JP2023539838A - マルチモーダル金属アフィニティー処理ａａｖカプシド - Google Patents
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Abstract
フルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド及び空ＡＡＶカプシドを含む緩衝された混合物中の空ＡＡＶカプシドからフルＡＡＶカプシドを分離する方法であって、前記緩衝された混合物を、金属アフィニティーリガンドが結合した第１の基材と接触させるステップ、ここで前記金属アフィニティーリガンドは、３個以上の窒素原子を介して金属イオンを錯化する能力を有する、前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で、ｐＨ勾配、塩勾配、金属イオン勾配、又はそれらの組み合わせで溶出することにより、フルＡＡＶカプシドから空ＡＡＶカプシドを分離して、精製されたフルＡＡＶカプシド画分を得るステップを含む方法。前記混合物又は精製ＡＡＶカプシド画分中の混入ＤＮＡを除去するために、本発明の方法は、前記緩衝された混合物又は前記精製フルＡＡＶカプシド画分と、金属アフィニティーリガンドが取り付けられた第２の基材とを、金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で接触させることと組み合わせることができ、ここで前記金属アフィニティーリガンドは、２つ以上の負に荷電したカルボン酸残基を含む。
Description
本発明の方法は、空ＡＡＶカプシド（empty AAV capsids）及び混入ＤＮＡ（contaminating DNA）からフルＡＡＶカプシド（full AAV capsids）を分離するための改良された方法に関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療の分野におけるＤＮＡプラスミドの充填及び送達のための一般的な候補として浮上している。その精製のための多くの材料及び方法が評価又は開発されつつある。アフィニティークロマトグラフィーは、操作が簡単であるため、一般的である。最も一般的には、抗体に由来するもののような生物学的リガンドが固相クロマトグラフィー表面上に固定化され、所望のＡＡＶ及び混入物質を含有する粗試料に曝露される。原則的に、ＡＡＶは結合するが、混入物は結合しない。未結合の混入物質は洗い流される。ＡＡＶは、リガンドとＡＡＶとの間の相互作用を化学的に破壊することによって回収される。
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、多くの場合、生物学的アフィニティーの有効な代用物として認識されている［１、２］。イミノ二酢酸（ＩＤＡ）リガンド又はニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）リガンド上に固定化されたニッケルイオンによってタンパク質を捕捉できるように、タンパク質上にポリヒスチジンテール（Ｈｉｓタグ）を遺伝子的にコードするやり方が知られている。そのようなＨｉｓタグは一般に、直鎖配列中に６個以上のヒスチジル残基を含有する。Ｈｉｓタグ付きＡＡＶのＩＭＡＣ精製は公知である［３、４］。非Ｈｉｓタグ付きＡＡＶの捕捉のためのＩＭＡＣの技術は実用的な有用性を有さないと理解されている［３、４］が、これはそうでなければ、ＡＡＶ上にＨｉｓタグをコードする必要がないからである。核酸の精製のためのＩＭＡＣの使用は公知である［５、６］。
国際規制当局によって認可されたＩＭＡＣ精製Ｈｉｓタグ生成物は知られておらず、これはおそらく、Ｈｉｓタグタンパク質を捕捉するために最も一般的に推奨されるニッケルイオンが発がん性であるという事実を反映するものである。最終生成物からの完全なニッケル除去を達成するのは困難であり、またニッケルがタグに非常に強く結合してタンパク質上の他の部位に結合する可能性があることから、その証明はより困難である。有毒金属はまた、有害な廃棄物処分のためのコストを増大させ、ＩＭＡＣ－ニッケルカラムを用いて作業する人々にとっては懸念されるものである。ニッケルのような重金属イオンは、塩化ナトリウム又は塩酸グアニジニウムが飽和レベルであっても、タンパク質に結合したままである。キレート剤はそれらのレベルを低下させ得るが、キレート剤はＡＡＶカプシドの安定性を脅かし、ＡＡＶカプシドの構造的完全性を維持するためのマグネシウム及び／又はカルシウムイオンを必要とする。
バイオアフィニティークロマトグラフィー及びＩＭＡＣの両方を含むアフィニティークロマトグラフィーの別の制限要因は、アフィニティーがＡＡＶの精製要件に完全には対応できないことである。それは、治療用プラスミドＤＮＡの意図された内部ペイロードを含有する所望のフルカプシドと共に、カプシド残屑、欠陥カプシド、及び空カプシドを無差別に捕捉する。「空カプシド」という用語は、患者への送達を意図した遺伝子治療ＤＮＡプラスミドを含まないＡＡＶカプシドを指す。「カプシド残屑（capsid debris）」及び「欠陥カプシド（defective capsids）」という用語は、不正確なアセンブリ又は損傷のために不完全又は非機能性であるカプシドを指す。
アフィニティークロマトグラフィーのさらなる制限要因は、患者の安全性及び規制当局への遵守を確実にするために必要な十分に低いレベルまで混入ＤＮＡを除去することはできないことである。混入ＤＮＡは、宿主細胞由来ＤＮＡの形態であり得、又はカプシドの外側にあるプラスミドＤＮＡでありうる。ＡＡＶにはそのようなＤＮＡをそのカプシド外部表面に結合する傾向を示し、アフィニティー法によるその共精製をもたらす。カプシド外面上のこの非特異的に結合したＤＮＡはまた、空カプシドを除去するための後続の方法も妨害する。
空カプシド及び混入ＤＮＡ含量を減少させるための強アニオン交換体の使用は公知である［７～９］。空カプシドの除去は一部のＡＡＶ血清型に有効であるが、多くは部分的に有効であり、その他のＡＡＶ血清型にはほとんど有用ではない。弱アニオン交換体は、フルカプシドからの空ＡＡＶカプシドの分画には効果がないことが証明されている。
「強アニオン交換体」という用語は、約ｐＨ２～ｐＨ１３の範囲にわたって一貫した電荷を維持するアニオン交換リガンドを指す。それらは、典型的には第四級アミンの形態であって、それぞれ第四級アミノ、第四級アミノエチル、第四級アミノメチル、第四級アミノメチル、トリエチルアミノエチル、トリメチルアミノメチル、又はトリメチルアミノメチルを指す、Ｑ、ＱＡ、ＱＡＥ、ＱＡＭ、ＴＥＡＥ、ＴＭＡＭ、又はＴＭＡＥなどの市販名を有する。
「弱アニオン交換体」という用語は、高いｐＨ値で電荷を失うアニオン交換リガンドを指す。それらは、最も一般的には第三級アミンの形態であり、その最も一般的なものはＤＥＡＥ(ジエチルアミノエチル）である。ＤＥＡＥはそのような分離が一般に、ＤＥＡＥがその電荷の大部分を失っているｐＨ９又はそれ以上に近いアルカリ性ｐＨ値を必要とするので、カプシド分離に有意な有用性を有さない。所望のカプシドを望ましくないカプシドからかなりの程度まで分画することができる程度でさえ、必要なｐＨ範囲におけるその電荷の損失は、分離が製造のための実用的な価値を有さないところまでその能力を低下させる。これは、特に、強アニオン交換体による優れた性能の文脈において当てはまる。
カチオン交換クロマトグラフィーは、所望のフルカプシドからの空カプシドの実際的な分離をほとんど又は全く達成しないことが知られている。それが全く分離を提供しない限り、それは、強アニオン交換体によって提供される分離よりも劣る。
ボレート（borate）は、種々の炭水化物及びグリコシル化化合物上の特定のヒドロキシル構成と共有結合複合体を形成する能力のため、合成レクチンと呼ばれることがある。シス－ジオールとのホウ酸錯体は、負電荷を有する錯体を与える［１０］。ボレートはまた、金属キレート部位の金属イオン選択性を変化させることができる［１１］。
固定化金属イオンへの結合を促進するためのＨｉｓタグ又は他の遺伝子改変を欠くＡＡＶを捕捉するという驚くべき能力を有する、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）リガンドの使用方法が開発されている。それは、カチオン性金属アフィニティーリガンドの使用を必要とする。それは有毒な重金属の使用を必要としない。これは、ヒトの生理に不可欠な多価金属カチオン種に有効である。
本方法は、フルカプシドから空カプシドを分画し、それを行うための公知の方法よりも効果的にＤＮＡ混入を低減する、さらに驚くべき能力を提供する。本発明の基本的な方法の能力は、空カプシド及び／又はＤＮＡの含有量をさらに減少させる方法と組み合わせることによって、例えばアニオン交換クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、又は他の技術の方法と組み合わせることなどによって、複合化される。
一態様では、本発明は、フル（full）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド及び空（empty）ＡＡＶカプシドを含む緩衝された混合物（buffered mixture）中の空ＡＡＶカプシドからフルＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
前記緩衝された混合物を、金属アフィニティーリガンドが結合した（attached）第１の基材と接触させるステップ、ここで前記金属アフィニティーリガンドは、３個以上の窒素原子を介して金属イオンを錯化する能力を有する；
前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で、ｐＨ勾配、塩勾配、金属イオン勾配、又はそれらの組み合わせで溶出することにより、フルＡＡＶカプシドから空ＡＡＶカプシドを分離して、精製されたフルＡＡＶカプシド画分を得るステップ
を含む方法に関連する。以下では簡明性のため、「３個以上の窒素原子を介して金属イオンを錯化する能力を有する金属アフィニティーリガンド」という表現は「カチオン性リガンド－金属固相」とも称される。
前記緩衝された混合物を、金属アフィニティーリガンドが結合した（attached）第１の基材と接触させるステップ、ここで前記金属アフィニティーリガンドは、３個以上の窒素原子を介して金属イオンを錯化する能力を有する；
前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で、ｐＨ勾配、塩勾配、金属イオン勾配、又はそれらの組み合わせで溶出することにより、フルＡＡＶカプシドから空ＡＡＶカプシドを分離して、精製されたフルＡＡＶカプシド画分を得るステップ
を含む方法に関連する。以下では簡明性のため、「３個以上の窒素原子を介して金属イオンを錯化する能力を有する金属アフィニティーリガンド」という表現は「カチオン性リガンド－金属固相」とも称される。
本発明の方法の一実施形態では、前記緩衝された混合物を前記第１の基材と接触させる前、前記緩衝された混合物を前記第１の基材と接触させる最中、及び／又は溶出中に、前記第１の基材に多価カチオンがロードされる。
本発明の方法のさらなる実施形態では、前記固相基材は、アルカリ性ｐＨを有するバッファーで平衡化することができる。
本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記第１の基材の金属アフィニティーリガンドが、ジエチルトリアミン；トリエチルテトラミン；テトラエチルペンタミン；ポリアミドアミン、ポリトリエチルアミン、デフェロキサミン、Ｎ，Ｎ－ビス（２－アミノエチル）－１，２－エタンジアミン、及びトリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）からなる群より選択される。
本発明の方法のさらに別の実施形態では、溶出中に存在する前記多価金属カチオンが、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されうる。特に、銅（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、又はそれらの組み合わせを使用することができる。本発明の方法の一実施形態では、前記金属アフィニティーリガンドに、溶出前に１種の多価カチオンを担持させる（charge）ことができ、前記ＡＡＶカプシドを、第２の種の多価金属カチオンの濃度を上昇させることによって溶出することができる。
本発明の方法のさらなる実施形態では、前記溶出勾配が、多価金属カチオンの濃度を上昇させながら適用することによって（by applying an increasing concentration of multivalent metal cations）実施される。勾配終点における多価カチオンの濃度は、０．１ｍＭ～２００ｍＭ、又は１ｍＭ～１００ｍＭ、又は２ｍＭ～５０ｍＭ、又は５ｍＭ～２５ｍＭの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、多価イオンの種が、マグネシウム、カルシウム、もしくはバリウム、もしくは銅、又はそれらの混合物でありうる。
本発明の方法のさらに別の実施形態では、フルＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを溶出することによって分離するための前記勾配バッファー中の塩濃度は、５００ｍＭ以下の範囲であり得る。典型的には、溶出は、１ｍＭ～５００ｍＭ、２ｍＭ～２５０ｍＭ、３ｍＭ～１２５ｍＭ、５ｍＭ～６０ｍＭ、又は７ｍＭ～３０ｍＭの範囲内で塩の濃度を上昇させることによって実施される。
各血清型はそれぞれ異なる表面化学的特徴を有するため、任意の所与のＡＡＶ血清型についての塩の範囲は、実験的に決定される必要がある。この現象は、いくつかの血清型が他の血清型よりも強く結合し、除去のためにより多くの塩を必要とするイオン交換クロマトグラフィーの分野においては、周知である。溶出に必要な塩の量もｐＨに依存するが、カチオン性金属アフィニティー基材の場合では、ｐＨ依存性のパターンが、強アニオン交換体の場合とは異なる。強アニオン交換体上における結合は、ｐＨが上昇すると強くなる。ＴＲＥＮ上において最も強い結合はほぼ中性のｐＨで起こり、より高いｐＨ値及びより低いｐＨ値の両方でより弱くなる。これは、ｐＨ６又はｐＨ９のいずれかよりもｐＨ７での溶出に必要とされる塩が多いことを意味する。ｐＨ７では、ＮａＣｌの勾配終点は５００ｍＭ以上であることが適切であろう。ｐＨ９では、勾配終点は２５０ｍＭ未満が適切であり、ｐＨ６の場合も同様である。塩の濃度はまた、カチオン性金属アフィニティー基材に結合した金属イオンの選択によっても変化する。銅がカチオン性金属アフィニティー基材に結合している場合にカプシドを溶出するのに必要な塩の濃度は、一般的に、他のほとんどの金属の約３分の１よりも低い（lower than most other metals by a factor of about 3）。
本発明の方法のさらなる実施形態において、フルＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを分離するための勾配バッファーのｐＨは、ｐＨ６．０～ｐＨ１０、ｐＨ７．０～ｐＨ９．７５、又はｐＨ８．０～ｐＨ９．５、又はｐＨ８．５～ｐＨ９．５、又はｐＨ９．０～ｐＨ９．５、又はｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、又はｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５、又はｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲であり得る。溶出ｐＨは、ｐＨ勾配溶出中の塩の存在によって下方シフトされる。一般に、塩の濃度が高いほど、カプシドが溶出するｐＨの低下は大きくなる。この一般則からの例外が可能であることが当業者には理解される。典型的には、塩が１０ｍＭの濃度で利用可能である場合よりも２５ｍＭの濃度で存在する場合、カプシドはより早く溶出する、などである。塩濃度はｐＨ勾配溶出の間、一定に保たれてもよく、又はそれは独立して変動してもよい。
本発明の方法のなおさらなる実施形態では、前記緩衝された混合物又は精製フルＡＡＶカプシド画分中に存在する混入ＤＮＡは、前記ＤＮＡを前記第１及び／又は第２の基材に結合させることによって除去されうる。本発明の方法のバリエーションは、いくつかの実施形態において、前記第１の基材としてのカチオン性リガンド－金属固相上でカプシドを分画するために使用される条件と同じ条件下で、２つ以上の負に荷電したカルボン酸残基を含む金属アフィニティーリガンドが取り付けられた第２の基材に、ＡＡＶカプシドは結合することができないが、ＤＮＡは結合する、という驚くべきさらなる発見を利用して開発された。簡明性のため、用語「２つ以上の負に荷電したカルボン酸残基を含む金属アフィニティーリガンドが取り付けられた第２の基材（second substrate bearing a metal affinity ligand attached to the second substrate, which metal affinity ligand comprises two or more negatively charged carboxylic acid residues）」は「アニオン性リガンド金属固相」とも称される。
カチオン性金属アフィニティーリガンドのステップを、アニオン性金属アフィニティーリガンド上で行われるステップと組み合わせることにより、ＤＮＡ混入（DNA contamination）のより大幅な低減が達成される。第１の基材での処理の前に適用される場合、第２の基材処理は、第１の基材のカプシド結合能力を増加させ得る。
緩衝された混合物又は精製されたフルＡＡＶカプシド画分と、金属アフィニティーリガンドが結合した第２の基材との接触は、金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で行われ、前記金属アフィニティーリガンドは２つ以上の負に荷電したカルボン酸残基を含む。緩衝された混合物を、第１の基材（カチオン性リガンド金属固相）及び第２の基材（アニオン性リガンド金属固相）と同時に処理することも可能である。
したがって、第２の態様では、本発明は、前記緩衝された混合物を、金属がロードされたアニオン性金属アフィニティーリガンドを有する第２の基材と接触させることによって前処理することができ、それによって前記フルＡＡＶカプシドが前記第２の基材によって結合されないことに関する。
いくつかの実施形態では、前記第１の基材が平衡化される条件が、前記第２の基材が平衡化される条件と異なってもよい。
本発明の方法のさらなる実施形態では、前記緩衝された混合物中に存在する混入ＤＮＡが、混入ＤＮＡを第２の基材に結合させることによって除去されうる。
本発明の方法のなおさらなる実施形態では、前記アニオン性金属アフィニティーリガンドが、アミノ－ジカルボン酸及びアミノトリカルボン酸からなる群より選択されうる。
本発明の方法のなおさらなる実施形態では、前記アミノ－ジカルボン酸がイミノ二酢酸（ＩＤＡ）であり得る。
本発明の方法の別の実施形態では、前記アミノ－トリカルボン酸がニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）である。
本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記第２の基材が、ｐＨ６．０～ｐＨ１０．０、又はｐＨ７．０～ｐＨ９．５、又はｐＨ８．０～ｐＨ９．２５、又はｐＨ８．５～ｐＨ９．０、又はｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、又はｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５の範囲のバッファー、特にｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲のｐＨで平衡化される。
本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記第２の基材へのフルＡＡＶカプシドの結合を防止するためのバッファーの塩濃度が、１Ｍ以下、又は０．１ｍＭ～１．０Ｍ、又は１ｍＭ～５００ｍＭ、又は２ｍＭ～２５０ｍＭ、又は５ｍＭ～２５０、又は３ｍＭ～１２５ｍＭ、又は１０ｍＭ～１２５ｍＭ、又は５ｍＭ～６０ｍＭ、又は２０～６２、又は７ｍＭ～３０ｍＭの範囲である。
本発明の方法のさらなる実施形態では、前記第１の基材を平衡化するためのバッファー及び／又は空ＡＡＶをフルＡＡＶから分離するためのバッファーが、好ましくはカルシウム、マグネシウム、銅（第二銅）、鉄（第二鉄）、マンガン、亜鉛、バリウム、ニッケル、コバルト、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも２価の正電荷（at least two positive charges）を有する金属イオンを含む。
本発明の方法のさらなる実施形態では、前記第１の基材を平衡化するためのバッファーは、カプシドを溶出するために使用される金属カチオンの種とは異なる種の多価金属カチオンを使用する。
カチオン性金属アフィニティーステップの全体的な有効性及びアニオン性金属アフィニティーステップとのその組み合わせは、完全な多段階精製手順の文脈において一方又は両方を置くことによって増加させることができる。
１つの非限定的な例では、本発明の方法は、以下のように実施することができる。
・表面にカチオン性金属キレートリガンドＮ，Ｎ－ビス（２－アミノエチル）－１，２－エタンジアミンを有するクロマトグラフィー固相を、金属カチオンの溶液に曝露して、リガンドに金属カチオンを担持させ、その後、過剰な金属カチオンを洗い流し、リガンド：金属複合体を有する固相の表面を残す。
・カチオン性金属－リガンド固相は、同じ種の過剰な金属イオンを含有するバッファーで約９のｐＨに平衡化される。これは、２つの点で、ＩＭＡＣの分野における独特の特徴である。既知のアプローチは、その存在が標的上の結合部位について固定化された金属イオンと競合すると予想されることから、金属イオンを実行バッファーから特に省くことである。それはまた、ＩＭＡＣの多くの例において毒性である過剰な金属イオンを含有する溶出生成物をもたらす。操作ｐＨが９．０であることも独特である。試料は、通常、中性に近いｐＨでＩＭＡＣカラムに適用される。これは、処理のいずれの段階でも強アルカリ性ｐＨ条件を用いる唯一の公知のＩＭＡＣ法である。
・空カプシド、フルカプシド、及び混入ＤＮＡのいくつかの組み合わせを含有する試料は、カチオン性金属－リガンド固相とほぼ同じ条件に平衡化される。
・試料をカチオン性金属－リガンド固相上にロードする。ＡＡＶカプシドは保持される。未結合の混入物質は保持されず、カチオン性金属－リガンド固相から濯がれる。
・空ＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドは、ｐＨを約９に維持しつつ非キレート化塩勾配の濃度を上昇させることによって、互いから分画される。非キレート化塩の濃度の上昇が固定されたｐＨで固定化された金属からタンパク質を溶出させないので、これはＩＭＡＣの分野における別の独特の特徴である。この特定の用途において、固定化された金属イオンは、フルカプシドからの空カプシドの分離を容易にする方法で、空カプシドに対する選択的な弱い誘引を媒介し、一方、固定化された金属はまた、ＤＮＡに対する高アフィニティー結合部位も提供すると思われる。
・表面にカチオン性金属キレートリガンドＮ，Ｎ－ビス（２－アミノエチル）－１，２－エタンジアミンを有するクロマトグラフィー固相を、金属カチオンの溶液に曝露して、リガンドに金属カチオンを担持させ、その後、過剰な金属カチオンを洗い流し、リガンド：金属複合体を有する固相の表面を残す。
・カチオン性金属－リガンド固相は、同じ種の過剰な金属イオンを含有するバッファーで約９のｐＨに平衡化される。これは、２つの点で、ＩＭＡＣの分野における独特の特徴である。既知のアプローチは、その存在が標的上の結合部位について固定化された金属イオンと競合すると予想されることから、金属イオンを実行バッファーから特に省くことである。それはまた、ＩＭＡＣの多くの例において毒性である過剰な金属イオンを含有する溶出生成物をもたらす。操作ｐＨが９．０であることも独特である。試料は、通常、中性に近いｐＨでＩＭＡＣカラムに適用される。これは、処理のいずれの段階でも強アルカリ性ｐＨ条件を用いる唯一の公知のＩＭＡＣ法である。
・空カプシド、フルカプシド、及び混入ＤＮＡのいくつかの組み合わせを含有する試料は、カチオン性金属－リガンド固相とほぼ同じ条件に平衡化される。
・試料をカチオン性金属－リガンド固相上にロードする。ＡＡＶカプシドは保持される。未結合の混入物質は保持されず、カチオン性金属－リガンド固相から濯がれる。
・空ＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドは、ｐＨを約９に維持しつつ非キレート化塩勾配の濃度を上昇させることによって、互いから分画される。非キレート化塩の濃度の上昇が固定されたｐＨで固定化された金属からタンパク質を溶出させないので、これはＩＭＡＣの分野における別の独特の特徴である。この特定の用途において、固定化された金属イオンは、フルカプシドからの空カプシドの分離を容易にする方法で、空カプシドに対する選択的な弱い誘引を媒介し、一方、固定化された金属はまた、ＤＮＡに対する高アフィニティー結合部位も提供すると思われる。
この方法はまた、任意のＩＭＡＣリガンド上の任意の固定化された金属種からの任意のタンパク質含有種の差次的分画を達成することが知られている唯一のＩＭＡＣ方法として独特である。今日までのＩＭＡＣの分野は、結合するか又は結合しないかのいずれかであるタンパク質によって特徴付けられている。結合するタンパク質は、固定化された金属との相互作用を停止させる単一のステップによって溶出される。密接に関連するタンパク質含有種の差次的溶出を達成するための先行技術は、当技術分野を定義する文献において見出されていない。
別の非限定的な例では、本発明の方法は、以下のように実施することができる：
・表面にアニオン性金属キレート化リガンドイミノ二酢酸を有するクロマトグラフィー固相を、金属カチオンの溶液に曝露して、リガンドに金属カチオンを担持させせ、その後、過剰な金属カチオンを洗い流し、リガンド：金属複合体を有する固相の表面を残す。
・アニオン性金属－リガンド固相は、同じ種の過剰な金属イオンを含有するバッファーで約９のｐＨに平衡化される。
・空カプシド、フルカプシド、及び混入ＤＮＡのいくつかの組み合わせを含有する試料は、アニオン性金属－リガンド固相とほぼ同じ条件に平衡化される。
・試料をアニオン性金属－リガンド固相上にロードする。ＡＡＶカプシドは流れて通過する。ＤＮＡは結合される。
・カラムが濯がれて非結合ＡＡＶカプシドが完全に回収され、上記のカチオン性金属－リガンド固相方法によって分画される。
・表面にアニオン性金属キレート化リガンドイミノ二酢酸を有するクロマトグラフィー固相を、金属カチオンの溶液に曝露して、リガンドに金属カチオンを担持させせ、その後、過剰な金属カチオンを洗い流し、リガンド：金属複合体を有する固相の表面を残す。
・アニオン性金属－リガンド固相は、同じ種の過剰な金属イオンを含有するバッファーで約９のｐＨに平衡化される。
・空カプシド、フルカプシド、及び混入ＤＮＡのいくつかの組み合わせを含有する試料は、アニオン性金属－リガンド固相とほぼ同じ条件に平衡化される。
・試料をアニオン性金属－リガンド固相上にロードする。ＡＡＶカプシドは流れて通過する。ＤＮＡは結合される。
・カラムが濯がれて非結合ＡＡＶカプシドが完全に回収され、上記のカチオン性金属－リガンド固相方法によって分画される。
本発明の基本バージョンを実施するためのカチオン性金属アフィニティーリガンドは、会合しているか又は会合するようになっていてもよい任意の金属カチオンとは独立して正電荷を少なくとも１価有する、アミノ系誘導体のファミリー由来のものである。１つ以上の正に荷電したアミノ残基は、１つ以上の第一級アミノ残基、第二級アミノ残基、第三級アミノ残基、第四級アミノ残基、イミド、又はイミンからなり得る。カチオン性アミノ残基は、任意の組み合わせ又はコンフォメーションでの前述の残基の任意の組み合わせを含み得る。カチオン性アミノ残基のうち少なくとも１つは、ｐＨ９．０で正電荷を維持しなければならない。リガンドはまた、正荷電アミノ誘導体が少なくとも１つ存在する限り、非荷電アミド窒素残基を含んでもよい。これらの要件を満たすカチオン性アミノ系リガンドの例としては、ジエチルトリアミン；トリエチルテトラミン；テトラエチルペンタミン；ポリトリエチルアミン、ポリアミドアミン；デフェロックス又はデスフェラールとしても知られるデフェロキサミン；及び２，２’，２’－ニトリロトリエチルアミン、又は２，２’，２’－トリアミノトリエチルアミン、又はトリス（２－アミノエチル）アミン、又はＴＡＥＡ、又はＴＲＥＮとしても知られるＮ，Ｎ－ビス（２－アミノエチル）－１，２－エタンジアミンが挙げられる。
上記のカチオン性金属アフィニティーリガンドはいずれも、そのアミノ基の１つ以上を介して固相クロマトグラフィー表面に直接共有結合され得る。あるいは、それらはリガンドをより接近可能にするために、又は多価直鎖触手状、分枝状、もしくはデンドリマー状構成を作り出すために、直鎖状又は分枝状ポリマーを介して固相表面に間接的に連結されてもよい。デンドリマー状（dendrimeric）という用語は、枝が他の枝から分岐して枝の深いネットワークを生成し、各枝末端がリガンドを担持する樹形分岐パターンを指す。公知の例としては、世界的な供給業者から市販されているトリエチルアミン末端デンドリマー（ポリトリエチルアミン、ｐＴＥＡ）及びポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーが挙げられる。同じアプローチをアニオン性金属アフィニティーリガンドに適用することができる。
一実施形態では、カチオン性金属アフィニティーリガンドはＴＲＥＮである。非固定化リガンドは、中心の第三級アミンからエチル基を介して分岐する３種類の第一級アミン残基を含む。クロマトグラフィー固相上でのリガンドの固定化は以下の構成のいずれか一つ又は複数の組み合わせを含む：
１つの第一級アミノ残基を固相に連結させること、並びに、第三級アミノ残基に結合した１つのエチル基及び末端第一級アミノ残基に続く２つの別のエチル基が結合した第二級アミノ基に、前記残基を変換すること；
２つの第一級アミノ残基を固相に連結させること、並びに、それぞれに第三級アミノ残基に続く１つのエチル基及び末端第一級アミノ残基に続く１つの別のエチル基が結合した第二級アミノ基に、前記残基を変換すること；及び
それぞれにエチル基を介して中心の第三級アミノ残基に続く３つの第一級アミノ残基を固相に連結させること（図１）。
１つの第一級アミノ残基を固相に連結させること、並びに、第三級アミノ残基に結合した１つのエチル基及び末端第一級アミノ残基に続く２つの別のエチル基が結合した第二級アミノ基に、前記残基を変換すること；
２つの第一級アミノ残基を固相に連結させること、並びに、それぞれに第三級アミノ残基に続く１つのエチル基及び末端第一級アミノ残基に続く１つの別のエチル基が結合した第二級アミノ基に、前記残基を変換すること；及び
それぞれにエチル基を介して中心の第三級アミノ残基に続く３つの第一級アミノ残基を固相に連結させること（図１）。
第一級アミノ基、第二級アミノ基、及び第三級アミノ基は全て、それらの個々のｐＫａ値に従う様々な程度で弱いアニオン交換基であることが、当業者によって認識されるであろう。ＴＲＥＮは、約ｐＨ９以下の正電荷を維持するものとして市販の文献に示されている。このことはＴＲＥＮの予想外の有用性を強調する。それは、弱いアニオン交換体ＤＥＡＥ（これもまた約ｐＨ９まで正電荷を維持する）がフルカプシドａからの空カプシドの分離のための実用的な有用性を欠くことが、当該分野において一般に認識されているためである。このことはまた、ＴＲＥＮの挙動が、一般に知られている弱アニオン交換体とは全般的に異なることを強調している。これは、多価金属カチオンに結合する構成で弱アニオン交換基の組合せを組み合わせるマルチアミノリガンドが、本発明の方法がその独特の結果を達成することを可能にする特有の特徴に寄与するものであることを示唆する。
ＴＲＥＮを有するクロマトグラフィー固相は、商業的供給業者、すなわち＜https://www.bio-works.com/product/iex-resin/workbeads-tren＞から入手可能である。他の多くの世界的なクロマトグラフィー媒体供給者がアニオン交換体を生産し販売しており、このことは、本発明の方法を実施するのに適したクロマトグラフィー製品を合成する技術が広く利用可能であることを実証している。
本発明の化合物バージョンを実施するためのアニオン性金属アフィニティーリガンドは、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）によって例示される、正電荷を欠くアミノ－ジカルボン酸のファミリーに由来するもの、又はニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）によって例示される、正電荷を欠くアミノ－トリカルボン酸のファミリーに由来するものである。
ＩＤＡ及びＮＴＡなどのアニオン性金属アフィニティーリガンドを有するクロマトグラフィー固相は、世界中のすべての主要な商業的クロマトグラフィーの供給業者から広く入手可能である。
本発明の方法は、バリウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、及び／又は亜鉛を含む多種多様な多価金属イオンのいずれか、又は任意の組合せで実施することができる。このリストは、非毒性金属を支持する。有毒な重金属は肯定的な結果をもたらすかもしれないが、その使用は、最終製品からのそれらの除去を証明するための余分な作業を作り出すことから、推奨されない。既知のヒトの栄養価、治療的価値、又は一般的な健康価値を有する金属が一般に好まれ、それらの中で、最も好まれる種は、任意の特定のＡＡＶ血清型について空カプシドとフルカプシドの最良の分離及び／又はＤＮＡの最良の低減を提供する種である。
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムを平衡化し、溶出を行うためのバッファーはまた、金属イオンを含有しうる。いくつかのそのような実施形態では、金属イオンの種（species）は、固相リガンドが担持しているものと同じである。いくつかの実施形態では、金属を固相リガンドに担持させるための先行ステップを実施する代わりに、金属を固相リガンドに担持させるためにそのようなバッファーを使用しうる。いくつかの実施形態では、平衡バッファー及び勾配バッファー中の金属イオンの種は、互いに異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、カチオン性金属アフィニティーリガンドには、試料をカチオン性金属アフィニティー基材と接触させる前に、多価金属カチオンを担持させうる。他の実施形態では、カチオン性金属アフィニティーリガンドには、試料中の過剰な多価金属カチオンによって、多価金属カチオンを担持させうる。他の実施形態では、カチオン性金属アフィニティーリガンドに、試料をカチオン性金属アフィニティー基材と接触させた後で、多価金属カチオンを担持させうる。１つのそのような実施形態においては、溶出を開始する前に、カチオン性金属アフィニティーリガンドに、洗浄バッファーを用いて多価金属カチオンを担持させうる。密接に関連する実施形態では、カチオン性金属アフィニティー基材には、勾配開始バッファー中に多価金属カチオンを含ませることによって多価金属カチオンを担持させうる。別のそのような実施形態では、カチオン性金属アフィニティー基材には、勾配終点バッファー中にその含有物が含まれることによって、多価金属カチオンを担持させうる。
様々な実施形態において、フルカプシドは、ｐＨ勾配を上昇させることによって、又は塩勾配を上昇させることによって、又は多価金属カチオンの勾配を上昇させることによって、溶出され得る。
いくつかの実施形態では、勾配開始バッファーは、０．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、又は２．５ｍＭ～７．５ｍＭ、又は４．０ｍＭ～６．０ｍＭ、又はより低い、より高い、もしくは中間の範囲の濃度の、多価金属カチオンを含有し得る。最初のスクリーニングは、約５ｍＭで行ってもよい。この濃度での結果に基づいて、最も望ましい結果を達成するために、金属含有量を上下に調節することができる。勾配開始バッファー中の金属イオンの濃度は、勾配終了バッファー中の金属イオンの濃度と同じであってもよい。
いくつかの実施形態では、金属塩を溶出剤として使用することができ、金属塩がＡＡＶカプシドの表面電荷特性を変化させてフルカプシドからの空カプシドの分離を改善することから好ましい場合がある。多価金属がカプシドの表面上の金属結合部位に結合する各事象は、カプシド上のジカルボキシ金属結合部位又はトリカルボキシ金属結合部位の等しい数の負電荷を中和する。負電荷はカチオン性金属アフィニティーリガンドとの相互作用に寄与するので、そのような金属結合はリガンドへのカプシドの誘引を低減する。この機構は、非金属塩による溶出とは基本的に異なる。それは、非金属塩は全体としてバルク移動相中の導電率を増加させることによってのみ作用するためである。非金属塩イオンは、電荷が存在する場所、それらのうちのいくつが互いに近接して存在するか、又はそれらが正であるか負であるかに関わらず、あらゆる種類のイオン相互作用を抑制する減衰場を作り出す。非金属塩による溶出は、場が特異的でない現象（non-specific field phenomenon）である。これは、カプシド表面上の金属結合部位に連関するアミノカルボキシル残基の局所電荷を中和する金属塩の局所的であり特異的である能力とは基本的に異なる。これは、金属塩が非金属塩よりも低い濃度でカプシドを溶出することができる理由を説明する。
溶出が金属イオンの濃度を増加させることによって行われるいくつかの実施形態では、勾配は、０ｍＭ～２００ｍＭ、又は０ｍＭ～１００ｍＭ、又は０ｍＭ～５０ｍＭ、又は０ｍＭ～２５ｍＭ、又は１ｍＭ～２５ｍＭ、又は２ｍＭ～２０ｍＭ、又は５ｍＭ～１５ｍＭ、又はより低い、より高い、又は中間の範囲の範囲をカバーし得る。最初のスクリーニングは、０ｍＭ～２５ｍＭの勾配範囲で行ってもよい。この濃度での結果に基づいて、勾配開始バッファー及び勾配終了バッファーの金属含有量を、最も望ましい結果を達成するために、上側又は下側に調整することができる。
いくつかの実施形態では、金属アフィニティーリガンドは、受動的に金属イオンを担持させられてもよく、これは試料を導入する前に別個の金属担持ステップを有するのではなく、固相が平衡化バッファー中に金属イオンを含めることによって、緩衝平衡化中に金属が固相にロードされてもよいことを意味する。当業者は、用語「平衡化バッファー」がクロマトグラフィー法の意図される使用を可能にする特定の化学的環境を作り出す目的でクロマトグラフィー装置に通されるバッファーを表すと認識するであろう。
いくつかの実施形態では、試料中に含有される金属イオンは、非担持カチオン性金属アフィニティーリガンド（uncharged cationic metal affinity ligands）を、本発明の方法を実施するためのそれらの金属複合体形態へと変換し得る。これは、試料への金属イオンの意図的な添加を通して起こり得るか、又は細胞培養回収物、溶解物、及び部分的に精製された試料中に不注意に残存する金属を通して不注意に起こり得る。
金属種の選択が部分的に、本発明の方法を全体的な多段階精製プロセスの何処に配置することが望まれるかに依存しうることは、精製手順の開発に精通している人々には明らかであろう。実験データは、ＤＮＡ及びエンドトキシンを含むその他のリン酸化した混入物質に対して第二鉄及びマンガンがより高いアフィニティーを有することを示す。これは、すでに高度に精製された試料を精製するためにこの方法が使用される場合、これらの金属が有利であり得ることを示唆する。高いＤＮＡ含量がカラムの全体的な結合能力の過剰な割合を消費する可能性があるため、鉄又はマンガンを使用して粗供給流からＡＡＶを捕捉する場合には、ＤＮＡに対する高いアフィニティーは有利ではない可能性がある。そのような場合、ＤＮＡに対するアフィニティーがより低い金属、例えば、限定されないが、カルシウム又はマグネシウムが、より有利であることが判明し得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ除去の効率は、カチオン性金属アフィニティー基材を用いての試料処理をアニオン性金属アフィニティー基材による処理と組み合わせることによって高められ得る。
いくつかの実施形態では、アニオン性金属アフィニティーリガンド上では鉄及びマンガンなどの強いＤＮＡ結合金属を使用し、カチオン性金属アフィニティーリガンド上ではカルシウム及び／又はマグネシウムなどのＡＡＶ安定化金属を使用することが、有利であり得る。
カチオン性金属アフィニティーリガンドに関する本発明の方法は、ｐＨ６．０～１０．０、又はｐＨ７．０～ｐＨ９．７５、又はｐＨ８．０～ｐＨ９．５、又はｐＨ８．５～ｐＨ９．５、又はｐＨ９．０～ｐＨ９．５、又はｐＨ９．０～ｐＨ９．５、又はｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、又はｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５の範囲のｐＨ値、又はより高い、より低い、又は中間の範囲のｐＨ、好ましくはｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲のｐＨで実施されてよい。初期評価の目的のために、約９．０のｐＨでのスクリーニングが推奨され、結果を最適化する目的のために、より低い値及びより高い値を評価することがさらに推奨される。
アニオン性金属アフィニティーリガンドに関する本発明の方法はｐＨ６．０～ｐＨ１０、又はｐＨ７．０～ｐＨ９．５、又はｐＨ８～ｐＨ９．２５、又はｐＨ８．５～ｐＨ９．５、又はｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、又はより狭い、より広い、又は中間の範囲で実施することができる。
いくつかの実施形態では、本方法はその全体が、本質的に一定のｐＨで実施される。このような一例では、カラム及び試料が約ｐＨ９に平衡化される。次いで、カラムにロードし、洗浄し、ｐＨ９．０で塩の上昇勾配を用いて溶出を行う。
いくつかの実施形態では、カチオン性金属アフィニティーリガンドに適用される方法を実施するためのカラム及び試料は、最初にｐＨ６．０～７．０の範囲などのより低いｐＨ値に平衡化され得、カラムにロードされた試料及びカラムは未結合の混入物質を除去するために洗浄され、次いで、ロードされたカラムは溶出ステップのための準備において、より高いｐＨ値に再平衡化される。ＡＡＶはｐＨ７．０、ｐＨ８．０、又はｐＨ９．０よりもｐＨ６．０でカチオン性リガンド－金属複合体により強く結合するので、これは容量を増加させる予想外の利点をもたらす。ｐＨの低下に伴う容量の増加は、プロトン化の根底にある増加を反映した、水素結合の増加に起因すると仮定される。試料が結合すると、カラムは、空カプシドとフルカプシドの分離を最大にするために所望される任意の条件に再平衡化され得る。驚くべきことに、固相ＴＲＥＮ－金属表面が、中性又はアルカリ性ｐＨよりも酸性ｐＨでより強くＤＮＡに結合することが見出されたので、低ｐＨ試料結合はＤＮＡを除去するためのさらなる有用性を有する。
いくつかの実施形態では、カチオン性金属アフィニティーカラムはｐＨ９などのアルカリ性ｐＨで平衡化され得るが、ロードされる試料はｐＨ７などのより低いｐＨ値であり得る。試料のより低いｐＨは、試料ロード中に、より低いｐＨへのカラムの一時的な再平衡化を引き起こす。実験データはＡＡＶがｐＨ７などのより低いｐＨ値でＴＲＥＮにより強く結合することを示し、これは一般に結合能力を増加させると理解されている。試料ロード段階が終了すると、平衡化バッファーの流れの回復が試料ロードの一時的効果を克服し、カラムをｐＨ９に再平衡化する。試料をロードする前にｐＨ７でのバッファー平衡化を必要としないので、これがより簡素化されたワークフローをもたらすことは、当業者によって認識されるであろう。
一実施形態では、多価金属カチオンをロードしたカチオン性金属アフィニティー固相がトリスホウ酸バッファーでｐＨ９．２に平衡化され、ここでトリスホウ酸バッファーを使用する特定の目的は低イオン強度で強い緩衝能を提供することである。このような一実施形態では、バッファー自体は多価金属カチオンを含有しない。一実施形態では、略生理学的条件で空ＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドを含有する試料が適用され、ここで、略生理学的という用語は、約ｐＨ６．５～ｐＨ７．５の範囲内のｐＨ、及び約５０ｍＳ／ｃｍ～約２００ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を意味すると理解される。試料は追加的なバッファー剤を含有してもよいが、含有は必須ではない。カラムへの試料の適用はカラムのｐＨ及び導電率条件に対してカラムを非平衡化し、その後、平衡化バッファーの流れの再開は、溶出勾配を開始するための準備において、カラムをその元の平衡化条件に復元する。このような一実施形態では、カラムが多価金属カチオンへの線形勾配で溶出される。このような一実施形態では、金属カチオンはマグネシウムである。このような一実施形態では、金属カチオン勾配の後に、塩化ナトリウムなどの非金属塩の勾配又はステップを続けることができる。別の実施形態では、金属カチオン勾配に続いて、ＮａＯＨなどの洗浄剤へのステップを行うことができる。いくつかのそのような実施形態では、その洗浄能力を高める意図を持って、ＮａＯＨが他の薬剤、例えば塩化ナトリウムを伴ってもよい。いくつかのそのような実施形態では、洗浄バッファーが１ＭのＮａＯＨ及び１～３ＭのＮａＣｌを含有し得る。
より低いｐＨ値でのより強い結合が、既知のアニオン交換体上におけるタンパク質挙動に基づく予想に直接反することは、当業者によって認識されるであろう。アニオン交換体上のタンパク質保持は、ｐＨの低下に伴って弱くなることが理解されている。それらを溶出するために低ｐＨがしばしば使用されることから、より低いｐＨ値でのより強い結合は、既知の金属アフィニティークロマトグラフィー媒体の挙動とも異なっている。これらの知見は、カチオン性リガンド－金属複合体を有するクロマトグラフィー固相はＩＭＡＣ及びアニオン交換の両方に遡る影響を示すが、カチオン性リガンド－金属複合体はいずれかとは異なる正味の選択性を生じる、という点を強調する。
ＡＡＶが９未満のｐＨ値で捕捉されるいくつかの実施形態では、カチオン性金属アフィニティーカラムが塩勾配ではなく、ｐＨ勾配の増加で溶出され得る。１つのそのような例では、金属をロードしたカラムが、約１５ｍＭ塩化ナトリウムを含有するバッファー中で約６のｐＨに平衡化される。試料条件はほぼ同じでありうる。カラムにＡＡＶカプシドをロードし、未結合の試料成分を除去するために洗浄した後、カラムを、約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ約９のバッファーに向かってｐＨ勾配を上昇させて溶出させ、換言すれば、塩濃度を一定に保ちながらｐＨ勾配を上昇させて溶出させる。複合ｐＨ溶出は、塩濃度がｐＨと並行して増加するときにも起こる。ｐＨを増加させながら塩濃度を増加させ、ｐＨを増加させながら塩濃度を減少させること、又はｐＨ及び塩濃度を独立して変化させる一連のステップで溶出すること、を含むが、これらに限定されない、このアプローチの多くの変形が可能であることは、認識されるであろう。また、この特徴が、ｐＨの上昇がＡＡＶをより強く結合させる強アニオン交換体上でのアニオン交換クロマトグラフィーと、本発明の方法とを、さらに区別することも、認識されるであろう
上記の範囲のそれぞれにおいて良好な緩衝能力を提供するバッファー化合物及び／又はバッファー化合物の組み合わせは、当技術分野において公知である。ｐＨ９の領域における緩衝能に寄与することが知られている能力を有する化合物としては、グリシン（ｐＫａ＝９．６）、アルギニン（ｐＫａ＝９．１）、ビストリスプロパン（ｐＫａ＝９．０）、及びホウ酸（ｐＫａ＝９．１５～９．２５）が挙げられる。そのようなバッファーは２０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で、当技術分野を通して一般に使用されるが、特別な要件の必要性を満たすために、濃度を減少又は増加させることができる。一般的に、カチオン性バッファーはカチオン性表面を使用するクロマトグラフィー、例えば、本発明の方法のために特定されたクロマトグラフィー固相と組み合わせて使用するのに好ましい。これは、上記リストからの最初の３種の使用に有利である。ホウ酸はアニオン性であり、負に帯電している。カチオン性クロマトグラフィー表面と共にアニオン性バッファーを使用することにおいてありうる制限要因は、バッファーと表面との間の相互作用が移動相からバッファーの大部分を抽出し、移動相に残るバッファーが不十分となることである。しかしながら、クロマトグラフィー表面と反対の電荷を有するバッファーを使用することは、所与の分離の利益に役立つ独特の選択性を時にはサポートし得ることも真実である。アニオン性及びカチオン性バッファー種の組み合わせ、並びに双性イオン性バッファーの使用及び双性イオン性バッファーとカチオン性及び／又はアニオン性バッファーとの組み合わせも可能である。ｐＫａが９に近い双性イオンバッファーとしては、とりわけ、３－（［１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ、ｐＫａ＝９．３６）、及びＮ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ、ｐＫａ＝９．４３）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、バッファーが特に、低い導電率で良好な緩衝能を提供するそれらの能力に基づいて選択され得る。このような一実施形態では、ホウ酸が約９．０～９．２のｐＨでバッファーとして使用される。１つのそのような実施形態では、トリスがバッファーのｐＨを選択された標的ｐＨまで滴定するための対イオンとして使用されるが、これはトリスがまた、低いモル導電率を具現化し、その緩衝容量がｐＨ９．０～９．２の範囲のｐＨ値でゼロであるからである。
ボレートバッファーが使用されるいくつかの実施形態では、ボレート化学の技術分野の知識を有する者は、ボレートアニオンがいくつかの炭水化物上に見られるようなシスジオールと共有結合を形成する能力のために合成レクチンと呼ばれることがあることを認識するであろう。そのような結合の形成は、以前に非担持ヒドロキシル基（uncharged hydroxyl groups）が２つ存在した位置に負のボレートを担持する（negative borate charge）複合体を与える。前記結合は共有結合であるので、高塩濃度への曝露に耐える。シス－ジオール炭水化物を有するＡＡＶカプシドの静電荷はより電気的に陰性になり、それらの正味の電気陰性度は、任意の所与のカプシドの表面上のシス－ジオールボレート結合事象の数に従って増強されることが理解されるであろう。空カプシド及びフルカプシドがシス－ジオール糖で差次的に与えられる程度まで、ホウ酸アニオンとの共有結合の形成は、それらの相対的電気陰性度を変化させ、カチオン性クロマトグラフィー支持体上でのそれらの相対的保持を変化させ得ることがさらに理解されるであろう。空カプシドにシス－ジオールが比較的豊富である限り、その保存が増加することが予測される。
ボレートバッファーが使用される他の実施形態では、ボレートアニオンがいくつかの状況においてキレート剤及びキレート部位を有する化合物による金属結合の選択性を変更することが知られていることを、ボレート化学の技術分野の知識を有する者は認識するであろう。ひいては、そのような修飾は、金属をキレート化する能力を有する、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むタンパク質の表面上の部位を、潜在的に含むと理解されるべきである。空カプシド及びフルカプシドがそれらの金属キレート部位に関して異なる限り、ボレートによるそれらのそれぞれの金属結合部位の金属結合選択性のさらなる修飾は、クロマトグラフィーによる空カプシドとフルカプシドの分離に影響を及ぼし得る。
一実施形態では、上昇する塩の勾配でクロマトグラフィー固相を溶出することによって、空カプシドとフルカプシドの分離をカチオン性金属アフィニティー固相上で実施され、ここで塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、又は酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムである。一般的に、塩化ナトリウムは始めるのに適切な種であり、他のものを評価する必要はない。しかしながら、そうすることは、関心のある結果を生じ得る。異なる血清型由来のＡＡＶカプシドはアニオン交換体に対して異なるアフィニティーを有することが知られており、したがって、開始点として、１Ｍの塩化ナトリウムで終わるものなどの広範な勾配が望ましいことが理解されるであろう。終点は、空カプシドとフルカプシドとの間の分離を最大にするために、後から調節することができる。ＡＡＶ血清型２／８のある一例では、最初の５０カラム体積（ＣＶ）直線勾配を１Ｍ ＮａＣｌの終点まで実行した。その後の実験において、勾配長は維持されたが、終点は５００ｍＭ ＮａＣｌに減じられ、別のその後の実験では、２５０ｍＭにまで減じられた。この性質の実験は、通常のプロセス開発の日常的な部分である。一般的な問題として、フルカプシドから空カプシドを分離し、フルカプシドの良好な回収を達成する最低塩濃度を有する勾配終点は、このような条件が固相に結合したＤＮＡの割合を最大としたまま残すはずであるので、好ましい。
いくつかの実施形態では、無機塩の代わりに、アルギニン、ヒスチジン、又はリシンを溶出剤として使用することができる。
金属カチオンを結合する強力な能力を有する塩は、固相リガンドに結合した金属を除去する傾向があるため、推奨されない。それらはまた、ＤＮＡを時期尚早に溶出する傾向があり、潜在的に、本方法が可能であるべきＤＮＡ除去のレベルを達成することを妨げる。特に懸念される塩には、クエン酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、別名エグタジル酸（ＥＧＴＡ）であるエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’－四酢酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、及び他の公知のキレート化塩が含まれる。
本発明の方法を実施するために使用されるバッファーは、ＡＡＶカプシドを安定化するか、又はクロマトグラフィー表面とＡＡＶカプシドとの非特異的相互作用を抑制するための化合物を含有し得る。このような安定化化合物には、非イオン性又は双性イオン性界面活性剤、例えば、とりわけ、オクタグルコシド、ポロキサマー１８８、プルロニックＦ６８、ＣＨＡＰＳ、又はＣＨＡＰＳＯが含まれ得る。そのような安定化化合物はその代わりに、又はそれに加えて、糖、例えば、とりわけ、スクロース、ソルビトール、キシロース、マンニトール、又はトレハロースを含み得る。そのような安定化化合物はその代わりに、又はそれに加えて、とりわけ、ベタイン、タウロベタイン、アルギニン、ヒスチジン、又はリシンなどのアミノ酸を含み得る。４．０～７．５のｐＨ範囲では、それらはグリシン及びアラニンも含み得る。これらの剤は全て、安定な生成物の溶解性及び／又は回収を改善する傾向があるため、バイオ医薬分野で知られている。場合によっては、それらはまた、望ましくない種からの所望の生成物の分画を改善する。それらは、典型的には本発明の方法の実施を妨げる可能性が低い低濃度で使用される。
一実施形態では、糖又は尿素などの非イオン性又は双性イオン性の強い水素供与体－受容体の勾配を上昇させることによって、カチオン性リガンド－金属固相からＡＡＶカプシドを溶出することが可能であり得る。この実施形態は最初に、カラムにＡＡＶカプシドをロードし、次いで、ｐＨ及び塩濃度を、フルカプシドが溶出しない最高レベルまで上昇させることを必要とする。その時点から、尿素、又は糖、又は別の非イオン性水素供与体－受容体へのステップ又は勾配の適用によって、フルカプシドを溶出させることができる。１つのそのような実施形態において、フルカプシドは、同ｐＨ及び塩濃度で３００ｍＭまでのソルビトールの勾配で溶出される。別のそのような実施形態において、フルカプシドは、同じｐＨ及び塩濃度で１０Ｍまでの尿素の勾配で溶出される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、２つの異なる金属種の影響を同時に利用することができる。このような実施形態では、カチオン性金属アフィニティー基材に第二鉄を担持させ、一方、マグネシウムの濃度を増加させることによって生成される勾配を用いてＡＡＶカプシドの溶出を行う。密接に関連する実施形態において、カチオン性金属アフィニティー基材に担持させるために使用される金属は、マンガンであってもよい。他の密接に関連する実施形態において、ＡＡＶカプシドの溶出を実施するために使用される金属は、カルシウム又はバリウム又は銅であり得る。
本発明の有効性を実証するための分析は、公知の技術を用いて行うことができる。１つの一般的な方法は、クロマトグラフィー画分にわたって２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の比を測定することである。ＡＡＶカプシドは、ＵＶ光に対して部分的に透明である。これは、カプシド内部のＤＮＡ並びに外部タンパク質カプシド壁に関連するＤＮＡを検出するためのクロマトグラムの標準的なＵＶモニタリングを可能にする。空カプシドは一般に、１未満、典型的には０．６～０．８の範囲の２６０／２８０比を示す。高度に精製されたフルカプシドは、典型的には１．３より大きい２６０／２８０比を示す（図２）。比率が高いほど、対応するクロマトグラフィー画分中のフルカプシドの割合が高くなる。例えば、１．３５の比は、１．３３の比を有する画分よりも大きい割合のフルカプシドを含有すると理解され、次いで、１．３１などの比を有する画分よりもフルカプシドがより富化されている。フルカプシド及び空カプシドの二次確認は、分析超遠心分離（ＡＵＣ）及び低温透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏＴＥＭ）を含み得る。ＡＡＶカプシドの外側のＤＮＡはまた、約１．５～２．２の範囲の特有の２６０／２８０比を有し、純粋なＤＮＡの比は２．０をわずかに超えることから、波長比は、混入ＤＮＡがクロマトグラムにおいて溶出する箇所を示すためにも使用され得る。
カプシド外面に付着したＤＮＡの量は、クロマトグラフィーの前にピコグリーンと呼ばれる色素で試料をプレインキュベートすることによって推定することができる。ピコグリーンは、ＤＮＡの塩基対の間にそれ自体を挿入することができる染料のクラスの１つである。この挿入プロセスは、インターカレーションとして知られている。ピコグリーン自体は光学的に重要な性質を持たないが、ＤＮＡの塩基対の間にあるピコグリーンは、ＤＮＡの検出を増幅するのに用いることができる緑色の蛍光を発生する（図３）。ピコグリーンは、カプシド外のＤＮＡのみを検出することが実験的に示されている。したがって、ＵＶ及びピコグリーンの両方によるＤＮＡ含有量の推定は、いずれかの方法単独よりも深い知見を与える情報を提供することができる。
ＵＶ吸光度に対してのピコグリーン蛍光の比は、カプシド自体に対してのカプシド外のＤＮＡの相対量を示すために、例えば本発明の方法の実施から得られた一連の画分にわたって、プロットすることもできる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＤＮＡ混入の量を低減するために試料を最初に処理した後に、実施することができる。１つのそのような実施形態において、試料は、ＤＮＡａｓｅ酵素で前もって処理される。別のそのような実施形態では、ＤＮＡを粒子に結合させてから該ＤＮＡが結合した該粒子を除去することによってＤＮＡを除去する目的で、試料が正に荷電した固相粒子で前もって処理される。関連する実施形態では、ＤＮＡとポリマーとの大きな不溶性複合体を形成して沈殿させ、遠心分離によって、又は濾過によって、又はその２つの組み合わせによって除去できるようにするする目的で、試料が正に荷電したポリマーで処理される。
１つの化合物の実施形態では、ＡＡＶカプシド及びＤＮＡを含有する試料をまず電気陽性固相で処理して、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による処理を容易にし、次いで試料を濃縮し、ＴＦＦによってヌクレアーゼ処理に適したバッファーに透析濾過する。次いで、試料をヌクレアーゼ酵素で処理してＤＮＡを分解する。次いで、試料をさらに濃縮し、膜を通してヌクレオチド及びヒストンタンパク質を除去しながら透析濾過する。この最後の実施形態では、濾過媒体は、混入物質の多様性が最大であっても排除することができるように、ＡＡＶを保持する最大の細孔を有するように選択されることが好ましい。
別の一連の実施形態では、カチオン性金属アフィニティーステップの後に、空カプシド及びＤＮＡの含有量を減少させるための追加的方法を続けることができる。このような一実施形態では、追加的方法は、強アニオン交換体上におけるアニオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法であってもよい。別のそのような実施形態では、追加的方法は、空カプシド及びフルカプシドが上昇するｐＨ勾配で分離される、一次アミン交換体上におけるアニオン交換クロマトグラフィーであってもよい。別のそのような実施形態では、追加的方法は、密度勾配遠心分離であってもよい。
別の一連の実施形態では、本発明の方法を実施する前に、試料がまずＤＮＡの量を減少させるために処理され、さらに、空カプシド及びＤＮＡの含有量をさらに減少させるための方法が続く。
別の一連の実施形態では、本発明の方法は、混入物質の大部分を除去するためにすでに処理されている試料の空カプシド及びＤＮＡ含有量を減少させるための精製方法（polishing method）として使用される。１つのそのような実施形態において、第１の精製ステップは、カチオン交換クロマトグラフィーの公知の方法を用いて実施される。カチオン交換ステップの溶出画分の中から部分的に精製されたＡＡＶを回収した後、これらのＡＡＶ画分を本発明の方法によって処理する。別のそのような実施形態では、第１の精製ステップは、バイオアフィニティークロマトグラフィーの公知の方法を用いて実施される。バイオアフィニティーステップの溶出画分の中から部分的に精製されたＡＡＶを回収した後、これらのＡＡＶ画分を本発明の方法によって処理する。これらの実施形態のいずれにおいても、試料は第１のクロマトグラフィーステップの前にＤＮＡ含有量を減少させるために、上記のように予め処理されていてよい。
一実施形態では、本発明の方法は、ＴＲＥＮ－金属固相が第四級アミンアニオン交換固相と直列に配管される構成で実施することができる。このような一実施形態では、第四級アミン固相が順番の最初に配置されうる。両固相は、同じ平衡化バッファーによって、例えばｐＨ９で共に平衡化される。試料をロードし、カラムを洗浄し、次いで塩勾配で溶出する。ＡＡＶは、カチオン性リガンド－金属固相からよりも低濃度の塩で強アニオン交換体から溶出するので、ＡＡＶカプシドは強アニオン交換体から溶出し、カチオン性リガンド－金属固相に再び結合する。しかしながら、カチオン性リガンド－金属固相からのカプシドの溶出全体を通して、ＤＮＡの大きなサブセットは、強アニオン交換体に結合したままである。このＤＮＡの亜集団がカチオン性リガンド－金属固相上に存在しないようにすることによって、カチオン性リガンド－金属固相の全容量がカプシド分離に利用可能になる。両カラムを高塩及びＮａＯＨでタンデムで洗浄して、強く結合した混入物質を放出することができる。別の実施形態では、固相の順序は逆である。
関連する実施形態では、本発明の方法は、第一級アミンアニオン交換体を用いるステップと組み合わされる。１つのそのような実施形態では、一次アミノ固相が順番の最初に実行されてもよい。第一級アミンアニオン交換体は、ｐＨ７～ｐＨ８の範囲のｐＨ値でロードされ、続いてｐＨ勾配を用いて約１０のｐＨまで溶出される。これは、空カプシド及びフルカプシドの部分的分離、並びに混入ＤＮＡの部分的減少を提供する。次いで、溶出されたフルカプシドをｐＨ９以下に滴定し、本発明の方法によって処理して、空カプシド及び混入ＤＮＡのさらなる除去を達成することができる。いくつかの実施形態では、プロセス順序は逆であってもよい。
別の密接に関連する実施形態では、本発明の方法は、カチオン性金属－リガンド固相がアニオン性固相と直列に配管される構成で実施され、ここでアニオン性金属－リガンド固相が最初の配列である。このような一実施形態において、アニオン性金属－リガンド固相は、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）である。別のそのような実施形態において、アニオン性金属－リガンド固相はニトリロ三酢酸である。このような一実施形態では、アニオン性固相にカチオン性金属－リガンド固相と同じ金属種が担持させられる。このような一実施形態では、アニオン性固相にカチオン性金属－リガンド固相とは異なる金属種が担持させられる。１つのそのような実施形態において、アニオン性金属－リガンド固相には鉄又はマンガンが担持させられ、一方、カチオン性金属－リガンド固相にはカルシウム、マグネシウム、又は別の非鉄、非マンガン種が担持させられる。これらの実施形態の全てにおいて、アニオン性金属－リガンド固相はそれがカチオン性金属－リガンド固相に接触する前に、リン酸化した混入物質を試料から除去する目的に役立つ。全てのそのような実施形態において、そのような高度にリン酸化した混入物は特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、エンドトキシン、並びに細胞小器官及び小胞由来の膜を含む細胞膜残屑を含む。全てのそのような実施形態において、これらの混入物を先行して除去することは、ＡＡＶカプシドのためのカチオン性金属－リガンド固相の能力を保存し、それらの混入物が所望の混入物と共にカラムに結合される場合よりもフルカプシドの純度を高くすることを可能にする。一実施形態では、タンデム法を用いて、精製されたフルＡＡＶカプシドを単一ステップで生成する。
別のそのような実施形態では、アニオン性金属－リガンド固相は、カチオン性金属－リガンド固相と順番に配管されない。このような一実施形態では、試料がカチオン性金属－リガンド固相法の実施に先立って、アニオン性金属リガンド固相で処理される。１つのそのような方法では、２つのステップが順次実行される。１つのそのような実施形態において、空ＡＡＶカプシド、フルＡＡＶカプシド、及びＤＮＡを含有する細胞培養回収物又は溶解物は、カチオン性金属－リガンド固相ステップの方法を実施する前に、アニオン性金属－リガンド固相で処理される。密接に関連する実施形態では、アニオン性金属－リガンドステップの後、及びカチオン性金属－リガンドステップの前に、１つ又は複数の追加のステップが実施される。１つのそのような実施形態では、フルカプシド、空カプシド、及びＤＮＡを含有する細胞培養回収物又は溶解物を、アニオン性金属－リガンド固相で処理し、ＤＮＡが欠乏した溶液を、アフィニティークロマトグラフィーの技術によって分画し、その後、カチオン性金属－リガンド固相の方法を実施することによって、空カプシド及びフルカプシドを分離し続ける。別のそのような実施形態では、アニオン性金属－リガンド固相処理細胞培養採取物又は溶解物がカチオン性金属－リガンド固相の方法を実施することによって空カプシド及びフルカプシドを分離し続ける前に、カチオン交換クロマトグラフィーの方法によって分画される。
一実施形態では、金属がロードされたアニオン性金属アフィニティー基材を用いたＤＮＡ低減ステップは、ＤＮＡｓｅ酵素を用いた同時ＤＮＡ低減と組み合わされる。このような一実施形態では、ＤＮＡａｓｅ酵素は耐塩性ＤＮＡｓｅであり、金属がロードされたアニオン性金属アフィニティー基材は、複数の金属がロードされたアニオン性金属アフィニティーリガンドを有する可溶性ポリマー骨格の形態である。別のそのような実施形態では、金属がロードされたアニオン性金属アフィニティー基材は、複数の金属がロードされたアニオン性金属アフィニティーリガンドを有する固体不溶性粒子の形態である。両方のこのような場合において、複数の金属がロードされたアニオン性金属アフィニティーリガンドを有する基材は、ＤＮＡの酵素的溶解の間に存在する。いくつかのそのような場合において、アニオン性金属アフィニティーリガンドにロードされる金属種は、酵素によって必要とされる金属種補因子と同じである。１つのそのような場合において、金属イオンはマグネシウムであり、他のそのような場合において、アニオン性金属アフィニティーリガンドにロードされる金属種は、酵素によって必要とされる金属種補因子とは異なる。そのような場合の１つでは、可溶性酵素補因子はマグネシウムであるが、アニオン性金属アフィニティーリガンドには鉄が予めロードされている。別のそのような場合において、可溶性酵素補因子はマグネシウムであるが、アニオン性金属アフィニティーリガンドにはマンガンが予めロードされている。
一実施形態では、カチオン性金属アフィニティーリガンドを有する固相は、１つ以上の多孔質粒子、又は１つ以上の多孔質膜、又は１つ以上のナノファイバー、又はモノリス、又はヒドロゲル、デプスフィルター、又は別の形態の固相の形態であってもよい。
密接に関連する実施形態では、アニオン性金属アフィニティーリガンドを有する固相は、１つ以上の多孔質粒子、又は１つ以上の多孔質膜、又は１つ以上のナノファイバー、又はモノリス、又はヒドロゲル、デプスフィルター、又は別の形態の固相の形態であってもよい。
一実施形態では、本発明の方法の任意の態様を実施するための固相は、クロマトグラフィー法の実施を容易にするためのフロースルーデバイスとして配置され得る。クロマトグラフィーを実施するためのフロースルー装置はそれらが含有する形態又は材料にかかわらず、一般にカラムと呼ばれる。
一実施形態では、本発明の材料及び方法、任意の先の処理ステップ、及び任意の後続の処理ステップはマイクロプロセッサに配管され、マイクロプロセッサとインターフェースされて、多段階プロセスの自動化をエンドツーエンドで可能にし、所望であれば、連続ベースでプロセスを実施することができる。
異なる血清型のＡＡＶカプシドは多くの基本的な物理的及び化学的類似性を共有するが、それらはまた、それらの表面化学及び精製特性に関して有意な変動性を示すことが、当業者によって認識されるであろう。アフィニティークロマトグラフィー媒体は、１つ又はいくつかの血清型を認識する傾向がある。いくつかの広域スペクトルアフィニティーリガンドは多くのＡＡＶ血清型を認識するが、これはそれらが同じアフィニティーで結合し、同じ能力を与え、又は同じ条件下で溶出することを意味しない。イオン交換クロマトグラフィーの挙動に関しても多様性が観察される。異なるＡＡＶ血清型は異なる結合力でカチオン交換体に結合し、異なる条件下で溶出する。異なるＡＡＶ血清型はまた、異なる結合活性でアニオン交換体に結合し、異なる条件下で、及び空カプシド及びフルカプシドを異なる程度に分離して溶出する。任意の所定の血清型について任意の所定の方法を最適化するために過度の実験が必要とされないように、全てのそのような方法について最良の範囲が知られている。同様に、本発明の方法では、それらの結合、能力、溶出、及び空カプシド－フルカプシド分離特性に関して、血清型間で変動が観察されることが予想される。本明細書において提供される、適切な出発条件の予備知識、主要なプロセス変数の同定、それらが評価され得る範囲、及びそれらが産生する効果の種類を考慮すると、任意の所与のＡＡＶ血清型に最も適合する方法を最適化するために過度の実験は必要とされない。
一実施形態では、本発明の方法によって処理されるＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、又はＡＡＶ２、又はＡＡＶ３、又はＡＡＶ４、又はＡＡＶ５、又はＡＡＶ６、又はＡＡＶ７、又はＡＡＶ８、又はＡＡＶ９、又はＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１、又は別の血清型であり得る。別の実施形態では、本発明の方法によって処理されるＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９のような組換えハイブリッド血清型、又は別のハイブリッド血清型であってもよい。別の実施形態では、本発明の方法によって処理されるＡＡＶ血清型は、合成組換え血清型であってもよい。
各血清型が任意の種類の吸着クロマトグラフィー媒体上で異なる保持特性を示すことは、当業者によって認識されるであろう。すべてのクロマトグラフィー法に伴うこの多様性の帰結は、任意の特定の血清型の最良の全体的精製を達成するためには条件は最適化される必要がある、ということである。
一実施形態では、空カプシド、フルカプシド、及びＤＮＡを含有する試料は、細胞培養回収物である。密接に関連する実施形態では、空カプシド、フルカプシド、及びＤＮＡを含有する試料は、細胞溶解物である。別の密接に関連する実施形態では、空カプシド、フルカプシド、及びＤＮＡを含有する試料は、部分的に処理された又は部分的に精製された調製物である。このような一実施形態では、空カプシド、フルカプシド、及びＤＮＡを含有する試料は、ＤＮＡを溶解するために酵素で処理された細胞培養回収物又は溶解物である。別のそのような実施形態では、空カプシド、フルカプシド、及びＤＮＡを含有する試料は、ＤＮＡを抽出するためにカチオン性ポリマー又はカチオン性固相で処理された細胞培養回収物である。別の実施形態では、空カプシド、フルカプシド、及びＤＮＡを含有する試料は、カチオン性固相で処理され、次いで濃縮され、タンジェンシャルフロー濾過によって透析濾過され、次いで酵素で処理されてＤＮＡを溶解させた細胞培養回収物又は溶解物である。その実施形態の拡張では、次いで、試料を濃縮し、クロマトグラフィー精製のための調製においてタンジェンシャルフロー濾過によって透析濾過する。別の実施形態では、細胞回収物又は溶解物を処理して、混入物質を沈殿させ、上清中にＡＡＶを残す。別の実施形態では、細胞回収物又は溶解物を処理してＡＡＶを沈殿させ、上清中に混入物質を残す。沈殿物を再懸濁し、上清から分離し、再懸濁し、ここで、最初に沈殿していない混入物質を含まない。別の実施形態において、細胞回収物又は溶解物は、クロマトグラフィー法によって部分的に精製される。そのような一実施形態では、回収物又は溶解物がアフィニティークロマトグラフィーによって部分的に精製される。別のそのような実施形態では、回収物又は溶解物が疎水性相互作用クロマトグラフィーによって部分的に精製される。別のそのような実施形態では、回収物又は溶解物がサイズ排除クロマトグラフィーによって部分的に精製される。別のそのような実施形態では、回収物又は溶解物がカチオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製される。別のそのような実施形態では、溶解物の回収物がアニオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製される。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
実施例１ 基準ベースラインの作成
カチオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製された空ＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドの混合試料を、５０ｍＭトリス、ｐＨ９で平衡化された強力な（第四級（４°）アミン）モノリスクロマトグラフィーカラムに注入した。アニオン交換体を２００ｍＭまでの塩化ナトリウム勾配で溶出し、次いでカラムを５００ｍＭ塩化ナトリウムまでのステップで洗浄した。溶出プロファイルを図２に示す。溶出プロファイルは、単一の空カプシドピークの溶出があるものの単一のフルカプシドピークと重複している、空カプシドピーク及びフルカプシドの部分的分離を示す。フルカプシドピークは、２６０／２８０波長比１．３０７を示す。これは、ある割合の空カプシドが全カプシドの領域にも溶出し、波長比を低下させていることを意味すると理解される。空カプシドピークのサイズが比較的大きいことに留意されたい。
カチオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製された空ＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドの混合試料を、５０ｍＭトリス、ｐＨ９で平衡化された強力な（第四級（４°）アミン）モノリスクロマトグラフィーカラムに注入した。アニオン交換体を２００ｍＭまでの塩化ナトリウム勾配で溶出し、次いでカラムを５００ｍＭ塩化ナトリウムまでのステップで洗浄した。溶出プロファイルを図２に示す。溶出プロファイルは、単一の空カプシドピークの溶出があるものの単一のフルカプシドピークと重複している、空カプシドピーク及びフルカプシドの部分的分離を示す。フルカプシドピークは、２６０／２８０波長比１．３０７を示す。これは、ある割合の空カプシドが全カプシドの領域にも溶出し、波長比を低下させていることを意味すると理解される。空カプシドピークのサイズが比較的大きいことに留意されたい。
実施例２ ｐＨ７．０及びｐＨ９．０におけるＴＲＥＮ－Ｍｇによる空カプシドとフルカプシドの分離の予備的評価
ＴＲＥＮ表面を有するモノリスに、水中の１００ｍＭ酢酸マグネシウムに曝露することによって、二価マグネシウムイオンをロードした。過剰のマグネシウムを、カラムを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳでｐＨ７．０に平衡化する間にすすぎ落とした。カラムを、１Ｍ塩化ナトリウムに対する直線勾配で溶出した。次いで、カラムを２Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのＨＥＰＥＳへのステップで洗浄し、次いで、１Ｍの水酸化ナトリウムへのステップでさらに洗浄した。フルカプシドピークは２６０／２８０波長比１．２４０を示す（図４）。別の実験では、ＴＲＥＮ表面を有するモノリスに、水中の１００ｍＭ酢酸マグネシウムに曝露することによって、二価マグネシウムイオンをロードした。過剰のマグネシウムを、５０ｍＭのビス－トリス－プロパン、２ｍＭの塩化マグネシウムでカラムをｐＨ９．０に平衡化する間にすすぎ落とした。実施例１に使用したカチオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製された空ＡＡＶ８カプシド及びフルＡＡＶ８カプシドと同じ試料を、ＴＲＥＮ－Ｍｇカラムに注入した。カラムを、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウムへの直線勾配で溶出した。次いで、それを２Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのビス－トリス－プロパン、２ｍＭの塩化マグネシウムへのステップで洗浄し、次いで、１Ｍの水酸化ナトリウムへのステップでさらに洗浄した。溶出プロファイルを図４に示す。溶出プロファイルが示しているのは、１つはフルカプシドピークの前に溶出し、１つは後に溶出している、２つの空カプシドピークがある、空カプシド及びフルカプシドの部分的分離である。フルカプシドピークは、２６０／２８０波長比１．３７７を示す（図５）。これは、フルカプシドの領域において溶出する空カプシドの割合が、試料が実施例１に示される強アニオン交換体によって分画された場合よりも小さい、ということを意味すると理解される。全体的な結果は、空カプシドとフルカプシドとの間のある程度の分離がｐＨ７．０で得られるものの、分離はｐＨ９．０で実質的に改善されることを示す。その後のｐＨ９．２５での実験は本質的に同等の性能を示したが、ｐＨ９．５ではわずかに劣った結果が示された。
ＴＲＥＮ表面を有するモノリスに、水中の１００ｍＭ酢酸マグネシウムに曝露することによって、二価マグネシウムイオンをロードした。過剰のマグネシウムを、カラムを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳでｐＨ７．０に平衡化する間にすすぎ落とした。カラムを、１Ｍ塩化ナトリウムに対する直線勾配で溶出した。次いで、カラムを２Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのＨＥＰＥＳへのステップで洗浄し、次いで、１Ｍの水酸化ナトリウムへのステップでさらに洗浄した。フルカプシドピークは２６０／２８０波長比１．２４０を示す（図４）。別の実験では、ＴＲＥＮ表面を有するモノリスに、水中の１００ｍＭ酢酸マグネシウムに曝露することによって、二価マグネシウムイオンをロードした。過剰のマグネシウムを、５０ｍＭのビス－トリス－プロパン、２ｍＭの塩化マグネシウムでカラムをｐＨ９．０に平衡化する間にすすぎ落とした。実施例１に使用したカチオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製された空ＡＡＶ８カプシド及びフルＡＡＶ８カプシドと同じ試料を、ＴＲＥＮ－Ｍｇカラムに注入した。カラムを、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウムへの直線勾配で溶出した。次いで、それを２Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのビス－トリス－プロパン、２ｍＭの塩化マグネシウムへのステップで洗浄し、次いで、１Ｍの水酸化ナトリウムへのステップでさらに洗浄した。溶出プロファイルを図４に示す。溶出プロファイルが示しているのは、１つはフルカプシドピークの前に溶出し、１つは後に溶出している、２つの空カプシドピークがある、空カプシド及びフルカプシドの部分的分離である。フルカプシドピークは、２６０／２８０波長比１．３７７を示す（図５）。これは、フルカプシドの領域において溶出する空カプシドの割合が、試料が実施例１に示される強アニオン交換体によって分画された場合よりも小さい、ということを意味すると理解される。全体的な結果は、空カプシドとフルカプシドとの間のある程度の分離がｐＨ７．０で得られるものの、分離はｐＨ９．０で実質的に改善されることを示す。その後のｐＨ９．２５での実験は本質的に同等の性能を示したが、ｐＨ９．５ではわずかに劣った結果が示された。
図６は、カプシド外面上のＤＮＡの分布が前記２つの方法の間で異なることを示す。バーの高さは、図２及び図４に示すクロマトグラムから、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によるピコグリーン蛍光のピーク面積を比較することによって推算された。Ｆと表示された画分はフルカプシド画分を示す。前記２つの方法はＤＮＡの分布において明確に異なっており、それらの選択性が互いに異なるということの証拠に加えられる。これはまた、それらの相補性及びアニオン交換クロマトグラフィーによる本発明の方法に従うことの潜在的価値、又はその逆を強調する。
図７は、元のカチオン交換精製試料を、図６のフルカプシドを含む画分、及び２Ｍ塩化ナトリウム洗浄液の内容物を含む図６の画分と比較する、アニオン交換分析プロファイル（第四級アミン）である。溶出プロファイルは、２つの理由から内因性トリプトファン蛍光に対してモニターした。第１の理由は、トリプトファン蛍光がタンパク質検出の感度を１５～２０倍増加させることであり、第２の理由は、トリプトファン蛍光がタンパク質によってのみ生成されることである。これはＤＮＡを検出しない。これは、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＵＶ吸光度に対するタンパク質及びＤＮＡの不確実な個々の寄与による混乱を回避する。図示されているとおり、元の試料は空カプシドで大きく優占されていた。フルカプシド画分はフルカプシドによって明らかに優占されていた。塩化ナトリウム洗浄画分は、空カプシドのみによって占められていた。これらの知見は、本発明の方法の選択性が任意の公知の方法とは異なっており、特に、強アニオン交換体を用いたアニオン交換クロマトグラフィーの方法とは異なっていることを実証する。
実施例３ 上昇ｐＨ勾配を用いた第一級アミノアニオン交換体上における空カプシドとフルカプシドの分離の比較
第一級アミンアニオン交換体を、１０ｍＭトリス、１０ｍＭビス－トリス－プロパン、２ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．０で平衡化した。実施例１及び２を調製するために使用したのと同じ試料をロードした。図８は、１°アミンと表示された右端の中央パネルにおける完全なピークを含む溶出領域を示す。これを、強アニオン交換体上の空カプシドとフルカプシドの分離を示す、図２の対応する領域と比較する（左パネル）。また、本発明の方法による空カプシドとフルカプシドの分離を示す、図５の対応する領域と比較する。示されるように、第一級アミンアニオン交換体からのフルカプシド画分の波長は１．３０、対する第四級交換体については１．３０７であり、本発明の方法については１．３７７であった。全体として、図８は、本発明の方法の選択性が両タイプのアニオン交換体とは異なることを強調し、また固定された金属イオンの効果を適示している。
第一級アミンアニオン交換体を、１０ｍＭトリス、１０ｍＭビス－トリス－プロパン、２ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．０で平衡化した。実施例１及び２を調製するために使用したのと同じ試料をロードした。図８は、１°アミンと表示された右端の中央パネルにおける完全なピークを含む溶出領域を示す。これを、強アニオン交換体上の空カプシドとフルカプシドの分離を示す、図２の対応する領域と比較する（左パネル）。また、本発明の方法による空カプシドとフルカプシドの分離を示す、図５の対応する領域と比較する。示されるように、第一級アミンアニオン交換体からのフルカプシド画分の波長は１．３０、対する第四級交換体については１．３０７であり、本発明の方法については１．３７７であった。全体として、図８は、本発明の方法の選択性が両タイプのアニオン交換体とは異なることを強調し、また固定された金属イオンの効果を適示している。
実施例４ クロマトグラフィーバッファーの金属補充を伴う及び伴わないカプシド分離の比較
図９は、金属イオンを欠く対照実験を行ったクロマトグラフィープロファイル（上側プロファイル）を比較する。ＴＲＥＮカラムには多価金属カチオンを担持させず、勾配バッファーは多価金属カチオンを含有しなかった。下側のプロファイルは、勾配バッファー中で２ｍＭマグネシウムが使用された場合の結果を示す。これは、空カプシドの後期溶出画分への有意なシフト、及び主要溶出ピークにおけるフルカプシドの割合の実質的な改善を示す。これは、そのより高い２６０／２８０比によって示される。別の実験では、試料を適用する前に、ＴＲＥＮカラムをマグネシウムで平衡化した。結果（図示せず）は、マグネシウムを勾配バッファー中にのみ供給した場合に得られた結果と同一であった。マグネシウムの存在によって得られる改善された性能を確認するだけでなく、これらの結果は、試料適用の前に金属をロードする必要がないことを示しており、これはカチオン性金属アフィニティーリガンドがＩＭＡＣの分野における古典的なアプローチである。金属は、カプシドの溶出前の任意の時点でリガンド上にロードすることができる。
図９は、金属イオンを欠く対照実験を行ったクロマトグラフィープロファイル（上側プロファイル）を比較する。ＴＲＥＮカラムには多価金属カチオンを担持させず、勾配バッファーは多価金属カチオンを含有しなかった。下側のプロファイルは、勾配バッファー中で２ｍＭマグネシウムが使用された場合の結果を示す。これは、空カプシドの後期溶出画分への有意なシフト、及び主要溶出ピークにおけるフルカプシドの割合の実質的な改善を示す。これは、そのより高い２６０／２８０比によって示される。別の実験では、試料を適用する前に、ＴＲＥＮカラムをマグネシウムで平衡化した。結果（図示せず）は、マグネシウムを勾配バッファー中にのみ供給した場合に得られた結果と同一であった。マグネシウムの存在によって得られる改善された性能を確認するだけでなく、これらの結果は、試料適用の前に金属をロードする必要がないことを示しており、これはカチオン性金属アフィニティーリガンドがＩＭＡＣの分野における古典的なアプローチである。金属は、カプシドの溶出前の任意の時点でリガンド上にロードすることができる。
実施例５ 異なる金属イオンを用いたクロマトグラフィーの比較
ＴＲＥＮ固相にそれぞれ異なる金属を担持させたこと以外は、実施例２で実施した方法を繰り返した。カルシウム、鉄（第二鉄）、マンガン、銅（第二銅）、亜鉛、及びバリウムを用いて比較を行った。プロファイルは空カプシド及びフルカプシドが溶出した領域では著しく一貫していたが、洗浄ステップの領域では異なっていた。特に鉄とマンガンは、水酸化ナトリウムのクリーン・イン・プレース（ｃｌｅａｎ－ｉｎ－ｐｌａｃｅ）ピークにおいて劇的に大きなピークを示した。図１０にカルシウムのクロマトグラムを示す。図１１に鉄のクロマトグラムを示す。これらの違いは、ＤＮＡの鉄への結合が不釣り合いに強いことに起因していた。図１２は、ｐＨ９．０における銅（ｃｏｐｐｅｒ（ｃｕｐｒｉｃ））のクロマトグラムを示す。銅が示した洗浄ピークはカルシウム又はマグネシウムより大きかったが、鉄よりは小さかった。マンガン（図示せず）の使用は、鉄と銅の中間のクリーニングピークを与えた。図１３は、マグネシウム及び銅について、カプシド除去領域における溶出プロファイルを比較している。留意されたいのは、銅中でカプシドがより早く溶出している、溶出プロファイル間のオフセットである。銅はまた、比較した中で最も好ましい波長比を生じており、これは銅が、空の粒子の割合が最も低いフルカプシド画分を生成したことを示す。フルカプシドピークも、銅を用いた場合が最も狭く、空カプシドの画分の中のバリアントの亜集団がより明確に解像された。
ＴＲＥＮ固相にそれぞれ異なる金属を担持させたこと以外は、実施例２で実施した方法を繰り返した。カルシウム、鉄（第二鉄）、マンガン、銅（第二銅）、亜鉛、及びバリウムを用いて比較を行った。プロファイルは空カプシド及びフルカプシドが溶出した領域では著しく一貫していたが、洗浄ステップの領域では異なっていた。特に鉄とマンガンは、水酸化ナトリウムのクリーン・イン・プレース（ｃｌｅａｎ－ｉｎ－ｐｌａｃｅ）ピークにおいて劇的に大きなピークを示した。図１０にカルシウムのクロマトグラムを示す。図１１に鉄のクロマトグラムを示す。これらの違いは、ＤＮＡの鉄への結合が不釣り合いに強いことに起因していた。図１２は、ｐＨ９．０における銅（ｃｏｐｐｅｒ（ｃｕｐｒｉｃ））のクロマトグラムを示す。銅が示した洗浄ピークはカルシウム又はマグネシウムより大きかったが、鉄よりは小さかった。マンガン（図示せず）の使用は、鉄と銅の中間のクリーニングピークを与えた。図１３は、マグネシウム及び銅について、カプシド除去領域における溶出プロファイルを比較している。留意されたいのは、銅中でカプシドがより早く溶出している、溶出プロファイル間のオフセットである。銅はまた、比較した中で最も好ましい波長比を生じており、これは銅が、空の粒子の割合が最も低いフルカプシド画分を生成したことを示す。フルカプシドピークも、銅を用いた場合が最も狭く、空カプシドの画分の中のバリアントの亜集団がより明確に解像された。
実施例６ ＤＮＡの先行除去に係るマグネシウムがロードされたアニオン性金属アフィニティーリガンドの評価
イミノ二酢酸（ＩＤＡ）キレート残基を有するモノリスにマグネシウムをロードし、ｐＨ９．０に平衡化した。カチオン交換精製したカプシドの試料を同じ条件に平衡化し、カラムにロードした。ＡＡＶカプシドは結合も分画もされずカラムを通過し、このことは空カプシドとフルカプシドの捕捉及び分離におけるカチオン性金属アフィニティーカラムの重要性を強調するものである。ただし、試料からのＤＮＡ及び混入物はカラムに結合していた（図１４）。
イミノ二酢酸（ＩＤＡ）キレート残基を有するモノリスにマグネシウムをロードし、ｐＨ９．０に平衡化した。カチオン交換精製したカプシドの試料を同じ条件に平衡化し、カラムにロードした。ＡＡＶカプシドは結合も分画もされずカラムを通過し、このことは空カプシドとフルカプシドの捕捉及び分離におけるカチオン性金属アフィニティーカラムの重要性を強調するものである。ただし、試料からのＤＮＡ及び混入物はカラムに結合していた（図１４）。
実施例７ 多段階精製法における本発明の方法の組み込み
ＤＮＡ、空ＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドを含有する濾過細胞培養溶解物を、正電荷を付与するエチレンジアミンを表面に有する粒子で処理した。それらを負電荷ＳＯ３基を有する粒子と混合した。混合した粒子を５％の体積比で試料に添加し、６０分間混合しながらインキュベートした。粒子は、可溶性の宿主細胞ＤＮＡの大部分に結合した。粒子－ＤＮＡ複合体を沈殿させ、上清を０．４５μｍの孔径カットオフを有する膜フィルターを通して濾過した。この処理は、タンジェンシャルフロー濾過による試料濃縮を可能にする程度まで濾過性を改善した。３００ｋＤａの孔径カットオフを有する膜を用いて試料を１０倍に濃縮し、タンパク質を含む多くの小分子混入物の除去を可能にした。また、試料を、タンジェンシャルフロー濾過により、耐塩性ヌクレアーゼ酵素を用いたＤＮＡの酵素的溶解を実施するのに適したバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中に透析濾過した。耐塩性ヌクレアーゼを５ｍＭ塩化マグネシウムと共に添加し、混合物を室温で１６時間インキュベートした。タンジェンシャルフロー濾過を再開して、宿主細胞ＤＮＡの消化によって遊離したヒストンを除去し、ＤＮＡ断片及びヌクレオチドを除去し、ＴＲＥＮ－マグネシウム複合体を有するカラム上での捕捉のために試料を平衡化した。試料をカラムに適用し、実施例２に記載されるように処理した。フルカプシドを含有するＴＲＥＮ画分の一部を、ｐＨ勾配で溶出させる第一級アミンアニオン交換体上でさらに分画した。ＴＲＥＮ画分の別の一部を、塩勾配で溶出させる強アニオン交換体上でさらに分画した。結果を、同じ条件下で行われるが最初のクロマトグラフィーステップはカチオン交換体上で実施される別の実験と比較した。図１５は、ＴＲＥＮ－Ｍｇ上における初期捕捉ステップからの全クロマトグラムを示す。図１６は、図１５の溶出勾配及び洗浄ステップを強調したものである。図１７は、ＴＲＥＮ－Ｍｇによる捕捉からのフルカプシド画分のアニオン交換精製を強調したものである。図１８は、最初に本発明の方法で精製されたＡＡＶ（右のパネル）と、最初にカチオン交換クロマトグラフィーで精製されたＡＡＶ（左のパネル）のアニオン交換精製結果を比較する。相対ピーク高さに基づくと、本発明の方法による捕捉では、カチオン交換クロマトグラフィーによる捕捉よりも８３％多くの空カプシドが排除された。本発明の方法による捕捉は、空カプシドのピークとフルカプシドのピークとの２つの間の重複を減少させ、その結果、アニオン交換クロマトグラフィーによる精製では空カプシドをより効率的に減少させることができた。図１９は、ｐＨ勾配で溶出される第一級アミンアニオン交換体（左パネル）対塩勾配で溶出される第四級アミンアニオン交換体（右パネル）によるＴＲＥＮ－Ｍｇ捕捉後の空カプシド減少（図１５、１６）を比較する。両方の結果は、アニオン交換クロマトグラフィーとの本発明の方法の相補性を強調し、空カプシド含有量のより効果的な全体的減少を達成するため、いずれかの方法を単独で使用するよりも組み合わせを使用することの可能性を強調する。
ＤＮＡ、空ＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドを含有する濾過細胞培養溶解物を、正電荷を付与するエチレンジアミンを表面に有する粒子で処理した。それらを負電荷ＳＯ３基を有する粒子と混合した。混合した粒子を５％の体積比で試料に添加し、６０分間混合しながらインキュベートした。粒子は、可溶性の宿主細胞ＤＮＡの大部分に結合した。粒子－ＤＮＡ複合体を沈殿させ、上清を０．４５μｍの孔径カットオフを有する膜フィルターを通して濾過した。この処理は、タンジェンシャルフロー濾過による試料濃縮を可能にする程度まで濾過性を改善した。３００ｋＤａの孔径カットオフを有する膜を用いて試料を１０倍に濃縮し、タンパク質を含む多くの小分子混入物の除去を可能にした。また、試料を、タンジェンシャルフロー濾過により、耐塩性ヌクレアーゼ酵素を用いたＤＮＡの酵素的溶解を実施するのに適したバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中に透析濾過した。耐塩性ヌクレアーゼを５ｍＭ塩化マグネシウムと共に添加し、混合物を室温で１６時間インキュベートした。タンジェンシャルフロー濾過を再開して、宿主細胞ＤＮＡの消化によって遊離したヒストンを除去し、ＤＮＡ断片及びヌクレオチドを除去し、ＴＲＥＮ－マグネシウム複合体を有するカラム上での捕捉のために試料を平衡化した。試料をカラムに適用し、実施例２に記載されるように処理した。フルカプシドを含有するＴＲＥＮ画分の一部を、ｐＨ勾配で溶出させる第一級アミンアニオン交換体上でさらに分画した。ＴＲＥＮ画分の別の一部を、塩勾配で溶出させる強アニオン交換体上でさらに分画した。結果を、同じ条件下で行われるが最初のクロマトグラフィーステップはカチオン交換体上で実施される別の実験と比較した。図１５は、ＴＲＥＮ－Ｍｇ上における初期捕捉ステップからの全クロマトグラムを示す。図１６は、図１５の溶出勾配及び洗浄ステップを強調したものである。図１７は、ＴＲＥＮ－Ｍｇによる捕捉からのフルカプシド画分のアニオン交換精製を強調したものである。図１８は、最初に本発明の方法で精製されたＡＡＶ（右のパネル）と、最初にカチオン交換クロマトグラフィーで精製されたＡＡＶ（左のパネル）のアニオン交換精製結果を比較する。相対ピーク高さに基づくと、本発明の方法による捕捉では、カチオン交換クロマトグラフィーによる捕捉よりも８３％多くの空カプシドが排除された。本発明の方法による捕捉は、空カプシドのピークとフルカプシドのピークとの２つの間の重複を減少させ、その結果、アニオン交換クロマトグラフィーによる精製では空カプシドをより効率的に減少させることができた。図１９は、ｐＨ勾配で溶出される第一級アミンアニオン交換体（左パネル）対塩勾配で溶出される第四級アミンアニオン交換体（右パネル）によるＴＲＥＮ－Ｍｇ捕捉後の空カプシド減少（図１５、１６）を比較する。両方の結果は、アニオン交換クロマトグラフィーとの本発明の方法の相補性を強調し、空カプシド含有量のより効果的な全体的減少を達成するため、いずれかの方法を単独で使用するよりも組み合わせを使用することの可能性を強調する。
実施例８ 異なる多段階精製プロセスへの本発明の方法の組み込み
元の捕捉ステップをカチオン交換クロマトグラフィーステップに置き換えることを除いて、実施例６の方法を繰り返す。次いで、試料を本発明の方法による処理のために調製し、そのように処理する。本方法の一変形形態では、ＴＲＥＮカラムに銅をロードする。本方法の別の変形例では、ＴＲＥＮカラムにマグネシウムを担持させる。
元の捕捉ステップをカチオン交換クロマトグラフィーステップに置き換えることを除いて、実施例６の方法を繰り返す。次いで、試料を本発明の方法による処理のために調製し、そのように処理する。本方法の一変形形態では、ＴＲＥＮカラムに銅をロードする。本方法の別の変形例では、ＴＲＥＮカラムにマグネシウムを担持させる。
実施例９ 本発明の方法を、空カプシドとフルカプシドの分離を達成可能な別の方法と組み合わせることによって、ＤＮＡの除去及び前記分離を増進する
実施例６のＴＲＥＮステップを通じて試料を処理した後、実施例１に示すように、塩勾配を用いて強アニオン交換体上で空カプシド及びフルカプシドを分離する公知の方法によって、フルカプシド画分を処理する。
実施例６のＴＲＥＮステップを通じて試料を処理した後、実施例１に示すように、塩勾配を用いて強アニオン交換体上で空カプシド及びフルカプシドを分離する公知の方法によって、フルカプシド画分を処理する。
実施例１０ 本発明の方法を、空カプシドとフルカプシドの分離を達成可能な別の方法と組み合わせることによって、前記分離を増進する
塩勾配溶出を用いる強アニオン交換クロマトグラフィーの方法によって、又はｐＨ勾配溶出を用いる第一級アミンアニオン交換クロマトグラフィーの方法によって、空カプシドとフルカプシドを分離した後、さらなる精製ステップとして本発明の方法を実施する。
塩勾配溶出を用いる強アニオン交換クロマトグラフィーの方法によって、又はｐＨ勾配溶出を用いる第一級アミンアニオン交換クロマトグラフィーの方法によって、空カプシドとフルカプシドを分離した後、さらなる精製ステップとして本発明の方法を実施する。
実施例１１ 本発明の方法を、空カプシドとフルカプシドの分離を達成可能な別の方法と組み合わせることによって、前記分離を増進する
ＤＮＡ、空カプシド、及びフルカプシドを含有する試料を、最初にアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉する。アフィニティーカラムから溶出されたＡＡＶ画分を本発明の方法によって処理して、過剰なＤＮＡを除去し、フルカプシドから空カプシドを分離する。変形例では、アフィニティークロマトグラフィーに先立って、ＤＮＡの濃度を低下させるために、試料が、例えば実施例７に記載される方法のいずれかによって処理される。
ＤＮＡ、空カプシド、及びフルカプシドを含有する試料を、最初にアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉する。アフィニティーカラムから溶出されたＡＡＶ画分を本発明の方法によって処理して、過剰なＤＮＡを除去し、フルカプシドから空カプシドを分離する。変形例では、アフィニティークロマトグラフィーに先立って、ＤＮＡの濃度を低下させるために、試料が、例えば実施例７に記載される方法のいずれかによって処理される。
実施例１２ カチオン性金属アフィニティー固相でフルカプシドと空カプシドを分離する前に、アニオン性金属アフィニティー固相で試料を処理することによって、ＤＮＡの低減及び空カプシドとフルカプシドの分離を増進する
ＤＮＡ、フルカプシド、空カプシドを含む試料を約９のｐＨまで平衡化し、第二鉄をロードしたイミニオジアセト酸（ＩＤＡ）カラムに適用する。ＤＮＡは結合するが、ＡＡＶカプシドは結合しない。処理後、試料を、マグネシウムを担持させたＴＲＥＮカラムに、さらなる調製を行わずに適用する。空カプシドは、上昇する塩化ナトリウム勾配によってフルカプシドから分離される。このアプローチの１つの変形において、ＩＤＡ固相は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）酸固相で置換される。別の変形例では、アニオン性金属アフィニティー固相にマンガンをロードする。別の変形では、ＴＲＥＮ固相にカルシウムをロードする。別の変形例では、両方の固相に同じ金属種をロードする。本方法の１つのバージョンでは、アニオン性金属アフィニティー固相がフロースルークロマトグラフィー装置の形態である。変形例では、アニオン性金属アフィニティークロマトグラフィー装置がＴＲＥＮカラムと直列に配管される。別の変形では、アニオン性金属アフィニティー固相がフルカプシド、空カプシド、及びＤＮＡを含有する試料に添加することができる粒子形態であり、ＤＮＡを結合させ、その後、ＤＮＡと一緒に粒子を除去する。別の変形例では、処理された試料が次にＴＲＥＮ固相によって処理される。別の変形例では、処理された試料がＴＲＥＮ固相によって処理される前に、カチオン交換体によって処理される。別の変形例では、処理された試料がＴＲＥＮ固相によって処理される前に、アフィニティークロマトグラフィーによって処理される。
ＤＮＡ、フルカプシド、空カプシドを含む試料を約９のｐＨまで平衡化し、第二鉄をロードしたイミニオジアセト酸（ＩＤＡ）カラムに適用する。ＤＮＡは結合するが、ＡＡＶカプシドは結合しない。処理後、試料を、マグネシウムを担持させたＴＲＥＮカラムに、さらなる調製を行わずに適用する。空カプシドは、上昇する塩化ナトリウム勾配によってフルカプシドから分離される。このアプローチの１つの変形において、ＩＤＡ固相は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）酸固相で置換される。別の変形例では、アニオン性金属アフィニティー固相にマンガンをロードする。別の変形では、ＴＲＥＮ固相にカルシウムをロードする。別の変形例では、両方の固相に同じ金属種をロードする。本方法の１つのバージョンでは、アニオン性金属アフィニティー固相がフロースルークロマトグラフィー装置の形態である。変形例では、アニオン性金属アフィニティークロマトグラフィー装置がＴＲＥＮカラムと直列に配管される。別の変形では、アニオン性金属アフィニティー固相がフルカプシド、空カプシド、及びＤＮＡを含有する試料に添加することができる粒子形態であり、ＤＮＡを結合させ、その後、ＤＮＡと一緒に粒子を除去する。別の変形例では、処理された試料が次にＴＲＥＮ固相によって処理される。別の変形例では、処理された試料がＴＲＥＮ固相によって処理される前に、カチオン交換体によって処理される。別の変形例では、処理された試料がＴＲＥＮ固相によって処理される前に、アフィニティークロマトグラフィーによって処理される。
実施例１３ マグネシウムをロードした固定化イミノ二酢酸による宿主細胞ＤＮＡの事前抽出の有無による、ｐＨ９でのＴＲＥＮ－ＭｇによるＡＡＶ分離の比較
アニオン性金属アフィニティーリガンドイミノ二酢酸を有するモノリスにマグネシウムイオンをロードした。次いで、モノリスをｐＨ９．０で５０ｍＭビス－トリス－プロパンで平衡化した。カチオン交換精製ＡＡＶ８の試料をｐＨ９．０に滴定した。試料をモノリスに通した。ＡＡＶは結合せず、流出通過した。ＤＮＡの大きな亜集団は結合し、それによって試料から除去された。マグネシウムをロードしたカチオン性金属アフィニティー（ＴＲＥＮ）モノリスに試料を適用し、塩化ナトリウムの上昇勾配で溶出した。別の試料を、ｐＨ９への滴定によって、ただしマグネシウム－ＩＤＡモノリスによる処理なしに、カチオン交換精製ＡＡＶから調製した。ＴＲＥＮクロマトグラムを比較した図２０では、ＩＤＡカラムによる前処理がＴＲＥＮカラム上における溶出挙動を変化させたことが分かる。
アニオン性金属アフィニティーリガンドイミノ二酢酸を有するモノリスにマグネシウムイオンをロードした。次いで、モノリスをｐＨ９．０で５０ｍＭビス－トリス－プロパンで平衡化した。カチオン交換精製ＡＡＶ８の試料をｐＨ９．０に滴定した。試料をモノリスに通した。ＡＡＶは結合せず、流出通過した。ＤＮＡの大きな亜集団は結合し、それによって試料から除去された。マグネシウムをロードしたカチオン性金属アフィニティー（ＴＲＥＮ）モノリスに試料を適用し、塩化ナトリウムの上昇勾配で溶出した。別の試料を、ｐＨ９への滴定によって、ただしマグネシウム－ＩＤＡモノリスによる処理なしに、カチオン交換精製ＡＡＶから調製した。ＴＲＥＮクロマトグラムを比較した図２０では、ＩＤＡカラムによる前処理がＴＲＥＮカラム上における溶出挙動を変化させたことが分かる。
実施例１４ 宿主細胞ＤＮＡの事前抽出
アニオン性金属アフィニティーリガンドイミノ二酢酸を有するモノリスにマグネシウムイオンをロードした。次いで、モノリスをｐＨ９．０で５０ｍＭビス－トリス－プロパンで平衡化した。カチオン交換精製ＡＡＶ８の試料をｐＨ９．０に滴定した。試料をモノリスに通した。ＡＡＶは結合せず、流出通過した。ＤＮＡは結合し、それによってＡＡＶ含有試料から除去された。その後、ＩＤＡカラムに結合したＤＮＡは、１Ｍ ＮａＯＨによる洗浄ステップによって除去された（図２１）。
アニオン性金属アフィニティーリガンドイミノ二酢酸を有するモノリスにマグネシウムイオンをロードした。次いで、モノリスをｐＨ９．０で５０ｍＭビス－トリス－プロパンで平衡化した。カチオン交換精製ＡＡＶ８の試料をｐＨ９．０に滴定した。試料をモノリスに通した。ＡＡＶは結合せず、流出通過した。ＤＮＡは結合し、それによってＡＡＶ含有試料から除去された。その後、ＩＤＡカラムに結合したＤＮＡは、１Ｍ ＮａＯＨによる洗浄ステップによって除去された（図２１）。
実施例１５ ＩＤＡ－マグネシウムカラムによる宿主細胞ＤＮＡの事前抽出後の、ＴＲＥＮ－マグネシウムカラムからの空カプシドとフルカプシドの最適化された分離
実施例１４に記載のように、カチオン交換精製ＡＡＶの試料からＤＮＡを抽出した。試料をｐＨ９でＴＲＥＮ－マグネシウムカラムに適用した。空カプシドを１０ｍＭ塩化マグネシウムでカラムから洗浄した。フルカプシドを塩濃度上昇勾配で溶出した（図２２）。
実施例１４に記載のように、カチオン交換精製ＡＡＶの試料からＤＮＡを抽出した。試料をｐＨ９でＴＲＥＮ－マグネシウムカラムに適用した。空カプシドを１０ｍＭ塩化マグネシウムでカラムから洗浄した。フルカプシドを塩濃度上昇勾配で溶出した（図２２）。
実施例１６ 第二鉄をロードしたイミノ二酢酸固相、次いでマグネシウムをロードしたＴＲＥＮ固相による勾配分離を用いての連続処理による、宿主細胞ＤＮＡ抽出及び空カプシドとフルカプシドの分離の直列
ＩＤＡカラムに第二鉄をロードし、ｐＨ９に平衡化する。ＴＲＥＮカラムにマグネシウムをロードし、ｐＨ９に平衡化する。２つのカラムをＩＤＡカラムが先になるよう一緒に配管し、次いでｐＨ９でバッファーですすぐ。空カプシド、フルカプシド、及び宿主細胞ＤＮＡを含有する試料をｐＨ９に平衡化する。試料を両カラムに通す。ＤＮＡは第二鉄－ＩＤＡカラムに結合する。ＡＡＶカプシドはＩＤＡカラムを通過し、マグネシウム－ＴＲＥＮカラムによって捕捉される。両カラムを一緒に配管したままで平衡バッファーで洗浄し、次いで、上昇塩勾配によってＴＲＥＮカラムを溶出させ、ＩＤＡカラムに結合したＤＮＡを残す。所望のフルＡＡＶカプシド画分を回収した後、カラムを１Ｍ ＮａＯＨで洗浄する。本方法の変形例では、洗浄ステップの後にＩＤＡカラムをオフラインにして、ＴＲＥＮカラムを独立して溶出させる。
ＩＤＡカラムに第二鉄をロードし、ｐＨ９に平衡化する。ＴＲＥＮカラムにマグネシウムをロードし、ｐＨ９に平衡化する。２つのカラムをＩＤＡカラムが先になるよう一緒に配管し、次いでｐＨ９でバッファーですすぐ。空カプシド、フルカプシド、及び宿主細胞ＤＮＡを含有する試料をｐＨ９に平衡化する。試料を両カラムに通す。ＤＮＡは第二鉄－ＩＤＡカラムに結合する。ＡＡＶカプシドはＩＤＡカラムを通過し、マグネシウム－ＴＲＥＮカラムによって捕捉される。両カラムを一緒に配管したままで平衡バッファーで洗浄し、次いで、上昇塩勾配によってＴＲＥＮカラムを溶出させ、ＩＤＡカラムに結合したＤＮＡを残す。所望のフルＡＡＶカプシド画分を回収した後、カラムを１Ｍ ＮａＯＨで洗浄する。本方法の変形例では、洗浄ステップの後にＩＤＡカラムをオフラインにして、ＴＲＥＮカラムを独立して溶出させる。
実施例１７ 中間タンジェンシャルフロー濾過ステップを用いたアニオン性及びカチオン性金属アフィニティーによるＡＡＶ精製
ＡＡＶ８及び宿主細胞ＤＮＡを含有する細胞溶解物を、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌに平衡化する。イミノ二酢酸を有する不溶性粒子には第二鉄がロードされる。粒子は、５％粒子の割合で細胞溶解物と混合される。試料を６０分間混合してインキュベートし、粒子を容器の底部に沈降させる。上清を、約０．４５ミクロンの平均多孔度を有する膜フィルターを通して濾過する。次いで、３００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過によって、試料を透析濾過する。透析濾過バッファーは、２ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭビス－トリス－プロパン、ｐＨ９．０を含有する。タンジェンシャルフロー濾過は６ダイアボリュームで行われ、その間、タンパク質及びより低分子量の混入物質は膜を通過することによって除去される。マグネシウムをロードしたＴＲＥＮを有するカラムに試料を適用し、実施例１５に記載の条件下で分画する。
ＡＡＶ８及び宿主細胞ＤＮＡを含有する細胞溶解物を、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌに平衡化する。イミノ二酢酸を有する不溶性粒子には第二鉄がロードされる。粒子は、５％粒子の割合で細胞溶解物と混合される。試料を６０分間混合してインキュベートし、粒子を容器の底部に沈降させる。上清を、約０．４５ミクロンの平均多孔度を有する膜フィルターを通して濾過する。次いで、３００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過によって、試料を透析濾過する。透析濾過バッファーは、２ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭビス－トリス－プロパン、ｐＨ９．０を含有する。タンジェンシャルフロー濾過は６ダイアボリュームで行われ、その間、タンパク質及びより低分子量の混入物質は膜を通過することによって除去される。マグネシウムをロードしたＴＲＥＮを有するカラムに試料を適用し、実施例１５に記載の条件下で分画する。
実施例１８ 第二鉄がロードされ塩化マグネシウム直線勾配で溶出されるカチオン性金属アフィニティー基材を用いる、同時ＤＮＡ抽出及び空／フルカプシド分離
ＴＲＥＮモノリスに第二鉄を担持させ、２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０に平衡化した。宿主ＤＮＡを含有したままのカチオン交換クロマトグラフィー精製ＡＡＶ８カプシドを同じ条件に平衡化し、ＴＲＥＮ－Ｆｅモノリスにロードした。カラムを平衡バッファーで洗浄して、非結合種をすすぎ流した。次いで、カラムを、２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０中の２５ｍＭ塩化マグネシウムへの５０ＣＶ直線勾配、次いで２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０中の５０ｍＭ塩化マグネシウムへの１０ＣＶ直線勾配で溶出した。洗浄ステップは２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、２．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０で行い、次いで１Ｍ ＮａＯＨ、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１３でより強力な洗浄ステップを行った。結果を図２３に示す。空カプシドの小さな亜集団が、フルカプシドの主要な集団の前に溶出した。空カプシドの別の亜集団は、フルカプシドのずっと後に溶出した。最初の洗浄ステップはカプシド残屑の小さな集団を除去し、ＮａＯＨステップは、宿主ＤＮＡの大きな集団を除去した。これらの結果は鉄がマグネシウムの存在下でＴＲＥＮに結合したままであることを示唆し、これは、ＴＲＥＮがマグネシウムよりも鉄に対してより強いアフィニティーを有し得ることを示唆することに留意されたい。
ＴＲＥＮモノリスに第二鉄を担持させ、２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０に平衡化した。宿主ＤＮＡを含有したままのカチオン交換クロマトグラフィー精製ＡＡＶ８カプシドを同じ条件に平衡化し、ＴＲＥＮ－Ｆｅモノリスにロードした。カラムを平衡バッファーで洗浄して、非結合種をすすぎ流した。次いで、カラムを、２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０中の２５ｍＭ塩化マグネシウムへの５０ＣＶ直線勾配、次いで２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０中の５０ｍＭ塩化マグネシウムへの１０ＣＶ直線勾配で溶出した。洗浄ステップは２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、２．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０で行い、次いで１Ｍ ＮａＯＨ、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１３でより強力な洗浄ステップを行った。結果を図２３に示す。空カプシドの小さな亜集団が、フルカプシドの主要な集団の前に溶出した。空カプシドの別の亜集団は、フルカプシドのずっと後に溶出した。最初の洗浄ステップはカプシド残屑の小さな集団を除去し、ＮａＯＨステップは、宿主ＤＮＡの大きな集団を除去した。これらの結果は鉄がマグネシウムの存在下でＴＲＥＮに結合したままであることを示唆し、これは、ＴＲＥＮがマグネシウムよりも鉄に対してより強いアフィニティーを有し得ることを示唆することに留意されたい。
実施例１９ マグネシウム勾配で溶出したＴＲＥＮ－Ｆｅによる空カプシドとフルカプシドの分離のための前駆体としてのＩＤＡ－ＦｅとＮＴＡ－Ｆｅの比較
ＩＤＡ粒子に第二鉄をロードし、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７に平衡化した。ＮＴＡ粒子も同様に調製した。カチオン交換クロマトグラフィーで精製したＡＡＶ８粒子の１つの試料に、ＩＤＡ－Ｆｅ粒子を５％の最終割合で添加した。カチオン交換クロマトグラフィーで精製したＡＡＶ８粒子の別の試料に、ＩＤＡ－Ｆｅ粒子を５％の最終割合で添加した。試料を１２０分間混合してインキュベートし、次いで粒子を遠心分離によって除去した。ＩＤＡ－Ｆｅ処理試料を、ｐＨ７でＴＲＥＮ－Ｆｅカラムに適用した。次いで、カラムをｐＨ９．０（２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８）に再平衡化し、５０ｍＭ塩化マグネシウム（同じ塩基バッファー中）への直線勾配で溶出した。次いで、カラムを洗浄し、まず２Ｍ ＮａＣｌ、次いで１Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。ＮＴＡ－Ｆｅ処理した試料を同様に処理した。ＮＴＡ－Ｆｅで処理した試料は、マグネシウムで溶出したＴＲＥＮ－Ｆｅの後、２６０／２８０比３．０２を与えた。ＩＤＡ－Ｆｅで処理した試料は、マグネシウムで溶出したＴＲＥＮ－Ｆｅの後、２６０／２８０比３．０５を与えた。
ＩＤＡ粒子に第二鉄をロードし、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７に平衡化した。ＮＴＡ粒子も同様に調製した。カチオン交換クロマトグラフィーで精製したＡＡＶ８粒子の１つの試料に、ＩＤＡ－Ｆｅ粒子を５％の最終割合で添加した。カチオン交換クロマトグラフィーで精製したＡＡＶ８粒子の別の試料に、ＩＤＡ－Ｆｅ粒子を５％の最終割合で添加した。試料を１２０分間混合してインキュベートし、次いで粒子を遠心分離によって除去した。ＩＤＡ－Ｆｅ処理試料を、ｐＨ７でＴＲＥＮ－Ｆｅカラムに適用した。次いで、カラムをｐＨ９．０（２５ｍＭビス－トリス－プロパン、１％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８）に再平衡化し、５０ｍＭ塩化マグネシウム（同じ塩基バッファー中）への直線勾配で溶出した。次いで、カラムを洗浄し、まず２Ｍ ＮａＣｌ、次いで１Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。ＮＴＡ－Ｆｅ処理した試料を同様に処理した。ＮＴＡ－Ｆｅで処理した試料は、マグネシウムで溶出したＴＲＥＮ－Ｆｅの後、２６０／２８０比３．０２を与えた。ＩＤＡ－Ｆｅで処理した試料は、マグネシウムで溶出したＴＲＥＮ－Ｆｅの後、２６０／２８０比３．０５を与えた。
実施例２０ ホウ酸バッファーの使用による空－フルカプシド分離の最適化
第二鉄を担持させた１ｍＬのＴＲＥＮモノリスを、１００ｍＭホウ酸、５０ｍＭトリス、１％スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０、導電率０．２５ｍＳ／ｃｍで平衡化した。１部のカチオン交換精製ＡＡＶ８を、９９部の４００ｍＭホウ酸、５０ｍＭトリス、１％スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．０、導電率０．７６ｍＳ／ｃｍで希釈し、カラムにロードした。バッファーｐＨ及び導電率が安定化するまで、平衡化バッファーで流れを回復させ、次いで、カラムを、１００ｍＭホウ酸、５０ｍＭトリス、５０ｍＭ塩化マグネシウム、１％スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０、導電率９．６ｍＳ／ｃｍまでの直線勾配で溶出した。空カプシドを２Ｍ ＮａＣｌへのステップで溶出し、次いでカラムを１Ｍ ＮａＯＨ、２Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。全クロマトグラムを図２４に示す。図２５では、フルカプシドの溶出に対応する領域を拡大している。試料希釈バッファーを２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．０、導電率０．８５ｍＳ／ｃｍで置換したことを除いて、実験を繰り返した。結果は本質的に同一であった（示さず）。図２４及び図２５に示す結果は、他のすべての材料及び条件に対して劇的かつ好都合に対比する。図２及び図３に示されるように、塩勾配で溶出された強アニオン交換体上の同一の試料は、大きな空カプシドピークと、それに続く大きなフルカプシドピークとを特徴とするプロファイルを生成する。図５、図１２、図１３、及び図２２に示すように、多価金属カチオンを担持したカチオン性金属アフィニティーカラム上での空カプシドとフルカプシドの分離は、通常、空カプシドが溶出し始め、フルカプシドピークの後縁境界と部分的に重なり合うプロファイルを生成する。図２４及び図２５では、フルカプシドが勾配の中央に溶出するにもかかわらず、フルカプシドピークの先頭側には小さな空カプシドピークしか存在せず、フルカプシドピークの後縁側には明らかな空カプシドは存在しない。代わりに、勾配の小さな最初のピークを除いて、空カプシドはすべて、マグネシウム勾配の後の２Ｎ塩段階で溶出する（図２６）。これは、それらの負電荷が増強されたことを示す。これは、ボレートが空カプシド上の負電荷の修飾によって分離を促進するという仮説を示唆している。
第二鉄を担持させた１ｍＬのＴＲＥＮモノリスを、１００ｍＭホウ酸、５０ｍＭトリス、１％スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０、導電率０．２５ｍＳ／ｃｍで平衡化した。１部のカチオン交換精製ＡＡＶ８を、９９部の４００ｍＭホウ酸、５０ｍＭトリス、１％スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．０、導電率０．７６ｍＳ／ｃｍで希釈し、カラムにロードした。バッファーｐＨ及び導電率が安定化するまで、平衡化バッファーで流れを回復させ、次いで、カラムを、１００ｍＭホウ酸、５０ｍＭトリス、５０ｍＭ塩化マグネシウム、１％スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ９．０、導電率９．６ｍＳ／ｃｍまでの直線勾配で溶出した。空カプシドを２Ｍ ＮａＣｌへのステップで溶出し、次いでカラムを１Ｍ ＮａＯＨ、２Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。全クロマトグラムを図２４に示す。図２５では、フルカプシドの溶出に対応する領域を拡大している。試料希釈バッファーを２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．０、導電率０．８５ｍＳ／ｃｍで置換したことを除いて、実験を繰り返した。結果は本質的に同一であった（示さず）。図２４及び図２５に示す結果は、他のすべての材料及び条件に対して劇的かつ好都合に対比する。図２及び図３に示されるように、塩勾配で溶出された強アニオン交換体上の同一の試料は、大きな空カプシドピークと、それに続く大きなフルカプシドピークとを特徴とするプロファイルを生成する。図５、図１２、図１３、及び図２２に示すように、多価金属カチオンを担持したカチオン性金属アフィニティーカラム上での空カプシドとフルカプシドの分離は、通常、空カプシドが溶出し始め、フルカプシドピークの後縁境界と部分的に重なり合うプロファイルを生成する。図２４及び図２５では、フルカプシドが勾配の中央に溶出するにもかかわらず、フルカプシドピークの先頭側には小さな空カプシドピークしか存在せず、フルカプシドピークの後縁側には明らかな空カプシドは存在しない。代わりに、勾配の小さな最初のピークを除いて、空カプシドはすべて、マグネシウム勾配の後の２Ｎ塩段階で溶出する（図２６）。これは、それらの負電荷が増強されたことを示す。これは、ボレートが空カプシド上の負電荷の修飾によって分離を促進するという仮説を示唆している。
実施例２１ 第四級アミン（ＱＡ）アニオン交換モノリスからのＡＡＶカプシドの分画
ＡＡＶ８カプシドを実施例２０のように調製した。第四級アミンアニオン交換体を平衡化し、実施例２０のように溶出した。溶出プロファイルを図２７に示す。これらの条件下で、ＮａＯＨピーク中のＤＮＡ量は、図２７の量と比較して少ない。これは、クロマチン除去が劣っていることを記録する。さらに、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＵＶ吸光度は、ＱＡカラムがこれらの条件下で、フルカプシドから空カプシドを効果的に分離できなかったことを示す（図２８）。図２９にＴＲＥＮ－Ｆｅ３とＱＡの結果を比較した。相対的クロマチン抽出及び空カプシドとフルカプシドの分離における明らかな相違を超えて、この比較は、従来のアニオン交換クロマトグラフィーに対する本発明の方法の分離化学における劇的な相違を強調する。
ＡＡＶ８カプシドを実施例２０のように調製した。第四級アミンアニオン交換体を平衡化し、実施例２０のように溶出した。溶出プロファイルを図２７に示す。これらの条件下で、ＮａＯＨピーク中のＤＮＡ量は、図２７の量と比較して少ない。これは、クロマチン除去が劣っていることを記録する。さらに、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＵＶ吸光度は、ＱＡカラムがこれらの条件下で、フルカプシドから空カプシドを効果的に分離できなかったことを示す（図２８）。図２９にＴＲＥＮ－Ｆｅ３とＱＡの結果を比較した。相対的クロマチン抽出及び空カプシドとフルカプシドの分離における明らかな相違を超えて、この比較は、従来のアニオン交換クロマトグラフィーに対する本発明の方法の分離化学における劇的な相違を強調する。
参照文献
本明細書に引用される全ての参考文献は、その組み込みが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、参照により本明細書に組み込まれる。
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本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞ フル（full）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド及び空（empty）ＡＡＶカプシドを含む緩衝された混合物（buffered mixture）中の空ＡＡＶカプシドからフルＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
前記緩衝された混合物を、金属アフィニティーリガンドが結合した（attached）第１の基材と接触させるステップ、ここで前記金属アフィニティーリガンドは、３個以上の窒素原子を介して金属イオンを錯化する能力を有する、
前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で、ｐＨ勾配、塩勾配、金属イオン勾配、又はそれらの組み合わせで溶出することにより、フルＡＡＶカプシドから空ＡＡＶカプシドを分離して、精製されたフルＡＡＶカプシド画分を得るステップ
を含む方法。
＜２＞ 前記緩衝された混合物を前記第１の基材と接触させる前、前記緩衝された混合物を前記第１の基材と接触させる最中、及び／又は溶出中に、前記第１の基材に多価カチオンがロードされる、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 前記第１の基材の前記金属アフィニティーリガンドが、ジエチルトリアミン；トリエチルテトラミン；テトラエチルペンタミン；ポリアミドアミン、ポリトリエチルアミン、デフェロキサミン、Ｎ，Ｎ－ビス（２－アミノエチル）－１，２－エタンジアミン、及びトリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）からなる群より選択される、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 溶出中に存在する前記多価金属カチオンが、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、特に、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５＞ 勾配終点における多価カチオンの濃度が、０．１ｍＭ～２００ｍＭ、又は１ｍＭ～１００ｍＭ、又は２ｍＭ～５０ｍＭ、又は５ｍＭ～２５ｍＭの範囲内である、＜１＞～＜４＞のいずれか一項に記載の方法。いくつかの実施形態では、多価イオンの種は、マグネシウム、カルシウム、もしくはバリウム、もしくは銅、又はそれらの混合物であってもよい。
＜６＞ 溶出が、ｐＨ６．０～ｐＨ１０、ｐＨ７．０～ｐＨ９．７５、ｐＨ８．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．５～ｐＨ９．５、ｐＨ９．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、ｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５の範囲内のｐＨ値で、特に、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲内のｐＨで、実施される、＜１＞～＜５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７＞ 溶出が、１Ｍ以下、１ｍＭ～５００ｍＭ、２ｍＭ～２５０ｍＭ、３ｍＭ～１２５ｍＭ、５ｍＭ～６０ｍＭ、又は７ｍＭ～３０ｍＭの範囲内で塩の濃度を上昇させることによって実施される、＜１＞～＜６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜８＞ 溶出が、金属塩の濃度を上昇させることによって実施され、ここで金属イオンは多価金属カチオンであり、好ましくは銅（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、又はそれらの組み合わせである、＜１＞～＜７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９＞ 接触及び／又は溶出が、ボレート（borate）を含むバッファーを用いて実施される、＜１＞～＜８＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１０＞ 前記金属アフィニティーリガンドは溶出前に１種の多価カチオンを担持し、前記ＡＡＶカプシドは第２の種の多価金属カチオンの濃度を上昇させることによって溶出される、＜１＞～＜９＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１＞ 前記緩衝された混合物又は精製された前記フルＡＡＶカプシド画分と、金属アフィニティーリガンドを担持する第２の基材との接触が、前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で行われ、前記金属アフィニティーリガンドは２つ以上の負に荷電したカルボン酸残基を含む、＜１＞～＜１０＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１２＞ 前記緩衝された混合物が、前記第１の基材及び前記第２の基材と同時に処理される、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞ 第２の基材に取り付けられている前記金属アフィニティーリガンドが、イミノ二酢酸などのアミノ－ジカルボン酸及びニトリロ三酢酸などのアミノトリカルボン酸からなる群より選択される、＜１０＞～＜１２＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１４＞ 前記第２の基材の前記アニオン性金属アフィニティーリガンドが、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される多価金属カチオン、特に鉄（ＩＩＩ）を担持している、＜１０＞～＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞ 前記緩衝された混合物と、金属を担持する前記アニオン性金属アフィニティー第２の基材との接触が、ｐＨ６．０～ｐＨ１０、ｐＨ７．０～ｐＨ９．７５、ｐＨ８．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．５～ｐＨ９．５、ｐＨ９．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、ｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５の範囲内のｐＨ値で、特に、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲のｐＨで起こる、＜１０＞～＜１４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１６＞ 前記緩衝された混合物と前記第２の基材との接触が、１Ｍ以下、又は０．１ｍＭ～１ｍＭ～５００ｍＭ、又は２ｍＭ～２５０ｍＭ、又は５ｍＭ～２５０、又は３ｍＭ～１２５ｍＭ、又は１０ｍＭ～１２５ｍＭ、又は５ｍＭ～６０ｍＭ、又は２０～６２、又は７ｍＭ～３０ｍＭの範囲内の塩濃度で起こる、＜１０＞～＜１５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１７＞ 前記緩衝された混合物又は精製フルＡＡＶカプシド画分中に存在する混入ＤＮＡが、前記ＤＮＡを前記第１の基材及び／又は第２の基材に結合させることによって除去される、＜１＞～＜１６＞のいずれか一項に記載の方法。
[11] A Bousher, Review: Unidentate complexes involving borate, J Coord Chem 34 (1995) 1-11.
本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞ フル（full）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド及び空（empty）ＡＡＶカプシドを含む緩衝された混合物（buffered mixture）中の空ＡＡＶカプシドからフルＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
前記緩衝された混合物を、金属アフィニティーリガンドが結合した（attached）第１の基材と接触させるステップ、ここで前記金属アフィニティーリガンドは、３個以上の窒素原子を介して金属イオンを錯化する能力を有する、
前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で、ｐＨ勾配、塩勾配、金属イオン勾配、又はそれらの組み合わせで溶出することにより、フルＡＡＶカプシドから空ＡＡＶカプシドを分離して、精製されたフルＡＡＶカプシド画分を得るステップ
を含む方法。
＜２＞ 前記緩衝された混合物を前記第１の基材と接触させる前、前記緩衝された混合物を前記第１の基材と接触させる最中、及び／又は溶出中に、前記第１の基材に多価カチオンがロードされる、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 前記第１の基材の前記金属アフィニティーリガンドが、ジエチルトリアミン；トリエチルテトラミン；テトラエチルペンタミン；ポリアミドアミン、ポリトリエチルアミン、デフェロキサミン、Ｎ，Ｎ－ビス（２－アミノエチル）－１，２－エタンジアミン、及びトリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）からなる群より選択される、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 溶出中に存在する前記多価金属カチオンが、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、特に、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５＞ 勾配終点における多価カチオンの濃度が、０．１ｍＭ～２００ｍＭ、又は１ｍＭ～１００ｍＭ、又は２ｍＭ～５０ｍＭ、又は５ｍＭ～２５ｍＭの範囲内である、＜１＞～＜４＞のいずれか一項に記載の方法。いくつかの実施形態では、多価イオンの種は、マグネシウム、カルシウム、もしくはバリウム、もしくは銅、又はそれらの混合物であってもよい。
＜６＞ 溶出が、ｐＨ６．０～ｐＨ１０、ｐＨ７．０～ｐＨ９．７５、ｐＨ８．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．５～ｐＨ９．５、ｐＨ９．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、ｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５の範囲内のｐＨ値で、特に、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲内のｐＨで、実施される、＜１＞～＜５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７＞ 溶出が、１Ｍ以下、１ｍＭ～５００ｍＭ、２ｍＭ～２５０ｍＭ、３ｍＭ～１２５ｍＭ、５ｍＭ～６０ｍＭ、又は７ｍＭ～３０ｍＭの範囲内で塩の濃度を上昇させることによって実施される、＜１＞～＜６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜８＞ 溶出が、金属塩の濃度を上昇させることによって実施され、ここで金属イオンは多価金属カチオンであり、好ましくは銅（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、又はそれらの組み合わせである、＜１＞～＜７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９＞ 接触及び／又は溶出が、ボレート（borate）を含むバッファーを用いて実施される、＜１＞～＜８＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１０＞ 前記金属アフィニティーリガンドは溶出前に１種の多価カチオンを担持し、前記ＡＡＶカプシドは第２の種の多価金属カチオンの濃度を上昇させることによって溶出される、＜１＞～＜９＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１＞ 前記緩衝された混合物又は精製された前記フルＡＡＶカプシド画分と、金属アフィニティーリガンドを担持する第２の基材との接触が、前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で行われ、前記金属アフィニティーリガンドは２つ以上の負に荷電したカルボン酸残基を含む、＜１＞～＜１０＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１２＞ 前記緩衝された混合物が、前記第１の基材及び前記第２の基材と同時に処理される、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞ 第２の基材に取り付けられている前記金属アフィニティーリガンドが、イミノ二酢酸などのアミノ－ジカルボン酸及びニトリロ三酢酸などのアミノトリカルボン酸からなる群より選択される、＜１０＞～＜１２＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１４＞ 前記第２の基材の前記アニオン性金属アフィニティーリガンドが、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される多価金属カチオン、特に鉄（ＩＩＩ）を担持している、＜１０＞～＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞ 前記緩衝された混合物と、金属を担持する前記アニオン性金属アフィニティー第２の基材との接触が、ｐＨ６．０～ｐＨ１０、ｐＨ７．０～ｐＨ９．７５、ｐＨ８．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．５～ｐＨ９．５、ｐＨ９．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、ｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５の範囲内のｐＨ値で、特に、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲のｐＨで起こる、＜１０＞～＜１４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１６＞ 前記緩衝された混合物と前記第２の基材との接触が、１Ｍ以下、又は０．１ｍＭ～１ｍＭ～５００ｍＭ、又は２ｍＭ～２５０ｍＭ、又は５ｍＭ～２５０、又は３ｍＭ～１２５ｍＭ、又は１０ｍＭ～１２５ｍＭ、又は５ｍＭ～６０ｍＭ、又は２０～６２、又は７ｍＭ～３０ｍＭの範囲内の塩濃度で起こる、＜１０＞～＜１５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１７＞ 前記緩衝された混合物又は精製フルＡＡＶカプシド画分中に存在する混入ＤＮＡが、前記ＤＮＡを前記第１の基材及び／又は第２の基材に結合させることによって除去される、＜１＞～＜１６＞のいずれか一項に記載の方法。
Claims (17)
- フル（full）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド及び空（empty）ＡＡＶカプシドを含む緩衝された混合物（buffered mixture）中の空ＡＡＶカプシドからフルＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
前記緩衝された混合物を、金属アフィニティーリガンドが結合した（attached）第１の基材と接触させるステップ、ここで前記金属アフィニティーリガンドは、３個以上の窒素原子を介して金属イオンを錯化する能力を有する、
前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で、ｐＨ勾配、塩勾配、金属イオン勾配、又はそれらの組み合わせで溶出することにより、フルＡＡＶカプシドから空ＡＡＶカプシドを分離して、精製されたフルＡＡＶカプシド画分を得るステップ
を含む方法。 - 前記緩衝された混合物を前記第１の基材と接触させる前、前記緩衝された混合物を前記第１の基材と接触させる最中、及び／又は溶出中に、前記第１の基材に多価カチオンがロードされる、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の基材の前記金属アフィニティーリガンドが、ジエチルトリアミン；トリエチルテトラミン；テトラエチルペンタミン；ポリアミドアミン、ポリトリエチルアミン、デフェロキサミン、Ｎ，Ｎ－ビス（２－アミノエチル）－１，２－エタンジアミン、及びトリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）からなる群より選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
- 溶出中に存在する前記多価金属カチオンが、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、特に、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の方法。
- 勾配終点における多価カチオンの濃度が、０．１ｍＭ～２００ｍＭ、又は１ｍＭ～１００ｍＭ、又は２ｍＭ～５０ｍＭ、又は５ｍＭ～２５ｍＭの範囲内である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。いくつかの実施形態では、多価イオンの種は、マグネシウム、カルシウム、もしくはバリウム、もしくは銅、又はそれらの混合物であってもよい。
- 溶出が、ｐＨ６．０～ｐＨ１０、ｐＨ７．０～ｐＨ９．７５、ｐＨ８．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．５～ｐＨ９．５、ｐＨ９．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、ｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５の範囲内のｐＨ値で、特に、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲内のｐＨで、実施される、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の方法。
- 溶出が、１Ｍ以下、１ｍＭ～５００ｍＭ、２ｍＭ～２５０ｍＭ、３ｍＭ～１２５ｍＭ、５ｍＭ～６０ｍＭ、又は７ｍＭ～３０ｍＭの範囲内で塩の濃度を上昇させることによって実施される、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
- 溶出が、金属塩の濃度を上昇させることによって実施され、ここで金属イオンは多価金属カチオンであり、好ましくは銅（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、又はそれらの組み合わせである、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の方法。
- 接触及び／又は溶出が、ボレート（borate）を含むバッファーを用いて実施される、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記金属アフィニティーリガンドは溶出前に１種の多価カチオンを担持し、前記ＡＡＶカプシドは第２の種の多価金属カチオンの濃度を上昇させることによって溶出される、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝された混合物又は精製された前記フルＡＡＶカプシド画分と、金属アフィニティーリガンドを担持する第２の基材との接触が、前記金属アフィニティーリガンドに結合した多価カチオンの存在下で行われ、前記金属アフィニティーリガンドは２つ以上の負に荷電したカルボン酸残基を含む、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝された混合物が、前記第１の基材及び前記第２の基材と同時に処理される、請求項１１に記載の方法。
- 第２の基材に取り付けられている前記金属アフィニティーリガンドが、イミノ二酢酸などのアミノ－ジカルボン酸及びニトリロ三酢酸などのアミノトリカルボン酸からなる群より選択される、請求項１０～請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の基材の前記アニオン性金属アフィニティーリガンドが、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、マグネシウム（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、バリウム（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される多価金属カチオン、特に鉄（ＩＩＩ）を担持している、請求項１０～請求項１３に記載の方法。
- 前記緩衝された混合物と、金属を担持する前記アニオン性金属アフィニティー第２の基材との接触が、ｐＨ６．０～ｐＨ１０、ｐＨ７．０～ｐＨ９．７５、ｐＨ８．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．５～ｐＨ９．５、ｐＨ９．０～ｐＨ９．５、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５、ｐＨ８．９～ｐＨ９．１、又はｐＨ８．９５～ｐＨ９．０５の範囲内のｐＨ値で、特に、ｐＨ８．７５～ｐＨ９．２５の範囲のｐＨで起こる、請求項１０～請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝された混合物と前記第２の基材との接触が、１Ｍ以下、又は０．１ｍＭ～１ｍＭ～５００ｍＭ、又は２ｍＭ～２５０ｍＭ、又は５ｍＭ～２５０、又は３ｍＭ～１２５ｍＭ、又は１０ｍＭ～１２５ｍＭ、又は５ｍＭ～６０ｍＭ、又は２０～６２、又は７ｍＭ～３０ｍＭの範囲内の塩濃度で起こる、請求項１０～請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝された混合物又は精製フルＡＡＶカプシド画分中に存在する混入ＤＮＡが、前記ＤＮＡを前記第１の基材及び／又は第２の基材に結合させることによって除去される、請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
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