wurden in IMCE Nr. 29 gefunden, schwache Banden derselben Größe wurden in cDNAs von IMCE Nr. 12 und 20 erhalten, aber die CE5-cDNA war in IMCE-Klonen Nr. 3, 7 und 28 nicht detektierbar.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung stabiler Zellinien a) Tiergewebe

Hunde-Epididymis wurden von örtlichen Tierarztpraxen erhalten, in denen Hunde aufgrund von Verhaltensstörungen kastriert worden waren. Epididymis von jungen, geschlechtsreifen und gesunden Mischlingen (2-4 Jahre alt) wurden für die Zellkulturexperimente ausgewählt. Die Gewebe wurden durch eine Operation entnommen, von anderem Gewebe abgetrennt, in DMEM-Medium (GIBCO- BRL, Eggenstein, Deutschland) bei Raumtemperatur überführt, wobei das DMEM 50 U/ml Penicillin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) und 50 µg/ml Streptomycin (Sigma) enthielt, und sofort zur Gewinnung von primären Zellkulturen wie unten beschrieben, bearbeitet. Kontroll-Epididymis wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren, entweder als gesamte Organe oder entsprechend der groben Morphologie aufgetrennt in Kaput, Korpus, Cauda und Vas-Regionen. Als Kontrolle wurde Hunde-Leber-Gewebe eingesetzt.

b) Primäre Zellkulturen

Die einzelnen Epididymis wurden sorgfältig von umgebendem Gewebe befreit, in kleine Stücke geschnitten und mit 10 U/ml Collagenase 2 (Sigma) zwei Stunden lang bei 37°C verdaut. Kleine Gewebefragmente wurden durch Sedimentierung gesammelt und in mit Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA, U.S.A.) oder mit Rinderhautcollagen (Cellon, Strassen, Luxemburg) beschichteten 6-Well-Platten bei einem Verhältnis von 500 mg frischem Gewebe pro Well ausplatiert. 24 Stunden später wurden das DMEM-Ausplatierungsmedium und alle nicht adherenten Zellen abgesaugt und die Primärkultur wurde in einer 1 : 4- Mischung von Ham's F12/DMEM ohne Phenolrot, Charcoal-Stripped Fetal Calf Serum (1% v/v FCS, PAA Laboratories, Linz, Austria), Penicillin (50 U/ml), Streptomycin (50 µg/ml), L-glutamin (2 mM), 8-Br-cAMP (5 µM), Transferrin (10 µg/ml), epidermale Wachstumsfaktor (10 ng/ml), Insulin (1 µg/ml), Hydrocortison (2 µg/ml), Retinol (1 µg/ml) und Selen (17 ng/ml), alle Bestandteile von Sigma kultiviert. Abhängig vom Experiment wurden Androgene in einer Mischung von 100 nM Testosteron (Sigma) + 100 nM Dihydrotestosteron (DHT, Sigma) hinzugefügt. Primäre Zellkulturen wurden routinemäßig bei 33°C inkubiert. Während Experimenten, die die Auswirkungen von Temperaturunterschieden betrafen, wurde eine Anzahl von Kulturwells zusätzlich bei 37°C inkubiert. Nach drei Tagen wurden geeignete Primärkulturen ausgewählt und einer retroviralen Infektion unterworfen.

c) Retrovirale Infektion

Die Zellkulturen wurden bis zu einer Confluenz von 80% wachsen gelassen, bevor die Viren hinzugegeben wurden. Um den Zellzyklus zu synchronisieren, wurden die Kulturen auf Raumtemperatur vor der Infektion abgekühlt. Zwei Helferzellstämme der Mausfibroblastenzellinie PA317 (Miller & Buttimone, 1986) Verpackungsretroviren pBABE-v-myc oder pZipSV40-6 (Morgenstern & Land, 1990a, b) wurden in Medium 199 (Sigma) mit 10% (v/v) FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 lU/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin aufgezogen. Bei einer Confluenz von 50% wurde das entsprechende Antibiotikum hinzugegeben (pBABE-v-myc Hygromycin; pZipSV40-6: Neomycin). Die retrovirale Infektion wurde wie beschrieben, durchgeführt (Brosens et al., 1996; Endocrinology, 137, 2225-31). Die Zellen wurden den Viren drei Tage lang ausgesetzt, wobei frische Viren etwa alle 12 Stunden hinzugefügt werden. Nur wenige Zellen, die mit pBABE-v-myc infiziert worden waren, überlebten die Viren, und die verbliebenen Zellen konnten nicht passagiert werden. Daher wurde das V-myc-Onkogen in den weiteren Experimenten nicht eingeschlossen.

d) Selektion transformierter Zellen

Nach der Infektion wurden die Zellen einer Antibiotika-Selektion unter Verwendung von G418 (GIBCO BRL) bei einer Konzentration von 1 mg/ml unterworfen. Von den überlebenden Kolonien wurden abtrennbare Einzelkolonien entnommen, dispergiert und in individuellen Petrischalen wachsen gelassen. Individuelle Kolonien wurden von zellulären Inseln dispergiert und bei einem Verhältnis von 1 : 0,3 in 96 Well-Platten zur klonalen Selektion platiert. Von diesen Platten wurde eine erste Auswahl von 50 Zellinien ausgewählt und in 6 Well-Platten im Kulturmedium, das 400 µg/ml G418 enthielt, wachsen gelassen. Bei einer zweiten Auswahl werden Zellinien, die den Phenotypen der primären Zellkultur ähnelten, ausgewählt, was letztendlich zu 6 individuellen Klonen führte, die detailliert auf zellulärer Ebene charakterisiert wurden. Elisa-Tests (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany) ergaben, daß diese Zellen bezüglich Mycoplasmen negativ waren. Die transduzierten Zellen wurden routinemäßig bei 37°C inkubiert, während Temperaturexperimenten wurde eine Anzahl von Zellkulturwells parallel bei 33°C inkubiert. Die Zellzahlen wurden durch Zellen unter Verwendung eines Hellichthematozytometers (Sigma) bestimmt.

Beispiel 2 Analyse der Zellen a) Lichtmikroskopie

Die Zellen wurden mindestens drei Tage lang auf unbeschichteten oder mit Matrigel beschichtenen Lab-Tek-4-Kammerplatten (Nung, Roskilde, Dänemark) wachsen gelassen. Primärkulturen der Hundeepididymis und 10 µm Kryoschnitte durch canines epididymales Gewebe aus dem Hund wurden als Kontrollen verwendet. Für die Immunozytochemie wurden die Zellen und Cryoschnitte wie kürzlich beschrieben (Pera et al. 1996, Endocrinology 137, 4451-4459; Kirchhoff et al., 2001, Cells Tissues Organs 168, 93-104) fixiert und permeabilisiert.

Die Phasenkontrastmikroskopie ergab, daß die transformierten Zellen die morphologischen Charakteristika von Zellen epithelialer Herkunft aufwiesen (Fig. 1), vergleichbar mit den ursprünglichen Primärkulturen. Während in verschiedenen permanenten Populationen die einzelnen Zellen wie Kopfsteinpflastersteine aussahen und einen sehr dichten Monolayer bildeten, wurde eine mehr spindelartige Zellform in anderen Populationen beobachtet, die weniger dicht wuchsen (Fig. 1). Allerdings erreichten die meisten der permanenten Zellpopulationen beträchtlich höhere Sättigungszelldichten als die Primärkulturen. Die Mehrzahl der transformierten Populationen erreichte nach 15 Wochen kontinuierlicher Kultur 45 Passagen ohne Zeichen von Senilität oder anderen Krisen. Abhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von rekonstruierter Basalmembran auf dem Boden der Kulturwells wuchsen die spindelförmigen Zellpopulationen in einer Retikulum- ähnlichen Art und Weise und bildeten nach drei bis fünf Tagen eventuell Multilayer, Zyst- oder Tubuliartige Strukturen, die sich vom Boden ablösten (Fig. 1).

b) Immunocytochemie und Lichtmikroskopie

Für den Nachweis des nukleären AR-Proteins wurde der polyklonale Antikörper PG21 (Prins et al., 1993) bei einer Verdünnung von 1 : 100 oder 1 : 200 verwendet (etwa 1-2 µg/ml). Intermediäre Cytokeratin-Fillamente wurden unter Verwendung des Hasenpolyklonalen Antikörpers Z622 (Dako, Hamburg, Deutschland) bei Verdünnungen von 1 : 500 bis 1 : 1000 angefärbt. Der polyklonale EPV20 Antikörper aus dem Kaninchen (zur Verfügung gestellt von Dr. Lottelarsen, Universität Aarhus, Dänemark) wurde bei einer Verdünnung von 1 : 1000 verwendet, der gegen Aktin gerichtete monoklonale Antikörper A2547 von Sigma wurde bei einer Verdünnung von 1 : 500 verwendet. Normale Kaninchen-IgG bei vergleichbaren Verdünnungen wurden als Kontrolle für den zweiten Antikörper verwendet.

6 Zellinien, IMCE Nr. 3, 7, 12, 20, 28 und 29 wurden für eine genaue Untersuchung mittels Cytokeratin-Immunocytochemie ausgewählt. Ihre epithetiale Abstammung wurde durch positive indirekte Immunofluoreszenz für epithetiale Cytokeratine bestätigt (Achtstätter et al., 1985, J. Histochem, Cytochem. 33, 415-26), die die perinukleäre Region der Zellen als ein fillamentöses Netzwerk umrundeten (Fig. 2). Gleichzeitig waren diese Populationen negativ für α-Aktin aus der glatten Muskulatur (Daten nicht gezeigt).

Verglichen mit den originären primären epididymalen Zellen zeigten die transformierten Zellen erhöhte Wachstumsraten. Da die Wachstumseigenschaften der primären Zellen durch Temperatur beeinflußt wurden (Pera et al. 1996, Endocrinology 137, 4451-4459), wurde die Proliferation der transformierten Zellen bei den verschiedenen Kulturtemperaturen von 33°C und 37°C untersucht. Die IMCE-Klone Nr. 20 und 28 wurden als ein Beispiel von spindelförmigen und kopfsteinpflasterförmigen Zelltypen ausgewählt (siehe Fig. 1). Bei einer Temperatur von 33°C betrugen die Verdopplungsraten der Population von 18-20 Stunden für den kopfsteinpflasterartigen Typ von IMCE Nr. 28 und von 28-30 Stunden für den spindelförmigen Zelltypen von IMCE Nr. 20. Bei einer Kulturtemperatur von 37°C waren die Wachstumsraten dramatisch erhöht, im Bereich von 8-10 Stunden für IMCE Nr. 28 bis etwa 16-18 Stunden für IMCE Nr. 20.

Unter Verwendung des PG21 polyklonalen Antikörpers (Prinz et al., 1991, Endocrinology, 129, 3187-3199) wurde bei primären Monolayern von epididymalen Zellen aus dem Hund kürzlich gezeigt, daß diese für nukleären Androgenrezeptor (AR) positiv sind (Pera et al. 1996, Endocrinology, 137, 4451-4459). Eine Immunoperoxidaseanfärbung der ausgewählten IMCE-Klone Nr. 3, 7, 12, 20, 28 und 29 zeigte die Gegenwart von nukleärem AR auch in transformierten Zellen (Fig. 3). Wie erwartet, wurde die größte Menge an immunoreaktiven AR-Proteinen in den Zellnuklei detektiert. Eine Supplementierung des Mediums mit Androgen oder dessen Entfernung von dem Kulturmedium beeinflußt nicht die Intensität oder Verteilung von immunoreaktivem AR in den Zellen. Die Muster und die Identitäten des Immuno-Stainings variierten allerdings signifikant zwischen verschiedenen Zellpopulationen (Fig. 3), wobei der Kopfsteinpflaster-geformte IMCE-Klon Nr. 28 die stärkste nukleäre Färbung zeigte. Die Expression des androgenen Rezeptors wurde durch RT-PCR-Analyse der caninen AR-mRNA (Genbankzugangsnummer: AF197950) in den IMCE-Linien Nr. 3, 7, 12, 20, 28 und 29 bestätigt (Verfahren siehe unten). RNA-Präparationen, die von caninem epididymalen Gesamtgewebe und von Tag 6 primären Zellmonolayern extrahiert worden waren, wurden als Kontrolle eingeschlossen (Fig. 4). Wiederum ergaben sich keine signifikanten Unterschiede bei den AR-mRNA-Mengen in den RNA- Extrakten von Zellen, die mit oder ohne Androgene in ihrem Kulturmedium wachsen gelassen wurden.

c) RT-PCR-Analyse anderer epididymaler Transkriptionsfaktoren

Zur RNA-Extraktion wurde das Medium vorsichtig von den Zellkulturen entfernt, und die Zellen wurden entweder in 1 ml well chaotrope Tristar™-Lösung (AGS, Heidelberg, Deutschland), oder entsprechend den Vorschriften des Herstellers für das RNA-Easy System (Quiagen, Hilden, Deutschland) lysiert. Gesamt-RNA-Mengen wurden photometrisch geschätzt, und gleiche Mengen wurden einer Northern Blot-Analyse unterworfen (Pera et al., 1996, Endocrinology, 137, 4451-4459). Kurz dargestellt wurden 5 bis 10 µg Gesamt-RNA pro Spalte, abhängig vom Experimenttyp, durch denaturierende Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Hybond N+ Nylonmembranen überführt (Amersham, Braunschweig, Deutschland). Gleiche Beladung wurde durch Anfärben der Gele mit Ethidiumbromid vor dem Blotten sichergestellt. Digoxigenin (DIG)-markierte cDNA-Proben wurden durch PCR-Amplifikation gereinigter cDNA-Fragmente entsprechend den Instruktionen des Lieferanten (Boehringer, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Komplementäre DNA wurde von 2-5 µg Gesamt-RNA-Extrakten aus Gewebe oder Zellen entsprechend dem Gene Script-Protokoll (Genecraft, Münster, Deutschland) in Gegenwart von 0,5 M Betain (Sigma) bei 23°C 10 Minuten lang synthetisiert, gefolgt durch eine 30-minütige Inkubation bei 42°C. Die Sequenzen aller Primerpaare, die in der RT-PCR verwendet wurden, waren wie in Tabelle 1 gezeigt. Die PCRs für die AR, PER3 und ER wurden mit einem Touchdown-Programm durchgeführt, bei dem die Temperatur von 64°C auf 56°C abnahm. Die Amplifikate wurden aufgetrennt und auf einem 1%igem TAE Agarose/Ethidiumbromidgel sichtbar gemacht. Die Identität der Inserts wurde durch Sequentierung bestätigt (MWG-Biotech).

Um zu bestimmen, ob zusätzliche Transkriptionsfaktoren, die in epididymisspezifische Genexpression involviert sind, durch die permanenten Populationen exprimiert wurden, wurden RT-PCR- Analysen in den IMCE-Linien Nr. 3, 7, 12, 20, 28 und 29 unter Verwendung von Oligonukleotide-Primerpaaren, die spezifisch für mRNAs sind, die den PEA3-Transkriptionsfaktor kodieren (Xin et al. 1992, Genes. Dec. 6, 481-496), und die Östrogenrezeptoren ERα (White et al., 1987, Mol. Endocrinol. 1, 735-744) und ERβ (Walter et al., 1999, Mol. Cell. Endocrinol. 152, 37-45) durchgeführt. Da die caninen homologen cDNA-Sequenzen dieser Transkriptionsfaktoren nicht in den Datenbanken zu finden waren, wurden Primersequenzen für die PCR-Amplifikation ausgewählt, die aus evolutiv hochkonservierten Regionen stammen (Tabelle 1). cDNAs, die von Gesamt-Hundepididymis und Rattenkaputfragmenten hergestellt worden waren, wurden als positive Kontrollen während der Amplifikation von PEA3-cDNA, cDNA von caninen Epididymis und Ovarien während der Analyse von ERα- und ERβ-cDNAs eingeschlossen. Alle IMCE-Linien waren klar positiv für PEA3, aber unterschieden sich in ihrem Status bezüglich ERα und ERβ (Fig. 5). Die Identität der amplifizierten cDNA-Fragmente wurde durch Sequenzanalyse bestätigt (Daten nicht gezeigt).

d) Expression spezifischer Genprodukte in primären und transformierten epididymalen Zellen

Northern Blot-Analysen wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die primären Zellkulturen, die denjenigen entsprechen, die für die Immortalisierung verwendet wurden, ihre Fähigkeit behalten hatten, CE-mRNAs herzustellen, die spezifisch für den nativen, sexuell reifen caninen epididymalen Duktus in vivo sind. DIG-markierte cDNA-Hybridisierungsproben für 8 epididymisspezifische mRNAs epithelialer Herkunft wurden in der Analyse verwendet, d. h. CE1, CE4, CE5/CE52 (Ellerbrock et al., 1994, Int. J. Androl. 17, 314-323), CE7/GPX5 (Beigelböck et al., 1998, J. Repod. Fertil. 112, 357-367), CE8, CE9, CE10 (Gebhardt et al., 1999, J. Reprod. Fertil., 116, 391-402) und CE12 (Saalmann et al., 2001, Mol. Reprod. Develop. 58, 88-100). Von diesen ist für die CE1- und CE4-mRNAs bekannt, daß sie durch das Epithelium des Duktus in nahezu allen Teilen der caninen Epididymis transkribiert werden (Pera et al., 1994, Int. J. Androl. 17, 324-330), während die anderen ein starkes und unterschiedliches Regionalisierungsmuster entlang der Länge des epididymalen Duktus zeigten (Beigelböck et al., 1998, J. Repod. Fertil. 112, 357-367; Gebhardt et al., 1999, J. Reprod. Fertil., 116, 391-402; Saalmann et al., 2001, Mol. Reprod. Develop. 58, 88-100). CE1-, CE4-, und CE5-mRNAs wurden in den Kurzzeit-primären Zellkulturen exprimiert (Fig. 6). Nach einer Langzeitkultur und Zellpassage waren allerdings nur CE1- und CE4-mRNAs im Northern Blot detektierbar (nicht gezeigt).

Die Mengen der anderen CE-mRNAs waren in vitro nicht stabil, aber nahmen schnell mit unterschiedlichen Halbwertszeiten ab. Die Abnahme der meisten der CE-mRNA-Mengen begann bereits nach 2 Tagen primärer Kultur, sobald die Gewebsexplantate adhäriert hatten und die Zellen sich auf dem Substrat verteilten, um einen Monolayer zu bilden. Keine offensichtlichen Unterschiede wurden zwischen Zellkulturen beobachtet, die in der Gegenwart oder Abwesenheit von Androgenen in dem Kulturmedium wachsen gelassen wurden (Fig. 6). Außerdem, während eine erhöhte Zellkulturtemperatur von 37°C die Halbwertszeit mancher der CE-mRNAs beeinflußte (am deutlichsten ausgeprägt mit CE5 und CE10), führte dies nicht zu einer Veränderung im Gesamtmuster der mRNA- Abnahme (Daten nicht gezeigt).

Alle permanenten Zellpopulationen, bei denen eine Northern Blot-Analyse durchgeführt worden war, exprimierten CE1- und CE4- mRNAs in detektierbaren Mengen (Fig. 7). Verglichen mit dem nativen Gewebe und mit frühen Primärkulturen (Fig. 6) waren allerdings die Mengen an CE1-mRNA reduziert, während die Mengen an CE4-mRNA stark zugenommen hatten. Die Expression der beiden mRNA-Typen schien leicht zwischen individuellen IMCE-Linien zu variieren (Fig. 7). Androgene Stimulation der Zellen (durchgeführt für IMCE-Klon Nr. 38 für 4, 8 und 24 Stunden) ergab allerdings keine Auswirkung auf CE1- oder CE4-mRNA-Mengen (Daten nicht gezeigt). In Übereinstimmung mit unseren vorherigen Studien in primären epididymalen Zellen (Pera et al., 1996) zeigten Temperaturshiftexperimente (durchgeführt für IMCE Nr. 20 und 28) auch keine signifikante Auswirkung auf CE1- oder CE4-mRNA (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung von polyklonalem EPV20-Antiserum (Larsen et al., 1992), das gegen das murine Gegenstück des HE1-Proteins gerichtet ist, wurde die Gegenwart von HE1-verwandtem Antigen in den IMCE-Klonen immunocytochemisch bestätigt (nicht gezeigt). Interessanterweise ergab unter gesättigten Bedingungen die sensitivere Analysetechnik der RT-PCR auch eine Expression von CE5/CD52-mRNA in allen Populationen (Fig. 8). Wurde die PCR für die CE-Transkripte mit den oben erwähnten Primern und ein 1 U Biotherme Taq Polymerase (Genecraft) in einem Touchdown-PCR-Programm durchgeführt, bei dem die Annealing-Temperatur von 61°C auf 51°C abnahm. SEQUENZPROTOKOLL

Tabelle 1 Primerpaare, die bei der RT-PCR Analyse und bei der Herstellung nicht-radioaktiver Proben verwendet wurden

Claims

1. Immortalisierte Zellinie epididymalen Ursprungs, erhältlich durch Immortalisierung von Primärkulturen epididymaler Zellen eines Säugetiers.

2. Immortalisierte Zellinie gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Primärkultur aus Zellen des Epithels des epididymalen Duktus gewonnen wurde.

3. Immortalisierte Zellinie gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von Menschen, Mäusen, Ratten, Schweinen oder Hunden stammen.

4. Immortalisierte Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen differenzierte Zellen vom adulten Säugetier sind.

5. Immortalisierte Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen differenzierte Zellen von adulten Menschen oder Hunden sind.

6. Immortalisierte Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in Primärkultur polar wachsen.

7. Immortalisierte Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie durch Transduktion mit dem Large T-Antigen des SV40 immortalisiert wurde.

8. Immortalisierte Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie epitheliale Cytokeratine, nuklearen Androgen-Rezeptor, PEA3-Transkriptionsfaktor, CE1, CE4 und/oder CE5/CE52 exprimiert.

9. Immortalisierte Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie CE1 und CE4 exprimiert.

10. Immortalisierte Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen caninen Ursprungs sind und aus der Gruppe bestehend aus DSM ACC 2499, DSM ACC 2500, DSM ACC 2501, DSM ACC 2502, DSM ACC 2503 und DSM ACC 2504 ausgewählt wurden.

11. Verfahren zur Immortalisierung von Zellen epididymalen Ursprungs, bei dem man epididymale Zellen eines Säugetiers gewinnt, daraus Primärkulturen anlegt und diese immortalisiert.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem man Zellen vom Epithel des epididymalen Duktus gewinnt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, bei dem man Zellen von Menschen, Mäusen, Ratten, Schweinen, oder Hunden gewinnt.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, bei dem man differenzierte Epithelzellen des epididymalen Duktus vom adulten Säugetier gewinnt.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, bei dem man differenzierte Epithelzellen des epididymalen Duktus von adulten Menschen oder Hunden gewinnt.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, bei dem man Zellen immortalisiert, die in Primärkultur polar wachsen.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16, bei dem man die Zellinie durch Transduktion mit dem Large T-Antigen des SV40 immortalisiert.

18. Verwendung einer Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Steigerung oder Hemmung der Fruchtbarkeit des Mannes.

19. Verwendung der Zellinien gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Analyse der Funktion der Epididymis.

20. Screening-Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen für die Steigerung oder Hemmung der Fruchtbarkeit des Mannes, bei dem man die Aktivität der Wirkstoffe auf eine Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 analysiert.

21. Screening-Verfahren zur Bestimmung der Toxizität von Wirkstoffen, bei dem man die Toxizität der Wirkstoffe auf eine Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 analysiert.

22. Screening-Verfahren gemäß Anspruch 20 oder 21, bei dem man Zellen der Zellinie in einer Mikrotiter-Platte mit mindestens 96 Vertiefungen zieht.

23. Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, bei dem man die Aktivität jedes Wirkstoffs einer Wirkstoff-Bibliothek mit mehr als 103 Wirkstoffen auf die Zellen einer Zellinie bestimmt.

24. Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 23, bei dem man in einem ersten Schritt die Aktivität der Wirkstoffe zur Steigerung oder Hemmung der Fruchtbarkeit des Mannes bestimmt und in einem zweiten Schritt die Toxizität der Wirkstoffe auf eine Zellinie bestimmt.

25. Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24, bei dem man die Wirkstoffe mit der größten Aktivität und geringsten Toxizität ermittelt.

26. Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffes, bei dem man einen Wirkstoff mittels eines Screening-Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 20 bis 25 identifiziert und den Wirkstoff anschließend synthetisch oder rekombinant herstellt.

27. Verfahren zur in-vitro Analyse der Aktivität eines Promotors, bei dem man ein Gen unter der Kontrolle des zu analysierenden Promotors in einer Zellinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 exprimiert.