DE3785673T2 - Monoklonaler antikoerper spezifisch gegen neutrophilen. - Google Patents
Monoklonaler antikoerper spezifisch gegen neutrophilen.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft eine Hybridomzell-Linie, die einen monoklonalen Antikörper bildet, der sich an die Neutrophilenpopulation von weißen Blutkörperchen bindet. Durch die spezifische Bindungsfähigkeit dieses monoklonalen Antikörpers ermöglicht die Erfindung hierdurch den direkten Immunoassay von Neutrophilen in peripherem menschlichen Blut und des weiteren die selektive Abreicherung von Neutrophilen aus einer peripheren Blutprobe.
- Das periphere Blut im menschlichen Kreislaufsystem besteht hauptsächlich aus roten Blutkörperchen, Erythrocyten, und weißen Blutkörperchen, Leukocyten. Die Funktion der Leukocyten und deren klinische Bedeutung ist in der Wissenschaft auf großes Interesse gestoßen. Die Fainilie der weißen Blutkörperchen besteht aus Neutrophilen, Monocyten, Eosinophilen, Basophilen und Lymphocyten, die wiederum zahlreiche Untergruppen besitzen.
- Neutrophile, Monocyten, Eosinophile und Basophile sind als Phagocyten bekannt, da ihre Primärfunktion im menschlichen Immunsystem die Phagocytose bzw. Einverleibung von Bakterien und anderen Mikroorganismen ist. Diese Zellen werden im menschlichen Knochenmark gebildet. Jede dieser Phagocyten besitzt jedoch eine unterschiedliche Funktion und verhält sich als ein in Verbindung stehendes, aber dennoch getrenntes System. Phagocyten werden zwar im Knochmark gebildet, finden jedoch Eingang in das periphere Blut und zirkulieren dort.
- Die allgemeine Funktion der Phagocyten besteht darin, eine Phagocytose von als fremd erkannten Substanzen zu bewirken und die Erzeugung einer Immunantwort gegen eine Fremdsubstanz zu unterstützen. Neutrophile sind sehr wirksam als Phagocyten für Bakterien, die mit einem Antikörper umhüllt wurden, und nicht so wirksam für Bakterien ohne Antikörperumhüllung. Die Hauptfunktion des Neutrophils besteht darin, ein Eindringen von pathogenischen Mikroorganismen durch deren Lokalisieren und Töten nach ihrem Eindringen zu verhindern. Um einen eindringenden Mikroorganismus erfolgreich anzugreifen, tritt das Neutrophil aus dem peripheren Blut aus, wandert in den Gewebebereich, in dem die Infektion angefangen hat, erkennt den Mikroorganismus, tötet und verdaut ihn.
- Das Neutrophil ist die am häufigsten vorkommende Zelle im Knochenmark und das am häufigsten vorkommende weiße Blutkörperchen im peripheren Blut. Ein Mikroliter einer normalen Vollblutprobe enthält im Durchschnitt 5 x 10³ Leukocyten, von denen 3.075 Neutrophile, 150 Eosinophile, 25 Basophile, 250 Monocyten und 1500 Lymphocyten sind. Die Abweichung von der normalen Neutrophilenkonzentration in peripherem Blut wurde als klinisch bedeutsam erkannt. Somit können erhöhte Neutrophilenkonzentrationen, die manchmal auch als "Neutrophilie" bezeichnet werden, Nachweis für eine bestimmte Krankeit oder physische Zustände sein, während herabgesetzte Neutrophilkonzentrationen in peripherem Blut, manchmal auch als "Neutropenie" bezeichnet, eine andere klinische Bedeutung besitzen. So stellt beispielsweise eine Neutrophilengesamtzahl von weniger als 500 Zellen pro Mikroliter einen lebensbedrohlichen Zustand dar, da ein Patient mit solch einer anormalen Neutrophilenzahl höchst anfällig für lebensbedrohliche bakterielle Infektionen oder Pilzinfektionen ist. Eine Neutropenie kann sich aus zytotoxischen Arzneimitteln, wie sie z.B. zur Behandlung von Krebs oder Leukämie verabreicht werden, ergeben. Es gibt zahlreiche kongenitale oder erworbene Krankeiten, die ebenfalls mit einer abnormen Neutrophilenfunktion in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung des Neutrophilengehalts in peripherem Blut ist daher ein wichtiger Bestandteil der Zählung der Leukocytengesamtzahl.
- Die vorliegende Erfindung schafft einen neuen monoklonalen Antikörper gegen einen antigenen Ort auf der Oberfläche eines Neutrophils. Solch ein monoklonaler Antikörper kann, entsprechend seiner Verwendung, zahlreiche verschiedene Funktionen ausüben, z.B. entsprechend seiner Markierung, beispielsweise mit Fluorescein oder Biotin, oder in Konjugation mit einem magnetischen oder nichtmagnetischen Kügelchen bzw. Mikrokügelchen, z.B. zur Identifizierung und Zählung von menschlichen Neutrophilen.
- Die mit solch einem spezifischen monoklonalen Antikörper erzielten Vorteile sind ganz klar wünschenswert.
- Die vorliegende Erfindung schafft eine Zell-Linie, die einen monoklonalen Antikörper bildet, der spezifisch gegen ein Oberflächen-Proteinantigen gerichtet ist, das durch in peripherem menschlichen Blut zirkulierenden Neutrophilen zum Ausdruck kommt. Die Vorteile, die sich aus der Verwendung solch eines spezifischen Antikörpers für Analysen ergeben, sind klar erkennbar.
- Der monoklonale Antikörper zeigt keine Reaktionsbereitschaft mit anderen menschlichen peripheren Blutzellen und praktisch keine Reaktionsbereitschaft mit Granulocytenvorstufen oder anderen Zellen im Knochenmark. Der monoklonale Antikörper wird durch eine Hybridomzell-Linie gebildet, bei der einer der Fusionspartner durch Immunisierung unter Verwendung von gereinigten menschlichen Granulocyten erhalten wurde.
- Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper ist durch die Bezeichnung 1D3 gekennzeichnet. Er wurde durch Fusion von Mausmilzzellen erzeugt, die mit gereinigten menschlichen Granulocyten und Myeloma-Mäusezellen unter Verwendung eines von Kohler und Milstein (Nature, 256, 495 - 497 (1975) beschriebenen Standardverfahrens immunisiert wurden.
- Die in dem Immunisierungsverfahren verwendeten menschlichen Granulocyten wurden speziell hergestellt. Menschliches Blut wurde durch Venenpunktur erhalten, und mononukleäre Zellen wurden von den Granulocyten und roten Blutkörperchen durch Ficoll-Hypaque Dichtegradientensedimentation, 1,077 g/cc, getrennt. Die roten Blutkörperchen und Granulocyten wurden dann durch Verdünnung der roten Blutköperchen/Granulocyten-Pellet mit Hankschem Mineralsalzmedium und Hinzufügen von 1/10 Volumen 4% Dextran von hoher Molekülmasse voneinander getrennt. Die Granulocyten wurden konzentriert und Erythrocytenreste mit einem hypotonischen Puffer lysiert. Zur Immunisierung wurden die Granulocyten in phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert.
- 10&sup6; dieser in höchstem Maße gereinigten menschlichen Granulocyten wurden in die Milz einer betäubten Balb C-Maus injiziert. Zehn Tage nach der intrasplenischen Immunisierung wurden der Maus nochmals 10 x 10&sup6; ähnlich gereinigte Granulocyten zur Verstärkung der Wirkung intravenös in eine Schwanzvene injiziert. Drei Tage danach wurde die Milz der Maus entnommen und die Milzzellen durch herkömmliche Verfahren geerntet.
- Anschließend fand die Fusion zur Bildung von Hybridomen statt. Die Milzzellen wurden mit der NS-1 Plasmocytom-Zell-Linie in einem Verhältnis von 8 Milzzellen zu 1 NS-1-Zelle in serumfreiem Medium gewaschen. Die Zellen wurden zu Pelletform zentrifugiert und in 0,5 ml 30% Polyethylenglykol acht Minuten lang bei 25ºC suspendiert. Anschließend wurde das Polyethylenglykol dekantiert, die Zellen in HAT-Medium verdünnt und auf Mikrotiterplatten verteilt.
- Untersuchungen der Reaktionsbereitschaft des monoklonalen Antikörpers 1D3 wurden durch indirekte Immunofluoreszenz und Strömungszytometrieverfahren durchgeführt, wobei auf die Reaktionsbereitschaft mit gereinigten menschlichen Granulocyten hin untersucht wurde. Der 1D3 monoklonale Antikörper wurde in einem Versuch ausgewählt, einen Antikörper nachzuweisen, der absolut selektiv für Granulocyten ist und sich des weiteren durch eine sehr hohe Antigendichte auszeichnet. Der 1D3 monoklonale Antikörper reagierte mit über 90% der von den fünfundzwanzig untersuchten Blutspendern erhaltenen Granulocyten. Der 1D3-Antikörper reagierte nicht mit gereinigten Monocyten, T-Zellen (E+-Zellen), B- Zellen/NK-Zellen (E- -Zellen); des weiteren reagierte er mit nur 3% der normalen mononukleären Zellen im Knochenmark. Der 1D3- Antikörper reagierte nicht mit Eosinophilen oder Basophilen, so daß er wirklich neutrophilenspezifisch ist.
- Weitere Untersuchungen der Reaktionsbereitschaft mit dem 1D3 monoklonalen Antikörper zeigten keine Reaktion mit Tonsillenzellen oder phytohämagglutinin-aktivierten T-Zellen in peripherem Blut. Der Antikörper wurde auf Reaktionsbereitschaft mit mehreren menschlichen Zell-Linien untersucht. Man fand heraus, daß die Reaktionsbereitschaft der HL 60-Zell-Linie schwach ist, d.h. bei ca. 26% liegt. Man fand heraus, daß die U937-, KG1-, K562- und Daudi-Zell-Linien mit dem 1D3-Antikörper nicht reaktionsbereit sind. Der 1D3-Antikörper zeigte keine Reaktionsbereitschaft mit 6 Proben von menschlichen akuten lymphoblastischen Leukämiezellen und 5 Proben von menschlichen akuten myeloblastischen Leukämiezellen.
- Der 1D3 monoklonale Antikörper ist aufgrund seiner außergewöhnlichen Spezifität für menschliche Neutrophile einzigartig. Der Antikörper besitzt keine Reaktionsbereitschaft mit anderen menschlichen peripheren Blutzellen und praktisch keine Reaktionsbereitschaft mit Granulocytenvorstufen oder anderen Zellen im Knochenmark. Da der Antikörper höchst neutrophilenspezifisch ist und in solch hoher Antigendichte vorhanden ist, wird der Granulocytennachweis mit sämtlichen Verfahren, wie z.B. Immunofluoreszenz oder Immunhistochemie, erheblich erleichtert. Dieser monoklonale Antikörper ist zur Identifizierung und zur Zählung von menschlichen Neutrophilen nützlich. Die mangelnde Reaktionsbereitschaft des 1D3-Antikörpers mit menschlichen Leukämiezellen ist von potentieller klinischer Bedeutung. So gut wie alle früheren Antikörper, die mit Neutrophilen reagieren, reagieren auch mit einigen akuten myeloblastischen Leukämiezellen. Der 1D3- Antikörper schafft eine Möglichkeit zur korrekten Zählung von Neutrophilen bei akuter Leukämie.
- Eine Probe der Hybridzelle, die die 1D3 monoklonalen Antikörper bilden kann, ist bei der American Type Culture Collection (A.T.C.C.) hinterlegt und mit der Nr. HB 9445 versehen.
- Beim Versuch, das durch den 1D3 monoklonalen Antikörper nachgewiesene Antigen biochemisch zu kennzeichnen, stieß man auf ungewöhnliche Schwierigkeiten. Drei unterschiedliche Verfahren urden folgendermaßen durchgeführt: (1) Western Blots von lysierten und extrahierten Neutrophilen; (2) Affinitätssäulenreinigung des 1D3-Antigens von Neutrophilen; (3) Iodierung der Neutrophile vor deren Extrahieren und anschließend Affinitätssäulenreinigung des Antigens von den Neutrophilen. Das gleiche angegebene Standardlaborverfahren, das zur Isolierung von Zellen zur Immunisierung für die Gewinnung von Hybridomen angewandt wurde, wurde auch zur Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut angewandt. Das Molekulargewicht des 1D3-Antigens wurde dabei durch diese Verfahren nicht bestimmt. Das 1D3-Antigen kann deshalb ein Kohlenhydrat- oder Lipidantigen sein.
- Es wurde versucht, den von dem 1D3 monoklonalen Antikörper erkannten Zellenoberflächenrezeptor bzw. das Antigen durch selektive Entfernung aus peripheren Blutzellenproben zellulär zu charakterisieren. Hierzu wurden die zwei folgenden Verfahren angewandt:
- I. Strömungszytometrie- und Zellsortierverfahren wurden unter Verwendung eines von der Coulter Corporation in Hialeah, Florida, vetriebenen EPICS -Instruments angewandt. Die Leukocyten, die nach einer Reaktion mit dem 1D3 monoklonalen Antikörper und der GAM-FITC-Fluoreszenzmarkierung Fluoreszenz-Positivität aufwiesen, wurden durch Zellsortierverfahren entfernt. Die sortierten Zellen wurden mit Wrightschem Farbstoff gefärbt und- morphologisch klassifiziert. Minimal 500 Leukocyten wurden in jeder untersuchten Probe gezählt.
- Auf diese Weise wurden insgesamt zwanzig normale, von Erwachsenen stammende periphere Blutproben bewertet. In diesen Proben waren mindestens 92% der reifen abgeteilten Neutrophile mit dem 1D3-Antikörper positiv.
- II. Bei diesem Verfahren wurde eine Zelltrennung mittels den mit dem 1D3-Antikörper konjugierten magnetischen Mikrokügelchen durchgeführt. Normale, von Erwachsenen stammende periphere Blutproben wurden durch Lysierung oder andere Verfahren behandelt, um die roten Blutkörperchen zu entfernen, ohne daß dadurch die verbleibenden Leukocyten Schaden nehmen. Nach ihrem Färben mit Wrightschem Farbstoff wurden die Leukocyten dann zytomorphologisch analysiert. Unter Verwendung der in eine Probe eingeführten, mit dem 1D3-Antikörper konjugierten magnetischen Mikrokügelchen wurden die Leukocyten, an die Neutrophile gebunden waren, aus der Probe entfernt. Die verbleibenden negativen Zellen wurden dann morphologisch auf das Vorhandensein von Neutrophilen bewertet.
- Neun (9) periphere Blutproben wurden auf diese Art untersucht. Weniger als 0,2% Neutrophile wurden in diesen verbleibenden Zellproben im Durchschnitt festgestellt. Es wurden wiederum minimal 500 Leukocyten gezählt.
- Aufgrund der durch diese Untersuchungen erhaltenen Daten konnte festgestellt werden, daß die weiße Blutkörperchenpopulation, an die sich der 1D3-Antikörper spezifisch bindet, die Neutrophilen-Population ist.
- Der zelluläre Charakter des durch den 1D3 monoklonalen Antikörper erkannten Zellenoberflächenrezeptors bzw. Antigens wurde unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen definiert. Unter reduzierenden Bedingungen wies das 1D3-Antigen ein Molekulargewicht von 48.000 Dalton auf. Unter nichtreduzierenden Bedingungen wies das identifizierte 1D3-Antigen ein breites Band mit einem molekularen Gewichtsbereich zwischen 48.000 und 60.000 Dalton auf. Das 1D3-Antigen wurde von den zirkulierenden Granulocyten, die von heparinisiertem peripheren menschlichen Blut durch Dichtegradientenzentrifugation erhalten wurden, isoliert und als eine einzige Form besitzend identifiziert.
- Das Äguivalent von 4 x 10&sup7; Zellen wurde mittels SDS-Polyacrylamidelektrophorese (5-15% Gradient) untersucht, die in einem diskontinuierlichen vertikalen Gelstreifen durchgeführt wurde. Es wurde ein von dem in einer Veröffentlichung von U.K. Laemole in Nature, 2271680 (1980) beschriebenes, abgewandeltes Verfahren angewandt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in dem Acrylamidstreifen elektrisch auf ein Cellulosenitratpapier übertragen. Die molekularen Gewichtsmarkersubstanzen des Cellulosenitratpapiers wurden mit Aminoschwarz B für Protein gefärbt. Das restliche Cellulosenitratpapier wurde mit einem Puffer blockiert, der nichtfette Trockenmilch enthält, zum Immunonachweis mit mit der radioaktiven Markersubstanz, Iod 125 (¹²&sup5;I), konjugierten Anti-1D3. Das Anti-1D3-¹²&sup5;I reagierte dann mit dem Cellulosenitrat unter Bindung an das 1D3-Antigen. Nach dem Wegwaschen des ungebundenen radio-iodierten Antikörpers wurde das Immunoblot durch Autoradiographie unter Verwendung eines Kodak XAR-Films sichtbar gemacht. Nach der Entwicklung des Kodak XAR-Films erschienen Banden, in die das 1D3-Antigen gewandert war. Auf diese Weise konnte das 1D3, an das sich der 1D3 monoklonale Antikörper spezifisch bindet, gekennzeichnet werden.
Claims (8)
1. Durch ein Hybridomverfahren hergestellte Hybridomzell-Linie,
die einen monoklonalen Antikörper bildet, der sich spezifisch
an das 1D3 Oberflächen-Antigen von Neutrophilen bindet, und
der sich nichtspezifisch an andere menschliche periphere
Blutzellen oder an menschliche akute Leukämiezellen bindet,
und der sich nicht wesentlich an Granulocytenvorstufen im
Knochenmark bindet, wobei das 1D3-Antigen ein unter
reduzierenden Bedingungen definiertes Molekulargewicht von ca.
48.000 Dalton besitzt, und ein unter nichtreduzierenden
Bedingungen definiertes Molekulargewicht im annähernden Bereich von
48.000 bis 60.000 Dalton.
2. Zell-Linie nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
der monoklonale Antikörper sich nichtspezifisch an menschliche
akute lymphoblastische Leukämiezellen bindet.
3. Zell-Linie nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
der monoklonale Antikörper sich nichtspezifisch an menschliche
akute myeloblastische Leukämiezellen bindet.
4. Durch ein Hybridomverfahren hergestellte Zell-Linie, die die
bindungsspezifischen Eigenschaften der bei der American Type
Culture Collection hinterlegten Probe Nr. HB 9445 aufweist,
die einen Antikörper gegen das 1D3-Antigen auf Neutrophilen
bildet.
5. Monoklonaler Antikörper,
dadurch gekennzeichnet, daß
der monoklonale Antikörper sich spezifisch an ein als 1D3
gekennzeichnetes Antigen auf der Oberfläche eines Neutrophils
bindet, wobei das 1D3-Antigen ein unter reduzierenden
Bedingungen definiertes Molekulargewicht von ca. 48.000 Dalton
besitzt, und ein unter nichtreduzierenden Bedingungen
definiertes Molekulargewicht im annähernden Bereich von 48.000 bis
60.000 Dalton, wobei der 1D3 monoklonale Antikörper des
weiteren dadurch gekennzeichnet ist, daß er keine
Bindungsspezifität besitzt hinsichtlich:
A. inenschlichen akuten Leukämiezellen,
B. anderen menschlichen peripheren Blutzellen,
und
C. Granulocytenvorstufen im Knochenmark.
6. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
die menschlichen akuten Leukämiezellen akute lymphoblastische
Leukämiezellen umfassen.
7. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
die menschlichen akuten Leukämiezellen akute myeloblastische
Leukämiezellen umfassen.
8. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
der monoklonale Antikörper durch die Hybridomzell-Linie
gebildet ist, die die bindungsspezifischen Eigenschaften der bei
der American Type Culture Collection hinterlegten Probe Nr. HB
9445 aufweist.
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