JPH08275775A - ハイブリドーマ細胞系 - Google Patents

ハイブリドーマ細胞系

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JPH08275775A JP8070247A JP7024796A JPH08275775A JP H08275775 A JPH08275775 A JP H08275775A JP 8070247 A JP8070247 A JP 8070247A JP 7024796 A JP7024796 A JP 7024796A JP H08275775 A JPH08275775 A JP H08275775A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 モノクローナル抗体の特異結合能力によって
ヒトの末梢血液中の好中球の直接的免疫測定を可能と
し、更に末梢血液サンプルからの好中球の選択的除去を
可能とする。 【解決手段】 好中球の1D3 抗原に特異的に結合し、他
のヒト末梢血液細胞へと特異的に結合せずかつ骨髄中の
顆粒球前駆体へは実質的に結合しないモノクローナル抗
体を産生する細胞系であって、前記1D3 抗原が還元性条
件下で定めると約48000 ダルトンの分子量を有すると共
に非還元性条件下で定めると約48000 〜60000 ダルトン
の範囲内の分子量を有する、ハイブリドーマ細胞系。好
中球の1D3抗原への抗体を産生するアメリカン タイプ
カルチャー コレクションNo. HB9445 の寄託試料の
結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ技術により産生
される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、白血球の好中球
集団に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞系に関するものである。本発明は、このモノ
クローナル抗体の特異結合能力によってヒトの末梢血液
中の好中球の直接的免疫測定を可能とし、更に末梢血液
サンプルからの好中球の選択的除去を可能とする。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの循環系の末梢血液は、主として赤
血球(erythrocy- tes)と白血球(leukocytes)とからな
る。白血球の機能とその臨床的関連性は科学界に多大の
興味を引き起こした。白血球のファミリーは、多数のサ
ブセットを有する、好中球、単球、好酸球、好塩基球及
びリンパ球からなる。
【０００３】好中球、単球、好酸球及び好塩基球は、ヒ
ト免疫系での本来の機能がバクテリアや他の微生物を食
べ、摂取することであるため、食細胞として知られる。
これらの細胞はヒトの骨髄で造られる。しかし、これら
の食細胞はそれぞれ異なる機能をもち、関連はするが相
異なるシステムとしてふるまう。食細胞は骨髄で生じる
が、末梢血液中に入って循環する。
【０００４】食細胞の一般的な機能は、外来のものと認
識された物質の食作用を達成し、外来物質に対する免疫
応答の発生を助けることである。好中球は抗体でコート
されたバクテリアの食細胞としては非常に有効であり、
抗体コーティングのないバクテリアにはさほど有効でな
い。好中球の主要な機能は病原性微生物の侵入後にこれ
らを局在化し、殺すことで、病原性微生物の侵入を防止
することである。侵入する病原性微生物の攻撃に成功す
るため、好中球は周辺血液から出て、感染の始まる組織
領域へと移り、次いで微生物を認識し、殺し、摂取す
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】好中球は骨髄で最もあり
ふれた細胞であり、末梢血液で最もありふれた白血球で
ある。１マイクロリットルの正常な全血には、平均して
５×103 の白血球が含まれ、白血球のうち3075が好中
球、150 が好酸球、25が好塩基球、250 が単球、1500が
リンパ球である。末梢血液中の好中球の正常な濃度から
の逸脱は、臨床的関連性を認める。時々「好中球増加
症」と呼ばれる濃度上昇は特定の病気又は身体状態の証
拠となり、一方、時々「好中球減少症」と呼ばれる末梢
血液中の好中球の濃度減少は、異なる臨床的関連をも
つ。例えば、マイクロリットル当り500の細胞よりも好
中球の絶対数が少ないのは、こうした異常な数をもつ患
者が生命を脅かすバクテリアまたは菌類の感染に対し非
常に感染し易いので、生命を脅かす状態である。好中球
減少症は、ガンや白血球の治療で投与されるような、細
胞性の薬剤の結果として起こりうる。そのうえ、好中球
の機能の異常を伴う多数の先天性及び後天性疾患があ
る。末梢血液中の好中球の測定は、全白血球のカウント
の重要な部分である。
【０００６】この発明は、好中球表面の抗原部位への新
規なモノクローナル抗体を提供する。こうしたモノクロ
ーナル抗体は、例えば、ヒト好中球の同定と計数のため
の使用方法、即ち例えばフルオレセイン又はビオチン等
で標識する方法、又は磁性若しくは非磁性のビーズ若し
くは微小球に接合する方法、に基づいて多様な異なる作
用をすることができる。こうした特異的なモノクローナ
ル抗体に由来する利益は疑いもなく望ましい。
【０００７】
【課題を解決するための手段】表面タンパク質抗原に特
異的なモノクローナル抗体を産生する細胞系は、ヒトの
末梢血液中を循環する好中球によって発現した。こうし
た特異的な抗体の測定への適用に伴う利益が実現され
る。
【０００８】このモノクローナル抗体は他のヒト末梢血
液細胞と反応性を示さず、実質的に顆粒球前駆体や他の
骨髄中の細胞との反応性を示さない。このモノクローナ
ル抗体は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されこの
場合融合へのパートナーの一つが精製ヒト顆粒球を用い
る免疫感作から誘導される。
【０００９】このモノクローナル抗体は、名称1D3 によ
り同定する。これは、コーラーとミルシュタイン(Kohle
r and Milstein) 〔Nature, 256, 495〜497(1975) 〕に
より記述された標準的な手順で、精製したヒト顆粒球と
マウスの骨髄腫細胞で免疫化したマウス脾臓細胞の融合
から発生した。
【００１０】免疫感作手続で用いるヒト顆粒球は特別に
調製した。血液はヒトからの静脈穿刺により得、単核細
胞はフィコル‐ハイペイク(Ficoll-Hypaque)勾配密度沈
降、1.077g/cc により顆粒球及び赤血球から分離した。
次いで赤血球と顆粒球とは、赤血球／顆粒球ペレットを
ハンクス平衡塩溶液で希釈し、1/10容量の４％高分子量
デキストランを加えることにより分離した。この顆粒球
を集め、残りの赤血球を低張性緩衝液で溶菌した。免疫
感作のため、顆粒球をリン酸緩衝食塩水(PBS)中で懸濁
した。
【００１１】これらの高度に精製したヒト顆粒球106 を
麻酔したバルブ(Balb)Ｃマウスの脾臓へと注射した。脾
臓内免疫化を行った10日後10×106 の同様に精製した顆
粒球をマウスの尾の静脈へと静脈内注射してマウスに追
加免疫した。３日後、このマウスの脾臓を回収し、従来
技術により脾臓細胞を回収した。
【００１２】ハイブリドーマを形成する融合を続行し
た。脾臓細胞を無血清培地中、NS-1骨髄腫細胞系で８の
脾臓細胞に対し１のNS-1細胞の割合で洗った。細胞を遠
心分離してペレット形とし、0.5 mlの30％ポリエチレン
グリコール中で８分間25℃で懸濁した。次いで、ポリエ
チレングリコールを静かにデカンテーションし、細胞を
ノット培地で希釈し、マイクロタイター平板に分配し
た。
【００１３】モノクローナル抗体1D3 の反応性試験は、
精製したヒト顆粒球との反応性をスクリーニングしなが
ら、間接的免疫螢光法とフローサイトメトリー法により
行った。1D3 モノクローナル抗体は、顆粒球に対し絶対
の選択性があり更に、非常に高い抗体密度により特徴づ
けられる抗体を同定しようと苦心した中で選択した。1D
3 モノクローナル抗体は、試験した25人の血液提供者の
25のサンプルに由来する顆粒球の90％以上と反応した。
1D3 は精製した単球、Ｔ細胞（Ｅ＋細胞）、Ｂ細胞／NK
細胞（Ｅ−細胞）と反応せず、更に正常な骨髄単核細胞
の僅か３％と反応する。1D3 は真に好中球特異的である
ため、好中球や好塩基球と反応しない。
【００１４】更に1D3 モノクローナル抗体の反応性試験
では、扁桃細胞やフィトヘマグルチニン活性化末梢血液
Ｔ細胞と反応をしなかった。この抗体につき数種のヒト
細胞系との反応性を試験した。HL60細胞系は弱い反応
性、即ち約26％を示した。U937、KG1 、K562及びドーデ
ィ(Daudi) 細胞系は1D3 とは非反応的であることが見出
された。1D3 抗体はヒト急性リンパ芽球性白血病細胞の
６個のサンプル及びヒト急性骨髄芽球性白血病細胞の５
個のサンプルと反応性を示さなかった。
【００１５】1D3 モノクローナル抗体は、ヒト好中球に
対する例外的な特異性のため独特である。この抗体は他
のヒト末梢血液細胞とまったく反応性を持たず、実際に
顆粒球前駆体や骨髄中の他の細胞との反応性を実質的に
持たない。この抗体が好中球に対し高度に特異的であ
り、こうした高い抗体密度で存在することから、免疫螢
光法や免疫組織化学のような任意の方法による顆粒球の
検出も非常に容易となる。このモノクローナル抗体はヒ
ト好中球の同定と計数とに有用であろう。ヒト白血病細
胞と1D3 との反応性の欠如は潜在的に臨床的関連性があ
る。好中球と反応するすべての従来報告されたモノクロ
ーナル抗体は、実際に幾つかの急性骨髄芽球性白血病細
胞とも反応する。従って、1D3 抗体は急性白血病の状態
の下で正確に好中球を計数する能力を提供するであろ
う。
【００１６】1D3 モノクローナル抗体を産生する能力の
あるハイブリッド細胞のサンプルは、アメリカン タイ
プ カルチャーコレクション(A.T.C.C.)に寄託され、N
o. HB9445を割り当てられている。
【００１７】1D3 モノクローナル抗体により同定した抗
原を生化学的に特徴づける試みは、異例の困難に当面し
た。次の三つの異なる方法を実施した。(1)溶菌し、抽
出した好中球のウエスタンブロット；(2)1D3 抗原の好
中球からのアフィニティカラム精製；(3)抽出前に好中
球をヨー素化し、次いで好中球から抗原をアフィニティ
カラム精製する。ハイブリドーマの産生で免疫化のため
のセルの分離に用い、リストした手順と同じ標準の実験
室的手順を、全血から好中球を分離するのに用いた。1D
3 抗原の分子量はこの時はこれらの方法で決定しなかっ
た。従って1D3抗原は炭水化物又は脂質抗原でありう
る。
【００１８】1D3 モノクローナル抗体により認識される
細胞表面のレセプター又は抗原を細胞的に特徴づける試
みを、末梢血液細胞サンプルからこれらを選択的に除去
することで行った。この目的のため、次のような二つの
手順を採用した。
【００１９】Ｉ．フロリダ、ハイアリー(Hialeah) のク
ールター社 (Coulter Corporation) から市販されて
いる「EPICS （登録）」機器を用い、フローサイトメト
リーと細胞選別技術とを採用した。1D3 モノクローナル
抗体との反応に従って螢光陽性を示すこれらの白血球と
GAM-FITC螢光標識とを、細胞選別技術により除去した。
選別した細胞をライト染料(Wright's stein)で染色し、
形態学的に組分けした。各試験サンプル中に最低500 の
白血球細胞が数えられた。20の正常な成人末梢血液サン
プル全体をこの方法で評価した。これらのサンプルにお
いて、少なくとも92％の成熟分節(segmented) 好中球
が、1D3 抗体と陽性であるとマークされた。
【００２０】II. この手順において、1D3 抗体に接合し
た磁性微小球による細胞分離を行った。正常な成人末梢
血液サンプルを、溶菌又は残留白血球に悪影響を及ぼす
ことなく赤血球を除去する他の技術によって処理した。
次いで、この白血球をライト染料で染色した後に細胞形
態学的に分析した。サンプルに導入した1D3 接合磁性微
小球を用い、これに結合した好中球をもつ白血球をこの
サンプルから回収した。残留した陰性細胞を、次いで好
中球の存在について形態学的に評価した。
【００２１】９つの末梢血液サンプルをこの方法で試験
した。これらの残留細胞サンプル中に、平均して0.2 ％
より少ない好中球が観察された。再び、最低500 の白血
球細胞が数えられた。
【００２２】これらの試験から得たデータは、1D3 抗体
が特異的に結合する白血球の集団が好中球集団であるこ
とを確証した。
【００２３】1D3 モノクローナル抗体によって認識され
る細胞表面セプター又は抗原の細胞的特徴を、還元性及
び非還元性条件下で規定した。還元性条件下では、1D3
抗原は48000 ダルトンの分子量をもつ。非還元性条件下
では、1D3 抗体は48000 〜60000 ダルトンの分子量範囲
で幅広いバンドをもつとして同定された。1D3 抗原は密
度勾配遠心分離によりヘパリン化末梢ヒト血液から得ら
れた循環顆粒球より分離し、単一形態をもつものとして
同定する。
【００２４】４×107 の細胞の相当量を、非連続垂直ス
ラブゲル上で実施したSDS ‐ポリアクリルアミド電気泳
動（５−15％勾配) で試験した。ユー・ケイ・ラエモー
ル(U. K. Laemole) により、Nature. 227680(1980)の文
献に記載された方法の修正法を採用した。電気泳動の
後、アクリルアミドスラブ中のタンパク質をニトロセル
ロースのシートにエレクトロブロットした。ニトロセル
ロース紙の分子量マーカーはタンパク質用にアミノブラ
ックＢで染色した。ニトロセルロース紙の残部は、放射
性マーカー、ヨウ素125 (125Ｉ）へと接合された抗−1D
3 での免疫検出のため、脱脂乾燥乳を含む緩衝液でブロ
ックした。この抗−1D3 -125Ｉを次いで1D3 抗原へと結
合したニトロセルロースと反応させた。非結合の放射性
ヨウ素化抗体を洗い取った後、イムノブラストをKodak
XAR フィルムを用いてオートラジオグラフィにより可視
化した。このKodak XAR フィルムを現像すると、1D3 抗
原が移動したところでバンドが現れた。この方法で、1D
3 モノクローナル抗体が特異的に結合する1D3 が特徴づ
けられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 好中球の1D3 抗原に特異的に結合し、他
    のヒト末梢血液細胞へと特異的に結合せずかつ骨髄中の
    顆粒球前駆体へは実質的に結合しないモノクローナル抗
    体を産生するハイブリドーマ技術によって産生され、前
    記1D3 抗原が還元性条件下で定めると約48000 ダルトン
    の分子量を有すると共に非還元性条件下で定めると約48
    000 〜60000 ダルトンの範囲内の分子量を有するハイブ
    リドーマ細胞系。
  2. 【請求項２】 前記モノクローナル抗体がヒト急性リン
    パ芽球性白血病細胞に特異的に結合しない、請求項１記
    載のハイブリドーマ細胞系。
  3. 【請求項３】 前記モノクローナル抗体がヒト急性骨髄
    芽球性白血病細胞に特異的に結合しない、請求項１記載
    のハイブリドーマ細胞系。
  4. 【請求項４】 前記モノクローナル抗体がヒト急性白血
    病細胞に特異的に結合しない、請求項１記載のハイブリ
    ドーマ細胞系。
  5. 【請求項５】好中球の1D3 抗原への抗体を産生するアメ
    リカン タイプ カルチャー コレクション(American
    Type Culture Collection) No. HB 9445の寄託試料の結
    合特異性の特徴を持つハイブリドーマ技術により産生さ
    れた、請求項１記載のハイブリドーマ細胞系。
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