CN114307988A - 一种用于纯化mRNA的微球的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于纯化mRNA的微球的制备方法及应用，用于纯化mRNA的微球的制备方法包括如下步骤，S1)用偶联缓冲液洗涤表面具有活性基团的聚苯乙烯微球；S2)加入Oligo dT与聚苯乙烯微球反应，反应结束后用偶联缓冲液进行清洗；S3)加入封闭试剂反应，反应结束后用偶联缓冲液进行清洗，制得用于纯化mRNA的微球。本发明刚性聚苯乙烯微球表面修饰氨基、羧基、环氧基、活泼酯(NHS)或苯磺酰基，使其具备反应活性，能够快速的与Oligo dT反应，将Oligo dT固定在微球表面，从而使微球具备了分离、纯化mRNA能力；且由于微球自身具有刚性结构，因此可承受一定压力，将Oligo dT微球装入层析柱，可以在液相色谱等设备上进行快速分离、纯化mRNA。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于纯化mRNA的微球的制备方法及应用。
背景技术
在真核生物中，成熟的mRNA分子从细胞核转移到细胞质中，并以此为直接模板模板合成蛋白。因此，mRNA在分子生物学、疫苗制备领域有着重要的意义。
一个典型的真核细胞中各类RNA的总量大约为15pg，而mRNA仅占其中的3％左右，因此，分离、纯化mRNA具有极高的挑战。传统的分离、纯化mRNA的方法有以下两种方法：(1)切向流过滤(TFF)；(2)oligo(dt)修饰的纤维素层析柱法。其中，TFF方法是根据滤膜的截留分子量不同以过滤杂质，所需设备复杂、昂贵，而且作为耗材的滤膜有各种不同规格，更换繁琐；oligo(dt)修饰纤维素层析柱法是根据Oligo(dt)会特异性的与mRNA一端的poly(A)尾结合，从而将mRNA分离、纯化出来。此种方法虽然已经商业化提供，但是由于纤维素自身原因，无法进行快速的过柱层析，过程费时、费力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低廉、操作便捷的用于纯化mRNA的微球的制备方法、以及应用这种微球对mRNA进行分离、纯化的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于纯化mRNA的微球的制备方法，包括如下步骤，
S1)用偶联缓冲液洗涤表面具有活性基团的聚苯乙烯微球；
S2)加入Oligo dT与聚苯乙烯微球反应，反应结束后用偶联缓冲液进行清洗；
S3)加入封闭试剂反应，反应结束后用偶联缓冲液进行清洗，制得用于纯化mRNA的微球。
作为进一步的优化，所述聚苯乙烯微球表面修饰氨基、羧基、环氧基和苯磺酰基中的一种或多种。
作为进一步的优化，所述聚苯乙烯微球为知益
牌刚性聚苯乙烯微球。
作为进一步的优化，所述偶联缓冲液为柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、碳酸盐缓冲液和硼砂缓冲液中的一种或多种。
作为进一步的优化，所述封闭试剂为牛血清蛋白、酪蛋白、Tris、乙胺和乙醇胺中的一种或多种。
作为进一步的优化，S2中的反应温度为4-40℃，反应时间为1-24h；S3中的反应温度为4-40℃，反应时间为1-5h。
本发明还提供了一种用于纯化mRNA的微球的应用，将用于纯化mRNA的微球装填至空柱管内制得mRNA纯化柱，利用mRNA纯化柱对mRNA进行纯化。
上述纯化方式为：将从细胞中得到的总RNA溶解于无核糖核酸酶的水中，加入高盐溶液，使盐浓度为0.5-2mol/L，将高盐溶液加入至经平衡缓冲液平衡的mRNA纯化柱中，使其缓慢过柱；用淋洗缓冲液过柱，洗去杂质；加入洗脱缓冲液，洗脱mRNA并收集。
作为进一步的优化，所述平衡缓冲液为柠檬酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液中的一种或多种。
作为进一步的优化，所述淋洗缓冲液为柠檬酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液中的一种或多种。
作为进一步的优化，所述洗脱缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、碳酸盐缓冲液中的一种或多种。
作为进一步的优化，所述高盐溶液为氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化锂溶液、硫酸钠溶液、硫酸钾溶液中的一种或多种。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：聚苯乙烯微球表面修饰氨基、羧基、环氧基或苯磺酰基，使其具备反应活性，能够快速的与Oligo dT反应，将Oligo dT固定在微球表面，从而使微球具备了分离、纯化mRNA能力；且由于微球自身具有刚性结构，因此可承受一定压力，将Oligo dT微球装入层析柱，可以在液相色谱等设备上进行快速分离、纯化mRNA。
附图说明
图1为本发明实施例1中采用Oligo dT纯化柱纯化后的mRNA紫外分光光度计检测图。
图2为本发明实施例1中采用Oligo dT纯化柱纯化后的mRNA紫外分光光度计检测图。
图3为本发明实施例1中采用Oligo dT纯化柱纯化后的mRNA紫外分光光度计检测图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
一种用于纯化mRNA的微球的制备方法，包括如下步骤，取表面具有环氧基活性基团的刚性聚苯乙烯微球(知益
牌)，用偶联缓冲液洗涤5次，按照5nmol/mL聚苯乙烯微球的比例加入Oligo dT，在25℃的条件下充分混匀，反应5小时，反应结束后，采用偶联缓冲液清洗微球，以洗去未反应的Oligo dT；加入封闭试剂，在25℃的条件下充分混匀，反应5小时，反应结束后，用清洗缓冲液清洗微球，然后将制备好的Oligo dT微球加入至保存缓冲液中备用。
上述制备的用于纯化mRNA的微球的应用为：取适当大小的空柱管，采用重力沉降或使用装柱机等方式，将表面偶联有Oligo dT的微球装填至空柱管内，得到mRNA纯化柱。
具体纯化方式为：将从细胞中得到的总RNA溶解于无核糖核酸酶(RNase Free)的水中，然后加入高盐溶液，使盐浓度最终达到2mol/L，混匀后，将高盐溶液加入至经过平衡缓冲液平衡好的Oligo dT纯化柱中，使其缓慢过柱，然后用淋洗缓冲液过柱，洗去杂质；加入洗脱缓冲液，将挂在柱子上的mRNA洗脱，并用离心管收集，采用电泳、紫外分光光度计等手段对得到的mRNA进行质控检测，如图1所示为采用Oligo dT纯化柱纯化后的mRNA紫外分光光度计检测图，OD260/280＝1.97,OD260/230＝2.13。
实施例2
一种用于纯化mRNA的微球的制备方法，包括如下步骤，取表面具有苯磺酰基活性基团的刚性聚苯乙烯微球(知益
牌)，用偶联缓冲液洗涤3次，按照1nmol/mL聚苯乙烯微球的比例加入Oligo dT，在25℃的条件下充分混匀，反应3小时，反应结束后，采用偶联缓冲液清洗微球，以洗去未反应的Oligo dT；加入封闭试剂，在25℃的条件下充分混匀，反应3小时，反应结束后，用清洗缓冲液清洗微球，然后将制备好的Oligo dT微球加入至保存缓冲液中备用。
上述制备的用于纯化mRNA的微球的应用为：取适当大小的空柱管，采用重力沉降或使用装柱机等方式，将表面偶联有Oligo dT的微球装填至空柱管内，得到mRNA纯化柱。
具体纯化方式为：将从细胞中得到的总RNA溶解于无核糖核酸酶(RNase Free)的水中，然后加入高盐溶液，使盐浓度最终达到1mol/L，混匀后，将高盐溶液加入至经过平衡缓冲液平衡好的Oligo dT纯化柱中，使其缓慢过柱，然后用淋洗缓冲液过柱，洗去杂质；加入洗脱缓冲液，将挂在柱子上的mRNA洗脱，并用离心管收集，采用电泳、紫外分光光度计等手段对得到的mRNA进行质控检测，如图2所示为采用Oligo dT纯化柱纯化后的mRNA紫外分光光度计检测图，OD260/280＝2.00,OD260/230＝2.02。
实施例3
一种用于纯化mRNA的微球的制备方法，包括如下步骤，取表面具有活泼酯(NHS)活性基团的刚性聚苯乙烯微球(知益
牌)，用偶联缓冲液洗涤3次，按照1nmol/mL聚苯乙烯微球的比例加入Oligo dT，在37℃的条件下充分混匀，反应3小时，反应结束后，采用偶联缓冲液清洗微球，以洗去未反应的Oligo dT；加入封闭试剂，在37℃的条件下充分混匀，反应2小时，反应结束后，用清洗缓冲液清洗微球，然后将制备好的Oligo dT微球加入至保存缓冲液中备用。
上述制备的用于纯化mRNA的微球的应用为：取适当大小的空柱管，采用重力沉降或使用装柱机等方式，将表面偶联有Oligo dT的微球装填至空柱管内，得到mRNA纯化柱。
具体纯化方式为：将从细胞中得到的总RNA溶解于无核糖核酸酶(RNase Free)的水中，然后加入高盐溶液，使盐浓度最终达到1.5mol/L，混匀后，将高盐溶液加入至经过平衡缓冲液平衡好的Oligo dT纯化柱中，使其缓慢过柱，然后用淋洗缓冲液过柱，洗去杂质；加入洗脱缓冲液，将挂在柱子上的mRNA洗脱，并用离心管收集，采用电泳、紫外分光光度计等手段对得到的mRNA进行质控检测，如图3所示为采用Oligo dT纯化柱纯化后的mRNA紫外分光光度计检测图，OD260/280＝1.90,OD260/230＝2.25。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (10)
1.一种用于纯化mRNA的微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1)用偶联缓冲液洗涤表面具有活性基团的聚苯乙烯微球；
S2)加入Oligo dT与聚苯乙烯微球反应，反应结束后用偶联缓冲液进行清洗；
S3)加入封闭试剂反应，反应结束后用偶联缓冲液进行清洗，制得用于纯化mRNA的微球。
2.根据权利要求1所述的用于纯化mRNA的微球的制备方法，其特征在于，所述聚苯乙烯微球表面修饰氨基、羧基、环氧基和苯磺酰基中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的用于纯化mRNA的微球的制备方法，其特征在于，所述聚苯乙烯微球为知益
牌聚苯乙烯微球。
4.根据权利要求1所述的用于纯化mRNA的微球的制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液为柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、碳酸盐缓冲液和硼砂缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的用于纯化mRNA的微球的制备方法，其特征在于，所述封闭试剂为牛血清蛋白、酪蛋白、Tris、乙胺和乙醇胺中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的用于纯化mRNA的微球的制备方法，其特征在于，S2中的反应温度为4-40℃，反应时间为1-24h；S3中的反应温度为4-40℃，反应时间为1-5h。
7.一种根据权利要求1-6任意一项所述的用于纯化mRNA的微球的应用，其特征在于，将用于纯化mRNA的微球装填至空柱管内制得mRNA纯化柱，利用mRNA纯化柱对mRNA进行纯化。
8.根据权利要求7所述的用于纯化mRNA的微球的应用，其特征在于，纯化方式为：将从细胞中得到的总RNA溶解于无核糖核酸酶的水中，加入高盐溶液，使盐浓度为0.5-2mol/L，将高盐溶液加入至经平衡缓冲液平衡的mRNA纯化柱中，使其缓慢过柱；用淋洗缓冲液过柱，洗去杂质；加入洗脱缓冲液，洗脱mRNA并收集。
9.根据权利要求8所述的用于纯化mRNA的微球的应用，其特征在于，所述平衡缓冲液为柠檬酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液中的一种或多种；所述淋洗缓冲液为柠檬酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液中的一种或多种；所述洗脱缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的用于纯化mRNA的微球的应用，其特征在于，所述高盐溶液为氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化锂溶液、硫酸钠溶液和硫酸钾溶液中的一种或多种。
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