CN116261483A - 多模式金属亲和加工衣壳 - Google Patents

Abstract

一种在缓冲混合物中将完整的腺相关病毒(AAV)从空AAV衣壳中分离的方法，所述缓冲混合物包括完整AAV衣壳和空AAV衣壳，包括步骤：‑将缓冲混合物与第一基质接触，所述第一基质带有连接到第一基质的金属亲和配体，所述金属亲和配体具有通过三个或更多氮原子使金属离子络合的能力，‑在与金属亲和配体结合的多价阳离子存在的情况下，通过pH梯度、盐梯度、金属离子梯度或其组合洗脱，将空AAV衣壳从完整AAV衣壳分离，以获得纯化的完整AAV衣壳馏分。为了去除混合物或纯化的AAV衣壳馏分中的污染DNA，在与金属亲和配体结合的多价阳离子存在的情况下，本发明的方法可以与缓冲混合物或纯化的完整AAV衣壳馏分与第二基质的接触相结合，所述第二基质带有连接到第二基质的金属亲和配体，所述金属亲和配体包含两个或更多个带负电荷的羧酸残基。

Description

多模式金属亲和加工衣壳

本发明涉及一种改进的方法，用于从空AAV衣壳和污染的DNA中分离完整的AAV衣壳。

背景

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)已成为基因治疗领域中DNA质粒包装和递送的热门候选者。这导致了评估或开发许多材料和方法来纯化它们。亲和色谱法因操作简单而广受欢迎。最常见的是，将生物配体(例如源自抗体的配体)固定在固相色谱表面上，将其暴露于含有所需AAV和污染物的原始样品中。原则上，AAV结合，污染物不结合。未结合的污染物被洗去。通过化学方法干扰配体和AAV之间的相互作用来回收AAV。

在许多情况下，固定化金属亲和色谱(IMAC)已被认为是生物亲和层析的有效替代物[1,2]。已知的实践是将多组氨酸尾巴(His-标签)遗传编码到蛋白质上，以便它可以被固定在亚氨基二乙酸(IDA)配体或次氮基三乙酸(NTA)配体上的镍离子捕获。这种His-标签通常包含6个或更多线性序列的组氨酰残基。His-标签的AAV的IMAC纯化是已知的[3,4]。用于捕获非His-标签的AAV的IMAC技术被认为没有实际应用[3,4]，因为这就不需要将His-标签编码到AAV上。利用IMAC纯化核酸是已知的[5,6]。

目前还没有IMAC纯化的His-标签产品获得国际监管机构的许可，这可能反映了一个事实，即最常被推荐用于捕获his-标签蛋白的镍离子是致癌的。很难实现并且更难证明镍从最终产品中被完全去除，因为它们与标签结合得非常紧密，并且可能与蛋白质上的其他位点结合。有毒金属也增加了危险废物处理的成本，这是从事IMAC-镍柱的人员所关注的问题。即使在饱和的氯化钠或盐酸胍水平下，像镍这样的重金属离子也能与蛋白质结合。螯合剂可能会降低它们的水平，但螯合剂会影响AAV衣壳的稳定性，因为衣壳需要镁和/或钙离子来维持其结构的完整性。

亲和色谱法(包括生物亲和色谱法和IMAC)的另一个局限性是亲和色谱不能完全满足AAV的纯化需求。它不加区分地捕获衣壳碎片、有缺陷的衣壳、空白的衣壳，以及包含预期内部载荷的治疗性质粒DNA的所需完整衣壳。所述术语“空衣壳”是指不包含旨在递送至患者的基因治疗DNA质粒的AAV衣壳。所述术语“衣壳碎片”和“有缺陷的衣壳”指的是由于不正确的组装或损坏而导致的不完整或无功能的衣壳。

亲和色谱法的另一个局限性是，它不能将污染的DNA去除到足够低的水平，以确保患者安全和符合监管机构的要求。污染的DNA可能是以宿主细胞衍生DNA的形式存在，也可能是衣壳外的质粒DNA。AAV已显示出一种倾向，将这种DNA结合到其外部衣壳表面，导致其通过亲和方法进行共纯化。这种衣壳外表上非特异性结合的DNA也会干扰后续去除空衣壳的方法。

使用强阴离子交换剂来减少空衣壳和污染的DNA的含量是已知的[7-9]。空衣壳去除对一些AAV血清型是有效的，对许多血清型部分有效，以及其他血清型几乎没有效用。已证明弱阴离子交换剂对于从完整衣壳中分离空AAV衣壳是无效的。

所述术语“强阴离子交换剂”指的是阴离子交换配体，其在pH值约为2到pH值13的范围内维持一致的电荷。它们通常以季胺的形式存在，商业名称如Q、QA、QAE、QAM、TEAE、TMAM或TMAE，分别指季铵、季氨基、季氨基乙基、季氨基甲基、三乙基氨基乙基、三甲基氨基甲基或三甲基氨基甲基。

所述术语“弱阴离子交换剂”指的是在高pH值下失去电荷的阴离子交换配体。它们通常以叔胺的形式存在，其中最常见的是DEAE(二乙基氨基乙基)。DEAE对于衣壳分离没有显著的作用，因为这种分离通过需要接近pH 9或以上的碱性pH值，而此时DEAE已经失去了大部分电荷。即使在很大程度上，它可能能够从不需要的衣壳中分离出所需的衣壳，但在必要的pH值范围内，它的电荷损失也会降低其容量，以至于分离对制造没有实际价值。这在强阴离子交换剂性能优越的情况下尤其如此。

已知阳离子交换色谱法只能实现很少或根本无法实现空衣壳与所需的完整衣壳的实际分离。在某种程度上，它所提供的任何分离，不如强阴离子交换剂提供的分离。

硼酸盐有时被称为合成凝集素，因为它们能够与多种碳水化合物和糖基化化合物上的某些羟基构成共价络合物。具有顺式二醇的硼酸盐络合物赋予络合物一个负电荷[10]。硼酸盐还可以改变金属螯合位点的金属离子选择性[11]。

发明概要

已开发出一种使用固定化金属亲和色谱(IMAC)配体的方法，所述配体具有捕获AAV的惊人能力，而AAV缺乏His-标签或其他促进与固定化金属离子结合的基因修饰。它需要使用阳离子金属亲和配体。它不需要使用有毒的重金属。它对人体生理学所必需的多价阳离子物种有效。

所述方法提供了进一步令人惊讶的能力，从完整的衣壳中分离空衣壳，并比已知的方法更有效地减少DNA污染。本发明基本方法的能力是通过与进一步降低空衣壳和/或DNA含量的方法相结合而复合，例如通过与阴离子交换色谱法、密度梯度离心法或其他技术相结合。

在一方面，本发明涉及一种在包含完整的AAV衣壳和空AAV衣壳子的缓冲混合物中从空AAV衣壳中分离完整腺相关病毒(AAV)衣壳的方法，包括以下步骤：

-将所述缓冲混合物与第一基质(substrate)接触，所述第一基质带有连接到第一基质的金属亲和配体，所述的金属亲和配体具有通过三个或更多个氮原子络合金属离子的能力；

-在与金属亲和配体结合的多价阳离子存在的情况下，通过使用pH浓度、盐浓度、金属离子梯度或其组合洗脱，将空AAV衣壳从完整AAV衣壳分离出来，以获得纯化的完整的AAV衣壳馏分(fraction)。接下来，为了简单起见，所表述的“具有通过三个或更多个氮原子络合金属离子的能力的金属亲和配体”也指的是“阳离子配体-金属固相”。

在本发明所述方法的一个实施方案中，在缓冲混合物与所述第一基质接触之前、所述缓冲混合物与所述第一基质接触期间和/或洗脱期间，所述第一基质负载有多价阳离子。在本发明所述方法的另一个实施方案中，可以用具有碱性pH的缓冲液平衡所述的固相基质。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，所述第一基质的金属亲和配体选自下组：二乙基三胺、三乙基四胺、四乙基五胺、聚酰胺胺(polyamidoamine)、聚三乙胺、去铁敏、N,N-双(2-氨基乙基)-1,2-乙二胺和三(2-氨基乙基)胺(TREN)。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，洗脱过程中存在的所述多价金属阳离子可选自下组：铁(III)、锰(II)、铜(II)、锌(II)、钴(II)、镁(II)、钙(II)、钡(II)、镍(II)及其组合。特别地，可以使用铜(II)、镁(II)、钙(II)、或其组合。在本发明所述方法的一个实施例中，金属亲和配体在洗脱之前可以用一种多价阳离子带电荷，可以通过增加第二种多价阳离子的浓度来洗脱AAV衣壳。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，通过应用提高多价金属阳离子的浓度来进行洗脱梯度。所述梯度终点处的多价阳离子的浓度可以在0.1mM至200mM、或1mM至100mM、或2mM至50mM、或5mM至25mM的范围内。在一些实施方案中，所述的多价离子的种类可以是镁、钙、或钡、或铜、或其混合物。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，用于通过洗脱完整的AAV衣壳和空AAV衣壳进行分离的梯度缓冲液，其中的盐浓度可以在高达500mM的范围内。通常，通过在1mM至500mM、2mM至250mM、3mM至125mM、5mM至60mM或7mM至30mM的范围内增加盐的浓度来进行洗脱。

任何特定的AAV血清型的盐浓度范围都需要通过实验来确定，因为每种血清型具有不同的表面化学特征。这种现象在离子交换色谱法领域是众所周知的，其中一些血清型的结合比其他血清型更紧密，且需要更多的盐才能去除。洗脱所需的盐量也取决于pH，但阳离子金属亲和基质与强阴离子交换剂的pH依赖性模式不同。随着pH值的增加，在强阴离子交换剂上的结合变得更强。在TREN的最强结合发生在大约中性pH值时，并且在较高和较低pH值时变得较弱。这意味着在pH 7时比在pH 6或pH 9时需要更多的盐进行洗脱。在pH 7时，至少500mM NaCl的梯度终点是合适的。在pH 9时，小于250mM NaCl的梯度终点就足够了，在在pH 6时也是如此。所述盐的浓度也会随着与阳离子金属亲和基质结合的金属离子的选择而变化。当铜与阳离子金属亲和基质结合时，洗脱衣壳所需的盐浓度通常比大多数其他金属低约3倍。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，用于分离完整AAV衣壳和空AAV衣壳的梯度缓冲液的pH值可以在pH 6.0至pH 10、pH 7.0至pH 9.75、或pH 8.0至pH 9.5、或pH 8.5至pH 9.5、或pH 9.0至pH 9.5、或pH 8.75至pH 9.25、或pH 8.9至pH 9.1、或pH 8.95至pH9.05、或pH 8.75至pH 9.25的范围内。在pH梯度洗脱过程中，由于盐的存在，洗脱pH值会下移。原则上，盐的浓度越高，衣壳洗脱时的pH值降低得越多。本领域技术人员应理解，所述规则的例外是有可能的。通常，如果盐浓度为25mM，衣壳会比在盐浓度浓度为10mM时更早洗脱，依次类推。盐浓度可以在pH梯度洗脱过程中保持恒定，或也可以独立变化。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，可以通过将DNA与第一和/或第二基质结合，去除缓冲混合物或纯化的完整AAV衣壳馏分中存在的污染的DNA。已经开发了本发明所述方法的变体，其利用了令人惊奇的进一步发现，即在一些实施方案中，以阳离子配体-金属固相作为第一基质分离衣壳的相同条件下，AAV衣壳无法结合到带有连接到第二基质的金属亲和配体的第二基质，但DNA结合，其中所述金属亲和配体包含两个或更多个带负电荷的羧酸残基。为了简单起见，所述术语“带有连接到第二基质的金属亲和配体的第二基质，其中所述金属亲和配体包含两个或更多个带负电荷的羧酸残基”也被称为“阴离子配体金属固相”。

将阳离子金属亲和配体的步骤与在阴离子金属亲和配体上进行的步骤相结合，可以更大程度地减少DNA污染。如果在用第一基质处理之前应用，则第二基质处理可以增加第一基质的衣壳结合能力。

在结合到金属亲和配体的多价阳离子存在下，将缓冲混合物或纯化的完整的AAV衣壳馏分与第二基质进行接触，所述第二基质带有连接到第二基质的金属亲和配体，所述的金属亲和配体含有两个或更多个带负电的羧酸残基。还可以同时用第一基质(阳离子配体金属固相)和第二基质(阴离子配体金属固相)处理缓冲混合物。

因此，在第二方面，本发明涉及其中所述的缓冲混合物可以通过使缓冲混合物与第二基质接触来预处理，所述的第二基质带有负载有金属的阴离子金属亲和配体，从而完整的AAV衣壳不被第二基质结合。

在一些实施方案中，所述第一基质平衡的条件可以不同于第二基质平衡的条件。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，缓冲混合物中存在的污染的DNA可通过将其结合到第二基质而去除。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，所述阴离子金属亲和配体可选自下组：氨基二羧酸或氨基三羧酸。

在本发明所述方法的又一个实施方案中，所述的氨基二羧酸可以是亚氨基二乙酸(IDA)。

在本发明所述方法另一个实施方案中，所述的氨基三羧酸是次氮基三乙酸(NTA)。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，所述第二基质用pH 6.0至pH 10.0、或pH7.0至pH 9.5、或pH 8.0至pH 9.25、或pH 8.5至pH 9.0、或pH 8.75至pH 9.25、或pH 8.9至pH 9.1或pH 8.95至pH 9.05，特别是pH 8.75至pH 9.25范围内的缓冲液进行平衡。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，所述用于防止完整AAV衣壳与第二基质结合的缓冲液的盐浓度在高达1M、或0.1mM至1.0M、或1mM至500mM、或2mM至250mM、或5mM至250、或3mM至125mM、或10mM至125mM、或5mM至60mM、或20至62mM、或7mM至30mM的范围内。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，用于平衡第一基质的缓冲液和/或用于将空AAV从完整AAV分离的缓冲液包含具有至少两个正电荷的金属离子，较佳地选自下组：钙、镁、铜(二价铜)、铁(三价铁)、锰、锌、钡、镍、钴、及其组合。

在本发明所述方法的另一个实施方案中，所述用于平衡所述第一基质的缓冲液使用了与用于洗脱所述衣壳的金属阳离子不同种类的多价金属阳离子。

可以通过将一个或两个步骤置于完整的多步纯化过程的背景下来提高阳离子金属亲和步骤及其与阴离子金属亲和步骤的组合的整体有效性。

在一个非限制性示例中，本发明所述方法可以按如下方式实施：

-将表面带有阳离子金属螯合配体N,N-双(2-氨基乙基)-1,2-乙二胺的色谱固相暴露于金属阳离子溶液中，使配体带上金属阳离子，然后洗去过量金属阳离子，留下带有配体：金属络合物的固相表面。

-阳离子金属配体固相用含有过量同种金属离子的缓冲液平衡至pH值约为9。这是IMAC领域的独特之处，体现在两个方面。已知的方法是专门从运行缓冲液中去除金属离子，因为金属离子的存在预计会与固定化的金属离子竞争靶标上的结合位点。这也会导致洗脱产物含有过量的金属离子，这种IMAC的许多示例中是有毒的。所述的起作用的9.0的pH值也是独一无二的。通常在接近中性的pH值下将样本上样到IMAC柱上。这是唯一已知的IMAC方法，在任何加工阶段都采用强碱性pH条件。

-将包含空衣壳、完整衣壳和污染的DNA的一些组合的样本平衡到与阳离子-配体固相大致相同的条件下。

-将所述样品负载到阳离子金属-配体固相上。AAV衣壳被保留，未结合的污染物不被保留，并将其从阳离子金属-配体固相中洗去。

-通过增加非螯合盐梯度的浓度，同时将pH值维持在大约9，将空的和完整的AAV衣壳彼此分离。这是IMAC领域的另一个独特特征，因为在固定pH下增加了非螯合盐的浓度并没有从固定化金属中洗脱蛋白质。在特定应用中，似乎固定化金属离子介导了对空衣壳的选择性弱吸引力，从而促进了空衣壳与完整衣壳的分离，而固定化金属也为DNA提供了高亲和力的结合位点。

所述方法作为已知的唯一一种可以从任何IMAC配体上实现任何含蛋白质种类与任何固定化金属种类的差异分离的IMAC方法，也是独一无二的。迄今为止，IMAC领域的特点是蛋白质要么结合，要么不结合。结合的蛋白质通过中止它们与固定化金属的相互作用的单个步骤被洗脱。在定义本领域的文献中没有发现实现密切相关的含蛋白质种类的差异洗脱的先例。

在另一个非限制性示例中，本发明所述的方法可以按如下方式实施：

-将表面带有阴离子金属螯合配体亚氨基二乙酸的色谱固相暴露于金属阳离子溶液中，使配体带上金属阳离子，然后洗去过量金属阳离子，留下带有配体：金属络合物的固相表面。

-阴离子金属配体固相用含有过量同种金属离子的缓冲液平衡至pH值约为9。

-将包含空衣壳、完整衣壳和污染的DNA的一些组合的样本平衡到与阴离子-配体固相大致相同的条件下。

-将所述样品负载到阴离子金属-配体固相上。AAV衣壳流过。DNA被结合。

-冲洗柱以完全回收未结合的AAV衣壳，然后通过上述阳离子金属-配体固相方法将其分馏。

附图的简要说明

图1描述TREN在色谱固相上的不同固定构型。(A)显示了通过一个氨基与固相结合的配体。正电荷显示为加号(+，仅在(A)中显示。每个氨基的衍生化状态用符号表示，一级为1°，二级为2°，三级为3°。(B)显示了通过两个氨基与固相结合的配体。(C)显示了通过三个氨基与固相结合的配体。(D)显示了(A)单个氨基结合版本，其与金属离子配位键合。

图2描述了通过在260nm和280nm处各自的UV吸光度比率来识别空的和完整的AAV衣壳。符号4°指的是季胺(QA)阴离子交换剂。用氯化钠运行梯度试验。

图3描述了在空衣壳和完整衣壳分离过程中通过检测嵌入DNA的Picogreen的在线荧光监测器检测DNA。图2中的紫外色谱图以浅灰色显示以供参考。应注意地是，大部分DNA与空衣壳的外表有关。

图4描述了在pH 7.0下固定化TREN-镁上空AAV衣壳和完整AAV衣壳的分离。

图5描述了在pH 9.0下固定化TREN-镁上空衣壳和完整衣壳的分离。

图6描述了当用本发明的方法分离空衣壳和完整衣壳时污染DNA分布的比较，并与当在强阴离子交换剂上通过盐梯度分离空衣壳和完整衣壳时的污染DNA分布进行了比较。分别得到图4和图2的试验数据。在这两种情况下，完整的衣壳馏分都用“F”表示。所有其他馏分代表空衣壳或碎片。

图7描述了用氯化钠梯度洗脱的强阴离子交换剂上的阴离子交换色谱法对来自实施例2的TREN-Mg馏分的分析。

图8描述了使用不同洗脱方法通过不同色谱介质分离空衣壳和完整衣壳的比较结果。4°胺是指用盐洗脱的季胺阴离子交换剂。1°胺是指用递增的pH梯度洗脱的伯胺阴离子交换剂。TREN-Mg指的是如实施例2中所述的本发明的方法。

图9描述了通过无金属的TREN和含镁的TREN进行空-完整衣壳分离的比较。

图10描述了通过TREN-金属色谱法在pH 7.0下使用钙将完整衣壳从空衣壳和DNA分离出来。除了将乙酸钙换成乙酸镁之外，所有条件都与实施例2相同。

图11描述了通过在pH 7.0下使用三价铁的TREN-金属色谱法将完整衣壳从空衣壳和DNA分离出来。除了将氯化铁换成乙酸镁之外，所有条件都与实施例2相同。

图12描述了在pH 9.0下在TREN-铜上的阳离子交换纯化的衣壳的分馏。

图13描述了TREN-Cu在pH 9.0与TREN-Mg在pH 9.0的洗脱曲线的比较。

图14描述了在pH 9下将阳离子交换纯化的AAV衣壳应用于负载镁的阴离子金属亲和配体(IDA)。

图15描述了在TREN-Mg上制备的样品的初始捕获。完整的色谱图。

图16描述了在TREN-Mg上制备的样品的初始捕获。衣壳洗脱和清洁步骤的区域如图15所示。

图17描述了来自图16的AAV完整衣壳部分的阴离子交换抛光。

图18描述了被两种不同捕获柱捕获后阴离子交换抛光曲线的比较。在这两种情况下，样品均按实施例6中所述进行制备。左侧曲线：通过已知的阳离子交换色谱方法捕获后的阴离子交换抛光曲线。右侧曲线：通过本发明所述方法捕获后的阴离子交换抛光曲线，来自图17的放大图像。

图19描述了TREN-Mg捕获(图15,16)后，通过用pH梯度洗脱的伯胺阴离子交换剂(左图)与用盐梯度洗脱的季胺阴离子交换剂(右图)的空衣壳减少的比较。

图20描述了在pH 9下，使用和不使用负载镁的固定化亚氨基二乙酸提取宿主细胞DNA时，使用TREN-Mg分离AAV的比较。

图21描述了AAV衣壳在pH 9下流过载有镁的IDA整体材料。

图22描述了在使用负载镁的亚氨基二乙酸整体材料进行先前的DNA提取步骤后，通过负载镁TREN柱对空AAV衣壳和完整AAV衣壳进行优化分离。在TREN柱上负载衣壳后，用10mM氯化镁洗涤液置换空衣壳。用氯化钠梯度洗脱完整的衣壳。

图23描述了在用镁梯度洗脱的载有三价铁的TREN整体材料上分离空AAV衣壳和完整AAV衣壳同时提取DNA。

图24描述了在负载有三价铁的TREN整体材料上同时提取DNA并分离空的和完整的AAV衣壳，用镁梯度洗脱的不含金属的硼酸三酯缓冲液平衡。

图25描述了图24的放大图像，显示了在负载有三价铁的TREN整体材料上同时提取DNA并分离空的和完整的AAV衣壳，并用不含金属的硼酸三酯缓冲液平衡，用镁梯度洗脱。

图26描述了图24中NaCl峰值的内容物的氯化铯密度梯度分馏。

图27描述了在季胺阴离子交换整体材料上空AAV衣壳和完整AAV衣壳的分离，用不含金属的硼酸三酯缓冲液平衡，用镁梯度洗脱。

图28描述了来自图27中洗脱梯度的放大图像。

图29描述了图24所示的TREN-Fe3整体材料和图27所示的季胺整料的洗脱梯度的叠加图像。

发明详述

用于实施本发明基本形式的阳离子金属亲和配体是来自氨基衍生物家族的一种，其带有至少一个独立于它可能与之结合或将要结合的任何金属阳离子的正电荷。一个或多个带正电的氨基残基可由一个或多个伯氨基残基、仲氨基残基、叔氨基残基、季氨基残基、酰亚胺或亚胺组成。阳离子氨基残基可以包括任何组合或构象的前述残基的任何组合。至少一个阳离子氨基残基必须在pH 9.0时保持正电荷。只要存在至少一种带正电的氨基衍生物，所述配体也可以包括不带电的酰胺氮残基。满足这些要求的阳离子氨基配体的示例包括二乙基三胺、三乙基四胺、四乙基五胺、聚三乙胺、聚酰胺胺、去铁敏(deferoxamine)，也称为去铁胺(deferox)或得斯芬(desferal)；以及N,N-双(2-氨基乙基)-1,2-乙二胺，也称为2,2',2”-次氮基三乙胺、或2,2',2”-三氨基三乙胺、或三(2-氨基乙基))胺、或TAEA、或TREN。

任一的上述阳离子金属亲和配体可以通过它们的一个或多个氨基直接共价键合到固相色谱表面。它们可以通过线性或分支聚合物间接连接到固相表面，所述线性或分支聚合物使配体更容易接近或产生多价线性触手状的、分支的或树枝状构型。所述术语树状聚体是指树形分支模式，其中分支与其他分支分叉以产生深层分支网络，每个分支末端带有配体。已知的示例包括三乙胺末端树枝状聚合物(聚三乙胺，pTEA)和聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物，它们可从全球供应商处购买。相同的方法可以应用于阴离子金属亲和配体。

在一种实施方案中，所述阳离子金属亲和配体是TREN。所述的未固定的配体包括3个伯胺残基，其从中心叔胺通过乙基分支。将配体固定在色谱固相上可产生以下构型中的任何一种或任何组合：一个伯氨基残基与固相的连接，将该残基转化为仲氨基，与叔氨基残基的乙基连接，与另两个乙基连接导致末端伯氨基残基；将两个伯氨基残基连接到固相，将这些残基转化为仲氨基，每个仲氨基与乙基连接产生叔氨基残基，与另一个乙基连接产生伯氨基；以及三个伯氨基与固相的连接，每个通过一个乙基与中心的叔氨基残基相连(图1)。

熟悉本领域的人员将认识到，伯氨基、仲氨基和叔氨基根据其各自的pKa值，在不同程度上都是弱阴离子交换基团。在商业文献中，在高达约pH 9时，TREN表现为保持正电荷。在这一领域普遍认为缺乏将空衣壳从完整衣壳分离的实用方法中，这强调了TREN意想不到的效用，因为弱阴离子交换剂DEAE在高达约pH 9时也保持正电荷。它还强调了TREN的行为通常不同于通常已知的弱阴离子交换剂。这表明，在结合多价金属阳离子的构型中，多氨基配体结合与弱阴离子交换基团的组合有助于使本发明的方法实现其独特结果的显著特征。

带有TREN的色谱固相可从商业供应商处获得，即<https://www.bio-works.com/product/iex-resin/workbeads-tren>。许多其他全球色谱介质供应商生产和销售阴离子交换剂，证明合成适用于实施本发明方法的色谱产品的技术是广泛可用的。

实施本发明化合物形式的阴离子金属亲和配体是一种来自缺乏正电荷的氨基二羧酸家族的配体，例如亚氨基二乙酸(IDA)或缺乏正电荷的氨基三羧酸，如次氮基三乙酸(NTA)。

带有阴离子金属亲和配体的色谱固相，如IDA和NTA，可从全球所有主要商业色谱供应商处广泛获得。

本发明所述的方法可以用多种多价金属离子中的任何一种或任何组合来实施，包括钡、钙、铁、镁、锰、铜和/或锌。此列表偏向于无毒金属。有毒重金属可能会提供积极的结果，但由于要证明从最终产品中去除有毒重金属需要额外的工作，因此不鼓励使用它们。一般来说，具有已知的人类营养、治疗或一般健康价值的金属通常应该受到青睐，其中，最受青睐的种类是提供最佳空衣壳和完整衣壳分离和/或任意AAV血清型中DNA减少最多的种类。

在一些实施方案中，用于平衡色谱柱和用于进行洗脱的缓冲液也可以含有金属离子。在一些这样的实施方案中，金属离子的种类将与固相配体所带电的种类相同。在一些实施方案中，此类缓冲液可用于使固相配体具有金属电荷，而不是执行先前的步骤以使配体具有金属电荷。在一些实施方案中，平衡缓冲液和梯度缓冲液中的金属离子种类可以彼此不同。

在一些实施方案中，在样品与所述阳离子金属亲和基质接触之前，所述阳离子金属亲和配体可以用多价金属阳离子带电。在其他实施方案中，所述阳离子金属亲和配体可以通过样品中过量的多价金属阳离子而使其用多价金属阳离子带电。在其他实施方案中，在样品与所述阳离子金属亲和基质接触后，所述阳离子金属亲和配体可以使其用多价金属阳离子带电。在一个这样的实施方案中，在开始洗脱之前，所述阳离子金属亲和配体可以用洗涤缓冲液使其用多价金属阳离子带电。在密切相关的实施方案中，所述阳离子金属亲和基质可以通过在梯度起始缓冲液中包含多价金属阳离子而使其带电。在另一个这样的实施方案中，所述阳离子金属亲和基质通过包含在梯度终点缓冲液中的多价金属阳离子而使其带电。

在各种实施方案中，可通过增加pH梯度、或通过增加盐梯度、或通过增加多价金属阳离子的梯度来洗脱完整衣壳。

在一些实施方案中，所述梯度起始缓冲液可含有多价金属阳离子，其浓度范围在0.0mM至10.0mM、或2.5mM至7.5mM、或4.0mM至6.0mM或更低、更高或中间范围。初步筛选可在约5mM处进行。根据该浓度下的结果，可以向上或向下调整金属含量，以获得最理想的结果。所述梯度起始缓冲液中的金属离子浓度可以与梯度终止缓冲液中的金属离子浓度相同。

在一些实施方案中，金属盐可用作洗脱剂，并且可能是优选的，因为它们改变了AAV衣壳的表面电荷性质并改善了空衣壳从完整衣壳的分离。多价金属与衣壳表面上的金属结合位点结合的每个事件都会中和衣壳上二羧基或三羧基金属结合位点的相等数量的负电荷。由于负电荷有助于与所述阳离子金属亲和配体的相互作用，因此这种金属结合会降低衣壳对配体的吸引力。这种机制与使用非金属盐的洗脱有根本的不同，因为非金属盐仅通过增加整体流动相的电导率来起作用。所述非金属盐离子创造了一个阻尼场，它可以抑制所有类型的离子相互作用，而不管电荷位于何处，它们中有多少是彼此靠近的，或者它们是正电荷还是负电荷。非金属盐的洗脱是非特异性场现象。这与金属盐的局部和特异性能力根本不同，其能中和与衣壳表面金属结合位点相关的氨基羧基残基的局部电荷。这解释了为什么金属盐能够以低于非金属盐的浓度洗脱衣壳。

在通过增加金属离子浓度进行洗脱的一些实施例中，所述梯度可以涵盖从0mM到200mM、或0mM到100mM、或0mM到50mM、或0mM到25mM，或1mM至25mM、或2mM至20mM、或5mM至15mM或更低、更高或中间范围的范围。可以使用0mM至25mM的梯度范围进行初始筛选。根据该浓度下的结果，可以向上或向下调整梯度起始缓冲液和梯度终止缓冲液的金属含量，以达到最理想的结果。

在一些实施方案中，所述金属亲和配体可以被动地用金属离子带电，这意味着在引入样品之前，所述固相可以在缓冲平衡期间，通过在平衡缓冲液中包含金属离子来负载金属，而不是有一个离散的金属带电步骤。本领域技术人员将认识到，所述术语“平衡缓冲液”代表通过色谱装置的缓冲液，其目的是创造特定的化学环境以实现色谱方法的预期用途。

在一些实施方案中，样品中包含的金属离子可以将不带电荷的阳离子金属亲和配体转化为其金属络合形式，用于实施本发明的方法。这可能是通过有意向样品中添加金属离子而发生的，也可能是由于无意中残留在细胞培养收获物、裂解物和部分纯化样品中的金属而无意中发生的。

对于熟悉开发纯化方法的人来说显而易见的是，所述金属种类的选择可能部分取决于，希望将本发明的方法置于整个多步纯化过程中的什么位置。实验数据表明，三价铁和锰对DNA和其他磷酸化污染物(包括内毒素)具有更高的亲和力。这表明，当所述方法用于抛光已经高度纯化的样品时，这些金属可能是有利的。当使用铁或锰从粗饲料流中捕获AAV时，提高对DNA的亲和力不太可能有利，因为高DNA含量可能会消耗过多的色谱柱总结合容量。在这种情况下，对DNA具有较低亲和力的金属，例如但不限于钙或镁，可能证明更有利。

在一些实施方案中，通过将用阳离子金属亲和基质进行的样品处理与用阴离子金属亲和基质进行的处理组合，可以提高DNA去除的效率。

在一些实施方案中，在阴离子金属亲和配体上使用强DNA结合金属，如铁和锰，并在阳离子金属亲和配体上使用AAV稳定金属，如钙和/或镁，可能是有利的。

涉及阳离子金属亲和配体的本发明的方法可以在pH 6.0至10.0、或pH 7.0至pH9.75、或pH 8.0至pH 9.5、或pH 8.5至pH 9.5、或pH 9.0至pH 9.5、或pH 8.75至pH 9.25、或pH 8.9至pH 9.1、或pH 8.95至pH 9.05、或更高、更低或中间范围的pH值范围内实施，优选在pH 8.75至pH 9.25的pH范围内。出于初始评估的目的，建议在pH值约为9.0时进行筛选，并进一步建议对较低和较高的值进行评估，以优化结果。

涉及阴离子金属亲和配体的本发明的方法可以在pH 6.0至10.0、或pH7.0至pH9.5、或pH 8.0至pH 9.25、或pH 8.5至pH 9.5、或pH 8.75至pH 9.25、或更窄、更宽或中间范围内实施。

在一些实施方案中，所述的整个方法在基本恒定的pH值下运行。在一个这样的实施中，将柱子和样品平衡到大约pH 9。然后，均在pH 9.0的条件下，用逐渐增加的盐梯度负载、洗涤和洗脱柱子。

在一些实施方案中，最初可以将用于实施适用于阳离子金属亲和配体的方法的柱子和样品平衡至较低的pH值，例如在pH 6.0至7.0的范围内，将样品负载到柱上并且洗涤色谱柱以去除未结合的污染物，然后将负载的色谱柱重新平衡至更高的pH值，为洗脱步骤做准备。这个过程产生了增加容量这一意想不到的好处，因为在pH 6.0时，AAV与阳离子配体-金属络合物的结合比在pH 7.0、或在pH 8.0、或在pH 9.0时更强。随着pH值的降低，容量增加，推测是由于氢键增加引起的，反映了潜在的质子化的增加。一旦样品被结合，可以将柱子重新平衡到任何所需的条件，以最大限度地分离空衣壳和完整衣壳。低pH样品结合对于去除DNA具有额外的效用，因为令人惊讶地发现，固相TREN-金属表面在酸性pH下比在中性或碱性pH下与DNA结合得更强。

在一些实施方案中，可以在碱性pH(如pH 9)下平衡阳离子金属亲和柱，但待负载的样品可能处于较低的pH下(如pH 7)。样品的较低pH值会导致在样品负载过程中，柱向低pH值的短暂重新平衡。实验数据表明，在较低的pH值(例如pH 7)下，AAV与TREN的结合更紧密，通常认为这可以增加结合容量。在样品负载阶段结束时，平衡缓冲液流量的恢复将克服样品负载的瞬时效应，并将柱重新平衡至pH 9。本领域有经验的人员将认识到，这将导致更流线型的工作流程，因为它不需要在负载样品之前，在pH 7下进行缓冲液平衡。

在一个实施方案中，负载有多价金属阳离子的阳离子金属亲和固相用Tris-硼酸缓冲液平衡至pH 9.2，其中使用Tris-硼酸缓冲液的特定目的是在低离子强度下提供强缓冲能力。在一个这样的实施方案中，所述缓冲液本身不含多价金属阳离子。在一个实施方案中，在大致生理条件下应用了包含空的和完整的AAV衣壳的样品，其中所述术语大致生理被理解为是指在约pH 6.5至pH 7.5范围内的pH值和约50mS/cm至大约200mS/cm范围内的电导率。所述样品可以包含但不需要包含额外的缓冲剂。将样品应用于柱子将使柱子的pH和电导率条件不平衡，之后恢复平衡缓冲液流将使柱子恢复到原始的平衡条件，为启动洗脱梯度做准备。在一个这样的实施方案中，所述柱子以线性梯度洗脱至多价金属阳离子。在一个这样的实施方案中，所述金属阳离子是镁。在一个这样的实施方案中，所述金属阳离子梯度之后可执行非金属盐(如氯化钠)的梯度或步骤。在另一个实施方案中，所述金属阳离子梯度之后可进行清洁剂(如NaOH)的步骤。在一些这样的实施方案中，NaOH可以伴有旨在增强其清洁能力的其他试剂，如氯化钠。在一些这样的实施方案中，所述清洁缓冲液可以包含1MNaOH和1-3M NaCl。

本领域技术人员将认识到，在较低pH值下更强的结合与基于已知蛋白质在阴离子交换剂上的行为的预期完全相反。阴离子交换剂上的蛋白质保留被认为随着pH值的降低而变弱。在较低的pH值下，更强的结合也不同于已知的金属亲和色谱介质的行为，因为通常使用低pH值来洗脱它们。这些发现强调了一点，尽管带有阳离子配体-金属络合物的色谱固相显示出可追溯到IMAC和阴离子交换的影响，但阳离子配体-金属络合物产生了不同于两者的净选择性。

在一些实施方案中，AAV在pH值低于9的情况下被捕获，所述阳离子金属亲和柱可以用增加的pH梯度而不是用盐梯度洗脱。在一个这样的实例中，在含有约15mM氯化钠的缓冲液中，将所述载有金属的柱平衡至pH约为6。样品条件应该大致相同。在用AAV衣壳负载柱子并洗涤以去除未结合的样品成分后，所述柱子以逐渐增加的pH梯度洗脱到pH约为9的缓冲液中，其中含有约100mM氯化钠，换句话说，在保持盐浓度不变的情况下，以逐渐增加的pH梯度洗脱。当盐浓度与pH平行增加时，也会发生联合pH洗脱。应当认识到，这种方法的许多变化是可能的，包括但不限于在增加pH的同时增加盐浓度，以及在增加pH的同时降低盐浓度，或者在一系列独立改变pH值的盐浓度的步骤中洗脱。还将认识到，这一特征进一步将本发明的方法与强阴离子交换剂上的阴离子交换色谱区分开来，在强阴离子交换剂上，pH值的增加导致AAV结合得更强。

在每个上述范围内，提供良好缓冲能力的缓冲化合物和/或缓冲化合物的组合是本领域已知的。已知能够在pH 9区域内提供缓冲能力的化合物包括甘氨酸(pKa 9.6)、精氨酸(pKa 9.1)、双三丙烷(pKa 9.0)和硼酸(pKa 9.15–9.25)。此类缓冲液在本领域中通常以20mM至50mM的浓度使用，尽管可以降低或增加浓度以满足特殊要求的需要。一般来说，阳离子缓冲液优选与使用阳离子表面的色谱结合使用，例如本发明所述方法指定的色谱固相。这有利于使用上述列表中的前3个种类。硼酸是阴离子；负电荷。将阴离子缓冲液与阳离子色谱表面一起使用的一个可能的局限性是缓冲液和表面之间的相互作用会从流动相中提取大部分缓冲液，从而使流动相的缓冲能力不足。然而，使用与色谱表面电荷相反的缓冲液有时也确实可以支持独特的选择性，从而有利于给定的分离。阴离子和阳离子缓冲物质的组合也是可能的，以及使用两性离子缓冲剂和两性离子缓冲剂与阳离子和/或阴离子缓冲剂的组合。pKa接近9的两性离子缓冲液包括3-([1,1-二甲基-2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(AMPSO，pKa 9.36)和N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPSO，pKa 9.43)等。

在一些实施方案中，可以特别根据其在低电导性下提供良好缓冲能力的能力来选择缓冲液。在一个这样的实施方案中，在pH约为9.0至9.2的情况下，使用硼酸作为缓冲液。在一个这样的实施方案中，使用Tris作为反离子来将缓冲液的pH提高至选定的目标pH，因为Tris还具有低摩尔电导率，并且在pH值9.0至9.2的范围内，其缓冲能力为零。

在采用硼酸盐缓冲液的一些实施方案中，硼酸盐化学领域的知识人员将认识到，硼酸盐阴离子有时被称为合成凝集素，因为它们能够与顺式二醇形成共价键，正如在一些碳水化合物上发现的。这种键的形成使络合物在原来有两个不带电荷的羟基的地方带有一个负硼酸盐电荷。由于该键是共价键，因此它暴露于高浓度盐中也能存活。应理解地是，含有顺式二醇碳水化合物的AAV衣壳的静电荷将变得更具电负性，其净电负性根据任何给定衣壳表面上的顺式二醇硼酸盐结合事件的数量而增强。还应理解地是，在某种程度上，将空衣壳和完整衣壳不同程度地赋予顺式二醇糖，与硼酸盐阴离子形成共价键将改变它们的相对电负性，这可能改变它们在阳离子色谱支撑上的相对保留。就空衣壳在富含顺式二醇中相对富集而言，预计它们的保留会增加。

在使用硼酸盐缓冲液的其他实施方案中，硼酸盐化学领域的技术人员将认识到，已知硼酸盐阴离子在某些情况下可以通过螯合剂和带有螯合位点的化合物改变金属结合的选择性。通过扩展，这种修饰应被理解为，可能包括蛋白质表面上具有螯合金属能力的位点，包括AAV衣壳蛋白。就空衣壳和完整衣壳的金属螯合位点在一定程度上不同而言，硼酸盐对它们各自金属结合位点的金属结合选择性的进一步修改可能会影响通过色谱法对空衣壳和完整衣壳的分离。

在一个实施方案中，通过用递增盐的梯度洗脱色谱固相，在阳离子金属亲和固相上进行空衣壳和完整衣壳的分离，其中盐为氯化钠、或氯化钾、或醋酸钠、或醋酸钾。一般来说，氯化钠是一种合适的初始物质，不需要评估其他物质。但是，这样做可能会产生感兴趣的结果。已知来自不同血清型的AAV衣壳对阴离子交换剂具有不同的亲和力，因此应理解地是，宽梯度(例如以1M氯化钠结束)作为起点是可取的。随后可以调整终点，以最大限度地分离空衣壳和完整衣壳。在AAV血清型2/8的一个示例中，运行初始50柱体积(CV)线性梯度至1M NaCl的终点。在随后的实验中，梯度长度保持不变，但终点减少到500mM NaCl，而在另一个后续实验中，它减少到250mM。这种特性的实验是正常工艺开发的常规部分。一般来说，将空衣壳从完整衣壳分离，并实现完整衣壳的良好恢复的最低盐浓度的梯度终点是优选的，因为这样的条件也应该使最大比例的DNA仍然结合到固相。

在一些实施方案中，精氨酸、组氨酸或赖氨酸可用作洗脱剂以代替无机盐。

不推荐具有强结合金属阳离子能力的盐，因为它们倾向于去除与固相配体结合的金属。它们也倾向于过早地洗脱DNA，并可能阻止该方法达到它应该能够去除的DNA水平。特别值得关注的盐包括柠檬酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(也称为依他酸(EGTA))、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和其他已知的螯合盐。

用于执行本发明的方法的缓冲液可以包含化合物，所述化合物能够稳定AAV衣壳或抑制它们与色谱表面的非特异性相互作用。此类稳定化合物可包括非离子或两性离子表面活性剂，例如八葡糖苷、泊洛沙姆188、普兰尼克F68、CHAPS、或CHAPSO等。此类稳定化合物可替代地或额外地包括糖，例如蔗糖、山梨糖醇、木糖、甘露糖醇、或海藻糖等。这种稳定化合物可以替代或额外包括氨基酸，如甜菜碱、牛磺-甜菜碱、精氨酸、组氨酸、或赖氨酸等。在4.0至7.5的pH范围内，它们还可能包括甘氨酸和丙氨酸。所有这些试剂在生物制药领域都是已知的，因为它们倾向于提高溶解度和/或稳定产品的回收率。在某些情况下，它们还改进了所需产品与不需要的物质的分馏。它们通常以不太可能干扰实施本发明方法的低浓度使用。

在一个实施方案中，可能通过增加非离子或两性离子强氢供体-受体(如糖或尿素)的梯度，从阳离子配体-金属固相中洗脱AAV衣壳。该实施方案首先需要在柱上负载AAV衣壳，然后将pH和盐浓度提高到最高水平，在该水平下，完整的衣壳不会被洗脱。从这一点开始，可以通过对尿素或糖或其他非离子氢供体-受体的一步或梯度的应用来洗脱完整的衣壳。在一个这样的实施方案中，在相同的pH和盐浓度下，用梯度至300mM的山梨糖醇洗脱完整的衣壳。在另一个这样的实施方案中，在相同的pH和盐浓度下，用梯度至10M的尿素洗脱完整的衣壳。

在一些实施方案中，本发明的方法可以同时利用两种不同金属种类的影响。在这样的实施方案中，用三价铁电荷使所述阳离子金属亲和基质带电，而AAV衣壳的洗脱是通过增加镁浓度产生的梯度进行的。在密切相关的实施方案中，用于使阳离子金属亲和基质带电的金属可以是锰。在其他密切相关的实施方案中，用于执行AAV衣壳洗脱的金属可以是钙或钡或铜。

可以用已知技术进行分析以证明本发明的有效性。一种常用的方法是测量色谱馏分在260nm和280nm处的UV吸光度比率。AAV衣壳对紫外线是部分透明的。这允许对色谱图进行标准UV监测，以检测衣壳内的DNA以及与外部蛋白质衣壳壁相关的DNA。空衣壳通常表现出低于1的260/280比率，通常在0.6到0.8的范围内。高度纯化的完整衣壳通常表现出大于1.3的260/280比率(图2)。该比率越高，相应色谱馏分中完整衣壳的比例就越高。例如，比率为1.35的馏分被理解为，相较比率为1.33的馏分包含更大比例的完整衣壳，这反过来又相较比率为1.31的馏分更富含完整的衣壳，等等。完整和空衣壳的二次确认可能包括分析超速离心(AUC)和低温透射电子显微镜(cryoTEM)。波长比也可用于指示污染DNA在色谱图中的洗脱位置，因为AAV衣壳外的DNA也具有独特的260/280比率，范围约为1.5到2.2，其中纯DNA的比率略高于2.0。

可以通过在色谱之前用一种叫做Picogreen的染料预孵育样品，来估计与衣壳外部相关的DNA数量。Picogreen是一类可以插入DNA碱基对之间的染料。这种插入过程称为插层。Picogreen本身没有重要的光学特性，但DNA碱基对之间的Picogreen会产生绿色荧光，可用于放大DNA的检测(图3)。已经实验证明，Picogreen只能检测衣壳外的DNA。因此，通过UV和Picogreen估计DNA含量，可以提供比单独使用任何一种方法更有深入的信息。

还可以绘制Picogreen荧光与UV吸光度的比率，以指示衣壳外的DNA与衣壳本身的相对量，例如通过实践本发明的方法获得的一系列馏分。

在一些实施方案中，本发明的方法可以在首先处理样品以减少DNA的污染量之后实施。在一个这样的实施方案中，预先用DNAase酶处理样品。在另一个这样的实施方案中，样品预先用带正电荷的固相颗粒进行处理，其目的是结合DNA，然后通过除去DNA所结合的颗粒来除去DNA。在一个相关的实施方案中，样品用带正电的聚合物进行处理，其目的是与DNA形成大的不溶性复合物，所述复合物沉淀后可以通过离心、过滤或两者的组合去除。

在一个化合物实施方案中，含有AAV衣壳和DNA的样品首先用正电性固相进行处理，以便通过切向流过滤(TFF)进行处理，然后将样品浓缩并通过TFF渗滤到适合核酸酶处理的缓冲液中。然后用核酸酶处理样品以分解DNA。然后，将样品进一步浓缩和渗滤，同时通过膜去除核苷酸和组蛋白。在最后一个实施方案中，过滤介质优选地选择为具有保留AAV的最大孔隙，以便可以消除污染物的最大多样性。

在另一系列的实施方案中，在阳离子金属亲和步骤之后，可以通过另外的方法来减少空衣壳和DNA的含量。在一个这样的实施方案中，所述的另外的方法可以是色谱方法，例如在强阴离子交换剂上的阴离子交换色谱法。在另一个这样的实施方案中，所述的另外的方法可以是在伯胺交换剂上的阴离子交换色谱，其中空衣壳和完整衣壳在递增的pH梯度中分离。在另一个这样的实施方案中，所述的另外的方法可以是密度梯度离心。

在另一系列的实施方案中，在执行本发明的方法之前，首先处理样品以减少DNA的量，并且随后还采用进一步减少空衣壳和DNA含量的方法。

在另一系列的实施方案中，本发明所述的方法用作抛光方法，以减少已经经处理以去除大部分污染物的样品的空衣壳和DNA含量。在一个这样的实施方案中，使用已知的阳离子交换色谱法进行第一纯化步骤。在从阳离子交换步骤的洗脱馏分中回收部分纯化的AAV后，通过本发明所述的方法处理这些AAV馏分。在另一个这样的实施方案中，使用已知的生物亲和色谱法进行第一纯化步骤。在从生物亲和步骤的洗脱馏分中回收部分纯化的AAV后，用本发明的方法处理这些AAV馏分。在这些实施例的任何一个中，可以如上所述预先处理样品，以在第一层析步骤之前减少DNA含量

在一个实施方案中，本发明所述的方法可以在一种构型中执行，其中TREN-金属固相与季胺阴离子交换固相串联连接(plumbed in series)。在一个这样的实施方案中，所述的季胺固相可以按顺序放在第一位。两种固相通过相同的平衡缓冲液共同平衡，例如在pH9下。负载样品，清洗柱子，然后用盐梯度洗脱。由于AAV从强阴离子交换剂中洗脱的盐浓度低于阳离子配体-金属固相中洗脱的盐浓度，因此AAV衣壳将从强阴离子交换剂中洗脱，并重新结合在阳离子配体-金属固相上。然而，很大一部分DNA将保持与强阴离子交换剂的结合，包括从阳离子配体-金属固相中洗脱衣壳的整个过程。通过阻止这个DNA亚群驻留在阳离子配体-金属固相上，所述阳离子配体-金属固相的全部容量将可用于衣壳分离。两种色谱柱都可以用高盐和NaOH串联洗涤，以释放强结合的污染物。在另一个实施方案中，所述固相的顺序是相反的。

在一个相关的实施方案中，本发明所述的方法与使用伯胺阴离子交换剂的步骤相结合。在一个这样的实施方案中，所述伯氨基固相可以首先在该顺序中运行。在pH值范围为pH 7至pH 8时负载所述伯胺阴离子交换剂，随后用pH梯度洗脱至pH值约为10。这提供了空衣壳和完整衣壳的部分分离以及污染DNA的部分减少。然后可以将洗脱的完整衣壳滴定至pH值为9或更低，并通过本发明所述的方法进行处理，以实现空衣壳和污染DNA的进一步消除。在一些实施方案中，工艺顺序可以颠倒。

在另一个密切相关的实施方案中，本发明所述的方法在以下构型中实施，其中阳离子金属-配体固相与阴离子固相串联连接，其中阴离子金属-配体固相在该顺序中是第一个。在一个这样的实施方案中，所述的阴离子金属-配体固相是亚氨基二乙酸(IDA)。在另一个这样的实施方案中，所述的阴离子金属-配体固相是次氮基三乙酸。在一个这样的实施方案中，所述的阴离子固相带有与阳离子金属-配体固相相同的金属种类。在一个这样的实施方案中，所述的阴离子固相带有与阳离子金属-配体固相不同的金属种类。在一个这样的实施方案中，所述的阴离子金属-配体固相带有铁或锰的电荷，而所述的阳离子金属-配体固相带有钙、镁或另一种非铁、非锰种类的电荷。在所有这些实施方案中，所述的阴离子金属-配体固相用于在样品接触阳离子金属-配体固相之前，从样品中除去磷酸化污染物。在所有此类实施方案中，所述的此类高度磷酸化的污染物特别包括DNA、RNA、内毒素和细胞膜碎片，包括来自细胞器和囊泡的膜。在所有这些实施方案中，预先去除这些污染保留了AAV衣壳的阳离子金属-配体固相的容量，并且允许其获得比那些污染物与所需污染物一起结合到柱子时的完整衣壳的更高纯度。在一个实施方案中，所述串联方法用于在单个步骤中产生纯化的完整AAV衣壳。

在另一个这样的实施方案中，所述的阴离子金属-配体固相不与阳离子金属-配体固相顺序连接。在一个这样的实施方案中，在执行阳离子金属-配体固相方法之前，用所述的阴离子金属配体固相处理样品。在一种这样的方法中，这两个步骤是按顺序执行的。在一个这样的实施方案中，在执行阳离子金属-配体固相步骤的方法之前，用阴离子金属-配体固相处理含有空AAV衣壳、完整AAV衣壳和DNA的细胞培养收获物或裂解物。在一个密切相关的实施方案中，在阴离子金属-配体步骤之后和阳离子金属-配体步骤之前，执行一个或多个额外的步骤。在一个这样的实施方案中，用阴离子金属配体固相处理含有完整衣壳、空衣壳和DNA的细胞培养物收获物或裂解物，在继续通过执行阳离子金属配体固相方法分离空和完整衣壳之前，通过亲和色谱技术分离缺乏DNA的溶液。在另一个这样的实施方案中，在继续通过执行阳离子金属配体固相方法分离空衣壳和完整衣壳之前，阴离子金属配体固相处理的细胞培养物收获物或裂解物通过阳离子交换色谱方法进行分离。

在一个实施方案中，使用载有金属的阴离子金属亲和基质的DNA减少步骤与通过DNAase酶同时进行的DNA减少相结合。在一个这样的实施方案中，所述DNAase酶是耐盐DNA酶，并且负载金属的阴离子金属亲和基质是以带有多个负载金属的阴离子金属亲和配体的可溶性聚合物骨架的形式存在。在另一个这样的实施方案中，所述的载有金属的阴离子金属亲和基质具有带有多个载有金属的阴离子金属亲和配体的固体不溶性颗粒的形式。在这两种情况下，在DNA的酶促裂解过程中，都存在带有多个负载金属的阴离子金属亲和配体的基质。在一些情况下，阴离子金属亲和配体负载的金属种类与酶所需的金属种类辅助因子相同。在一种情况下，所述的金属离子是镁，在其他这样的情况下，负载阴离子金属亲和配体的金属种类不同于酶所需的金属种类辅助因子。在这样的一种情况下，所述的可溶性酶辅因子是镁，但阴离子金属亲和配体预载有铁。在另一种情况下，所述的可溶性酶辅助因子是镁，但阴离子金属亲和配体预载有锰。

在一个实施方案中，带有阳离子金属亲和配体的固相可以是一种或多种多孔颗粒、或一种或多种多孔膜、或一种或多种纳米纤维、或整体材料、或水凝胶、深层过滤器、或另一种形式的固相。

在一个密切相关的实施方案中，带有阴离子金属亲和配体的固相可以是一种或多种多孔颗粒、或一种或多种多孔膜、或一种或多种纳米纤维、或整体材料、或水凝胶、深层过滤器、或另一种形式的固相。

在一个实施方案中，用于实施本发明所述方法的任何方面的固相可以布置为流通装置，以促进色谱方法的实施。用于执行色谱法的流通装置通常称为色谱柱，无论其形式或所含材料。

在一个实施方案中，本发明的材料和方法、任何先前的处理步骤和任何后续处理步骤都可以连接微处理器并与微处理器接口，以实现多步骤过程的端到端的自动化，如果需要，可以连续地执行所述工艺。

本领域技术人员将认识到，尽管不同血清型的AAV衣壳具有许多基本的物理和化学相似性，但它们在表面化学和纯化特性方面也表现出显著的可变性。亲和色谱介质倾向于识别一种或几种血清型。一些广谱亲和配体可识别多种AAV血清型，但这并不意味着它们以相同的亲和力结合、提供相同的容量或在相同的条件下洗脱。在离子交换色谱行为方面也观察到多样性。不同的AAV血清型以不同的亲和力结合阳离子交换剂，并在不同条件下洗脱。不同的AAV血清型也以不同的亲和力结合阴离子交换剂，并在不同的条件下洗脱，空衣壳和完整衣壳的分离程度也不同。所有这些方法的最佳范围都是已知的，因此不需要过度的实验来优化任何给定血清型的任何给定方法。预计使用本发明所述的方法同样可以观察到血清型之间在结合、容量、洗脱和空-完整衣壳分离特征方面的差异。鉴于预先了解适当的起始条件、关键过程变量的识别、它们可能被评估的范围、以及它们产生的效果的种类，如本说明书中所提供的，不需要过度的实验来优化方法，以最佳地适应任何给定的AAV血清型。

在一个实施方案中，通过本发明所述的方法处理的AAV血清型可以是AAV1、或AAV2、或AAV3、或AAV4、或AAV5、或AAV6、或AAV7、或AAV8、或AAV9、或AAV10、或AAV11、或另一种血清型。在另一个实施方案中，使用本发明所述方法处理的AAV血清型可以是重组杂交血清型，如AAV2/8或AAV2/9、或另一种杂交血清型。在另一个实施方案中，通过本发明所述的方法处理的AAV血清型可以是合成的重组血清型。

本领域技术人员将认识到，每种血清型在任何类型的吸附色谱介质上都表现出不同的保留特性。所有色谱方法的这种多样性的结果是需要优化条件以实现任何特定血清型的最佳整体纯化。

在一个实施例方案中，含有空衣壳、完整衣壳和DNA的样品是细胞培养收获物。在一个密切相关的实施方案中，含有空衣壳、完整衣壳和DNA的样品是细胞裂解物。在另一个密切相关的实施方案中，含有空衣壳、完整衣壳和DNA的样品是部分加工或部分纯化的制剂。在一个这样的实施方案中，含有空衣壳、完整衣壳和DNA的样品是细胞培养收获物或裂解物，其已经用酶处理以裂解DNA。在另一个这样的实施方案中，含有空衣壳、完整衣壳和DNA的样品是已用阳离子聚合物或阳离子固相处理以提取DNA的细胞培养收获物。在另一个实施方案中，含有空衣壳、完整衣壳和DNA的样品是细胞培养收获物或裂解物，其已用阳离子固相处理，然后通过切向流过滤浓缩和渗滤，然后用酶处理以裂解DNA。在该实施方案的扩展中，然后通过切向流过滤对样品进行浓缩和过滤，为色谱纯化做准备。在另一个实施方案中，处理细胞收获物或裂解物以沉淀污染物，将AAV留在上清液中。在另一个实施方案中，处理细胞收获物或裂解物以沉淀AAV，在上清液中留下污染物。重新悬浮的沉淀物从上清液中分离出来，并重新悬浮，此时没有最初未沉淀的污染物。在另一个实施方案中，通过色谱法纯化部分细胞收获物或裂解物。在一个这样的实施方案中，通过亲和色谱法纯化部分收获物或裂解物。在另一个这样的实施方案中，通过疏水相互作用色谱法纯化部分收获物或裂解物。在另一个这样的实施方案中，通过尺寸排阻色谱法纯化部分收获物或裂解物。在另一个这样的实施方案中，通过阳离子交换色谱法部分纯化部分收获物或裂解物。在另一个这样的实施方案中，通过阴离子交换层析进行纯化收获物或裂解物。

通过以下非限制性实施例进一步解释本发明。

实施例

实施例1.参考基线的制备。通过阳离子交换色谱法部分纯化的空和完整AAV8衣壳的混合样品，将其注射到用50mM Tris，pH 9平衡的强(季(4°)胺)整体式色谱柱上。阴离子交换剂用氯化钠梯度洗脱至200mM，然后用500mM氯化钠一步清洗柱子。洗脱曲线如图2所示。它显示了空衣壳和完整衣壳的部分分离，单个空衣壳峰先于单个完整衣壳峰洗脱，但与单个完整衣壳峰重叠。完整衣壳的峰值显示了260/280波长比为1.307。可以理解为，意味着一定比例的空衣壳也在完整衣壳区域洗脱并降低波长比。注意空衣壳峰值的尺寸相对较大。

实施例2.在pH 7.0和pH 9.0下，通过TREN-Mg对空衣壳和完整衣壳分离的初步评估。通过将具有TREN表面的整体材料暴露在水中的100mM醋酸镁中，使其负载二价镁离子。用50mM HEPES将柱平衡至pH 7.0期间，冲洗掉过量的镁。该柱用线性梯度洗脱至1M氯化钠。然后用2M氯化钠、50mM HEPES一步清洗，然后用1M氢氧化钠进一步清洗。完整衣壳峰显示260/280波长比为1.240(图4)。在一个单独的实验中，通过将具有TREN表面的整体材料暴露于100mM醋酸镁水溶液中，使其负载二价镁离子。在柱平衡至pH 9.0期间，用50mM双三丙烷、2mM氯化镁冲洗掉过量的镁。将用于实施例1的通过阳离子交换色谱部分纯化的空和完整AAV8衣壳的相同样品注射到TREN-Mg柱上。该柱以500mM氯化钠、2mM氯化镁线性梯度洗脱。然后用2M氯化钠、50mM双三丙烷、2mM氯化镁逐步清洁，然后用1M氢氧化钠进一步清洗。洗脱曲线如图4所示。它显示了空衣壳和完整衣壳的部分分离，其中有两个空衣壳峰，一个在完整衣壳峰之前洗脱，一个在后洗脱。完整衣壳峰显示了260/280波长比为1.377(图5)。还可以理解为，在完整衣壳区域洗脱的比例小于样品被实施例1所示的强阴离子交换剂分馏时的比例。总体结果表明，即使在pH 7.0时，空衣壳和完整衣壳之间获得一定程度的分离，但在pH 9.0时，分离得到实质性的改善。随后在pH 9.25的条件下的实验表明，性能基本相同，但在pH 9.5的条件下的结果稍差。

图6显示了两种方法之间DNA在衣壳外部的分布不同。从图2和图4所示的色谱图中，通过比较260nm处的UV吸光度的Picogreen荧光的峰面积来估计条形的高度。标有F的馏分表示完整衣壳的馏分。这两种方法在DNA的分布上表现出明显的区别，增加了它们的选择性彼此不同的证据。这也强调了它们的互补性和使用阴离子交换色谱法的本发明所述的方法的潜在价值，反之亦然。

图7比较了原始阳离子交换纯化样品的分析阴离子交换曲线(季胺)，与图6中包含完整衣壳的馏分，以及图6中含有2M氯化钠洗涤的馏分。出于两个原因，监测了洗脱曲线的内在色氨酸荧光，第一个原因是色氨酸荧光将蛋白质检测的灵敏度提高了15-20倍。第二个原因是色氨酸荧光仅由蛋白质产生。它不检测DNA。这避免了由于蛋白质和DNA对260nm和280nm UV吸光度的不确定个体贡献而造成的混淆。如图所示，原始样本主要是空衣壳。完整衣壳馏分明显以全完整衣壳为主。氯化钠洗涤馏分完全由空衣壳组成。这些发现表明，本发明所述方法的选择性不同于任何已知的方法，尤其不同于使用强阴离子交换剂的阴离子交换色谱法。

实施例3.在pH梯度上升的伯氨基阴离子交换剂上，空衣壳和完整衣壳分离的比较。用10mM Tris、10mM双三丙烷、2mM氯化镁(pH 7.0)平衡伯胺阴离子交换剂。它负载了用于制备实施例1和2的相同样品。图8说明了在最右侧的中心面板中含有全峰的洗脱区域，标记为1°胺。将其与图2中相应区域进行比较，显示了在强阴离子交换剂(左图)上空衣壳和完整衣壳的分离。还将其与图5的相应区域进行比较，显示了通过本发明所述的方法分离空衣壳和完整衣壳。如图所示，来自伯胺阴离子交换剂的完整衣壳馏分的波长为1.30，季交换剂为1.307，而本发明所述方法为1.377。总体而言，图8强调了本发明所述方法的选择性不同于两种类型的阴离子交换剂，并指出了固定金属离子的影响。

实施例4.色谱缓冲液中添加和不添加金属时衣壳分离的比较。图9比较了在缺乏金属离子的情况下，进行对照运行的色谱图(顶部图)。TREN柱不带多价金属阳离子，且梯度缓冲液不含多价金属阳离子。底部的曲线说明了在梯度缓冲液中使用2mM镁时的结果。结果表明，空衣壳明显向晚洗脱馏分转变，而在主洗脱峰中完整衣壳比例的显著提高。较高的260/280比率表明了这一点。在另一个实验中，上样前用镁平衡TREN柱。结果(未显示)与仅在梯度缓冲液中提供镁时获得的结果相同。这些结果除了肯定镁的存在获得的改进性能外，还表明了阳离子金属亲和配体不需要在样品应用之前负载金属，这代表了IMAC领域的经典方法。金属可以在衣壳洗脱之前的任何时候负载到配体上。

实施例5.不同金属离子色谱的比较。重复实施例2中运行的方法，只是在每种情况下用不同的金属使TREN固相带电。与钙、铁(三价铁)、锰、铜(二价铜)、锌和钡进行了比较。在空衣壳和完整衣壳洗脱的区域，曲线一致，但在洗涤步骤的区域中，曲线不同。尤其是铁和锰在氢氧化钠的原位清洁峰中显示出明显更大的峰。图10示出了钙的色谱图。图11显示了铁的色谱图。这些差异归因于DNA与铁的结合异常强。图12显示了pH 9.0时，铜(二价铜)的色谱图。铜的清洁峰大于钙或镁，但小于铁。锰(未显示)的使用产生了介于铁和铜之间的清洁峰。图13比较了镁和铜在衣壳去除区域的洗脱曲线。注意洗脱曲线之间的偏移，铜中的衣壳较早洗脱。在比较中，铜还产生了最有利的波长比，这表明它产生了空衣壳比例最低的完整的衣壳馏分。含铜的完整衣壳峰也最窄，空馏分中的变异亚群得到更清楚的解析。

实施例6.负载镁的阴离子金属亲和配体用于DNA预先减少的评估。带有亚氨基二乙酸(IDA)螯合残基的整体材料负载镁，并平衡至pH 9.0。将阳离子交换纯化的衣壳样品平衡至相同条件并负载到柱上。AAV衣壳通过柱未结合并未分馏，强调了阳离子金属亲和柱对于捕获和分离空衣壳和完整衣壳的重要性。然而，样品中的DNA和污染物结合在一起(图14)。

实施例7.将本发明的方法整合到多步纯化方法中。过滤后的细胞培养裂解液含有DNA、空的和完整的AAV衣壳，用表面带有乙二胺的颗粒处理，并赋予它们一个正电荷。将它们与带负电荷的SO3基团的颗粒混合。将混合的颗粒以5％的体积比添加到样品中，并孵育混合60分钟。这些颗粒结合了大量可溶性宿主细胞DNA。将颗粒-DNA复合物沉淀，并将上清液通过孔径截断为0.45μm的膜过滤器过滤。这种处理提高了可过滤性，使其能够通过切向流过滤来浓缩样品。使用孔径截断为300kDa的膜将样品浓缩10倍，这使得许多小分子污染物(包括蛋白质)得以消除。还通过切向流过滤将样品渗滤到适合于用耐盐核酸酶进行DNA酶裂解的缓冲液中：20mM Tris、500mM NaCl、pH 8.0。将耐盐核酸酶与5mM氯化镁一起加入，并将混合物在室温下孵育16小时。重新切向流过滤，以去除通过消化宿主细胞DNA释放的组蛋白，以消除DNA片段和核苷酸，并平衡样品，以便在带有TREN-镁复合物的柱上捕获。将样品加到柱上，并按照实施例2所述进行处理。将一部分含有完整衣壳的TREN馏分在用pH梯度洗脱的伯胺阴离子交换剂上进一步分馏。另一部分TREN馏分在用盐梯度洗脱的强阴离子交换剂上进一步分馏。将结果与在相同条件下进行但在阳离子交换剂上执行初始色谱步骤的另一个实验进行比较。图15显示了TREN-Mg初始捕获步骤的完整色谱图。图16强调了图15中的洗脱梯度和清洁步骤。图17突出显示了由TREN-Mg捕获的完整衣壳部分的阴离子交换抛光。图18比较了采用本发明方法纯化的AAV的阴离子交换抛光结果(右图)与采用阳离子交换色谱初始纯化的AAV(左图)。基于相对峰高，通过本发明的方法捕获比通过阳离子交换色谱捕获多消除了83％的空衣壳。这减少了两个空峰和全峰之间的重叠，结果是通过阴离子交换色谱法进行抛光能够更有效地减少空衣壳。图19比较了用pH梯度洗脱的伯胺阴离子交换剂(左图)与用盐梯度洗脱的季胺阴离子交换剂(右图)捕获TREN-Mg后空衣壳减少(图15,16)。两个结果都强调了本发明方法与阴离子交换色谱的互补性，并强调了使用该组合比单独使用任一方法更有效地实现空衣壳含量的整体减少的潜力。

实施例8.将本发明的方法整合到不同的多步纯化过程中。重复实施例6的方法，除了用阳离子交换色谱步骤代替原来的捕获步骤。然后准备样品用于通过本发明的方法处理，并如此加工。在所述方法的一种变体中，TREN柱载有铜。在所述方法的另一个变体中，TREN柱负载有镁。

实施例9.通过将本发明的方法与可以另一种能够实现它们分离的方法组合，来增强DNA的去除以及空衣壳和完整衣壳的分离。通过实施例6的TREN步骤对样品进行处理后，完整衣壳馏分用已知的空衣壳和完整衣壳分离方法在具有盐梯度的强阴离子交换剂上进行处理，如实施例1中所示。

实施例10.通过将本发明的方法与另一种能够实现它们分离的方法组合，增强空衣壳和完整衣壳的分离。本发明采用盐梯度洗脱的强阴离子交换色谱法，或pH梯度洗脱伯胺阴离子交换色谱法分离空衣壳和完整衣壳后，作为进一步的抛光步骤进行。

实施例11.通过将本发明的方法与另一种能够实现它们分离的方法组合，来增强空衣壳和完整衣壳的分离。包含DNA、空衣壳和完整衣壳的样本首先被亲和色谱法捕获。通过本发明的方法对从亲和柱洗脱的AA馏分进行处理，以去除过量的DNA并将空衣壳从完整衣壳分离。在一个变体中，在亲和色谱之前对样品进行处理以降低DNA的浓度，例如通过实施例7中描述的任何方法。

实施例12.在用阳离子金属亲和固相分离完整和空衣壳之前，用阴离子金属亲和固相处理样品，来增强DNA的减少和空和完整衣壳的分离。将含有DNA、完整衣壳和空衣壳的样品平衡至pH值约9，然后上样至装有三价铁的亚氨基二乙酸(IDA)柱。DNA是结合的，但AAV衣壳不是。处理后，样品无需进一步准备就可上样至载有镁的TREN柱。通过增加氯化钠梯度，将空衣壳从完整衣壳分离。在该方法的一个变体中，IDA固相被次氮基三乙酸(NTA)酸固相取代。在另一个变体中，阴离子金属亲和固相负载有锰。在另一个变体中，TREN固相载有钙。在另一种变化中，两种固相都负载有相同的金属物质。在该方法的一个版本中，阴离子金属亲和固相以流通色谱装置的形式存在。在一个变体中，阴离子金属亲和色谱装置与TREN柱串联。在另一种变体中，将阴离子金属亲和固相以颗粒的形式添加到包含完整衣壳、空衣壳和DNA的样品中，使DNA结合，然后去除带着DNA一起的颗粒。在另一个变体中，处理过的样品接下来用TREN固相处理。在另一个变体中，处理过的样品在被TREN固相处理之前用阳离子交换剂处理。在另一个变体中，处理过的样品在被TREN固相处理之前通过亲和色谱处理。

实施例13.使用和不使用预先通过装载镁的固定化亚氨基二乙酸提取宿主细胞DNA，比较TREN-Mg在pH值为9时进行的AAV分离。带有阴离子金属亲和配体亚氨基二乙酸的整体材料负载有镁离子。然后在pH 9.0时，用50mM双-三-丙烷平衡整体材料。将阳离子交换纯化的AAV8样品滴定至pH 9.0。样品通过整体材料。AAV没有结合并流过。大量DNA亚群结合并从样品中去除。将样品应用于载有镁的阳离子金属亲和(TREN)整体材料，并用渐增的氯化钠梯度洗脱。另一个样品是通过滴定至pH 9从阳离子交换纯化的AAV制备的，但没有经过镁-IDA整体材料处理。图20比较了TREN色谱图，其中可以看出IDA柱的预处理改变了TREN柱上的洗脱行为。

实施例14.宿主细胞DNA的预先提取。带有阴离子金属亲和配体亚氨基二乙酸的整体材料装载有镁离子。然后在pH 9.0时，用50mM双-三-丙烷平衡整体材料。将阳离子交换纯化的AAV8样品滴定至pH 9.0。将样品通过整体材料。AAV没有结合并流过。DNA结合并因此从含有AAV的样品中去除。随后通过使用1M NaOH的清洁步骤去除与IDA柱结合的DNA(图21)。

实施例15.通过IDA-镁柱预先提取宿主细胞DNA后，从TREN-镁柱中优化空衣壳和完整衣壳的分离。如实施例14所述，从阳离子交换纯化的AAV样品中提取DNA。将样品施加到pH 9的TREN-镁柱上。用10mM氯化镁从柱上清洗空衣壳。用增加的盐梯度洗脱完整的衣壳(图22)。

实施例16.串联宿主细胞DNA的提取和空衣壳和全衣壳的分离，依次用载有三价铁的亚氨基二乙酸固相进行处理，然后用载有镁的TREN固相进行梯度分离。将IDA柱上负载三价铁，并平衡至pH 9。TREN柱上负载镁，并平衡至pH 9。首先将两根柱与IDA柱串联接在一起，然后用pH 9的缓冲液冲洗。将包含空衣壳和完整衣壳以及宿主细胞DNA的样品平衡至pH9。样品通过两个色谱柱。DNA与三价铁IDA柱结合。AAV衣壳通过IDA柱，并被镁-TREN柱捕获。柱子仍然连接在一起，用平衡缓冲液清洗，然后用增加的盐梯度洗脱TREN柱，使DNA与IDA柱结合。在收集到所需的完整AAV衣壳馏分后，用1M NaOH清洗柱。在该方法的一个变体中，IDA柱在洗涤步骤后脱机，以便TREN柱独立洗脱。

实施例17.通过阴离子和阳离子金属亲和力以及切向流过滤为中间步骤纯化AAV。将含有AAV8和宿主细胞DNA的细胞裂解物平衡至pH 7.0、100mM NaCl。带有亚氨基二乙酸的不溶性颗粒负载有三价铁。颗粒以5％颗粒的比例与细胞裂解物混合。将样品孵育混合60分钟，让颗粒沉降到容器底部。上清液通过平均孔隙率为约0.45微米的膜滤器过滤。然后使用截留分子量(MWCO)为300kDa的膜通过切向流过滤对样品进行渗滤。渗滤缓冲液含有2mM氯化镁、25mM双三丙烷，pH 9.0。对6个透析体积进行切向流过滤，在此期间蛋白质和较低分子量的污染物通过膜被去除。将样品施加到装有载有镁的TREN的柱上，并在实施例15中描述的条件下进行分馏。

实施例18.使用载有三价铁并用氯化镁线性梯度洗脱的阳离子金属亲和基质同时进行DNA提取和空/全衣壳分离。TREN整体材料装有三价铁并平衡至25mM双三丙烷、1％蔗糖、0.1％泊洛沙姆188、pH 9.0。将仍含有宿主DNA的阳离子交换色谱纯化的AAV8衣壳平衡至相同条件，并负载到TREN-Fe整体材料上。用平衡缓冲液洗涤该柱，以冲洗掉未结合的物质。然后以50CV线性梯度洗脱柱，在25mm双三丙烷、1％蔗糖、0.1％泊洛沙姆188、pH 9.0下洗脱至25mm氯化镁，再以10CV线性梯度在25mm双三丙烷、1％蔗糖、0.1％泊洛沙姆188、pH9.0下洗脱至50mm氯化镁。使用25mM双三丙烷、1％蔗糖、0.1％泊洛沙姆188、2.0M NaCl、pH9.0执行清洁步骤，然后使用1M NaOH、2M NaCl、pH 13执行更强的清洁步骤。显示结果如图23所示。一小部分的空衣壳亚群在主要的完整衣壳群之前洗脱。空衣壳的另一个亚群在完整的衣壳之后很久就洗脱了。初始清洁步骤去除了一小部分衣壳碎片，NaOH步骤去除了大量宿主DNA。值得注意的是，这些结果表明，在镁存在的情况下，铁仍与TREN结合，这反过来表明TREN对铁的亲和力可能强于镁。

实施例19.IDA-Fe和NTA-Fe作为前体，用于通过镁梯度洗脱的TREN-Fe分离空衣壳和完整衣壳的比较。IDA颗粒负载有三价铁，并平衡至50mM Hepes，pH 7。用相同的方法制备NTA颗粒。向阳离子交换层析纯化的AAV8颗粒的一个样品中，添加IDA-Fe颗粒至最终比例为5％。向阳离子交换层析纯化的AAV8颗粒的另一个样品中，添加IDA-Fe颗粒至最终比例为5％。将样品孵育混合120分钟，然后通过离心去除颗粒。将IDA-Fe处理的样品应用于pH 7的TREN-Fe柱。然后将柱重新平衡至pH 9.0(25mM双三丙烷、1％蔗糖、0.1％泊洛沙姆188)，并以线性梯度洗脱至50mM氯化镁(在相同的基础缓冲液中)。然后用2M NaCl清洗柱，然后用1MNaOH清洗。NTA-Fe处理的样品进行了相同的处理。在TREN-Fe用镁洗脱后，用NTA-Fe处理的样品的260/280比率为3.02。在TREN-Fe用镁洗脱后，用IDA-Fe处理的样品的260/280比率为3.05。

实施例20.通过使用硼酸盐缓冲液优化空-完整衣壳分离。用100mM硼酸、50mMTris、1％蔗糖、0.01％泊洛沙姆188、pH 9.0、电导率0.25mS/cm平衡带有三价铁的1mL TREN整体材料。将一份阳离子交换纯化的AAV8稀释于99份400mM硼酸、50mM Tris、1％蔗糖、0.01％泊洛沙姆188、pH 7.0、电导率0.76mS/cm中，并负载到柱上。用平衡缓冲液恢复流量，直到缓冲液pH和电导率稳定，然后将柱以线性梯度洗脱至100mM硼酸、50mM Tris、50mM氯化镁、1％蔗糖、0.01％泊洛沙姆188、pH 9.0、电导率9.6mS/cm。用2M NaCl逐步洗脱空衣壳，然后用1M NaOH、2M NaCl清洁柱子。完整的色谱图如图24所示。图25放大了洗脱完整衣壳所对应的区域。重复实验，除了用25mM Hepes、1％蔗糖、0.01％泊洛沙姆188、pH 7.0、电导率0.85mS/cm代替样品稀释缓冲液。结果基本相同(未显示)。图24和25所示的结果与所有其他材料和条件形成了显著和有利的对比。如图2和3所示，在强阴离子交换剂上用盐梯度洗脱的相同样品产生的曲线特征是一个大的空衣壳峰，紧接着是大的完整衣壳峰。如图5、12、13和22所示，在带有多价金属阳离子的阳离子金属亲和柱上，空衣壳和完整衣壳的分离通常会产生空衣壳开始洗脱的曲线，并与全衣壳峰的尾界部产生部分的重叠。在图24和25中，尽管在梯度中间洗脱了完整衣壳，但在完整衣壳峰的前侧只有一个小的空衣壳峰，在完整衣壳峰的尾部没有明显的空衣壳峰。相反，除了梯度中的第一个小峰外，所有空衣壳都在镁梯度后的2N盐步骤中洗脱(图26)。这表明它们的负电荷得到了增强。这提示了一个假设：硼酸盐通过修饰空衣壳上的负电荷来增强分离。

实施例21.从季胺(QA)阴离子交换整体材料中分馏AAV衣壳。如实施例20制备AAV8衣壳。如实施例20所示，平衡和洗脱季胺阴离子交换剂。洗脱曲线如图27所示。在这些条件下，NaOH峰中的DNA量比图27中的数量少。此文件显示了较差的染色质去除。此外，260nm和280nm的UV吸光度表明，QA柱在这些条件下失效，无法有效地将空衣壳从完整衣壳分离(图28)。来自TREN-Fe3和QA的结果在图29中进行比较。除了相对染色质提取和空衣壳与完整衣壳分离的明显差异之外，该比较突出了本发明方法与传统阴离子交换色谱分离化学方面的巨大差异。

参考文献

本文中所引用的所有参考文献均以引用方式纳入，只要纳入与此处的明确教导不相抵触。

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Claims (17)

1.一种在包含完整AAV衣壳和空AAV衣壳缓冲混合物中将完整的腺相关病毒(AAV)从空AAV衣壳中分离的方法，包括步骤：

-将缓冲混合物与第一基质接触，所述第一基质带有连接到第一基质的金属亲和配体，所述金属亲和配体具有通过三个或更多氮原子使金属离子络合的能力，

-在与金属亲和配体结合的多价阳离子存在的情况下，通过pH梯度、盐梯度、金属离子梯度或其组合洗脱，将空AAV衣壳从完整AAV衣壳分离，以获得纯化的完整AAV衣壳馏分。

2.如权利要求1所述的方法，在所述缓冲混合物与第一基质接触之前，在缓冲混合物与第一基质接触期间和/或在洗脱期间，其中第一基质负载多价阳离子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一基质的金属亲和配体选自下组：二乙基三胺、三乙基四胺、四乙基五胺、聚酰胺胺、聚三乙胺、去铁敏、N,N-双(2-氨基乙基)-1,2-乙二胺和三(2-氨基乙基)胺(TREN)。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在洗脱期间存在的多价金属阳离子选自下组：铁(III)、锰(II)、铜(II)、锌(II)、钴(II)、镁(II)、钙(II)、钡(II)、镍(II)及其组合，特别地选自下组：镁(II)、钙(II)、钡(II)，铜(II)及其混合物。

5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其中多价阳离子在梯度终点的浓度范围为0.1mM至200mM、或1mM至100mM、或2mM至50mM、或5mM至25mM。在一些实施例中，所述多价离子的种类可以是镁、钙、或钡、或铜、或其混合物。

6.如据权利要求1-5中任一所述的方法，其中洗脱在pH值范围为pH 6.0至pH 10、pH7.0至pH 9.75、pH 8.0至pH 9.5、pH 8.5至pH 9.5、pH 9.0至pH 9.5、pH 8.75至pH9.25、pH8.9至pH 9.1、或pH 8.95至pH 9.05，特别地pH值范围为pH 8.75至pH 9.25。

7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其中通过在高达1M、1mM至500mM、2mM至250mM、3mM至125mM、5mM至60mM、或7mM至30mM的范围内增加盐的浓度来进行洗脱。

8.如权利要求1-7中任一所述的方法，其中通过增加金属盐的浓度进行洗脱，其中所述金属离子是多价金属阳离子，优选铜(II)、镁(II)、钙(II))、或其组合。

9.如权利要求1-8中任一所述的方法，其中使用包含硼酸盐的缓冲液进行接触和/或洗脱。

10.如权利要求1-9中任一所述的方法，其中所述金属亲和配体在洗脱之前带有一种多价阳离子，并且通过增加第二种多价金属阳离子的浓度来洗脱AAV衣壳。

11.如权利要求1-10中任一所述的方法，其中所述的缓冲混合物或纯化的完整AAV衣壳馏分与具有连接到第二基质的金属亲和配体的第二基质的接触，在与金属亲和配体结合的多价阳离子存在的情况下进行，所述金属亲和配体包括两个或多个带负电荷的羧酸残基。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述缓冲混合物用第一基质和第二基质同时处理。

13.如权利要求10-12所述的方法，其中连接到第二基质的金属亲和配体选自下组：氨基二羧酸(如亚氨基二乙酸)和氨基三羧酸(如次氮基三乙酸)。

14.如权利要求10-13所述的方法，其中所述第二基质的阴离子金属亲和配体带有多价金属阳离子，所述多价金属阳离子选自下组：铁(III)、锰(II)、铜(II)、锌(II)、钴(II)、镁(II)、钙(II)、钡(II)、镍(II)及其组合，特别地为铁(III)。

15.如权利要求10-14中任一所述的方法，其中所述缓冲混合物与所述带金属的阴离子金属亲和第二基质的接触发生的pH值范围为pH 6.0至pH 10、pH 7.0至pH9.75、pH 8.0至pH9.5、pH 8.5至pH 9.5、pH 9.0至pH 9.5、pH 8.75至pH 9.25、pH 8.9至pH 9.1、或pH 8.95至pH 9.05，特别是pH范围为pH 8.75至pH 9.25。

16.如权利要求10至15中任一所述的方法，其中所述缓冲混合物与所述第二基质的接触发生的盐浓度范围为至多1M、或0.1至1mM至500mM、或2mM至250mM、或5mM至250、或3mM至125mM、或10mM至125mM、或5mM至60mM、或20至62、或7mM至30mM。

17.如权利要求1-16中任一所述的方法，其中通过将DNA结合至第一和/或第二基质，来去除缓冲混合物或纯化的完整AAV衣壳馏分中存在的污染DNA。

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