KR101183173B1

KR101183173B1 - 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 ｒｎａ의 제조 규모 정제 방법

Info

Publication number: KR101183173B1
Application number: KR1020097012957A
Authority: KR
Inventors: 토마스 케터러; 플로리안 본 데 뮬베; 레디스라우스 레이델; 토르스텐 뮤츠케
Original assignee: 큐어백 게엠바하
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2012-09-14
Also published as: ATE481482T1; KR20090098968A; WO2008077592A1; CN101563457B; DE102006061015A1; EP2092064B1; JP5307724B2; AU2007338360B2; CN101563457A; CA2670727A1; DE602007009295D1; JP2010512767A; EP2092064A1; CA2670727C; ES2352306T3; US8383340B2; AU2007338360A1; DK2092064T3; PL2092064T3; US20100048883A1

Abstract

본 출원은 RNA의 제조 규모 정제(preparative purfication) 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 다공성 역상 물질을 정지상으로 이용하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통하여 RNA를 정제하는데 차별성이 있다. HPLC에서 이 다공성 역상 물질을 사용하는 방법도 본 출원에서 기술하고 있다.

Description

고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 ＲＮＡ의 제조 규모 정제 방법{METHOD FOR PURIFYING RNA ON A PREPARATIVE SCALE BY MEANS OF HPLC}

본 발명은 HPLC를 이용하여 RNA를 제조 규모(preparative scale)로 정제하는 방법과 이 방법에서 정지상으로서 다공성 역상(porous reverse phase)의 용도에 관한 것이다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, high performance (high pressure) liquid chromatography의 약어)는 물질의 혼합물을 분리하는 확립된 수단인데, 생화학, 분석화학과 임상화학에서 널리 쓰인다.

HPLC 장치는 가장 간단한 경우에 이동상(mobile phase)을 담고 있는 용리액 저장조(eluent reservoir)를 갖춘 펌프, 시료 부가 시스템, 정지상(stationary phase)을 담고 있는 분리용 컬럼과 감지기로 이루어진다. 덧붙여서 분획 수집기(fraction collector)를 더 갖추고 있을 수 있는데, 여기서는 분리 후 각각을 따로 수집하여 추후 용도에 사용하는 것이 가능하다.

이온쌍 역상(ion pair reversed phase) HPLC를 이용한 RNA 분석은 A. Azarani와 K. H. Hecker의 연구(Nucleic Acids Research, 통권 29, 제2호 e7)로 알려져 있다. 여기서 이 정지상은 비다공성 알킬화 폴리스티렌디비닐벤젠 매트릭 스(non-porous alkylated polystyrenedivinylbenzene matrix)로 이루어진다. 용리는 두 개의 용리액으로 된 완충 용액 시스템을 가지고 진행한다. A 완충액은 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄(TEAA) 수용액, pH 7.0으로 이루어지고 B 완충액은 25% 아세토니트릴을 포함하는 0.1 M TEAA, pH 7.0으로 이루어진다. 용리는 다음의 세 농도구배(gradient) 시스템을 사용하여 수행하였다: 1분에 걸쳐 B 38~40%로, 이후 15분에 걸쳐 60% B까지, 5분에 걸쳐 66% B까지, 0.5분에 걸쳐 70% B까지, 0.5분에 걸쳐 100% B까지, 100% B에 1분간 유지, 1분에 걸쳐 38%로, 2분 동안 38% B에 유지. 혹은 다음 농도구배 프로그램을 이용하였다: 30분에 걸쳐 38~60%로, 이후 2분에 걸쳐 100% B까지, 3분에 걸쳐 38% B로. 세번째 농도구배 프로그램으로 다음을 이용하였다: 1분에 걸쳐 B 38~40%로, 이후 3분에 걸쳐 60% B까지, 1분에 걸쳐 100% B까지, 100% B에 6분간 유지, 1분에 걸쳐 38%로, 1분 동안 38% B에 유지.

이 HPLC 방법은 따라서 상대적으로 복잡하고 비싼 농도구배 프로그램을 포함하였다. 게다가 이 방법으로 분리하고 분석할 수 있는 RNA 분석량은 최대 1000 ng(1 ㎍ 또는 0.001 mg)에 불과하다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 유형의 분리법을 개선하여 선행 기술의 단점을 더 이상 가지지 않도록 하는 것이다.

본 발명에서는 이 같은 개선을 제조 규모(preparative scale)로 RNA를 정제하는 방법을 이용하여 이룩하는데, 여기서 이 정제 방법은 다공성 역상을 정지상으로 이용하는 HPLC를 써서 RNA를 분리하는데 특징이 있다. 따라서 본 발명의 이 방법에서 중요한 요소는 다공성 역상을 사용하는 것이다.

본 발명의 맥락에서 "HPLC를 이용하여(by means of HPLC)"라는 용어에는 본 발명 방법을 수행하는데 쓰일 수 있는 여러 가지 HPLC 방법은 물론 저압이나 정상 압력 액체 크로마토그래피 분리법이 포함된다. 여기에는 역상 HPLC(RP-HPLC), 크로마토그래피, 크기별 배제(size exclusion) 크로마토그래피, 겔 여과, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 이온쌍 크로마토그래피가 포함될 수 있는데 역상 HPLC가 바람직하다. 상술하지는 않으나, 역상 HPLC는 비극성 정지상과 약간 극성인 이동상으로 이루어진다. 흔한 정지상 중 하나는 예를 들어 RMe₂SiCl 등으로 처리한 실리카인데, 여기서 R은 C₁₈H₃₇나 C₈H₁₇과 같은 곧은 사슬 알킬기이다. 이 때문에 더 비극성인 분자의 머무름 시간(retention time)이 더 길어 극성 분자가 쉽게 용출되게 한다. 머무름 시간은 이동상에 극성 용매를 부가하여 늘릴 수 있고, 더 소수성인 용매를 부가하여 줄일 수 있다.

그러나 전술한 여러 가지 방법은 소수성 상호작용의 원리에 따라 작동하는데, 이 상호작용은 상대적으로 극성인 용매, 상대적으로 비극성인 분석 대상 물질(analyte) 그리고 비극성인 이동상(역상 원리) 사이의 척력에서 비롯한다. 분석 대상 물질(RNA 분자)이 정지상에 결합하도록 하는 구동력은 용매에 노출된 분석 대상 분자의 비극성 부위의 면적을 줄이는 데서 나온다. 이러한 소수성 효과(hydrophobic effect)를 지배하는 것은 분자-극성 용매 계면의 정돈된 구조를 최소화하려는 엔트로피 작용에서 비롯하는 자유 에너지 감소이다. 이 소수성 효과는 비극성 용매를 이동상에 더 넣으면 줄어든다. 이렇게 하면 분배 계수 값이 바뀌어 분석 대상 물질이 이동상 속에서 컬럼을 따라 이동하는데 시간의 일부를 보내게 되어 결국에는 컬럼에서 용출한다.

분석 대상 물질인 특이적 RNA 분자의 성질은 자신의 머무름 특성에 중요한 역할을 한다. 일반적으로 무극성 작용기를 더 많이 가지고 있는 분석 대상 물질은 머무름 시간이 길게 되는데 그 까닭은 이러한 작용기가 분자의 소수성을 높이기 때문이다. 그러나 아주 거대한 분자는 대형 분석 대상 물질의 표면과 알킬기 사이에 상호작용이 불완전할 수 있다. 머무름 시간은 소수성 표면적이 커짐에 따라 늘어나는데 이 표면적은 용질 크기에 대략 역비례한다. 가지친 사슬 화합물은 다른 이성질체보다 더 빨리 용출하는데 이는 전체적인 표면적이 줄어들었기 때문이다.

이동상의 소수성을 제외하더라도 본 발명에 따르면 이동상의 기타 개질제가 분석 대상 물질(RNA 분자)의 머무름 시간에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어 무기 염을 부가하는 것은 수용액의 표면장력을 선형적으로 증가시킨다고 여기고 있고 분석 대상 물질-용매 계면의 엔트로피는 표면장력이 조절하고 있기 때문에 염의 부가는 머무름 시간을 늘리는 편이다. 본 발명에 따라서 쓸 수 있는 다른 중요한 성분은 pH인데, pH는 분석 대상 물질의 소수성을 바꿀 수 있기 때문이다. 이러한 이유에서 인산나트륨이나 기타 흔한 완충제 등의 완충제를 사용하여 pH를 조절할 수 있다. 포름산이나 가장 흔하게는 트리플루오로아세트산과 같은 유기산을 이동상에 가할 수 있다. 이 같은 개질은 여러 가지 목적을 위한 것이다: 개질은 pH를 조절하고 정지상 위에 놓인 모든 잔류 노출 물질의 전하를 중화하며 이온쌍 생성제(ion pairing agent)로 작용하여 분석 대상 물질의 전하를 중화한다. 이 효과는 용도에 따라 달라지지만 일반적으로 크로마토그래피 분리를 개선한다.

본 발명의 용도를 위해서는 "정제"라는 용어가 시료 속의 원하는 RNA를 시료의 존재하는 불순물로부터 분리 및/또는 단리(單離 isolation)하는 것으로 이해하여야 한다. 따라서 HPLC 분리 후 RNA는 HPLC 정제 전의, 분리에 사용한 RNA-함유 시료 속에 있는 형태보다 더 순수한 형태로 존재하게 된다. 분리가 필요한, RNA-함유 시료 속의 원하지 않는 구성 성분은 특히 파괴된 조각들이나 전사의 때 이른 종료나 플라스미드가 완전히 선형화되지 않았을 때의 과도하게 긴 전사체에서 생기는 조각들일 수 있다. 게다가 RNase와 중합효소 등의 효소와 같은 불순물과 뉴클레오티드를 분리할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면 정제 후 출발 물질보다 순도가 더 높은 RNA로 정제한다. 이러한 측면에서 순도는 100%에 최대한 가까운 것이 바람직하다. 이 방법으로 70%를 넘는 순도, 특히 80%, 더욱 특히 90% 그리고 매우 바람직하게는 99%나 그 이상 되는 정도의 순도를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 제조용 RNA 정제를 이룰 수 있다. 제조용 정제는 분석용 HPLC법과는 다른데, HPLC법은 상기 선행 기술(Azarani와 Hecker)에서 기술하고 있다. 분석용 HPLC법에서는 제조용 HPLC법보다 뚜렷이 더 적은 양을 투입하고 분리한다. 선행 기술에서 논하고 있는 방법에서는 8 ng 내지 1000 ng 분량을 투입하였다. 반면에 제조용 HPLC법에서는 상대적으로 많은 양의 RNA를 정제한다. 이렇게 상대적으로 많은 양은 예를 들어 0.5 mg 이상, 특히 1.0 mg 내지 1000 mg 또는 그 이상, 아주 특히는 약 1.5 mg 이상이고 kg 범위까지 규모를 키울 수도 있다. 앞선 문장은 따라서 이러한 양이 1회의 HPLC 운전에 해당한다는 것으로 이해하여야 한다. HPLC 운전을 여러 번 한다면 HPLC 운전 수에 정비례하여 양이 늘어난다.

본 발명의 방법, 특히 이 명세서에서 이후 상술할 바람직한 실시 태양은 일련의 장점을 보여준다: 본 발명의 방법을 사용하면 종래 기술로 알려진 방법으로 가능한 양보다 상당히 더 많은 양의 RNA를 분리할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하면 이러한 상대적으로 많은 양을 높은 순도로 얻을 수 있다. 파괴된 조각이나 과도하게 긴 조각 또는 때 이른 전사 종료 때문에 생긴 조각을 분리하는 것도 가능하다. 게다가 RNA 시료 속에 있는 추가적 불순물, 예를 들어 RNase와 중합효소 등의 효소와 뉴클레오티드를 분리할 수 있다. 이 상대적 다량의 RNA를 몇 분만에 그것도 불순물 오염 정도가 매우 심한 시료로부터 얻을 수 있다. RNA 회수는 신뢰성 있게, 즉 고순도 RNA를 높은 신뢰성으로 회수한다.

본 발명 방법에서는 높은 수준의 분별을 이룰 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 추가로 자동화 운영이 용이하다. 따라서 제조용 규모의 통상적인 RNA 정제에 가장 적합하다. RNA는 본 발명의 방법에 따른 조건하에서 안정한데, 즉 HPLC 분리 도중 RNA 조각으로 파괴되어 새 불순물이 생기고 HPLC 정제 중 원하는 RNA의 수득률이 감소하는 것을 방지한다. 본 발명에 따른 방법을 따라서 간편하고 신속하고 저렴한 방식으로 정확하고 결과에 신뢰성이 있게 수행할 수 있다. HPLC 분리 후 RNA의 단리는 분획 수집기로 단순하게, 즉 RNA의 회수를 아주 간단하게 할 수 있는데, 마찬가지로 RNA의 직접 후속 처리도 가능하다. 검출은 아주 민감도 높게 이루어질 수 있다.

본 발명 방법에 따라 정제할 "RNA"는 모든 종류의 리보핵산이다. 이 RNA는 특히 tRNA, rRNA, mRNA 또는 온세포(whole-cell) RNA 중에서 선택하는 것이 바람직하다. 나아가 이 RNA는 압타머(aptamer)와 리보자임을 포함할 수 있다. 단리할 RNA는 단일 가닥이나 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 RNA는 선택적으로 재접힘(refolding)을 통하여 2차 구조를 이룰 수도 있는데, 분리할 RNA는 단일 가닥인 것이 전형적인 경우이다. 이 RNA는 무표지이거나 (형광 표지나 방사능 표지 또는 항체 항원 결정기로) 표지된 것일 수 있다. 표지된 RNA의 한 예는 디곡시제닌 표지 β-액틴 RNA이다.

분리할 RNA는 천연 또는 비천연 RNA일 수 있다. 천연 RNA를 사용하는 것이 바람직한데, 이는 예를 들어 세포나 시험관내 발현 시스템을 이용하여 마련한다. 이 RNA를 이어서 단리하고 그 단리물을 본 발명의 방법에 따라 정제한다. 선택적으로는 화학 합성한 RNA를 본 발명의 방법에 따라 정제할 수도 있다. 어느 경우이건 RNA는 비천연 뉴클레오티드도 포함하고 있을 수 있는데 여기서 RNA 골격에는 화학적 변형이 있을 수 있다. 예를 들어 포스포로티오에이트처럼 RNA 골격에 그리고 뉴클레오티드 염기의 구조에 변형이 있을 수 있는데 예를 들어 하이포크산틴, 디하이드로유라실, 슈도유라실, 2-티오유라실, 4-티오유라실, 5-아미노유라실, 5-(C1-C6)-알킬유라실, 5-(C2-C6)-알켄일유라실, 5-(C2-C6)-알킨일유라실, 5-(하이드록시메틸)유라실, 5-클로로유라실, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 5-하이드록시시토신, 5-(C1-C6)-알킬시토신, 5-(C2-C6)-알켄일시토신, 5-(C2-C6)-알킨일시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, N<2>-디메틸구아닌, 2,4-디아미노퓨린, 8-아자퓨린, 치환된 7-데아자퓨린, 바람직하게는 7-데아자-7-치환 및/또는 7-데아자-8-치환 퓨린, 5-하이드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 예를 들어 N4-에틸시토신, 5-하이드록시데옥시시티딘, 5-하이드록시메틸데옥시시티딘, N4-알킬데옥시시티딘, 예를 들어 N4-에틸데옥시시티딘, 6-티오데옥시구아노신과 니트로피롤의 데옥시리보뉴클레오티드, C5-프로핀일피리미딘과 디아미노퓨린, 예를 들어 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린 또는 당 잔기에 변형이 있을 수 있다. 변형 뉴클레오티드의 예를 더 들면 2-아미노-6-클로로퓨린-리보사이드-5'-삼인산, 2-아미노아데노신-5'-삼인산, 2-티오시티딘-5'-삼인산, 2-티오유리딘-5'-삼인산, 4-티오유리딘-5'-삼인산, 5-아미노알릴시티딘-5'-삼인산, 5-아미노알릴유리딘-5'-삼인산, 5-브로모시티딘-5'-삼인산, 5-브로모유리딘-5'-삼인산, 5-요오도시티딘-5'-삼인산, 5-요오도유리딘-5'-삼인산, 5-메틸시티딘-5'-삼인산, 5-메틸유리딘-5'-삼인산, 6-아자시티딘-5'-삼인산, 6-아자유리딘-5'-삼인산, 6-클로로퓨린-리보사이드-5'-삼인산, 7-데아자아데노신-5'-삼인산, 7-데아자구아노신-5'-삼인산, 8-아자아데노신-5'-삼인산, 8-아지도아데노신-5'-삼인산, 벤즈이미다졸-리보사이드-5'-삼인산, N1-메틸아데노신-5'-삼인산, N1-메틸구아노신-5'-삼인산, N6-메틸아데노신-5'-삼인산, O6-메틸구아노신-5'-삼인산, 슈도유리딘-5'-삼인산, 퓨로마이신-5'-삼인산, 잔토신-5'-삼인산이 있다.

본 발명 방법의 한 바람직한 실시 태양에서는 분리할 RNA의 크기가 최대 약 15000 뉴클레오티드(단일 가닥 RNA 분자일 때)나 염기쌍(이중 가닥 RNA 분자일 때)이고, 특히 100 내지 10000, 더욱 바람직하게는 500 내지 10000 뉴클레오티드나 염기쌍, 더더욱 바람직하게는 800에서 5000 뉴클레오티드나 염기쌍이다. 이 크기의 RNA에 대해서는 RNA 정제에서 매우 좋은 결과를 얻을 수 있음을 증명하였다. 그러나 선택적으로 더 작은 RNA 조각, 예를 들어 길이가 30~1000, 50~1000 또는 100~1000 또는 20~200, 20~100, 20~50 또는 20~30 뉴클레오티드인 조각도 이 방법으로 분리할 수 있다.

분리할 RNA가 mRNA이면 이 mRNA는 단백질을 암호화하는 것이 바람직한데, 특히 항원 성격이 있는 단백질이고, 예를 들어 재조합 방식으로 제조하였거나 천연적으로 존재하는 모든 단백질로서 선행 기술로부터 이 분야 당업자가 알고 있고 의료, 진단이나 연구 용도로 쓰이는 단백질이 좋다. 구체적으로 이 경우 이 항원은 종양 항원이나 병원체 항원, 예를 들어 바이러스, 세균 또는 원생 동물이다.

여기에 한정되는 것은 아니지만 이 단백질에는 그 중에서도 성장 호르몬이나 성장인자, 예를 들어 TGF와 IGF("인슐린 유사 성장인자")와 같이 살아 있는 (유전자 삽입)생물의 성장을 촉진하는 것, 대사 및/또는 조혈에 영향을 주는 단백질, 예를 들어 (알파-1)-안티트립신, LDL 수용체, 에리드로포이에틴(EPO), 인슐린, GATA-1 등, 혹은 예를 들어 혈액 응고 시스템의 인자 VIII과 인자 XI과 같은 단백질이 포함된다. 나아가서 이러한 단백질에는 효소, 예를 들어 β-갈락토시다아제(lacZ), DNA 제한 효소(예를 들어 EcoRI, HindIII 등), 리소자임 등의 효소 또는 단백질 분해 효소, 예를 들어 파파인, 브로멜라인(bromelain), 케라틴 분해효소, 트립신, 키모트립신, 펩신, 레닌(rennin)(chymosin), 수이자임(suizyme), 노르타제(nortase) 등의 단백질 분해 효소와 (예를 들어 HIV 감염 치료를 위한) 단백질 분해 효소 억제제, 예를 들어 다음 군에서 선택하는 단백질 분해 효소 억제제가 포함된다: AG1776, 암프레나비어(amprenavir)(141W94 또는 VX-478), 아타자나비어(atazanavir)(BMS-232632), 카텝신 S 단백질 분해 효소 억제제, D1927, D9120, 포스암프레나비어(fosamprenavir)(GW-433908 또는 VX-175), GS 9005, GW640385 (VX-385), HCV 단백질 분해 효소 억제제, 인다나비어(indinavir)(MK-639), L-756 423, 레보프린-ZG(Levoprin-ZG), 로피나비어(lopinavir)(ABT-378), 로피나비어/리토나비어(ritonavir)(LPV ABT-378/r), MK-944A, 모제나비어(mozenavir)(DMP450), 넬피나비어(nelfinavir)(AG-1343), NNRTI, P-1946, PL-100, 프리노마스탯(prinomastat), 리토나비어(ritonavir)(ABT-538), RO033-4649, TMC114, 사퀴나비어(saquinavir)(Ro-31-8959), NRTI, 티프라나비어(tipranavir)(PNU-140690), TLK 19781, TMC-114, 버텍스 385(vertex 385), VX-950. 본 발명에 의하여 분리한 RNA가 암호화하는 단백질에는 마찬가지로 사이토킨 등과 같이 세포 신호 전달을 자극하거나 억제하는 단백질이 포함될 수 있다. 이러한 단백질에는 따라서 예를 들어 사이토킨 단백질군의 클래스 I형 사이토킨이 포함되는데, 이들은 자리 보존된 시스테인 잔기 4개(CCCC)와 하나의 보존된 서열 모티프 Trp-Ser-X-Trp-Ser를 갖추고 있으며, 여기서 X는 보존되지 않는 아미노산이다. 이 사이토킨 단백질군의 클래스 I형 사이토킨에는 예를 들어 IL-3, IL-5, GM-CSF 등의 GM-CSF 아군(亞群), 예를 들어 IL-6, IL-11, IL-12의 IL-6 아군, 예를 들어 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 등의 IL-2 아군, 그리고 사이토킨 IL-1, IL-1, IL-10 등이 있다. 마찬가지로 이 단백질은 또한 사이토킨 단백질 클래스 II형 사이토킨을 포함할 수 있는데, 이들은 자리 보존된 시스테인 잔기 4개(CCCC)를 갖추고 있지만 보존된 서열 모티프 Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)는 지니고 있지 않다. 클래스 II형 사이토킨 EKSQORWF군의 사이토킨에는 IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마 등이 있다. 분리한 RNA가 암호화하는 단백질은 나아가 예를 들어 TNF-알파, TNF-베타, CD40 리간드, Fas 리간드 등의 종양 괴사 인자 단백질군의 사이토킨을 포함하거나, 케모킨 단백질군의 사이토킨을 포함할 수도 있는데, 특히 인터페론, 인터류킨, 콜로니 자극 인자와 종양 괴사 인자로서 G 단백질과 상호작용하는 것을 포함하며, 예를 들어 IL-8, MIP-1, RANTES, CCR5, CXR4 등이 있다. 이러한 단백질을 세포 자멸사 인자나 세포 자멸사 관련 또는 연결 단백질로부터 선택할 수도 있는데, 여기에는 AIF, Apaf, 예를 들어 Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3 또는 APO-2(L), APO-3(L), 아포파인(apopain), Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-x_L, Bcl-x_S, bik, CAD, 칼파인(calpain), 카스파제류(caspases), 예를 들어 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-10, 카스파제-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, 시토크롬 C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PK_CS, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas(Fas 리간드 CD95/fas(수용체)), FLICE/MACH, FLIP, 포드린(fodrin), fos, G-액틴, Gas-2, 겔솔린(gelsolin), 그랜자임(granzymes) A/B, ICAD, ICE, JNK, 라민 A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NF-B, NuMa, p53, PAK-2, PARP, 퍼포린(perforin), PITSLRE, PKC, pRb, 프레세닐린(presenilin), prICE, RAIDD, Ras, RIP, 스핑고미엘린 분해 효소(sphingomyelinase), 헤르페스 심플렉스 유래 티미딘 키나아제, TRADD, TRAF2, TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, 트랜스글루타민아제 등이 포함된다. 본 발명의 방법에 따라 분리한 RNA가 암호화하는 단백질은 또한 항원들 중에서 선택할 수 있는데, 예를 들어, 종양 특이적 표면 항원(TSSA), 예를 들어 5T4알파5베타1 인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, Bcr-abl, MN/C IX-항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, 베타-카테닌/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/멜란(melan)-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, PAP, 단백질 분해 효소-3, p190 소형(minor) bcr-abl, Pml/RAR, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, 서바이빈(survivin), TEL/AML1, TGF, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF와 WT1에서 선택하거나 예를 들어 NY-Eso-1이나 NY-Eso-B와 같은 서열에서 선택할 수 있다. 본 발명에 따라 분리한 RNA가 암호화할 수 있는 단백질에는 또한 전술한 단백질 중 어느 하나에 대한 서열 동일성(sequence identity)이 적어도 80% 또는 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 나타나는 단백질이 포함된다.

분리할 mRNA는 대응하는 야생형 mRNA와 비교하였을 때 다음과 같은 변형을 가질 수 있는데, 이는 서로 대안으로서 존재하거나 공존할 수 있다.

한편으로 변형 mRNA에서 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 부위의 G/C 함량은 상기 펩티드나 폴리펩티드를 암호화하는 야생형 mRNA의 암호화 부위 G/C 함량보다 더 높을 수 있는데 이 때 암호화되는 아미노산 서열에는 야생형과 변함이 없다. 이 변형은 번역할 mRNA 영역의 서열 순서가 효율적인 mRNA 번역을 위하여 절실하다는 데에 바탕을 두고 있다. 이러한 면에서 여러 가지 뉴클레오티드의 조성과 서열은 중요한 역할을 한다. 특히 G(구아노신)/C(시토신) 함량이 높은 서열은 A(아데노신)/U(우라실) 함량이 높은 서열보다 더 안정하다. 그러므로 본 발명에 따르면 번역할 아미노산 서열을 유지하면서도 야생형 mRNA의 코돈을 바꾸어 G/C 뉴클레오티드의 함량이 커지게 할 수 있다. 여러 가지 코돈이 하나의 동일한 아미노산을 암호화하므로(유전자 코드의 중복성) 안정성에 가장 유리한 코돈이 어느 것인지 정할 수 있다(대안적 코돈 사용법). 반면에 본 발명에 따라 번역에 최적화한 RNA를 제공하는 것도 가능하다.

본 발명의 방법에서는 HPLC 정제를 위한 정지상으로 역상(逆相 reversed phase)을 사용한다. 역상을 가진 크로마토그래피에서는 비극성 화합물이 정지상이 되며 극성 용매, 예를 들어 일반적으로 완충 용액 형태로 쓰이는 물이 예를 들어 아세토니트릴 및/또는 메탄올의 섞인 혼합물이 용출을 위한 이동상을 맡는다.

컬럼에 채우는 물질은 정지상으로 쓰이는데, 이를 비드 형태나 고분자화 "블록(block)", 즉 크로마토그래피 컬럼의 상당 부분을 채우는 블록으로 제공할 수 있다. 그 정확한 성질이 무엇이건 간에 이 고분자 정지상은 다공성인데, 그 의미는 비드나 블록이 특징적으로 공극(pore)을 가진다는 것이다.

본 발명 방법의 한 바람직한 실시 태양에서는 이 다공성 역상 물질의 입자 크기를 8.0 ㎛에서 50 ㎛, 특히 8.0 내지 30, 더 바람직하게는 8.0에서 25 ㎛로 하여 제공한다. 이 역상 물질은 작은 공 모양일 수 있다. 이러한 크기의 입자, 선택적으로는 비드 형태인 다공성 역상 물질로 본 발명의 방법을 수행하면 특히 유리한데, 아주 우수한 분리 결과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 쓰이는 역상은 다공성이고 특정한 입자 크기를 지닌다. 반면에 예를 들어 A. Azarani와 K. H. Hecker가 기술한 것처럼 다공성이 아니기 때문에 입자 크기 면에서 본 발명과 완전히 다른 정지 역상에서는 극도로 고압이 발생하여 제조 규모 RNA 정제가 불가능하거나 가능하더라도 매우 어렵다.

본 발명에 따른 방법의 한 바람직한 실시 태양에서는 이 역상의 공극 크기가 1000 Å 내지 5000 Å, 특히 공극 크기가 1000 Å에서 4000 Å, 더 바람직하게 1500 Å에서 4000 Å, 2000 Å에서 4000 Å 또는 2500 Å에서 4000 Å이다. 특히 바람직한 역상의 공극 크기는 1000 Å에서 2000 Å, 더 바람직하게 1000 Å에서 1500 Å, 가장 바람직하게 1000 Å에서 1200 Å 또는 3500에서 4500 Å이다. 이러한 크기의 공극을 가지는 역상이 있으면 본 발명의 방법에 따라 RNA를 정제하는데 있어서 특히 좋은 결과를 얻을 수 있는데, 구체적으로 A. Azarani와 K. H. Hecker에 따른 방법에서 발생하는 고압을 피할 수 있기 때문에 제조 규모 분리가 가능하게 특히 유리한 방식으로 이루어질 수 있다. 1000 Å보다 작은 공극 크기에서는 RNA 분자의 분리가 악화된다.

공극 크기 1000 Å에서 5000 Å, 특히 공극 크기 1000 Å에서 4000 Å, 더 바람직하게 1500 Å에서 4000 Å, 2000 Å에서 4000 Å 또는 2500 Å에서 4000 Å는 혼합물의 다른 성분들로부터 RNA를 분리하는데 적합할 것인데, 이 RNA는 전술한 바와 같이 그 크기가 최대 15000 뉴클레오티드(단일 가닥 RNA인 경우) 또는 염기쌍(이중 가닥 RNA인 경우), 특히 100에서 10000, 더 바람직하게는 500에서 10000 뉴클레오티드 또는 염기상, 더더욱 바람직하게는 800에서 5000 뉴클레오티드 또는 염기쌍, 더더욱 바람직하게는 800에서 2000 뉴클레오티드 또는 염기쌍이다. 그러나 역상의 공극 크기는 분리할 RNA의 크기에 따라 선택할 수도 있는데, 즉 더 큰 RNA를 분리할 때는 더 큰 공극을 사용하고, 더 작은 RNA를 선택할 때는 더 작은 공극을 택한다. 이는 RNA 분자의 머무름 시간과 분리는 (역)상과의 상호작용뿐 아니라 분자가 매트릭스의 공극 속으로 들어가 머무름 효과를 나타낼 수 있는 가능성에도 달려 있기 때문이다. 이하로 한정하자는 것은 아니나, 예를 들어 역상의 공극 크기가 약 2000 Å에서 약 5000 Å, 더 바람직하게는 약 2500에서 약 4000, 가장 바람직하게는 약 3500에서 약 4500 Å인 것을 사용하여 큰 RNA 분자, 예를 들어 100에서 10000, 더 바람직하게는 500에서 10000 뉴클레오티드 또는 염기쌍, 더더욱 바람직하게는 800에서 5000 뉴클레오티드 또는 염기쌍, 더더욱 바람직하게는 800에서 2000 뉴클레오티드 또는 염기쌍인 RNA 분자를 분리하는데 사용할 수 있다. 한편으로, 이하로 한정하자는 것은 아니나, 예를 들어 역상의 공극 크기가 약 1000 Å에서 약 2500 Å, 더 바람직하게는 약 1000 Å에서 약 2000 Å, 가장 바람직하게는 약 1000 Å에서 약 1200 Å인 것을 사용하여 작은 RNA 분자, 예를 들어 30~1000, 50~1000 또는 100~1000 또는 20~200, 20~100, 20~50 또는 20~30 뉴클레오티드인 RNA 분자도 분리할 수 있다.

일반적으로 다공성 형태로 제조할 수 있는 한 역상 정지상으로 쓰이는 모든 재료, 특히 모든 고분자 물질을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 이 정지상은 유기 및/또는 무기 재료로 이루어질 수 있다. 본 발명에 쓰이는 고분자의 예로는 (비알킬화) 폴리스티렌, (비알킬화) 폴리스티렌디비닐벤젠, 실리카겔, 비극성 잔기로 변형된 실리카겔, 특히 알킬 함유 잔기, 더 바람직하게는 부틸, 옥틸 및/또는 옥타데실 함유 잔기로 변형된 실리카겔, 페닐(phenylic) 잔기로 변형된 실리카겔, 폴리메트아크릴레이트 등 또는 예를 들어 겔 크로마토그래피나 덱스트란 등 기타 전술한 크로마토그래피법에 적합한 다른 재료를 들 수 있는데, 크로마토그래피법에 적합한 다른 재료에는 세파덱스(Sephadex 등록상표)와 세파크릴(Sephacryl 등록상표) 재료, 아가로스, 덱스트란/아가로스 혼합물, 폴리아크릴아미드 등이 포함된다.

특별히 바람직한 실시 태양으로서 역상을 위한 재료는 다공성 폴리스티렌 고분자, (비알킬화)(다공성) 폴리스티렌디비닐벤젠 고분자, 다공성 실리카겔, 비극성 잔기로 변형된 다공성 실리카겔, 특히 알킬 함유 잔기로 변형된 실리카겔, 더 바람직하게는 부틸-, 옥틸 및/또는 옥타데실 함유 잔기로 변형된 실리카겔, 페닐 잔기로 변형된 다공성 실리카겔, 다공성 폴리메트아크릴레이트인데, 여기서 특히 다공성 폴리스티렌 고분자나 비알킬화 (다공성) 폴리스티렌디비닐벤젠을 쓸 수 있다. 폴리스티렌디비닐벤젠을 갖춘 정지상은 그 자체로 알려져 있다. 이미 HPLC법에 쓰이고 있는, 그 자체로 알려진 폴리스티렌디비닐벤젠은 상업적으로 입수 가능하고 본 발명의 방법에 쓰일 수 있다.

비알킬화 다공성 폴리스티렌디비닐벤젠으로서 본 발명의 방법에서 매우 바람직한 것은, 여기에 한정하고자 하는 것은 아니지만, 특히 입자 크기가 8.0±1.5 ㎛, 특히 8.0±0.5 ㎛이고 공극 크기가 1000~1500 Å, 특히 1000~1200 Å 또는 3500~4500 Å인 것이다. 역상을 이 재료로 하면 전술한 본 발명 방법의 이점을 특히 유리하게 달성할 수 있다.

앞서 자세하게 설명한 정지상은 통상적으로 컬럼 속에 자리 잡는다. V2A 강철을 컬럼 재료로 쓰는 것이 일반적인데 HPLC 도중 지배적인 조건에서 적합한 한 다른 물질을 컬럼에 쓸 수도 있다. 통상적으로 이 컬럼은 직선이다. HPLC 컬럼은 길이가 5 cm에서 100 cm이고 지름이 4 mm에서 25 mm인 것이 유리하다. 본 발명의 방법에 쓰이는 컬럼은 특히 다음 크기를 지닐 수 있다: 길이 50 mm, 지름 7.5 mm이거나 길이 50 mm에 지름 4.6 mm 또는 길이 50 mm에 지름 10 mm 혹은 제조 규모 RNA회수에 적합한 다른 모든 규모의 길이와 지름을 가지는 컬럼, 심지어 몇 미터의 길이에 큰 지름을 갖춘 것도 정제 규모를 키워야 할 때는 가능하다. 컬럼의 규모는 액체 크로마토그래피에서 기술적으로 가능한 방향에 맞춰져 있다.

바람직한 한 실시 태양에서는 본 발명의 방법을 이온쌍법(ion pair method)에 따라 수행하는데, 여기서는 음으로 하전된 RNA의 반대 이온으로서 친지질성 잔기와 양전하를 가지는 이온을 이동상에 보태준다. 이렇게 하여 친지질성인 이온쌍을 얻고 이는 다시 역상 시스템의 비극성 정지상에 의하여 감속된다. 실제에서는 이온쌍법의 정확한 조건을 각 구체적인 분리에서 실험적으로 결정하여여 한다. 반대 이온의 크기, 농도와 용액의 pH 값은 분리 결과에 큰 영향을 끼친다. 이는 실험적으로 확립하는 이온쌍법의 조건을 다른 분리 문제에 그대로 적용할 수 없다는 것을 의미한다. 만일 예를 들어 한 가지 이온쌍법이 선행 기술로 알려져 있다고 하더라도 이는 같은 조건을 본 발명이 관련된 분리 문제에 틀림 없이 적용할 수 있다는 것을 의미하지는 않고, 이는 같거나 비슷한 조건이 실제 유용하다고 궁극적으로 밝혀진다고 하여도 마찬가지이다. 알킬암모늄염, 예를 들어 아세트산트리에틸암모늄 및/또는 테트라부틸암모늄 등의 테트라알킬암모늄 화합물은 본 발명의 방법에서 부가하여 주는 것이 좋다. 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄을 가하고 pH 값을 약 7로 조절하는 것이 바람직하다. 이온쌍법을 위한 이 완충 용액은 본 발명에 관련된 분리 문제, 즉 제조 규모로 RNA를 특히 유리한 방식으로 정제하는 것을 해결한다. 이하의 용액도 완충 용액으로 고려할 수 있다: 트리플루오로아세트산, 아세트산, 포름산, 아세트산 완충액, 인산 완충액, 황산수소테트라부틸암모늄, 브롬화테트라부틸암모늄과 염화테트라부틸암모늄.

이동상의 선택은 원하는 분리 형태에 따라 달라진다. 이것은 한 특정 분리에서 정한 이동상, 예를 들어 선행 기술로 알려진 이동상을 다른 분리 문제에 그대로 적용하여서는 성공 가능성이 충분하지 않다는 것을 의미한다. 각 분리 문제에서 이상적인 용출 조건, 특히 사용하는 이동상은 실험으로 검사하여 정하여야 한다.

본 발명의 HPLC법의 한 바람직한 실시 태양에서는 수성 용매와 유기 용매의 혼합물을 RNA 용출을 위한 이동상으로 쓴다. 수성 용매로는 완충 용액을 쓰는 것이 유리한데, 이 수성 용매는 특히 pH가 6.0~8.0, 예를 들어 약 7, 예를 들어 7.0이고, 바람직하게는 이 완충 용액이 아세트산트리에틸암모늄이며, 특히 바람직하게는 0.02 M 내지 0.5 M, 특히 0.08 M 내지 0.12 M, 매우 바람직하게는 약 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄 완충 용액인데, 이 용액은 전술한 것처럼 이온쌍법에서 RNA의 반대 이온을 맡기도 한다.

한 바람직한 태양에서는 이동상으로 쓰이는 유기 용매가 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 아세톤 또는 이들의 혼합물로서, 매우 바람직하게는 아세토니트릴이다. 이들 유기 용매, 특히 아세토니트릴을 사용하면 RNA의 정제가 본 발명의 방법에서 특히 유리하게 진행된다.

본 발명 방법의 특히 바람직한 실시 태양에서는 이 이동상이 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄, pH 7과 아세토니트릴의 혼합물이다.

본 발명에 따른 방법에서 이동상이 이동상 부피 기준으로 5.0 부피%에서 25.0 부피%의 유기 용매를 함유하고 수성 용매로 100 부피%까지 채우는 것이 특히 유리하다고 밝혀졌다. 전형적인 경우에 농도구배 분리를 할 때에는 이동상의 초기 상태 부피%와 비교하여 유기 용매의 비율을 증가, 특히 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 100%, 선택적으로는 적어도 200% 증가시킨다. 본 발명 방법의 한 바람직한 태양에서 이동상의 유기 용매 비율은 HPLC 분리 과정에서 3에서 9, 바람직하게는 4에서 7.5, 특히 5.0 부피%인데, 각 경우 이 값은 이동상에 대한 상대값이다. 더 바람직하게는 이동상의 유기 용매 비율을 HPLC 분리 과정에서 3에서 9, 특히 5.0 부피%로부터 최대 20.0 부피%까지 증가시키는데, 각 경우 이 값은 이동상에 대한 상대값이다. 더더욱 바람직하게는 이동상의 유기 용매 비율이 HPLC 분리 과정에서 6.5 내지 8.5, 특히 7.5 부피%로부터 최대 17.5 부피%까지 늘어나도록 이 방법을 수행하는데, 각 경우 이 값은 이동상에 대한 상대값이다.

본 발명에 따른 방법에서 이동상이 이동상 부피 기준으로 7.5 부피%에서 17.5 부피%의 유기 용매를 함유하고 수성 완충 용매로 100 부피%까지 채우는 것이 더더욱 유리하다고 밝혀졌다.

본 발명에 따른 방법에서 용리는 등용매(isocratic)로 진행하거나 농도구배 분리를 써서 진행할 수 있다. 등용매 분리에서 RNA의 용리는 단일한 용리제로 하거나 복수의 용리제의 일정한 혼합물로 할 수 있는데, 앞에서 상술한 용매를 용리제로 쓸 수 있다.

본 발명 방법의 한 바람직한 실시 태양에서는 농도구배 분리를 수행한다. 이 측면에서 용리제의 조성은 농도구배 프로그램을 이용하여 바꾸게 된다. 농도구배 분리에 필요한 이 장치는 당업자에게 잘 알려져 있다. 농도구배 용리는 저압 쪽으로 혼합 체임버에서 수행하거나 고압 쪽으로 펌프를 추가하여 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에서 바람직하게는 농도구배 분리 도중에 전술한 유기 용매의 비율을 수성 용매와 비교하여 증가시킨다. 전술한 물질을 여기서 수성 용매로 또한 전술한 물질을 유기 용매로 쓸 수 있다.

예를 들어 이동상 속의 유기 용매 비율은 HPLC 분리 과정에서 5.0 부피%에서 20.0 부피%로 늘릴 수 있는데, 각 경우에 이 값은 이동상에 대한 상대값이다. 특히 이동상 속 유기 용매의 비율을 HPLC 분리 과정에서 7.5 부피%에서 17.5 부피%, 특히 9.5에서 14.5 부피%로 증가시킬 수 있는데, 각 경우에 이 값은 이동상에 대한 상대값이다.

본 발명의 방법에 따라 RNA를 정제할 때 다음 농도구배 프로그램이 특히 유리하다고 밝혀졌다:

용리액 A: 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄, pH 7

용리액 B: 25 부피% 아세토니트릴을 포함하는 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄, pH 7

용리액 조성:

시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

58% B까지 증가(분당 B 1.67% 증가) (3~15분째)

100% B(15~20분째)

다른 농도구배 프로그램의 예를 아래 설명하는데, 같은 용리액 A와 B를 사용한다:

용리액 조성:

? 시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

? 분리 범위 I: 38%~49.5% B 농도구배(분당 B 5.75% 증가) (3~5분째)

? 분리 범위 II: 49.5%~57% B 농도구배(분당 B 0.83% 증가) (5~14분째)

? 상승 범위: 100% B(15~20분째)

컬럼을 오염시키거나 막히게 하거나 검출을 방해하지 않기 위하여 정제한 용매를 HPLC에 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 용매는 상업적으로 입수할 수 있다. 이 용매를 1에서 5 ㎛ 마이크로필터로 더 여과할 수 있는데, 마이크로필터는 펌프 전단계에 시스템에 장착되어 있다. 또한 사용 전에 모든 용매를 탈기하는 것이 바람직한데, 그렇지 않으면 대부분의 펌프에서 기포가 생긴다. 공기 방울이 용매 속에 생기면 분리의 방해는 유출액을 감지기로 연속 감시하는 기능에도 방해가 될 수 있다. 용매는 가열, 자기 교반기에 의한 힘찬 교반, 잠시 동안의 방기, 초음파 분쇄 또는 용매 저장 용기에 소량의 헬륨류를 관통시켜 탈기할 수도 있다.

용리액의 유속은 조사할 시료 속의 다른 성분들로부터 RNA를 잘 분리할 수 있도록 선택한다. 본 발명의 방법에서 선택하는 용리액의 유속은 제조 규모 증가를 하는 형태와 범위에 따라 분당 약 1 mL에서 몇 리터(제조 규모를 키우는 경우), 특히 분당 약 1에서 1000 mL, 더 바람직하게는 분당 5 mL에서 500 mL에 달하거나, 더더욱 바람직하게는 분당 100 mL를 넘을 수도 있다. 이 유속은 펌프로 확립하고 조절할 수 있다.

감지는 자외선 감지기로 254 nm에서 하는 것이 유리한데, 기준 측정은 600 nm에서 이루어질 수 있다. 그러나 앞서 상술한 RNA를 만족스럽고 신뢰성 있게 감지할 수 있는 다른 모든 감지 방법을 대안으로 사용할 수 있다.

본 발명 방법에 따라 RNA를 제조 규모로 정제하려면 RNA를 함유하는 용리된 용매를 수집하는 것을 권할만하다. 이러한 측면에서 수집은 용리된 용매를 개별 분리된 분획으로 수집하는 방식으로 수행하는 것이 유리하다. 이는 예를 들어 분획 수집기(fraction collector)로 할 수 있다. 이 방법에서는 고순도 RNA 함유 분획을 여전히 원하지 않는 불순물을 비록 적은 양으로나마 함유하고 있는 다른 RNA 함유 분획으로부터 분리한다. 이러한 개별 분획을 예를 들어 1분에 걸쳐 수집할 수 있다.

본 발명의 방법은 완전한 변성(denaturing) 조건 하에서 순조롭게 수행할 수 있다. 이는 예를 들어 시료 투입이 4~12℃의 온도에서 이루어지고 HPLC법은 더 높은 온도, 바람직하게는 70℃ 이상, 특히 바람직하게는 75℃ 이상, 특히 최대 82℃, 그리고 매우 바람직하게는 약 78℃에서 이루어지는 방식으로 진행할 수 있다. 전형적인 경우에 가열은 RNA의 변성에 중요한데, 변성으로 결국 더 나은 분리를 얻을 수 있다. 낮은 온도에서 분해능이 떨어지는데, 즉 불순물로부터 RNA의 분리가 나빠진다.

시료 투입은 흐름 정지식 주입(stop-flow injection)과 고리 주입(loop injection)의 두 가지 방식으로 이루어질 수 있다. 흐름 정지식 주입은 HPLC에서 가해지는 고압을 견딜 수 있는 미세주사기를 사용한다. 시료는 주입 밸브의 격막(septum)을 통하여 채운 컬럼 속으로 직접 또는 상기 채운 컬럼 물질 바로 위의 비활성 물질의 작은 방울 속으로 주입된다. 이 때 시스템은 가압하에 있거나, 주입 전에 펌프를 꺼고 압력이 정상값 근처까지 떨어졌을 때 주입할 수도 있다. 고리 주입의 경우에는 고리 주입기(loop injector)를 이용하여 시료를 도입한다. 고리 주입기는 튜브로 된 고리로 이루어지는데, 여기에 시료를 삽입한다. 적당한 로타리 밸브를 써서 정지상을 이 고리를 통하여 펌프로부터 운반해 내는데, 이 고리의 출구는 컬럼으로 직접 이어진다. 이렇게 하여 펌프로 향하는 용매의 흐름을 멈추지 않고 시료를 정지상을 통하여 컬럼으로 운반하게 된다.

본 발명은 나아가 전술한 HPLC 방법에서 본 발명에 따른 다공성 역상의 용도를 제공한다.

본 발명 방법의 한 바람직한 실시 태양에서는 다공성 역상의 입자 크기가 8.0 ㎛에서 50 ㎛, 특히 8.0에서 30, 더욱 바람직하게는 8.0에서 25 ㎛이다. 이 역상은 비드 형태로 있을 수 있다. 본 발명을 이 입자 크기 및/또는 비드 형태로 하여 다공상 역상과 함께 수행하면 특히 유리한데, 매우 좋은 분리 결과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 용도로 사용하는 역상은 다공성인데, 이는 예를 들어 A. Azarani와 K. H. Hecker가 기술한 것처럼 다공성이 아닌 정지 역상은 입자 크기 면에서 본 발명과 완전히 다르고 극도로 고압이 발생하여 제조 규모 RNA 정제가 불가능하거나 가능하더라도 매우 어렵다.

본 발명에 따른 용도의 한 바람직한 실시 태양에서는 이 역상의 공극 크기가 1000Å에서 5000 Å, 특히 공극 크기가 1000 Å에서 4000 Å, 또는 전술한 바람직한 값이다. 역상의 특히 바람직한 공극 크기는 1000~1200 Å와 3500~4500 Å이다. 이러한 크기의 공극을 가지는 역상이 있으면 본 발명의 방법에 따라 RNA를 정제하는데 있어서 특히 좋은 결과를 얻을 수 있는데, 구체적으로 A. Azarani와 K. H. Hecker에 따른 방법에서 발생하는 고압을 피할 수 있기 때문에 제조 규모 분리가 가능하게 특히 유리한 방식으로 이루어질 수 있다. 1000 Å보다 작은 공극 크기에서는 RNA 분자의 분리가 악화되기 때문에 이 정도 크기의 입자는 덜 바람직하다. 그러나 이 공극 크기는 전술한 것처럼 분리할 RNA 크기에 따라 선택할 수 있다.

본 발명 용도의 특별히 바람직한 실시 태양에서는 역상을 위한 재료가 폴리스티렌디비닐벤젠 고분자인데, 여기서 특히 비알킬화 폴리스티렌디비닐벤젠을 쓸 수 있다. 폴리스티렌디비닐벤젠을 갖춘 정지상은 그 자체로 알려져 있다. 이미 HPLC법에 쓰이고 있는, 그 자체로 알려진 폴리스티렌디비닐벤젠은 상업적으로 입수 가능하고 본 발명의 방법에 따라서 쓰일 수 있다.

비알킬화 다공성 폴리스티렌디비닐벤젠으로서 본 발명에 따른 용도에서 매우 바람직한 것은, 구체적으로 입자 크기가 8.0±1.5 ㎛, 특히 8.0±0.5 ㎛이고 공극 크기가 1000- 또는 4000 Å인 것이다. 역상을 이 재료로 하면 후술하는 이점들을 특히 유리하게 달성할 수 있다.

본 발명에서 앞서 상술한 정지상은 통상적으로 컬럼 속에 자리 잡는다. V2A 강철을 컬럼 재료로 쓰는 것이 일반적인데 HPLC 회수 도중 지배적인 조건에서 적합한 한 다른 물질을 컬럼에 쓸 수도 있다. 통상적으로 이 컬럼은 직선이다. HPLC 컬럼은 길이가 5 cm에서 100 cm이고 지름이 4 mm에서 25 mm인 것이 유리하다. 본 발명의 방법에 쓰이는 컬럼은 특히 다음 크기를 지닐 수 있다: 길이 50 mm, 지름 7.5 mm이거나 길이 50 mm에 지름 4.6 mm 또는 길이 50 mm에 지름 10 mm 혹은 제조 규모 RNA 회수에 적합한 다른 모든 규모의 길이와 지름을 가지는 컬럼, 심지어 몇 미터의 길이에 큰 지름을 갖춘 것도 정제 규모를 키워야 할 때는 가능하다. 컬럼의 규모는 액체 크로마토그래피에서 기술적으로 가능한 방향에 맞춰져 있다.

본 발명에 따른 용도를 위한 추가적인 조건은 이미 본 발명에 따른 방법과 관련하여 설명하였기 때문에 상기 방법 부분을 언급하여 불필요한 반복을 피한다.

본 발명에 따른 용도, 특히 여기서 후술하는 바람직한 실시 태양들은 일련의 장점을 보여준다: 본 발명에 따른 용도로 사용하면 종래 기술에서 알려진 방법으로 가능한 양보다 상당히 더 많은 양의 RNA를 분리할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하면 이러한 상대적으로 많은 양을 높은 순도로 얻을 수 있다. 파괴된 조각이나 과도하게 긴 조각 또는 때 이른 전사 종료 때문에 생긴 조각을 분리하는 것도 가능하다. 게다가 RNA 시료 속에 있는 추가적 불순물, 예를 들어 RNase와 중합효소 등의 효소와 뉴클레오티드를 분리할 수 있다. 이 상대적 다량의 RNA를 몇 분만에 그것도 불순물 오염 정도가 매우 심한 시료로부터 얻을 수 있다. RNA 회수는 신뢰성 있게, 즉 고순도 RNA를 높은 신뢰성으로 회수한다. 본 발명에 따른 용도에 의하여 높은 수준의 분별을 이룰 수 있다. 본 발명에 따른 용도는 자동화 운영이 용이하다. 따라서 제조용 규모의 통상적인 RNA 정제에 가장 적합하다. RNA는 이 HPLC법에 따른 조건하에서 안정한데, 즉 HPLC 분리 도중 RNA 조각으로 파괴되어 새 불순물이 생기고 HPLC 정제 중 정제된 RNA의 수득률이 감소하는 것을 방지한다. 본 발명에 따른 용도를 따라서 간편하고 신속하고 저렴한 방식으로 정확하고 결과에 신뢰성이 있게 수행할 수 있다. HPLC 분리 후 RNA의 단리는 분획 수집기로 단순하게, 즉 RNA의 회수를 아주 간단하게 할 수 있는데, 마찬가지로 RNA의 직접 후속 처리도 가능하다. 검출은 아주 민감도 높게 이루어질 수 있다.

본 발명에 대한 도면과 예시 실시 태양을 들어 더 자세히 설명하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 루시퍼라제(luciferase) mRNA(분석용) 10 ㎍의 분리에 대한 크로마토그램을 보여준다.

도 2는 루시퍼라제 mRNA(제조용) 1.5 ㎍의 분리에 대한 크로마토그램을 보여준다.

도 3은 도 2의 크로마토그램을 나타내는데, 수집한 분획을 회색으로 강조하고 있다.

도 4는 수집한 mRNA 분획의 순도를 아가로스 겔로 증명한 것을 보여준다.

도 5는 공극 크기가 1000 Å인 정지상으로 2 kb와 4 kb의 RNA 조각을 200 ㎍ 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 6은 공극 크기가 4000 Å인 정지상으로 2 kb와 4 kb의 RNA 조각을 100 ㎍ 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 7은 공극 크기가 4000 Å인 정지상으로 2 kb와 4 kb의 RNA 조각을 250 ㎍ 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 8은 본 발명의 방법에 따라 정제한 RNA에서 나온 루시퍼라제의 발현 향상도를 나타내는 막대 그래프이다.

도 9는 야생형 루시퍼라제 서열, 구체적으로 mRNA 서열을 보여 주는데, 이는 실시예에 사용된 것이다.

도 10은 공극 크기가 4000 Å인 정지 매트릭스로 Flic(GC) RNA 조제(FC-9050)를 위하여 3 mg을 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 11은 공극 크기가 4000 Å인 정지 매트릭스로 FOLH1(GC) RNA 조제(FO-9334)를 위하여 1.5 mg을 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 12는 공극 크기가 4000 Å인 정지 매트릭스로 KLK3(GC) RNA 조제(KL-8849)를 위하여 1.5 mg을 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 13은 공극 크기가 4000 Å인 정지 매트릭스로 PSCA(GC) RNA 조제(PC-8845)를 위하여 1.5 mg을 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 14는 공극 크기가 4000 Å인 정지 매트릭스로 STEAP(GC) RNA 조제(ST-8848)를 위하여 1.5 mg을 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 15는 비다공성 정지 매트릭스로 2 kb RNA(200 ㎍)와 4 kb RNA(200 ㎍)의 혼합물을 분리한 크로마토그램을 보여준다.

도 16은 도 15에 따른 크로마토그램과 상응하는 아가로스 겔 분석 결과를 보여 주는데, 2 kb RNA(200 ㎍)과 4 kb RNA의 혼합물을 비다공성 정지 매트릭스로 분리한 것을 보여준다.

실시예 1: 본 발명의 HPLC 방법을 이용한 루시퍼라제 mRNA 1.5 mg 의 정제

1825 염기쌍 크기의 루시퍼라제(luciferase) mRNA를 분리에 사용하였다. 다공성인 비알킬화 폴리스티렌/디비닐벤젠(폴리스티렌디비닐벤젠) 매트릭스(Polymer Laboratories사의 통상적인 상업 제품)를 정지상으로 사용하였다. 이 매트릭스는 입자 크기가 8 ㎛이고 공극 크기가 4000 Å였다. 쓰인 컬럼은 길이가 5.0 cm였고 지름이 7.5 mm였다. 시료 주입 장치(sampler)의 온도는 12℃였고 HPLC 분리의 온 도, 특히 분리용 컬럼의 온도는 78℃였는데, 즉 분리 조작을 완전한 변성 조건 하에서 수행하였다.

분리는 다음 농도구배 프로그램을 통하여 이루어졌다:

용리액 A: 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄, pH 7

용리액 조성:

시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

58% B까지 증가(분당 B 1.67% 증가) (3~15분째)

100% B(15~20분째)

감지는 자외선 감지기로 254 nm에서 이루어졌고, 비교 기준 측정은 600 nm였다. 유속은 분당 3 mL였다.

루시퍼라제 mRNA 속의 불순물을 보여 주기 위하여 먼저 분석용 분리(analytical separation)을 하였는데, 이 루시퍼라제 mRNA 중 10 ㎍만을 컬럼에 가하였다. 이 분석용 HPLC 분리의 결과를 도 1에 나타내었다(농도구배는 이 크로마토그램에서 파선으로 나타내었다). 도 1로부터 명백하듯이 원하는 루시퍼라제 mRNA(머무름 시간 12.760분) 외에도 불순물이 여전히 있는데, 이 불순물 피크는 루시퍼라제 피크 양쪽(머무름 시간 12.398분과 13.227분)에 나타난다.

이 루시퍼라제 mRNA를 제조 규모로 정제하는 목적은 이 원하지 않는 불순물을 제거하기 위함이다.

도 2와 3은 루시퍼라제 mRNA를 제조용 규모(1.5 mg)로 분리하는데 있어서 해당 크로마토그램을 나타내는데, 농도구배 프로그램은 도 2에서 파선으로 나타내었다. 수집한 분획 1에서 10은 도 2와 3에서 회색으로 강조하였는데, 이 분획은 1분에 걸쳐 수집하였다.

mRNA 분획의 순도를 측정하기 위하여 각각의 경우에 수집한 분획 2에서 10으로부터 1 ㎍씩 루시퍼라제 mRNA를 아가로스 겔에 가하고 브롬화에티듐을 이용하여 가시화하였다.

아가로스 겔의 분리 결과는 도 4에 나타내었다(M은 크기 표준 물질을 가리킨다). 분획 5에서 8은 원하지 않는 불순물 없이 원하는 루리퍼라제 mRNA만을 함유한다. 결과를 놓고 볼 때 RNA의 분리는 성공적이어서 제조 규모의 고순도 RNA 분획으로 이어졌다.

본 실시예는 본 발명의 방법을 이용하면 HPLC를 써서 제조 규모로 RNA를 정제할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 2: 공극 크기가 1000 Å 인 정지상을 이용한 2 kb 와 4 kb RNA 조각 200 ㎍ 의 분리

2 kb와 4 kb RNA 조각 200 ㎍을 분리에 사용하였다. 다공성인 비알킬화 폴리스티렌/디비닐벤젠 매트릭스(Polymer Laboratories사의 통상적인 상업 제품)를 정지상으로 사용하였다. 이 매트릭스는 입자 크기가 8 ㎛이고 공극 크기가 1000 Å였다. 쓰인 컬럼은 길이가 2.5 cm였고 지름이 4.6 mm였다. 시료 주입 장치(sampler)의 온도는 12℃였고 HPLC 분리의 온도, 특히 분리용 컬럼의 온도는 78 ℃였는데, 즉 분리 조작을 완전한 변성 조건 하에서 수행하였다.

분리는 다음 농도구배 프로그램을 통하여 이루어졌다:

용리액 A: 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄

용리액 B: 25 부피% 아세토니트릴을 포함하는 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄

용리액 조성:

? 시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

? 분리 범위 I: 38%~49.5% B 농도구배(분당 B 5.75% 증가) (3~5분째)

? 상승 범위: 100% B(15~20분째)

도 5는 이 제조 규모(200 ㎍)의 분리에서 해당 크로마토그램을 나타내는데, 그 농도구배 프로그램은 도 5에서 파선으로 나타내었다. 수집한 분획들은 도 5에서 회색으로 강조하였는데, 이 분획은 1분에 걸쳐 수집하였다. 결과를 놓고 볼 때 RNA의 분리는 성공적이어서 제조 규모의 고순도 RNA 분획으로 이어졌다.

실시예 3: 공극 크기가 4000 Å 인 정지상을 이용한 2 kb 와 4 kb RNA 조각 100 ㎍ 의 분리

2 kb와 4 kb RNA 조각 100 ㎍을 분리에 사용하였다. 다공성인 비알킬화 폴리스티렌/디비닐벤젠 매트릭스(Polymer Laboratories사의 통상적인 상업 제품)를 정지상으로 사용하였다. 이 매트릭스는 입자 크기가 8 ㎛이고 공극 크기가 4000 Å였다. 쓰인 컬럼은 길이가 2.5 cm였고 지름이 4.6 mm였다. 시료 주입 장치(sampler)의 온도는 12℃였고 HPLC 분리의 온도, 특히 분리용 컬럼의 온도는 78℃였는데, 즉 분리 조작을 완전한 변성 조건 하에서 수행하였다.

분리는 다음 농도구배 프로그램을 통하여 이루어졌다:

용리액 A: 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄

용리액 조성:

? 시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

? 분리 범위 I: 38%~49.5% B 농도구배(분당 B 5.75% 증가) (3~5분째)

? 상승 범위: 100% B(15~20분째)

도 6은 이 제조 규모(100 ㎍)의 분리에서 해당 크로마토그램을 나타내는데, 그 농도구배 프로그램은 도 6에서 파선으로 나타내었다. 수집한 분획들은 도 6에서 회색으로 강조하였는데, 이 분획은 1분에 걸쳐 수집하였다. 결과를 놓고 볼 때 RNA의 분리는 성공적이어서 제조 규모의 고순도 RNA 분획으로 이어졌다.

실시예 4: 공극 크기가 4000 Å 인 정지상을 이용한 2 kb 와 4 kb RNA 조각 250 ㎍ 의 분리

2 kb와 4 kb RNA 조각 250 ㎍을 분리에 사용하였다. 다공성인 비알킬화 폴 리스티렌/디비닐벤젠 매트릭스(Polymer Laboratories사의 통상적인 상업 제품)를 정지상으로 사용하였다. 이 매트릭스는 입자 크기가 8 ㎛이고 공극 크기가 4000 Å였다. 쓰인 컬럼은 길이가 2.5 cm였고 지름이 4.6 mm였다. 시료 주입 장치(sampler)의 온도는 12℃였고 HPLC 분리의 온도, 특히 분리용 컬럼의 온도는 78℃였는데, 즉 분리 조작을 완전한 변성 조건 하에서 수행하였다.

분리는 다음 농도구배 프로그램을 통하여 이루어졌다:

용리액 A: 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄

용리액 조성:

? 시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

? 분리 범위 I: 38%~49.5% B 농도구배(분당 B 5.75% 증가) (3~5분째)

? 상승 범위: 100% B(15~20분째)

도 7은 이 제조 규모(250 ㎍)의 분리에서 해당 크로마토그램을 나타내는데, 그 농도구배 프로그램은 도 7에서 파선으로 나타내었다. 수집한 분획들은 도 7에서 회색으로 강조하였는데, 이 분획은 1분에 걸쳐 수집하였다. 결과를 놓고 볼 때 RNA의 분리는 성공적이어서 제조 규모의 고순도 RNA 분획으로 이어졌다.

본 발명에 따른 방법으로 정제하는 데에서 비롯한 루시퍼라제 발현 향상은 도 8에 나타내었다.

실시예 5: 공극 크기가 4000 Å 인 정지상을 이용한 1.7 kb RNA( FliC ( GC ) 조제, FC9050 ) 3 mg 의 분리

1.7 kb RNA(FliC(GC) 조제, FC9050)을 분리에 사용하였다. 다공성인 비알킬화 폴리스티렌/디비닐벤젠 매트릭스(Polymer Laboratories사의 통상적인 상업 제품)를 정지상으로 사용하였다. 이 매트릭스는 입자 크기가 8 ㎛이고 공극 크기가 4000 Å였다. 쓰인 컬럼은 길이가 2.5 cm였고 지름이 4.6 mm였다. 시료 주입 장치(sampler)의 온도는 12℃였고 HPLC 분리의 온도, 특히 분리용 컬럼의 온도는 78℃였는데, 즉 분리 조작을 완전한 변성 조건 하에서 수행하였다.

분리는 다음 농도구배 프로그램을 통하여 이루어졌다:

용리액 A: 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄

용리액 조성:

? 시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

? 분리 범위 I: 38%~49.5% B 농도구배(분당 B 5.75% 증가) (3~5분째)

? 상승 범위: 100% B(15~20분째)

도 10은 이 제조 규모(3 mg)의 분리에서 해당 크로마토그램을 나타내는데, 그 농도구배 프로그램은 도 10에서 파선으로 나타내었다. 수집한 분획들은 도 10에서 회색으로 강조하였다. 결과에서 볼 수 있듯이 RNA의 분리는 성공적이어서 제조 규모의 고순도 RNA 분획으로 이어졌다.

실시예 6: 공극 크기가 4000 Å 인 정지상을 이용한 1.5 mg 의 FOLH1 ( GC ) RNA 조제( FO -9334), 1.5 mg 의 KLK3 ( GC ) RNA 조제( KL -8849), 1.5 mg 의 PSCA ( GC ) RNA 의 조제( PS -8845) 또는 1.5 mg 의 STEAP ( GC ) RNA 의 조제( ST -8848)

1.5 mg의 FOLH1(GC) RNA 조제분(FO-9334), 1.5 mg의 KLK3(GC) RNA 조제분(KL-8849), 1.5 mg의 PSCA(GC) RNA의 조제분(PS-8845) 또는 1.5 mg의 STEAP(GC) RNA의 조제분(ST-8848)을 분리에 사용하였다. 다공성인 비알킬화 폴리스티렌/디비닐벤젠 매트릭스(Polymer Laboratories사의 통상적인 상업 제품)를 정지상으로 사용하였다. 이 매트릭스는 입자 크기가 8 ㎛이고 공극 크기가 4000 Å였다. 쓰인 컬럼은 길이가 2.5 cm였고 지름이 4.6 mm였다. 시료 주입 장치(sampler)의 온도는 12℃였고 HPLC 분리의 온도, 특히 분리용 컬럼의 온도는 78℃였는데, 즉 분리 조작을 완전한 변성 조건 하에서 수행하였다.

분리는 다음 농도구배 프로그램을 통하여 이루어졌다:

용리액 A: 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄

용리액 조성:

? 시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

? 분리 범위 I: 38%~49.5% B 농도구배(분당 B 5.75% 증가) (3~5분째)

? 상승 범위: 100% B(15~20분째)

도 11, 12, 13과 14는 각각 제조 규모(1.5 mg)인 1.5 mg의 FOLH1(GC) RNA 조제분(FO-9334), 1.5 mg의 KLK3(GC) RNA 조제분(KL-8849), 1.5 mg의 PSCA(GC) RNA의 조제분(PS-8845) 또는 1.5 mg의 STEAP(GC) RNA의 조제분(ST-8848)의 분리에서 해당 크로마토그램을 나타내는데, 그 농도구배 프로그램은 이들 그림에서 파선으로 나타내었다. 수집한 분획들은 도 11, 12, 13과 14에서 회색으로 강조하였다. 각 실험 결과에서 볼 수 있듯이 RNA의 분리는 성공적이어서 각 경우에 제조 규모의 고순도 RNA 분획으로 이어졌다.

실시예 7: 비다공성 폴리스티렌디비닐벤젠 정지 매트릭스를 이용한 2 kb RNA 200 ㎍ 과 4 kb RNA 200 ㎍ 혼합물의 분리( 비교예 )

2 kb RNA 200 ㎍과 4 kb RNA 200 ㎍의 혼합물을 분리에 사용하였다. 사용한 컬럼은 1000 Å 다공성 비알킬화 폴리스티렌디비닐벤젠 또는 비다공성 정지 폴리스티렌디비닐벤젠 매트릭스로 채웠다. 상기 1000 Å 다공성 비알킬화 폴리스티렌디비닐벤젠에 쓰인 컬럼은 길이가 2.5 cm였고 지름이 4.6 mm였다. 상기 비다공성 비알킬화 폴리스티렌디비닐벤젠에 쓰인 컬럼은 길이가 2.5 cm였고 지름이 4.0 mm였다. 시료 주입 장치(sampler)의 온도는 12℃였고 HPLC 분리의 온도, 특히 분리용 컬럼의 온도는 78℃였는데, 즉 분리 조작을 완전한 변성 조건 하에서 수행하였다.

분리는 다음 농도구배 프로그램을 통하여 이루어졌다:

용리액 A: 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄

용리액 조성:

? 시작: 62% A와 38% B(첫 1~3분)

? 분리 범위 I: 38%~49.5% B 농도구배(분당 B 5.75% 증가) (3~5분째)

? 상승 범위: 100% B(15~20분째)

도 15는 이 제조 규모(200 ㎍)의 분리에서 해당 크로마토그램을 나타내는데, 그 농도구배 프로그램은 도 15에서 파선으로 나타내었다. 수집한 분획들은 도 15에서 회색으로 강조하였다. 결과에서 볼 수 있듯이 통상적인 다공성 비알킬화 폴리스티렌디비닐벤젠을 매트릭스로 사용하면 양쪽 RNA를 모두 분리하는 것은 가능하지 않다. 도 16은 도 15에 따른 크로마토그램과 상응하는 아가로스 겔 분석 결과를 보여준다.

<110> CureVac GmbH <120> Method for purifying RNA on a preparative scale by means of HPLC <130> IMP091335DE <150> DE 102006061015.6 <151> 2006-12-22 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1825 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luciferase wild type, CAP-Ppluc(wt)-muag-A70 from Figure 9 <400> 1 gggagaaagc uuggcauucc gguacuguug guaaagccac cauggaagac gccaaaaaca 60 uaaagaaagg cccggcgcca uucuauccgc uggaagaugg aaccgcugga gagcaacugc 120 auaaggcuau gaagagauac gcccugguuc cuggaacaau ugcuuuuaca gaugcacaua 180 ucgaggugga caucacuuac gcugaguacu ucgaaauguc cguucgguug gcagaagcua 240 ugaaacgaua ugggcugaau acaaaucaca gaaucgucgu augcagugaa aacucucuuc 300 aauucuuuau gccgguguug ggcgcguuau uuaucggagu ugcaguugcg cccgcgaacg 360 acauuuauaa ugaacgugaa uugcucaaca guaugggcau uucgcagccu accguggugu 420 ucguuuccaa aaagggguug caaaaaauuu ugaacgugca aaaaaagcuc ccaaucaucc 480 aaaaaauuau uaucauggau ucuaaaacgg auuaccaggg auuucagucg auguacacgu 540 ucgucacauc ucaucuaccu cccgguuuua augaauacga uuuugugcca gaguccuucg 600 auagggacaa gacaauugca cugaucauga acuccucugg aucuacuggu cugccuaaag 660 gugucgcucu gccucauaga acugccugcg ugagauucuc gcaugccaga gauccuauuu 720 uuggcaauca aaucauuccg gauacugcga uuuuaagugu uguuccauuc caucacgguu 780 uuggaauguu uacuacacuc ggauauuuga uauguggauu ucgagucguc uuaauguaua 840 gauuugaaga agagcuguuu cugaggagcc uucaggauua caagauucaa agugcgcugc 900 uggugccaac ccuauucucc uucuucgcca aaagcacucu gauugacaaa uacgauuuau 960 cuaauuuaca cgaaauugcu ucugguggcg cuccccucuc uaaggaaguc ggggaagcgg 1020 uugccaagag guuccaucug ccagguauca ggcaaggaua ugggcucacu gagacuacau 1080 cagcuauucu gauuacaccc gagggggaug auaaaccggg cgcggucggu aaaguuguuc 1140 cauuuuuuga agcgaagguu guggaucugg auaccgggaa aacgcugggc guuaaucaaa 1200 gaggcgaacu gugugugaga gguccuauga uuauguccgg uuauguaaac aauccggaag 1260 cgaccaacgc cuugauugac aaggauggau ggcuacauuc uggagacaua gcuuacuggg 1320 acgaagacga acacuucuuc aucguugacc gccugaaguc ucugauuaag uacaaaggcu 1380 aucagguggc ucccgcugaa uuggaaucca ucuugcucca acaccccaac aucuucgacg 1440 caggugucgc aggucuuccc gacgaugacg ccggugaacu ucccgccgcc guuguuguuu 1500 uggagcacgg aaagacgaug acggaaaaag agaucgugga uuacgucgcc agucaaguaa 1560 caaccgcgaa aaaguugcgc ggaggaguug uguuugugga cgaaguaccg aaaggucuua 1620 ccggaaaacu cgacgcaaga aaaaucagag agauccucau aaaggccaag aagggcggaa 1680 agaucgccgu guaauucuag uuauaagacu gacuagcccg augggccucc caacgggccc 1740 uccuccccuc cuugcaccga gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1825

Claims

RNA 정제 방법에 있어서,

다공성 역상(porous reversed phase)을 정지상(stationary phase)으로 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 저압이나 정상압 액체 크로마토그래피로 RNA를 정제하며,

상기 다공성 역상은 다공성 비알킬화 폴리스티렌 또는 다공성 비알킬화 폴리스티렌디비닐벤젠인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모(preparative scale) 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 RNA는 tRNA, rRNA, mRNA, 온세포(whole-cell) RNA 또는 RNA 변이체이며, 상기 RNA 변이체는 압타머(aptamer) 또는 리보자임 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 RNA는 그 크기가 최대 15000 뉴클레오티드 또는 염기쌍인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 RNA는 그 크기가 100에서 10000 뉴클레오티드 또는 염기쌍인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 다공성 역상은 그 입자 크기가 8 ㎛에서 50 ㎛인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 다공성 역상은 그 공극(pore) 크기가 1000 Å에서 5000 Å인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 다공성 역상은 그 공극 크기가 1000 Å에서 4000 Å인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
삭제
제1항에 있어서,

상기 다공성 역상은 비드들로 이루어지거나 고분자 블록(polymerized block) 형태로 나타나는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

HPLC의 컬럼은 그 길이가 5 cm를 넘어 최대 100 cm까지이고, 지름이 4 mm를 넘어 100 cm까지인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 HPLC 정제는 음으로 하전된 RNA의 반대 이온으로 이동상에 양전하를 띤 이온을 부가하는 이온쌍법으로 수행하거나, 크기별 배제 크로마토그래피, 겔 여과, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 이온쌍 크로마토그래피에 의하여 수행하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

HPLC 정제에서 용리(elution)를 위하여 수성 용매와 유기 용매의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제12항에 있어서,

상기 수성 용매는 완충 용액인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제13항에 있어서,

상기 완충 용액은 아세트산트리에틸암모늄, 트리플루오로아세트산, 아세트산, 포름산, 아세트산 완충액, 인산 완충액, 황산수소테트라부틸암모늄, 브롬화테트라부틸암모늄 또는 염화테트라부틸암모늄인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제14항에 있어서,

상기 아세트산트리에틸암모늄 완충 용액은 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄 완충 용액인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제12항에 있어서,

상기 유기 용매는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 아세톤 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제16항에 있어서,

상기 유기 용매는 아세토니트릴인 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제12항에 있어서,

이동상이 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄과 아세토니트릴의 혼합물인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제12항에 있어서,

이동상에 대해서 5.0 부피%에서 25.0 부피%의 유기 용매를 이동상이 함유하고, 상기 수성 용매로 100 부피%까지 보충하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제19항에 있어서,

이동상에 대해서 7.5 부피%에서 17.5 부피%의 유기 용매를 상기 이동상이 함유하고, 상기 수성 용매로 100 부피%까지 보충하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제12항에 있어서,

상기 용리는 등용매(isocratic) 분리인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

농도구배 분리를 수행하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제22항에 있어서,

농도구배 분리시의 유기 용매 비율은 이동상의 초기 부피 %값과 비교하였을 때 적어도 10% 증가하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제23항에 있어서,

상기 이동상의 유기 용매 비율은 HPLC 분리 과정에서 3에서 9 부피%에 해당하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제23항에 있어서,

상기 이동상의 유기 용매 비율을 HPLC 분리 과정에서 각각의 경우에 이동상에 대해서 3에서 9 부피%까지 늘리는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제25항에 있어서,

상기 이동상의 유기 용매 비율을 HPLC 분리 과정에서 각각의 경우에 이동상에 대해서 6.5에서 8.5 부피%까지 늘리는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 다공성 역상은 그 입자 크기가 8 ㎛에서 30 ㎛인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제1항에 있어서,

상기 다공성 역상은 그 입자 크기가 8 ㎛에서 25 ㎛인 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제22항에 있어서,

농도구배 분리시의 유기 용매 비율은 이동상의 초기 부피 %값과 비교하였을 때 적어도 50% 증가하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제22항에 있어서,

농도구배 분리시의 유기 용매 비율은 이동상의 초기 부피 %값과 비교하였을 때 적어도 100% 증가하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제22항에 있어서,

농도구배 분리시의 유기 용매 비율은 이동상의 초기 부피 %값과 비교하였을 때 적어도 200% 증가하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제23항에 있어서,

상기 이동상의 유기 용매 비율은 HPLC 분리 과정에서 4에서 7.5 부피%에 해당하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제23항에 있어서,

상기 이동상의 유기 용매 비율은 HPLC 분리 과정에서 5.0 부피%에 해당하는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제23항에 있어서,

상기 이동상의 유기 용매 비율을 HPLC 분리 과정에서 각각의 경우에 이동상에 대해서 5.0 부피%로부터 최대 20.0 부피%까지 늘리는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
제25항에 있어서,

상기 이동상의 유기 용매 비율을 HPLC 분리 과정에서 각각의 경우에 이동상에 대해서 7.5 부피%로부터 최대 17.5 부피%까지 늘리는 것을 특징으로 하는 RNA의 제조 규모 정제 방법.
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