CN101165183A - 利用金磁微粒分离mRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种利用金磁微粒分离mRNA的方法。其技术解决方案为：该方法包括以下步骤：1)链亲和素－金磁微粒的制备；2)将生物素标记的oligo(dT)探针和链亲和素－金磁微粒混合，通过链亲和素－生物素的结合，将生物素化的oligo(dT)探针固定于磁粒表面，作为反应和分离的固相载体；3)使oligo(dT)探针和mRNA polyA发生特异性杂交，磁性分离，弃上清；4)加入清洗缓冲液清洗磁粒，除去杂质；5)加入洗脱缓冲液，洗脱mRNA。本发明具有成本低廉、简便、分离快捷的优点。

Description

利用金磁微粒分离mRNA的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种利用金磁微粒分离mRNA的方法。

背景技术

从组织或细胞中分离mRNA，是分子生物学、遗传工程领域的一项基本技术。典型哺乳动物一个细胞中只有大约10pg的RNA，而mRNA则仅占总RNA的1-5％。常用的mRNA的分离方法有：(1)oligo(dT)-纤维素柱层析法，基于oligo(dT)-纤维素亲和色谱柱对PolyA⁺mRNA的专一吸附，然后经洗脱缓冲液洗脱获得PolyA⁺mRNA。(2)oligo(dT)-纤维素液相离心法，即用oligo(dT)-纤维素直接加人到总的RNA溶液中使PolyA⁺mRNA与oligo(dT)-纤维素结合，离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去oligo(dT)-纤维素。这两种方法的过程均比较复杂，费时、费力。目前mRNA分离试剂盒多基于亲和色谱法原理，这些试剂盒的主要特点是用微粒状的oligo(dT)吸附剂代替纤维状的oligo(dT)纤维素，用旋转柱法取代统的柱色谱法。应用亲和色谱法进行mRNA分离时，仍存在亲和柱流速慢、易堵塞、mRNA产量低，容易发生非特异性偶连等缺点。

磁性复合微粒，以超顺磁性纳米微粒与有机或无机材料，通过包覆、交联、修饰而制备的纳米级或微米级复合微粒。磁性复合微粒具有超顺磁性、较大的比表面积、良好的生物相容性、丰富的表面功能基团及其他荧光、发光等理化特性，因而被广泛应用于生物分子标记、生物分离、生物检测、靶向治疗等领域。

利用磁性微粒分离mRNA的研究和应用也非常活跃，其原理为：将oligo(dT)偶联于磁粒上，基于mRNA的PolyA尾巴与之相配对的原理，使mRNA结合于磁粒上，通过外加磁场将携带有mRNA的磁粒与体系中的杂质分离，最后将mRNA从磁粒上洗脱下来。Invitrogen、Promega等国外公司已有相应mRNA分离产品上市，但其价格昂贵，不利于一般实验室的普遍使用。

组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组成已经在中国专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别进行了公开，但其应用中主要包括分子固定以及相关检测的内容，未涉及到对mRNA进行分离的方法。

发明内容

本发明利用金磁微粒作为反应和分离的固相载体，提供一种成本低廉、简便、快捷的分离mRNA的方法。

本发明的技术解决方案是：本发明为一种利用金磁微粒分离mRNA的方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：

1)链亲和素-金磁微粒的制备；

1.1)取金磁微粒，以偶联缓冲液平衡1～3次，按20～500μg/(mg磁粒)的比例加入链亲和素，在20～40℃的条件下充分混匀，反应5min～2h，用清洗缓冲液清洗，除去未结合的链亲和素，加入保存缓冲液保存备用；

2)将生物素标记的oligo(dT)探针和链亲和素-金磁微粒混合，通过链亲和素-生物素的结合，将生物素化的oligo(dT)探针固定于磁粒表面，作为反应和分离的固相载体；

2.1)取链亲和素-金磁微粒，以偶联缓冲液平衡1～3次，按0.5～6nmol/(mg磁粒)加入生物素标记的oligo(dT)探针，在20～40℃的条件下充分混匀，反应5min～2h，用清洗缓冲液清洗，除去未结合的探针；

2.3)加入封闭剂在20～40℃的条件下充分混匀，反应30min～12h，封闭磁粒，然后用清洗缓冲液充分洗涤磁粒，除去未结合的封闭剂，加入保存缓冲液保存备用；

3)将RNA溶于无核糖核酸酶(RNase)的水中，在50～70℃的条件下放置3～15min，立即加入高盐溶液，使高盐终浓度达到0.1～2M，混匀后按10～1000μg总RNA/(mg磁粒)加入到用杂交缓冲液平衡的固定有oligo(dT)探针的金磁微粒中，在20～40℃的条件下放置3～15min，使oligo(dT)探针和mRNA polyA发生特异性杂交，磁性分离，弃上清；

4)加入清洗缓冲液清洗磁粒，除去杂质；

5)加入洗脱缓冲液，洗脱mRNA；

上述步骤1.1)之后还包括有步骤

1.2)测定链亲和素固定化前后在280nm的OD值，计算链亲和素在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。

上述步骤2.1)、2.3)之间还包括有步骤

2.2)测定生物素标记oligo(dT)探针固定化前后在260nm的OD值，计算生物素标记oligo(dT)探针在链亲和素-金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。

上述步骤3)之前需对总RNA进行质控实验，包括电泳检测及紫外检测。

上述步骤5)之后还包括步骤6)：对分离后的mRNA进行质控实验，包括电泳检测、紫外检测及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。

上述金磁微粒为核壳型金磁微粒或组装型金磁微粒。

上述偶联缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液(0.005M～1M，pH7.0～9.0)，碳酸盐缓冲液(0.005M～1M，pH9.0～11.0)，醋酸盐缓冲液(0.005M～1M，pH5.6)，柠檬酸盐缓冲液(0.005M～1M，pH3.0～7.0)，TBS缓冲液(0.005M～1M，pH7.0～9.0)，STE缓冲液(0.1×～10×，pH7.0～9.0)，TE缓冲液(0.005M～1M，pH3.0～7.0)，PBS缓冲液(0.5×～10×，pH5.0～8.0)，SSC缓冲液(0.1×～20×，pH7.0～9.0)，SSPE缓冲液(0.1×～20×，pH7.0～9.0)；

上述清洗缓冲液为上述偶联缓冲液；

上述封闭剂为含1～10％牛血清白蛋白(BSA)，赖氨酸(Lys)，乙醇胺，小牛血清，山羊血清等动物血清的一种或多种成分的上述偶联缓冲液；

上述保存缓冲液为上述偶联缓冲液或加入防腐剂(如0.01～0.1％的叠氮钠或0.01～0.1％的硫柳汞等)和保护剂(如0.05～1％BSA，0.05～1％的动物血清，蛋白酶抑制剂，核酸酶抑制剂等)的上述偶联缓冲液；

上述杂交缓冲液为含0.005M～0.5M的Tris-HCl(pH7.0～9.0)和0.03M～1M的NaCl的缓冲液，或10×～20×的SSC缓冲液(pH7.0～9.0)；

上述高盐溶液为1～5M的NaCl溶液；

上述洗脱缓冲液为0.001M～0.1M的TE缓冲液(pH7.0～8.0)或无核糖核酸酶(RNase)的水。

上述步骤1)中，

优选的偶联缓冲液是：0.01M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液；

优选的保存缓冲液是：含0.01％NaN₃，1％BSA的2×STE(pH8.0)缓冲液；

优选的清洗缓冲液是：2×STE(pH8.0)缓冲液；

上述步骤2)中，

优选的偶联缓冲液是：2×STE(pH8.0)缓冲液；

优选的清洗缓冲液是：2×STE(pH8.0)缓冲液；

优选的封闭剂为：含3％的脱脂奶粉的0.01M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液；

上述步骤3)中，

优选的杂交缓冲液是：含0.01M的Tris-HCl(pH8.5)和0.1M的NaCl的缓冲液；优选的高盐溶液是：3M的NaCl溶液；

上述步骤4)中，

优选的清洗缓冲液是：2×STE(pH8.0)缓冲液；

上述步骤5)中，

优选的洗脱缓冲液是：DEPC(二乙基焦碳酸，用于灭活核糖核酸酶(RNase))处理水。

上述步骤1.1)和2.1)中，

优选的反应条件为：在摇床中37℃，180r/min的条件下反应10min；

上述步骤2.3)中，

优选的反应条件为：在摇床中37℃，180r/min的条件下反应1h；

上述步骤3)中，

加入高盐溶液的优选的反应条件为：将总RNA样品在65℃的条件下水浴5min后立即加入高盐溶液，使高盐终浓度为0.3M。

本发明利用金磁微粒作为分离mRNA的载体，同时利用生物素与亲和素具有高度的特异亲和性进行mRNA的分离，因此本发明具有如下优点：

1)探针固定化操作简单方便，固定容量高，用较少金磁微粒即可完成mRNA的分离，降低分离成本。本发明中采用的链亲和素-金磁微粒的制备过程快速、简便，利用链亲和素和生物素的特异结合将oligo(dT)探针固定于金磁微粒表面，使探针的固定化操作更为省时、省力，而且对探针的固定化容量高，是已商品化的

M-270 Streptavidin的6～7倍，用较少的金磁微粒即可完成mRNA的分离，降低分离成本。

2)整个mRNA分离过程无需离心和沉淀，操作快速简捷，整个分离过程可在短时间内完成。

3)洗脱体积小，可得到高纯度、高浓度的mRNA，而且可根据后续实验要求调整洗脱体积，分离的mRNA可直接应用于下游实验。

附图说明

图1为本发明中的mRNA分离原理图；

图2为本发明实施例1中金磁微粒固定链亲和素前后的紫外吸收曲线；

图3为本发明实施例2中链亲和素-金磁微粒固定生物素标记的寡核苷酸探针前后的紫外吸收曲线；

图4为链亲和素-金磁微粒和M-270 Streptavidin磁性微粒对生物素标记的寡核苷酸探针固定化量的比较；

图5为本发明实施例3中经金磁微粒纯化获得的mRNA的电泳检测图；

图6为本发明实施例3中经金磁微粒纯化获得的mRNA的紫外检测图；

图7为本发明实施例3中经金磁微粒纯化获得的mRNA的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测图。

具体实施方式

参见图1，本发明的具体方法流程如下：

1)链亲和素-金磁微粒的制备；

1.1)取1mg金磁微粒，用0.01M Tris-HCl(pH8.0)平衡两次，加入200μg链亲和素，反应体积500μl，在摇床中37℃，180r/min的条件下反应20min，反应完毕，用2×STE(pH8.0)缓冲液清洗三次；

1.2)紫外-可见分光光度计测定链亲和素固定化前后及清洗后上清液在280nm的OD值，计算链亲和素在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量，加入1ml含0.01％NaN₃，1％BSA的2×STE(pH8.0)缓冲液，在4℃的条件下保存备用；

2)将生物素标记的oligo(dT)探针和链亲和素-金磁微粒混合，通过链亲和素-生物素的结合，将生物素化oligo(dT)探针固定于磁粒表面，作为反应和分离的固相载体；

2.1)取1mg包被链亲和素的金磁微粒，以2×STE(pH8.0)缓冲液平衡三次，磁性分离后，加入3.5nmol生物素标记的oligo(dT)探针，在摇床中37℃，180r/min的条件下反应10min；

2.2)反应结束后，磁性分离，以2×STE(pH8.0)缓冲液充分洗涤，测定生物素标记的oligo(dT)探针在固定化前后以及清洗后上清液在260nm的OD值，计算生物素标记的oligo(dT)探针在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量；

2.3)用含3％的脱脂奶粉的0.01M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液在摇床中37℃，180r/min的条件下反应1h封闭磁粒，然后用2×STE(pH8.0)充分洗涤磁粒三次，加入终浓度为O.1％DEPC，在摇床中37℃、180r/min的条件下振荡1h后，在4℃的条件下保存备用。

3)对RNA进行质控实验，包括电泳检测及紫外检测，将达到实验标准的RNA用于以下操作。

以下步骤适用于500μg偶连有oligo(dT)探针的链亲和素-金磁微粒从100μg总RNA中纯化mRNA的实验操作，可以按比例扩大或缩小纯化规模。

取500μg金磁微粒于RNase-free(无核糖核酸酶)的离心管中，用含0.01M的Tris-HCl(pH8.5)和0.1M的NaCl的缓冲液平衡2～3次后，悬浮于100μl含0.01M的Tris-HCl(pH8.5)和0.1M的NaCl的缓冲液中；将总RNA样品100μg溶于90μl DEPC处理水中，65℃水浴后立即加入10μl、3M的NaCl溶液，混匀，将处理后的总RNA溶液100μl立即加入预处理的金磁微粒溶液中，用移液器吹打均匀，室温反应5min，磁性分离，弃上清。

4)向上步得到的金磁微粒中加入200μl 2×STE(pH8.0)缓冲液，用移液器吹打均匀，磁性分离，弃上清。此步骤操作3次。

5)向金磁微粒中加入100μl的DEPC处理水或所需体积的DEPC处理水，用移液器吹打均匀，磁性分离，上清即为纯化的mRNA。

6)对分离后的mRNA进行质控实验，包括电泳检测、紫外检测，及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。

金磁微粒为核壳型金磁微粒或组装型金磁微粒。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明：

实施例1

本实施例为本发明中链亲和素在金磁微粒表面固定化的过程。

取1mg金磁微粒，用0.01M Tris-HCl(pH8.0)平衡两次，加入200μg链亲和素，反应体积500μl。在摇床中37℃，180r/min的条件下反应10min，反应完毕，用2×STE(pH8.0)缓冲液洗三次，每次500μl。紫外-可见分光光度计测定链亲和素固定化前后及清洗后上清液在280nm的OD值，计算链亲和素在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。加入1ml含0.01％NaN₃，1％BSA的2×STE(pH8.0)缓冲液，4℃保存备用。

金磁微粒偶联链亲和素前后的紫外吸收曲线如图2所示，其中曲线1为链亲和素溶液的紫外吸收曲线；曲线2为和金磁微粒结合后溶液的紫外吸收曲线；曲线3为清洗溶液的紫外吸收曲线。图中结果表明，链亲和素溶液在被固定化前在280nm处具有明显的光吸收，而固定化后及清洗后在280nm处没有明显的光吸收，说明链亲和素几乎全部被固定在金磁微粒表面。

实施例2

本实施例为本发明中生物素标记的寡核苷酸探针在链亲和素-金磁微粒表面固定化的过程。

取250μg链亲和素-金磁微粒，以2×STE缓冲液平衡三次，磁性分离，加入150μl生物素标记的寡核苷酸(溶于2×STE中，含862.5pmol寡核苷酸)，在摇床中37℃，120r/min的条件下反应10min，反应结束后，磁性分离，以2×STE缓冲液充分洗涤，测定固定化前后以及清洗后上清液在260nm的OD值，计算生物素标记寡核苷酸在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。

链亲和素-金磁微粒固定生物素标记的寡核苷酸探针前后的紫外吸收曲线如图3所示，曲线1为生物素标记寡核苷酸溶液的紫外吸收曲线；曲线2为和链亲和素-金磁微粒结合后的剩余溶液的紫外吸收曲线；曲线3为清洗溶液的紫外吸收曲线。图中结果表明，生物素标记寡核苷酸探针溶液在被固定化前在260nm处具有明显的光吸收，而固定化后及清洗后在260nm处没有明显的光吸收，说明生物素标记寡核苷酸探针几乎全部被固定在链亲和素-金磁微粒表面；

链亲和素-金磁微粒和已商品化的

M-270 Streptavidin磁性微粒对生物素标记的寡核苷酸探针偶联量的比较结果如图4所示，其中区块1为

M-270 Streptavidin的偶联量，区块2为链亲和素-金磁微粒的偶联量。图中结果表明，链亲和素-金磁微粒对生物素标记的寡核苷酸探针的固定化容量是已商品化的M-270 Streptavidin磁性微粒的6～7倍。

实施例3

本实施例为本发明中偶连有oligo(dT)探针的链亲和素-金磁微粒纯化mRNA的过程。

以下步骤适用于500μg偶连有oligo(dT)探针的链亲和素-金磁微粒(以下简称金磁微粒)从100μg总RNA中纯化mRNA的实验操作，可以按比例扩大或缩小纯化规模。

1、金磁微粒的预处理：

1.1将金磁微粒摇匀后，用移液器移取500μl于RNase-free的离心管中，将离心管置于磁性分离器中磁性分离2min，在磁性分离器上用移液器移取上清弃去；

1.2将200μl含0.01M的Tris-HCl(pH8.5)和0.1M的NaCl的缓冲液加入上步的金磁微粒中，轻摇重悬磁粒，磁性分离，弃上清，此步骤操作2次；

1.3加入100μl含0.01M的Tris-HCl(pH8.5)和0.1M的NaCl的缓冲液，轻摇重悬磁粒，备用；

2、mRNA纯化

2.1总RNA样品溶于90μl的DEPC处理水中，放入65℃水浴5min；

2.2取出离心管，立即加入10μl的3M的NaCl溶液，混匀；

2.3将处理后的总RNA溶液100μl立即加入步骤1.3预处理的金磁微粒溶液中，用移液器吹打均匀，室温反应5min，磁性分离，弃上清。

2.4向上步得到的金磁微粒中加入200μl的2×STE(pH8.0)缓冲液，用移液器吹打均匀，磁性分离，弃上清，此步骤操作3次；

2.5向金磁微粒中加入100μl的DEPC处理水或所需体积的DEPC处理水，用移液器吹打均匀，磁性分离，上清即为纯化的mRNA。

经金磁微粒纯化获得的mRNA经电泳检测的结果如图5所示，图中可清楚的看到一抹被纯化的mRNA条带；

经金磁微粒纯化获得的mRNA的紫外检测结果如图6所示，图中结果表明，被纯化mRNA在260nm处具有明显的光吸收，从100μg总RNA中可纯化获得2μg左右的mRNA；

经金磁微粒纯化获得的mRNA经RT-PCR检测的结果如图7所示，图中结果表明，以纯化mRNA为摸板，经过RT-PCR，β-actin基因被很好的扩增出来，说明纯化的mRNA具有良好的完整性及反转录活性，可直接应用于下游实验。

金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃等铁的氧化物粒子，单质Fe、Co、Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质Fe、Co、Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。

Claims (9)

1.一种利用金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)链亲和素-金磁微粒的制备；

1.1)取金磁微粒，以偶联缓冲液平衡1～3次，按20～500μg/(mg磁粒)的比例加入链亲和素，在20～40℃的条件下充分混匀，反应5min～2h，用清洗缓冲液清洗，除去未结合的链亲和素，加入保存缓冲液保存备用；

2)将生物素标记的oligo(dT)探针和链亲和素-金磁微粒混合，通过链亲和素-生物素的结合，将生物素化的oligo(dT)探针固定于磁粒表面，作为反应和分离的固相载体；

2.1)取链亲和素-金磁微粒，以偶联缓冲液平衡1～3次，按0.5～6nmol/(mg磁粒)加入生物素标记的oligo(dT)探针，在20～40℃的条件下充分混匀，反应5min～2h，用清洗缓冲液清洗，除去未结合的oligo(dT)探针；

2.3)加入封闭剂在20～40℃的条件下充分混匀，反应30min～12h，封闭磁粒，然后用清洗缓冲液充分洗涤磁粒，除去未结合的封闭剂，加入保存缓冲液保存备用；

3)将RNA溶于无核糖核酸酶的水中，在50～70℃的条件下放置3～15min，立即加入高盐溶液，使盐终浓度达到0.1～2M，混匀后按10～1000μg总RNA/(mg磁粒)加入到用杂交缓冲液平衡的固定有oligo(dT)探针的金磁微粒中，在20～40℃的条件下放置3～15min，使oligo(dT)探针和mRNA polyA发生特异性杂交，磁性分离，弃上清；

4)加入清洗缓冲液清洗磁粒，除去杂质；

5)加入洗脱缓冲液，洗脱mRNA。

2.根据权利要求1所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：所述步骤1.1)之后还包括有步骤

1.2)测定链亲和素固定化前后在280nm的OD值，计算链亲和素在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。

3.根据权利要求1所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：所述步骤2.1)、2.3)之间还包括有步骤

2.2)测定生物素标记oligo(dT)探针固定化前后在260nm的OD值，计算生物素标记oligo(dT)探针在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。

4.根据权利要求1所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：所述步骤3)之前需对总RNA进行质控实验，包括电泳检测及紫外检测。

5.根据权利要求1所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：所述步骤5)之后还包括步骤6)：对分离后的mRNA进行质控实验，包括电泳检测、紫外检测及反转录聚合酶链式反应。

6.根据权利要求1至5任一权利要求所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：所述金磁微粒为核壳型金磁微粒或组装型金磁微粒。

7.根据权利要求6所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：所述偶联缓冲液可以是0.005M～1M，pH7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，0.005M～1M，pH9.0～11.0的碳酸盐缓冲液，0.005M～1M，pH5.6的醋酸盐缓冲液，0.005M～1M，pH3.0～7.0的柠檬酸盐缓冲液，0.005M～1M，pH7.0～9.0的TBS缓冲液，0.1×～10×，pH7.0～9.0的STE缓冲液，0.005M～1M，pH3.0～7.0的TE缓冲液，0.5×～10×，pH5.0～8.0的PBS缓冲液，0.1×～20×，pH7.0～9.0的SSC缓冲液，0.1×～20×，pH7.0～9.0的SSPE缓冲液；

所述清洗缓冲液为上述偶联缓冲液；

所述封闭剂为含1～10％牛血清白蛋白，赖氨酸，乙醇胺，小牛血清，山羊血清等动物血清的一种或多种成分的上述偶联缓冲液；

所述保存缓冲液为上述偶联缓冲液或加入防腐剂0.01～0.1％的叠氮钠或0.01～0.1％的硫柳汞和保护剂0.05～1％BSA，0.05～1％的动物血清，蛋白酶抑制剂，核糖核酸酶抑制剂的上述偶联缓冲液；

所述杂交缓冲液为含0.005M～0.5M、pH7.0～9.0的Tris-HCl和0.03M～1M的NaCl缓冲液或10×～20×，pH7.0～9.0的SSC缓冲液；所述高盐溶液为1～5M的NaCl溶液；

所述洗脱缓冲液为0.001M～0.1M，pH7.0～8.0的TE缓冲液或无核糖核酸酶的水。

8.根据权利要求6所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：

所述步骤1)中，

优选的偶联缓冲液是：0.01M，pH8.0的Tris-HCl缓冲液；

优选的保存缓冲液是：含0.01％NaN₃，1％BSA的pH8.0的2×STE缓冲液；

优选的清洗缓冲液是：pH8.0的2×STE缓冲液；

所述步骤2)中，

优选的偶联缓冲液是：pH8.0的2×STE缓冲液；

优选的清洗缓冲液是：pH8.0的2×STE缓冲液；

优选的封闭剂为：含3％的脱脂奶粉的pH8.0的0.01M Tris-HCl缓冲液；

所述步骤3)中，

优选的杂交缓冲液是：含0.01M、pH8.0的Tris-HCl和0.1M的NaCl缓冲液；

优选的高盐溶液是：3M的NaCl溶液；

所述步骤4)中，

优选的清洗缓冲液是：pH8.0的2×STE缓冲液；

所述步骤5)中，

优选的洗脱缓冲液是：DEPC处理水。

9.根据权利要求6所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于：

所述步骤1.1)和2.1)中，

优选的反应条件为：在摇床中37℃，180r/min反应10min；

所述步骤2.3)中，

优选的反应条件为：在摇床中37℃，180r/min反应1h；

所述步骤3)中，

加入高盐溶液的优选的反应条件为：将总RNA样品在65℃的条件下水浴5min后立即加入高盐溶液，使高盐终浓度为0.3M。

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