DE69731983T2 - Verwendung von molt4 cd69 expression zur bestimmung der anwesenheit und der aktivität von interferoninhibitoren - Google Patents

Verwendung von molt4 cd69 expression zur bestimmung der anwesenheit und der aktivität von interferoninhibitoren Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Aktivität von Interferoninhibitoren in einer Probe. Ist die Probe menschliches Serum, werden durch die Messung des Vorhandenseins und der Aktivität von Interferoninhibitoren, die in dem Serum vorliegen, Informationen über die Fähigkeit der Interferone, die in dem Serum vorliegen, zur Stimulierung der Aktivität des Immunsystems erhalten.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Frühere Forschungsarbeiten deuten stark darauf hin, dass es bestimmte biologische Faktoren gibt, die entweder die Aktivität oder die Produktion oder beides von Interferonen (IFN) inhibieren. So wird die Aktivität von exogenen IFN durch das Vorhandensein dieser bis jetzt noch nicht charakterisierten IFN-Inhibitoren eindeutig verringert.
  • Zurzeit wird IFN routinemäßig zur Behandlung von vielen verschiedenen Krankheitszuständen eingesetzt, insbesondere von neuroimmunologischen Malignitäten und Immundefekten. Es hat sich jedoch eindeutig herausgestellt, dass die Wirksamkeit der Behandlung mit IFN sowohl für einen gegebenen Patienten als auch die Toleranz eines gegebenen Patienten gegenüber der Behandlung mit IFN über einen weiten Bereich variiert. Daher würde es hilfreich sein, die potentielle Wirksamkeit und Empfindlichkeit eines gegebenen Patienten in Bezug auf eine Behandlung mit IFN zu bestimmen. Es wird angenommen, dass die Wirksamkeit und die Empfindlichkeit eines gegebenen Patienten für eine Behandlung mit IFN wesentlich durch das Vorhandensein von IFN-Inhibitoren im Serum der Patienten beeinflusst wird. Eine Abschätzung des Vorhandenseins und/oder der Aktivität dieser IFN-Inhibitoren würde daher wertvolle Informationen über die Aktivität entweder von nativen oder exogenen IFN im Serum des Patienten liefern.
  • Bekannte Verfahren zur Abschätzung der IFN-Aktivität als solcher oder des Vorhandenseins von IFN-Inhibitoren fallen unter drei breite Kategorien:
    • 1. Inhibierung des Virenschutzes: Interferone erhielten ihren Namen aufgrund ihrer Fähigkeit in Virusinfektionen von Zellen einzugreifen. Der am weitesten verbreitete IFN-Test umfasst die Inkubation von Verdünnungen von Probenserum mit einer amniotischen Zelllinie (WISH-Zellen) über einen Zeitraum von einigen Stunden bis 24 Stunden und anschließende Zugabe eines Virus, der für die WISH-Zellen pathogen ist. In dem Testserum vorhandenes Interferon bewirkt den Schutz der WISH-Zellen gegen eine Infektion mit dem zugesetzten Virus. Der Grad des Schutzes der WISH-Zellen gegen den Virus, der als WISH-Zelltod gemessen wird, ist proportional zu der Menge an IFN in dem Testserum. Dieses Verfahren wurde für die Messung der Aktivität von IFN-Inhibitoren in dem Testserum angepasst. Verdünnungen eines Testserums werden einer Interferonmenge zugesetzt, von der bekannt ist, dass sie einen 90–100%igen Schutz der WISH-Zellen bewirkt, wenn diese einem Virus ausgesetzt werden. Der Test wird dann wie vorstehend beschrieben, durchgeführt und es wird die Lebensfähigkeit der WISH-Zellen in Gegenwart der Testseren mit der Lebensfähigkeit von WISH-Zellen verglichen, die nur IFN ausgesetzt werden. Das Vorliegen von IFN-Inhibitoren in den Testproben ist bestätigt, wenn der Grad des Virenschutzes in den Testproben im Vergleich zu den Kontrollen verringert ist. Vergleiche Havredaki, M. und Barona, F. (1985) "Variations of interferon inactivators and/or inhibitors in human serum and their relationship to interferon therapy," Japan J. Med. Sci. Biol. 38: 107–111; und Kawade, Y und Watanabe, Y. (1984) "Neutralization of interferon by antibody: Appraisals of methods of determining and expressing neutralization titer, "J. of Interferon Res. 4: 571–584.
    • 2. Inhibierung der Monozyten-Fc-Rezeptorexpression gemessen mittels roter Blutkörperchenrosette: Es ist bekannt, dass Interferone die Expression von Fc-Rezeptoren auf Monozyten erhöhen. Bei der Methode von Rhodes et al., (1984) "Human tumor-induced inhibition of interferon action in vitro: Reversal of inhibition by β-carotene (provitamin A), "Cancer Immunol. Immunother. 16: 189–192, werden Antikörper beschichtete Erythrocyten eingesetzt, um den relativen Grad der Fc-Rezeptor-Expression von Monozyten zu messen. Die Anzahl an roten Blutkörperchen, die um die Monozyten herum Rosetten ausbilden, die mikroskopisch gezählt werden, ist proportional zur Anzahl der Fc-Rezeptoren auf der Monozytenmembran. Die Autoren setzen dieses Verfahren ein, um das Vorliegen von IFN-Inhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht im Serum und in Kulturüberständen von Zelllinien zu bestimmen. Liegt ein Inhibitor vor ist die Anzahl an roten Blutkörperchen, die um die Monozyten herum Rosetten ausbilden, im Vergleich zu Kontrollen, die nur IFN enthalten, verringert.
    • 3. Enzym verbundener Immunoassay (ELISA) für Interferonantikörper: Es sind kommerzielle Kits erhältlich, die das Vorhandensein von Antikörpern gegen verschiedene IFNs messen. Beispielsweise ist rekombinantes IFN α2a eine Interferonform, die häufig therapeutisch verwendet wird. Es wird angenommen, dass etwa 20% der Patienten, die so behandelt werden, neutralisierende Antikörper gegen das IFN entwickeln. Das kommerziell erhältliche Doppelantikörpersandwich ELISA-Format.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Das Verfahren umfasst die Stufen der Kultivierung von MOLT4-Zellen, die in Gegenwart von Interferon α2a durch Interferon induzierbares CD69 Antigen exprimieren, wodurch die Expression der CD69 Antigene induziert wird. Jeweils ein Aliquot der kultivierten Zellen wird dann einer Probe und einer Kontrollprobe zugesetzt. Die bevorzugte Probe ist menschliches Blutserum eines bestimmten menschlichen Patienten, wobei die entsprechende Kontrollprobe ein gepooltes menschliches Blutserum ist. Die Expression des durch Interferon induzierbaren Antigens in den kultivierten Zellen der Probe und den kultivierten Zellen der Kontrollprobe wird dann gemessen und verglichen. Durch den Vergleich der Menge an exprimierten Antigen in der Probe und der Kontrollprobe wird das Vorhandensein und die Aktivität der Interferoninhibitoren in der Probe quantifiziert.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Aktivität von Interferoninhibitoren in menschlichem Blutserum umfassend die Stufen der Kultivierung von MOLT4-Zellen in Gegenwart einer Menge an Interferon α2a, die ausreicht, um die Expression von CD69 Antigen in den MOLT4-Zellen zu induzieren.
  • Ein Aliquot der kultivierten MOLT4-Zellen wird dann einer Probe von menschlichem Blutserum eines Patienten und einer Kontrollprobe von kommerziell erhältlichem gepoolten menschlichen Blutserum zugesetzt. Ein Aliquot an Fluorophor markierten monoklonalen Anti-CD69-Antikörpern wird dann der Probe und der Kontrollprobe zugesetzt. Das CD69 Antigen, das auf den MOLT4-Zellen der Probe und den MOLT4-Zellen der Kontrollprobe exprimiert wird, wird dann mittels Durchflusszytometrie bestimmt und die zwei Werte verglichen, um das Vorhandensein und die Aktivität von Interferoinhibitoren in der Probe zu bestimmen.
  • Ein praktischer Nutzen der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass sie ein Verfahren zur Bestimmung der potentiellen Empfindlichkeit eines bestimmten Patienten für die Therapie mit IFN darstellt. Den Patienten, deren Serum eine hohe IFN-Inhibitoraktivität aufweist, können dann größere Dosen an IFN verabreicht werden, um die nachteiligen Effekte der IFN-Inhibitoraktivität auszugleichen und so eine therapeutisch wirksame Dosierung an IFN zu erhalten. Im Gegensatz dazu können Patienten, die nur eine geringe oder keine IFN-Inhibitoraktivität aufweisen, sehr gut auf Behandlungen mit IFN ansprechen, für die wesentlich geringere Dosen an IFN eingesetzt werden, wodurch nachteilige Nebeneffekte der IFN-Behandlung selbst vermieden oder minimiert werden. Kurz gesagt, durch die Bestimmung des Vorhandenseins und der Aktivität von IFN-Inhibitoren können Ärzte therapeutische Behandlungen mit IFN entsprechend anpassen.
  • Das Verfahren ist auch als ein Mittel zum Aufzeigen des möglichen Vorliegens von Autoimmunkrankheitszuständen, viralen oder malignen neoplastischen Krankheitszuständen in der zu untersuchenden Person geeignet. Wie in den nachfolgenden Beispielen aufgezeigt, werden diese Krankheitszustände im Allgemeinen von einer erhöhten Aktivität von IFN-Inhibitoren im Serum begleitet.
  • Das Verfahren ist auch zur Überwachung der Wirksamkeit von fortgesetzten Behandlungen mit IFN geeignet, wobei das Vorliegen von IFN-Inhibitoren in dem Patienten im Verlauf der Therapie evaluiert wird. Verringert sich die Aktivität der IFN-Inhibitoren kann die Dosis an verabreichtem IFN entsprechend verringert werden.
  • Der Hauptvorteil des vorliegenden Verfahrens ist, dass es ein effizienter, schneller und leicht durchzuführender in vitro Assay zur Messung des Vorhandenseins und der Aktivität von Faktoren ist, die die biologische Aktivität von endogenen oder exogenen IFN nachteilig beeinflussen.
  • Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach dem vollständigen Lesen der "ausführlichen Beschreibung" und der anliegenden Ansprüche ersichtlich.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist ein Diagramm, das die mittlere Zunahme der CD69-Expression von MOLT4-Zellen aufzeigt, die in Gegenwart von IFN α2a und von Serum von 21 gesunden Spendern kultiviert wurden. Vergleiche Beispiel 1.
  • 2 ist ein Diagramm, das die Inhibierung der Fähigkeit von IFN zeigt, die Expression von CD69-Antigen in MOLT4-Zellen zu induzieren, durch den Zusatz eines Anti-IFN-Antikörpers zu der Kultur. Vergleiche Beispiel 2.
  • 3 ist ein Diagramm, das die mittlere Zunahme der CD69-Expression von MOLT4-Zellen zeigt, die in Gegenwart von Patientenserum kultiviert wurden, im Vergleich zur CD69-Expression in Kontrollkulturen von MOLT4-Zellen (linkes Histogramm) und die IFN-Aktivität (rechtes Histogramm) in Serum von drei Patienten mit remittierenden Autoimmunkrankheiten: zwei mit remittierender Psoriasis und einer mit remittierender Multipler Sklerose.
  • 4 ist ein Diagramm, das die CD69-Expression in sieben Patienten mit remittierenden bösartigen Krebsformen zeigt. Das linke Histogramm zeigt die mittlere Zunahme der CD69-Expression, das rechte Histogramm zeigt den Gehalt an endogenen IFN, der in den einzelnen Serumproben gefunden wurde (U/mL). Die Patientenpopulation bestand aus drei Patienten, die an chronischer myeloischer Leukämie (CML) litten, einem Patienten, der an chronischer lymphozytischer Leukämie (CML) litt, und drei Patienten, die bösartige Melanome hatten. Alle sieben Patienten befanden sich in der Remission.
  • 5 ist ein Diagramm, das einen Vergleich der CD69-Expression von Patienten, die an verschiedenen akuten Krankheitszuständen litten, und Patienten, die sich in der Remission befanden, zeigt. Das hier beschriebene Verfahren wurde an Seren von vierzehn Patienten, die an akuten Krankheitszuständen litten, und von 10 Patienten, deren Krankheitszustand remittierend war, durchgeführt. Bei den Krankheitszuständen handelte es sich um Psoriasis, Multipler Sklerose, erworbenes Immunschwächesyndrom (Aids), Hepatitis C, Myelome, chronische myeloische Leukämie (CML), chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Melanome, Magenkrebs, Brustkrebs und Prostatakrebs. Dargestellt ist die mittlere Zunahme der CD69-Expression in MOLT4-Zellen für jeden Patienten (linkes Histogramm) sowie der Gehalt an IFN (rechtes Histogramm). Vergleiche Beispiel 5.
  • 6 ist ein Diagramm, das das berechnete Niveau der IFN-Inhibierung in Prozent bezogen auf die Aktivität von IFN in den Kontrollen derselben Patientenpopulation wie in Beispiel 5 zeigt. Wie in Beispiel 5 umfasste diese Probe 14 Patienten, die an akuten Krankheitszuständen litten, gegenüber 10 Patienten, die sich in der Remission befanden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen
  • Die folgenden Definitionen dienen einem eindeutigen und widerspruchsfreien Verständnis der Bedeutung und des Umfanges von bestimmten Ausdrücken, die in dieser Beschreibung verwendet werden.
  • "Monoklonaler Anti-CD69 Antikörper", "Anti-CD69 mAb": ein monoklonaler Antikörper, der für das CD69-Antigen spezifisch ist. Mit Phycoerythrin markierter Anti-CD69 mAb ist kommerziell von Becton Dickinson, Mountain View, Kalifornien (Cat. #347827) erhältlich. Der L78-Klon, der von Becton Dickinson eingesetzt wird, um diesen Antikörper herzustellen, wird erhalten durch die Hybridisierung von SP2/0-Ag14 Mausmyelomzellen mit Lymphknotenzellen von BALB/C-Mäusen, die mit einer zytotoxischen T-Lymphozytenzelllinie, die gegen CD8+ Alloantigen gerichtet ist, immunisiert sind. Die Zusammensetzung der Immunglobulinketten des Antikörpers besteht aus langen Maus-IgG1-Ketten und kurzen Kappaketten.
  • "CD69 Antigen" oder "CD69 Molekül": Ein oberflächengebundenes Antigen, das von nahezu allen T-Zellen nach Aktivierung exprimiert wird. Das CD69 Antigen ist ein Heterodimer, das eine Untereinheit mit 32 kDa und eine Untereinheit mit 28 kda enthält, die über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Unter normalen Kulturbedingungen wird das CD69 Antigen ohne weiteres von MOLT4-Zellen nach Aktivierung exprimiert.
  • "Interferon(e)", "IFN(s)": eine Familie von mehr als 50 nahe verwandten Glycoproteinen, die antivirale, immunregulatorische und antiproliferative Aktivität besitzen. Für die vorliegende Erfindung umfasst der Ausdruck alle Interferonarten und Unterarten aus beliebigen Quellen, einschließlich menschliche, nicht menschliche und rekombinante Interferone. Die immunregulatorische Wirkung der Interferone wie die Erhöhung der Killerlymphozytenaktivität, Zunahme der Expression von histokompatiblen Antigenen, Aktivierung von Monozyten und Makrophagen und Regulierung anderer B-Zellfunktionen, hat sich als klinisch bedeutend herausgestellt. Beispielsweise wird IFN eingesetzt, um Knochenmark gegen die toxischen Nebenwirkungen von Chemotherapien zu schützen. Ein weiteres Beispiel für die therapeutische Anwendung von IFN ist die Zunahme von klinischen Remissionen von Krankheiten wie Haarzellenleukämie, chronischen myeloischen Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphomen und multiplen Myelomen durch die Behandlung mit IFN allein oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln.
  • "Interferon(IFN)-Inhibitoren" oder "Interferon-Inhibitorfaktoren": Ein Mittel oder Mittel, die in Tierseren gefunden werden, die die Herstellung und/oder Aktivität von IFNs inhibieren.
  • Im Fall von exogenen IFNs inhibieren die IFN-Inhibitoren die biologische Aktivität des zugesetzten IFN. Untersuchungen deuten darauf hin, dass bei Patienten, die an bestimmten Krankheitszuständen leiden, IFN-Inhibitoren entweder gleichzeitig bei der Produktion von endogenen IFN produziert werden, wodurch die heilsame Aktivität von IFN limitiert wird, oder die IFN-Inhibitoren eine Verringerung der Produktion an endogenen IFN bewirken. In jedem Fall ist die biologische Gesamtaktivität von IFN-Inhibitoren die Inhibierung der Aktivität von IFN.
  • "MOLT4": Eine T-Lymphoblastenleukämiezelllinie, die von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Zugriffsnummer ATCC CRL-1582 erhalten werden kann. Wie der Großteil von T-Zellen kann diese Zelllinie schnell zur Expression des Oberflächenantigens CD69 induziert werden. Vergleiche zum Beispiel Bjorndahl, J. M., et al. (1988), "The 28 kDa/32 kDa activation antigen EA1; further characterization and signal requirements for its expression," J. Immunol. 141: 4094.
  • Vorgehensweise
  • Die vorliegende Erfindung ist ein in vitro Verfahren, das die Inhibierung der Expression eines durch IFN induzierbaren Antigens benutzt, um das Vorhandensein und die Aktivität von IFN-Inhibitoren zu messen. Wenn sie IFN ausgesetzt werden, werden immunkompetente Zellen aktiviert und exprimieren bestimmte durch IFN induzierbare Antigene auf ihren Zelloberflächen. Sind jedoch IFN-Inhibitoren vorhanden, was der Fall ist, wenn der Patient an bestimmten verschiedenen Krankheitszuständen leidet, ist die Expression des durch IFN-induzierbaren Antigens aufgrund der Wechselwirkung zwischen IFN und den IFN-Inhibitoren inhibiert. Dies bewirkt, dass die Zellen von den biologischen Wirkungen von IFN abgeschirmt werden. Daher liefert die Bestimmung des Umfangs der Inhibierung der Expression des durch IFN induzierbaren Antigens quantitative Daten über das Vorhandensein und die Aktivität von IFN-Inhibitoren, die in der Probe vorliegen. Durch Vergleich des Umfangs der Inhibierung in einer Probe und in einer Kontrollprobe ohne IFN-Inhibitoren kann die IFN inhibierende Aktivität der Probe bestimmt werden.
  • Der erste Schritt des Verfahrens ist die in vitro Kultivierung von Zellen, die in Gegenwart eines Interferons ein durch Interferon induzierbares Antigen exprimieren, sodass die Expression des durch Interferon induzierbaren Antigens induziert wird. Die bevorzugte Zelllinie für die Kultivierung ist die lymphoplastische Leukämiezelllinie MOLT4. Diese Zelllinie exprimiert ohne Weiteres das CD69 Antigen, wenn es einer aktivierenden Konzentration an IFN ausgesetzt wird.
  • Obwohl die folgende Beschreibung auf den Einsatz der bevorzugten MOLT4 Zelllinie beschränkt ist, dient diese abgekürzte Diskussion lediglich der Knappheit und Klarheit. Für das erfindungsgemäße Verfahren können verschiedene Zelllinien, die verschiedene durch IFN induzierbare Antigene exprimieren, eingesetzt werden. Die MOLT4 Zelllinie ist bevorzugt, da sie ohne Weiteres in Kultur wächst und aufgrund ihrer vorhersagbaren Expression des CD69 Antigens. Jedoch können andere Zelllinien und exprimierte andere durch IFN induzierbare Antigene mit gleichem Erfolg eingesetzt werden.
  • Das bevorzugte IFN für den Einsatz für die vorliegende Erfindung ist IFN α2a. Jedoch können auch andere Unterarten von IFNs mit Erfolg eingesetzt werden.
  • Ein Aliquot der kultivierten Zellen wird dann einer Testprobe und einer Kontrollprobe zugesetzt. Das Zellen/Probengemisch wird dann in vitro über einen beliebigen Zeitraum von etwa 24 bis 72 Stunden unter Standardkulturbedingungen (37°C, 5% CO2, 100% Luftfeuchtigkeit) kultiviert.
  • Die bevorzugte Testprobe ist menschliches Blutserum eines individuellen menschlichen Patienten. Die entsprechende bevorzugte Kontrollprobe ist ein Aliquot eines gepoolten menschlichen Blutserums von gesunden Personen.
  • Die Expression des durch Interferon induzierbaren Antigens in den kultivierten Zellen der Testprobe und in den kultivierten Zellen der Kontrollprobe wird dann gemessen und verglichen. Durch den Vergleich der Menge an exprimierten Antigenen in der Testprobe und der Kontrollprobe wird das Vorliegen und die Aktivität von Interferoninhibitoren in der Testprobe quantifiziert.
  • Die Messung des Umfangs der Antigenexpression in den Test- und Kontrollproben kann am einfachsten und genauesten mittels Durchflusszytometrie durchgeführt werden. Dieses Verfahren wird aufgrund seiner Flexibilität, Effizienz und Geschwindigkeit am meisten bevorzugt. Werden Zellen eingesetzt, die das bevorzugte CD69 Antigen exprimieren, können die Zellen, die das CD69 Antigen exprimieren, einfach bestimmt werden, indem die Zellen einer Sättigungsmenge an Fluorophor markierten Anti-CD69 mAb ausgesetzt werden, mAb ist für CD69 spezifisch und bindet an die Zellen, die das Antigen exprimieren. Die Zellen, die CD69 exprimieren, werden dann anhand des kennzeichnenden Fluoreszenzsignals identifiziert, das von dem Fluorophor emittiert wird, wenn es mit Laserlicht einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird. Das bevorzugte Fluorophor ist Phycoerythrin, das eine Strahlung von 580 nm emittiert, wenn es mit einer Lichtquelle von 488 nm angeregt wird.
  • Es können auch quantitative Vorrichtungen oder Protokolle eingesetzt werden, die vergleichbare Daten hinsichtlich der Expression eines bestimmten Antigens liefern. Das Verfahren zur Bestimmung der Menge an exprimiertem Antigen ist nicht kritisch, solange das Verfahren genaue und präzise Daten liefert.
  • Gemäß der am meisten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Vorhandensein und die Aktivität von Interferoninhibitoren in menschlichem Blutserum quantifiziert. Im ersten Schritt wird eine Stammkultur an MOLT4 Zellen, ATCC CRL-1582, in Gegenwart einer ausreichenden Menge an IFN α2a zur Induzierung der Expression von CD69 Antigen in den MOLT4 Zellen angesetzt. Ein Aliquot der kultivierten MOLT4 Zellen wird dann einer Probe von menschlichem Blutserum eines individuellen Patienten und einer Kontrollprobe von kommerziell erhältlichen gepoolten menschlichen Blutserum zugesetzt. Ein Aliquot an Fluorophor markierten monoklonalen Anti-CD69-Antikörpern wird dann der Probe und der Kontrollprobe zugesetzt. Das CD69 Antigen, das an den MOLT4 Zellen der Probe und den MOLT4 Zellen der Kontrollprobe exprimiert wird, wird dann mittels Durchflusszytometrie bestimmt und die zwei Werte verglichen, um das Vorhandensein und die Aktivität von Interferoninhibitoren in der Probe zu bestimmen.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sind allein aus dem Grund eingefügt, um einen vollständigeren Verständnis der vorliegenden Erfindung zu dienen. Die Beispiele limitieren den Umfang der beschriebenen und hier beanspruchten Erfindung in keiner Weise.
  • Die folgenden beispielhaften Reagenzien und Ausstattungen und kommerziellen Lieferanten hierfür wurden für die Beispiele eingesetzt. Äquivalente Reagenzien und Ausstattungen können von verschiedenen anderen nationalen und internationalen kommerziellen Lieferanten bezogen werden.
  • Durchflusszytometer: "FACScan" Modell, von Becton Dickinson, Mountain View, Kalifornien, USA.
  • Monoklonaler Anti-CD69 Antikörper: mit Phycoerythrin konjugierter monoklonaler Anti-CD69 Antikörper von Becton Dickinson, Mountain View, Kalifornien, Katalog-Nr. 347827.
  • Anti-IFN Antikörper: Antimenschlicher polyklonaler Schafsantikörper gegen menschliches Interferon Alpha von Sigma Corporation, St. Louis, Missouri, USA.
  • Rekombinantes IFN α2a (3.000.000 Einheiten/mL): erhältlich von Roche Laboratories, einer Abteilung von Hoffman-LaRoche Inc, Nutley, New Jersey, USA eingetragen unter dem Warenzeichen "ROFERON-A".
  • MOLT4 T-Zellen-Leukämiezellen: ATCC CRL-1582; gelagert in Kultursuspension und in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/mL eingesetzt. Die Durchsatzzahl der MOLT4-Zellen sollte nach Erhalt dieser Zelllinie von der ATCC unter 300 gehalten werden. Vorzugsweise ist die Lebensfähigkeit der MOLT4-Zellen, die für dieses Verfahren eingesetzt werden, größer als 90%. Ist die Lebensfähigkeit der Zellen geringer als 90%, könnte die Empfindlichkeit des Tests nachteilig beeinträchtigt werden.
  • Lyophilisiertes gepooltes menschliches Serum wurde von Sigma Corporation bezogen.
  • HERSTELLUNG DER REAGENZIEN
  • RPMI 1640 MEDIUM
  • 10% RPMI 1640 (1 ×) G, G-verstärkt, alle Komponenten von Sigma Corporation erhältlich:
  • Figure 00130001
  • Die vorstehenden Komponenten wurden zusammengegeben und sorgfältig miteinander in einer sterilen Werkbank (laminar flow hood) vermischt. Phenolrot wird verwendet, um einen visuellen Check der Medienfarbe auf einen geeigneten pH durchzuführen. Das vorbereitete Medium ist 3 Monate stabil, wenn es gekühlt bei 2 bis 8°C gelagert wird.
  • PATIENTENKULTURMEDIUM
    Figure 00140001
  • 250,0 ml an RPMI (1 ×) 250,0 mL an IMDM in sterilen Messzylindern werden in einer sterilen Werkbank auf einem 500,0 mL sterilen Filter mit einer 0,22 mm Celluloseacetatmembran mit einem 60 mm Vorfilter zusammengegeben. Fötales bovines Serum (FBS) wird mit sterilen Einmalpipetten zugesetzt. Alle anderen aufgeführten Bestandteile werden unmittelbar vor dem Einsatz zugesetzt. Phenolrot wird eingesetzt, um einen visuellen Check der Medienfarbe auf einen geeigneten pH durchzuführen. Das hergestellte Medium ist 3 Monate stabil, wenn es gekühlt bei 2 bis 8°C gelagert wird.
  • IFN α2a
  • Wird es in lyophilisierter Form geliefert, sollte das IFN α2a gemäß der Anweisung des Herstellers reaktiviert werden. Die Konzentrationen der Stammlösung kann von Lieferant zu Lieferant differieren. 100 μL IFN α2a (3 × 106 U/mL) werden in ein steriles 14 mL Röhrchen gegeben und 9,9 mL 10%iges RPMI zugesetzt. Der Röhrcheninhalt wird sorgfältig vermischt. Die erhaltene Lösung enthält 30.000 U/mL IFN. 100 μL der ersten Verdünnung wird einem weiteren 14 mL Röhrchen zugesetzt und weitere 9,9 mL 10%iges RPMI wird zugesetzt. Der Röhrcheninhalt wird wiederum vermischt. Die erhaltene Lösung enthält 300 U/mL. Drei (3) mL der 300 U/mL IFN-Lösung wird in ein 50 mL konisches Messröhrchen gegeben und 42 mL Patientenkulturmedium (vorstehend definiert) wird zugesetzt. Der Röhrcheninhalt wird 5 bis 10 Sekunden vermischt. Die erhaltene Lösung enthält eine Arbeitskonzentration an IFN α2a. Aliquots der Arbeitslösung (1,5 mL) werden in 6 mL sterile Röhrchen mit Kappen verteilt und können bei –40°C bis zu 3 Monaten gelagert werden.
  • Antimenschlicher polyklonaler Schafsantikörper
  • Antimenschlicher polyklonaler Schafsantikörper wird in 3 mL Aliquots mit 1.000 neutralisierenden Einheiten/mL bei –40°C einsatzbereit gelagert. Er wird dann bei 37°C aufgetaut und mittels Inversion vermischt bis das gesamte Protein resuspendiert ist. Ein 2 mL Aliquot an aufgetautem Antikörper wird einem 50 mL sterilen Röhrchen zugesetzt und 38 mL Patientenkulturmedium wird zugeführt. Der Röhrcheinhalt wird 5 bis 10 Sekunden vermischt. Die erhaltene Lösung enthält nun eine Arbeitskonzentration an 50 neutralisierenden Einheiten/mL. Aliquots der Arbeitslösung (1,5 mL) werden in 6 mL sterile Röhrchen mit Kappen gegeben und können bei –40°C bis zu 6 Monaten gelagert werden.
  • Phycoerythrin-markierter monoklonaler CD69 Antikörper
  • Unmittelbar vor der Verwendung wird der Antikörper in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem 6 mL verschließbaren Röhrchen 1 zu 3 verdünnt und vorsichtig vermischt.
  • Fixierung für Durchflusszytometrie
  • Paraformaldehyd, 2,5 g, wird 500 mL PBS zugesetzt und auf einem Magnetrührer bis zur Auflösung gerührt. Sie kann bei Raumtemperatur bis zu 3 Monaten gelagert werden.
  • Lyophilisiertes gepooltes menschliches Serum
  • Lyophilisiertes gepooltes menschliches Serum wird gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt, indem eine geeignete Menge an sterilem entionisierten oder destilliertem Wasser zu dem lyophilisierten Pulver gegeben wird und dieses unter gelegentlichem Rühren stehen gelassen wird, bis es gelöst ist. Aliquots von 100 μL des reaktivierten Serums werden in sterile verschließbare 6 mL Röhrchen gegeben, die bei –40°C bis zu 12 Monaten gelagert werden können.
  • Vollblutprobensammlung
  • Vollblut wird in ein Serumtrennrohr gegeben und lässt es gerinnen.
  • Die Probe wird dann bei 3.000 rpm 5 Minuten lang zentrifugiert und dann das Serum entfernt. Falls es nicht sofort untersucht wird, sollte das Serum bei –20°C oder weniger eingefroren werden, bis es untersucht wird.
  • Herstellung der Serumtestproben
  • Alle gefrorenen Reagenzien werden aufgetaut und vor der Verwendung gemäß der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise sorgfältig vermischt. Die hier beschriebenen Beispiele wurden unter Verwendung von menschlichem Blutserum als Probe durchgeführt. Mit demselben Protokoll können vergleichbare Erfolge mit anderen biologischen Proben, von denen angenommen wird, dass sie IFN-Inhibitoren enthalten (zum Beispiel andere Körperflüssigkeiten, Zellextrakte, Kulturüberstände etc.), erhalten werden.
  • Aliquots (20 μL) an gepooltem menschlichen Serum werden als Kontrolle in eine erste Reihe Zentrifugenröhrchen pipettiert. Aliquots (20 μL) eines Serums von einem individuellen Patienten wird in eine parallele Reihe Zentrifugenröhrchen pipettiert. Wenigstens ein Röhrchen des Kontrollserums und des Testserums werden für die negative Kontrolle beiseite genommen.
  • Patientenkulturmedium (900 μL) wird den Röhrchen mit der negativen Kontrolle zugesetzt.
  • Es wurde dann eine erste Reihe an Proben hergestellt, bei der das Kontrollserum und das Testserum mit IFN vermischt wurden: IFN α2a (100 μL mit 20 Einheiten/mL) wird jeweils wenigstens einem Röhrchen mit dem Kontrollserum und dem Testserum zugesetzt. Diese Röhrchen werden als "S+IFN" (Kontrolle oder Test) gekennzeichnet. Patientenkulturmedium (800 μL) wird jedem dieser Röhrchen zugesetzt.
  • Es wird dann eine zweite Reihe an Proben hergestellt, bei der das Kontrollserum und das Testserum mit Anti-IFN-Antikörpern auf dieselbe Weise wie eben vorstehend für IFN beschrieben, vermischt wurden. Diese Röhrchen wurden als "S+Anti-IFN" (Kontrolle oder Test) gekennzeichnet.
  • MOLT 4 T-Zellleukämiezellen, 100 μL mit einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/mL wurden dann jedem Röhrchen zugesetzt und die Röhrchen bei 37°C, 5% CO2, 48 Stunden inkubiert. Ein Überblick der angesetzten Proben ist wie folgt:
  • Figure 00170001
  • Nach der Inkubation wurden die Proben zentrifugiert und der Überstand entfernt. Verdünnter monoklonaler CD69 Antikörper (10 μL) wird jedem Röhrchen zugesetzt und in der Dunkelheit 15 Minuten inkubiert. Die Zellen werden einmal mit 1 mL PBS, pH 7,2, gewaschen und dann in 0,5 mL 0,5% Paraformaldehyd für die Durchflusszytometrie resuspendiert.
  • Durchflusszytometrie
  • Es ist jeder kommerziell erhältliche Durchflusszytometer einsetzbar, der Phycoerythrinfluoreszenz (FL2) von 580 nm misst, wenn sie mit einer 488 nm Lichtquelle angeregt wird. Bei herkömmlichen Durchflusszytometern wird eine Zellsuspension hydrodynamisch in einen Strom gezwungen, wobei die Zellen nacheinander einen Focus passieren. Ein Laser wird auf diesen Focus fokussiert und wenn eine Zelle den Laser passiert, wird das Laserlicht in verschiedene Richtungen gestreut. Das gestreute Licht wird gesammelt und mittels Sammeloptik/Detektoren verstärkt und zu elektrischen Impulsen umgewandelt. Die elektrischen Impulse können dann mit Computern dekodiert und analysiert werden, um Informationen über die Zelle zu erhalten. Der Durchflusszytometer kann die Zellen in der Suspension zählen und Informationen über verschiedene Charakteristiken der Zellen innerhalb der Suspension durch Bestimmung von Farben und anderen Markern, mit denen die Zellen behandelt worden sind, sammeln. Beispielsweise können Subpopulationen der Zellen von bestimmten durchflusszytometrischen Analysen ausgeschlossen werden, indem die Subpopulationen markiert werden und der Durchflusszytometer so eingestellt wird, dass diese von der Analyse ausgeschlossen (abgezogen) werden. Unabhängig von der vorhergehenden Beschreibung des Aufbaus und der Arbeitsweise eines Durchflusszytometers kann für die Erfindung selbstverständlich jede Art von Zytometer verwendet werden, der die wesentlichen Funktionen des beschriebenen Durchflusszytometers aufweist. Der Durchflusszytometer, der für die vorliegenden Proben eingesetzt wurde, war "FACSCAN" Immunocytometry Systems flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, Kalifornien, USA), der mit Becton Dickinson "CELLQUEST"-Software auf einem "MACINTOSH QUADRA 650"-Computer betrieben wurde. Weitere geeignete Durchflusszytometer sind die Marke "COULTER XL" (Coulter Electronics, Hialeah, Florida, USA) oder die Marke "ORTHO CYTRON" (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, New Jersey, USA).
  • "FACSCAN" Zytometereinstellungen
  • Die Spannungen für die lineare Vorwärtsstreuung und seitliche Streuung wurden so eingestellt, dass die Dot-Blots von MOLT4 im Zentrum des FSC und SSC Blots erschienen. Die log FL-2 Detektorspannung wurde so eingestellt, dass der Zentralwert des log FL-2 Histogramms für das Röhrchens mit dem gepoolten Serum bei annähernd 500 erschien. Es wurde keine Kompensation verwendet, da es sich dabei um Einfarbenanalysen handelte. Die Zellproben wurden gesammelt (jeweils 25.000 Zellen) und die Zentralwerte der log FL-2 Histogramme wurden als Grundlage zur Berechnung der Ergebnisse verwendet.
  • Ergebnisberechnung
  • Der Variationskoeffizient von 10 zweifach getesteten Proben betrug 5,6%.
  • Das Ergebnismittel der doppelten Tests wird für die folgende Berechnung verwendet:
  • Figure 00190001
  • Kriterien für die Ergebnisakzeptanz
  • Aufgrund wiederholter Versuche mit Serum sowohl von gesunden Individien als auch mit kommerziell erhältlichen gepoolten menschlichen Serum sollten die Kontrollproben bei Vorhandensein von IFN üblicherweise eine Zunahme des Zentralwertes der CD69 Expression von wenigstens etwa 9,5% aufweisen. Weist im Fall von gepoolten Serum die CD69 Expression in den Kontrollen nicht wenigstens eine Zunahme von etwa 9,5% auf, sollten die Tests vorzugsweise mit einer anderen Charge gepooltem menschlichen Serums wiederholt werden. Die Zunahme der CD69 Expression ist serumchargenempfindlich und muss für jede neue Charge neu berechnet werden.
  • BEISPIEL 1 – Feststellung eines Referenzbereiches
  • Die Bestimmung eines Normalbereichs der Zunahme der CD69 Expression für Referenzzwecke wurde mit 21 gesunden Personen durchgeführt. Die Seren, die jeder dieser Personen entnommen worden waren, wurden dem vorstehend beschriebenen Protokoll für die Durchflusszytometrie unterzogen. Der Zweck war, einen Referenzbereich der IFN-Aktivität zu bestimmen, mit dem die Testproben verglichen werden können.
  • Für jede normale Probe wurde der Zentralwert der CD69 Fluoreszenz, der nach Inkubation mit Patientenserum in Gegenwart von 20 U/mL IFN α2a erhalten wurde, mit dem Zentralwert der CD69 Expression verglichen, der für die Röhrchen erhalten wurde, die nur Patientenserum enthielten. Die mittlere Zunahme der CD69 Expression für die 21 normalen Personen ist in 1 dargestellt. Die Durchschnittszunahme der CD69 Expression betrug 14,5%, wobei sich der Bereich von 9,5% bis 21,8% erstreckte.
  • Wie vorstehend angegeben, wird basierend auf diesen Resultaten angenommen, dass eine Probe IFN-Inhibitoren enthält, wenn bei Vorhandensein von IFN die Zunahme der CD69 Expression der MOLT4 Zellen einer gegebenen Testprobe nicht wenigstens etwa 9,5% beträgt.
  • BEISPIEL 2 – Bestätigung, dass die Zunahme der CD69 Expression durch IFN α2a bewirkt wird
  • Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Standardprotokolls wurden für jede der 10 normalen Proben zweifach 3 Proben hergestellt:
    • 1. nur Serum
    • 2. Serum + 20 μ/mL IFN α2a
    • 3. Serum + 20 μ/mL IFN α2a + 50 U/mL Anti-IFN Antikörper
  • Das Ziel dieses Experiments war die Bestätigung, dass Interferon für die Zunahme der CD69 Expression in den MOLT4-Zellen verantwortlich ist. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt und graphisch in 2 dargestellt.
  • In der zweiten Spalte der Tabelle 1 ist die prozentuale Zunahme des Zentralwerts der Fluoreszenzaktivität wiedergegeben, die dem Zusatz von 20 μ/mL IFN α2a zu dem Serum zugeschrieben wird, im Vergleich zu der Fluoreszenzaktivität des Serums alleine. Die dritte Spalte der Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse des Zusatzes von Anti-IFN zu den Röhrchen, die Serum und Interferon enthielten. In jedem Fall ist die Zunahme der Aktivität (das heißt die CD69 Expression), die dem Zusatz von IFN zugeschrieben wird, beträchtlich verringert.
  • Tabelle 1
    Figure 00210001
  • BEISPIEL 3 – CD69 Expression bei Autoimmunkrankheiten Patienten in Remission
  • In diesem Beispiel wurde Serum von drei Patienten mit Autoimmunkrankheiten im Remissionszustand, zwei mit remittierender Psoriasis und einer mit remittierender Multipler Sklerose, dem vorstehend beschriebenen Verfahren unterzogen. Die mittlere Zunahme der CD69 Expression in MOLT4 Zellen, die in Gegenwart des Patientenserums kultiviert wurden, im Vergleich zur CD69 Expression der MOLT4 Zellen der Kontrollkulturen ist in 3 dargestellt. Das linke Histogramm der 3 stellt die mittlere Zunahme der CD69 Expression dar, das rechte Histogramm stellt den Gehalt an endogenen IFN dar, das in den einzelnen Serumproben (U/mL) gefunden wurde. leiden an Autoimmunkrankheiten und im Remissionszustand. Jeder der Patienten, dessen Autoimmunzustand in der Remission war, zeigte eine mittlere Zunahme der CD69 Expression, die deutlich über der vorstehend genannten 9,5% Grenzwertschwelle lag. Diese Ergebnisse zeigen, dass nur wenig oder gar keine IFN Inhibitoren im Serum dieser Patienten vorlagen. Tatsächlich ist das Serum dieser Patienten ununterscheidbar von dem gesunder Personen.
  • BEISPIEL 4 – CD69 Expression bei Krebspatienten in Remission
  • Dieses Beispiel ist identisch zu Beispiel 3 mit der Ausnahme, dass als Versuchspersonen 7 Patienten dienten, die maligne Krebse in Remission hatten. Das linke Histogramm von 4 stellt die mittlere Zunahme der CD69 Expression und das rechte Histogramm den Gehalt an endogenen IFN dar, der in den jeweiligen Serumproben gefunden wurde (U/mL). Die Patientenpopulation bestand aus 3 Patienten, die an chronischer myeloischer Leukämie (CML) litten, 1 Patienten, der an chronischer lymphozytischer Leukämie (CML) litt, und 3 Patienten, die an malignen Melanomen litten. Alle 7 Patienten befanden sich in Remission.
  • Wie aus 4 ersichtlich ist, zeigten alle diese Patienten, deren maligne Zustände in Remission waren, mittlere Zunahmen der CD69 Expression, die über dem vorstehend genannten Grenzwert von 9,5% lagen. Diese Ergebnisse lassen erkennen, dass nur wenige oder keine IFN Inhibitoren in dem Serum dieser Patienten vorhanden waren. Tatsächlich ist das Serum dieser Patienten ununterscheidbar von demjenigen von gesunden Personen.
  • BEISPIEL 5 – Vergleich der CD69 Expression bei Patienten mit akuten Krankheitszuständen und Patienten in Remission
  • In diesem Beispiel wurde Serum von 14 Patienten mit akuten Krankheitszuständen und von 10 Patienten, deren Krankheitszustände in Remission waren, dem Standardprotokoll unterzogen. Bei den Krankheitszuständen handelte es sich um Psoriasis, Multipler Sklerose, erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) Hepatitis C, Myelom, chronischer myeloischer Leukämie (CML), chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL), Melanome, Magenkrebs, Brustkrebs und Prostatakrebs. Für jeden Patienten wurde sowohl die mittlere Zunahme der CD69 Expression von MOLT4 (linkes Histogramm) als auch der Gehalt an IFN (rechtes Histogramm) bestimmt.
  • Wie ohne Weiteres anhand von 5 festgestellt werden kann, zeigten die ersten 14 Patienten, diejenigen mit den akuten Krankheitszuständen, eine Zunahme der CD69 Expression, die wesentlich geringer war als der 9,5% Grenzwert. Diese Patienten litten an einem akuten pathologischen Krankheitszustand. In einigen Fällen zeigte sich eine Abnahme der CD69 Expression. Dies weist darauf hin, dass IFN Inhibitorfaktoren in großer Menge (oder mit hohen Aktivitäten) offensichtlich nicht nur die IFN Aktivität zu inhibieren scheinen, sondern zudem die CD69 Expression als solche.
  • Im Gegensatz dazu zeigten alle diejenigen Patienten, deren Krankheit in Remission war (das heißt die letzten 10 Patienten), die übliche Überschreitung der 9,5% Grenze. Es zeigte sich auch ein deutlicher Unterschied des Gehalts an zirkulierenden IFN bei Patienten mit akuten Krankheitszuständen im Vergleich zu Patienten in Remission; Patienten in Remission wiesen einen höheren Gehalt an zirkulierendem IFN auf.
  • Dieses Beispiel belegt deutlich die Nützlichkeit des vorliegenden Verfahrens zur Vorhersage des Vorliegens von akuten Krankheitszuständen.
  • BEISPIEL 6 – Vergleich der IFN Inhibierung bei Patienten mit akuten Krankheitszuständen und Patienten in Remission
  • Hier ist der berechnete Gehalt der IFN Inhibierung in Prozent IFN Aktivität in den Kontrollen der Patientenpopulation von Beispiel 5 dargestellt.
  • Diese Probe umfasste wiederum 14 Patienten mit akuten Krankheitszuständen im Vergleich zu 10 Patienten in Remission. Siehe 6.
  • Das linke Histogramm zeigt den Prozentanteil an IFN Inhibitor in Prozent IFN Aktivität (U/mL) für beide Patientengruppen, das rechte Histogramm stellt den IFN Gehalt von beiden Patientengruppen dar.
  • Bei denjenigen Patienten, deren Krankheitszustände in Remission waren, lag die Aktivität der IFN Inhibitorfaktoren deutlich über 25% der Kontrollen. Diese 14 Patienten durchlitten akut einen pathologischen Krankheitszustand.
  • Im Gegensatz hierzu lag die Aktivität der IFN Inhibitoren bei den 10 Patienten in Remission, die in diesem Beispiel untersucht wurden, nicht über 25%. Tatsächlich wurde niemals bei anderen gesunden Personen oder Personen in Remission, die nach dem vorliegenden Verfahren untersucht wurden, eine IFN Inhibitoraktivität von mehr als 25% gefunden.
  • Dieses Beispiel ist ein hervorragender Vergleich, der zeigt, dass die Aktivität der IFN Inhibitoren lediglich bei Patienten mit akuten Krankheitszuständen deutlich erhöht ist. In Hinblick auf IFN zeigt sich auch hier ein deutlicher Unterschied zwischen den zwei Patientenpopulationen, wobei der IFN Gehalt bei Patienten in Remission höher ist.
  • Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung ist nicht auf die Reagenzien und Zelllinien beschränkt, die hier insbesondere beschrieben worden sind, sondern umfasst alle Variationen und äquivalenten Ausführungsformen hierfür, die von den folgenden Ansprüchen umfasst werden.

Claims (8)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und der Aktivität von Interferon-Inhibitoren in einer Probe umfassend: (a) die Kultivierung von MOLT4-Zellen, die in Gegenwart von Interferon α2a ein durch Interferon induzierbares Antigen exprimieren, wobei das durch Interferon induzierbare Antigen CD69 ist und das CD69 induziert wird; dann (b) Zugabe eines Aliquots an kultivierten Zellen zu einer Probe; und (c) Zugabe eines Aliquots an kultivierten Zellen zu einer Kontrollprobe; und dann (d) Messung der Expression des durch Interferon induzierbaren Antigens in den kultivierten Zellen der Probe und in den kultivierten Zellen der Kontrollprobe und Vergleich der Expression der Antigene, um die Anwesenheit von Interferon-Inhibitoren in der Probe zu bestimmen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe (b) das Aliquot an kultivierten Zellen zu einer Probe von menschlichem Blutserum gegeben wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei in Stufe (d) die Expression des CD69 Antigens gemessen wird, indem eine Aliquot an markierten Anti-CD69 Antikörpern zu der Probe und zu der Kontrollprobe gegeben wird und die Menge an Anti-CD69 Antikörper bestimmt wird, die an die kultivierten Zellen der Probe und der Kontrollprobe gebunden sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein Aliquot an monoklonalen Anti-CD69 Antikörpern zu der Probe und der Kontrollprobe gegeben wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein Aliquot eines fluoreszenz-markierten Anti-CD69 Antikörpers zu der Probe und der Kontrollprobe gegeben wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe (d) die Menge an Anti-CD69 Antikörper, die an die kultivierten Zellen der Probe und der Kontrollprobe gebunden sind, mittels Durchflusszytometrie bestimmt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch, wobei in Stufe (b) die kultivierten Zellen zu einer Probe aus menschlichem Blutserum gegeben werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe menschliches Blutserum ist und wobei: Stufe (a) die Kultivierung von MOLT4-Zellen, ATCC CRL-1582, in Gegenwart einer Menge an Interferon α2a umfasst, die ausreicht, die Expression von CD69 Antigen in den MOLT4-Zellen zu induzieren; Stufe (c) die Zugabe eines Aliquots an kultivierten MOLT4-Zellen zu einer Probe an menschlichem Blutserum aus einem Pool umfasst, gefolgt von einer weiteren Stufe, in der ein Aliquot eines Fluorophor-markierten monoklonalen Anti-CD69 Antikörpers zu der Probe und der Kontrolleprobe gegeben wird; und Stufe (d) die Messung der CD69 Antigene, die an den MOLT4-Zellen der Probe und den MOLT4-Zellen der Kontrollprobe exprimiert werden, mittels Durchflusszytometrie und den Vergleich derselben umfasst, um die Anwesenheit von Interferon-Inhibitoren in der Probe zu bestimmen.
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