CN103773852B - 一种用于检测液体中游离miRNA的试剂盒及其操作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测液体中游离miRNA的试剂盒及其操作方法，包括A液和B液，A液和B液均是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，A液中包含羧基化磁珠，B液中包含羧基化微球，它们均通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA一半互补序列的单链DNA链接在磁珠或微球上。与传统光波导生物传感器比较，本案所涉及的试剂盒能够实现重复利用；本发明采用的方法，能够在溶液中快速检测出游离的miRNA，过程更简单，效率更高，并且能够高通量的检测样品；通过连接微球，能够显著改变光波导免疫传感器中谐振腔的折射率，提高检测灵敏度。

Description

一种用于检测液体中游离miRNA的试剂盒及其操作方法
技术领域
本发明涉及医学体外检测领域，特别涉及一种用于检测液体中游离miRNA的试剂盒及其操作方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有4361个miRNA分子。由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难，多数研究人员采用Northern B10ts--一种技术复杂而费力的方法来检测小分子RNA的存在。传统的Northern Blot的方法是是用探针检测固相支持物(膜)上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，近来又发展了一种基于核酶保护分析方法改进的新方法——将同位素标记好的小分子RNA探针和待检测样品混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的RNA分子，最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。上述方法都存在技术复杂、费用高昂的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测液体中游离miRNA的试剂盒及其操作方法，这种试剂盒与配套的光波导免疫传感器(CN101846674B)配合使用，能够高速、高灵敏度的检测出液体中游离的miRNA分子。同时，该试剂盒还能够回收重复利用，大大降低了检测成本。
本发明提供一种用于检测液体中游离miRNA的试剂盒，包括A液和B液，其中：
所述A液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，所述A液中还包含直径为90～150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA一半互补序列的单链DNA链接在磁珠上；
所述B液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，所述B液中还包含直径为90～150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA另一半互补序列的单链DNA链接在微球上。
优选地，所述的用于检测液体中游离miRNA的试剂盒，所述A液和B液中，Tri s缓冲液的pH均为7.3。
本发明还提供一种用于检测液体中游离miRNA的试剂盒的操作方法，包括以下步骤：
1)将光波导免疫传感器开启，先通入A液，所述A液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，所述A液中还包含直径为90～150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA一半互补序列的单链DNA链接在磁珠上；在光波导免疫传感器的电磁场作用下，所述羧基化的磁珠被吸附在光波导免疫传感器的谐振腔外，产生基底光波导信号；
2)随后将待测样品与B液等体积混合得到混合液，所述B液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，所述B液中还包含直径为90～150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA另一半互补序列的单链DNA链接在微球上；将所述混合液通入光学通道，此时步骤1)中吸附在谐振腔外的磁珠与混合液中的微球通过待测样品中游离的miRNA结合在一起，以此改变谐振腔的折射率，使谐振腔内的光波导信号发生变化；
3)配制至少四个含不同浓度的游离miRNA标准液，每个标准液按步骤1)和2)的操作方法得到两个光波导信号值，以miRNA浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；
4)将步骤1)和2)所得待测样品的两次光波导信号值差值与所述标准曲线比对，定量检测出待测样品中游离miRNA的存在及其浓度。
优选地，所述的用于检测液体中游离miRNA的试剂盒的操作方法，所述A液和B液中，Tris缓冲液的pH均为7.3。
本发明的有益效果是：与传统光波导生物传感器比较，本发明采用的方法能够实现试剂盒的重复利用；与传统miRNA检测方法相比，本发明采用的方法，能够在溶液中快速检测出游离的miRNA，过程更简单，效率更高，并且能够高通量的检测样品；通过连接微球，能够显著改变光波导免疫传感器中谐振腔的折射率，提高检测灵敏度；在检测结束后撤去电磁场，流动液可带出通道内的磁珠与微球，通过吸附、离心等技术手段，能够实现试剂盒主要成分的回收再利用。
附图说明
图1为本发明所述用于检测液体中游离miRNA的试剂盒的工作原理示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
作为本发明的一个较优实施方案，其所涉及的用于检测液体中游离miRNA的试剂盒，包括A液和B液，其中：
A液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，该A液中还包含直径为90～150nm的羧基化的磁珠；羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA一一半互补序列的单链DNA链接在磁珠上；Tris缓冲液的pH为7.3。
B液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，该B液中还包含直径为90～150nm的羧基化的微球，该微球不带磁性；羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA另一半互补序列的单链DNA链接在微球上；Tris缓冲液的pH为7.3。
A液和B液中氯化钠的作用是稳定双螺旋结构，增强核酸的热稳定性。
本发明所涉及的用于检测液体中游离miRNA的试剂盒的操作方法，包括以下步骤：
1)将与该试剂盒相配套的光波导免疫传感器(CN101846674B)开启，先通入A液，该A液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，A液中还包含直径为90～150nm的羧基化的磁珠；羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA一半互补序列的单链DNA链接在磁珠上；Tris缓冲液的pH为7.3；在光波导免疫传感器的电磁场作用下，羧基化的磁珠被吸附在光波导免疫传感器的谐振腔外，产生基底光波导信号；
2)随后将待测样品与B液等体积混合得到混合液，B液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，该B液中还包含直径为90～150nm的羧基化的微球；羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA另一半互补序列的单链DNA链接在微球上；Tris缓冲液的pH为7.3；将混合液通入光学通道，此时步骤1)中吸附在谐振腔外的磁珠与混合液中的微球通过待测样品中游离的miRNA结合在一起，以此改变谐振腔的折射率，使谐振腔内的光波导信号发生变化；
3)配制至少四个含不同浓度的游离miRNA标准液，每个标准液按步骤1)和2)的操作方法得到两个光波导信号值，以miRNA浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；
4)将步骤1)和2)所得待测样品的两次光波导信号值差值与所述标准曲线比对，定量检测出待测样品中游离miRNA的存在及其浓度。
实施例1
(1)试剂盒A液及B液配制
分别制备直径为90nm的羧基化磁珠和90nm的羧基化微球，分别在其上偶联miR-141的配对DNA半序列5’-GCCAACCCAGTGUUTATTGTGACATTGTGACAGA及5’-CUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACCCATTTCTACC。
具体的来说，上述DNA半序列均进行末端氨基修饰，单链DNA与磁珠和微球的偶联通过EDC-NHS法，即碳化二亚胺法。A液包含直径为90nm的羧基化磁珠及其偶联的半序列5’-GCCAACCCAGTGUUTATTGTGACATTGTGACAGA；B液包含直径为90nm的羧基化微球及其偶联的半序列5’-CUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACCCATTTCTACC，上述磁珠和微球均分别悬浮在A液和B液中，A液和B液均为0.1M的Tris缓冲液，pH为7.3，同时含有0.1M的NaCl。
(2)试剂盒应用
光波导免疫传感器开启后，先使用A液通入，在电磁场作用下，磁珠被吸附在谐振腔外，产生基底光波导信号。之后将待测样品与B液等体积混合，并通过光学通道。此时分别连有目标RNA一半互补序列的磁珠与微球，通过目标RNA，吸附后的磁珠与溶液中的微球能够结合在一起，以此改变谐振腔的折射率，从而使谐振腔内的光波导信号产生变化。
配制四个含不同浓度的miR-141标准液，每个标准液按上述的操作方法得到两个光波导信号值，以miR-141的浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；将待测样品的两次光波导信号值差值与标准曲线比对，能够快速、高灵敏度地定量检测出待测样品中游离miR-141的存在及浓度。
实施例2
(1)试剂盒A液及B液配制
分别制备直径为150nm的羧基化磁珠和150nm的羧基化微球，分别在其上偶联miR-199的配对DNA半序列5’-GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGATTATGACAGA及5’-CUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACCCATTTTGGCA。
具体的，上述DNA半序列均进行末端氨基修饰，单链DNA与微球的偶联通过EDC-NHS法。A液包含直径为150nm的羧基化磁珠及其偶联的半序列5’-GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGATTATGACAGA；B液包含直径150nm的羧基化微球及其偶联的半序列5’-CUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACCCATTTTGGCA，上述磁珠和微球均分别悬浮在A液和B液中，A液和B液均为0.1M的Tris缓冲液，pH为7.3，同时含有0.1M的NaCl。
(2)试剂盒应用
光波导免疫传感器开启后，先使用A液通入，在电磁场作用下，磁珠被吸附在谐振腔外，产生基底光波导信号。之后将待测样品与B液等体积混合，并通过光学通道。此时分别连有目标RNA一半互补序列的磁珠与微球，通过目标RNA，吸附后的磁珠与溶液中的微球能够结合在一起，以此改变谐振腔的折射率，从而使谐振腔内的光波导信号产生变化。
配制六个含不同浓度的miR-199标准液，每个标准液按上述的操作方法得到两个光波导信号值，以miR-199的浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；将待测样品的两次光波导信号值差值与标准曲线比对，能够快速、高灵敏度地定量检测出待测样品中游离miR-199的存在及浓度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (3)

1.一种用于检测液体中游离miRNA的试剂盒，其特征在于，包括A液和B液，其中：
所述A液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，所述A液中还包含20～200nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA一半互补序列的单链DNA链接在磁珠上；
所述B液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，所述B液中还包含20～200nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA另一半互补序列的单链DNA链接在微球上；
所述A液和B液中，Tris缓冲液的pH均为7.3。
2.一种用于非疾病诊断目的的检测液体中游离miRNA的试剂盒的操作方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将光波导免疫传感器开启，先通入A液，所述A液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，所述A液中还包含20～200nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA一半互补序列的单链DNA链接在磁珠上；在光波导免疫传感器的电磁场作用下，所述羧基化的磁珠被吸附在光波导免疫传感器的谐振腔外，产生基底光波导信号；
2)随后将待测样品与B液等体积混合得到混合液，所述B液是包含0.1M氯化钠的0.1M Tris缓冲液，所述B液中还包含20～200nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通过碳化二亚胺法将末端氨基修饰的含有目标miRNA另一半互补序列的单链DNA链接在微球上；将所述混合液通入光学通道，此时步骤1)中吸附在谐振腔外的磁珠与混合液中的微球通过待测样品中游离的miRNA结合在一起，以此改变谐振腔的折射率，使谐振腔内的光波导信号发生变化；
3)配制至少四个含不同浓度的游离miRNA标准液，每个标准液按步骤1)和2)的操作方法得到两个光波导信号值，以miRNA浓度为横坐标，两次光波导信号值差值为纵坐标，绘制标准曲线；
4)将步骤1)和2)所得待测样品的两次光波导信号值差值与所述标准曲线比对，定量检测出待测样品中游离miRNA的存在及其浓度。
3.根据权利要求2所述的用于非疾病诊断目的的检测液体中游离miRNA的试剂盒的操作方法，其特征在于，所述A液和B液中，Tris缓冲液的pH均为7.3。
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