DE69721731T2

DE69721731T2 - Immortalisierte menschliche prostata-epithelzellen und klone und ihre verwendungen zur untersuchung und therapie von prostata-krebs

Info

Publication number: DE69721731T2
Application number: DE69721731T
Authority: DE
Inventors: L. Suzanne TOPALIAN; Marston W. Linehan; K. Robert BRIGHT; D. Cathy VOCKE
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1997-01-30
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2017-01-31
Also published as: AU7749398A; EP0877798B1; US6982168B1; JP2000506379A; EP0877798A1; DE69721731D1; ATE239781T1; CA2245099A1; JP2006122052A; WO1997028255A1; AU755554B2; CA2245099C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft unsterbliche, maligne, menschliche, adulte epitheliale Prostatazelllinien. Die Erfindung betrifft auch einzelne Zellklone dieser Linien. Die Erfindung betrifft weiterhin unsterbliche, maligne, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinien und Klone, die charakterisiert sind durch Analyse des allelischen Verlusts der Heterozygotie. Im Besonderen betrifft die Erfindung Paare autologer, normaler und maligner epithelialer Prostatazelllinien und Klone und ihre Anwendungen in der Forschung. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Zellen in der Diagnose und Behandlung von Prostatakrebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Schwierigkeiten in der Etablierung von humanen Langzeit-Prostatakrebszelllinien in vitro haben Fortschritte hinsichtlich des Verständnisses der Tumorentstehung und der Entwicklung neuer Therapien für Prostatakrebs erschwert. Bislang haben nur vier Prostatakrebszelllinien, die aus metastatischen Läsionen initiiert wurden, die Grundlage geschaffen für die Mehrzahl an in vitro-Experimenten, die die biologischen und molekularen Vorgänge betreffen, die die Entstehung von Tumoren der Prostata regulieren. Dementsprechend gibt es einen sehr großen Bedarf für die Forschung, die Diagnose und die Therapie für etablierte Langzeit-Prostatakrebszellkulturen.
Unter der männlichen Bevölkerung in den Vereinigten Staaten hat sich Prostatakrebs in den letzten Jahren als die am häufigsten diagnostizierte Krebsvariante entwickelt. Allein für dieses Jahr wird die Zahl der auftretenden Prostatakrebsfälle auf nahezu 300 000, mit über 40 000 Todesfällen, geschätzt, was zu einer Krebssterblichkeitsrate führt, die an zweiter Stelle hinter der Sterblichkeitsrate für Lungenkrebs liegt (1). Obwohl die durch Prostatakrebs verursachte Sterblichkeit im Allgemeinen eine Folge der metastatischen Erkrankung ist, haben nahezu 60% der neu diagnostizierten Patienten örtlich lokalisierbare Muttergeschwülste. Chirurgische Maßnahmen und Strahlentherapie sind oftmals wirkungsvoll in der Behandlung der örtlich lokalisierten Erkrankung, aber die ausstrahlende metastatische Erkrankung ist weitestgehend nicht behandelbar. Trotz erheblicher wissenschaftlicher Bemühungen ist immer noch relativ wenig bekannt über die biologischen Vorgänge, die den Ursprung und den Verlauf von Prostatakrebs verursachen. Die Entwicklung neuer Strategien für die Behandlung des Adenokarzinoms der Prostata erfordert ein zunehmendes Verständnis der zellulären und molekularen Vorgänge, die an der Entstehung von primärem Prostatakrebs und seiner metastatischen Entwicklung beteiligt sind.
Vier humane Prostatakarzinom-Zelllinien (LNCaP, DU145, PC-3, TSU-Pr1), die auf metastatische Läsionen zurückzuführen sind, haben die Grundlage geschaffen für die überwiegende Anzahl an in vitro-Experimenten betreffend Prostatakrebs. Erhebliche Fortschritte sind gemacht worden bezüglich der in vitro-Kultivierung von Kurzzeit-Linien von primären (nicht metastatischen) Prostatakarzinomen. Diese Fortschritte beinhalteten die Entwicklung von Kulturmedien und Verbesserungen in der Vorbereitung frischen Gewebes und epithelialen Prostata-Zellkultur-Techniken (3, 4). Die Etablierung und das Aufrechterhalten von Langzeithumanen epithelialen Prostata-Zelllinien von primären Tumoren konnte in Abwesenheit des Unsterblichmachens von Zellen in vitro nicht erfolgreich durchgeführt werden. Diesbezüglich gibt es nur wenige Berichte, die Langzeit-unsterbliche Zelllinien beschreiben und diese Berichte beschränkten sich auf normale epitheliale Prostatakulturen (5, 6, 7, 8). Transformation mit HPV Typ 18-DNA von aus normalem Gewebe und Tumorgewebe gewonnenen humanen epithelialen Prostatazellen, die infolgedessen unsterblich wurden, sind von von Weijerman, et al. (Cancer Res., 1994, 54: 5579–5583) beschrieben worden. Die WO95/29994 betrifft humane Prostatazelllinien, die mit einem Adenovirus 12-Affenvirus 40 (AD12/SV40)-Hybridvirus unsterblich gemacht wurden. Die WO95/29990 beschreibt das Unsterblichmachen von humanen epithelialen Prostatazelllinien mit der DNA des humanen Papillomavirus (HPV). Folglich war es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, zuverlässige Methoden zu entwickeln, um fortwährend proliferierende Prostatakarzinom-Zelllinien aus primären Tumoren zu generieren.
Neben den Schwierigkeiten in der Etablierung unsterblicher epithelialer Prostata-Zelllinien gibt es Probleme, kultiviertes Prostatakarzinom von normalen epithelialen Zellen zu unterscheiden. In der Vergangenheit hat die zytogenetische Beurteilung von multiplen kurzzeitepithelialen Prostata-Zellkulturen gezeigt, dass die Mehrzahl aller Linien, die von lokalisierten Prostatakarzinomen generiert wurden, einen normalen männlichen Karyotyp zeigten (9, 10, 11). Dies, zusammen mit der unauffälligen mikroskopischen Morphologie von Kurzzeitkulturen, sowie der Mangel an Erfolg mit Xenotransplantation, hat die genaue Identifizierung und Charakterisierung von humanen primären Prostatakarzinom-Zelllinien sehr erschwert.
Man nimmt an, dass das Entstehen von Prostatakrebs das Ergebnis von mehreren genetischen Veränderungen innerhalb der Zelle darstellt, und auch die Inaktivierung von potentiellen Tumor-Suppressor-Genen, was sich äußert durch allelische chromosomale Deletionen, mit einschließt (Übersicht in 12). Frühe Untersuchungen über chromosomale Deletionen in frischen (nicht in Kultur gehaltenen) primären Prostatakarzinom-Proben zeigten allelischen Verlust der Heterozygotie (LOH) auf Chromosomen 10q und 16q (13, 14, 15). Nachfolgende Studien zeigten einen bemerkenswert hohen Prozentsatz an allelischem Verlust auf dem kurzen Arm des Chromosoms 8. Somit wurde Chromosom 8p ein wahrscheinlicher Kandidat für die Lokalisierung von mit Prostatakarzinom assoziierte Tumor-Suppressor-Gene (16, 17, 18). Weiterhin zeigte die kürzlich vorgenommene Untersuchung von 99 mikro-sezierten Tumoren (19) und 54 mikrosezierten PIN-Läsionen (20) für LOH auf dem kurzen Arm des Chromosoms 8p deutliche Hinweise auf die Inaktivierung von Tumor-Suppressor-Genen (oder eines Tumor-Suppressor-Gens) auf Chromosom 8p12–21 im Vergleich zu gleichen Normalkontrollen. Dementsprechend repräsentiert die Untersuchung von LOH innerhalb dieser minimalen Deletionsregion auf Chromosom 8p12–21 eine potentiell wirksame alternative Methode für die Identifizierung und Charakterisierung von humanen epithelialen Prostata-Zelllinien, die sich von primären Tumoren herleiten.
Die vorliegende Erfindung betrifft die erfolgreiche Generierung und einzigartige genetische Charakterisierung von multiplen unsterblichen humanen Tumorzelllinien, die sich von primären Adenokarzinomen der Prostata ableiten.
ZUSAMMENFASSUGN DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung, das Unsterblichmachen und die Charakterisierung von Langzeit-humanen epithelialen Zelllinien, die sich von kanzerogenem Prostatagewebe herleiten, sowie die potentiellen Anwendungen dieser Zelllinien in der Erforschung und zur Therapie von Prostatakrebs. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung epithelialer Prostata-Zelllinien mit unbeschränktem Proliferationspotential maligner Proben.
Die Zelllinien der vorliegenden Erfindung sind nützlich als Modelle in Untersuchungen zur Onkogenese von epithelialen Zellen. Beispielsweise sind die unsterblich gemachten epithelialen Prostata-Zelllinien der vorliegenden Erfindung im Besonderen nützlich, um die Tumorentstehung von Prostatakrebs zu verstehen. Die vorliegende Erfindung betrifft unsterblich gemachte, gutartige adulte Prostata-Zelllinien für die Verwendung in Kombination mit unsterblich gemachten, autologen malignen adulten Prostata-Zelllinien als Reagenzien, um die genetischen Vorgänge zu definieren, die vom gutartigen zum malignen zellulären Phänotyp führen, und ermöglicht die Erforschung der Rolle von Heredität in Prostatakrebs.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte, unsterblich gemachte maligne, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie. Die Erfindung betrifft ferner eine klonierte, unsterblich gemachte maligne adulte epitheliale Prostata-Zelllinie, die gekennzeichnet ist durch mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie (LOH). Die Erfindung betrifft ferner eine klonierte, unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostata-Zelllinie, die gekennzeichnet ist durch einen Verlust von einem oder mehreren Allelen auf Chromosom 8p.
Die Zelllinien der Erfindung können verwendet werden in einer Methode, um ein vorgewähltes Protein herzustellen, und einer Methode, um Proteine, die epithelialen Zellen entstammen, herzustellen. Beispielsweise sind die Zelllinien der Erfindung geeignet zur Isolierung von malignen Prostata-assoziierten Proteinen, die als Marker für die Diagnose oder als Ziele für die Immuntherapie dienen könnten. In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Methode für die Herstellung von Proteinen bereitgestellt, umfassend die Schritte des In-Kultur-Haltens der epithelialen Zelllinien der vorliegenden Erfindung und des Sammelns eines oder mehrerer Proteine, die von den neuen Zellen hergestellt werden. Die Identifizierung der Gene, die für diese Proteine kodieren, nach üblichen Verfahren, gestattet die Konstruktion von rekombinanten Vektoren zur Herstellung des Proteins oder Teilen davon in großem Maßstab.
Die Zelllinien der vorliegenden Erfindung eignen sich auch zum Testen der Wirkung von Arzneistoffen gegen Prostatakrebs in vitro, z. B. Chemotherapeutika, biologische „response" Modifier oder genetische Reagenzien wie Antisense-Oligonukleotide.
Die Zelllinien der vorliegenden Erfindung sind auch geeignet als Ganzzell-Impfstoff, um das Wiederauftreten von Prostatakrebs zu behandeln oder zu verhindern. Der gesamte Zellimpfstoff kann verabreicht werden in seiner nativen Form, in Kombination mit Adjuvanzien oder als durch Transgene modifiziert, welche beispielsweise für verschiedene Cytokine, Chemokine, Adhäsionsmoleküle oder MHC-Moleküle kodieren.
Die Zelllinien der vorliegenden Erfindung sind auch therapeutisch nützlich als Stimulanzien, um prestatakrebsreaktive Antikörper oder Immunzellen des peripheren Blutes oder der Lymphknotenzellen für die Verabreichung an Prostatakrebs-Patienten zu generieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch unsterbliche Prostata-Zelllinien für die Anwendung in der molekularen Klonierung von malignen prostataassoziierten Antigenen, die vom Immunsystem erkannt werden. Diese Antigene werden dann zu rekombinanten Vakzinen entwickelt, die für die Prävention oder Heilung von Prostatakrebs bestimmt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine oder mehrere unsterbliche Zelllinien der Erfindung sowie pharmakologische, therapeutische und diagnostische Anwendungen für die unsterblichen Zelllinien und pharmakologischen Zusammensetzungen, die Letztere umfassen.
Diese und andere Ziele der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den Zeichnungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B. Morphologische Eigenschaften und Wachstumseigenschaften einer unsterblichen epithelialen Prostata-Zelllinie. (1A) Das Unsterblichmachen mit dem Retro-Virus LXSNI6E6E7 war nötig, um die fortwährende Proliferation der Kultur 1510-CP, die sich von einer Prostatakarzinom-Probe herleitet, zu erreichen. Zellen wurden transduziert (1510-CPTX) oder nicht transduziert (1510-CPNV) bei Kulturpassage 3, und die Proliferation in Platten mit 24 Näpfchen wurde entsprechend bei Passagen 10 und 5 überprüft. (1B) Photomikrograph von 1510-CPTX nach 10 Kulturpassagen (200 x, Phasenkontrast). Das Aussehen dieser Kultur ist typisch für andere epitheliale Prostata-Zelllinien, die aus gutartigen oder bösartigen Proben generiert worden sind.
2. Expression von PSA durch gutartige und maligne epitheliale Prostatazellen in situ. Ein in Paraffin eingebetteter Gewebeschnitt aus einer radikalen Prustatektomie-Probe des Patienten 1510 enthält sowohl Bereiche mit invasivem Prostatakrebs (einzelner Pfeil) als auch mit normalem prostatischem Epithel (Doppelpfeile). Dunkle Pigmentierung deutet auf die Bindung eines anti-PSA-monoklonalen Antikörpers hin. Während PSA-Expression von normalen prostatischen epithelialen Zellen intensiv und homogen ist, ist die Expression durch Krebszellen schwach und heterogen. Dazwischenliegende Stromazellen exprimieren PSA nicht (200 x).
3. Die Genkarte des Chromosoms 8p, die die relative Lage des Mikrosatelliten-Markers identifiziert, der für die Analyse des Verlustes der Heterozygotie verwendet wird.
4. PCR-Analyse des Mikrosatelliten D8S136 von frischen und kultivierten Zellen des Patienten 1542. Spur 1, 1542-NPTX, Passage 26. Spur 2, frischer mikro-sezierter Tumor #11. Spur 3, nicht-kloniertes 1542-CP₃TX, Passage 21. Spuren 4–6, Tumorklone 1542-CP₃TX.8.1, 1542-CP₃TX.8.3 und 1542-CP₃TX.8.4 aus der 8. Passage von 1542-CP₃TX.
5A–5F. IFN-γ induziert die erhöhte Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I- und II-Molekülen auf 1542-CP₃TX. Nicht behandelte 1542-CP₃TX-Zellen exprimierten eine mäßige Anzahl an Klasse-I-Molekülen (Färbung mit mAb W6/32) (5A), exprimierten jedoch keine nachweisbaren Mengen an Klasse-II-Molekülen (mAb L243) (5B). Nach Kontakt mit IFN-γ 500 U/ml für 3 Tage erhöhte sich die Klasse-I-Expression (5C) und Klasse-II-Expres sion wurde induziert (5D). MHC-Expression von autologen EBV-transformierten B-Zellen ist als Vergleich gezeigt (5E und 5F).
DETAILLIERTE BESCHRIEBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung, das Unsterblichmachen und die Charakterisierung von humanen, adulten, epithelialen Prostata-Zelllinien und Klone, hergeleitet aus einer Anzahl von frischen chirurgischen Proben, einschließlich normaler Prostata- und Prostatakrebszelllinien, sowie ihre mögliche Anwendbarkeit in Forschung und Therapie.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner unsterbliche Zelllinien und Klone von Zelllinien und pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine oder mehrere der Zelllinien, sowie ihre Verwendung als pharmazeutisch aktive Wirkstoffe.
Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung sowohl Zelllinien von unsterblichen, malignen; adulten epithelialen Prostata-Zelllinien als auch gleiche autologe unsterbliche maligne und normale adulte epitheliale Prostata-Zelllinien. Die unsterblich gemachten epithelialen Prostata-Zelllinien werden hier bezeichnet als 1510-CP (Karzinoma Prostata), 1510-NP (Normal-Prostata), 1512-CP, 1519-CP, 1532-NP (1532-NP, bezeichnet als 1532-NPTX, hinterlegt am 2. Februar 1996 bei derATCC, Hinterlegungsnummer CRL-12036), 1532-CP1, 1532-CP2 (1532-CP2, bezeichnet als 1532-CP2TX, hinterlegt am 2. Februar 1996 bei der ATCC, Hinterlegungsnummer CRL-12038), 1535-NP (1535-NP, bezeichnet als 1535-NPTX, hinterlegt am 2. Februar 1996 bei der ATCC, Hinterlegungsnummer CRL-12039), 1535-SV(Samenblase), 1535-CP1 (1535-CP1, bezeichnet als 1535-CP1TX, hinterlegt am 2. Februar 1996 bei der ATCC, Hinterlegungsnummer CRL-12041), 1535-CP2, 1542-NP (1542-NP, bezeichnet als 1542-NPTX, hinterlegt am 2. Febraur 1996 bei der ATCC, Hinterlegungsnummer CRLK-12040), 1542-SV, 1542-CP1, 1542-CP2 und 1542-CP3 (1542-CP3, bezeichnet als 1542-CP3TX, hinterlegt am 2. Februar ,1996 bei der ATCC, Hinterlegungsnummer CRL-12037).
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner klonierte, unsterblich gemachte maligne epitheliale Prostata-Zelllinien. Im Weiteren betrifft die Erfindung diese Klone, die dadurch charakterisiert sind, dass sie mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie (LOH) besitzen.
In einer Ausführungsform ist die klonierte, unsterblich gemachte maligne humane adulte epitheliale Prostata-Zelllinie dadurch charakterisiert, dass sie einen Verlust der Heterozygotie an einem oder mehreren Genorten auf Chromosom 8p besitzt. In einer weiteren Ausführungsform besitzt die klonierte unsterblich gemachte maligne epitheliale Prostata-Zelllinie einen oder mehrere allelische Verluste der Heterozygotie am Genort 12 bis 21 auf Chromosom 8p.
In einer besonderen Ausführungsform ist die klonierte, unsterblich gemachte maligne humane adulte epitheliale Prostata-Zelllinie gekennzeichnet durch einen Verlust der unteren Allele von D8S133, D8S136 und D8S131. Die klonierte, unsterblich gemachte Zelllinie besitzt die identifizierenden Eigenschaften einer klonierten unsterblich gemachten malignen humanen adulten epithelialen Prostata-Zelllinie 1542-CP₃TX.8.1, hinterlegt am 15. Januar 1997 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL-12265 nach den Bestimmung des Budapester Abkommens.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die klonierte, unsterblich gemachte maligne humane adulte eptiheliale Prostata-Zelllinie gekennzeichnet durch einen Verlust der oberen Allele von D8S133, D8S136 und D8S131. Die klonierte, unsterblich gemachte Zelllinie hat die identifizierenden Eigenschaften einer klonierten, unsterblich gemachten malignen humanen adulten epithelialen Prostata-Zelllinie 1542-CP₃TX.8.4, hinterlegt am 15. Januar 1997 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12264 nach den Bestimmungen des Budapester Abkommens.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die klonierte, unsterblich gemachte maligne humane adulte eptiheliale Prostata-Zelllinie gekennzeichnet durch einen Verlust der unteren Allele von SFTP-2, D8S136 und D8S131 und der oberen Allele von D8S133 und NEFL. Die klonierte Zelllinie hat die identifizierenden Eigenschaften einer klonierten malignen epithelialen Prostata-Zelllinie 1535-CP1TX.14.3, hinterlegt am 15. Januar 1997 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12263 nach den Bestimmungen des Budapester Abkommens.
Die Zelllinien und klonierten Zellen der Erfindung sind unsterblich gemacht worden mit dem humanen Papillomavirus-(HPV)-Gen oder Teilen davon. In einer Ausfühungsform werden die malignen Zellen unsterblich gemacht mit einem Teil von HPV, das für E6 und E7 kodiert und in einem rekombinierten Retrovirus getragen wird. Kulturen der unsterblich gemachten malignen epithelialen Prostata-Zelllinien der Erfindung bleiben mit kontinuierlicher Passage für mindestens 1 Jahr stabil und lebensfähig.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Isolieren und Klonieren reiner Zelllinien von humanen adulten epithelialen Prostata-Zelllinien. Speziell ist das Verfahren geeignet zur Abtrennung von nicht-epithelialen Zellen aus den Kulturen, insbesondere zur Abtrennung von Fibroblasten aus den Kulturen. Das Verfahren umfasst die sorgfältige Dissektion von frischen primären Tumoren in Zellen oder Geweben, die morphologisch der normalen Prostata und der malignen Prostata ähneln. Um das Wachstum von Fibroblasten zu verhindern, werden Zellen im Medium mit wenig oder keinem fetalem Rinderserum und/oder Cholera-Toxin kultiviert. Differenzielle Trypsinierung kann auch dazu verwendet werden, um Fibroblasten von kultivierten epithelialen Prostatazellen abzutrennen. Die erhaltenen epithelialen Zelllinien sind > 90%, vorzugsweise 100% rein. Anschließendes Klonieren der Zelllinie führt zu 100% reinen epithelialen Zellen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion von unsterblich gemachten malignen epithelialen Prostatazellen. Im Stand der Technik sind Marker, wie PSA-Expression, PAP-Expression, PSA-Hochregulation durch Androgen, malignes Wachstum bei nackten Mäusen und aneuploiden Karyotypen benutzt worden, um maligne epitheliale Prostatazellen von normalen epithelialen Prostatazellen zu unterscheiden. Diese Marker unterscheiden jedoch nicht durchweg maligne epitheliale Prostatazellen von normalen Zellen. Die Erfindung der Selektion von unsterblich gemachten malignen epithelialen Prostatazellen auf der Grundlage des Verlustes der Heterozygotie ermöglicht ein konstantes, reproduzierbares Selektionsverfahren. Das Verfahren setzt mindestens einen DNA-Marker ein, der einen spezifischen Allel-Verlust auf einem bestimmten Chromosom identifiziert. In einer Ausführungsform des Verfahrens identifiziert der DNA-Marker einen spezifischen Verlust eines Allels auf Chromosom 8p. Das Verfahren kann verschiedene DNA-Marker verwenden, um mehr als einen Allel-Verlust auf einem bestimmten Chromosom oder einen Allel-Verlust auf mehreren Chromosomen zu identifizieren.
Bei dem Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung maligner Zellen werden PCR-Primer spezifisch für einzelne chromosomale Genorte mit DNA aus einer unsterblich gemachten epithelialen Prostata-Zelllinie inkubiert und ein PCR-Assay wird durchgeführt. Die amplifizierten Produkte werden auf LOH an einem oder mehreren Genorten im Vergleich zu einer DNA-Kontrolle, die aus bekannten normalen Zellen gewonnen wurde, analysiert. Ein Kriterium für die Kennzeichnung von LOH ist mindestens 75% Verlust eines Allels der malignen Zelle im Vergleich zu einer normalen DNA-Kontrolle, bestimmt durch visuelle Inspektion von Autoradiogrammen. Bekannte Verfahren, umfassend densitometrische Analyse zum Nachweis von Unterschieden, wobei die Kriterien für die Kennzeichnung von LOH mindestens 30% Verlust eines Allels der malignen Zelle darstellen.
Die unsterblich gemachten malignen epithelialen Prostata-Zelllinien und Klone der Erfindung eignen sich zur Identifizierung von neuen Genen, die einzigartig für maligne epitheliale Prostatazellen sind oder die von solchen Zellen überexprimiert werden und die nicht in normalen epithelialen Prostatazellen gefunden werden oder in diesen aktiv sind. Die neuen Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf transformierende Gene, Wachstumsfaktor-Gene, Onkogene, Tumor-Suppressor-Gene. Diese Gene können identifiziert werden unter Verwendung bekannter Verfahren der RNA Subtraction Analysis, wie beispielsweise Standard Subtractive Hybridization, Differential Display oder Representative Differential Analysis (RDA) (51, 52). Die neuen Gene werden nach bekannten Standardmethoden der Molekularbiologie kloniert. Die Identifizierung von neuen Genen, die mit der Entwicklung von Prostatakrebs assoziiert sind, erlaubt die Entwicklung von Antisense-Oligonukleotiden, die in der Hemmung oder Prävention von Prostatakrebs geeignet sind (42), und die Entwicklung von rekombinanten DNA-Vakzinen.
Die Zelllinien der Erfindung sind nützlich als Modell zum Studium epithelialer Zellonkogenese. Beispielsweise sind die epithelialen Prostata-Zelllinien der Erfindung besonders nützlich, um die Tumorgenese von Prostatakrebs zu verstehen. Die Erfindung betrifft eine gutartige Prostata-Zelllinie für die Verwendung in Kombination mit einer malignen Prostata-Zelllinie, die aus demselben Patienten stammt, als Reagenzien, um die genetischen Vorgänge zu definieren, die vom gutartigen zum malignen zellulären Phänotyp führen, und um die Rolle der Heredität bei Prostatakrebs zu untersuchen.
Die Zelllinien der Erfindung eignen sich für ein Verfahren, um ein vorgewähltes Protein oder Teile davon herzustellen, und für ein Verfahren, um Proteine maligner, prostatischer Zellen epithelialen Ursprungs herzustellen. Beispielsweise sind die Zelllinien der Erfindung geeignet zum Isolieren von Prostatakrebs-assoziierten Proteinen, die als Marker zur Diagnose oder als Ziele für Immuntherapie dienen können. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung von Protein bereitgestellt, umfassend die Schritte des Kultivierens der epithelialen Zelllinien der Erfindung und des Isolierens eines oder mehrerer Proteine, die von diesen Zellen gebildet werden. Die übliche Identifizierung der für diese Proteine kodierenden Gene ermöglicht die Konstruktion von rekombinanten Vektoren und Wirtszellen zur wirksamen Herstellung des Proteins oder Teilen davon in großem Maßstab.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein neues rekombinantes Virus, das ein Prostatakrebsassoziiertes Protein oder einen Teil davon exprimiert. Das rekombinante Virus kann auch ein oder mehrere ko-stimulatorische Moleküle exprimieren, Cytokine, MHC-Moleküle, Chemokine und dergleichen, um die Immunantwort auf das Prostatakrebs-assoziierte Protein oder Teile davon zu erhöhen. Verfahren zur Konstruktion und zur Expression exogener Genprodukte von rekombinanten Virusvektoren sind bekannt (43–50).
Die vorliegende Erfindung umfasst DNA oder RNA, isoliert aus unsterblich gemachten humanen malignen adulten epithelialen Prostatazellen, die LOH aufweisen, wie in den Ansprüchen 1–15 definiert. Die isolierte DNA oder RNA kann zum Nachweis und zur Diagnose von Prostatakrebs oder seiner Vorform in einem Patienten verwendet werden. Die DNA oder RNA kann als Sondenmoleküle und/oder Primer in üblichen Verfahren der Molekularbiologie wie Southern-Blot-Analyse, Northern-Blot-Analyse, PCR, RT-PCR und dergleichen zum Nachweis und zur Diagnose von Prostatakrebs oder seiner Vorform verwendet werden.
Nackte DNA, die für Prostatakrebs-Antigen oder Epitope davon kodiert, kann zur aktiven Immuntherapie bei Prostatakrebs verwendet werden. Bekannte Methoden zur intramuskulären oder subkutanen Injektion von nackter DNA oder an Lipide verknüpfter nackter DNA können benutzt werden, um sowohl eine zelluläre als auch eine humorale Immunantwort auf das kodierte Prostatakrebs-Antigen oder seiner Epitope hervorzurufen (33–41).
Die Zelllinien der Erfindung eignen sich auch zum Nachweis der Wirkungen von Therapeutika gegen Prostatakrebs in vivo oder in vitro. Beispielsweise können chemotherapeutische Medikamente, biologische Response Modifier oder genetische Reagenzien wie Antisense-Oligonukleotide auf ihre Wirksamkeit hin gescreent werden. Der Wirkstoff wird in Gegenwart der Zellen in vivo oder in vitro getestet. Nach einer geeigneten Anwendungsdauer wird die Wirkung der Chemikalie oder des Agens auf die Zelle durch bekannte Verfahren wie Cytotoxizitäts-Analyse, Proteininhibitions-Analysen, Inhibition von Tumorwachstum und Ähnlichem geprüft. Der Wirkstoff, der eine vitale Stoffwechselfunktion inhibiert oder die Zellen tötet, wird als wirksames Mittel angesehen.
Die Zelllinien und Klone der Erfindung sind auch geeignet als Ganzzell-Vakzin zur Behandlung oder zum Verhindern des Wiederauftretens von Prostatakrebs. Dieses Vakzin kann in seiner nativen Form verabreicht werden, in Kombination mit Adjuvantien, oder modifiziert durch Transgene, die beispielsweise verschiedene Cytokine, Chemokine, ko-stimulatorische Moleküle, Adhäsionsmoleküle, MHC-Moleküle und dergleichen kodieren. Solche Modifikationen können zur Steigerung des immuntherapeutischen Effekts des Immunogens und des Vakzins der Erfindung verwendet werden.
Die Gene können nach bekannten Verfahren wie Elektroporation, Polybren-induzierte DNA-Transfektion, über Plasmide, über rekombinante Viren und dergleichen in die unsterblich gemachten humanen malignen epithelialen Prostata-Zelllinien und Klone eingebracht werden. Ein rekombinantes Virus, das ein oder mehrere interessierende Gene enthält, kann gemäß der WO94/16716, WO96/11279 und WO96/10419 konstruiert werden.
Ko-stimulatorische Moleküle, die in der Erfindung eingesetzt werden können, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf B7-1, B7-2, B7-3, ICAM-1, LFA-1, LFA-3, CD72 und dergleichen.
Cytokine, die in der Erfindung benutzt werden können, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf IL-2; GM-CSF, TNFα, IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-7 und dergleichen.
MHC-Moleküle beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Klasse-I- oder Klasse-II-Moleküle und dergleichen. Nichtklassische MHC-Moleküle oder MHC-ähnliche Moleküle wie CD1 können ebenfalls verwendet werden.
Chemokine beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf RANTES, IL-8, MIP1-alpha, MIP1-beta und dergleichen.
Die Zelllinien der Erfindung sind auch therapeutisch geeignet als Stimulanzien zur Generierung von Prostatakrebs-reaktiven Antikörpern oder Immunzellen des peripheren Blutes oder Lymphknotenzellen für die Verabreichung an Prostatakrebs-Patienten.
Die Erfindung betrifft ferner unsterbliche Prostata-Zelllinien für die Verwendung in der molekularen Klonierung von Prostatakrebs-assoziierten Antigenen, die vom Immunsystem erkannt werden. Diese Antigene werden dann zu rekombinanten Vakzinen entwickelt, welche auf die Prävention oder Heilung von Prostatakrebs gerichtet sind.
Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die die unsterblichen Zelllinien der Erfindung enthalten, sowie die Verwendung dieser Zelllinien und pharmakologischen Zusammensetzungen, die diese Zelllinien umfassen, für pharmakologische, therapeutische und diagnostische Anwendungen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, Vakzine und Immunogene können nach üblichen Methoden hergestellt werden. Solche Zusammensetzungen können einem Patienten in an sich bekannter Weise unter Berücksichtigung des Alters, des Körpergewichts und des Zustand des einzelnen Patienten und unter Berücksichtigung des Verabreichungsweges verabreicht werden.
Das Immunisierungsprotokoll für die Zusammensetzungen, Vakzine und Immunogene kann parenteral (intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär oder subkutan) sein. Die Zusammensetzung, das Vakzin und das Immunogen können auch direkt in eine Tumormasse appliziert werden. Überdies können die Zusammensetzungen in vitro verwendet werden; um Antigen-spezifische cytotoxische T-Lymphozyten zu stimulieren, welche anschließend dem Patienten wieder zugeführt werden.
Die Zusammensetzungen, Vakzine und Immunogene können ko-appliziert werden oder nacheinander appliziert werden mit Adjuvantien wie Alaun, inkomplettem Freund'schem Adjuvans und dergleichen, Cytokinen, Ko-Stimulanzien, Chemokinen, Adhäsionsmolekülen, MHC-Molekülen und dergleichen. Zusätzlich können die Zusammensetzungen, Vakzine und Immunogene ko-appliziert oder nacheinander appliziert werden mit anti-neoplastischen, Anti-Tumor-, Anti-Krebs-Agenzien und/oder mit Agenzien, die die Nebenwirkungen von antineoplastischen, Anti-Tumor- oder Anti-Krebs-Agenzien reduzieren oder mildern.
Beispiele von Vakzinen oder Zusammensetzungen der Erfindung beinhalten flüssige Präparate wie Suspension, Sirupe, Elixiere und Präparate für die parenterale, subkutane, intradermale, intramuskuläre oder intravenöse Gabe. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können im Gemisch mit einem geeigneten Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff wie steriles Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Glukose und dergleichen vorliegen.
Die Wirksamkeit der Behandlung lässt sich durch Bildung von Antikörpern oder Immunzellen feststellen, die die maligne Zelle oder das Prostatakrebs-Peptid oder einen Teil davon erkennen, ferner durch Bestimmung der Antigen-spezifischen Cytotoxizität, der spezifischen Cytokin-Produktion oder der Tumorregression.
Die unsterblich gemachten humanen adulten epithelialen Prostatazellen können in Form eines Kits bereit gestellt werden. Der Kit kann eine oder mehrere unsterblich gemachte humane adulte epitheliale Prostatazelle oder Teile davon enthalten. Teile enthalten lysierte Zellen, Zellfragmente, intrazellulare Bestandteile, extrazellulare Komponenten, Protein, DNA, RNA, Glykolipide und dergleichen. Kits können auch autologe unsterblich gemachte humane adulte maligne epitheliale Prostatazellen oder Teile davon in Kombination mit autologen unsterblich gemachten humanen adulten normalen epithelialen Prostatazellen oder Teile davon enthalten. In einer Ausführungsform umfasst der Kit die unsterblich gemachte humane adulte normale epitheliale Zelllinie 1532-NP in Kombination mit der autologen unsterblich gemachten humanen adulten malignen Zelllinie 1532-CP1 und/oder 1532-CP2. In einer Ausfürungsform umfasst der Kit die unsterblich gemachte humane adulte normale epitheliale Zelllinie 1535-NP in Kombination mit der autologen unsterblich gemachten humanen adulten malignen Zelllinie 1535-CP1, 1535-CP2 und/oder 1535-CP₁TX.14.3. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit die unsterblich gemachte humane adulte normale epitheliale Zelllinie 1542-NP in Kombination mit einer oder mehreren der autologen unsterblich gemachten humanen adulten malignen Zelllinien 1542-CP1, 1542-CP2, 1542-CP3, 1542-CP₃TX.8.1 und 1542-CP₃TX.8.4. Der Kit kann auch einen gesonderten Behälter umfassen, der einen geeigneten Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Hilfsstoff enthält. Der Kit kann auch ein Adjuvans, ein Cytogen, ein ko-stimulatorisches Molekül, ein Chemokin, ein Adhäsionsmolekül, ein MHC-Molekül, ein anti-neoplastisches Mittel, ein Anti-Tumor-Mittel, Immunoassay-Reagenzien, PCR-Reagenzien, radioaktive Marker und dergleichen enthalten. Zusätzlich kann der Kit Anweisungen für das Mischen oder das Kombinieren der Bestandteile und/oder für die Verabreichung enthalten.
Der Ausdruck „unsterblich gemacht" bedeutet hier, dass die Zelllinie fortwährend wächst ohne zu altern, wenn sie in vitro in einem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert wird.
Die Zelllinien der Erfindung eignen sich für eine Vielzahl von therapeutischen und diagnostischen Zwecken. Diese werden nachstehend weiter beschrieben.
Beispiel I
(1) Charakteristische Merkmale von Patienten, von denen in Kultur gehaltene Zelllinien erhalten wurden.
Epitheliale Prostata-Zelllinien wurden aus Radikal-Prostatektomieproben entnommen, die von 6 Patienten mit mittel- bis hochgradigen Tumoren stammten (Gleason Grad 6–8) (siehe Tabelle 1). Zellkulturen wurden generiert durch mechanisches Zertrümmern oder enzymatische Verdauung von primären Tumorknötchen, die aus frischen Radikal-Prostatektomieproben herausgeschnitten wurden; vgl. Beispiel II für eine detaillierte Beschreibung der Verfahren der Kultivierung.
Tabelle 1: Prostatakrebs-Patienten: Klinische Informationen
(2) Pathologische Analyse von Gewebeproben
Pathologische Analyse von frischen Gewebeproben, die verwendet wurden, um Prostata-Zelllinien zu erzeugen, zeigten, dass einige Karzinomproben reines Tumorgewebe waren, während andere aus einer Mischung von gutartigen und malignen Zellen bestanden. Siehe Tabelle 2: Eine vorbereitende Identifizierung der Proben wurde mittels „gross examination" von einem erfahrenen Pathologen durchgeführt. Mikroskopische Identifizierung wurde von einem erfahrenen Pathologen durchgeführt. BPH = gutartige prostatische Hypertrophie. PIN = prostatische intraepitheliale Neoplasie. ^a = ein Gemisch von Zelltypen. ^b = 80% der Proben bestanden aus gutartigem fibromuskulärem Stroma. ^c = ein mikroskopischer Fokus des festgestellten Krebses.
Tabelle 2: Pathologische Analyse von frischen Prostataproben
(3) Bestätigung des epithelialen Ursprungs von Prostata-abgeleiteten Zelllinien
Der epitheliale Ursprung von Prostata-abgeleiteteten Zelllinien wurde bestätigt mittels Cytokeratinfärbung. Cytokeratine sowohl mit hohem als auch niedrigem Molekulargewicht wurden in allen 16 Zelllinien exprimiert, die aus 6 Radikalprostatektomieproben (normale Prostata, Prostatakrebs, normale Samenblase) generiert wurden. Mit Ausnahme einer frühen Passage von 1519-CP exprimierten keine der Prostata-abgeleiteten Zelllinien PSA oder PAP. Siehe Tabelle 3: F = Fibroblasten, NP = normale Prostata, SV = Samenblase, CP = Prostatakarzinom. ^a = enthält sowohl hoch- als auch niedermolekulare Keratine. ⁿ = PSA- und PAP-Expression wurde bei Kulturpassage Nr. 5 festgestellt, trat aber im weiteren Verlauf der Passage in vitro nicht mehr auf. ^c = die beobachtete Färbung wurde als möglicher Hintergrund festgestellt.
Tabelle 3: Immunzytochemische Analyse von unsterblich gemachten epithelialen Prostata-Zelllinien
(4) Zelloberflächenphenotypisierung
Zelloberflächenphenotypisierung wird beschrieben in Beispiel II, Tabelle 6.
(5) Genetische Analyse von epithelialen Prostata-Zelllinien
Allelischer Verlust auf Chromosom 8 ist in Zusammenhang gebracht worden mit PIN und invasivem Prostatakrebs und repräsentiert somit ein alternatives Verfahren, um epitheliale Zelllinien, die von Prostatakrebsproben abgeleitet sind, zu charakterisieren. Die Untersuchung des allelischen Verlustes an 10 verschiedenen Genorten auf Chromosom 8p unter Verwendung der PCR (Polymerase-Kettenreaktion) zeigte einen Verlust der Heterozygotie (LOH) an einem Genort in 1 von 9 untersuchten nicht-klonierten Krebs-abgeleiteten Zelllinien, was vermuten lasst, dass dies eine etablierte Langzeit-primäre Prostata-Zelllinie ist. Obwohl äußerst genau darauf geachtet wurde, nur die reinst möglichen Tumorfragmente für die in vitro-Kultivierung zu sezieren, zeigte die nachfolgende mikroskopische Auswertung der ursprünglichen Tumorproben eine veränderliche Mischung von gutartigem Epithel BPH, PIN und/oder invasivem Tumor (siehe Tabelle 2), das LOH maskieren könnte, was die Epithelzellklonierung für eine genaue Charakterisierung erfordert. Eine definitive genetische Charakterisierung der epithelialen Prostatazellkulturen, die hier beschrieben sind, sowie die Einzelzellklonierung der Zelllinien werden nachstehend beschrieben.
Beispiel II
Einzelzellklonierung und Charakterisierung von unsterblich gemachten malignen epithelialen Prostatazellen
Material und Methoden
Erzeugung von primären Zellkulturen. Gewebeproben für die Erzeugung von Zelllinien wurden aus sechs Patienten entnommen, die Radikalprostatektomie am NCI zur Behandlung von mittel- bis hochgradig lokalisiertem Prostatakrebs (Gleason-Grad 6–8, Tumorphasen T2C bis T3C) unterzogen wurden. Frische Prostatektomieproben, die direkt aus dem Operationssaal erhalten wurden, wurden unter sterilen Bedingungen von einem Pathologen seziert.
Gewebe, das bei "gross inspection" als normale Prostata, Prostatakrebs oder normale Samenblasengewebe bezeichnet wurde, wurde gesondert zur Erzeugung von Zellkulturen jeweils zerkleinert. Kulturen wurden angelegt durch mechanisches Zertrümmern (Fragmente mit einem Durchmesser < 1 cm) oder durch enzymatischen Verdau (Fragmente mit einem Durchmesser > 1 cm) (21). Proben von den Patienten 1510 und 1512 wurden durch enzymatischen Verdau vorbereitet, während nachfolgende Kulturen durch mechanisches Zertrümmern erzeugt wurden. Für den enzymatischen Verdau wurde das zerkleinerte Gewebe in 100 ml Verdaumedium suspendiert und auf einem Rührtisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die erhaltene Einzelzellsuspension wurde dann mit sterilem PBS gewaschen, in Wachstumsmedium resuspendiert (siehe unten) und in Platten mit 6 Näpfchen gegeben, die mit Typ-I-Rattenschwanz-Collagen (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) beschichtet waren. Für die mechanische Zertrümmerung der Proben wurden Gewebefragmente in einem kleinen Volumen von Wachstumsmedium vorsichtig in 2–2 mm große quadratische Stücke zerwürfelt. Die erhaltene Gewebe- und Zellaufschwämmung wurde in Platten mit 6 Näpfchen gegeben. Alle Kulturen wurden in einem Volumen von 1 ml pro Näpfchen angesetzt und bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Sie wurden für 2–3 Tage in Ruhe stehen gelassen, um es den lebenden Zellen und den Gewebestücken zu ermöglichen, sich niederzusetzen und sich an den Napfwandungen anzuheften. Anschließend wurden nicht angeheftete Zelltrümmer vorsichtig abgesaugt und die Näpfchen mit 3–5 ml frischem Wachstumsmedium gespült. Kulturmedium wurde routinemäßig alle 2–4 Tage ausgetauscht und proliferierende adhärente Zellen wurden passagiert nach Ablösung mit Trypsin. Etablierte wachsende Kulturen wurden in Gewebekulturflaschen (Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) gehalten. Wachstumsmedium für Prostata- und Samenblasen-Epithelial-Zelllinien bestanden aus keratinocytenserumfreiem Medium (Keratinocyte-SFM, GIBCO-BRL, Grand Island, NY), das 25 μg/ml Rinderhypophysenextrakt, 5 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer, Antibiotika und 5% Hitze-inaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) (Biofluids, Rockville, MD) enthielt. Für das Anlegen von epithelialen Kulturen aus frischen Gewebeproben wurde die Konzentration an fetalem Rinderserum auf 1– 2% reduziert und/oder Choleratoxin (Sigma, St. Louis, MO) in einer Menge von 10–20 ng/ml wurde als Schutz gegen das Überwachsen von Fibroblast-Verunreinigungen hinzugefügt. In dem seltenen Fall, dass Fibroblasten in epithelialen Zellkulturen weiterbestehen, war die differentielle Trypsinierung (Inkubation für 1–2 min bei 37°C, gefolgt vom Auswaschen losgelöster Fibroblasten, um die adhärenteren epithelialen Zellen zu behalten) äußerst erfolgreich in der Erzeugung reiner epithelialer Zellkulturen.
Autologe Fibroblast-Zelllinien wurden aus mechanisch zerkleinerten gutartigem stromalem Prostatagewebe erzeugt und in RPMI 1640-Medium kultiviert, das 10% Hitze-inaktiviertes FBS enthielt. Die mit autologem Epstein-Barr-Virus transformierten B-Zelllinien wurden unter Verwendung von StandardMethoden erzeugt und in RPMI 1640 mit 10% fetalem Rinderserum kultiviert.
Metastatische Prostatakrebs-Zellkulturen. Die adhärenten Zelllinien LNCaP, DU145, PC-3 (ATCC, CRL1740, HTB 81 bzw. CRL1435) und TSU-Prl (erhalten von Dr. William Isaacs, John Hopkins University, Baltimore, MD; wie beschrieben in Iizumi et al., J. Urol. 137: 1304– 1306, 1987) wurden in RPMI 1640-Medium, supplementiert mit 10% fetalem Rinderserum, gehalten.
Das Unsterblichmachen von primären Zellkulturen. Das Unsterblichmachen von Zellkulturen wurde erreicht durch Transduktion von aktiv proliferierenden Zellen mit einem rekombinanten Retrovirus, das für die transformierenden Proteine E6 und E7 des humanen Papillomavirus Serotyp 16 (HPV 16) und den eukaryotischen Selektionsmarker Neomycin Phosphotransferase, bezeichnet als LXSN16E6E7 (erhalten von Dr. Denise Galloway, Fred Hutchinson Cancer ResearchCenter, Seattle, WA) (22), kodiert. Als Vorbereitung für das Unsterblichmachen wurden kurzeit-epitheliale Zellkulturen (Kulturpassagen 1–3) 1 : 2 geteilt und für mindestens 48 Std. am Boden der Platten mit 6 Näpfchen anheften gelassen, wobei 50–60% konfluente Kulturen erhalten wurden. Zur Transduktion mit dem LXSN16E6E7 Retrovirus wurde das Kulturmedium ersetzt durch den von der Retrovirus-Produktionslinie PA317 gesammelten Kulturüberstand (22) in Anwesenheit von 10 μg/ml DEAE-Dextran (Sigma) für eine Zeitdauer von 24 Std.
Einzelzellklonierung der unsterblich gemachten Zellkulturen. Klonale Populationen von unsterblichen epithelialen Zellkulturen wurden regeneriert für die Verwendung in Studien zur Charakterisierung von LOH. Kurz gesagt wurden konfluente Zellkulturen mit Trypsin geerntet, gewaschen und gezählt. Zellen wurden in Keratinocyt-Wachstumsmedium (siehe oben) seriell verdünnt auf eine Konzentration von 2–5 Zellen pro ml und in 8–10 einzelne Flachboden-Mikrokulturplatten mit 96 Näpfchen in einer Menge von 200 μl/Näpfchen (≤ 1 Zelle/Näpfchen) verteilt. Näpfchen mit konfluentem Inhalt, die von Verdünnungen < 1 Zelle/Näpfchen herrührten, wurden auf Platten mit 24 Näpfchen expandiert, um zu gewährleisten, dass genug Zellen für DNA-Extraktion und Cryo-Konservierung zur Verfügung standen.
Immunzytochemische Analyse. Für die immunzytochemische Untersuchungen von unsterblich gemachten kultivierten Zellen wurden Zellen mit Trypsin geerntet, gewaschen und pellettiert. Zellpellets wurden anschließend in 10% gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Frische Gewebeschnitte von Prostataproben wurden ebenfalls in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Fünf Mikronschnitte wurden auf frischen Tumorproben und kultivierten Zellblöcken und auf geladenen Objektträgern angebracht (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) (23). Immunzytochemie wurde durchgeführt unter Verwendung der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexmethode und der folgenden primären Antikörper: Monoklonales anti-humanes prostataspezifisches Antigen (PSA) (Dako Corp. Carpenteria, CA); polyklonale anti-humane prostatische saure Phosphatase (PAP) (Dako Corp., Carpenteria, CA); antihumanes Cytokeratin CAM 5.2 (Becton-Dickinson, San Jose, CA); und anti-humanes Cytokeratin AE1/AE3 (Boehringer-Manheim, Indianapolis, IN). Zelllinien und Tumorgewebeschnitte wurden beurteilt auf der Grundlage des Prozentsatzes an eingefärbten Zellen (< 25%, 25–50%, 50–75% oder > 75%) sowie der Intensität der Färbung (1+ bis 4+).
Fließzytometrie. Für zukünftige Studien und weitere Charakterisierung war es von Interesse, das Ausmaß der Expression von Oberflächenmolekülen zu ermitteln, die immunologische Bedeutung für die Langzeit-epithelialen Prostata-Zelllinien besitzen. Unsterblich gemachte Zellkulturen wurden geerntet und mit den folgenden monoklonalen Antikörpern gefärbt: CD54 (Anti-ICAM-1), CD80 (Anti-B7.1), CD86 (Anti-B7.2) (Becton-Dickinson), W6/32 (Anti-HLA-A, B, C) und L243 (Anti-HLA-DR) (ATCC, Rockville, MD) (21). Um die Oberflächenexpression von MHC-Molekülen zu erhöhen, wurden Zellen in Anwesenheit von IFN-γ 500 U/ml für 72 Std. vor der fließzytrometrischen Analyse kultiviert.
Mikrodissektion und DNA-Extraktion. Mikrodissektion ausgewählter Foci normaler epithelialer Prostatazellen oder invasiver Tumorzellen aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben, wurden unter unmittelbaren lichtmikroskopischen Bedingungen, wie vorher beschreiben (24, 25, 26) durchgeführt. Kurz gesagt wurden nicht gefärbte formalinfixierte, in Paraffin eingebettete 5 Mikron dicke, histologische Gewebeschnitte auf Glasobjektträgern vorbereitet und zweimal mit Xylol deparaffiniert, zweimal mit 95%igem Ethanol gewaschen, mit Eosin gefärbt und luftgetrocknet. Die Nachbarsektion wurde mit Hematoxylin und Eosin gefärbt. Bestimmte interessierende Zellen wurden von den mit Eosin gefärbten Objektträgern ausgewählt und mittels einer modifizierten Wegwerf-Injektionsspritze mit einer Nadelgröße von 30 Gauge mikroseziert. DNA wurde aus 1 – 5 × 10³ Zellen extrahiert, die durch Mikrodissektion erhalten wurden. In einigen Fällen wurden Zellen mehrerer benachbarter sezierter Tubuli des Krebs- oder normalen Epithelgewebes kombiniert. DNA wurde ebenfalls aus 1 – 5 × 10⁴ Zellen extrahiert, die aus schnell wachsenden unsterblichen Kulturen erhalten wurden. Die Zellen wurden sofort in einer Lösung (20 μl für mikrosezierte oder 200 μl für kultivierte Zellen) resuspendiert, die 0,01 M TRIS-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1% Tween 20 und 0,1 mg/ml Proteinase K enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Mischung für 5–10 min gekocht, um die Proteinase K zu inaktivieren, und bei 4°C für die nachfolgende Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Analyse aufbewahrt.
Ermittlung des Verlustes der Heterozygotie. Die polymorphen DNA-Marker, die für den Nachweis von LOH auf Chromosom 8p12–21 untersucht wurden, enthielten: SFTP-2, D8S133, D8S136, NEFL, D8S137, D8S131, D8S139 und ANK. Die PCR-Primer-Paare, die zur Amplifizierung der DNA-Mikrosatellitenmarker verwendet wurden, sind Folgende:
1) SFTP-2 Nukleinsäuresequenzen: L16861
Amplifizierte Seq. Min Länge: 0,111
Amplifizierte Seq. Max Länge: 0,157
Vgl. Wood, S., Genomics 24: 597–600, 1994. SFTP2-kartiert in der Region zwischen 8p11– 8p22.
2) D8S133 Nukleinsäuresequenzen: M73471
Amplifizierte Seq. Min. Länge: 0,094
Amplifizierte Seq. Max. Länge: 0,112
Vgl. Wood, S. Cytogenet Cell Genet 58: 1932, 1991; Wood, S., Genomics 13: 232, 1992.
3) D8S136
Amplifizierte Seq. Min. Länge: 0,071
Amplifizierte Seq. Max. Länge: 0,089
Vgl. Wood, S., Cytogenet Cell Genet 58: 1932, 1991.
4) NEFL Nukleinsäuresequenzen: L04147
Amplifizierte Seq. Min. Länge: 0,137
Amplifizierte Seq. Max. Länge: 0,147
Vgl. Rogaev, E., Hum. Mol. Genet. 1: 781, 1992.
5) D8S137 Nukleinsäuresequenzen: X61694
Amplifizierte Seq. Min. Länge: 0,152
Amplifizierte Seq. Max. Länge: 0,161
Vgl. Wood, S., Cytogenet Cell Genet 58: 1932, 1991; Wood, S., Nucleic Acids Res. 19: 6664, 1991.
6) D8S131
Amplifizierte Seq. Min. Länge: 0,132
Amplifizierte Seq. Max. Länge: 0,144
Vgl. Yu, CE., Hum. Mol. Genet. 3: 211, 1994.
7) D8S339
Amplifizierte Seq. Min. Länge: 0,162
Amplifizierte Seq. Max. Länge: 0,176
Vgl. Thomas, W., Hum. Mol. Genet. 2: 828, 1993.
8) ANK Nukleinsäuresequenzen: D16990
Vgl. Polymeropoulos et al., Nucleic Acids Res. 19: 969, 1991.
PCR wurde durchgeführt wie vorher beschrieben (19). Kurz gesagt enthielten 12,5 ml PCR-Reaktionslösung 200 mM dATP, dGTP und dTTP; 40 μM dCTP; 0,8 mM Primer (Research Genetics, Huntsville, Ala., oder synthetisiert mittels eines Applied Biosystems DNA-Synthesizers); 2 μCi [α³²P] dCTP; 16 μM Tetramethylammoniumchlorid (27); 1 × PCR-Reaktionspuffer (enthaltend 1,25 mM MgCl₂) und eine Einheit Taq-Poylmerase (Boehringer-Mannheim). Fünf Prozent DMSO wurde zu den Reaktionen für die Marker D8S133 und D8S137 hinzugefügt, um die Auflösung und Amplifikation der Produkte zu verbessern. Reaktionen mit allen Markern wurden wie folgt durchgeführt: 2 min bei 95°C, gefolgt von 28–40 Zyklen (je nach Marker) des Annealing und der Extension (95°C für 30 s, Annealing-Temperatur für 30 s und 72°C für 30 s) und eine zweiminütige Inkubation bei 72°C. Annea ling-Temperaturen für jeden einzelnen Marker wurde nach einer anfänglichen Schätzung, bezogen auf Primer-Länge und Zusammensetzung, empirisch bestimmt.
Die markierten amplifizierten DNA-Proben wurden für 5–10 min bei 90°C denaturiert und auf ein Gel geladen, das aus 7% Acrylamid (30 : 0,8 Acrylamid : Bisacryamid), 5,6 M Harnstoff, 32% Formamid und 1 × TBE (0,089 M Tris pH 8,3, 0,089 M Borat, 0,002 M EDTA) bestand (28). Proben wurden bei 95°C für 2–4 Std. elektrophoriert. Gele wurden dann auf Sequenziergel-Filterpapier (Bio-Rad) transferiert und Audioradiographie wurde mit Kodak X-OMAT-Film durchgeführt. Das Kriterium für LOH war mindestens 75% Verlust eines Allels im Vergleich zu einer autologen frischen. PBL-Kontrolle, bestimmt durch direktes Untersuchen von drei unabhängigen Prüfern. Wenn ausreichend DNA verfügbar war, wurde LOH durch mindestens zwei unabhängige Experimente verifiziert.
Ergebnisse
Gewebe für die Zellkultur. Angesichts der bekannten Schwierigkeiten, die mit der Erzeugung von unsterblichen Prostata-Zelllinien von primären (nicht metastatischen) Proben einhergehen, wurden die größten, grob sichtbaren Tumorknötchen (1–3 cm im Durchmesser) zunächst ausgesucht als Quelle für frisches Gewebe für die Generierung von Kulturen. Nachfolgende mikroskopische Analyse der angrenzenden Gewebesektionen der ersten drei Vesuche (Patienten 1510, 1512 und 1519) zeigten, dass "Tumor"-Proben tatsächlich eine variable Mischung von gutartigem prostatischen Epithel, gutartiger prostatischer Hypertrophie (BPH), prostatischer intraepithelialer Neoplasie (PIN) und invasiven Tumorzellen enthielten. Jedoch bestanden "normale" Proben von Patienten 1512 und 1519 aus gutartigem prostatischem Epithel (Tabelle 2).
Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, reines Tumorgewebe für das Anlegen von Tumorzelllinien von nachfolgenden Patienten zu erhalten, wurden kleinere Gewebefragmente (< 1 cm) mit angrenzenden Sektionen beschafft, die für Gewebekultur, Gefrier- und Paraffinsektionen bestimmt waren. Zusätzlich wurden, wann immer es möglich war, verschiedene ausgeprägte Tumorgewebsfragmente aus einzelnen Proben selektiert für das Anlegen der Kultur. Durch den Einsatz dieser strengeren Bedingungen war es möglich, Gewebesektionen zu erhalten, die mindestens 95% neoplastische Zellen (PIN plus invasivem Krebs) in 6 von 7 Versuchen an drei Radikalprostatektomieproben (Patienten 1532, 1535 und 1542) enthalten. Zusätzlich wurden Gewebefragmente, die für das Anlegen von drei gutartigen epithelialen Prostata-Zelllinien und zwei benignen epithelialen Zelllinien der Samenblase geeignet waren, erfolgreich aus diesen Radikalprostatektomieproben seziert (Tabelle 2).
Das Unsterblichmachen und die immunzytochemische Charakterisierung von Prostataabgeleiteten Zelllinien. Alle bis auf eine von den 17 Gewebeproben, die in Tabelle 2 (normale Prostata aus Patient 1519) aufgelistet sind, wurden ohne Weiteres in Kurzzeit-Kultur etabliert. Jedoch war die Zellproliferation relativ langsam und die in vitro-Immortalisierung der epithelialen Zellkulturen war nötig, um schnell wachsende Kulturen zu etablieren, die im Stande waren, über 5–6 Wochen hinaus zu überleben. Adhärente Mono-Layer-Kulturen wurden bei der zweiten oder dritten Passage mit einem rekombinanten Retrovirus, der für die E6- und E7-transformierenden Proteine von HPV 16 kodierte, transduziert. Dies ergab die Etablierung von 16 Langzeit-epithelialen Zelllinien: 4 abgeleitet aus normaler Prostata, 2 aus der Samenblase und 10 aus primären Tumorproben. Zusätzlich wurden unsterbliche fibroblastische Linien, die aus prostatischem Stroma angesetzt worden waren, in vier Patienten etabliert. Erfolgreiche Transduktion wurde bestätigt durch Zellüberlebensfähigkeit in G418 bei einer Konzentration von 1 mg/ml und erweiterte Zelllebensfähigkeit und rasche Proliferation jenseits von 50 Kulturpassagen im Vergleich zu nicht unsterblich gemachten Zellen, die parallel dazu kultiviert wurden (1A). Unter dem Mikroskop zeigten die unsterblich gemachten epithelialen Prostatazelllinien alle eine vergleichbare Morphologie, unabhängig davon, ob sie von benignem oder malignem Gewebe stammten. Somit war die Morphologie der Kulturen kein brauchbares Kriterium, um benigne von malignen Zellen zu unterscheiden (1B).
Um die epithelialen und prostatischen Ursprünge der Prostata-abgeleiteten Zelllinien zu bestätigen, wurde Immunzytochemie an Zellblöcken aus aktiv wachsenden unsterblichen Kulturen durchgeführt (Tabelle 3). Cytokeratine mit sowohl hohem als auch niedrigem Molekulargewicht wurden von allen epithelialen Zelllinien, die in unserem Labor angelegt wurden, einschließlich solchen, die von normaler Prostata, normalen Samenblasen und Prostatakrebsproben abgeleitet waren, exprimiert. Mehr als 75% der Zellen färbten mit 4 + Intensität, ähnlich der Färbung wie sie mit etablierten metastatischen Prostatakrebszelllinien LNC_aP, DU145, PC-3 und TSAU-PR1 beobachtet werden konnten. Somit war der epitheliale Ursprung dieser Kulturen bestätigt. Keine nennenswerte Cytokeratinexpression wurde für Kontrollfibroblastenlinien oder Melanomzellen beobachtet.
Obwohl positive Cytokeratinexpression darauf hindeutete, dass Zelllinien, die aus primären Prostatakrebsproben generiert wurden, eigentlich epithelialen Ursprungs waren, war es auch von Interesse, die Expression der Prostata-assoziierten Proteine, PSA und PAP, von diesen Kulturen zu bewerten. Nur die unsterbliche Prostatatumor-abgeleitete Zelllinie, die aus Patient 1519 (1519-CPTX) generiert wurde, exprimierte nachweisbare Mengen dieser Proteine (> 75% der Zellen, färbend mit 2 – 3 + Intensität, und > 75% mit 4 + Intensität) nach 5 Kulturpassagen. Nach 30 Kulturpassagen war die Expression von PSA und PAP in 1519-CPTX jedoch nicht mehr nachweisbar. Im Weiteren war die Expression in den späten Passagen dieser Zelllinie nicht durch IFN-5-aza-2'-Deoxicytidine oder Dihydroxytestosteron induzierbar. Immunhistochemische Untersuchung von fixierten Prostatakrebsgewebeschnitten zur Expression von PSA und PAP zeigten oftmals schwache und heterogene Färbung von Tumor-"Coals", wobei einige Tumorherde keine nachweisbare Expression dieser Proteine zeigten. Im Gegensatz dazu färbten alle normalen Drüsen in demselben mikroskopischen Schnitt kräftig und gleichmäßig für PSA und PAP (2). Die schwache heterogene Expression von PSA und PAP von Prostatakrebszellen in situ könnte die Abwesenheit der Expression der unsterblichen Prostatatumor-abgeleiteten Zelllinien erklären. Jedoch korreliert der Mangel an Expression in den gutartigen epithelialen Prostatazelllinien nicht mit der starken Expression, die in den entsprechenden Gewebeschnitten beobachtet worden sind. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust der PSA- und PAP-Expression auch als Folge der in vitro-Zellkultur auftreten kann.
Untersuchung von Chromosom 8p auf LOH in mikrosezierten Geweben. Wie vorstehend bemerkt, wurden unsere "Prostatakrebs"-Zelllinien in den meisten Fällen tatsächlich von Gewebeproben abgeleitet, die eine Mischung aus benignen und malignen Zelltypen enthielten (Tabelle 2). Da alle Kulturen retrovirale Transformation benötigten, um Langzeitproliferation induzieren zu können, und da transformierte benigne und maligne epitheliale Prostatazellen morphologisch und histochemisch nicht unterscheidbar waren, wurde die Verwendung der LOH-Analyse als alternatives Mittel zur Charakterisierung der neu etablierten Kulturen untersucht. LOH auf Chromosom 8p12–21 wurde zuerst in mikrosezierten Herden von Tumor- oder normalen epithelialen Zellen der entsprechenden frischen Gewebesektionen bewertet. Ein Satz von 8 Mikrosatellitenmarkern, von welchen vorher gezeigt werden konnte, dass sie einen hohen Prozentsatz an LOH in mikrosezierten Prostatakrebsproben detektieren können (19), wurde ausgewählt, um Deletionen auf Chromosom 8p zu identifizieren. Der Satz der 8 Mikrosatellitenmarker ist im Stande, Deletionen an den Genorten 11 bis 21 des Chromosoms 8 zu identifizieren, wie in 3 gezeigt. Unter der Annahme, dass Zellen, die im Mikroskop normal erscheinen, LOH als Vorläufer für die maligne Transformation enthalten könnten, wurden frische autologe PBL als normale Kontrolle für die LOH-Analyse verwendet. Es stellte sich heraus, dass alle 6 Patienten heterozygot (informativ) an 4 oder weiteren Genorten der 8 Genorte waren, die bei der Analyse der DNA von frischem PBL untersucht wurden. Jedoch lieferten für 2 Patienten (1519 und 1532) mikrosezierte Tumorproben keinen Hinweis auf LOH. Dies zeigt, dass die LOH-Analyse möglicherweise für die Charakterisierung von Zellkulturen, die von solchen Proben hergeleitet sind, nicht geeignet ist (Tabelle 4).
Tabelle 4: LOH auf Chromosom 8p in mikrasezierten Foci von Prastatakrebs oder benignem Epithel
Im Gegensatz dazu zeigten mikrosezierte Tumore der Patienten 1510 und 1512 LOH an allen untersuchten informativen Genorten. Für Patient 1535 wurden 6 einzelne mikrosezierte Tumor-Foci untersucht und alle zeigten ähnliche LOH-Muster. Von Bedeutung ist, dass die LOH-Analyse von 12 einzelnen mikrosezierten Tumoren des Patienten 1542 verschiedene LOH-Muster zeigte, wobei 4/12 das Beibehalten aller untersuchten 16 informative Allele zeigte (Tabelle 5). Mikroseziertes Normalepithel zeigte kein Anzeichen von LOH auf Chromosom 8p mit der Ausnahme von Proben, die von Patient 1510 stammten. Alle 3 "normalen" mikrosezierten Foci des Patienten 1510 zeigten extensives LOH im Einklang mit dem LOH-Muster, das in autologem Tumor beobachtet wurde. Dies verdeutlicht die Bedeutung der Verwendung von PBL als Normalkontrolle für diese Art von Untersuchung.
Tabelle 5: LOH auf Chromosom 8p in mikrosezierten Prostatageweben und unsterblich gemachte Zelllinien des Patienten 1542
LOH-Analyse von unsterblich gemachten Zelllinien des Patienten 1542. Verlust von Heterozygotie in Zellkulturen, die von Patient 1542 erzeugt wurden, war von besonderem Interesse hinsichtlich der verschiedenen Muster von LOH, die sich in 12 charakteristischen mikrosezierten Tumor-Foci zeigten. Dieser Patient lieferte aufschlussreiche Informationen bezüglich der Genorte D8S133, D8S136, D8S137, D8S131, D8S339 und ANK. Vier von diesen Genorten wurden auf Verlust von Allelen in Kulturen näher untersucht, die sich aus Tumoren normaler Prostata, normaler Samenblase und normalen Fibroblasten ableiteten (Tabelle 5). Wiederholte Analyse von „Bulk"-Kulturen früher Passagen (Passage 3, 6, 13) die aus Tumorgewebe gewonnen wurden und als 1542-CP₃TX bezeichnet wurden, zeigten keinen LOH für jeden der vier untersuchten Satellitenmarker. Jedoch zeigte 1542-CP₃TX nach 21 seriellen Kulturpassagen (ungefähr 6 Monate) einen Verlust des oberen Allels an allen vier untersuchten Genorten. Dieses Muster des Allelenverlustes war identisch mit dem Muster, das in dem mikrosezierten Tumorherd Nr. 7 gefunden wurde. Dreißig Einzelzellklone wurden aus Passage 23 von 1542-CP₃TX erzeugt. Alle Klone zeigten ein Muster an LOH, welches identisch mit dem der nicht klonierten späten Kulturpassage und des mikrosezierten Tumors Nr. 7 war. Dies deutete auf die klonale oder annähernd klonale Zusammensetzung der "Bulk-Late"-Passage-Zelllinie hin. Diese Befunde legten außerdem nahe, dass die Unfähigkeit, LOH in frühen Passagen von 1542-CP₃TX nachzuweisen, die Anwesenheit von multiplen Tumorklonen in der "Bulk"-Kultur, die verschiedene Muster an LOH besitzt, zeigen könnte, was den Nachweis von LOH mit einer PCR-basierten Technik ausschließen würde. Um dies zu untersuchen, wurden Einzelzellklone aus einer frühen Passage (Passage 8) von 1542-CP₃TX erzeugt und auf LOH untersucht (4). Sieben der neun Klone offenbarten kein LOH bei D8S136 oder D8S131, ähnlich der 3/12 mikrosezierten Tumore des Patienten 1542. Jedoch zeigte ein einzelner Klon (Klon 4) (1542-CP₃TX.8.4) ein Muster an LOH, was ähnlich zu dem des mikrosezierten Tumors Nr. 7, der späten Passage von 1542-CP₃TX und ihrer abgeleiteten Klone ist. Dies zeigt, dass der (die) Tumor-Klon(e), der (die) in der "Bulk"-Kultur der späten Passage vorherrschte(n), offensichtlich in sehr frühen Kulturpassagen vorherrschte(n). Interessanterweise zeigte Klon 1 (1542-CP₃TX.8.1) der frühen Passage 1542-CP₃TX ein anderes Muster an LOH als das, was bei den anderen 8 Klonen aus frühen Passagen mit Verlust der unteren Allelen von D8S133, D8S136 und D8S131 beobachtet wurde. Dies war wiederum im Einklang mit dem Muster an LOH, welches in zwei mikrosezierten Tumoren (Nr. 1 und Nr. 3) nachgewiesen wurde. Bemerkenswert ist, dass LOH nicht nachgewiesen werden konnte in wiederholten Experimenten mit frühen und späten Passagen von unsterblich gemachten Kulturen von normalem prostatischem Epithel der Samenblase oder von Fibroblasten des Patienten 1542. Dies spricht gegen die Wahrscheinlichkeit, dass der Verlust an Heterozygotie, der in Tumor-abgeleiteten Zellen beobachtet wurde, ein Artefakt der Kultur darstellte.
Untersuchung des Verlustes der Heterozygotie auf Chromosom 8p12–21 in Zellkulturen, die aus den fünf verbleibenden Patienten gewonnen wurden. In den Patienten 1510 und 1512 wurde LOH an verschiedenen Genorten in mikrosezierten Tumorproben nachgewiesen (Tabelle 4). Jedoch konnten unsterblich gemachte epitheliale Kulturen, die aus entsprechenden krebsenthaltenden Gewebeproben erzeugt worden waren, keinen Verlust der Heterozygotie zeigen, wenn sie auf dem "Bulk"-Niveau bei frühen oder späten Kulturpassagen untersucht wurden. In ähnlicher Weise konnten auch Klone, die aus späten Kulturpassagen (Passage 23 für 1510-CPTX, Passage 31 für 1512-CPTX) kein Vorhandensein an LOH anzeigen. Dies könnte das Vorhandensein bedeutender Mengen an normalem prostatischem Epithel in den Gewebeproben, aus denen diese Kulturen generiert wurden, widerspiegeln (Tabelle 2), verbunden mit einem übermäßigen Wachstum von normalen Zellen in vitro. Das Klonieren dieser Zellkulturen bei sehr frühen Kulturpassagen könnte vielversprechendere Resultate ergeben.
Die Untersuchung von mikrosezierten Tumor-Foci von den Patienten 1519 (ein Focus) und 1532 (8 Foci) zeigte keinen Verlust der Heterozygotie (Tabelle 4). Dennoch wurden Kulturen, die aus diesen Tumoren etabliert wurden, auf LOH geprüft. Im Falle des Patienten 1519 zeigte die Untersuchung der "Bulk"-Kultur 1519-CPTX die Beibehaltung der Heterozygotie bei 6 informativen Genorten, die untersucht wurden. Jedoch zeigte ein Zellklon aus 11 Einzelzellklonen, die aus Kulturpassage 24 gewonnen wurden, Verlust der Heterozygotie an einem einzigen Genort, D8S 133. Im Falle des Patienten 1532 zeigte die "Bulk"-kultivierte Linie 1532-CP₂TX, die aus einer von zwei Tumorzellproben (Tabelle 2) erzeugt wurde, einen Verlust der Heterozygotie bei D8S 133, D8S 136 und NEFL, dies allerdings nur nach anhaltender Kultivierung (Passage 24). Alle 10 Klone, die aus der späten Kulturpassage erzeugt wurden, zeigten ebenfalls das gleiche Verlustmuster. Jedoch zeigte eine unsterblich gemachte Kultur, die aus normalem Prostatagewebe des Patienten 1532 gewonnen wurde, kein Anzeichen von LOH, auch nicht nach 20 Kulturpassagen. In ähnlicher Weise behielt eine autologe, unsterblich gemachte Fibroblastenlinie Heterozygotie an den gleichen 3 Allelen bei, die bei 1532-CP₂TX verloren waren. Somit deutet der Verlust der Heterozygotie, der bei einem einzigen 1519-CPTX-Klon und bei 1532-CP₂TX beobachtet wurde, darauf hin, dass diese Befunde den Verlust der Heterozygotie widerspiegeln, der in einem In situ-Tumor-Focus vorhanden ist, der nicht für die Analyse seziert wurde.
Interessante Ergebnisse wurden mit Kulturen erhalten, die von Patient 1535 gewonnen wurden. In diesem Fall wurde ein umfassender Verlust der Heterozygotie in 6 verschiedenen mikrosezierten Tumor-Foci dokumentiert, wobei alle das gleiche Verlustmuster zeigten (Tabelle 4). Kulturen aus frühen und späten Passagen, die aus Prostatakrebs erzeugt wurden, sowie aus normaler Prostata und normaler Samenblase, zeigten keinen Verlust der Heterozygotie. In ähnlicher Weise zeigten 11 Tumorklone, die bei Kulturpassage 27 generiert wurden, keinen Verlust. Jedoch zeigte die Klonierung einer Tumorkultur einer frühen Passage (Passage 12) einen Klon mit einem Muster an LOH, welcher den 6 mikrosezierten Tumor-Foci glich (Klon 1535-CP₁TX.14.3). Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen des Patienten 1542 überein und sprechen dafür, dass die frühe Klonierung von unsterblich gemachten Kulturen, die aus histologisch heterogenen Prostatakrebsproben erzeugt wurden, notwendig sein könnte, um reine Tumorkulturen zu erhalten.
Expression von MHC-Molekülen durch unsterblich gemachte Zelllinien, die von Prostatakrebs abgeleitet sind. Die Untersuchung der Oberflächen-MHC-Expression auf unsterblich gemachten Tumor-abgeleiteten Zellenlinien war von Bedeutung bei der Betrachtung der potentiellen Nützlichkeit dieser Linien für immunologische Studien. Kulturen, die von allen 6 Patienten gewonnen wurden, exprimierten signifikante Oberflächenmengen an MHC-Klasse I und dem Adhäsionsmolekül ICAM-1, wie durch Fließzytometrie ermittelt wurde (Tabelle 6).
Tabelle 6: Zelloberflächenexpression von MHC- und Adäsionsmolekülen durch unsterblich gemachte epitheliale Prostatazelllinien
Keine der unsterblich gemachten Linien exprimierten nachweisbare Mengen an MHC-Klasse-II-Molekülen oder an der B7-Familie ko-stimulatorischer Moleküle (B7.1, B7.2). Jedoch war es von Interesse zu ermitteln, ob die Expression von MHC-Molekülen in Anwesenheit von IFN-γ hochreguliert werden könnte, wie vorher für Melanomzelllinen berichtet worden ist (29). Unsterblich gemachte Tumor-abgeleitete Zelllinien 1532-CP₂TX, 1535CP₁TX und 1542-CP₃TX wurden in Anwesenheit von 500 U/ml IFN-γ für 72 Std. kultiviert und anschließend auf MHC-Expression geprüft. Alle Zelllinien wurden zur Expression signifikanter Mengen an MHC-Klasse-II-Molekülen veranlasst. Zusätzlich wurde die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen erhöht im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (5C gegenüber 5A). Angesichts dessen repräsentieren diese unsterblichen tumorabgeleiteten Zelllinien potentiell wertvolle Reagenzien, um die CD4⁺ und CD8⁺-zellvermittelte Immunantwort in Patienten mit primären Adenokarzinom der Prostata zu studieren oder zu stimulieren.
HLA-Typisierung von epithelialen Prostatazelllinien. HLA-Typisierung wurde für jeden Patienten durchgeführt, von dem epitheliale Prostatazelllinien stammten. Typen A, B und C wurden durch Serotypisierung von Lymphozyten unter Verwendung von üblichen Methoden bestimmt. Die Typen DR und DQ wurden durch Genotypisierung von Lymphozyten nach üblichen Methoden bestimmt. Die Ergebnisse der HLA-Typisierung sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7
Literaturstellen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine isolierte, unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie oder Klon davon, gekennzeichnet durch mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie, wobei der allelische Verlust sich auf einem Chromosom befindet und das Chromosom Chromosom 8 ist, und die Zelllinie oder ein Klon davon sich von einem primären malignen Prostatatumor ableitet und der allelische Verlust in der Zelllinie oder einem Klon davon charakteristisch für einen Verlust in den malignen epithelialen Zellen im Prostatatumor ist.
Die unsterblich gemachte, maligne, humane, epitheliale Prostatazelllinie oder ihr Klon nach Anspruch 1, wobei sich mindestens ein allelischer Verlust auf Chromosom 8p befindet.
Die unsterblich gemachte, maligne, humane, epitheliale Prostatazelllinie oder ihr Klon nach Anspruch 1, wobei sich der allelische Verlust auf Chromosom 8p12–21 befindet.
Die unsterblich gemachte, maligne, humane, epitheliale Prostatazelllinie oder ihr Klon nach Anspruch 1, wobei sich der allelische Verlust auf mehr als einem Genort befindet.
Die unsterblich gemachte, maligne Zelllinie oder ihr Klon nach Anspruch 3, wobei sich der Verlust an einem Genort, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SFTP-2, D8S133, D8S136, D8S131, NEFL, D8S137, D8S339, ANK und Kombinationen davon, befindet.
Eine klonierte, unsterblich gemachte, maligne epitheliale Prostatazelllinie mit den identifizierenden Charakteristika einer klonierten, unsterblich gemachten epithelialen Prostatazelllinie 1535-CP₁TX.14.3, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12263, wobei diese Zelllinie einen Verlust der unteren Allele SFTP-2, D8S136 und D8S131, und einen Verlust der oberen Allele D8S133 und NEFL auf Chromosom 8 aufweist, wobei diese Zelllinie sich ableitet aus einem primären, malignen Prostatatumor und der allelische Verlust in der Zelllinie charakteristisch für einen Verlust in den malignen epithelialen Zellen im Prostatatumor ist.
Eine klonierte, unsterblich gemachte, maligne, epitheliale Prostatazelllinie, mit den identifizierenden Charakteristika einer klonierten, unsterblich gemachten, malignen epithelialen Prostatazelllinie 1542-CP₃TX.8.4, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12264, wobei diese Zelllinie einen Verlust der oberen Allele D8S133, D8S136 und D8S131 auf Chromosom 8 aufweist, wobei diese Zelllinie sich ableitet aus einem primären, malignen Prostatatumor und der allelische Verlust in der Zelllinie charakteristisch für einen Verlust in den malignen epithelialen Zellen im Prostatatumor ist.
Eine klonierte, unsterblich gemachte, maligne, epitheliale Prostatazelllinie mit den identifizierenden Charakteristika einer klonierten, unsterblich gemachten, malignen, epithelialen Prostatazelllinie 1542-CP₃TX.8.1, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12265, wobei diese Zelllinie einen Verlust der unteren Allele D8S133, D8S136 und D8S131 auf Chromosom 8 aufweist, wobei diese Zelllinie sich ableitet aus einem primären, malignem Prostatatumor und der allelische Verlust in der Zelllinie charakteristisch ist für einen Verlust in den malignen epithelialen Zellen im Prostatatumor.
Eine klonierte, unsterblich gemachte, maligne, epitheliale Prostatazelllinie 1535-CP₁TX.14.3, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12263, wobei diese Zelllinie gekennzeichnet ist durch mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie und sich mindestens ein allelischer Verlust auf Chromoson 8p befindet.
Eine klonierte, unsterblich gemachte, maligne, epitheliale Prostatazelllinie 1542-CP₃TX.8.4, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12264, wobei diese Zelllinie gekennzeichnet ist durch mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie und sich mindestens ein allelischer Verlust auf Chromoson 8p befindet.
Eine klonierte, unsterblich gemachte, maligne, epitheliale Prostatazelllinie 1542-CP₃TX.8.1, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12265, wobei diese Zelllinie gekennzeichnet ist durch mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie und sich mindestens ein allelischer Verlust auf Chromoson 8p befindet.
Eine unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie 1532-CP2TX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12038, wobei diese Zelllinie gekennzeichnet ist durch mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie und diese Zelllinie sich ableitet von einem primären, malignen Prostatatumor und der allelische Verlust in der Zelllinie charakteristisch ist für einen Verlust in den malignen epithelialen Zellen im Prostatatumor.
Eine unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie 1535-CP₁TX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12041, wobei diese Zelllinie gekennzeichnet ist durch mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie und diese Zelllinie sich ableitet von einem primären, malignen Prostatatumor und der allelische Verlust in der Zelllinie charakteristisch ist für einen Verlust in den malignen epithelialen Zellen im Prostatatumor.
Eine unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie 1542-CP3TX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12037, wobei sich mindestens ein allelischer Verlust auf Chromosom 8p befindet.
Die unsterblich gemachten, malignen, humanen, adulten, epithelialen Prostatazelllinien nach den Ansprüchen 1–14, weiterhin gekennzeichnet durch Expression von MHC Klasse I-Molekülen, ICAM-1-Molekülen und IFN-γ-induzierbaren MHC Klasse II-Molekülen.
Eine Zusammensetzung, umfassend die unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie 1532-CP2TX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12038, und die autologe, unsterblich gemachte, normale, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie 1532-NPTX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12036.
Eine Zusammensetzung, umfassend die unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie 1535-CP1TX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12041, und die autologe, unsterblich gemachte, normale, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie 1535-NPTX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterleungsnummer CRL-12039.
Eine Zusammensetzung, umfassend die unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie 1542-CP3TX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnumer CRL-12037, und die autologe, unsterblich gemachte, normale, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie 1542-NPTX, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12040.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine unsterblich gemachte, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie oder ihrem Klon nach den Ansprüchen 1–14 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, weiterhin umfassend ein Adjuvans, ein Ko-stimulatorisches Molekül, ein Zytokin, ein Chemokin, ein Adhäsionsmolekül, ein MHC-Molekül oder eine Kombination davon.
Ein Immunogen für das Hervorrufen einer Immunantwort spezifisch für ein Prostatakrebsprotein oder ein antigenes Teil davon, umfassend eine unsterblich gemachte, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie oder ihrem Klon nach den Ansprüchen 1–14.
Das Immunogen nach Anspruch 21, weiterhin umfassend ein Adjuvans, ein Zytokin, ein Ko-stimulatorisches Molekül, ein Chemokin, ein Adhäsionsmolekül, ein MHC-Molekül oder eine Kombination davon.
Das Immunogen nach Anspruch 21, wobei die Immunantwort eine zellvermittelte Antwort ist.
Das Immunogen nach Anspruch 21, wobei die Immunantwort eine humorale Antwort ist.
Ein Prostatakrebsvakzin, umfassend eine unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostatazelllinie oder ihrem Klon nach den Ansprüchen 1–14.
Das Prostatakrebsvakzin nach Anspruch 25, weiterhin umfassend ein oder mehrere Gene kodierend für Zytokine, Chemokine, Ko-stimulatorische Moleküle, Adhäsionsmoleküle oder MHC-Moleküle, die in die Zelle inkorporiert sind.
Ein Suchverfahren für einen möglichen therapeutischen Wirkstoff, umfassend dem Aussetzen einer unsterblich gemachten, adulten, epithelialen Prostatazelle nach den Ansprüchen 1–14 dem zu untersuchenden Wirkstoff und der Bewertung der Wirkung des Wirkstoffs auf die Zelle.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Wirkung Zytotoxizität ist.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Wirkung Inhibition von Zellwachstum ist.
Ein Kit, umfassend mindestens eine unsterblich gemachte, adulte, epitheliale Prostatazelllinie nach den Ansprüchen 1–14.
Der Kit nach Anspruch 30, weiterhin umfassend: eine autologe, unsterblich gemachte, normale, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie, wobei sich die normalen und malignen Zelllinien aus demselben primären, malignen Prostatatumor ableiten.
Der Kit nach Anspruch 31, wobei die unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie 1532-CP2TX ist, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12038, und die autologe, unsterblich gemachte, normale, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie 1532 NPTX ist, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12036.
Der Kit nach Anspruch 31, wobei die unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie 1535-CP₁TX ist, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12041, und die autologe, unsterblich gemachte, normale, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie 1535 NPTX ist, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12039.
Der Kit nach Anspruch 31, wobei die unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie 1542-CP3TX ist, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12037, und die autologe, unsterblich gemachte, normale, humane, adulte epitheliale Prostatazelllinie 1542 NPTX ist, hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL-12040.
Verfahren zur Herstellung einer unsterblich gemachten, malignen, humanen, adulten, epithelialen Prostatazelle, wie in Anspruch 1 definiert, aus einem primären, malignen Prostatatumor, umfassend: A. Anlegen einer Zellkultur von Epithelzellen aus einem primären, malignen, humanen, adulten Prostatatumor, B. Unsterblichmachen der epithelialen Prostatazellen, C. Einzelzellklonierung einer unsterblich gemachten, humanen, adulten, epithelialen Prostatazelllinie einer frühen Passage, und D. Auswählen von Zellen, die mindestens einen allelischen Verlust der Heterozygotie auf mindestens einem Chromosom aufweisen, wobei sich der allelische Verlust auf Chromosom 8 befindet, und der Verlust charakteristisch ist für die unsterblich gemachte, maligne, humane, adulte, epitheliale Prostatazelle in dem primären malignen Prostatatumor.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das Chromosom 8p ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Verlust auf mindestens einem Allel, ausgewählt aus der Region 8p12–21, ist.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend die DNA oder RNA aus den unsterblich gemachten, malignen, humanen, adulten epithelialen Prostatazellen nach einem der Ansprüche 1– 15, wobei die DNA genomisch ist.
Verfahren zum Identifizieren und Klonieren neuer Gene, die einmalig für maligne, epitheliale Prostatazellen oder in diesen überexprimiert sind, umfassend RNA-subtraktive Analyse von Nukleinsäure, isoliert aus den unsterblich gemachten, normalen, humanen, adulten, epithelialen Prostatazellen wie in den Ansprüchen 32–34 definiert, aus Nukleinsäure, isoliert aus den unsterblich gemachten, malignen, humanen, adulten, epithelialen Prostatazellen wie in den Ansprüchen 32–34 definiert, gefolgt von der Identifizierung und Klonierung von neuen Genen, die einmalig für maligne Zellen oder auf diesen überexprimiert sind und die nicht in normalen Zellen gefunden werden oder auf ihnen unterexprimiert sind.