CZ302526B6 - Rekombinantní produkce teriparatidu v bakteriích Escherichia coli - Google Patents

Abstract

Rešení se týká rekombinantní prípravy peptidového léciva PTH(1-34) v bakteriích Escherichia coli, kterým je biologicky aktivní fragment lidského parathormonu, skládající se z jeho 34 N-koncových aminokyselin. Podle postupu je peptid PTH(1-34) exprimován v bakteriích jako fúzní protein, a to ve vysokých výtežcích, který je snadno, efektivne a pomerne levne purifikován z bakteriální kultury.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká biotechnologické přípravy teriparatidu, což je generický název pro terapeuticky aktivní část lidského parathormonu, skládající se z 34 N-koncových aminokyselin původního peptidového hormonu (tzv. PTH(l-34)). Teriparatid je v předkládaném vynálezu připravován rekombinantně v bakteriích Escherichia coli ve formě fúzního proteinu. Výhoda tohoto vynálezu spočívá vtom, že peptid PTH(l-34) je díky použitému fúznímu proteinu produkován bakteriemi ve vysokých výtěžcích, a fúzní protein navíc umožňuje jeho snadnou, efektivní a finančně nenáročnou purifikaci. Teriparatid je využitelný k léčbě osteoporózy.

Dosavadní stav techniky

Lidský parathormon (PTH) hraje důležitou roli v regulaci homeostázy vápníku a fosfátů v lidském organismu. PTH zajišťuje mobilizaci vápníku a fosfátů uložených v kostech a zvyšuje příjem vápníku v tenkém střevě a vylučování fosfátů ledvinami. PTH navíc spouští cAMP-dependentní proteinkinasu v někteiých populacích kostních buněk nesoucích PTH receptory, což stimuluje proliferaci osteobiastů. PTH je sekretován příštítnýmí tělísky jako polypeptid skládající se z 84 aminokyselin (PTH(l-84)) (Bonn, 1996; Kronenberg et al., 1993). Peptidový fragment složený z 34 N-koncových aminokyselin PTH (PTH(l-34)) je plně biologicky aktivní. Jelikož injekční podávání PTH(1-34) zvyšuje novotvorbu kostní tkáně a vede ke zlepšení kvality a pevnosti kostí, je tento peptid pod generickým názvem teriparatid používán k léčbě osteoporózy (Bonn, 1996; Hodsman et al. 2005; Whitfield and Morley, 1995).

Aby se PTH (1-34) mohl stát dostupným léčivem pro širokou veřejnost, je nezbytné docílit jeho produkce ve vysokých výtěžcích za nízkou cenu. V podstatě existují dva přístupy pro produkci peptidů, a to chemická syntéza a rekombinantní DNA technologie. Chemická syntéza peptidů, mj. i teriparatidu, je popřána např. v patentovém dokumentu W02008/109079, GB 1 559 610 A a US 4 086 196. Základním principem syntézy peptidů na pevné fázi je postupná příprava peptidového řetězce z jednotlivých aminokyselin na nerozpustném polymerním nosiči. Přebytky činidel se odstraňují prostým odsáváním a promýváním, hotový peptid se z nosiče odštěpí a podrobí se čistění pomocí HPLC purifikace. Chemická syntéza peptidů je vhodná pro kratší peptidy (do cca 30 aminokyselin), jelikož při přípravě delších peptidů narážíme na limitaci této metody. Ta spočívá především vtom, že během procesu vznikají chyby v rostoucím aminokyselinovém řetězci a získáváme řadu velmi podobných peptidů, které se od sebe mohou lišit absencí třeba jen jedné aminokyseliny, a ty je zpravidla obtížné separovat dostupnými technikami. I když je pomocí dvoustupňové HPLC purifikace většinou docílena velmi vysoká čistota syntetického peptidů, není možné se 100% vyhnout riziku kontaminace. Z hlediska použití daného peptidů v humánní medicíně je přítomnost kontaminujících látek klíčová. Na druhé straně biotechnologicky získaný peptid by měl být vždy jen jedna chemická entita, u níž nehrozí kontaminace potenciálně nebezpečnými meziprodukty s jedním nebo několika máto chybějícími aminokyselinovými jednotkami. Průmyslová výroba delších peptidů pomocí rekombinantních technik s využitím mikroorganismů se proto jeví jako slibná alternativa.

Nejčastěji používaný prokaryotní produkční organismus je bezesporu bakterie Escherichia coli. Bakterie neumí produkovat proteiny vyžadující posttranslační modifikace, jako jsou např. glykosylace, proto nejsou vhodným expresním systémem pro produkci glykoproteinů. PTH(l-34) ale glykosylován není. Obecné metody produkce rekombinantních proteinů v bakteriích zahrnují přímou intracelulámí expresi a sekreci proteinu do periplazmatického prostoru (tzn. těch proteinů, které navíc obsahují tzv. sekreční signál, který je cílí do periplasmy) (Ruml et al., 2002). Rekombinantní proteiny, které se v bakteriích produkují ve vysokém množství a zůstávají v cytoplasmě, jsou často exprimovány ve formě inkluzních tělísek, zkteiých se biologicky aktivní protein

- I CZ 302526 B6 získává poměrně obtížně (purifíkace zahrnuje denaturací a renaturaci) a tato cesta často i prodražuje vlastní purifíkační proces. V případě, že rekombinantní protein je cílem do periplasmatického prostoru bakterie, je tvorba inkluzních tělísek vyloučena. Periplasmatická lokalizace proteinu přináší i další výhody, jako např. přítomnost menšího počtu proteas ve srovnání s cytosolem a usnadnění purifíkace daného proteinu z důvodu menšího počtu kontaminujících protein (Lee et al., 2005).

Výhodou bakterií je jejich rychlý růst v levném médiu, takže rekombinantní produkce terapeutických proteinů v bakteriích potenciálně umožňuje získat vysoké výtěžky požadovaného produktu io za nízkou cenu. V praxi se však produkce biologicky aktivních peptidů a bakterií E. coli bohužel setkává s nízkými výtěžky, a to především z důvodu nízké stability jejich mRNA (Rabbani et al.,

1988), intracelulámí degradace krátkých rekombinantních peptidů a obtížné purifíkace peptidů od kontaminujících proteinů (Nakagawa et al.; 1994; Oldenburg et al., 1994). Ke zvýšení výtěžku může být ale využito několik strategií klonování.

První metoda reprezentuje tzv, genovou polymeraci, kdy je příslušný gen exprimován jako polymer a výsledný protein-polymer je následně specificky chemicky nebo proteolyticky štěpen na jednotlivé peptidy-monomery. PTH(l-34)-analog byl metodou genové polymerace produkován podle Oldenburg a kol. (Oldenburg et al., 1994).

Další metoda spočívá v použití vhodné fúzní značky. PTH(l-34) a PTH(l-84) byl připravován ve fúzi s rozličnými fúzními značkami, jako např. glutathion-S-transferasou-GST-(Gangireddy et al., 2010; Smith and johnson, 1988), β-galaktosidasou (Suzuki et al, 1998) (W02009/019715AI), cro-p-galaktosidasou (Wingender et al., 1989), lidským růstovým hormonem - hGH

2? (Gardella et al. 1990), thioredoxinem - Trx (Fu et al., 2005; Liu et al., 2007) (W02007/112677A1), proteinem A (Kareem et al., 1992), fosforibulokinasou (WO 1999/00527) apod. Fúzní značka může být po úspěšné expresi oddělena od požadovaného peptidů proteolyrickým štěpením díky specifické rozpoznávací sekvenci, která je umístěná mezi zmíněným fúzním proteinem a vlastním peptidem. K uvolnění PTH(l-24) nebo PTH(1~84) od fúzní značky bylo použito spe50 cifické štěpení proteinů proteasami jako např enterokinasou (Liu et al„ 2007) (W02009/019715A1, W02007/112677A1, EP2 173 768), faktorem Xa(Gangireddy et al.; 2010; Gardella et ak, 1990; Kareem et al., 1992)), Kex2 proteasou (Suzuki et al., 1998) (EP 0 794 255) a urokinasou (WO 1999/005277).

Gardella a kok (1990) exprimovali gen pro PTH(l-84) ve fúzi s genem pro lidský růstový hormon (hGH, z angl. human growth hormone), vzájemně oddělené sekvencí pro štěpení faktorem Xa (hGH-rXa-PTH(184)). Intaktní PTh(l-84) byl z fúzního proteinu uvolněn pomocí specifického štěpení faktorem Xa. Výtěžek PTH(l-84) Činil jen 1,5 až 3 mg/1 bakteriální kultury, což je pro průmyslovou výrobu nedostačující.

Kareem a kol. (1992) popsali podobné výsledky, rovněž s nízkým výtěžkem, s použitím obdobného fúzního proteinu, kde byl namísto lidského růstového hormonu (hGH) použit protein A (protein A-rXa-PTH(l-84)).

Wingender a kok (1989) připravili PTH(l-34) ve fúzi s cro—β—galaktosidasou. Fúzní protein v bakteriích tvořil inkluzní tělíska, která byla denaturována 8M močovinou. Následovalo uvolnění PTH(l-84) z fúzního proteinu v kyselém prostředí. Štěpení proteinů v kyselém prostředí, ale vede k tvorbě mnoha nespecifických produktů, které je obtížné separovat, a navíc kyselé pH může vést k ovlivnění biologické aktivity cílového peptidu/proteinu.

Patent WO1999/005277 popisuje přípravu PTH(l-84), kterýje připojen k fosforibulokinase. Fúzní protein je bakteriemi produkován ve formě inkluzních tělísek, které jsou denaturovány 8M močovinou. Následně je PTH(l-84) z fúzního proteinu uvolněn specifickým štěpením urokinasou, jejíž rozpoznávající místo se nachází mezi fosforibulokinasou a PTH(l-84). PTH(l-84) byl nakonec purifikován pomocí iontové chromatografíe a RPHPLC.

Suzuki a kol. (1998) připojili gen pro PTH0-34) kfúznímu genu pro část modifikované βgalaktosidasy a peptidy obsahující několik histidinů, přičemž PTH(l-34) byl od fúzní částí oddělen sekvencí pro specifické štěpení Kex2 proteasou (p-galaktosidasa(l-l 17)-HHHHPGG5 rKex2-PTH(l-34)). Fúzní protein se v bakteriích produkoval ve formě inkluzních tělísek, z kterých byl získáván denaturací 8M močovinou, která byla následně ředěna na 3M močovinu. Následovalo uvolnění PTH(l-34) z fúzního proteinu specifickým štěpením Kex2 proteasou. Nakonec byl PTH(l-34) purifíkován ionexovou chromatografií a dvoustupňovou chromatografií s reverzní fází. Suzuki a kol. uvádí, že z důvodu udržení proteinu v rozpustné formě je vedle 3M io močoviny navíc nezbytný přídavek CaCb o koncentraci 2,5 mM, který brání srážení proteinu během štěpení. Přítomnost močoviny a CaCU ale vede k vysokým nárokům na koncentraci Kex2 proteasy, která je nutná pro uvolnění PTH(l-34) z fúzního proteinu (molární poměr 1:2000 enzym:substrát). Velké množství Kex2 proteasy tedy hraje velkou roli v primárních nákladech na produkci PTH(l-34) a prodražuje tak celý proces.

Gangireddy a kol. (2010) produkovali PTH(l-34) ve formě rozpustného fúzního proteinu, který obsahoval glutathion-S-transferasu (GST) a PTH(l-34), vzájemně oddělené rozpoznávacím místem pro štěpení faktorem Xa (GST-rXa-PTH(l-34)). Pro purifikací fúzního proteinu byla využita přítomná GST (glutathion-S-transferasa), která se váže na bioafinitní kolonu s imobili20 zovaným glutathionem. Náplně biofinitních kolon ale bývají drahé, a právě z toho důvodu nejsou vhodné pro puriflkaci proteinů v průmyslovém měřítku. PTH(l-34) byl od GST specificky odštěpen působením faktoru Xa a nakonec byl purifíkován pomocí RP-HPLC.

Nakagawa a kol. (1994) připravili PTH0-34) tak, že ho uvolnili z [Cys35]PTH(l-84) specific25 kým chemickým štěpením, které zahrnovalo štěpení Cys zbytků s připojeno CN skupinou v[Cys35]PTH(l-84) v alkalickém prostředí. [Cys.35]PTH(l-84) byl připraven rekombinantně v bakteriích E. coli (Oshika et al., 1994). Popsané chemické štěpení velo k mnoha nespecifickým produktům, čímž se výrazně snížil výtěžek PTH0-34).

Jin a kol. (2000) popisují puriflkaci PTH(l-34), který byl produkován v E. coli ve formě inkluzních tělísek. Inkluze byly denaturovány 7M močovinou. Peptid byl purifíkován na koloně s reverzní fází, následně pomocí kotexové iontové chromatografíe a nakonec pomocí RP-HPLC. Tato metoda, využívající několik následných chromatografických technik, je pro produkci PTH0-34) z finančního hlediska v průmyslovém měřítku vhodná,

Fu a kol. (2005) popisují metodu přípravy PTH0-34) ve fúzi s thioredoxinem (Trx). Inkluzní tělíska fúzního proteinu Trx-PTH(l-34) byla denaturována Tritonem-XlOO a vysokou teplotou 80 °C po dobu 15 min. Tento postup ale vystavuje peptid/protein riziku vysoké teploty, což může vést k ovlivnění jeho biologické aktivity.

Patent CN 1 417 231 popisuje přípravu PTH0-34) ve formě fúzního proteinu, který v bakteriích tvoří inkluzní tělíska. Metoda zahrnuje puriflkaci inkluzních tělísek, jejich denaturací a renaturaci, uvolnění PTH0-34) z fúzního proteinu trombinem a finální puriflkaci PTH0-34) pomocí katexové iontové chromatografíe. Nedostatkem této metody je použití trombinu pro uvolnění

PTH0-34) z fúzního proteinu, jelikož cílový peptid/protein uvolněný z fúzního proteinu pomocí trombinu nemá zachován intaktní N-konec. N-konec cílového proteinu je modifikován Gly nebo Gly-Ser, což může ovlivnit jeho biologickou aktivitu. Štěpení fúzního proteinu trombinem je kromě výše zmíněného faktu často provázeno nespecifickým štěpením fúzního proteinu mimo vloženou rozpoznávající sekvenci, což navíc vede ke snížení výtěžku a komplikacím v odstranění nespecifických produktů.

Patent CN 1 424 325 popisuje přípravu PTH0-34) ve fúzi s GST. Fúzní protein je nejprve Štěpen trombinem. Purifikace proteinu probíhá na bioafinitní koloně s imobilizovaným chymotrypsinem. Následuje další štěpení proteinu prolin-endopeptidasou a další chromatografické techniky pro

- j CZ 302526 B6 purifikaci PTH0-34). Tento proces přípravy PTH(l-34)je komplikovaný a zahrnuje štěpení dvěma specifickými proteasami, což značně podražuje celou metodu.

Chen a kol. připravili PTH(l-34) ve fúzi s doménou vázající celulosu (CBD), mezi PTH(l-34) aCBD se nachází specifické místo pro štěpení faktorem Xa. Fúzní protein byl purifikován na bioafinitní koloně s imobilizovanou celulosou . PTH( 1-34) byl z fúzního proteinu uvolněn pomocí enzymu faktoru Xa a nakonec byl purifikován pomocí RP-HPLC. Proces vedl k výtěžku jen 3 mg/l bakteriální kultury, což je pro průmyslové účely nedostačující.

Gram a kol. (1994) připravili PTH0-38) ve fúzi s gp55 proteinem (protein z bakteríofága T4). Fúzní protein tvořil v bakteriích inkluzní tělíska, která byla denaturována. Následovalo štěpení v kyselém prostředí (HCl), během kterého se z fúzního proteinu uvolnil aspartyl-propyl-PTH(l38)”. Dipeptid aspartyl-propyl byl následně z PTH(l-38) uvolněn působením dipeptidyl peptidasy IV. Podobně jako u práce Wingender a kol. (1989), štěpení proteinů v kyselém prostředí může vést k tvorbě mnoha nespecifických produktů, které je obtížné separovat, a kyselé pH navíc může ovlivnit biologickou aktivitu cílového peptidu/proteinu.

Oldenburg a kol. (1994) představil expresi analogu PTH(l-34) s využitím genové polymerace, kdy oktamer analogu PTH(l-34) byl štěpen na jednotlivé monomery pomocí bromkyanu, který specificky štěpí proteiny za methioninem. Aby pro štěpení peptipolymeru na peptidy-monomery mohl být použit právě bromkyan, bylo nutné pozměnit aminokyselinovou sekvenci PTH0-34) tak, aby se methioniny nacházely uvnitř peptidového řetězce, ale naopak aby byl methionin přítomný na jeho C-konci. Z tohoto důvodu byla využita syntetická oligonukleotidové sekvence kódující analog PTH0-34), a to konkrétně [Le^8,18, Tyr^34, Met³⁵]-PTH(l-34). Oldenburg a kol. tak připravili bakterie E. coli produkující oktamer peptidů [Leu^8,18, Tyr³⁴, Met³⁵] -PTH0-34), který navíc obsahoval histidinovou kotvu, a to ve formě inkluzních tělísek. Oktamer byl denaturován 10% SDS (dodecylsulfátem sodným), následovalo specifické štěpení bromkyanem, který štěpí za methioninem. Tímto krokem byl z oktameru uvolněn peptid-monomer [Leu^8,18, Tyr³⁴, Hse^3í]-PTH( 1-34), kde byl Met po štěpení bromkyanem přeměněn za homoserinlakton, který je v rovnováze s homoserinem (Armstrong, 1949). Bylo dokázáno, že analog PTH(I-34) (tzn. [Le⁸¹⁸, Tyr³⁴, Hse³⁵] -PTH0-34)) vykazuje srovnatelnou biologickou aktivitu jako samotný PTH0-34) (Oldenburg et al., 1994). Z důvodu vysoké toxicity bromkyanu ale tato metoda není vhodná pro produkci peptidů v průmyslovém měřítku.

Liu a kol. (2007) připravili PTH0-84) ve formě rozpustného fúzního proteinu His-Trx-rEKPTH0-84), který obsahoval His kotvu, thioredoxin, specifickou sekvenci pro štěpení enterokinasou a PTH( 1 -84). Fúzní protein byl specificky štěpen enterokinasou za uvolnění PTH(l-84).

Patent W02007/1126787A1 popisuje přípravu PTH0-34) ve formě fúzního proteinu, který obsahuje thioredoxin (Trx), Histidinovou kotvu (His), specifické místo pro štěpení enterokinasou (rEK) (Trx-His-rEK-Pth(l-34)).

Patent W020009/019715A1 popisuje přípravu PTH0-34) ve formě fúzního proteinu obsahující histidinovou kotvu (His), β-galaktosidasu a specifické místo pro štěpní enterokinasou (rEK) (Hís-|3-galaktosidasa-rEK-PTH(l-34)).

Patent EP 2 173 768 popisuje přípravu PTH0-34) ve formě fúzního proteinu obsahujícího βgalaktosidasu, histidinovou kotvu (His) a specifické místo pro štěpení enterokinasou (eEK) (βgalaktosidasa-His-rEK-PTH( 1-34)).

Patentové dokumenty CN 101 555 482 A, CN 1 807 456A, CN 1 212 336 C, 12N15/62 popisují variace již výše uvedených principů, nepřinášející výrazný technický efekt.

-4CZ 302526 B6

Kvasinky (nejčastěji Saccharomyces cerevisiae) představují vedle bakterií další mikroorganismy použitelné pro produkci rekombinantních proteinů. Jelikož se jedná o eukaryotní organismy, jimi produkované proteiny bývají posttranslačně modifikovány, např. glykosylovány. Produkce proteinů v kvasinkách nabízí několik výhod, a to především rychlou a jednoduchou produkci s vyso5 kým výtěžkem (který je ale nižší než v bakteriích), nízkou cenu kultivačního média a možnost produkce glykoproteinů. Přítomnost glykosylací však limituje využití kvasinkového expresního systému pro produkci proteinů, které glykosylace nevyžadují. Rekombinantní proteiny mohou být v kvasinkách produkovány intracelulámě nebo může být upravena sekvenčním dráha tak, aby byly proteiny sekretovány do média, což značně usnadňuje purifikaci daného proteinu (Byme et io al., 2005; Cereghino and Cregg, 2000).

Produkce PTH(l-84) v kvasinkách byla testována vědeckou skupinou Olstad a kol. (Oldstad et al., 1992) a Gautvik a kol. (Gautvik et ak, 1991). PTH(l-84) byl produkován ve fúzi s kvasinkovým α-faktorem, který cílí protein ven z buňky do média. Jako expresní systém byly použity is kvasinky Saccharmyces cerevisiae. Bylo zjištěno, že PTH(l-84) byl v kvasinkách O-giykosylován (Gautvik et al., 1991; Olstad et al., 1992). Glykosylovaný peptid se ale odlišuje od své nativní lidské formy, což může mít za následek zvýšenou imunogenitu v lidském organismu.

Produkce peptidu kvasinkami (či jinými eukaryotními organismy) vede kjeho glykosylaci, čímž se ale peptid odlišuje od své nativní lidské formy, což může způsobit zvýšenou imunogenitu takového glykosylovaného peptidu v lidském organismu. Produkce peptidu bakteriemi tímto nedostatkem netrpí, ale naráží na jiné překážky. Předchozí studie ukázaly, že rekombinantní produkce samostatného PTH(l-84) a PTH(l-34) vede k velmi nízkým výtěžkům, a to především kvůli nestabilitě jeho mRNA a rovněž kvůli rychlé degradaci peptidu intracelulámími proteasami (Nakagawa et al., 1994; Oldenburg et al., 1994; Rabbani et al„ 1988). Zvýšení rekombinantní produkce peptidu bylo dosaženo metodou genové polymerace. Tato metoda s sebou ale přináší nutnost pozměnění aminokyselinové sekvence peptidu z důvodu specifického štěpení peptidu— polymeru na peptíd-monomer (Oldenburg et al., 1994). Jako další metoda pro zvýšení rekombinantní produkce peptidu, a to bez změny aminokyselinové sekvence, připadá v úvahu použití fúzního proteinu, např. lidského růstového hormonu (Gardella et al., 1990), proteinu a (Kareem et al., 1992), thioredoxinu (Liu et al., 2007), β-galaktosidasy (Suzuki et al., 1998), glutathion-Stransferasy (GST) (Gangireddy et al., 2010; Smith and Johnson, 1988), protein vázajícího maltosu (MBP) (di Guan et al,, 1988) a dalších. Při plánování rekombinantní produkce peptidu v průmyslovém měřítku je vedle vysokého výtěžku nutné sledovat i cenu purifikačního procesu.

Mnohé z výše zmíněných fúzních proteinů vedle toho, že zvyšují bakteriální produkci peptidu, rovněž působí jako afinitní značka pro purifikaci daného proteinu pomocí bioafinitní chromatografie. Mezi tyto afinitní značky patří např. GST, který se váže na glutathion (interakce enzymsubstrát) a MBP, který se váže na amylosu (interakce protein sacharid). Je ale nutné zdůraznit, že právě použití takovýchto afinitních značek, tzv. bioligandů, často prodražuje vlastní purifikační proces z důvodu, že náplň biofinitních kolon mají a) nízkou kapacitu a b) jsou drahé. Z hlediska kapacity a ceny afinitní kolony se jeví jako nejefektivnější Ni²⁺ chelatační kolona, která váže proteiny s přítomnou histidínovou kotvou (Smith and Pidgeon, 1984). Kapacity Ni²⁺ chelatačních kolon bývají 2,5 až 5x větší než kolon bioafinitníqh ajejich cena je také příznivější.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je fúzní protein MBP-His-r(Spec)-PTH, obsahující ve svém řetězci sekvenci proteinu vázajícího maltosu (MBP), histidínovou kotvou (His) a sekvenci teriparatidu (PTH0-34)) oddělenou od fúzní části specifickou sekvencí r(Spec) pro štěpení vhodným enzymem, například enterokinasou (rEK) nebo TEV proteasou (rTEV), který je vhodný pro přípravu biologicky aktivní části lidského parathormonu (PTH(l-34)) v bakteriích Escherichia coli. Dále jsou předmětem vynálezu sekvence DNA kódující fúzní protein podle vynálezu, vektory obsahující sekvenci DNA kódující fúzní protein podle vynálezu, jakož i buňky Escherichia coli transfor- 5 CZ 302526 B6 mované těmito vektory, a dále způsob přípravy teriparatidu zahrnující použití fúzního proteinu, sekvencí DNA, rekombinantních vektorů nebo transformovaných buněk podle vynálezu.

Podstatou vynálezu je spojení sekvencí MBP, His a PTH(l-34) do fúzního proteinu výše uvede5 ným způsobem, umožňujícím zároveň dosahovat vysokého výtěžku produkce tohoto fúzního proteinu v bakteriích E. coli, provádět jeho snadnou, efektivní a finančně nenáročnou purifíkaci, a vysoce selektivním způsobem enzymového štěpení zabudované specifické sekvence získávat z puriUkovaného fúzního proteinu teriparatid v kvalitě umožňující průmyslovou predikci pro farmaceutické účely.

Detailní popis vynálezu

Rekombinantní vektory podle vynálezu představují základ pro nový způsob biotechnologické produkce teriparatidu (PTH(l-34)). Teriparatid, kteiý je využitelný pro léčbu osteoporózy, je krátký peptid (34 aminokyselin), jehož samotná produkce bakteriemi vede k velmi nízkým výtěžkům, především z důvodu nestability jeho mRNA v bakteriích ajeho rychlé degradaci bakteriálními intracelulamími proteasami (Nakagawa et al., 1994; Oldenburg et al., 1994; Rabbani et al., 1988).

Naši snahou bylo zkonstruovat vektory pro expresi fúzního proteinu, které byl a) zajistily vysoké výtěžky bakteriální produkce peptidu a b) umožnily efektivní a levnou purifíkaci daného proteinu. Ačkoliv problém se již snažila řešit řada autorů a jsou známy obecné přístupy, jež by k úspěšnému řešení měly vést, žádný z dosud publikovaných způsobů nevede kplně uspokojivému řešení, jež by mohlo posloužit za základ biotechnologického procesu pro průmyslovou výrobu teriparatidu. To naznačuje, že o zdárném výsledku konkrétního řešení zřejmě rozhodují subtilní detaily, jejichž vliv nikdo nedokáže předem odhadnout. Naše pokusy potvrdily, že k úspěšnému řešení nemusí vždy vést cesta, která by se podle teoretických předpokladů mohla jevit jako nejperspektivnější. Připravili jsme několik variant expresních vektorů, které kódují různé fúzní proteiny. Některé fúzní protein navíc obsahovaly sekvenční signální sekvenci, která cílí daný protein do periplasmatického prostoru bakterie, kde je nižší koncentrace bakteriálních proteas. Ostatní fúzní proteiny sekreění signální sekvenci neobsahovaly, a zůstávaly tudíž v cytosolu bakterií. Produkce různých fúzních proteinů bakteriemi byla testována a výsledky všech experimentů byly porovnány. Přehled navržených fúzních proteinů a úspěšnost jejich produkce bakteriemi £. coli uvádí tabulka č. 1.

Tabulka č. 1: přehled navržených fúzních proteinů a úspěšnost jejich produkce bakteriemi E. coli.

Expresní plasmid	Fúzní protein	Sekvence id. δ	Lokalizace proteinu	Úspěšnost bakteriální produkce	Viz příklad č.
pfvíAL-p2x-His-rEK-PTH	pMBP-His-rEK-PTH	1	periplasma	+/-	1-2
pMAL-p2x-His-rTEV-PTH	pMBP-His-rTEV-PTH	2	periplasma	+/-	1-2
pMAL-c2x-His-rEK-PTH	cMBP-His-rEK-PTH	1	cytosol	+	1-6
pMAL-c2x-His-rTEV-PTH	cMBP-His-rTEV-PTH	2	cytosol	+	1-6
pET-45b(+->-His-rEK-PTH	His-rEK-PTH	6	cytosol	-	7
pET-45b(+)-His-rTEV-PTH	His-rTEV-PTH	8	cytosol	-	7
pET-45b(+)-QmpA-His-rEK-PTH	OmpA-His-rEK-PTH	10	periplasma	-	7
pET-45b(+) OmpA-His-rTEV-PTH	OmpA-His-rTEV-PTH	12	periplasma	-	7
pET-45b(-»-)-OmpA-PTH	OmpA-PTH	14	periplasma	-	7

-6CZ 302526 B6

Pozn. pMBP = protein vázající maltosu (MBP), který je cílen do periplasmatického prostoru (tzn. obsahuje sekreční signální sekvenci); cMBP - protein vázající maltosu (MBP), který zůstává v cytosolu (tzn. neobsahuje sekreční signální sekvenci) + proces produkce fúzního proteinu vedl k vysokým výtěžkům +/- proces produkce fúzního proteinu vedl k velmi nízkým výtěžkům proces produkce fúzního proteinu vedl k nulovým výtěžkům

Ukázalo se, že bakteriální exprese fúzních proteinů cílených do periplasmatického prostoru, a to konkrétně proteinů pMBP-His-rEK-PTH, pMBP-His-rTEV-PTH, OmpA-His-rEK-PTh, OmpA-His-rTEV-PTH, OmpA-PTH, vedla k nulovým nebo velmi nízkým výtěžkům, přestože je známo, že v periplasmatickém prostoru je ve srovnání s cytosolem bakterie nižší koncentrace bakteriálních proteas schopných štěpit produkovaný rekombinantní peptid/protein. Je též známo, že připojení proteinu vázajícího maltosu (MBP) k peptidu může značně zvýšit expresi fúzního proteinu a zároveň jeho stabilitu v bakterii E. coli (di Guan et al., 1988). U fúzních proteinů pMBP-His-rEK-PTh, pMBP-His-rTEV-PTH však kombinace obou přístupů očividně selhala.

Exprese fúzního proteinu His-rEK-PTH a His-rTEV-PTH, který zůstával v cytosolu bakterie, vedla k nulovým výtěžkům. Histidinová kotva (Smith and Pidgeon, 1984) sice umožňuje použití finančně výhodnějších afmitních chromatografických kolon, ale v případě teriparatidu se ukázalo, že samotné připojení histidinové kotvy k peptidu nestačí kjeho vysoké bakteriální produkci.

Na rozdíl od výše zmíněných fúzních proteinů, exprese proteinu MBP-His-r(Spec)PTH (např. MBP-His-rEK-PTH nebo MBP-His-rTEV-PTH), s lokalizací v cytosolu bakterie, překvapivě vedla k vysokým výtěžkům fúzního proteinu. Fúzní protein MBP-His-r(Spec)PTll obsahuje protein vázající maltosu (MBP), histidinovou kotvu (His) a teriparatid (PTh(l~34)). Teriparatid je od fúzní části oddělen specifickou sekvencí pro štěpení vhodným enzymem (například enterokinasou (rEK) nebo TEV proteasou (rTEV)). K efektivní purifikaci připraveného fúzního proteinu postačuje afinitní chromatografie na Ni²⁺ v případě potřeby (například pro přípravu analytického standardu) je však možno provést ještě jeho přečištění na bioafinitní koloně využívající interakce se sekvencí MBP. Po štěpení sekvence r(Spec) příslušným specifickým enzymem lze připravený teriparatid izolovat a finálně purifikovat kterýmkoliv obvyklým způsobem.

Podstata úspěšné přípravy rekombinantních peptidů v bakterii E. coli, jakoje příprava teriparatidu, tedy spočívá nejen v nalezení správného fúzního proteinu, tj. vhodné aminokyselinové sekvence i její délky, ale i ve výběru lokalizace produkovaného proteinu, tzn. zda má zůstat v cytosolu bakterie nebo má být transplantován do jejího periplasmatického prostoru. Pro průmyslové použití dále hraje zásadní roli možnost jednoduché a levné separace připraveného fúzního proteinu od ostatních biomolekul vytvářených produkčním mikroorganismem, dále i možnost snadného specifického odštěpení peptidu a jeho finální purifikace.

Námi připravený fúzní protein MBP-His-r(Spec)-PTH, všechny tyto požadavky splňuje v bakteriích je produkován ve vysokých výtěžcích a jeho purifikace z bakteriální kultury, včetně závěrečného odštěpení teriparatidu, představují efektivní a finančně nenáročný proces.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. č. 1

Expresní vektor pMAL-c2x-His-rEK-PTH pro expresi fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTh.

Obr. ě. 2

Expresní vektor pMAL-c2x-His-rTEV-Pl h pro expresi fúzního proteinu MBP-His-rTEV-PTh.

- 7 CZ 302526 B6

Obr č. 3

Dokumentace exprese MBP-His-rEK-PTH (49 kDa) v bakterii E. coli v případě (A) periplasmatické lokalizace a (B) cytosolické lokalizace pomocí Glycin-SDS-PAGE (12% gel). A) V sloupci označeném jako M je molekulový markér Přec ision Plus Protein Unstained Standard (Bio-Rad); v sloupci označeném jako NI jsou periplasmatické bakteriální proteiny z bakterie E. coli XL1—Blue s expresním vektorem pMAL-p2x-His-eEK-PTh před indukcí exprese pomocí 1PTG (isopropyΙ-β-D-l-thiogalactopyranosid); v sloupci označeném jako I jsou periplasmatické bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-p2xHis-rEK-PTH po 3 h od indukce exprese pomocí 1PTG. Β) V sloupci označeném jako M je molekulový markér Precision Plus Protein Unstained Standard (Bio-Rad); v sloupci označeném jako NI jsou všechny bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-c2x-His-rEK-PTH před indukcí exprese pomocí IPTG; v sloupci označeném jako I jsou všechny bakteriální proteiny z bakterie E, coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL—c2xHis-rEK-PTH po 3 h od indukce exprese pomocí IPTG.

Obr. č. 4

Dokumentace průběhu purifikace MBP-His-rEK-PTH (49 kDa) pomocí Glycin-SDS-PAGE (10% gel). Fúzní protein MBP-his-rEK-PTH byl purifikován na základě afinitní chromatografie s využitím Ni²⁺ chelatační kolony. V sloupci označeném jako M je molekulový markér Ml2 Unstained Standard (Invitrogen); v sloupci označeném jako NI jsou všechny bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-c2x-HisrEK-PTH před indukcí exprese pomocí IPTG; v sloupci označeném jako I jsou všechny bakteriální proteiny z bakterie E, coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-c2x-His-rEK-PTH po 3 h od indukce exprese pomocí IPTG; v sloupci označeném jako CL jsou všechny rozpustné bakteriální proteiny izolované z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMALc2x-His-rEK-PTH po 3-hodinové expresi; v sloupci označovaném jako FT jsou proteiny, které se nezachytily na Ni²⁺ chelatační kolonu; v sloupci označeném jako WB jsou proteiny vymyté z Ni²⁺ chelatační kolony po promytí pufrem 300mM NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 8,0; v sloupci označeném jako W1 jsou proteiny vymyté zNi²⁺ chelatační kolony po promytí pufrem 300mM NaCl, 50mM NaH2PO₄, lOmM imidazol, pH 8,0; v sloupci označeném jako W2 jsou proteiny vymyté zNi²⁺ chelatační kolony po promytí pufrem 300mM NaCl, 50mM NaH2PO4, 20mM imidazol, pH 8,0; v sloupci označeném jako Eje purifikovaný fůzní protein MBP-His-rEK-PTh, který byl eluován zNi²⁺ chelatační kolony pufrem 300mM NaCl, 50mM NaH2PO₄, 70mM imidazol, pH 8,0.

Obr. č. 5

Dokumentace specifického štěpení fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH (49 kDa) enterokinasou za uvolnění PTH(l-34) (4 kDa) pomocí Tricin-SDS-Page (16% gel). V sloupci označeném jako M je molekulový markér M12 Unstained Standard (Invitrogen); V sloupci označeném jako 1 je fúzní protein MBP-his-rEK-PTH před specifickým štěpením enterokinasou; v sloupci označeném jako 2 je fúzní protein MBP-His-rEK-PTH po štěpení enterokinasou, přičemž se uvolňuje PTH(l-34); v sloupci označeném jako 3 je syntetický PTH0-34) jako kontrola.

Obr. č. 6

RP-HPLC purifikace PTH(l-34). Na obr. A je zaznamenán RP-HPLC chromatogram purifikace PTH(l-34), který vznikl po štěpení fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTh. Na obr. B je zaznamenán RP-HPLC chromatogram přečištěného PTH(l-34).

- 8 CZ 302526 B6

Příklady provedení vynálezu

Příkladě. 1

Byly připraveny 2 expresní plasmídy, které měly exprimovat fúzní protein, zůstávající v cytosolu bakterie (tzn., že neobsahují sekreění signál pro transport proteinu do periplasmy - využití plasmidu pMAL-c2x), a 2 expresní plasmídy, které měly exprimovat fúzní protein, který byl cílen do periplasmatického prostoru bakterie (tzn. že obsahují sekreění signál cílící protein do periplasmy - využití plasmidu pMAL-p2x).

Z kompletní aminokyselinové sekvence lidského parathormonu PTH(l-84) byla použita biologicky aktivní N-koncová část PTH(l-34) (voz id. č. 3). Na základě této sekvence byla navržena oligonukleotidová sekvence s přesahy kódující His-rEK-PTH, skládající se z histidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení enterokinasou (rEK) a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id. č. 4). Dále byla navržena sekvence His-rTEV-PTH. skládající se z histidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení TEV proteasou (rTEV) a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id. č. 5).

Oligonukleotidové přesahy jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami (BamH MHind III) expresního vektoru pMAL-c2x, respektive pMAL-p2x, který obsahuje sekvenci kódující MBP (protein vázající maltosu). Oligonukleotidové sekvence His-rEK-PTH (viz id. č, 4), respektive His-rTEV-PTH (voz id. č. 5), byly ligovány do vektoru pMAL-c2x, respektive pMAL-p2x, který byl naštěpen endonukleasami BamH I a Hind III, za vzniku expresních vektorů pMAL-c2x-His-rEK-PTH a pMAL-c2x-His-rTEVPTH, respektive pMAL-p2x-His-rEK-PTH a pMAL-p2x-His-rTEV-PTH, Schéma plasmidu pMAL-c2x—His-rEK-PTH a pMAL-c2x-His-rTEV-PTH je na obr. 1 a 2.

Připravené expresní plasmídy pMAL-c2x-His-rEK-PTh, respektive pMAL-c2x-His-rTEVPTh, kódují fúzní protein MBP-His-rEK-PTh (viz id. č. 1), respektive MBP-His-rTEV-PTH (viz id. č. 2), který po expresi zůstává v cytosolu bakterie. Připravené expresní plasmídy pMALp2x-His-rEK-PTH, respektive pMAL-p2x-His-rTEV-PTH, kódují fúzní protein MBP-HisrEK-PTh (viz id. č. 1), respektive MBP-his-rTEV-PTH (viz id. č. 2), který je po expresi transportován do periplasmatického prostoru bakterie.

Připravenými konstrukty pMAL-c2x-his-rEK-PTH, pMAL-c2x-His-rEK-PTh, respektive pMAL-p2x-His-rTEV-PTh, pMAL-p2x-His-rTEV-PTH byly transformovány bakterie E. coli XLI-Blue.

Příklad č. 2

E, coli XLI-Blue obsahující plasmídy pMAL-c2xhis-rEK-PTH, respektive pMAL-c2x-hisrTEV-PTH, kde produkován fúzní protein zůstává v cytosolu buněk, byly po expresi lyžovány a složení bakteriálních proteinů bylo testováno pomocí Tricine-SDS-PAGE (viz obr. č. 3).

E. coli XLI-Blue obsahující plasmídy pMAL-p2x-his-rEK-PTH, respektive pMAL-p2x-hisrTEV-PTH, kde je produkovaný fúzní protein cílen do periplasmatického prostoru byly po expresi podrobeny osmotickému šoku z důvodu separace periplasmatických ostatních bakteriálních proteinů. Buňky byly resuspendovány v pufru obsahujícím 30mM Tris-HCI, pH 8,0, 20% sacharosu, a byly míchány 5 až 10 min při pokojové teplotě. Buněčná suspenze byla poté centrifugována a bakteriální peleta byla resuspendována v ledově chladném 5mM MgSO₄ a míchána po dobu 10 minut v ledové vodní lázni. Buněčná suspenze byla poté opět centrifugována, Peri-9CZ 302526 B6 plasmatické proteiny se po tomto kroku nacházely v supematantu. Složení periplasmatických proteinů bylo testováno pomocí Tricin-SDS-PAGE (viz obr. č. 3).

Při porovnání exprese fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH v případě jeho lokalizace v cytosolu a v periplasmatickém prostoru je z obr. č. 3 zřejmé, že z hlediska výtěžku je výhodnější fúzní protein MBP-His-rEK-PTH s cytosolickou lokalizací, který je kódován plasmidem pMAL-c2xHis-rEK-PTh. Z tohoto důvodu je v příkladě 3 až 6 popisována práce pouze s fúzním proteinem MBP-His-rEK-PTH, respektive MBP-His-rTEV-PTH, s lokalizací v cytosolu bakterie.

Příklad č. 3

Fúzní protein MBP-his-rEK-PTh, respektive MBP-His-rTEV-PTH, byl izolován z cytosolu buněk E. coli XLI-Blue lyží ve frakci rozpustných bakteriálních proteinů a po převedení do pufru (300mM NaCl, 50mM NaH₂PO₄, pH 8,0) byl purifikován díky přítomné histidinové kotvě afinitní chromatografie na chelatační koloně obsahující Ni²\ Po eluci proteinu z kolony (eluční pufr o složení 300 mM NaCl, 50mM NaH₂PO₄, 70mM imidazol, pH 8,0) byl protein naředěn na koncentraci cca 3 mg/ml a převeden dialýzou do pufru (50mM Tris-HCl, lOOmM NaCl, lOmM EDTA, pH 7,4) pro odstranění imidazolu. Po dialýze byl fúzní protein zahuštěn na koncentraci cca 3 mg/ml a v této koncentraci byl použit k uvolnění PTH(l-34) pomocí specifického štěpení enterokinasou, respektive TEV proteasou (viz příklad č. 5). Postup purifikace fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH z bakteriální kultury je dokumentován na obr. 4.

Příklad č. 4

Fúzní protein MBP-His-rEK-PTH, respektive MBP-His-rTEV-PTH, byl izolován z E. coli XLI-Blue lyží ve frakci rozpustných bakteriálních proteinů a po převedení do pufru (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT) byl purifikován díky přítomnému proteinu vázajícímu maltosu (MBP) afínitní chromatografií na amylosové koloně vázající právě MBP. Po eluci proteinu z kolony (eluční pufr o složení 20mM Tris-HCl, pH 7,5, 200mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT, lOmM maltosa) byl protein převeden dialýzou do pufru (50mM TrisHCl, lOOmM NaCl, lOmM EDTA, pH 7,4) pro odstranění maltosy.

Vzhledem k tomu, že amy losové náplně chromatografie kých kolon mají a) nižší kapacitu a b) jsou finančně náročnější nežNi²⁺ náplně chromatografických kolon (viz tabulka č. 1), je efektivnější použít afínitní kolonu s náplní Ni²⁺, na kterou se váží proteiny obsahující histidinovou kotvu (viz příklad č. 3).

Příklad č. 5

PTH(l-34) byl z fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH, respektive MBP-HIS-rTEV-PTH, uvolněn specifickým proteolytickým štěpením enterokinasou, respektive TEV proteasou. Fúzní protein MBP-His-rEK-PTH byl specificky štěpen enterokinasou v reakční směsi obsahující reakční pufr pro enterokinasu (20mM Tris-HCl, pH 7,4, 50mM NaCl, 20mM CaCl₂), enzym, a substrát (v poměru 1 U enzymu : 1 nmol substrátu) po dobu 5 hodin za pokojové teploty. Štěpení fúzního proteinu MBP-Hís-rEK-PTH enterokinasou, při kterém se uvolňuje PTH(l-34) je dokumentováno na obr. 5.

Fúzní protein MBP-His-rTEV-PTH byl specificky štěpen TEV proteasou v reakční směsi obsahující reakční pufr pro TEV proteasu (50mM Tris-HCl, 0,5mM EDTA, pH 7,5, ImM DTT), enzym a substrát (v poměru 1 mol enzymu : 100 mol substrátu) po dobu 16 hodin za pokojové teploty.

- 10CZ 302526 B6

Příklad ě. 6

Po specifickém štěpení fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH, respektive MBP-His-rTEVPTH, na PTH(l-34) a zbytek fúzního proteinu, tzn. MBP-His-rEK, respektive MBPHisrTEV, byl tento zbytek fúzního proteinu z roztoku z větší části odstraněn srážením ethanolem. Částečně přečištěný PTH(l-34) byl pak lyofilizován a následně rozpuštěn v roztoku o složení 90% H₂O/10% acetonitril/0,1% TFA a finálně přečištěn pomocí RP-HPLC na koloně „Discoverý® Bio Wide Póre C8 column (25x1 Omm, 5 pm)“ od firmy Sigma-Aldrich - SUPELCO.PTH(l-34) byl eluován z kolony gradientem 20 až 100% acetonitril/0,1% TFA po dobu 60 min. Purifikace PTH(l-34) pomocí RP-HPLC je dokumentována na obr. 6. Nakonec byl PTH(l-34) po purifikaci pomocí RP-HPLC lyofilizován a takto byl připraven pro další použití.

Příklad Č. 7 (srovnávací)

Byly připraveny další expresní vektory, které měly exprimovat 2 různé fúzní proteiny zůstávající po expresi v cytosolu (tzn., že neobsahují sekreční signál pro transport proteinu do per i plasmy).

Nejprve bylo do expresního plasmidů pET-45b(+) vloženo restrikční místo Nde I mezi Xho I a Nco I, za vzniku plasmidů pET-45b(+)-NdeI.

Podobně, jako v příkladu l, z kompletní aminokyselinové sekvence lidského parathormonu PTH(l-84) byla použita biologicky aktivní N-koncová část PTH(l-34) (viz id.ě. 3). Na základě této sekvence byla navržena oligonukleotidová sekvence s přesahy kódující His-rEK-PTH, skládající se z histidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení enterokinasou (rEK) aPTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id.ě. 7). Dále byla navržena oligonukleotidová sekvence kódující His-rTEV-PTH, skládající se z histidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení TEV proteasou (rTEV) a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz. id.ě. 9).

Oligonukleotidové přesahy jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami (Nde V Hind IH) expresního vektoru pLT—45b(+)-NdeI, Oligonukleotidové sekvence His-rEK-PTH (viz id. č. 7), respektive His-rTEV-PTH (viz id. ě. 9), byly ligovány do vektoru pET-45b(+)-NdeI, který byl naštěpen endonukleasami Nde I a Hind III, za vzniku 2 expresních vektorů pET-45b(+)~His-rEK-PTH, respektive pET-45b(+)-His-rTEVPTH, kódující fuzní protein His-rEK-PTH (viz id. ě. 6), respektive His-rTEV-PTH (viz id. ě. 8). Takto připravenými konstrukty byly transformovány bakterie E. coli BL21(DE3).

E.coli BL21(DE3) obsahující plasmidy pET—45b(+)-His-rEK-PTH, respektive pET^I5b(+)His-rTEV-PTH, kde produkovaný fúzní protein zůstává v cytosolu buněk, byly po expresi lyžovány a složení bakteriálních proteinů bylo testováno pomocí Tricin-SDS-PAGE. Produkce proteinu His-rEK-PTH, respektive His-rTEV-PTH, nebyla v bakteriích detekována.

Byly připraveny další expresní vektory, které měly exprimovat 3 různé fúzní proteiny, všechny obsahující sekreční signál proteinu OmpA (z angl. outer membrané protein A), který cílí daný protein do periplasmatického prostoru bakterie.

Nejprve bylo do expresního plasmidů pET-45b(+) vloženo restrikční místo Nde I mezi Xho I a Nco I, za vzniku plasmidů pET-45b(+)-NdeI.

Podobně, jako v příkladu 1, z kompletní aminokyselinové sekvence lidského parathormonu PTH0-84) byla použita biologicky aktivní N-koncová část PTH(l-34) (viz id.ě. 3). Na základě této sekvence byla navržena oligonukleotidová sekvence s přesahy kódující OmpA-His-rEKPTH, skládající se ze sekrečního signálu pro OmpA protein, histidinové kotvy (His), specifické

- 11 CZ 302526 B6 sekvence pro štěpení enterokinasou (rEK) a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id. č. 11). Dále byla navržena oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-His-rTEV-PTH, skládající se ze sekrečního signálu pro OmpA protein, histidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení TEV proteasou (rTEV) a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz íd. č. 13). Dále byla navržena oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-PTH, skládající se ze sekrečního signálu pro OmpA protein a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id. č. 15).

Oligonukleotidové přesahy jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami (Nde MHind III) expresního vektoru pET-45b(+)-NdeL Olígonukleotidové sekvence OmpA-His-rEK-PTH (viz id. ě. 11), OmpA-His-rTEV-PTH (viz id. č. 13), respektive OmpA-PTH (viz id. č. 15), byly ligovány do vektoru pET—15b(+)-NdeI, který byl naštěpen endonukleasami Nde I a Hind III, za vzniku 3 expresních vektorů ρΕΊΜ5b(+)—OmpAHis-rEK-PTH, pET-45b(+)-OmpA-His~r-TEV-PTH, respektive pET-45b(+>OmpA-PTH, kódujících fúzní proteiny OmpA-His-rEK-PTH (viz id. č. 10), OmpA-His-rTEV-PTH (viz id. č. 12), respektive OmpA-PTH (viz id č. 14). Takto připravenými konstrukty byly transformovány bakterie E. coli BL21(DE3).

E. coli BL21(DE3) obsahující plasmidy pET-^45b(+)-OmpA~His-rEK-PTH, pET-45b(+}~ OmpA-His-rTEV-PTH, respektive pET-45b(+)-OmpA-PTH, kde je produkovaný protein transportován do periplasmatického prostoru bakterií, byly po expresi podrobeny osmotickému šoku z důvodu separace periplasmatických a ostatních bakteriálních proteinů. Buňky byly resuspendovány v pufru obsahujícím 3mM Tris-HCl, pH 8,0, 20% sacharosu, a byly míchány 5 až 10 min pri pokojové teplotě. Buněčná suspenze byla poté centrifugována a bakteriální peleta byla re suspendována v ledově chladném 5mM MgSO₄ a míchána po dobu 10 min v ledové vodní lázni. Buněčná suspenze byla poté opět centrifugována. Periplasmatické proteiny se po tomto kroku nacházely v supernatantu. Složení periplasmatických proteinů bylo testování pomocí TricinSDS-PAGE. Produkce proteinu OmpA-His-rEK-PTH, OmpA-His-rTEV-PTH, respektive OmpA-PTH, nebyla v bakteriích detekována.

Reference

Armstrong MD. The relationship between homoserine and its lactone. Journal of the American Chemical Society 1949; 71: 3399 až 3402.

Bonn D.Parathyroid hormone for osteoporosis. Lancet 1996; 347: 50 až 50.

Byrne LJ, O^rCallaghan KJ, Tuite MF. Heterologous gene expression in yeast. In: Smales CM, James DC, editors. Methods in molecular biology. 308. Humana Press, Totowa, 2005, pp. 51 až 64.

Cereghino JL, CreggJM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Fems Microbiology Reviews 200; 24:45 až 66.

di Guan C, Li P, Riggs PD, Inouye H. Vectors that facilítáte the expression and purifícation of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein. Gene 1988; 67: 21 až 30.

Fu XY, Tong WY, Weí DZ. Extracellular production of human parathyroid hormone as a thioredoxin fusion form in Escherichia coli by Chemical permeabilization eombined with heat treatment. Biotechnology Progress 2005; 21: 1429 až 1435.

Gangireddy SR, Madhavi RD, Ravikanth KR, Reddy PK, Konda VR, Rao KRSS, et al. High yield expression of human recombinant PTH(l-34). Curr Trends Biotechnol Pharm 2010; 4: 568 až 577.

- 12CZ 302526 B6

Gardella TJ, Rubin D, Abousamra AB, Keutmann HT, Potts JT, Kronenberg HM, et al Expression of human parathyroid hormone-( 1-84) in Escherichia coli as a factor-X-cleavable fusion protein. Journal of Biological Chemistry 1990; 265: 15854 až 15859.

Gautvik KM, Alestrom P, Oven TM, Gabrielsen OS. Production of human parathyroid hormone from microorganisms. US Patent No. 5,010,010 1991.

Gram H, Ramage P, Memmert K, Gamse R, Kocher HP. A novel-approach for high-level proio duction of a reckombinant human parathyroid-hormone fragment in Escherichia coli. BioTechnology 1994; 12: 1017 až 1023.

Hodsman AB, Bauer DC, Dempster DW, Dian L, Hanley DA, Harris ST, et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: A review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews 2005; 26: 688 až 703.

Jin L, Briggs SL, Chandrasekhar S, Chirgadze NY, Clawson DK, Schevitz RW, et al. Crystal structure of human parathyroid hormone 1-34 at 0.9-angstrom resolution. Journal of Biological Chemistry 2000; 275: 28238 až 27244.

Kareem BN, Rokkones E, Hogset A, Holmgren E, Gautvik KM. A method for the evaluation of the efficiency of signál sequences for secretion and correct n-terminal processing of human parathyroid-hormone produced in Escherichia coli. Analytical Biochemistry 1992; 204: 26 až 33.

Kronenberg HM, Bringhurst FR, Nussbaum S, JuppnerH, Abou-Samra AB, Segre GV, et al. Parathyroid hormone: biosynthesis, secreton, chemistry, and action. Heidelberg: Springer-Verlag KG, 1993.

jo Lee SY, Choi JH, Lee SJ. Secretory production of therapeutic proteins in Escherichia coli. In: Smales CM, James DC, editors. Methods in Molecular Biology. 308. Humana Press, Totowa, 2005, pp. 31 až 41.

Liu QH, Lin JP, Liu MY, Tao XY, Wei DZ, Ma XY, et al. Large scale preparation of recombinant human parathyroid hormone 1-84 from Escherichia coli. Protein Expression and Purification 2007; 54: 212 až 219.

Nakagawa S, Tamakashi Y, Ishibashi Y, Kawase M, Taketomi S, Nishimura O, et al. Production of human PTH(l-34) via a recombinant DNA technique. Biochemical and Biophysical Research

Communications 1994; 200; 1735 až 1741.

Oldenburg KR, Dorfani Al, Selick HE. A method for the high-level expression of a parathyroidhormone analog in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 1994; 5: 278 až 284.

Olstad OK, Reppe S, Gabrielsen OS, Hartmanis M, Blingsmo OR, Gautvik VT, et al. Isolation and characterization of 2 biologically-active O-glycosylated forms of human parathyroidhormone produced in Saccharomyces cerevisiae - Identification of a new motif for O-glycosylation. European Journal of Biochemistry 1992; 205: 311 až 319.

Oshika Y, Yamada T, Nakagawa S, Fujishima A, Kawase M, Ishibashi Y, et al. Human parathyroid-hormone - effícient synthesis in Escherichia coli using a synthetic gene, purification and characterization. International Journal of Peptide and Protein Research 1994; 43: 441 až 447.

- 13 CZ 302526 B6

Rabbani SA, Yasuda T, Bennett HPJ, Sung WL, Zahab DM, Tam CS, et al. Recombinant human parathyroid-hormone synthesized in Escherichia coli - purification and characterization. Journal ofBiological Chemistry 1988; 263: 1307 až 1313.

> Ruml T, Rumlová M, Pačes V. In: Ruml T, Rumlová M, Pačes V, editors. Genové inženýrství. VŠCHT Praha, Praha, 2002.

Smith DB, Johnson KS. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 1988; 67: 31 až 40.

i o

Smith MC, Ptdgeon C. Process for purifýíng proteins and compounds useful in such process. US Patent No. 4,569,794 1984.

Suzuki Y, Yabuta M, Ohsuye K. High-level production of recombinant human parathyroid 15 hormone 1-34. Applied and Environmental Microbiology 1998; 64: 526 až 529.

Whitfield JF, Morley P. Smáli bone-building fragments of parathyroid-hormone - new therapeutic agents for osteoporosis. Trends in Pharmacological Sciences 1995; 16: 382 až 386.

Wingender E, BerczG, Blocker H, Frank R, Mayer H. Expression of human parathyroidhormone in Escherichia coli. Journal ofBiological Chemistry 1989; 264: 4367 až 4373.

Průmyslová využitelnost

Postup biotechnologické produkce teriparatidu (PTH(l-34)) dle předloženého vynálezu je vhodný pro farmaceutickou výrobu výše zmíněného terapeutického peptidů, použitelného pro léčbu osteoporózy.

Přehled sekvencí

Identifikační číslo 1:

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH.

MKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVA

ATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLI

AYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFT

WPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADT

DYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVG

VLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAK

DPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQ

TNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGSHHHHHHGAGDDDDKSVSEIQLMHNL

GKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

- 14CZ 302526 B6

Identifikační číslo 2:

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu MBP-His-rTEV-PTH.

MKIEEGKXVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKEEEKFPQVA

ATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLI

AYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFT

WPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADT

DYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVG

VLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAK

DPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQ

TNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGSHHHHHHGAENLYFQSVSEIQLMHNLG

KHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo 3:

io Charakteristika: aminokyselinová sekvence peptidů PTH(l-34)

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo 4:

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující His-rEK-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami BamH V Hind III expresního vektoru pMAL-c2x, respektive pMAL~p2x)

GGATCCCACCACCACCACCACCACGGTGCGGGTGATGATGATGATAAATCTGTTT

CTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGT

TGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAAGCTT

Identifikační číslo 5:

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující Hís-rTEV-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami BamH UHind III expresního vektoru pMAL-c2x, respektive pMAL—p2x)

GGATCCCACCACCACCACCACCACGGTGCGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGTTT CTG AA ATCC AGCTG ATGC ACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGT TGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAAGCTT

Identifikační číslo: 6

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu His-rEK-PTH.

MHHHHHHGAGDDDDKSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

- 15CZ 302526 B6

Identifikační číslo 7:

Charakteristika: Oligonukleotídová sekvence kódující His-rEK-PTH s optimalizovanými kodo5 ny pro E, coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami Nde MHind III expresního vektoru pET-^I5(+)-Ndel).

CATATGCACCACCACCACCACCACGGTGCGGGTGATGATGATGATAAATCTGTTT

CTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGT

TGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAAGCTT io Identifikační číslo: 8

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu His-rTEV-PTH.

MHHHHHHGAENLYFQSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo 9:

Charakteristika: Oligonukleotídová sekvence kódující His-rTEV-PTH s optimalizovanými kodony pro E, coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami Nde MHind III expresního vektoru pET—45(+)-NdeI).

CATATGCACCACCACCACCACCACGGTGCGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGTTT

CTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGT

TGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAAGCTT

Identifikační číslo: 10

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu OmpA-His-rEK-PTH.

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAGSHHHHHHGAGDDDDKSVSEIQLMHNLGKHLNSM

ERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo 11:

Charakteristika: Oligonukleotídová sekvence kódující OmpA-His-rEK-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami Nde MHind III expresního vektoru pET—45(+)35 Ndel).

CATATGAAAAAAACTGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTGGTTTCGCTACTGT

TGCTCAGGCTGGATCCCACCACCACCACCACCACGGTGCGGGTGATGATGATGAT

AAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTA

TGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAA

GCTT

Identifikační číslo: 12

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu OmpA-His-rTEV-PTH.

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAGSHHHHHHGAENLYFQSVSEIQLMHNLGKHLNSME

RVEWLRKKLQDVHNF

-16CZ 302526 B6

Identifikační číslo 13:

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-His-rTEV-PTH s optimalizovaný5 mi kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami Nde UHind III expresního vektoru pET45(+)-NdeI).

CATATGAAAAAAACTGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTGGTTTCGCTACTGT

TGCTCAGGCTGGATCCCACCACCACCACCACCACGGTGCGGAAAACCTGTACTTC

CAGTCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTA

TGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAA

GCTT io

Identifikační číslo: 14

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu OmpA-PTH.

_]5 MKKTAIAIAVALAGFATVAQSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo 15:

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-PTH s optimalizovanými kodony 20 pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpení příslušnými endonukleasami Nde UHindXŘ expresního vektoru pET-45(+)-NdeI).

CATATGAAAAAAACTGCTATCGCTATCGGTGTTGCTCTGGCTGGTTTCGCTACTGT

TGCTCAGTCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAAC

TCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCT

AAAAGCTT

Identifikační číslo: 16

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující fúzní protein MBP-His-rEK-PTH.

ATGAAAACTGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTAT

AACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTC

ACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACT

GGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTC

AATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTA

TCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATC

GCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAA

AAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAG

AGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTG

CTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACG

TGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGAT

TAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTT

AATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATC

GACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAAC

CATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAA

CAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTG

GAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAG

- 17CZ 302526 B6

G AAG AGTTGGCGAAAG ATCC ACGTATTGCCGCC ACC ATGGAAAACGCCCAG AAA

GGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTA

CTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAG

ACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACC

TCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCCACCACCACCACCACCACG

GTGCGGGTGATGATGATGATAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCT

GGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCA

GGATGTTCACAACTTC

Identifikační číslo: 17

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující fúzní protein MBP-His-rTEV-PTH.

ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTAT

AACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTC

ACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACT

GGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTC

AATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTA

TCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATC

GCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAA

AAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAG

AGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTG

CTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACG

TGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGAT

TAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTT

AATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATC

GACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAAC

CATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAA

CAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTG

GAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAG

GAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAA

GGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTA

CTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAG

ACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACC

TCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCCACCACCACCACCACCACG

GTGCGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCT

GGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCA

GGATGTTCACAACTTC

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Fúzní protein MBP-His-r(Spec)-PTH tvořený proteinem vázajícím maltosu (MBP), histidinovou kotvou (His), aminokyselinovou sekvencí r(Spec) pro specifické štěpení proteasou a sekvencí PTH(l-34), kde sekvence PTH(1-34) představuje bioaktivní část parathyroidního hormonu sekvence id. č.3.
2. 2. Fúzní protein podle nároku 1, vyznačující se tím, že sekvence r(Spec) umožňuje specifické štěpení enterokinasou.

   -18CZ 302526 B6
3. 3. Fúzní protein podle nároku 1, vyznačující se tím, že sekvence r(Spec) umožňuje specifické štěpení TEV proteasou.
4. 4. Fúzní protein podle nároku l nebo 2, vyznačující se tím, že má aminokyselinovou sekvenci id. č. 1.
5. 5. Fúzní protein podle nároku 1 nebo 3, vyznačující se tím, že má aminokyselinovou sekvenci id. č. 2.
6. 6. Molekula DNA kódující fúzní protein podle některého z nároků 1 až 5.
7. 7. Molekula DNA podle nároku 6, vyznačující se tím, že má sekvenci id. č. 16 nebo 17.
8. 8. Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 6 nebo 7.
9. 9. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 8.
10. 10. Hostitelská buňka podle nároku 9, kterou je E. coli XL 1-Blue.
11. 11. Použití fúzního proteinu podle některého z nároků 1 až 5 k přípravě teriparatídu.

    4 výkresy