CZ2010374A3 - Rekombinantní produkce teriparatidu v bakteriích Escherichia coli - Google Patents

Abstract

Rešení se týká rekombinantní prípravy peptidového léciva PTH(1-34) v bakteriích Escherichia coli, kterým je biologicky aktivní fragment lidského parathormonu, skládající se z jeho 34 N-koncových aminokyselin. Podle postupu je peptid PTH(1-34) exprimován v bakteriích jak fúzní protein, a to ve vysokých výtežcích, který je snadno, efektivne a pomerne levne purifikován z bakteriální kultury.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká biotechnologické přípravy teriparatidu, což je generický název pro terapeuticky aktivní část lidského parathormonu, skládající se z 34 N-koncových aminokyselin původního peptidového hormonu (tzv. PTH( 1-34)). Teriparatid je v předkládaném vynálezu připravován rekombinantně v bakteriích Escherichia coli ve formě fúzního proteinu. Výhoda tohoto vynálezu spočívá vtom, že peptid PTH(l-34) je díky použitému fúznímu proteinu produkován bakteriemi ve vysokých výtěžcích, a fúzní protein navíc umožňuje jeho snadnou, efektivní a finančně nenáročnou purífikaci. Teriparatid je využitelný k léčbě osteoporózy.

Dosavadní stav techniky

Lidský parathormon (PTH) hraje důležitou roli v regulaci homeostázy vápníku a fosfátů v lidském organismu. PTH zajišťuje mobilizaci vápníku a fosfátů uložených v kostech a zvyšuje příjem vápníku v tenkém střevě a vylučování fosfátů ledvinami. PTH navíc spouští cAMP-dependentní proteinkinasu v některých populacích kostních buněk nesoucích PTH receptory, což stimuluje proliferaci osteoblastů. PTH je sekretován příštítnými tělísky jako polypetid skládající se z 84 aminokyselin (PTH(l-84)) (Bonn, 1996; Kronenberg et al., 1993). Peptidový fragment složený z 34 N-koncových aminokyselin PTH (PTH(l-34)) je plně biologicky aktivní. Jelikož injekční podávání PTH(l-34) zvyšuje novotvorbu kostní tkáně a vede ke zlepšení kvality a pevnosti kostí, je tento peptid pod generickým názvem teriparatid používán k léčbě osteoporózy (Bonn, 1996; Hodsman et al., 2005; Whitfíeld and Morley, 1995).

Aby se PTH(l-34) mohl stát dostupným léčivem pro širokou veřejnost, je nezbytné docílit jeho produkce ve vysokých výtěžcích za nízkou cenu. V podstatě existují dva přístupy pro produkci peptidů, a to chemická syntéza a rekombinantní DNA technologie. Chemická syntéza peptidů, mj. i teriparatidu, je popsána např. v patentovém dokumentu W02008/109079, GB 1 559 61OA a US 4 086 196. Základním principem syntézy peptidů na pevné fázi je postupná příprava peptidového řetězce z jednotlivých aminokyselin na nerozpustném polymemím nosiči. Přebytky činidel se odstraňují prostým odsáváním a promýváním, hotový peptid se z nosiče odštěpí a podrobí se čistění pomocí HPLC puriťikace. Chemická syntéza peptidů je vhodná pro kratší peptidy (do cca 30 aminokyselin), jelikož při přípravě delších peptidů narážíme na limitaci této metody. Ta spočívá především v tom, že f během procesu vznikají chyby v rostoucím aminokyselinovém řetězci a získáváme řadu velmi podobných peptidů, které se od sebe mohou lišit absencí třeba jen jedné aminokyseliny, a tyje zpravidla obtížné separovat dostupnými technikami. I když je pomocí dvoustupňové HPLC purifikace většinou docílena velmi vysoká čistota syntetického peptidu, není možné se 10()j% vyhnout riziku kontaminace. Z hlediska použití daného peptidu v humánní medicíně je přítomnost kontaminujících látek klíčová. Na druhé straně biotechnologicky získaný peptid by měl být vždy jen jedna chemická entita, u níž nehrozí kontaminace potenciálně nebezpečnými meziprodukty s jedním nebo několika málo chybějícími aminokyselinovými jednotkami. Průmyslová výroba delších peptidů pomocí rekombinantních technik s využitím mikroorganismů se proto jeví jako slibná alternativa.

Nejčastěji používaný prokaryotní produkční organismus je bezesporu bakterie Escherichia coli. Bakterie neumí produkovat proteiny vyžadující posttranslační modifikace, jako jsou např. glykosylace, proto nejsou vhodným expresním systémem pro produkci glykoproteinů. PTH(l-34) ale glykosylován není. Obecné metody produkce rekombinantních proteinů v bakteriích zahrnují přímou intracelulámí expresi a sekreci proteinu do periplazmatického prostoru (tzn. těch proteinů, které navíc obsahují tzv. sekreční signál, který je cílí do periplasmy) (Ruml et al., 2002). Rekombinantní proteiny, které se v bakteriích produkují ve vysokém množství a zůstávají v cytoplasmě, jsou často exprimovány ve formě inkluznich tělísek, z kterých se biologicky aktivní protein získává poměrně obtížně (purifikace zahrnuje denaturaci a renaturaci) a tato cesta často i prodražuje vlastní purifikační proces. V případě, že rekombinantní protein je cílen do periplasmatického prostoru bakterie, je tvorba inkluznich tělísek vyloučena. Periplasmatická lokalizace proteinu přináší i další výhody, jako např. přítomnost menšího počtu proteas ve srovnání s cytosolem a usnadnění purifikace daného proteinu z důvodu menšího počtu kontaminujících proteinů (Lee et al., 2005).

Výhodou bakterii je jejich rychlý růst v levném médiu, takže rekombinantní produkce terapeutických proteinů v bakteriích potenciálně umožňuje získat vysoké výtěžky požadovaného produktu za nízkou cenu. V praxi se však produkce biologicky aktivních peptidů v bakteriích E. coli bohužel setkává s nízkými výtěžky, a to především z důvodu nízké stability jejich mRNA (Rabbani et al., 1988), intracelulámí degradace krátkých rekombinantních peptidů a obtížné purifikace peptidů od kontaminujících proteinů (Nakagawa et al., 1994; Oldenburg et al., 1994). Ke zvýšení výtěžku může být ale využito několik strategií klonování.

První metoda reprezentuje tzv. genovou polymeraci, kdy je příslušný gen exprimován jako polymer a výsledný protein-polymer je následně specificky chemicky nebo proteolyticky štěpen na jednotlivé peptidy-monomery, PTH(l-34)-analog byl metodou genové polymerace produkován podle Oldenburg a kol. (Oldenburg et aL, 1994).

Další metoda spočívá v použití vhodné fúzní značky. PTH(l-34) a PTH(l-84) byl připravován ve fúzi s rozličnými fúzními značkami, jako např. glutathion-S-transferasou 2

GST (Gangireddy et al., 2010; Smith and Johnson, 1988), β-galaktosidasou (Suzuki et al., 1998) (W02009/019715A1), cro-p-galaktosidasou (Wingender et al., 1989), lidským růstovým hormonem - hGH (Gardella et al., 1990), thioredoxinem - Trx (Fu et al., 2005; Liu et al., 2007) (W02007/112677A1), proteinem A (Kareem et al., 1992), fosforibulokinasou (WO 1999/005277) apod. Fúzní značka může být po úspěšné expresi oddělena od požadovaného peptidu proteolytickým štěpením díky specifické rozpoznávací sekvenci, která je umístěná mezi zmíněným fúzním proteinem a vlastním peptidem. K uvolnění PTH(134) nebo PTH(l-84) od fúzní značky bylo použito specifické štěpení proteinů proteasami, jako např. enterokinasou (Liu et aL, 2007) (W02009/019715A1, W02007/112677A1, EP 2 173 768), faktorem Xa (Gangireddy et al., 2010; Gardella et al., 1990; Kareem et al., 1992), Kex2 proteasou (Suzuki et al., 1998) (EP 0 794 255) a urokinasou (WO 1999/005277).

Gardella a kol. (1990) exprimovali gen pro PTH(l-84) ve fúzi s genem pro lidský růstový hormon (hGH, z angl. human growth hormone), vzájemně oddělené sekvencí pro štěpení faktorem Xa (hGH-rXa-PTH(l-84)). Intaktní PTH(l-84) byl z fúzního proteinu uvolněn pomocí specifického štěpení faktorem Xa. Výtěžek PTH(l-84) činil jen 1,5 až 3 mg/1 bakteriální kultury, což je pro průmyslovou výrobu nedostačující.

Kareem a kol. (1992) popsali podobné výsledky, rovněž s nízkým výtěžkem, s použitím obdobného fúzního proteinu, kde byl namísto lidského růstového hormonu (hGH) použit protein A (proteinA-rXa-PTH(l-84)).

Wingender a kol. (1989) připravili PTH(l-34) ve fúzi s cro-P-galaktosidasou. Fúzní protein v bakteriích tvořil inkluzní tělíska, která byla denaturována 8M močovinou. Následovalo uvolnění PTH(l-84) z fúzního proteinu v kyselém prostředí. Štěpení proteinů v kyselém prostředí ale vede k tvorbě mnoha nespecifických produktů, které je obtížné separovat, a navíc kyselé pH může vést k ovlivnění biologické aktivity cílového peptidu/proteinu.

Patent WO1999/005277 popisuje přípravu PTH(l-84), který je připojen k fosforibulokinase. Fúzní protein je bakteriemi produkován ve formě inkluzních tělísek, které jsou denaturovány 8M močovinou. Následně je PTH(l-84) z fúzního proteinu uvolněn specifickým štěpením urokinasou, jejíž rozpoznávající místo se nachází mezi fosforibulokinasou a PTH(l-84). PTH(l-84) byl nakonec purifikován pomocí iontové chromatografie a RP-HPLC.

Suzuki a kol. (1998) připojili gen pro PTH(l-34) k fúznímu genu pro část modifikované β-galaktosidasy a peptidy obsahující několik histidinů, přičemž PTH(l-34) byl od fúzní části oddělen sekvenci pro specifické štěpení Kex2 proteasou (P-galaktosidasa(l117)-HHHHPGG-rKex2-PTH(l-34)). Fúzní protein se v bakteriích produkoval ve formě inkluzních tělísek, z kterých byl získáván denaturací 8M močovinou, která byla následně ředěna na 3M močovinu. Následovalo uvolnění PTH(l-34) z fúzního proteinu specifickým štěpením Kex2 proteasou. Nakonec byl PTH(l-34) purifikován ionexovou chromatografii a dvoustupňovou chramatografií s reverzní fázi. Suzuki a kol. uvádí, že z důvodu udržení .3 proteinu v rozpustné formě je vedle 3M močoviny navíc nezbytný přídavek CaCl? o koncentraci 2,5 mM, který brání sráženi proteinu během štěpení. Přítomnost močoviny a CaCh ale vede k vysokým nárokům na koncentraci Kex2 proteasy, která je nutná pro uvolnění PTH(l-34) z fúzního proteinu (molámí poměr 1:2000 enzyrmsubstrát). Velké množství Kex2 proteasy tedy hraje velkou roli v primárních nákladech na produkci PTII( 1 -34) a prodražuje tak celý proces.

Gangireddy a kol. (2010) produkovali PTH(l-34) ve formě rozpustného fúzního proteinu, který obsahoval glutathion-S-transferasu (GST) a PTH(l-34), vzájemně oddělené rozpoznávacím místem pro štěpení faktorem Xa (GST-rXa-PTH(l-34)). Pro purifikaci fúzního proteinu byla využita přítomná GST (glutathion-S-transferasa), která se váže na bioafinitní kolonu s mobilizovaným glutathionem. Náplně bioafinitních kolon ale bývají drahé, a právě z tohoto důvodu nejsou vhodné pro purifikaci proteinů v průmyslovém měřítku. PTH(l-34) byl od GST specificky odštěpen působením faktoru Xa a nakonec byl purifikován pomocí RP-HPLC.

Nakagawa a kol. (1994) připravili PTH(l-34) tak, že ho uvolnili z [Cys35]PTH(l-84) specifickým chemickým štěpením, které zahrnovalo štěpení Cys zbytků s připojenou CN skupinou v [Cys35]PTH(l-84) v alkalickém prostředí. [Cys35]PTH(l-84) byl připraven rekombinantně v bakteriích E. coli (Oshika et ai., 1994). Popsané chemické štěpení vedlo k mnoha nespecifickým produktům, čímž se výrazně snížil výtěžek PTH(l-34).

Jin a kol. (2000) popisují purifikaci PTH(l-34), který byl produkován v E. coli ve formě inkluzních tělísek. Inkluze byly denaturovány 7M močovinou. Peptid byl purifikován na koloně s reverzní fází, následně pomocí katexové iontové chromatografie a nakonec pomocí RP-HPLC. Tato metoda, využívající několik následných chromatografických technik, je pro produkci PTH(l-34) z finančního hlediska v průmyslovém měřítku nevhodná.

Fu a kol. (2005) popisují metodu přípravy PTH(l-34) ve fúzi s thioredoxinem (Trx). Inkluzní tělíska fúzního proteinu Trx-PTH(l-34) byla denaturována Tritonem-X100 a vysokou teplotou 80 °C po dobu 15 min. Tento postup ale vystavuje peptid/protein riziku vysoké teploty, což může vést k ovlivnění jeho biologické aktivity.

Patent CN 1 417 231 popisuje přípravu PTH(l-34) ve formě fúzního proteinu, který v bakteriích tvoří inkluzní tělíska. Metoda zahrnuje purifikaci inkluzních tělísek, jejich denaturaci a renaturaci, uvolnění PTH(l-34) z fúzního proteinu trombinem a finální purifikaci PTH(l-34) pomocí katexové iontové chromatografie. Nedostatkem této metody je použiti trombinu pro uvolnění PTH(l-34) z fúzního proteinu, jelikož cílový peptid/protein uvolněný z fúzního proteinu pomocí trombinu nemá zachován intaktní N-konec. N-konec cílového proteinu je modifikován Gly nebo Gly-Ser, což může ovlivnit jeho biologickou aktivitu. Štěpení fúzního proteinu trombinem je kromě výše zmíněného faktu často provázeno nespecifickým štěpením fúzního proteinu mimo vloženou rozpoznávající sekvenci, což navíc vede ke snížení výtěžku a komplikacím v odstranění nespecifických produktů.

Patent CN i 424 325 popisuje přípravu PTH(l-34) ve fúzi s GST. Fúzní protein je nejprve štěpen trombinem. Purifikace proteinu probíhá na bioafínitní koloně s imobilizovanýrn chymotrypsinem. Následuje další štěpení proteinu prolin-endopeptidasou a další chromatografické techniky pro purifíkaci PTH(l-34). Tento proces přípravy PTH(1 -34) je komplikovaný a zahrnuje štěpení dvěma specifickými proteasami, což značně prodražuje celou metodu.

Chen a kol. připravili PTH(l-34) ve fúzi s doménou vázající celulosu (CBD), mezi PTH(l-34) a CBD se nachází specifické místo pro štěpení faktorem Xa. Fúzní protein byl purifikován na bioafínitní koloně s imobilizovanou celulosou. PTH(l-34) byl z fúzního proteinu uvolněn pomocí enzymu faktor Xa a nakonec byl purifikován pomocí RP-HPLC. Proces vedl k výtěžku jen 3 mg/1 bakteriální kutlury, což je pro průmyslové účely nedostačující.

Gram a kol. (1994) připravili PTH(l-38) ve fúzi s gp55 proteinem (protein z bakteriofága T4). Fúzní protein tvořil v bakteriích inkluzní tělíska, která byla denaturována. Následovalo štěpení v kyselém prostředí (HCI), během kterého se z fúzního proteinu uvolnil aspartyl-propyl-PTH(l-38). Dipeptid aspartyl-propyl byl následně z PTH(l-38) uvolněn působením dipeptidyl peptidasy IV. Podobně jako u práce Wingender a kol. (1989), štěpení proteinů v kyselém prostředí může vést k tvorbě mnoha nespecifických produktů, které je obtížné separovat, a kyselé pH navíc může ovlivnit biologickou aktivitu cílového peptidu/proteinu.

Oldenburg a kol. (1994) představil expresi analogu PTH(l-34) s využitím genové polymerace, kdy oktamer analogu PTH(l-34) byl štěpen na jednotlivé monomery pomocí bromkyanu, který specificky štěpí proteiny za methioninem. Aby pro štěpení peptidupolymeru na peptidy-monomery mohl být použit právě bromkyan, bylo nutné pozměnit aminokyselinovou sekvenci PTH(l-34) tak, aby se methioniny nenacházely uvnitř peptidového řetězce, ale naopak aby byl methionin přítomný na jeho C-konci. Z tohoto důvodu byla využita syntetická oligonukleotidová sekvence kódující analog PTH(l-34), a to konkrétně [Leu^8,18, Tyr³⁴, Met³⁵]-PTH(l-34). Oldenburg a kol. tak připravili bakterie E. coli produkující oktamer peptidu [Leu^8,18, Tyr³⁴, Met³⁵]-PTH(l-34), který navíc obsahoval histidinovou kotvu, a to ve formě inkluzních tělísek. Oktamer byl denaturován 10% SDS (dodecylsuifátem sodným), následovalo specifické štěpení bromkyanem, který štěpí za methioninem. Tímto krokem byl z oktameru uvolněn peptid-monomer [Leu^8,18, Tyr³⁴, Hse³⁵]-PTH(l-34), kde byl Met po štěpení bromkyanem přeměněn za homoserinlakton, který je v rovnováze s homoserinem (Armstrong, 1949). Bylo dokázáno, že analog PTHfl-34) (tzn. [Leu⁸'¹⁸, Tyr³⁴, Hse³⁵]’PTH(l-34)) vykazuje srovnatelnou biologickou aktivitu jako samotný PTH(l-34) (Oldenburg et al., 1994). Z důvodu vysoké toxicity bromkyanu ale tato metoda není vhodná pro produkci peptidu v průmyslovém měřítku.

Liu a kol. (2007) připravili PTH(l-84) ve formě rozpustného fúzního proteinu His-Trx-rEK-PTH(l-84), který obsahoval £Iis kotvu, thioredoxin, specifickou sekvenci r

pro štěpení enterokinasou a PTH(l-84). Fůzní protein byl specificky štěpen enterokinasou za uvolnění PTH(l-84).

Patent W02007/112677A1 popisuje přípravu PTH(l-34) ve formě fúzního proteinu, který obsahuje thioredoxin (Trx), Histidinovou kotvu (His), specifické místo pro štěpení enterokinasou (rEK) (Trx-His-rEK-PTH(l-34)).

Patent W02009/019715A1 popisuje přípravu PTH(l-34) ve formě fúzniho proteinu obsahující histidinovou kotvu (His), β-galaktosidasu a specifické místo pro štěpení enterokinasou (rEK) (His-P-galaktosidasa-rEK-PTH(l-34)).

Patent EP 2 173 768 popisuje přípravu PTH(l-34) ve formě fúzního proteinu obsahující β-galaktosidasu, histidinovou kotvu (His) a specifické místo pro štěpení enterokinasou (rEK) ^-galaktosidasa-His-rEK-PTH( 1-34)). ₍

Patentové dokumenty CN 101 555 48Á, CN 1 807 456^, CN 1 212 336C, CN 12N15/62 popisují variace již výše uvedených principů, nepřinášející výrazný technický efekt.

Kvasinky (nejčastěji Saccharomyces cerevisiae) představují vedle bakterií další mikroorganismy použitelné pro produkci rekombinantních proteinů. Jelikož se jedná o eukaryotní organismy, jimi produkované proteiny bývají posttranslačně modifikovány, např. glykosylovány. Produkce proteinů v kvasinkách nabízí několik výhod, a to především rychlou a jednoduchou produkci s vysokým výtěžkem (který je ale nižší než v bakteriích), nízkou cenu kultivačního média a možnost produkce glykoproteinů. Přítomnost glykosylací však limituje využití kvasinkového expresního systému pro produkci proteinů, které glykosylace nevyžadují. Rekombinantní proteiny mohou být v kvasinkách produkovány intracelulámě nebo může být upravena sekreční dráha tak, aby byly proteiny sekretovány do média, což značně usnadňuje purifikaci daného proteinu (Byme et al., 2005; Cereghino and Cregg, 2000).

Produkce PTH(l-84) v kvasinkách byla testována vědeckou skupinou Olstad a kol. (Olstad et al., 1992) a Gautvik a kol. (Gautvik et al., 1991). PTH(l-84) byl produkován ve fúzi s kvasinkovým α-faktorem, který cílí protein ven z buňky do média. Jako expresní systém byly použity kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Bylo zjištěno, že PTH(l-84) byl v kvasinkách O-glykosylován (Gautvik et al., 1991; Olstad et al., 1992). Glykosylovaný pcptid se ale odlišuje od své nativní lidské formy, což může mít za následek zvýšenou imunogenitu v lidském organismu.

Produkce peptidu kvasinkami (či jinými eukaryotnimi organismy) vede k jeho glykosylací, čímž se ale peptid odlišuje od své nativní lidské formy, což může způsobit zvýšenou imunogenitu takového glykosylovaného peptidu v lidském organismu. Produkce peptidu bakteriemi tímto nedostatkem netrpí, ale naráží na jiné překážky. Předchozí studie ukázaly, že rekombinantní produkce samostatného PTH(l-84) a PTH(l-34) vede k velmi nízkým výtěžkům, a to především kvůli nestabilitě jeho mRNA a rovněž kvůli rychlé degradaci peptidu intracelulámími proteasami (Nakagawa et al., 1994; Oldenburget al., 1994; Rabbani et al., 1988). Zvýšení rekombinantní produkce peptidu bylo dosaženo metodou genové polymerace. Tato metoda s sebou ale přináší nutnost pozměnění aminokyselinové sekvence peptidu z důvodu specifického štěpení peptidu-polymeru na peptid-monomer (Oldcnburg et ai., 1994). Jako další metoda pro zvýšení rekombinantní produkce peptidu, a to bez změny aminokyselinové sekvence, připadá v úvahu použití fúzního proteinu, např. lidského růstového hormonu (Gardella et al., 1990), proteinu A (Kareem et al., 1992), thioredoxinu (Liu et al., 2007), β-galaktosidasy (Suzuki et al., 1998), glutathion-S-transferasy (GST) (Gangireddy et al., 2010; Smith and Johnson, 1988), proteinu vázajícího maltosu (MBP) (di Guan et al., 1988) a dalších. Pri plánování rekombinantní produkce peptidu v průmyslovém měřítku je vedle vysokého výtěžku nutné sledovat i cenu purifikačniho procesu. Mnohé z výše zmíněných fúzních proteinů vedle toho, že zvyšují bakteriální produkci peptidu, rovněž působí jako afmitní značka pro purifikaci daného proteinu pomocí bioafinitní chromatografie. Mezi tyto afmitní značky patří např. GST, který se váže na glutathion (interakce enzym-substrát) a MBP, který se váže na amylosu (interakce proteinsacharid). Je ale nutné zdůraznit, že právě použití takovýchto afinitních značek, tzv. bioligandů, často prodražuje vlastní purifikační proces z důvodu, že náplně bioafinitních kolon mají a) nízkou kapacitu a b) jsou drahé. Z hlediska kapacity a ceny afínitní kolony se jeví jako nej efektivnější Ni²⁺ chelatační kolona, která váže proteiny s přítomnou histidinovou kotvou (Smith and Pidgeon, 1984). Kapacity Ni²⁺ chelatačních koion bývají 2,5 až 5 χ větší než kolon bioafinitních a jejich cena je také příznivější.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je fúzní protein MBP-His-r(Spec)-PTH, obsahující ve svém řetězci sekvenci proteinu vázajícího maltosu (MBP), histidinovou kotvou (His) a sekvenci teriparatidu (PTH(l-34)) oddělenou od fúzní části specifickou sekvencí r(Spec) pro štěpení vhodným enzymem, například enterokinasou (rEK) nebo TEV proteasou (rTEV), který je vhodný pro přípravu biologicky aktivní části lidského parathormonu (PTH(l-34)) v bakteriích Escherichia coli. Dále jsou předmětem vynálezu sekvence DNA kódující fúzní protein podle vynálezu, vektory obsahující sekvence DNA kódující fúzní protein podle vynálezu, jakož i buňky Escherichia coli transformované těmito vektory, a dále způsob přípravy teriparatidu zahrnující použití fúzního proteinu, sekvencí DNA, rekombinantních vektorů nebo transformovaných buněk podle vynálezu.

Podstatou vynálezu je spojení sekvencí MBP, His a PTH(l-34) do fúzního proteinu výše uvedeným způsobem, umožňujícím zároveň dosahovat vysokého výtěžku produkce tohoto fúzního proteinu v bakteriích E. coli, provádět jeho snadnou, efektivní a finančně nenáročnou purifikaci, a vysoce selektivním způsobem enzymového štěpení zabudované

7' specifické sekvence získávat z puntíkovaného fúzního proteinu teriparatid v kvalitě umožňující průmyslovou produkci pro farmaceutické účely.

Detailní popis vynálezu

Rekombinantní vektory podle vynálezu představují základ pro nový způsob biotechnologické produkce teriparatidu (PTH(l-34)). Teriparatid, který je využitelný pro léčbu osteoporózy, je krátký peptid (34 aminokyselin), jehož samotná produkce bakteriemi vede k velmi nízkým výtěžkům, především z důvodu nestability jeho mRNA v bakteriích a jeho rychlé degradace bakteriálními intracelulámími proteasami (Nakagawa et al., 1994; Oldenburg et al., 1994; Rabbani et al., 1988).

Naší snahou bylo zkonstruovat vektory pro expresi fúzního proteinu, které by a) zajistily vysoké výtěžky bakteriální produkce peptidu a b) umožnily efektivní a levnou purifikaci daného proteinu. Ačkoliv problém se již snažila řešit řada autorů a jsou známy obecné přístupy, jež by k úspěšnému řešení měly vést, žádný z dosud publikovaných způsobů nevede k plně uspokojivému řešení, jež by mohlo posloužit za základ biotechnologického procesu pro průmyslovou výrobu teriparatidu. To naznačuje, že o zdárném výsledku konkrétního řešení zřejmě rozhodují subtilní detaily, jejichž vliv nikdo nedokáže předem odhadnout. Naše pokusy potvrdily, že k úspěšnému řešeni nemusí vždy vést cesta, která by se podle teoretických předpokladů mohla jevit jako nejperspektivnější. Připravili jsme několik variant expesních vektorů, které kódují různé fúzní proteiny. Některé fúzní proteiny navíc obsahovaly sekreční signální sekvenci, která cílí daný protein do penplasmatického prostoru bakterie, kde je nižší koncentrace bakteriálních proteas. Ostatní fúzní proteiny sekreční signální sekvenci neobsahovaly, a zůstávaly tudíž v cytosolu bakterií. Produkce různých fúzních proteinů bakteriemi byla testována a výsledky všech experimentů byly porovnány. Přehled navržených fúzních proteinů a úspěšnost jejich produkce bakteriemi E. coli uvádí tabulka č. 1.

Tabulka č. 1: Přehled navržených fúzních proteinů a úspěšnost jejich produkce bakteriemi

E, coli.

Expresní plasmid	Fúzní protein	Sekvence id.ě	Lokalizace proteinu	---y.-. Úspěšnost bakteriální produkce	Viz příklad ě.
pMAL-p2x-His-rEK-PTH	pMBP-His-rEK-PTH	1	periplasma	+/-	1 - 2
pMAL-p2x-His-rTEV-PTH	pMBP-His-rTEV-PTII	2	periplasma	+/-	1 - 2
pMAL-c2x-His-rEK-PTII	cMBP-His-rEK-PTH	1	cytosol	+	1 - 6
pMAL-c2x-Hi$-rTEV.PTH	cMBP-His-rTEV-PTH	2	cytosol	+	1 -6
pET-45b( * )-His-rEK-PTH	His-rEK-PTH	6	cytosol	-	7
pET-45b(+)-His-iTEV-PTH	His-rTEV-PTH	8	cytosol	-	7
pET-45b( )-OmpA-His-rEK-PTFI	OmpA-His-rEK-PTH	10	periplasma	-	7

pET-45b( O-OnipA-His-rTEV-PTH	OmpA-His-rTEV-PTH	12	periplasma	—	7
pET-45b( * l-OrnpA-P TH	OmpA-PTH	14	periplasma	-	7

Pozn.: pMBP - protein vázající maltosu (MBP), který je cílen do periplasmatického prostoru (tzti. obsahuje sekreční signální sekvenci); cMBP = protein vázající maltosu (MBP), který zůstává v cytosolu (tzn. neobsahuje sekreční signální sekvenci) + proces produkce fúzního proteinu vedl k vysokým výtěžkům +/- proces produkce fúzního proteinu vedl k velmi nízkým výtěžkům proces produkce fúzního proteinu vedl k nulovým výtěžkům

Ukázalo se, že bakteriální exprese fúzních proteinů cílených do periplasmatického prostoru, a to konkrétně proteinů pMBP-His-rEK-PTH, pMBP-His-rTEV-PTH, OmpA-HisrEK-PTH, OmpA-His-rTEV-PTH, OmpA-PTH, vedla k nulovým nebo velmi nízkým výtěžkům, přestože je známo, že v periplasmatickém prostoru je ve srovnání s cytosolem bakterie nižší koncentrace bakteriálních proteas schopných štěpit produkovaný rekombinantni peptid/protein. Je též známo, že připojení proteinu vázajícího maltosu (MBP) k peptidu může značně zvýšit expresi fúzního proteinu a zároveň jeho stabilitu v bakterii E. coli (di Guan et al., 1988). U fúzních proteinů pMBP-IIis-rEK-PTH, pMBP-His-rTEV-PTH však kombinace obou přístupů očividně selhala.

Exprese fúzního proteinu His-rEK.-PTH a His-rTEV-PTH, který zůstával v cytosolu bakterie, vedla k nulovým výtěžkům. Histidinová kotva (Smith and Pidgeon, 1984) sice umožňuje použití finančně výhodnějších afmitních chromatografických kolon, ale v případě teriparatidu se ukázalo, že samotné připojení histidinové kotvy k peptidu nestačí k jeho vysoké bakteriální produkci.

Na rozdíl od výše zmíněných fúzních proteinů, exprese proteinu MBP-His-r(Spec)PTH (např. MBP-His-rEK-PTH nebo MBP-His-rTEV-PTH), s lokalizací v cytosolu bakterie, překvapivě vedla k vysokým výtěžkům fúzního proteinu. Fúzní protein MBP-His-r(Spec)PTH obsahuje protein vázající maltosu (MBP), histidinovou kotvu (His) a teriparatid (PTH(134)). Teriparatid je od fúzní části oddělen specifickou sekvencí pro štěpení vhodným enzymem (například enterokinasou (rEK) nebo TEV proteasou (rTEV)). K efektivní purifikaci připraveného fúzního proteinu postačuje afinitní chromatografie na Ni²* koloně, v případě potřeby (například pro přípravu analytického standardu) je však možno provést ještě jeho přečištění na bioafinitní koloně využívající interakce se sekvencí MBP. Po štěpení sekvence r(Spec) příslušným specifickým enzymem lze připravený teriparatid izolovat a finálně purifikovat kterýmkoliv obvyklým způsobem

Podstata úspěšné přípravy rekombinantních peptidu v bakterii E. coli, jako je příprava teriparatidu, tedy spočívá nejen v nalezení správného fúzního proteinu, tj. vhodné aminokyselinové sekvence i její délky, ale i ve výběru lokalizace produkovaného proteinu, tzn. zda má zůstat v cytosolu bakterie nebo má být transportován do jejího periplasmatického $

prostoru. Pro průmyslové použití dále hraje zásadní roli možnost jednoduché a levné separace připraveného fúzního proteinu od ostatních biomolekul vytvářených produkčním mikroorganismem, dále i možnost snadného specifického odštěpení peptidu a jeho finální purifikace.

Námi připravený fúzní protein MBP-His-r(Spec)-PTH, všechny tyto požadavky splňuje - v bakteriích je produkován ve vysokých výtěžcích a jeho purifikace z bakteriální kultury, včetně závěrečného odštěpení teriparatidu, představují efektivní a finančně nenáročný proces.

obrázků na/přik>ženýd/ výkresech

Obr. č. 1

Expresní vektor pMAL-c2x-His-rEK-PTH pro expresi fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH.

Obr. č. 2

Expresní vektor pMAL-c2x-His-rTEV-PTH pro expresi fúzního proteinu MBP-His-rTEVPTH.

Obr. č. 3

Dokumentace exprese MBP-His-rEK-PTH (49 kDa) v bakterii E. coli v případě (A) periplasmatické lokalizace a (B) cytosolické lokalizace pomocí Glycin-SDS-PAGE (12% gel). A) V sloupci označeném jako M je molekulový markér Precision Plus Protein Unstained Standard (Bio-Rad); v sloupci označeném jako NI jsou periplasmatické bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-p2x-His-rEK-PTH před indukcí exprese pomocí ÍPTG (isopropyl-p-D-l-thiogalactopyranosid); v sloupci označeném jako I jsou periplasmatické bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-p2x-His-rEK-PTH po 3 h od indukce exprese pomocí IPTG. Β) V sloupci označeném jako M je molekulový markér Precision Plus Protein Unstained Standard (BioRad); v sloupci označeném jako NI jsou všechny bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLlBlue s expresním vektorem pMAL-c2x-His-rEK-PTH před indukcí exprese pomocí IPTG; v sloupci označeném jako I jsou všechny bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-c2x-His-rEK-PTH po 3 h od indukce exprese pomocí IPTG.

Obr. č. 4

Dokumentace průběhu purifikace MBP-His-rEK-PTH (49 kDa) pomocí Glycin-SDS-PAGE (10% gel). Fúzní protein MBP-His-rEK-PTH byl purifikován na základě afínitní chromatograííe s využitím Ni^z+ chelatační kolony. V sloupci označeném jako M je molekulový markér Ml 2 Unstained Standard (Invitrogen); v sloupci označeném jako NI jsou .10.

všechny bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-c2xHis-rEK-ΡΓΗ před indukcí exprese pomocí IPTG; v sloupci označeném jako I jsou všechny bakteriální proteiny z bakterie E. coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-c2x-His-rEKP1 H po 3 h od indukce exprese pomocí IPTG; v sloupci označeném jako CL jsou všechny rozpustné bakteriální proteiny izolované z bakterie E, coli XLl-Blue s expresním vektorem pMAL-c2x-His-rEK-PTH po 3-hodinové expresi; v sloupci označeném jako FT jsou proteiny, které se nezachytily na Ni²⁺ chelatační kolonu; v sloupci označeném jako WB jsou proteiny vymyté z Niⁱ⁺ chelatační kolony po promytí pufrem 300mM NaCl, 50mM NaH₂PO4, pH 8.0; v sloupci označeném jako W1 jsou proteiny vymyté zNi²^ chelatační kolony po promytí pufrem 300mM NaCl, 50mM NafLPCL, lOmM imidazol, pH 8.0; v sloupci označeném jako W2 jsou proteiny vymyté z Ni^2í chelatační kolony po promytí pufrem 300mM NaCl, 50mM NafbPOí, 20mM imidazol, pH 8.0; v sloupci označeném jako E je punfikovaný fúzní protein MBP-His-rEK-PTH, který byl eluován z Ni²⁺ chelatační kolony pufrem 300mM NaCl, 50mM NaEBPCU, 70mM imidazol, pH 8.0.

Obr. č. 5

Dokumentace specifického štěpení fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH (49 kDa) enterokmasou za uvolnění PTH(l-34) (4 kDa) pomocí Tricin-SDS-PAGE (16% gel). V sloupci označeném jako M je molekulový markér Ml2 Unstained Standard (Invitrogen); v sloupci označeném jako 1 je fúzní protein MBP-His-rEK-PTH před specifickým štěpením enterokinasou; v sloupci označeném jako 2 je fúzní protein MBP-His-rEK-PTH po štěpení enterokinasou, přičemž se uvolňuje PTH(l-34); v sloupci označeném jako 3 je syntetický PTH( 1-34) jako kontrola.

Obr. č. 6

RP-HPLC purifikace PTH(l-34). Na obr. A je zaznamenán RP-HPLC chromatogram purifikace PTH(l-34), který vznikl po štěpení fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH. Na obr. B je zaznamenán RP-HPLC chromatogram přečištěného PTH(l-34).

Příklady provedení vynálezu

Příklad Č. 1

Byly připraveny 2 expresní plasmidy, které měly exprimovat fúzní protein, zůstávající v cytosolu bakterie (tzn., že neobsahují sekreční signál pro transport proteinu do periplasmy využití plasmidu pMAL-c2x), a 2 expresní plasmidy, které měly exprimovat fúzní protein, který byl cílen do periplasmatického prostoru bakterie (tzn. že obsahují sekreční signál cílící protein do periplasmy - využití plasmidu pMAL-p2x).

Z kompletní aminokyselinové sekvence lidského parathormonu PTH(l-84) byla použita biologicky aktivní N-koncová část PTH(l-34) (viz id.č. 3). Na základě této sekvence

Lbyla navržena oligonukleotidová sekvence s přesahy kódující His-rEK-PTH, skládající se z hístidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení enterokinasou (rEK) a ΡΊΤí( 1 -34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id.č. 4). Dále byla navržena sekvence His-rTEVΡΊΉ, skládající se z hístidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpeni TEV proteasou (rTEV) a PTH( 1-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id.č. 5).

Oligonukleotidové přesahy jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými .endonukleasami (BamH I/Hind Ιϊ[) expresního vektoru pMAL-c2x, respektive pMAL-p2x, který obsahuje sekvenci kódující MBP (protein vázající maltosu). Oligonukleotidové sekvence His-rEK-PTH (viz id.č. 4), respektive His-rTEV-PTH (viz id.č. 5), byly ligovány do vektoru pMAL-c2x, respektive pMAL-p2x, který byl naštěpen endonukleasami BamH I a Hind III, za vzniku expresních vektorů pMAL-c2x-His-rEK-PTH a pMAL-c2x-His-rTEV-PTH, respektive pMAL-p2x-His-rEK-PTH a pMAL-p2x-His-rTEVPTH. Schéma plasmidu pMAL-c2x-His-rEK-PTH a pMAL-c2x-His-rTEV-PTH je na obr. 1 a 2.

Připravené expresní plasmidy pMAL-c2x-His-rEK-PTH, respektive pMAL-c2x-HisrTEV-PTH, kódují fúzni protein MBP-His-rEK-PTH (viz id. č. 1), respektive MBP-HisrTEV-PTH (viz id. č. 2), který po expresi zůstává v cytosolu bakterie. Připravené expresní plasmidy pMAL-p2x-His-rEK-PTH, respektive pMAL-p2x-His-rTEV-PTH, kódují fúzni protein MBP-His-rEK-PTH (viz id. č. 1), respektive MBP-His-rTEV-PTH (viz id. č. 2), který je po expresi transportován do periplasmatického prostoru bakterie.

Připravenými konstrukty pMAL-c2x-His-rEK-PTH, pMAL-c2x-His-rEK-PTH, respektive pMAL-p2x-His-rTEV-PTH, pMAL-p2x-His-rTEV-PTH byly transformovány bakterie E. coli XLl-Blue.

Příklad č. 2

E. coli XLl-Blue obsahující plasmidy pMAL-c2x-His-rEK-PTH, respektive pMALc2x-His-rTEV-PTH, kde produkovaný fúzni protein zůstává v cytosolu buněk, byly po expresi lyžovány a složení bakteriálních proteinů bylo testováno pomocí Tricine-SDSPAGE (viz obr. č. 3).

E. coli XLl-Blue obsahující plasmidy pMAL-p2x-His-rEK-PTH, respektive pMALp2x-His-rTEV-PTH, kde je produkovaný fúzni protein cílen do periplasmatického prostoru, byly po expresi podrobeny osmotickému šoku z důvodu separace periplasmatických a ostatních bakteriálních proteinů. Buňky byly resuspendovány v pufru obsahujícím 30mM Tris-HCl, pH 8,0, 20% sacharosu, a byly míchány 5 až 10 min při pokojové teplotě. Buněčná suspenze byla poté centrifugována a bakteriální peleta byla resuspendována v ledově chladném 5mM MgSCL a míchána po dobu 10 min v ledové vodní lázni. Buněčná suspenze byla poté opět centrifugována. Pcriplasmatické proteiny se po tomto kroku nacházely v supematantu. Složení periplasmatických proteinů bylo testováno pomocí Tricin-SDS-PAGE (viz obr. č. 3).

V.

Při porovnání exprese fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH v případě jeho lokalizace v cytosolu a v pcriplasmatickém prostoru jc z obr. č. 3 zřejmé, že z hlediska výtěžku je výhodnější fúzní protein MBP-His-rEK-PTH s cytosolickou lokalizací, který je kódován plasmidem pMAL-c2x-His-rEK-PTH, Z tohoto důvodu je v příkladě 3 až 6 popisována práce pouze s íúznínt proteinem MBP-His-rEK-PTH, respektive iMBP-His-rTEV-PTH, s lokalizaci v cytosolu bakterie.

Příklad č. 3

Fúzní protein MBP-His-rEK-PTH, respektive MBP-His-rTEV-PTH, byl izolován z cytosolu buněk E. coli XLl-Blue lyží ve frakci rozpustných bakteriálních proteinů a po převedení do pufru (300mM NaCI, 50mM NaH₂PC>4, pH 8,0) byl purifikován díky přítomné histidinové kotvě afinitní chromatografií na chelatační koloně obsahující Ni²⁺. Po eluci proteinu z kolony (eluční pufr o složení 300mM NaCI, 50mM NaH₂PO4, 70mM imidazol, pH 8,0) byl protein naředěn na koncentraci cca 3 mg/ml a převeden dialýzou do pufru (50mM Tris-HCl, lOOmM NaCI, lOmM EDTA, pH 7,4) pro odstanění imidazolu. Po dialýze byl fúzní protein zahuštěn na koncentraci cca 3 mg/ml a v této koncentraci byl použit k uvolnění PTH(l-34) pomocí specifického štěpení enterokinasou, respektive TEV proteasou (viz příklad č. 5). Postup purifikace fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH z bakteriální kultury je dokumentován na obr. 4.

Příklad č. 4

Fúzní protein MBP-His-rEK-PTH, respektive MBP-His-rTEV-PTH, byl izolován z E. coli XLl-Blue lyží ve frakci rozpustných bakteriálních proteinů a po převedení do pufru (20mM Tris-HCl, pH 7,5, 200mM NaCI, lmM EDTA, lmM DTT) byl purifikován díky přítomnému proteinu vázajícímu maltosu (MBP) afinitní chromatografií na amylosové koloně vázající právě MBP. Po eluci proteinu z kolony (eluční pufr o složení 20mM Tris-HCl, pH 7,5, 200mM NaCI, lmM EDTA, lmM DTT, lOmM maltosa) byl protein převeden dialýzou do pufru (50mM Tris-HCl, lOOmM NaCI, lOmM EDTA, pH 7,4) pro odstranění maltosy.

Vzhledem k tomu, že amylosové náplně chroniatografických kolon mají a) nižší kapacitu a b) jsou finančně náročnější než Ni²^ náplně chromatografických kolon (viz tabulka č. 1), je efektivnější použít afinitní kolonu s náplní Ni²⁺, na kterou se váží proteiny obsahující histidinovou kotvu (viz příklad č. 3).

Příklad č. 5

PTH(l-34) byl z fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH, respektive MBP-His-rTEVPTH, uvolněn specifickým proteolytickým štěpením enterokinasou, respektive TEV proteasou. Fúzní protein MBP-His-rEK-PTH byl specificky štěpen enterokinasou v reakční směsi obsahující reakční pufr pro enterokinasu (20mM Tris-HCl, pH 7,4, 500mM NaCI, 20mM CaCb), enzym a substrát (v poměru 1 U enzymu : 1 nmol substrátu) po dobil 5 hodin

II za pokojové teploty. Štěpení fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH enterokinasou, při kterém se uvolňuje PTH(l-34)je dokumentováno na obr. 5.

bázní protein MBP-Hís-rTEV-PTH byl specificky štěpen TEV proteasou v reakční směsi obsahující reakční pufr pro TEV proteasu (50mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, pH 7,5, iniM DTT), enzym a substrát (v poměru 1 mol enzymu ; 100 mol substrátu) po dobu 16 hodin za pokojové teploty.

Příklad č. 6

Po specifickém štěpení fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH, respektive MBP-HisrTEV-PTH, na PTH(l-34) a zbytek fúzního proteinu, tzn. MBP-His-rEK, respektive MBPHis-rTEV, byl tento zbytek íúzního proteinu z roztoku z větší části odstraněn srážením ethanolem. Částečně přečištěný PTH(l-34) byl pak lyofilizován a následně rozpuštěn v roztoku o složení 90% H20/10% acetonitril/0,1% TFA a finálně přečištěn pomocí RP-HPLC na koloně “Discoverý® Bio Wide Póre C8 column (25^xi0mm, 5 pm)” od firmy SigmaAldrich - SUPELCO. PTH(l-34) byl eluován z kolony gradientem 20*100% acetonitril/0,1% TFA po dobu 60 min. Purifikace PTH(l-34) pomocí RP-HPLC je dokumentována na obr. 6, Nakonec byl PTH(l-34) po purifikaci pomocí RP-HPLC lyofilizován a takto byl připraven pro další použití.

Příklad č. 7 (srovnávací)

Byly připraveny další expresní vektory, které měly exprimovat 2 různé fúzní proteiny zůstávající po expresi v cytosolu (tzn., že neobsahují sekreční signál pro transport proteinu do periplasmy).

Nejprve bylo do expresního plasmidu pET-45b(+) vloženo restrikční místo Nde I mezi Xho I a Nco I, za vzniku plasmidu pET-45b(+)-NdeI.

Podobně, jako v příkladu 1, z kompletní aminokyselinové sekvence lidského parathormonu PTH(l-84) byla použita biologicky aktivní N-koncová část PTH(l-34) (viz id.č. 3). Na základě této sekvence byla navržena oligonukleotidová sekvence s přesahy kódující His-rEK-PTH, skládající se z histidínové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení enterokinasou (rEK) a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id.č. 7). Dále byla navržena oligonukleotidová sekvence kódující His-rTEV-PTH, skládající se z histidínové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení TEV proteasou (rTEV) a PTH(134) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id.č. 9).

Oligonukleotidové přesahy jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčnim štěpením příslušnými endonukleasami (Nde \/Hind III) expresního vektoru pET-45b(+)-NdeL Oligonukleotidové sekvence His-rEK-PTH (viz id. č. 7), respektive His-rTEV-PTH (viz id. č. 9), byly tigovány do vektoru pET-45b(+)-NdeI, který byl naštěpen endonukleasami Nde I a Hind III, za vzniku 2 expresních vektorů pET-45b(+)-His-rEK-PTH, respektive pET45b( Ο-His-rTEV-PTH, kódující fúzní protein His-rEK-PTH (viz id. č. 6), respektive His14 rTEV-PTH (viz id. č. 8). Takto připravenými konstrukty byly transformovány bakterie E. coli

BL21(DE3).

E. coli BL21(DE3) obsahující plasmidy pET-45b(+)-His-rEK-PTH, respektive pET45b(v)-His-r'I EV-PTH, kde produkovaný fúzní protein zůstává v cytosolu buněk, byly po expresi lyžovány a složení bakteriálních proteinu bylo testováno pomocí Tricin-SDSPAGE. Produkce proteinu His-rEK-PTH, respektive His-rTEV-PTH, nebyla v bakteriích detekována.

Byly připraveny další expresní vektory, které měly exprimovat 3 různé fúzní proteiny, všechny obsahující sekreční signál proteinu OmpA (z angl. outer membrane protein A), který cílí daný protein do periplasmatického prostoru bakterie.

Nejprve bylo do expresního plasmidu pET-45b(+) vloženo restrikční místo Nde I mezi Xho I a Nco I, za vzniku plasmidu pET-45b(+)-NdeI.

Podobně, jako v příkladu 1, z kompletní aminokyselinové sekvence lidského parathormonu PTH(l-84) byla použita biologicky aktivní N-koncová část PTH(l-34) (viz id.č. 3). Na základě této sekvence byla navržena oligonukleotidová sekvence s přesahy kódující OmpA-His-rEK-PTH, skládající se ze sekrečního signálu pro OmpA protein, histidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení enterokinasou (rEK) a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id.č. 11). Dále byla navržena oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-His-rTEV-PTH, skládající se ze sekrečního signálu pro OmpA protein, histidinové kotvy (His), specifické sekvence pro štěpení TEV proteasou (rTEV) a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id.č. 13). Dále byla navržena oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-PTH, skládající se ze sekrečního signálu pro OmpA protein a PTH(l-34) s optimalizovanými kodony pro E. coli (viz id.č. 15).

Oligonukleotidové přesahy jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami (Nde 1/Hind III) expresního vektoru pET-45b(+)-NdeI. Oligonukleotidové sekvence OmpA-His-rEK-PTH (viz id. č. 11), OmpA-His-rTEV-PTH (viz id. č. 13), respektive OmpA-PTH (viz id. č. 15), byly ligovány do vektoru pET-45b(+)-NdeI, který byl naštépen endonukleasmi Nde I a Hind III, za vzniku 3 expresních vektorů pET45b( 4)-OmpA-His-rEK-PTH, pET-45b(+)-OmpA-His-rTEV-PTH, respektive pET-45b(ijOmpA-PTH, kódujících fúzní proteiny OmpA-His-rEK-PTH (viz id.č. 10), OmpA-His-rTEVPTH (viz id.č. 12), respektive OmpA-PTH (viz id.č. 14). Takto připravenými konstrukty byly transformovány bakterie E. coli BL21(DE3),

E. coli BL21(DE3) obsahující plasmidy pET-45b(+)-OmpA-His-rEK-PTH, pET45b(+)-OmpA-His-rTEV-PTH, respektive pET-45b(+)-OmpA-PTH, kde je produkovaný protein transportován do periplasmatického prostoru bakterií, byly po expresi podrobeny osrnotickému šoku z důvodu separace periplasmatických a ostatních bakteriálních proteinů. Buňky byly resuspendovůny v pufru obsahujícím 30mM Tris-HCl, pH 8,0, 20% sacharosu, a byly míchány 5 až 10 min pri pokojové teplotě. Buněčná suspenze byla poté centrifugována a bakteriální peleta byla resuspendována v ledově chladném 5mM MgSCL a míchána po dobu .¹⁵ min v ledové vodní lázni. Buněčná suspenze byla poté opět centrifugována. Pcriplasmatické proteiny se po tomto kroku nacházely v supematantu. Složení periplasmatických proteinu bylo testováno pomocí Tricin-SDS-PAGE. Produkce proteinu OmpA-His-rEK-PTH, OmpA-His-rTEV-PTH, respektive OmpA-PTH, nebyla v bakteriích detekována.

'16

Reference

Armstrong MD. fhe relationship between, homoserine and its lactone. Joumal of the Američan Chemical Society 1949; 71: 3399*^402.

•n*

Bonn D. Parathyroid hormone for osteoporosis. Lancet 1996; 347: 50/50.

Byme LJ, O’Callaghan KJ, Tuite MF. Heterologous gene expression in yeast. In: Smales CM, James DC, editors. Methods in molecular biology. 308. Humana Press, Totowa, 2005, pp. 51.«*ť 64.

Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Fems Microbiology Reviews 2000; 24: 45/(56.

di Guan C, Li P, Riggs PD, Inouye H. Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein. Gene 1988; 67: 21»« 30.

Fu XY, Tong WY, Wei DZ. Extracellular production of human parathyroid hormone as a thioredoxin fusion form in Escherichia coli by chemical permeabilization combined with heat treatment. Biotechnology Progress 2005; 21: 1429*^435.

Gangireddy SR, Madhavi RD, Ravikanth KR, Reddy PK, Konda VR, Rao KRSS, et al. High yield expression of human recombinant PTH(l-34). Curr Trends Biotechnol Pharm 2010; 4: 568Í577.

Gardella TJ, Rubin D, Abousamra AB, Keutmann HT, Potts JT, Kronenberg HM, et al. Expression of human parathyroid hormone-(l-84) in Escherichia coli as a factor-X-cleavable fusion protein. Joumal of Biological Chemistry 1990; 265: 15854*15859.

Gautvik KM, Alestrom P, Oven TM, Gabrielsen OS. Production of human parathyroid hormone from microorganisms. US Patent No. 5,010,010 1991.

Gram H, Ramage P, Memmert K, Gamse R, Kocher HP. A novel-approach for high-level production of a recombinant,human parathyroid-hormone fragment in Escherichia coli. BioTechnology 1994; 12: 1017ÍÍ023.

Hodsman AB, Bauer DC, Dempster DW, Dian L, Hanley DA, Harris ST, et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: A reyicw of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews 2005; 26: 688*703.

Jin L, Briggs SL, Chandrasekhar S, Chirgadze NY, Clawson DK, Schevitz RW, et al. Crystal structure of human parathyroid hormpne 1-34 at 0.9-angstrom resolution. Joumal of Biological Chemistry 2000; 275: 27238*27244.

Kareem BN, Rokkones E, Hogset A, Holmgren E, Gautvik KM. A rnethod for the evaluation of the efficiency of signa! sequences for secretion and correct n-terminal proccssing of human parathyroid-honnone produccd in Escherichia coli. Analytical Biochemistry 1992; 204: 26*^J*'

33.

Kronenberg HM, Brínghurst FR, Nussbaum S, Juppner H, Abou-Samra AB, Segre GV, et al. Parathyroid hormone: biosynthesis, secretion, chemistry, and action. Heidelberg: SpringerVerlag KG, 1993.

Lee SY, Choi JH, Lee SJ. Secretory production of therapeutic proteins in Escherichia coli. In: Smales CM, James DC, editors. Methods in Molecular Biology, 308. Humana Press, Totowa, 2005, pp. 314l.

Liu QH, Lin JP, Liu MY, Tao XY, Wei DZ, Ma XY, et al. Large scale preparation of recombinant human parathyroid hormone 1-84 from Escherichia coli. Protein Expression and Purification 2007; 54: 212^519.

Nakagawa S, Tamakashi Y, lshibashi Y, Kawase M, Taketomi S, Nishimura O, et al. Production of human PTH(l-34) via a recombinant DNA technique, Bíochemical and Biophysical Research Communications 1994; 200: 1735*1741.

Oldenburg KR, Dorfani AL, Selick HE. A method for the high-level expression of a paratliyroid-hormone analog in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 1994; 5; 278*284.

Olstad OK, Reppe S, Gabrielsen OS, Hartmanis M, Blingsmo OR, Gautvik VT, et al. Isolation and characterization of 2 biologically-active O-glycosylated forms of human parathyroid-hormone produced in Saccharomyces cerevisiae - identification of a new motif for O-glycosylation. European Joumal of Biochemistry 1992; 205: 311<S19.

Oshika Y, Yamada T, Nakagawa S, Fujishima A, Kawase M, lshibashi Y, et al. Human parathyroid-hormone - efficient synthesis in Escherichia coli using a synthetic gene, purification and characterization. Intemational Joumal of Peptide and Protein Research 1994; 43; 441ÍŤ447.

Rabbani SA, Yasuda T, Bennett HPJ, Sung WL, Zahab DM, Tam CS, et al. Recombinant human parathyroid-hormone synthesized in Escherichia cgli - purification and characterization. Joumal of Biological Chemistry 1988; 263: 1307*1313.

Ruml T, Rumlová M, Pačes V. In: Ruml T, Rumlová M, Pačes V, editors. Genové inženýrství. VŠCHT Praha, Praha, 2002.

Smith DB, Johnson KS. Single-step purification of poiypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 1988; 67: 31 *40.

Smith MC, Pidgeon C. Process for purifying proteins and compounds useful in such process. US Patent No. 4,569,794 1984.

Suzuki Y, Yabuta M, Ohsuye K. High-level production of recombinant human parathyroid hormone U34. Applied and Environmcntal Microbiology 1998; 64: 526^29.

1S

Whitheld JF, Morley P. Smáli bone-building fragments of parathyroid-hormone new therapeutic agents for osteoporosis. Trends in Pharmacological Sciences 1995, 16: 382.Á86.

Wingender E, Bcrcz G, Blocker H, Frank R, Mayer H. Expression of humaii parathyroidhormone in Escherichia coli. Joumal of Biological Chcmistry 1989; 264: 4367*4373.

Průmyslová využitelnost

Postup biotechnologické produkce teriparatidu (PTH(l-34)) dle předloženého vynálezu je vhodný pro farmaceutickou výrobu výše zmíněného terapeutického peptidů, použitelného pro léčbu osteoporózy.

Přehled sekvencí

Identifikační číslo: 1

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu MBP-His-rEK-PTH.

MKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVA

ATGDGPD1IFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLI AYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFT WPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADT DYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVG VLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAK DPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQ TNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGSHHHHHHGAGDDDDKSVSEIQLMHNL GKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo: 2

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu MBP-His-rTEV-PTH.

MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVA ATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLI AYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFT WPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADT DYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVG VLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAK DPR1AATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQ TNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGSHHHHHHGAENLYFQSVSEIQLMHNLG KHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo: 3

Charakteristika: aminokyselinová sekvence peptidů PTH(I-34)

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

19'

Identifikační číslo: 4

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující His-rEK-PTH s optimalizovanými kodony pro coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami BamH \JHind III expresního vektoru pMAL-c2x, respektive pMAL-p2x)

GGATCCCACCACCACCACCACCACGGTGCGGGTGATGATGATGATAAATCTGTTT CTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGT TGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAAGCTT

Identifikační číslo: 5

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující His-rTEV-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpem příslušnými endonukleasami BamH V Hind III expresního vektoru pMALc2x, respektive pMAL-p2x)

GGATCCCACCACCACCACCACCACGGTGCGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGTTT CTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGT TGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAAGCTT

Identifikační číslo: 6

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu His-rEK-PTH.

MHHHHHHGAGDDDDKSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo: 7

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující His-rEK-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpení příslušnými endonukleasami Nde UHindítt expresního vektoru pET45b(+)-NdeI).

CATATGCACCACCACCACCACCACGGTGCGGGTGATGATGATGATAAATCTGTTT CTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGT TGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAAGCTT

Identifikační číslo: 8

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu His-rTEV-PTH.

MHHHHHHGAENLYFQSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo: 9

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující His-rTEV-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpení příslušnými endonukleasami Nde VHindWl expresního vektoru pET45b(+)-NdeI).

CATATGCACCACCACCACCACCACGGTGCGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGTTT CTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGT TGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAAGCTT

20'

Identifikační Číslo: 10

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu OmpA-His-rEK-PTH.

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAGSHHHHHHGAGDDDDKSVSEIQLMHNLGKHLNSM ERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo: 11

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-His-rEK-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpeni příslušnými endonukíeasami Nde XJHind III expresního vektoru pET-45b(+)-NdeI).

CATATGAAAAAAACTGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTGGTTTCGCTACTGT TGCTCAGGCTGGATCCCACCACCACCACCACCACGGTGCGGGTGATGATGATGAT AAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTA TGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAA GCTT

Identifikační číslo: 12

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu OmpA-His-rTEV-PTH. MKKTAIAIAVALAGFATVAQAGSHHHHHHGAENLYFQSVSEIQLMHNLGKHLNSME RVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo: 13

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-His-rTEV-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpení příslušnými endonukíeasami Nde V Hind III expresního vektoru pET-45b(+)-NdeI).

CATATGAAAAAAACTGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTGGTTTCGCTACTGT TGCTCAGGCTGGATCCCACCACCACCACCACCACGGTGCGGAAAACCTGTACTTC CAGTCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTA TGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAAA GCTT

Identifikační číslo: 14

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fúzního proteinu OmpA-PTH.

MKKTAIAIAVALAGFATVAQSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

Identifikační číslo: 15

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující OmpA-PTH s optimalizovanými kodony pro E. coli (s oligonukleotidovými přesahy komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpení příslušnými endonukíeasami Nde VHind III expresního vektoru pET45b(+)-NdeI).

CATATGAAAAAAACTGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTGGTTTCGCTACTGT TGCTCAGTCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAAC TCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCT AAAAGCTT

21'

Identifikační číslo: 16

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující fúzní protein MBP-His-rEK-PTH.

ATGAAAACTGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTAT AAUGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTC ACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACT GGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTC AATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTA TCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATC GCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAA AAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAG AGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTG CTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACG TGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGAT TAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTT AATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATC GACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAAC CATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAA CAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTG GAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAG GAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAA GGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTA CTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAG ACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACC TCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCCACCACCACCACCACCACG GTGCGGGTGATGATGATGATAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCT GGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCA GGATGTTCACAACTTC

Identifikační Číslo: 17

Charakteristika: Oligonukleotidová sekvence kódující fúzní protein MBP-His-rTEV-PTH.

ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTAT AACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTC ACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACT GGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTC AATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTA TCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATC GCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAA AAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAG AGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTG CTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACG TGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGAT TAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTT AATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATC GACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAAC CATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAA CAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTG GAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAG GAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAA

22'

GGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTA CTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAG ACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACC TCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCCACCACCACCACCACCACG GTGCGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCT GGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCA GGATGTTCACAACTTC

Claims (11)

1. Patentové nároky

   1. Fúzní protein MBP-His-r(Spec)-PTH tvořený proteinem vázajícím maltosu (MBP), histidinovou kotvou (His), aminokyselinovou sekvencí r(Spec) pro specifické štěpeni proteasou a sekvencí PTH(l-34), kde sekvence PTH(l-34) představuje bioaktivni část parathyroidního hormonu sekvence id. č.3.
2. 2. Fúzní protein dle nároku ^vyznačující se tím, že sekvence r(Spec) umožňuje specifické štěpení enterokinasou.
3. 3. Fúzní protein podle nároku 1 ₍ vyznačující se tím, že sekvence r(Spec) umožňuje specifické štěpení TEV proteasou.
4. 4. Fúzní protein podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že má aminokyselinovou sekvenci id.č. 1.
5. 5. Fúzní protein podle nároku 1 nebo 3, vyznačující se tím, že má aminokyselinovou sekvenci id.č. 2.

   JX*
6. 6. Molekula DNA kódující fúzní protein dle některého z nároků 1x5.
7. 7. Molekula DNA podle nároku 6₍vyznačující se tím, že má sekvenci id.č. 16 nebo 17.
8. 8. Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny dle nároku 6 nebo 7.
9. 9. Hostitelská buňka obsahující vektor dle nároku 8.
10. 10. Hostitelská buňka dle nároku 9, kterou je E. coli XLl-Blue.
11. 11. Použití fúzního proteinu podle některého z nároků N5 k přípravě teriparatidu.

    24.

    1/4

    PTH(1-34)

    EK recognition