CN101165173B - 利用金磁微粒进行细胞分选的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用金磁微粒从含不同细胞的混合样本中分离所需目的细胞的方法。其技术解决方案为：该方法包括以下步骤：1)抗体分子固定化：在金磁微粒表面固定单克隆抗体分子；2)细胞和金磁微粒的结合：将固定好单克隆抗体分子的金磁微粒和待分离样本孵育15-60min，使细胞表面抗原和单克隆抗体充分结合而使细胞结合在金磁微粒表面；3)磁分离：孵育完毕之后，使用磁性分离装置进行磁分离，将目的细胞和其它细胞分开；4)清洗：磁分离结束后对金磁微粒进行清洗洗去非特异性结合的细胞。本发明具有制作简单迅速，低成本，对所结合细胞毒性小，不影响细胞活力，还能够用于后续培养等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用金磁微粒从含不同细胞的混合样本中分离所需目的细胞的方法。
背景技术
随着生命科学的不断发展，细胞生物学和免疫学基础研究以及临床疾病的诊断与治疗都需要从含有不同细胞的混合样本中分离出纯化细胞，现有的细胞分离技术主要有：Ficoll密度梯度离心，离心洗提，双水相分离，这些方法都是利用细胞大小，密度，表面电荷等物理性质的特征加以分离，难以获得理想纯度及回收率，而流式细胞仪分选虽然能获得很高的纯度和回收率却需要昂贵仪器，且操作过程复杂费时，CN1376779公开了一种染色后介电电泳从母体血液样本中分离胎儿细胞和分离红细胞和白细胞的方法，该方法不但需要较复杂仪器，而且不具备分离其他细胞样本的通用性。ZL00256373.8公布开了一种免疫亲和分离柱，将亲和素交联的凝胶充填在亲和层析柱中，用生物素化单抗和细胞悬液通过层析柱，此方法成本较高；CN1357620公开了一种利用不同种类细胞吸附性质的不同分离造血干细胞，其方法同样不具备通用性。
磁性微粒用于细胞分选是近些年来迅速发展起来的一项细胞分离的技术，其通过在磁性微粒上标记抗体分子使其和细胞发生特异性结合，借助于外磁场的作用，使和磁性颗粒结合的细胞发生定向移动而实现目的细胞的分离，此方法操作简便迅速，不需要大规模仪器，且能获较高的纯度和回收率。Molday最早将含羧基的磁性高分子微粒用于细胞分离的研究(Application ofmagnetic microspheres in labeling and separation of cells[J].Nature，1977，268：437～438)，美国专利4230685公开了利用蛋白A结合的磁粒分离细胞的方法，美国专利6190870公开了磁性微粒从外周血中分离肿瘤细胞的方法，美国专利5635363公了磁性微粒分离纯化抗原特异性T细胞的方法。市场上已有用于细胞分选的商品化的磁粒出售如Dynalbiotech公司的粒径4.5μm的苯乙烯磁粒Milteny公司的50nm的葡聚糖包覆磁粒，BD公司的粒径200nm的二氧化硅磁粒。但这些用于细胞分选的磁性微粒大都为有机/无机磁性复合颗粒，即以磁性材料为核心，有机小分子，天然高分子，有机合成高分子等为壳层，这些磁粒用于细胞分选仍存在一些缺陷：如表面通过共价修饰固定抗体分子，固定方法复杂且易造成抗体活性损失；单位质量磁性微粒固定抗体分子数量少，细胞分选后续步骤磁粒与细胞的解离复杂且成本较高，价格昂贵。
组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组成已经在中国专利ZL03153486.4和ZL03124061.5分别进行了公开，但其应用中主要包括分子或细胞标记以及相关检测的内容，未涉及到细胞分选的内容。
发明内容
本发明为解决背景技术中存在的上述技术问题，而提供一种制作简单迅速，低成本，对所结合细胞毒性小，不影响细胞活力，能够用于后续培养的金磁微粒进行细胞分选的方法。
本发明的技术解决方案是：本发明为一种金磁微粒用于细胞分选的方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：
1)在金磁微粒表面直接固定或通过其他亲核配基间接固定单克隆抗体分子：其可包括以下四种方式：方式一：可以通过直接固定单克隆抗体分子；方式二：可以通过先固定二抗分子再和单抗分子结合间接固定；方式三：可以通过链亲和素和生物素化的单抗结合间接固定；方式四：可以通过先固定蛋白A或蛋白G再结合单抗分子间接固定。
2)细胞和金磁微粒的结合：将固定好单克隆抗体分子的金磁微粒和待分离样本孵育15-60min，使细胞表面抗原和单克隆抗体充分结合而将细胞固定在金磁微粒表面；
3)磁分离：孵育完毕之后，使用磁性分离装置进行磁分离2-5min，将目的细胞和其它细胞分开；
4)清洗：磁分离结束后对金磁微粒进行清洗洗去非特异性结合的细胞，用清洗缓冲液在不撤去外磁场的条件下缓慢冲洗金磁微粒，弃上清，重复此步骤直至洗去非特异性结合的细胞。
以下以1mg金磁微粒说明表面固定单克隆抗体分子的步骤，具体应用时可根据比例放大或缩小相应倍数。
方式一中直接固定单克隆分子的具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入200-800μl偶联缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清；
1.2)抗体溶液的配制：将单克隆抗体溶解于200-800μl偶联缓冲液中，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和单克隆抗体摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min，完成单克隆分子在金磁微粒表面的固定；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入200-800μl清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的抗体分子；
1.5)封闭：取200-800μl封闭剂加入金磁微粒中，摇匀，在20-40℃的条件下充分反应30min-2h，然后用200-800μl清洗缓冲液清洗去除多余的封闭剂。
方式二中通过二抗分子间接固定单克隆抗体分子的具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入200-800μl偶联缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清；
1.2)抗体溶液的配制：将3-300μg二抗分子溶液溶解于200-800μl的偶联缓冲液中，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和二抗分子摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min，完成二抗分子在金磁微粒表面的固定；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入200-800μl清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的二抗分子；
1.5)封闭：取200-800μl封闭剂加入金磁微粒中摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应30min-2h，加清洗缓冲液洗去多余的封闭剂；
1.6)结合单抗分子：取固定好二抗分子且封闭清洗后的金磁微粒和3-300μg的单克隆抗体分子在2-8℃的条件下孵育15-30min，使单克隆抗体分子和二抗分子充分结合；
1.7)清洗：加入200-800μl清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的单抗分子。
方式三中通过链亲和素和生物素化单抗固定单抗分子的具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入200-800μl偶联缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清；
1.2)金磁微粒结合连亲和素：将3-300μg链亲和素溶于100-800μl偶联缓冲液配成链亲和素溶液，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中，摇匀，充分反应5-30min；
1.3)固定生物素化单抗：将3-300μg单克隆抗体分子溶于100-800μl偶联缓冲液中，加入结合有链亲和素的金磁微粒，摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入200-800μl清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合单抗分子；
1.5)封闭：取200-800μl封闭剂加入金磁微粒中摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应30min-2h，加200-800μl清洗缓冲液洗去多余的封闭剂。
方式四中利用蛋白A或蛋白G间接固定单克隆抗体分子具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入200-800μl偶联缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清；
1.2)蛋白A或蛋白G溶液的配制：将蛋白A或蛋白G溶液溶解于200-800μl偶联缓冲液，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和蛋白A或蛋白G溶液摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入200-800μl清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的蛋白A或蛋白G；
1.5)封闭：取200-800μl封闭剂加入金磁微粒溶液中摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应30min-2h，加清洗缓冲液洗去多余的封闭剂；
1.6)结合单抗分子：将3-300μg单克隆抗体分子溶于200-800μl偶联缓冲液中，加入固定好蛋白A或蛋白G且封闭清洗过的金磁微粒，摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min；
1.7)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入200-800μl清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的单抗分子。
上述金磁微粒为核壳型超顺磁性复合微粒或组装型磁性复合微粒。
上述偶联缓冲液为Tris-HCl缓冲液(pH7.0-9.0，5mM-1M)或磷酸盐缓冲液PBS(pH5.0-8.0，0.5×-10×)或碳酸盐缓冲液CBS(pH9.0-11.0，5mM-1M)或醋酸盐缓冲液(pH3.6-5.6，5mM-1M)或柠檬酸盐缓冲液(pH3.0-7.0，5mM-1M)或TE缓冲液(pH7.0-9.0，5mM-1M)或TBS缓冲液(pH7.0-9.0，5mM-1M)。
上述清洗缓冲液为偶联缓冲液或含0.02-0.2％吐温的偶联缓冲液。
上述封闭剂为含有1-10％的牛血清白蛋白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清或山羊血清中的一种或多种成分的偶联缓冲液。
本专利发明人在专利ZL0314061.5公开了核壳型磁性复合微粒的制备方法，ZL03153486.4公开了组装性磁性复合微粒的制备方法，并将这两种磁性复合颗粒称为金磁微粒，和现有技术相比，金磁微粒在细胞分选方面有以下优点：标记抗体分子具有比现有产品固定容量大，操作简单迅速，低成本等特点，且对所结合细胞毒性小，不影响细胞活力，能够用于后续培养，细胞从磁粒上的解离条件不苛刻，只需要用移液器反复吹打磁粒或将细胞继续培养就可实现细胞从磁粒上的解离。
根据金磁微粒分离细胞的原理，要想从混合细胞样本中分离目的细胞，只要能得到针对抗特定细胞表面抗原分子的单克隆抗体，并将其固定在金磁微粒表面，便可实现对特定细胞的分离，目前，大多抗特定细胞表面抗原的单克隆抗体已经能在市场上购得。本发明的方法尤其适用于分离外周血，骨髓，脐带血和淋巴组织液中感兴趣的细胞，并将它们用于细胞、免疫学基础研究和临床诊断与治疗。例如，细胞免疫主要是由T淋巴细胞来实现的，因此分离出高纯度的T淋巴细胞对研究T细胞功能的实现和免疫机理研究有重要意义，CD3是T细胞表面特异抗原，因此用CD3单抗可实现T细胞的分离。CD4阳性T细胞是HIV感染的主要靶分子，临床上对潜在的感染威胁而进行的抗病毒或预防治疗决定，是依据对CD4+T细胞的计数而做出的；因此金磁微粒用于细胞分离可以用于检测HIV感染。造血干细胞表达特异的表面标志，从外周血或脐带血中分离高纯度造血干细胞可以用于干细胞移植。肿瘤细胞表达特异性表面标志，金磁微粒作为载体可以用于从病人血液中清除肿瘤细胞。本发明对阴性分选和阳性分选两种方法均适用.
附图说明
图1为本发明实施例一固定前和固定后抗体溶液的紫外吸收峰；
图2为本发明实施例三的流式细胞仪结果。
具体实施方式
本发明的具体方法优选的步骤如下：
1、在金磁微粒表面直接固定或通过其他亲核配基间接固定单克隆抗体分子：具体有以下四种方法：
1)在金磁微粒表面直接固定抗细胞表面抗原的单克隆抗体，此种固定方法采用一步固定步骤少操作简单，采用较少的试剂和反应步骤，避免了抗体间的交叉反应带来的非特异吸附，但要求固定相对较多数目的单克隆抗体分子，其具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入500μl的0.01M Tris-HCl pH7.4中摇匀，磁性分离2min，弃上清；
1.2)抗体溶液的配制：将75μg单克隆抗体溶于500μl的0.01M Tris-HClpH7.4中，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和单克隆抗体摇匀，置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应30min；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离2min，弃上清，加入500μl的含0.05％吐温20的1×PBS中，摇匀，磁性分离2min，弃上清，重复三次；
1.5)封闭：取400μl的含5％脱脂奶粉的0.01M Tris-HCl pH7.4加入金磁微粒中，摇匀置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应2h，用500μl的含0.05％吐温20的1×PBS清洗三次。
2)在金磁微粒表面固定抗单克隆抗体的二抗分子，通过二抗和单克隆抗体的结合，将单克隆抗体间接固定在金磁微粒表面，此种方法首先固定二抗分子，此二抗分子可以是抗单克隆抗体来源的任何多克隆抗体分子，由于二抗的放大作用使可以固定相对数量较少的单克隆抗体，且二抗分子的引入使单克隆抗体的Fc端和二抗分子结合，结合细胞表面抗原的Fab端充分伸展而保持良好的活性，因此在成本和使用的通用性方面有一定的优势，其具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入600μl的0.01M Tris-HClpH7.4中摇匀，磁性分离2min，弃上清；
1.2)抗体溶液的配制：将75μg二抗分子溶于500μl的0.01M Tris-HClpH7.4中，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和二抗分子摇匀，置于恒温摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应30min；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离2min，弃上清，加入500μl的含0.05％吐温20的1×PBS，摇匀，磁性分离2min，弃上清；
1.5)封闭：取400μl的含5％脱脂奶粉的0.01M Tris-HClpH7.4加入金磁微粒中，摇匀置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应2h，用500μl的含0.05％吐温20的1×PBS清洗三次；
1.6)结合单抗分子：取固定好二抗分子封闭清洗后的金磁微粒和10μg单克隆抗体分子在4℃的条件下孵育30min；
1.7)清洗：加入500μl的含0.05％吐温20的1×PBS摇匀，磁性分离2min，弃上清，重复三次。
3)在金磁微粒表面固定链亲和素，通过生物素化抗体和链亲和素的强结合力将单克隆抗体固定在金磁微粒表面，链亲和素是非糖基化蛋白，非特异性很低，和生物素化蛋白的结合能力是抗原抗体亲和力的100万倍，此种方法需要生物素化的单克隆抗体分子，其具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入400μl的0.1M Tris-HClpH7.4摇匀，磁性分离2min，弃上清；
1.2)金磁微粒结合链亲和素：将300μg链亲和素溶于500μl的0.1MTris-HClpH7.4配成链亲和素溶液，加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中，将离心管置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应10min；
1.3)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离2min，弃上清，加入400μl的0.01MTris-HCl pH7.4，轻摇重悬磁粒，磁分离2min，弃上清；
1.4)固定生物素化单抗：将10μg单克隆抗体分子溶于200μl的0.01MTris-HCl pH7.4中，加入结合有链亲和素的金磁微粒摇匀，置于摇床中，在37℃、120r/min的条件下充分反应15min；
1.5)封闭：取400μl的含5％脱脂奶粉的0.1M Tris-HClpH7.4加入金磁微粒中，摇匀置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应30min，用500μl的0.1M Tris-HClpH7.4清洗三次；
4)在金磁微粒表面固定蛋白G，利用蛋白G和IgG分子的强结合力将单克隆抗体固定在金磁微粒表面，其具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入500μl的0.02MTris-HCl PH7.4摇匀，磁性分离2min，弃上清；
1.2)蛋白G溶液的配制：将160mg蛋白G溶液溶解于500μl的0.02MT ris-HCl PH7.4中，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和蛋白G溶液摇匀，置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应30min；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离2min，弃上清，加入500μl的含0.05％吐温20的1×PBS，摇匀，磁性分离2min，弃上清，重复此步骤三次；
1.5)封闭：取400μl的含5％脱脂奶粉的0.02M Tris-HCl加入金磁微粒中摇匀，在37℃的条件下充分反应30min，加入500μl的含0.05％吐温20的1×PBS清洗三次；
1.6)结合单抗分子：将10mg单克隆抗体分子溶于100μl的0.1M柠檬酸盐缓冲液pH5.0中，加入固定好蛋白G封闭清洗过的金磁微粒，摇匀，在37℃的条件下充分反应10min；
1.7)清洗：离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入500μl的0.1M pH5.0柠檬酸盐缓冲液清洗三次。
2、细胞和金磁微粒的结合：固定有单克隆抗体分子的金磁微粒经过简单的孵育过程就可以完成细胞核金磁微粒的结合，将固定好的金磁微粒和待分离样本孵育30min，其间间隔5min轻摇一次避免细胞沉底，使细胞表面抗原和单克隆抗体充分结合而将细胞固定在金磁微粒表面；
3、磁分离：孵育完毕之后，使用磁性分离装置进行磁分离5min，将固定在金磁微粒表面的细胞和其它细胞分开；
4、清洗：磁分离结束后对磁粒进行清洗洗去非特异性结合的细胞，用含1％BSA+2mM EDTA的1×PBS不撤去外磁场缓慢冲洗磁粒，弃上清，重复三次，可依据分选策略保留上清溶液(阴性分选)和磁粒(阳性分选)继续后续试验；
5、细胞从金磁微粒上的解离：微米级金磁微粒直径和细胞相当，不需要强磁场就能迅速实现细胞分离，分离得到的细胞需要从磁粒上解离下来，细胞从磁粒上的解离可以通过将磁性微粒-细胞复合物进行继续培养，培养后在机械压力如移液管的反复吹打可使细胞与磁性微粒解离。
下面以具体的实施例进一步阐明本发明：
实施例1
在金磁微粒表面直接固定抗细胞表面抗原的单克隆抗体(CD3单抗)。
取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入500μl的0.02M Tris-HCl pH7.4用手摇匀，磁性分离2min左右，弃上清，将75mg的CD3单抗溶解于500μl的0.02M Tris-HCl pH7.4中，取400μl加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中另留100μl作紫外检测；将装有金磁微粒和抗体的离心管摇匀，置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应30min反应完毕，磁性分离，取100μl上清作紫外检测其余弃去。对金磁微粒进行清洗以洗去多余的抗体分子，加入500μl的含5％吐温的1×PBS摇匀，磁分离弃上清，重复此步骤二次，以400μl的含5％脱脂奶粉的1×PBS加入金磁微粒中，在37℃、180r/min的条件下充分反应30min，然后用400μl的含5％吐温的1×PBS清洗三次。
参见图1，图为固定前后抗体溶液的紫外吸收峰，在此实施例一中抗体分子在280nm处吸收峰的显著降低说明抗体分子已固定于金磁微粒表面且不易洗脱。
实施例2
金磁微粒通过二抗分子(羊抗小鼠IgG)间接固定单克隆抗体(抗CD3单抗)。
取1mg金磁微粒，置于离心管中，加入500μl的0.02M Tris-HCl PH7.4摇匀，磁性分离2min，弃上清，将75μg的羊抗小鼠IgG抗体溶液溶解于500μl的0.02M Tris-HCl pH7.4中，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；将装有金磁微粒和抗体的离心管置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应30min，反应完毕后磁性分离，弃上清；加入500μl的含0.05％吐温20的1×PBS对金磁微粒进行清洗一次，然后以400μl的含5％脱脂奶粉的0.01M Tris-HCl加入到金磁微粒中，然后置于摇床中，在37℃、180r/min的条件下充分反应30min，用400μl的含0.05％吐温20的1×PBS清洗三次去除多余的脱脂奶粉。
实施例3
通过二抗间接固定单克隆抗体分子的金磁微粒分选CD3+细胞
细胞样本的准备：将Raji(CD3-)，Jurkat(CD3+)细胞分别计数，按4：1的比例混合，于4℃1200r/min离心5min，弃上清，收集沉淀，以分选缓冲液1×PBS含1％BSA+2mMEDTA重悬至一定体积。
细胞和金磁微粒的结合：细胞样本和金磁微粒按照每1×106个目的细胞加入200μg通过二抗间接固定有单抗分子的金磁微粒的比例充分混匀，室温孵育30min，其间每5min轻摇一次避免细胞沉至管底，使细胞表面抗原和单克隆抗体充分结合而将细胞固定在金磁微粒表面；
磁分离：反应完毕后，将磁粒—细胞悬液磁性分离5min；
清洗和检测：取上清留作染色以检测得率。磁粒上细胞用1×PBS含1％BSA+2mMEDTA在不撤去外磁场的条件下清洗三次，以去除非特异性结合的细胞，金磁微粒-细胞加入1ml的1×PBS含1％BSA+2mMEDTA重悬，摇匀，留作染色以检测纯度。
参见图2，结果经流式细胞仪检测：分选前细胞混合液中CD3+的含量23％，分选后细胞混合液上清CD3+的含量6.2％，分选后细胞混合液中磁粒上CD3+含量91％，所以，分选得率为73％，纯度为91％。
金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子，单质Fe、Co、Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质Fe、Co、Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。
Claims (10)
1.一种金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)抗体分子固定化：在金磁微粒表面固定单克隆抗体分子；
2)细胞和金磁微粒的结合：将固定好单克隆抗体分子的金磁微粒和待分离样本孵育15-60min，使细胞表面抗原和单克隆抗体充分结合而使细胞结合在金磁微粒表面；
3)磁分离：孵育完毕之后，使用磁性分离装置进行磁分离，将目的细胞和其它细胞分开；
4)清洗：磁分离结束后对金磁微粒进行清洗洗去非特异性结合的细胞。
2.根据权利要求1所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤1)中的固定的具体步骤如下：
1.1)金磁微粒预处理：取金磁微粒，置于离心管中，加入偶联缓冲液用手摇匀，磁性分离1-3min，弃上清；
1.2)抗体溶液的配制：将单克隆抗体溶解于偶联缓冲液中，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和单克隆抗体摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min，完成单克隆分子在金磁微粒表面的固定；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的抗体分子；
1.5)封闭：取封闭剂加入金磁微粒中，摇匀，在20-40℃的条件下充分反应30min-2h，然后用清洗缓冲液清洗去除多余的封闭液。
3.根据权利要求1所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤1)中的固定的具体步骤如下：
1.1)金磁微粒预处理：取金磁微粒，置于离心管中，加入偶联缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清；
1.2)抗体溶液的配制：将二抗分子溶液溶解于的偶联缓冲液中，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和二抗分子摇匀，在20-40℃的条件下、充分反应5-30min，完成二抗分子在金磁微粒表面的固定；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的二抗分子；
1.5)封闭：取封闭剂加入金磁微粒中摇匀，在20-40℃的条件下、充分反应30min-2h，加清洗缓冲液洗去多余的封闭剂；
1.6)结合单抗分子：取固定好二抗分子且封闭清洗后的金磁微粒和的单克隆抗体分子在2-8℃的条件下孵育15-30min，使单克隆抗体分子和二抗分子充分结合；
1.7)加入清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的单抗分子。
4.根据权利要求1所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤1)中的固定的具体步骤如下：
1.1)金磁微粒的预处理：取金磁微粒，置于离心管中，加入偶联缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清；
1.2)金磁微粒结合连亲和素：将链亲和素溶于偶联缓冲液配成链亲和素溶液，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中，摇匀，充分反应5-30min；
1.3)固定生物素化单抗：将单克隆抗体分子溶于偶联缓冲液中，加入结合有链亲和素的金磁微粒，摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合单抗分子；
1.5)封闭：取封闭剂加入金磁微粒中摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应30min-2h，加清洗缓冲液洗去多余的封闭剂。
5.根据权利要求1所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤1中的固定的具体步骤如下：
1.1)金磁微粒预处理：取金磁微粒，置于离心管中，加入偶联缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清；
1.2)蛋白A或蛋白G溶液的配制：将蛋白A或蛋白G溶液溶解于偶联缓冲液，然后加入到含有预处理过的金磁微粒的离心管中；
1.3)固定化反应：将离心管中的金磁微粒和蛋白A或蛋白G溶液摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min；
1.4)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的蛋白A或蛋白G；
1.5)封闭：取封闭剂加入金磁微粒溶液中摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应30min-2h，加清洗缓冲液洗去多余的封闭剂；
1.6)结合单抗分子：将单克隆抗体分子溶于偶联缓冲液中，加入固定好蛋白A或蛋白G且封闭清洗过的金磁微粒，摇匀，在20-40℃的条件下，充分反应5-30min；
1.7)清洗：将离心管置于磁性分离器上，磁性分离1-3min，弃上清，加入清洗缓冲液摇匀，磁性分离1-3min，弃上清，重复此步骤洗去未结合的单抗分子。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤4)后还包括有步骤5)细胞从磁粒上的解离：通过将磁性微粒-细胞复合物继续进行培养，培养后在机械压力下可使细胞与磁性微粒解离。
7.根据权利要求1或2或3或4或5所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述金磁微粒为核壳型超顺磁性复合微粒或组装型磁性复合微粒。
8.根据权利要求7所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：上述偶联缓冲液为pH7.0-9.0 5mM-1M的Tris-HCl缓冲液或pH5.0-8.0 0.5×-10×的磷酸盐缓冲液PBS或pH9.0-11.0 5mM-1M的碳酸盐缓冲液CBS或pH3.6-5.65mM-1M的醋酸盐缓冲液或pH3.0-7.0 5mM-1M的柠檬酸盐缓冲液或pH7.0-9.05mM-1M的TE缓冲液或pH7.0-9.0 5mM-1M的TBS缓冲液。
9.根据权利要求7所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述清洗缓冲液为偶联缓冲液或含0.02％-0.2％吐温的偶联缓冲液。
10.根据权利要求8所述的金磁微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述封闭剂为含有1-10％的牛血清白蛋白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清或山羊血清中的一种或多种成分的偶联缓冲液。
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| 崔亚丽等.组装型金磁微粒的制备及其在免疫学检测中的应用.中国科学B辑化学36 2.2006,36(2),摘要、正文160页左栏第2段-161页右栏第1段、附图8-9. * |
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