JP2023504264A - 合成ガイドｒｎａ、組成物、方法、およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、とりわけ、自己テンプレート化アプローチを使用して合成ＲＮＡを産生する方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、第１のＲＮＡを第２のＲＮＡと接触させ、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡが、相補的である少なくとも５個のＲＮＡヌクレオチドを含み、接触させることが、ステム構造またはステムループ構造を形成することと、ライゲーション酵素で、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡを（ｉ）ステム構造内でライゲーションするか、または（ｉｉ）ステム構造の末端でライゲーションし、それによってステム構造の末端でループを形成することと、を含んで、合成ｇＲＮＡが産生される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月３日に出願されたＵＳ６２／９４３，１５８および２０２０年５月２８日に出願されたＵＳ６３／０３１，２６２の利益および優先権を主張し、これらの各々の内容は本明細書に援用される。

Ｃａｓエンドヌクレアーゼに付随するガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、および塩基エディターを含む関連する酵素は、遺伝子編集における用途に使用される。治療用途に使用されるｇＲＮＡの一般的な形態は、Ｃａｓ９とリボ核タンパク質を形成する、約１００個のヌクレオチドの単一の非天然ＲＮＡである。プラスミドＤＮＡおよびホスホロアミダイト化学を使用する固相合成は、治療用ｓｇＲＮＡを得るための典型的なアプローチである。合成ＲＮＡの使用は、ｓｇＲＮＡの化学的安定性を増加させること、および望ましくない位置でのゲノムＤＮＡの編集（オフターゲット）を低減させることができる修飾の組込みを可能にするため、有利である。

ｇＲＮＡの製造には、以下の問題が残っている。例えば、ｉ）ｓｇＲＮＡ分子の長さ、典型的には１００個のヌクレオチドの長さが、ホスホロアミダイト化学の限界を超える。ホスホロアミダイト化学は、ＲＮＡについては約０．９８５Ｘ（Ｘは、ヌクレオチドの数である）のカップリング効率を有する。例えば、１００ｎｔ長のｇＲＮＡの合成は、単離前に約２０％の全長産物を得る。これらの長さは、現在市販されているオリゴヌクレオチドベースの治療薬で使用されているものよりも顕著に大きい（ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、典型的には、長さが２０～５０ヌクレオチドであり、したがって、精製により適している）。ｉｉ）不完全なカップリング（トランケーション産物）、不完全な脱保護、およびヌクレオチドの無作為な挿入（付加産物）から形成された副産物の完全な除去は、現在、標準的な精製方法（例えば、クロマトグラフィー、電気泳動）によってこれらの長さのスケールでのＲＮＡに対しては達成することはできない。ｉｉｉ）全長産物と同様の配列相同性を有する、全長産物とともに単離された副産物は、リボヌクレオタンパク質複合体の活性を低減させ、オフターゲット編集をもたらす可能性がある。

合成ＲＮＡの純度、完全性、および最終的な（精製後の）収率を制限する課題を克服する、化学的および／または酵素的戦略を使用してｇＲＮＡを合成するプロセスが本明細書に記載される。本発明は、一部の態様では、２つ以上の合成ＲＮＡが酵素を使用してライゲーションされる、ライゲーションベースのアプローチを提供する。驚くべきことに、ライゲーションベースのアプローチは、産生されるｇＲＮＡの純度、収率、および完全性を増加させることが見出された。結果として得られるｇＲＮＡの純度、収率および完全性は、ｇＲＮＡ合成の以前の方法と比較して、編集効率の増加およびオフターゲット編集の低減を可能にする。ｇＲＮＡの合成のためのライゲーションベースの方法は、後でライゲーションされる２つ以上の部分的に相補的な合成ＲＮＡを使用することを含む方法（「テンプレートアプローチ」）、および２つ以上の合成ＲＮＡ間の相補性を必要としない方法（「非テンプレートアプローチ」）を含む。

一部の態様では、第１のＲＮＡを第２のＲＮＡと接触させることであって、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡが、相補的である少なくとも５個のＲＮＡヌクレオチドを含み、接触させることが、ステム構造またはステムループ構造を形成する、接触させることと、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡをライゲーション酵素で、（ｉ）ステム構造内でライゲーションするか、または（ｉｉ）ステム構造の末端でライゲーションし、それによってステム構造の末端でループを形成することと、を含む方法が提供される。

一部の実施形態では、接触させることは、ステム構造を形成し、ライゲーション酵素は、ステム構造の末端で第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡをライゲーションし、それによってステム構造の末端でループを形成する。

一部の実施形態では、接触させることは、ステムループ構造を形成し、ライゲーション酵素は、ステムループ構造のステム内で第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡをライゲーションする。

一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、ＥｌｅｃｔｒｏＬｉｇａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、およびＤＮＡリガーゼＩＶからなる群から選択される。したがって、一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１である。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、ＲｔｃＢリガーゼである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、ＥｌｅｃｔｒｏＬｉｇａｓｅである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、ＤＮＡリガーゼＩである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、ＤＮＡリガーゼＩＩＩである。一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、ＤＮＡリガーゼＩＶである。

一部の実施形態では、第１および／または第２のＲＮＡは、化学的に合成される。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり、第２のＲＮＡが、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）である。

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、本明細書の方法に従って産生される。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、化学的に合成される。

一部の実施形態では、第１および／または第２のＲＮＡは、酵素的に合成される。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、修飾された塩基を含む。様々な修飾されたＲＮＡ塩基には、当該技術分野で既知であり、例えば、２－メトキシエトキシＡ、２－メトキシエトキシＭｅＣ、２－メトキシエトキシＧ、２－メトキシエトキシＴなどの２’－Ｏ－メトキシエチル塩基（２’－ＭＯＥ）を含む。他の修飾された塩基には、例えば、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、およびフルオロ塩基が含まれる。様々なフルオロ塩基が既知であり、例えば、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ塩基が含まれる。様々な２’Ｏメチル修飾もまた、本明細書に記載の方法とともに使用され得る。例えば、以下の２’Ｏメチル修飾のうちの１つ以上を含む以下のＲＮＡを、記載の方法とともに使用することができる：２’－ＯＭｅ－５－メチル－ｒＣ、２’－ＯＭｅ－ｒＴ、２’－ＯＭｅ－ｒＩ、２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ｒＡ、アミノリンカー－Ｃ６－ｒＣ、アミノリンカー－Ｃ６－ｒＵ、２’－ＯＭｅ－５－Ｂｒ－ｒＵ、２’－ＯＭｅ－５－Ｉ－ｒＵ、２－ＯＭｅ－７－デアザ－ｒＧ。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、以下の修飾、ホスホロチオエート、２’Ｏ－メチル、２’フルオロ（２’Ｆ）、ＤＮＡのうちの１つ以上を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、３’および５’末端に２’ＯＭｅ修飾を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、以下の修飾のうちの１つ以上を含む：２’－Ｏ－２－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ロック核酸、架橋核酸、アンロック核酸、ペプチド核酸、モルホリノ核酸。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、以下の塩基修飾のうちの１つ以上を含む：２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、シュードウラシル、Ｎ１－メチル－シュードウラシル、５’メチルシトシン、２’ピリミジノン（ゼブラリン）、チミン。

他の修飾された塩基には、例えば、２－アミノプリン、５－ブロモｄＵ、デオキシウリジン、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）、ジデオキシ－Ｃ、デオキシイノシン、ヒドロキシメチルｄＣ、反転ｄＴ、イソ－ｄＧ、イソ－ｄＣ、反転ジデオキシ－Ｔ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＣ、５－ニトロインドール、Ｓｕｐｅｒ Ｔ（登録商標）、２’－Ｆ－ｒ（Ｃ、Ｕ）、２’－ＮＨ２－ｒ（Ｃ、Ｕ）、２，２’－無水－Ｕ、３’－デソキシ－ｒ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、３’－Ｏ－メチル－ｒ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、ｒＴ、ｒＩ、５－メチル－ｒＣ、２－アミノ－ｒＡ、ｒスペーサー（脱塩基）、７－デアザ－ｒＧ、７－デアザ－ｒＡ、８－オキソ－ｒＧ、５－ハロゲン化－Ｕ、Ｎ－アルキル化－ｒＮが含まれる。

本明細書では、他の化学的に修飾されたＲＮＡを使用することができる。例えば、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、例えば、５’，Ｉｎｔ，３’アジド（ＮＨＳエステル）、５’ヘキシニル、５’，Ｉｎｔ，３’５－オクタジイニルｄＵ、５’，Ｉｎｔ ビオチン（アジド）、５’，Ｉｎｔ ６－ＦＡＭ（アジド）、および５’，Ｉｎｔ ５－ＴＡＭＲＡ（アジド）などの修飾された塩基を含み得る。本明細書に記載の方法とともに使用され得るＲＮＡヌクレオチド修飾の他の例としては、例えば、５’リン酸化および３’リン酸化などのリン酸化修飾が挙げられる。ＲＮＡはまた、以下の修飾：アミノ修飾、ビオチン化、チオール修飾、アルキン修飾子、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、およびジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）のうちの１つ以上を有し得る。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡをライゲーション酵素でライゲーションすることにより、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間にホスホジエステル連結が作製される。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡヌクレオチドは、非共有結合の会合を可能にするように操作される。

一部の実施形態では、ステムループは、約２～５０個のヌクレオチドの長さを有する。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、完全な相補性を有する少なくとも２つのＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、完全な相補性を有する少なくとも３、４、５、６、または７つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、完全な相補性を有するＲＮＡヌクレオチドは、上部ステムおよび／または下部ステムに存在する。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡによって形成された下部ステムで相補的である少なくとも５、６、または７つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、上部ステムで相補的である少なくとも４～１４個の連続したＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、上部ステムで相補的である４つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、上部ステムで相補的である５つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、上部ステムで相補的である７つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、上部ステムで相補的である１４個の連続したＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、下部ステムで相補的である７つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、ライゲーション酵素のライゲーション部位を作製するように操作される。

一部の実施形態では、ステムループは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のヌクレオチドのループを含む。したがって、一部の実施形態では、ステムループは、本明細書でテトラループとも称される４つのヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、５つのヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、６つのヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、７つのヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、８つのヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、９つのヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、１０個のヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、１１個のヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、１２個のヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、１３個のヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、１４個のヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、１５個のヌクレオチドのループを含む。一部の実施形態では、ステムループは、１５個のヌクレオチドのループを含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のライゲーションは、ループから少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基対にあるライゲーション部位で生じる。したがって、一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも１塩基対のところであるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも２塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも３塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも４塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも５塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも６塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも７塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも８塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも９塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも１０塩基対にあるライゲーション部位で生じる。

一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ループから２または３塩基対にある。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２塩基対にあるライゲーション部位で生じる。したがって、一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも３塩基対のところであるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも４塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも５塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも６塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも７塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも８塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも９塩基対であるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも１０塩基対にあるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも１１塩基対にあるライゲーション部位で生じる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも１２塩基対にあるライゲーション部位で生じる。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、バルジから３、４、５、または１１塩基対にあるライゲーション部位で生じる。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、酵素的に産生される。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、第２のＲＮＡの一部分と塩基対形成することができる３’配列を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、５’末端にホスフェートを含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、ドナーＲＮＡである。

一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、可変プロトスペーサー領域を含む。

一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、アクセプターＲＮＡである。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、５’末端にアデノシン三リン酸を含む。

一部の実施形態では、約８～５０個のヌクレオチドが相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～４０個のヌクレオチドが相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～３０個のヌクレオチドが相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～２０個のヌクレオチドが相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～１０個のヌクレオチドが相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。

一部の実施形態では、上記８～５０個のヌクレオチドは、部分的に相補的である。一部の実施形態では、約８～４０個のヌクレオチドは、部分的に相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～３０個のヌクレオチドは、部分的に相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～２０個のヌクレオチドは、部分的に相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～１０個のヌクレオチドは、部分的に相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。

一部の実施形態では、８～５０個のヌクレオチドは、約５０％～９９％相補的である。

一部の実施形態では、８～５０個のヌクレオチドは、完全に相補的である。一部の実施形態では、約８～４０個のヌクレオチドは、完全に相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～３０個のヌクレオチドは、完全に相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～２０個のヌクレオチドは、完全に相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。一部の実施形態では、約８～１０個のヌクレオチドは、完全に相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。

一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、異なるヌクレオチド長さを有する。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２０～１００個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２０～９０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２０～８０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２０～７０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２０～６０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２０～５０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２０～４０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２０～３０個のヌクレオチドを有する。

一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約２０～７０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約２０～６０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約２０～５０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約２０～４０個のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約２０～３０個のヌクレオチドを有する。

一部の実施形態では、塩基対形成は、下部ステムにおいて生じる。

一部の実施形態では、７個のヌクレオチドが、下部ステムにおいて相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。

一部の実施形態では、塩基対形成は、上部ステムにおいて生じる。

一部の実施形態では、２個のヌクレオチドが、上部ステムにおいて相補的であり、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１００個のヌクレオチド、約１２５個のヌクレオチド、約１５０個のヌクレオチド、約１７５個のヌクレオチド、約２００個のヌクレオチド、または約２００個よりも大きいヌクレオチドの長さを有する。したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１００個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１２５個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１５０個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１７５個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約２００個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２００個よりも大きいヌクレオチドの長さを有する。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、伸長ガイドＲＮＡ、プライムエディターガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、またはＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｂガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｃガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｄ、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｅガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｆガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｇガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｈガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｉガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｊガイドＲＮＡ、もしくはＣａｓ１２ｋガイドＲＮＡなどのＣａｓ１２ガイドＲＮＡである。したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、伸長ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、プライムエディターガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ガイドＲＮＡである。様々なＣａｓ１２は、既知であり、当該技術分野であり、例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム由来のＣａｓ１２が挙げられる。例示的なＣａｓ１２としては、例えば、クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム由来の任意のＣａｓ１２が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、および／またはＣａｓ１２ｋのｇＲＮＡを合成するのに好適である。したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｂガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｃガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｄガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｅガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｆガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｇガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｈガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｉガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｊガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｋガイドＲＮＡである。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、スペーサー、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、およびヘアピンのうちの１つ以上を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、または１：０．５の比で存在する。したがって、一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約０．５：１の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約０．６：１の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約０．７：１の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約０．８：１の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約０．９：１の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約１：１の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約１：０．９の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約１：０．８の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約１：０．７の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約１：０．６の比で存在する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約１：０．５の比で存在する。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上の収率で産生される。したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約５０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約５５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約６０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約６５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約７０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約７５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約８０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約８５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約９０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約９５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、９９％超の収率で産生される。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上改善して産生される。したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が５０％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が５５％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が６０％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が５５％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が６０％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が６５％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が７０％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が７５％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が８０％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が８５％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が９０％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が９９％改善して産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が９９％超改善して産生される。

一部の態様では、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法が提供され、５’－モノホスフェートを含む第１のＲＮＡを提供することと、第２のＲＮＡを提供することと、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡに対して部分的な相補性を有するオリゴヌクレオチドを提供することであって、オリゴヌクレオチドの相補性が、第１および第２のＲＮＡとの塩基対形成を可能にする、提供することと、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間のライゲーションを触媒するためのリガーゼを提供し、したがって合成ｇＲＮＡを産生することと、を含む。

一部の態様では、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法が提供され、５’－モノホスフェートを含む第１のＲＮＡを提供することと、ブロックされた３’末端を含む第２のＲＮＡを提供することと、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間のライゲーションを触媒するためのリガーゼを提供し、したがって合成ｇＲＮＡを産生することと、を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり、第２のＲＮＡは、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ヌクレオチド長である。

一部の態様では、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法が提供され、
２つ以上のＲＮＡ断片を提供することと、２つ以上のＲＮＡ断片に対して部分的な相補性を有するオリゴヌクレオチドを提供することであって、オリゴヌクレオチドの相補性が、２つ以上のＲＮＡ断片との塩基対形成を可能にする、提供することと、２つ以上のＲＮＡ断片間のライゲーションを触媒するためのリガーゼを提供し、したがって合成ガイドＲＮＡを産生することと、を含む。

一部の実施形態では、２つ以上のＲＮＡ断片は、オーバーハング、平滑末端、またはバルジでライゲーションされる。

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）が、本明細書に記載の方法によって合成される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡまたはＣａｓ１２ガイドＲＮＡである。

本明細書に記載の方法は、Ｃａｓ１２ｂガイドＲＮＡなどのＣａｓ１２ガイドＲＮＡを合成するために使用され得る。例えば、Ｃａｓ１２ｂ ＲＮＡヘアピンループ構造が、ｓｇＲＮＡを分割する位置として標的化され得る。例えば、図１６に示されるようなそれらのヘアピンループ構造など、様々なヘアピンループ構造が、ｓｇＲＮＡを分割する位置として標的化され得る。したがって、一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ガイドＲＮＡが、１つ以上のヘアピンループ構造を標的とすることによって、本明細書に記載の方法に従って合成され得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ ＲＮＡ内の１つ以上のテトラループが、ライゲーションのために標的化される。例えば、一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂ ＲＮＡ内の１つ以上のテトラループが、ライゲーションのための標的である。一部の実施形態では、標的化されるテトラループは、Ｃａｓ１２ ＲＮＡの５’末端に位置する。一部の実施形態では、標的化されるテトラループは、Ｃａｓ１２ ＲＮＡの３’末端に位置する。一部の実施形態では、標的化されたテトラループは、Ｃａｓ１２ ＲＮＡの３’末端から約５～３０個のヌクレオチド内に位置する。一部の実施形態では、標的化されたテトラループは、Ｃａｓ１２ ＲＮＡの５’末端から約５～３０個のヌクレオチドである。

一部の態様では、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、または標的化されたゲノム修飾のための方法が提供され、本方法は、真核細胞中に（ａ）先行請求項のいずれか一項に定義される合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を導入することを含み、（ａ）および（ｂ）と染色体ＤＮＡにおける標的配列との相互作用が、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、または標的化されたゲノム修飾をもたらす。

一部の態様では、標的化されたＲＮＡ修飾のための方法が提供され、本方法は、真核細胞中に（ａ）先行請求項のいずれか一項に定義される合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を導入することを含み、（ａ）および（ｂ）と染色体ＤＮＡによって発現されたＲＮＡとの相互作用が、染色体ＤＮＡによって発現されたＲＮＡの修飾をもたらす。

一部の実施形態では、染色体ＤＮＡによって発現されたＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、またはそれらの修飾されたバージョンから選択される。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生するための方法が提供される。

一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、第１のＲＮＡの一部分と塩基対形成することができる３’配列を含む。

一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、可変プロトスペーサー領域を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、５’末端にホスフェートを含む。

一部の実施形態では、接触させることは、ステムループ構造を形成し、ライゲーション酵素は、ステムループ構造のステム内で第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡをライゲーションする。

一部の実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である。

一部の実施形態では、ステムループは、上部ステムにおいてＧＣ塩基対を含む。

一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと同一のヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＣＧと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＣＧと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＣＧと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＣＧと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＣＧと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＣＧと少なくとも約９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＣＧと同一のヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＧＣＣＧＣと同一のヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＧＣと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＧＣと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＧＣと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＧＣと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＧＣと少なくとも約９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＣＧＣと同一のヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵと少なくとも約９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上部ステムは、ＣＧＡＵと同一のヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態では、ステムループは、下部ステムにおいてＧＣ塩基対を含む。

一部の実施形態では、下部ステムは、ＧＣ塩基対を含まない。

一部の実施形態では、上部ステムは、ＧＣ塩基対を含まない。

一部の実施形態では、上部ステムは、少なくとも１、２、３、４、５、または６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも１つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも２つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも３つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも４つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも２つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも５つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも６つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも７つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも８つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも９つのＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも１０個のＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも１１個のＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、ステムは、少なくとも１２個のＧＣ塩基対を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡをライゲーションすることにより、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％超の全長産物の収率がもたらされる。一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、全長産物の少なくとも６０％の収率をもたらす。一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、全長産物の少なくとも７０％の収率をもたらす。一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、全長産物の少なくとも８０％の収率をもたらす。一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、全長産物の少なくとも９０％の収率をもたらす。一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、全長産物の少なくとも９５％の収率をもたらす。一部の実施形態では、第１および第２のＲＮＡは、全長産物の９５％超の収率をもたらす。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも１グラムの量で産生される。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも５グラム、１０グラム、２０グラム、３０グラム、４０グラム、５０グラム、６０グラム、７０グラム、８０グラム、９０グラム、または１００グラムの量で産生される。したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも５グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも１０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも２０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも３０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも４０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも５０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも６０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも７０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも８０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも９０グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも１００グラムの量で産生される。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、１グラム未満の量で産生される。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、約０．０５グラム、０．１グラム、０．２グラム、０．３グラム、０．４グラム、０．５グラム、０．６グラム、０．７グラム、０．８グラム、または０．９ｇの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．０５グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．１グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．２グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．３グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．４グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．５グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．６グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．７グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．８グラムの量で産生される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約０．９グラムの量で産生される。

一部の実施形態では、本方法は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超の純度でｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約５０％の純度でｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約６０％の純度でｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約７０％の純度でｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約８０％の純度でｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９０％の純度でｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、９０％超の純度でｇＲＮＡを産生する。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、３’から５’方向に合成される。

一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、３’から５’方向に合成される。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１００個のヌクレオチド、約１２５個のヌクレオチド、約１５０個のヌクレオチド、約１７５個のヌクレオチド、約２００個のヌクレオチド、または約２００個よりも大きいヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１００個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１２５個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１５０個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１７５個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約２００個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２００個よりも大きいヌクレオチドの長さを有する。

一部の実施形態では、ループは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、本明細書でテトラループとも称される４つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、５つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、６つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、７つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、８つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、９つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、１０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、１１個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、１２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、１３個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、１４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、１５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループは、１６個のヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのライゲーションは、ループから少なくとも約３塩基対にあるライゲーション部位で生じる。

一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ループから１、２、３、４、５、６、または１０塩基対にある。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ループから１塩基対のところである。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから２塩基対である。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから３塩基対である。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから４塩基対である。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから５塩基対である。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから６塩基対である。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから７塩基対である。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから８塩基対である。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから９塩基対である。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ライゲーションループから１０塩基対にある。

一部の実施形態では、第１および／または第２のＲＮＡは、１つ以上の骨格修飾を含む。

一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’Ｏ－メチルまたはホスホロチオエート修飾を含む。したがって、一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’Ｏ－メチル修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾を含む。

一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエート、２’Ｏ－メチル、２’－リボ３’－ホスホロチオエート、デオキシ、または５’ホスフェート修飾から選択される。したがって、一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエート修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、２’－リボ３’－ホスホロチオエート修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、デオキシ修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、５’ホスフェート修飾を含む。

一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ライゲーションの部位に存在する。

一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ドナーＲＮＡおよび／またはアクセプターＲＮＡに存在する。したがって、一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ドナーＲＮＡに存在する。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、アクセプターＲＮＡに存在する。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ドナーおよびアクセプターＲＮＡの両方に存在する。

一部の実施形態では、ドナーＲＮＡの３’および／または５’の末端は、１つ以上の骨格修飾を有する。したがって、一部の実施形態では、ドナーＲＮＡの３’末端は、１つ以上の骨格修飾を有する。一部の実施形態では、ドナーＲＮＡの５’末端は１つ以上の骨格修飾を有する。

一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡの３’および／または５’の末端は、１つ以上の骨格修飾を有する。したがって、一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡの３’末端は、１つ以上の骨格修飾を有する。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡの５’末端は、１つ以上の骨格修飾を有する。

一部の実施形態では、第１および／または第２のＲＮＡの濃度は、約１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌである。

一部の実施形態では、拳および／または第２のＲＮＡの濃度は、約１ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、拳および／または第２のＲＮＡの濃度は、約２ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、第１および／または第２のＲＮＡの濃度は、約３ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、拳および／または第２のＲＮＡの濃度は、約４ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、拳および／または第２のＲＮＡの濃度は、約５ｇ／Ｌである。

一部の実施形態では、５’末端にホスフェートを含む第１のＲＮＡおよび可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡを含む、本明細書に記載の方法によって産生される組成物が、提供され、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、非共有結合で結合している。

一部の実施形態では、５’末端にホスフェートを含む第１のＲＮＡおよび可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡを含む、本明細書に記載の方法によって産生される組成物が、提供され、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、リガーゼに結合している。

一部の実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である。

一部の態様では、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。

一部の態様では、ＣＧＣＣＧと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＣＣＧと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＣＣＧと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＣＣＧと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＧＣＣＧと同一である。

一部の態様では、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＧＣＣＧＣと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＧＧＣＣＧＣと同一である。

一部の態様では、ＣＧＣＧＣと少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＣＧＣと少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＣＧＣと少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ＣＧＣＧＣと少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む組成物が、提供される。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＧＣＧＣと同一である。

一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物を含むキットが、提供される。

一部の態様では、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む第１のＲＮＡ、可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡ、およびリガーゼを含むキットが、提供される。

一部の実施形態では、キットは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を含む。

定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語についてのさらなる定義は、本明細書全体にわたって記載される。

ａまたはａｎ：冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「エレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つのエレメントまたは１つより多いエレメントを意味する。

およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、１つ以上の目的の値に適用される場合、記載される参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいか、より小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満内に収まる値の範囲を指す（かかる数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。

関連する：一方の存在、レベルおよび／または形態が、他方の存在、レベルおよび／または形態と相関する場合に該用語が本明細書で使用される場合、２つの事象または実体は、互いに「関連する」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベルおよび／または形態が（例えば、関連する集団全体にわたって）疾患、障害もしくは状態の発生率および／またはその感受性と相関する場合、特定の疾患、障害もしくは状態と関連するとみなされる。一部の実施形態では、２つ以上の実体が、直接的または間接的に相互作用する場合、それらが互いに物理的に近接し、それを維持するように、物理的に互いに「関連する」。一部の実施形態では、物理的に互いに関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合で連結され、一部の実施形態では、物理的に互いに関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合では連結されないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、およびそれらの組合せによって、非共有結合で関連する。

塩基エディター「塩基エディター（ＢＥ）」または「核酸塩基エディター（ＮＢＥ）」は、ポリヌクレオチドに結合し、核酸塩基修飾活性を有する薬剤を意味する。様々な実施形態では、塩基エディターは、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と併せて、核酸塩基修飾ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）およびポリヌクレオチドプログラマブル（プログラム可能）ヌクレオチド結合ドメインを含む。様々な実施形態では、薬剤は、塩基編集活性を有するタンパク質ドメイン、すなわち、核酸分子（例えば、ＤＮＡ）内の塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）を修飾することができるドメインを含む生体分子複合体である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結される。一実施形態では、薬剤は、塩基編集活性を有する１つ以上のドメインを含む融合タンパク質である。別の実施形態では、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、ガイドＲＮＡに連結される（例えば、ガイドＲＮＡ上のＲＮＡ結合モチーフおよびデアミナーゼに融合されたＲＮＡ結合ドメインを介して）。一部の実施形態では、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ分子内の１つ以上の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）またはアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）およびアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）およびシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメイン、またはｄＩＳＮドメイン）に融合される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼと、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメインまたはｄＩＳＮドメイン）と、を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、脱塩基（ａｂａｓｉｃ）塩基エディターである。塩基エディターの詳細は、国際ＰＣＴ出願第２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）および同第ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。また、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ” Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ” Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７）、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ” Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）、およびＲｅｅｓ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｄｅｃ；１９（１２）：７７０－７８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０１８－００５９－１を参照されたく、その全容は、参照により本明細書に援用される。

塩基編集活性：「塩基編集活性」とは、（例えば、塩基を脱アミノ化することによって）ポリヌクレオチド内の塩基を化学的に変化させるように作用することを意味する。一実施形態では、第１の塩基が第２の塩基に変換される。一実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、アデノシンまたはアデニンデアミナーゼ活性であり、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換し、かつアデノシンデアミナーゼ活性またはアデニンデアミナーゼ活性であり、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する。

塩基エディターシステム：「塩基エディターシステム」という用語は、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するためのシステムを指す。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）システムは、（１）標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を脱アミノ化するための、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、デアミナーゼドメイン、およびシチジンデアミナーゼドメイン、ならびに（２）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと併せて、１つ以上のガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）システムは、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼから選択される核酸塩基エディタードメイン、および核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、（１）標的ヌクレオチド配列中の１つ以上の核酸塩基を脱アミノ化するための、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む塩基エディター（ＢＥ）、ならびに（２）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと合わさる、１つ以上のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニンまたはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニンまたはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）またはシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。

生物学的に活性：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性」という語句は、生物学的システム、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与される場合、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、ペプチドが生物学的に活性である場合、ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのペプチドの一部分は、典型的には、「生物学的に活性」な部分と称される。

開裂：本明細書で使用される場合、開裂は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼによって作製される標的核酸の切断を指す。一部の実施形態では、開裂事象は、二本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、一本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、一本鎖ＲＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、二本鎖ＲＮＡ切断である。

相補的：「相補的」または「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソン－クリックまたはフーグスティーン塩基対形成のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成することができることを意味する。相補的な塩基対形成は、Ｇ－ＣおよびＡ－Ｔ塩基対形成だけでなく、イノシンなどの普遍的な塩基を伴う塩基対形成も含む。相補性の割合は、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）できる核酸分子中の隣接した残基の割合を示す（例えば、１０個のヌクレオチドを有する第２の核酸配列に対して塩基対形成される第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０個のヌクレオチドのうちの５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％補完的であることを表す）。相補性の割合が少なくとも一定の割合であることを決定するために、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）することができる核酸分子中の隣接した残基の割合を計算し、最も近い整数に四捨五入される（例えば、２３個のヌクレオチドを有する第２の核酸配列に対して塩基対形成される第１のオリゴヌクレオチド中の合計２３個のヌクレオチドのうち、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個のヌクレオチドは、それぞれ、５２％、５７％、６１％、６５％、７０％、および７４％を表し、それぞれ、少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％、および７０％の相補性を有する）。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」とは、それらが生物学的な条件下でハイブリダイゼーション可能であるような鎖間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには１００％の相補性を有する。さらに、２つの鎖が、それらのヌクレオチド配列を調べることによって、生物学的な条件下でハイブリダイゼーションすることができるかどうかを決定する技術は、当該技術分野で周知である。

Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システム：本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＣＲＩＳＰＲエフェクター、ＲＮＡガイド、およびＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物をコードする配列を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの発現に関与するまたはその活性を指示する核酸および／またはタンパク質を指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、操作された天然に生じないＣＲＩＳＰＲシステムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの成分は、システムの１つ以上の成分をコードする核酸（例えば、ベクター）、タンパク質形態の成分、またはそれらの組合せを含み得る。

ＣＲＩＳＰＲアレイ：「ＣＲＩＳＰＲアレイ」という用語は、本明細書で使用される場合、第１のＣＲＩＳＰＲリピートの第１のヌクレオチドで始まり、最後の（末端）ＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドで終わる、ＣＲＩＳＰＲリピートおよびスペーサーを含む核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントを指す。典型的には、ＣＲＩＳＰＲアレイ中の各スペーサーは、２つのリピートの間に位置する。「ＣＲＩＳＰＲリピート」または「ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート」、または「ダイレクトリピート」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲアレイ内の配列バリエーションをほとんど示さないかまたは全く示されない複数の短いダイレクトリピート配列を指す。

ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）：「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」、「エフェクター」、または「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡガイドによって特定される核酸上の標的部位に酵素活性を行う、および／または結合するタンパク質を指す。種々の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、エンドヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、トランスポザーゼ活性、および／または切除活性を有する。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ヌクレアーゼ不活性である。

ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の核酸配列を標的化するためにＣＲＩＳＰＲエフェクターによって使用されるガイド配列を含むＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｃｒＲＮＡは、標的認識を媒介する配列、およびｔｒａｃｒＲＮＡと二本鎖を形成する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲエフェクターに結合する。

二本鎖：本明細書で使用される場合、「二本鎖」は、２つの一本鎖核酸の相互作用によって形成された二重らせん構造を指す。二本鎖は、典型的には、互いに関して逆平行に配向された２つの一本鎖核酸間の塩基の対状水素結合、すなわち、「塩基対形成」によって形成される。二本鎖における塩基対形成は、概して、ワトソン－クリック塩基対形成によって行われ、例えば、グアニン（Ｇ）は、ＤＮＡおよびＲＮＡにおけるシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）は、ＤＮＡにおけるチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）は、ＲＮＡにおけるウラシル（Ｕ）と塩基対を形成する。塩基対が形成され得る条件としては、生理学的または生物学的に関連する条件（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭのカリウムイオン、細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭのナトリウムイオン）が含まれる。さらに、二本鎖は、隣接するヌクレオチド間の相互作用を積み重ねることによって安定化される。本明細書で使用される場合、二本鎖は、塩基対形成または相互作用を積み重ねることによって確立され得るか、または維持され得る。二本鎖は、実質的に相補的であり得るか、または完全に相補的であり得る２つの相補的核酸鎖によって形成される。いくつかの塩基にわたって塩基対形成する一本鎖核酸は「ハイブリダイゼーションする」と言われる。

エクスビボ：本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、多細胞生物内ではなく、外部で培養した細胞または組織において生じる事象を指す。

機能的同等物または類似体：本明細書で使用される場合、「機能的同等物」または「機能的類似体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈において、元の配列の生物学的活性と実質的に同様の生物学的な活性（機能または構造のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体または同等物は、天然誘導体であってもよく、または合成的に調製されてもよい。例示的な機能的誘導体としては、タンパク質の生物学的な活性が保存されることを条件として、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列が挙げられる。置換するアミノ酸は、望ましくは、置換されたアミノ酸と同様の化学物理的特性を有する。同様の望ましい化学物理的特性としては、電荷の類似性、かさ高さ、疎水性、親水性などが含まれる。

半減期：本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、タンパク質濃度または活性などの量が、期間の開始時に測定されたその値の半分に低下するのに必要な時間である。

ハイブリダイゼーションする：「ハイブリダイゼーションする」とは、ストリンジェントな様々な条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）またはその一部分の間で二本鎖分子を形成することを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸塩基間のワトソン－クリック水素結合、フーグスティーン水素結合、または逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合によって生じる。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対合する相補的な核酸塩基である。

改善する、増加する、または低減する：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、もしくは「低減する」という用語、または文法的同等物は、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載の治療の不在下での対照対象（または複数の対照対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照対象」は、治療されている対象と同じ形態の疾患に罹患している対象であり、治療されている対象とほぼ同じ年齢である。

インデル：本明細書で使用される場合、「インデル」という用語は、核酸配列における塩基の挿入または欠失を指す。一般的に変異をもたらし、遺伝的バリエーションの一般的な形態である。

阻害：本明細書で使用される場合、「阻害」、「阻害する」、および「阻害すること」という用語は、目的のタンパク質または遺伝子の活性および／または発現を減少または低減するプロセスまたは方法を指す。典型的には、タンパク質または遺伝子を阻害することは、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で認識される１つ以上の方法によって測定される、タンパク質または遺伝子の発現または関連する活性を少なくとも１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上低減させること、または１倍より大きい、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍もしくはそれ以上の発現または関連する活性の低下を指す。

インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養内などにおいて生じる事象を指す。

インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースのシステムの文脈では、該用語は、（例えば、インビトロシステムとは対照的に）生細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。

オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、概して、約５～約１００個のヌクレオチドの一本鎖または二本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離されてもよく、または化学的に合成されてもよい。

ＰＡＭ：「ＰＡＭ」または「プロトスペーサー隣接モチーフ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などの、ＣＲＩＳＰＲシステムによる開裂の標的となる核酸領域に続く短い核酸配列（通常、２～６塩基対の長さ）を指す。Ｃａｓヌクレアーゼが切断するために、ＰＡＭが必要とされる場合があり、概して、切断部位から３～４個のヌクレオチドの下流に見出される。

ポリペプチド：「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介してともに連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。該用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者は、該用語が長鎖に限定されず、ペプチド結合を介してともに連結された２つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するであろう。当業者に既知のように、ポリペプチドは、処理および／または修飾され得る。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、互換的に使用される。

予防する：本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」という用語は、疾患、障害、および／または状態の発生に関連して使用される場合、疾患、障害、および／または状態を発症するリスクを低減することを指す。

プライム編集ガイドＲＮＡ：「プライム編集ガイドＲＮＡ」または「ｐｅｇＲＮＡ」という用語は、標的部位を特定すること、および所望の編集をコードすることの両方をするガイドＲＮＡのタイプを指す。プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）は、当該技術分野において既知であり、以前に、例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ Ａ．Ｖ．，“Ｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｒｅｐｌａｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｏｒ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ”Ｎａｔｕｒｅ．２０１９ Ｏｃｔ ２１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１７１１－４に記載されており、その全容は、参照により本明細書に援用される。

タンパク質：「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、個別の単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが個別の機能単位であり、個別の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的または一時的な物理的会合を必要としない場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され得る。個別機能単位が、互いに物理的に会合する１つより多くのポリペプチドからなる場合、「タンパク質」という用語は、物理的にカップリングされ個別単位としてともに機能する複数のポリペプチドを指す。

参照：「参照」の実体、システム、量、条件のセットなどは、本明細書に記載のように試験の実体、システム、量、条件のセットなどと比較されるものである。例えば、一部の実施形態では、「参照」抗体は、本明細書に記載のように操作されていない対照抗体である。

ＲＮＡガイド：ＲＮＡガイドという用語は、本明細書に記載のタンパク質の標的核酸への標的指向化を促進するＲＮＡ分子を指す。例示的な「ＲＮＡガイド」または「ガイドＲＮＡ」としては、ｃｒＲＮＡ、または同族のｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせたｃｒＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。後者は、独立したＲＮＡであってもよく、またはリンカー（ｓｇＲＮＡ）を使用して単一のＲＮＡとして融合されてもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡガイドは、化学的または生化学的修飾を含むように操作され、一部の実施形態では、ＲＮＡガイドは、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。

スプリント：「スプリント」という用語は、少なくとも２つ、３つ、またはそれ以上の一本鎖ＲＮＡヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることができる一本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは他のポリマーを指す。

対象：「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、診断、予後、または療法が望まれる任意の対象を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類（類人猿、サル、オランウータン、またはチンパンジーなど）、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、またはウシ（ｃｏｗ）であり得る。

ｓｇＲＮＡ：「ｓｇＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、または「ガイドＲＮＡ」という用語は、（ｉ）ガイド配列（ｃｒＲＮＡ配列）および（ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼリクルーティング配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むシングルガイドＲＮＡを指す。

実質的な同一性：「実質的な同一性」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者に理解されるように、２つの配列は、概して、対応する位置に同一の残基を含有する場合、「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較され得、それは、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む。例示的なかかるプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９において記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列が、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、関連するひと続きの残基にわたって同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連するひと続きは、完全な配列である。一部の実施形態では、関連するひと続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基である。

標的核酸：「標的核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが結合する任意の長さのヌクレオチド（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかを指す。標的核酸は、コーディング領域または非コーディング領域を含み得る三次元構造を有し得、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、プラスミド、ベクター、外因性配列、内因性配列を含み得る。標的核酸は、修飾されたヌクレオチド、メチル化されたヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含み得る。標的核酸は、非核酸成分とともに散布されてもよい。標的核酸は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーであるが、これらに限定されない。

治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、任意の医学的治療に適用可能な妥当な利益／リスク比で治療される対象に治療効果を与える治療分子（例えば、本明細書に記載の操作された抗体）の量を指す。治療効果は、客観的であり得る（すなわち、何らかの試験またはマーカーによって測定可能である）、または主観的であり得る（すなわち、対象が効果の指標を与えるか、または効果を感じる）。特に、「治療有効量」とは、疾患と関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防または遅延させること、および／または疾患の症状の重症度もしくは頻度を減少させることなどによって、特定の疾患もしくは状態を治療、改善、もしくは予防するのに有効であるか、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すのに有効である治療分子または組成物の量を指す。治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで投与され得る。任意の特定の治療分子について、治療有効量（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬剤との組合せに依存して変化し得る。また、任意の特定の対象に対する特定の治療有効量（および／または単位用量）は、治療されている障害および障害の重症度；用いられる特定の薬剤の活性；用いられる特定の組成物；対象の年齢、体重、一般的な健康、性別および食事；用いられる特定の治療分子の投与時間、投与経路、および／または排泄もしくは代謝速度；治療期間；ならびに医学分野で周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存し得る。

ｔｒａｃｒＲＮＡ：「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲｌＳＰＲ関連タンパク質が特定された標的核酸に結合するのに必要な構造を形成する配列を含むＲＮＡを指す。

治療：本明細書で使用される場合、「治療」（「治療する」または「治療すること」も）という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状または特徴の発症を部分的にまたは完全に緩和、改善、軽減、阻害、遅延、それらの重症度の低減、および／またはそれらの発生率を低減する治療分子（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ治療タンパク質またはシステム）の任意の投与を指す。かかる治療は、関連する疾患、障害、および／もしくは状態の兆候を示さない対象、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の早期兆候のみを示す対象のものであり得る。代替的または追加的に、かかる治療は、関連する疾患、障害および／または状態の１つ以上の確立された兆候を示す対象のものであってもよい。

図面は、限定のためではなく、例示の目的のみのためである。

合成ＲＮＡの標準的な化学合成を示す概略図である。合成ＲＮＡは、典型的には、固体支持体上での配列制御重合を介して合成される。化学合成は、図１の概略図に示されるように、各々が様々なステップを含むサイクルで実施される。 標的ＤＮＡ配列と相互作用するｓｇＲＮＡを示す一般的な概略図である。概略図は、スペーサー領域、下部ステム、テトラループ、およびバルジ領域からなるステムループ、ネクサスモチーフ、ならびに一連のヘアピンモチーフを含む、ｓｇＲＮＡに存在する様々なモチーフを示す。 パネルＡは、ライゲーションベースの方法を使用したｓｇＲＮＡの合成のための２つの一般的なアプローチを示す。第１のアプローチ（１）では、ライゲーションは、ステムループのループ部分で生じる。第２のアプローチ（２）では、ライゲーションは、ステムループのヘリックスで生じる。各アプローチでは、ステムループは伸長され、酵素ライゲーションのためにセクションを会合させるために使用される。図３のパネルＢは、ＲＮＡ断片と該断片をライゲーションすることによって産生されるｇＲＮＡとの間の分離を示す概略ＨＰＬＣグラフを示し、それらはピークによって表されている。ライゲーション後、ライゲーションしなかったＲＮＡ断片を除去するために、ＨＰＬＣを使用して最終精製ステップを実施する。全長産物（ＦＬＰ）からのＲＮＡ断片の完全な分離が可能である。 薬物合成において使用される典型的なクリック化学反応の例を示す模式図である。以前の方法は、ＲＮＡ断片を全長ｓｇＲＮＡに組み合わせるために「クリック化学」を使用する化学ライゲーションを使用した。 パネルＡ～Ｃは、酵素的ライゲーションに使用される様々な基質を示す。図５のパネルＡは、スプリントに関連する２つのＲＮＡオリゴを示す。このシナリオでは、ニック（例えば、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の結合点）は、リガーゼによって密封され、天然のホスホジエステル骨格連結がもたらされる。図５のパネルＢは、互いに部分的な相補性を有し一緒に塩基対形成してステムループ構造を形成する、２つのＲＮＡオリゴを示す。酵素的ライゲーションは、ステムループのループセクションで高効率に実施され得る。図５のパネルＣは、スプリントと塩基対を形成する２つのＲＮＡを示す。ライゲーションは、様々なＲＮＡ会合において実施され得、事前の会合を必要とせずに実施され得る。 パネルＡは、最も一般的に使用されるｓｇＲＮＡと関連する配列および構成を示す。図６のパネルＢは、ループライゲーションのための２つの代表的なＲＮＡ配列および関連するライゲーション部位を示す。図６のパネルＣは、ヘリックスライゲーションのための２つの代表的なＲＮＡ配列およびライゲーション部位を示す。配列は、以下のとおりである。 パネルＡ：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ パネルＢ：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＣＵＵＧＣＵＣＧＡ ｐＵＡＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ パネルＣ：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵ ｐＣＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ Ｘは任意のヌクレオチドであり、「ｐ」は、図に示されるように、ＲＮＡが共有結合で連結されていないところの遊離ホスフェートを示す。 パネルＡは、ライゲーション実験で使用される断片の配列を示す。アクセプター配列およびドナー配列の両方が示されている。塩基コード：Ａ、アデノシン；Ｇ、グアノシン；Ｕ、ウリジン；Ｃ、シチジン；ｍＡ、２’－Ｏ－メチル－アデノシン；ｍＵ、２’－Ｏ－メチル－ウリジン；ｍＣ、２’－Ｏ－メチル－シチジン；ｐＣ、５’－リン酸化シチジン。パネルＢは、プレライゲーションされた複合体の提案された構造を示す。アクセプター配列およびドナー配列が示され、図７パネルＡに示されるアクセプター配列およびドナー配列に対応する。ホスフェートは、丸として表される。パネルＣは、以下を示すクロマトグラムを示している：１、アクセプター断片；２、ドナー断片；３、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２でのアクセプターとドナー断片との間の反応の産物。反応は、１０μＭのドナー断片、１０μＭのアクセプター断片、４０μＬの１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２反応緩衝液（ＮＥＢ）、および２０ユニットのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を含有し、３７℃で実施された。 パネルＡは、ＲＮＡドナー１（Ｄｎｒ－０１）、ＲＮＡアクセプター１（Ａｃｐ－０１）設計およびライゲーション複合体についてのＲＮＡ断片設計を示す。Ｄｎｒ－０１およびＡｃｐ－０１配列を表４に示す。文字「Ｐ」は、ホスフェートおよびライゲーションの位置を示す。図８のパネルＢは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の有無でのＡｃｐ－１とＤｎｒ－１との間の反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。「ＦＬＰ」は「全長産物」を表す。 パネルＡは、ＲＮＡアクセプター２（Ａｃｐ－０２）、ＲＮＡドナー２（Ｄｎｒ－０２）、およびライゲーション複合体についてのＲＮＡ断片設計を示す。文字「Ｐ」は、ホスフェートおよびライゲーションの位置を示す。図９のパネルＢは、リガーゼＴ４ ＲＮＡリガーゼ１の有無でのＡｃｐ－０２とＤｎｒ－０２との間の反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。Ａｃｐ－０２およびＤｎｒ－０２配列を表４に示す。「ＦＬＰ」は「全長産物」を表す。 パネルＡは、ＲＮＡアクセプター３（Ａｃｐ－０３）、ＲＮＡアクセプター３（Ｄｎｒ－０３）、およびライゲーション複合体についてのＲＮＡ断片設計を示す。文字「Ｐ」は、ホスフェートおよびライゲーションの位置を示す。図１０のパネルＢは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の有無でのＡｃｐ－０３とＤｎｒ－０３との間の反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０のパネルＣは、ＲＮＡアクセプター４（Ａｃｐ－０４）、ＲＮＡドナー４（Ｄｎｒ－０４）およびライゲーション複合体についての断片設計を示す。文字「Ｐ」は、ライゲーション部位の位置を示す。図１０のパネルＤは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の有無でのＲＮＡアクセプター４（Ａｃｐ－０４）とＲＮＡドナー４（Ｄｎｒ－０４）との間の反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。Ａｃｐ－０３およびＤｎｒ－０３配列を表４に示す。「ＦＬＰ」は「全長産物」を表す。 パネルＡは、ＲＮＡアクセプター５（Ａｃｐ－０５）、ＲＮＡドナー５（Ｄｎｒ－０５）、およびライゲーション複合体についてのＲＮＡ断片設計を示す。文字「Ｐ」は、ライゲーション部位の位置を示す。図１１のパネルＢは、リガーゼ２の有無でのＡｃｐ－０５とＤｎｒ－０５との間の反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１１のパネルＣは、ＲＮＡアクセプター６（Ａｃｐ－０６）、ＲＮＡドナー６（Ｄｎｒ－０６）およびライゲーション複合体についてのＲＮＡ断片設計を示す。文字「Ｐ」は、ライゲーション部位の位置を示す。図１１のパネルＤは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の有無でのＡｃｐ－０６とＤｎｒ－０６との間の反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。Ａｃｐ－０５およびＤｎｒ－０５配列を表４に示す。文字「Ｐ」は、ライゲーション部位の位置を示す。「ＦＬＰ」は「全長産物」を表す。 パネルＡは、ＲＮＡアクセプター７（Ａｃｐ－０７）、ＲＮＡドナー７（Ｄｎｒ－０７）、およびライゲーション複合体についての断片設計を示す。文字「Ｐ」は、ライゲーション部位の位置を示す。図１２のパネルＢは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の有無でのＡｃｐ－０７とＤｎｒ－０７との間の反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。Ａｃｐ－０７およびＤｎｒ－０７配列を表４に示す。「ＦＬＰ」は「全長産物」を表す。副産物が反応において産生され、「＊」でラベル付けされている。 開始断片濃度（ｇ／Ｌ）の関数として反応収率（「ＦＬＰ」）を示すグラフである。これらの研究については、ＲＮＡアクセプター５／ＲＮＡドナー５（Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０５）およびＲＮＡアクセプター６／ＲＮＡドナー６（Ａｃｐ／Ｄｎｒ－６）を使用した。「ＦＬＰ」は「全長産物」を表す。 パネルＡは、広範囲に修飾された断片である：ＲＮＡアクセプター８（Ａｃｐ－０８）、ＲＮＡドナー８（Ｄｎｒ－０８）、およびライゲーション複合体についての断片設計を示す。Ａｃｐ－０８およびＤｎｒ－０８配列を表４に示す。パネルＡにおけるハイライトされた／陰影の付いたヌクレオチドは、２Ｏ－メチル修飾で修飾された位置を示す。文字「Ｐ」は、ライゲーション部位の位置を示す。図１４のパネルＢは、これらの反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。文字「Ｐ」は、ホスフェートおよびライゲーションの位置を示す。図１４のパネルＢは、リガーゼ（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）の存在（実線）および不在（点線）における反応からのクロマトグラムを示す。「ＦＬＰ」は全長産物を表す。 アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）および自己テンプレート化ライゲーション方法を使用して合成した３つのガイドＲＮＡ（ＡＤ－０８、ＡＤ－０５、ＡＤ－０６）のうちの１つを使用した、線維芽細胞における編集の割合を示すグラフである。 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉのｂｈＣａｓ１２ｂ ｓｇＲＮＡの配列および二次構造を示す概略図である。概略図は、ｓｇＲＮＡを分割する位置として標的化され得るヘアピンループ構造を示す「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」とラベル付けされた領域を示す。配列中の文字「Ｎ」は、任意の核酸塩基を示す。

本発明は、合成ＲＮＡを産生する方法を提供する。本明細書に記載の方法で任意の合成ＲＮＡを作製することができる。例えば、一部の実施形態では、提供されるライゲーション方法は、とりわけ、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、塩基エディター、およびプライムエディターなどの部位指向性修飾ポリペプチドとともに使用される場合に標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の特定の遺伝子座を修飾するのに有用となるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の産生に使用され得る。本発明者らは、驚くべきことに、高い純度、完全性および最終的な（精製後の）収率を有するｇＲＮＡの産生をもたらす、ＲＮＡ断片からｇＲＮＡを産生する方法を発見した。

本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に説明される。セクションの使用は、本発明を限定することを意図するものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、別段の定めのない限り、「および／または」を意味する。

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
ｇＲＮＡは、標的配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡは、標的核酸配列とハイブリダイゼーションし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸への配列特異的結合を指向する。一部の実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的核酸配列に対して５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する。

一部の実施形態では、本発明のｇＲＮＡは、約５０個のヌクレオチド～２５０個のヌクレオチドである。したがって、一部の実施形態では、本発明のｇＲＮＡは、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、または２５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、のｇＲＮＡは、約５０～７５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約７５～１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１００～１２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１２５～１５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１５０～１７５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１７５～２００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約２００～２２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約２２５～２５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、「プライム編集ガイドＲＮＡ」または「ｐｅｇＲＮＡ」である。Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１９ Ｏｃｔ ２１を参照されたく、その内容は、参照により本明細書に援用される。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ライゲーションされたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。様々なｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、とりわけいくつかのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２）、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ、Ｃａｓ１２、およびプライム編集Ｃａｓと関連したものである。

ｇＲＮＡは、任意の標的配列を標的化するように設計され得る。最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒアルゴリズム、ＣｌｕｓｔｌＷ、ＣｌｕｓｔｌＸ、ＢＬＡＳＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ、ＳＯＡＰ、ＭａｑおよびＥＬＡＮＤを含む配列をアラインメントするための任意のアルゴリズムを使用して決定される。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞のゲノム内の固有の標的配列を標的化するように設計される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列を欠くように設計される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ｍＦｏｌｄまたはＧｅｎｅｉｏｕｓを含む折り畳みアルゴリズムを使用して、最適な二次構造を有するように設計される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの発現は、誘導性プロモーター、例えば、ホルモン誘導性、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン誘導性、アラビノース誘導性、または光誘導性の下であり得る。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と複合体を形成し、いずれの実質的なヌクレアーゼ活性もなしに特定の標的に結合し得る「死んだｃｒＲＮＡ」、「死んだガイド」、または「死んだガイド配列」である。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、糖ホスフェート骨格または塩基において化学修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性または塩基対形成を改善するための、以下の修飾２’Ｏ－メチル、２’－Ｆまたはロック核酸のうちの１つ以上を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２－チオウリジエンまたはＮ６－メチルアデノシンなどの修飾塩基を含有し得る。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、他のオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、タグ、色素、またはポリエチレングリコールとコンジュゲートされている。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、三次元構造に起因して特定の標的分子に結合するアプタマーまたはリボスイッチ配列を含む。

一部の実施形態では、ループ形成配列は、３、４、５またはそれ以上のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ループは、配列ＧＡＡＡ、ＡＡＡＧ、ＣＡＡＡおよび／またはＡＡＡＣを有する。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２、３、４、または５個のヘアピンを有する。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、６個のヌクレオチドを含むポリＴ配列を含む転写終結配列を含む。

合成ガイドＲＮＡの産生
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの合成ＲＮＡを作製する方法を本明細書に記載する。記載の方法は、高い完全性および収率を有するｇＲＮＡなどの合成ＲＮＡを産生する。

本明細書に記載のライゲーション戦略は、ｇＲＮＡなどの合成ＲＮＡを合成するために使用される以前に報告された化学ライゲーション戦略とは異なり、記載の戦略は、ライゲーションの部位で天然のホスフェート連結を形成する。（本明細書に記載のような）セグメント化された合成アプローチを使用する利点は、完全長ｇＲＮＡと比較して、ＲＮＡの短いセクションを精製後により高い純度で産生し得ることである。このアプローチでは、５’アクセプターは、最小のＲＮＡ断片（約３０～５０ｎｔ）であり、したがって、ライゲーションの前に高レベルに精製することができる。３’ドナーは、合成に必要なホスフェートで終結され、したがって、完全長断片のみが全長産物に組み込まれる（すなわち、トランケーション物は基質にならない）。

ｐｅｇＲＮＡまたはＣａｓ１２ｂガイドなどの１００ｎｔを超えるｇＲＮＡを考慮する場合に、本明細書に記載の方法の利点は増大する。本明細書に記載の酵素ライゲーションのタイプは、非常に高い収率（＞８０％）であり、オリゴヌクレオチド出発物質は、高い選択性でライゲーションされた産物から分離され得、全長産物が非常に純粋であることを保証する。これらのタイプの酵素性ライゲーションは、比較的安価であり、スケール拡大しやすい。

合成ｇＲＮＡを産生するための自己テンプレート化アプローチ
一部の態様では、合成ｇＲＮＡを作製する方法は、以下を含む：相補性を有する第１および第２のＲＮＡを提供することであって、相補性は、第１および第２のＲＮＡ間の塩基対形成およびステムループの作製を可能にする、提供すること；ライゲーション酵素を用いて第１および第２のＲＮＡをステムループ内でライゲーションし、したがって合成ｇＲＮＡを産生すること。これにより、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間に形成されるヘリックスまたは他の構造を使用して、２つのＲＮＡの酵素的ライゲーションをテンプレート化することが可能になる。一部の実施形態において、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間に形成された構造の長さおよび配列組成は、非共有結合の会合を促進し、ＲＮＡライゲーションと適合する酵素のための最適なライゲーション部位を作製するように改変される。

相補性は、第１および第２のＲＮＡの一連のヌクレオチド間の部分的または完全のいずれかであり得る。相補性は、相補的ヌクレオチド間の塩基対形成を可能にする。部分的相補性が存在する領域において、ミスマッチのヌクレオチドは、第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子との間のバルジまたはループ構造の形成をもたらすであろう。第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子との間のハイブリダイゼーションに基づいて、第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子との間に様々な構造を形成することができる。第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子との間に形成され得る例示的な構造を、図２に示す。２つのＲＮＡ分子間のライゲーションは、ステム、ヘリックス、ループ、オーバーハング、平滑末端、またはバルジで生じ得る。

このアプローチを使用して、第１のＲＮＡは、複数のリガーゼのうちの１つによって可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡの３’末端（アクセプターと呼ばれる）にライゲーションされる５’末端にホスフェートを有して合成される（ドナーと呼ばれる）。

一部の実施形態では、２つ以上のＲＮＡ断片が、このアプローチを使用してライゲーションされる。例えば、一部の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のＲＮＡ断片が、自己テンプレート化アプローチを使用してライゲーションされる。したがって、一部の実施形態では、合成ＲＮＡを産生する自己テンプレート化アプローチは、２つ以上のＲＮＡ断片を提供することと、２つ以上のＲＮＡ断片に対して部分的な相補性を有するオリゴヌクレオチドを提供することであって、オリゴヌクレオチドの相補性が、２つ以上のＲＮＡ断片との塩基対形成を可能にする、提供することと、２つ以上のＲＮＡ断片間のライゲーションを触媒するためのリガーゼを提供し、したがって合成ガイドＲＮＡを産生することと、を含む。

本明細書に記載の方法とともに、様々なリガーゼを使用することができる。例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、ＥｌｅｃｔｒｏＬｉｇａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、およびＤＮＡリガーゼＩＶのうちの１つ以上が使用され得る。一部の実施形態において、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１が、末端ループで第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡをライゲーションするために使用される。一部の実施形態において、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２が、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間に形成されたステム内で第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡをライゲーションするために使用される。

第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間に形成されたヘアピンの末端ループ内でのライゲーションなどの様々な種類のライゲーションが、このアプローチを使用して可能である。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１などの様々なリガーゼが、形成されたヘアピンの末端ループでのライゲーションに好適である。このアプローチで可能な別の種類のライゲーションは、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間に形成された二本鎖内のライゲーションである。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２およびＤＮＡリガーゼなどの様々なリガーゼが、２つのＲＮＡ間に形成された二本鎖でのライゲーションに好適である。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり、第２のＲＮＡは、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約１０～約１００ヌクレオチド長である。したがって、一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約１０～２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約２５～４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約４０～４５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約４５～６０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約６０～７５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約７５～９０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、約９０～１００ヌクレオチド長である。

一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約１０～約１００ヌクレオチド長である。したがって、一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約１０～２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約２５～４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約４０～４５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約４５～６０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約６０～７５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約７５～９０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のＲＮＡは、約９０～１００ヌクレオチド長である。

合成ＲＮＡの産生におけるスプリントテンプレート化アプローチ
一部の実施形態では、スプリントが、合成ＲＮＡの産生に使用される。スプリントの使用は、スプリントをテンプレートとして使用して、反応のために１つ以上のＲＮＡ分子を物理的に近接させることを可能にする。２つより多くのＲＮＡが結合される場合、スプリントの使用は、合成ＲＮＡの産生を促進する。

スプリントは、１つ以上のＲＮＡ分子を近接させることができる任意の好適なポリマーであり得る。例えば、一部の実施形態では、スプリントは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子である。

一部の実施形態において、スプリントは、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのセクションに対して相補性を有する。相補性は、部分的または完全のいずれかであり得る。したがって、一部の実施形態では、ガイドＲＮＡなどの合成ＲＮＡを産生する方法が提供され、５’ホスフェートを含む第１のＲＮＡを提供することと、遊離３’－ヒドロキシルを含む第２のＲＮＡを提供することと、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡに対して部分的な相補性を有するオリゴヌクレオチドを提供することであって、オリゴヌクレオチドの相補性が、第１および第２のＲＮＡの塩基対形成を可能にする、提供することと、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間のライゲーションを触媒するためのリガーゼを提供し、したがってｇＲＮＡを産生することと、を含む。

一部の実施形態では、スプリントは、カップリングされる第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのセクションに対して相補性を有さない。したがって、一部の実施形態では、ガイドＲＮＡなどの合成ＲＮＡを産生する方法が提供され、５’ホスフェートを含む第１のＲＮＡを提供することと、遊離３’－ヒドロキシルを含む第２のＲＮＡを提供することと、カップリングされる第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのヌクレオチドに対して相補性を有しないオリゴヌクレオチドを提供することと、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間のライゲーションを触媒するためのリガーゼを提供し、したがってｇＲＮＡを産生することと、を含む。

合成ＲＮＡを産生するための非テンプレート化アプローチ
一部の実施形態において、非テンプレート化アプローチを使用して、ガイドＲＮＡなどの合成ＲＮＡを産生する。

非テンプレート化アプローチの一部の実施形態では、５’ホスフェート（５’モノホスフェートなど）を有する第１のＲＮＡが提供され、ブロックされた３’末端（ブロックされた３’ＯＨなど）を含む第２のＲＮＡが提供される。第２のＲＮＡの３’ＯＨをブロックする目的は、ライゲーションが生じるときに、テンプレート化されていない機構を介して第２のＲＮＡが環化することができないようにすることである。例えば、この非テンプレート化アプローチを使用することは、ドナー分子の３’末端の３’ヒドロキシルが化学的にブロックまたは除去されたもの（例えば、ジデオキシヌクレオチド）を含む第２のＲＮＡを含むことができ、酵素（特にＴ４ ＲＮＡリガーゼ１による）は、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間の適切なライゲーションを触媒する。一部の実施形態では、このライゲーション戦略は、高濃度で実施される。

したがって、一部の態様では、合成ＲＮＡを産生する非テンプレート化アプローチは、５’－モノホスフェートを含む第１のＲＮＡを提供することと、ブロックされた３’末端を含む第２のＲＮＡを提供することと、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとの間のライゲーションを触媒するためのリガーゼを提供し、したがってｇＲＮＡを産生することと、を含む。

化学的に修飾されたＲＮＡ
一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、その骨格またはその塩基のうちの１つ以上に対する化学修飾を含む。例えば、化学的に修飾されたＲＮＡは、化学合成を含むことができ、天然ヌクレオチドに類似しない修飾された糖、塩基、骨格、または官能基を含む高度に修飾されたモノマーを導入するために使用することができる。

したがって、一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、修飾された塩基を含む。一部の実施形態では、修飾されたＲＮＡには、以下、２－メトキシエトキシＡ、２－メトキシエトキシＭｅＣ、２－メトキシエトキシＧ、２－メトキシエトキシＴなどの２’－Ｏ－メトキシエチル塩基（２’－ＭＯＥ）のうちの１つ以上が含まれる。他の修飾された塩基には、例えば、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、およびフルオロ塩基が含まれる。様々なフルオロ塩基が既知であり、例えば、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ塩基が含まれる。様々な２’Ｏメチル修飾もまた、本明細書に記載の方法とともに使用され得る。例えば、以下の２’Ｏメチル修飾のうちの１つ以上を含む以下のＲＮＡを、記載の方法とともに使用することができる：２’－ＯＭｅ－５－メチル－ｒＣ、２’－ＯＭｅ－ｒＴ、２’－ＯＭｅ－ｒＩ、２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ｒＡ、アミノリンカー－Ｃ６－ｒＣ、アミノリンカー－Ｃ６－ｒＵ、２’－ＯＭｅ－５－Ｂｒ－ｒＵ、２’－ＯＭｅ－５－Ｉ－ｒＵ、２－ＯＭｅ－７－デアザ－ｒＧ。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、以下の修飾、ホスホロチオエート、２’Ｏ－メチル、２’フルオロ（２’Ｆ）、ＤＮＡのうちの１つ以上を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、３’および５’末端に２’ＯＭｅ修飾を含む。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、以下の修飾のうちの１つ以上を含む：２’－Ｏ－２－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ロック核酸、架橋核酸、アンロック核酸、ペプチド核酸、モルホリノ核酸。

一部の実施形態では、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、以下の塩基修飾のうちの１つ以上を含む：２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、シュードウラシル、Ｎ１－メチル－シュードウラシル、５’メチルシトシン、２’ピリミジノン（ゼブラリン）、チミン。

他の修飾された塩基には、例えば、２－アミノプリン、５－ブロモｄＵ、デオキシウリジン、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）、ジデオキシ－Ｃ、デオキシイノシン、ヒドロキシメチルｄＣ、反転ｄＴ、イソ－ｄＧ、イソ－ｄＣ、反転ジデオキシ－Ｔ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＣ、５－ニトロインドール、Ｓｕｐｅｒ Ｔ（登録商標）、２’－Ｆ－ｒ（Ｃ、Ｕ）、２’－ＮＨ２－ｒ（Ｃ、Ｕ）、２，２’－無水－Ｕ、３’－デソキシ－ｒ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、３’－Ｏ－メチル－ｒ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、ｒＴ、ｒＩ、５－メチル－ｒＣ、２－アミノ－ｒＡ、ｒスペーサー（脱塩基）、７－デアザ－ｒＧ、７－デアザ－ｒＡ、８－オキソ－ｒＧ、５－ハロゲン化－Ｕ、Ｎ－アルキル化－ｒＮが含まれる。

本明細書では、他の化学的に修飾されたＲＮＡを使用することができる。例えば、第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡは、例えば、５’，Ｉｎｔ，３’アジド（ＮＨＳエステル）、５’ヘキシニル、５’，Ｉｎｔ，３’５－オクタジイニルｄＵ、５’，Ｉｎｔ ビオチン（アジド）、５’，Ｉｎｔ ６－ＦＡＭ（アジド）、および５’，Ｉｎｔ ５－ＴＡＭＲＡ（アジド）などの修飾された塩基を含み得る。本明細書に記載の方法とともに使用され得るＲＮＡヌクレオチド修飾の他の例としては、例えば、５’リン酸化および３’リン酸化などのリン酸化修飾が挙げられる。ＲＮＡはまた、以下の修飾、アミノ修飾、ビオチン化、チオール修飾、アルキン修飾子、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、およびジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）のうちの１つ以上を有し得る。

アクセプターおよびドナーＲＮＡのライゲーション
一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、アクセプターＲＮＡとドナーＲＮＡとの間に形成されたループから設定された距離にあるライゲーション部位でライゲーションされる。例えば、ライゲーション部位は、アクセプターＲＮＡとドナーＲＮＡとの間に形成されたループから少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基対にある。一部の実施形態では、ライゲーション部位は、ループから２または３塩基対である。アクセプターＲＮＡとドナーＲＮＡとの間に形成されたループ構造は、長さの点で変化し得る。例えば、アクセプターＲＮＡとドナーＲＮＡとの間に形成されたループは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、ループ長さは、４である。４のループ長さは、本明細書ではテトラループと呼ばれる。一部の実施形態では、ループは、７つのヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、アクセプターおよびドナーＲＮＡは、アクセプターＲＮＡとドナーＲＮＡとの間に形成されたバルジから設定された距離にあるライゲーション部位でライゲーションされる。例えば、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡのライゲーションは、バルジから少なくとも約３、４、５、６、７、８、１０、１１または１２塩基対離れたライゲーション部位で行われる。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡのライゲーションは、バルジから３、４、５、または１１塩基対にあるライゲーション部位で生じる。

アクセプターＲＮＡとドナーＲＮＡとの間の塩基対形成は、下部ステムおよび／または上部ステムで生じ得る。したがって、一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、ヌクレオチド相補性を有する。ヌクレオチド相補性は、部分的であってもよく、例えば、アクセプターＲＮＡとドナーＲＮＡとの間の相補性は、約５０％～約９９％の相補性であってもよい。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、完全に相補的であるヌクレオチドを有する。

一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、約０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、または１：０．５の比で存在する。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、従来の合成方法を使用して産生されたｇＲＮＡと比較して改善された収率を有するｇＲＮＡの産生を可能にする。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って産生されるｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上改善する。

一部の実施形態において、上部および／または下部ステムのＧＣ含量は、ＲＮＡライゲーション反応の収率、産生性および純度に影響を与える。

一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、上部ステムにおいてＧＣ塩基対を含まない。

一部の実施形態では、単一のドナー断片を、様々なアクセプター断片とともに使用することができる。このようにして、ドナー断片は、様々なアクセプター断片の１つ以上の組合せで対形成し得るユニバーサルドナー断片として機能し得る。

一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、上部ステムにおいてＧＣ塩基対を含有するように操作される。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、上部ステムにおいて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＧＣ塩基対を含む。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、上部ステムにおいて２つのＧＣヌクレオチドを含む。本明細書に記載の例示的な上部ステムヌクレオチドとしては、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣ（配列番号１）、ＣＧＣＣＧ（配列番号２）、ＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号３）、ＣＧＣＧＣ（配列番号４）、およびＣＧＡＵ（配列番号５）が挙げられる。

一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、下部ステムにおいてＧＣ塩基対を含まない。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、下部ステムにおいてＧＣ塩基対を含む。

一部の実施形態では、アクセプターおよびドナーＲＮＡの濃度は、約１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、アクセプターおよびドナーＲＮＡの濃度は、得られるｇＲＮＡの収率、産生性および純度に影響を及ぼす。

一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、ＲＮＡライゲーション反応の収率または産生性に影響を与える。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃である。したがって、一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約１５℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約１６℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約１７℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約１８℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約１９℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２０℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２１℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２２℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２３℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２４℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２５℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２６℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２７℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２８℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約２９℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３０℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３１℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３２℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３３℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３４℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３５℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３６℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３７℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３８℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約３９℃である。一部の実施形態では、ライゲーション反応が生じる温度は、約４０℃である。

一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、完全な相補性を有する少なくとも２つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、下部ステムにおいて５つの標準的な塩基対を含む。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、下部ステムにおいて２つの非標準的な塩基対を含む。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、上部ステムにおいて２つの標準的な塩基対を含む。一部の実施形態では、アクセプターＲＮＡおよびドナーＲＮＡは、８個の塩基対を含む。一部の実施形態では、塩基対は、隣接していない。一部の実施形態では、塩基対は、隣接している。

ｇＲＮＡを使用する遺伝子編集
本明細書に記載の合成ｇＲＮＡは、標的遺伝子編集のための好適な遺伝子編集システムとともに使用することができ、これは、遺伝子サイレンシング事象、または所望の標的遺伝子の発現における発現の変化（例えば、増加または減少）をもたらすことができる。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ｇＲＮＡは、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、または標的化されたゲノム修飾のための方法で使用することができ、本方法は、真核細胞中に、（ａ）本明細書で定義される合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を導入することを含み、（ａ）および（ｂ）と染色体ＤＮＡにおける標的配列との相互作用が、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、または標的化されたゲノム修飾をもたらす。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡは、以下を含む遺伝子編集システムにおいて使用することができる。本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡであって、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列および標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるスペーサー配列を含む、合成ガイドＲＮＡ；遺伝子編集タンパク質であって、遺伝子編集酵素が、ＲＮＡガイドに結合し、ＲＮＡガイドに相補的な標的核酸配列の切断を引き起こすことができる、遺伝子編集タンパク質。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ＲＮＡは、以下を含む遺伝子編集システムで使用することができる。本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡであって、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列および標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるスペーサー配列を含む、合成ガイドＲＮＡ；ならびに遺伝子編集タンパク質ｈであって、遺伝子編集タンパク質がデアミナーゼに融合されており、遺伝子編集タンパク質融合が、ＲＮＡガイドに結合し、ＲＮＡガイドに相補的な標的核酸配列を編集することができる。

一部の実施形態では、本発明は、真核細胞中の標的核酸の発現を変化させる方法を提供し、細胞を遺伝子編集タンパク質および本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡと接触させることを含み、ＲＮＡガイドが、ダイレクトリピート配列および標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるスペーサー配列を含み、遺伝子編集タンパク質が、ＲＮＡガイドに結合し、ＲＮＡガイドに相補的な標的核酸配列の切断を引き起こすことができる。

一部の実施形態では、本発明は、真核細胞中の標的核酸の発現を変化させる方法を提供し、細胞を遺伝子編集タンパク質および本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡと接触させることを含み、ＲＮＡガイドが、ダイレクトリピート配列標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるおよびスペーサー配列を含み、遺伝子編集タンパク質が、ＲＮＡガイドに結合し、ＲＮＡガイドに相補的な標的核酸配列を編集することができる。

一部の実施形態では、本発明は、真核細胞中の標的核酸を修飾する方法を提供し、細胞を遺伝子編集タンパク質および本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡと接触させることを含み、ＲＮＡガイドが、ダイレクトリピート配列および標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるスペーサー配列を含み、遺伝子編集タンパク質が、ＲＮＡガイドに結合し、ＲＮＡガイドに相補的な標的核酸配列を編集することができる。

一部の実施形態では、遺伝子編集方法またはシステムは、部位特異的な様式で標的ＤＮＡを修飾するエフェクターを有する融合タンパク質を含み、修飾活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、またはヌクレアーゼ活性を含み、これらのうちのいずれかは、ＤＮＡまたはＤＮＡ関連ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＤＮＡ結合タンパク質）を修飾することができる。

一部の実施形態では、遺伝子編集方法またはシステムは、アデノシンまたはシトシン塩基を修飾することができ、部位特異的塩基エディターとして機能することができるデアミナーゼ酵素を含む、ヌクレオチド塩基を化学的に修飾することによってＤＮＡ配列を編集することができる酵素を有する融合タンパク質を含む。例えば、通常、ＲＮＡを基質として使用するＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９と融合した場合、一本鎖および二本鎖ＤＮＡに対して標的指向化され得、シチジンを直接ウリジンに変換し、ＴａｄＡ酵素は、アデノシンを脱アミノ化してイノシンにするように進化されてきた。したがって、デアミナーゼを使用する「塩基編集」は、１つの標的ＤＮＡ塩基の別の塩基へのプログラマブル変換を可能にする。様々な塩基エディターは、当該技術分野で知られており、本明細書に記載の方法およびシステムにおいて使用することができる。例示的な塩基エディターは、例えば、Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１８，１９（１２）：７７０－７８８に記載されており、その内容は、本明細書に援用される。

一部の実施形態では、塩基編集は、遺伝子をサイレンシングするための終止コドンの導入をもたらす。一部の実施形態では、塩基編集は、アミノ酸配列を改変することによって、改変されたタンパク質機能をもたらす。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの転写を調節する遺伝子編集方法またはシステムにおいて使用され得る。一部の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および長ｎｃＲＮＡを含む標的非コードＲＮＡの発現を調節する遺伝子編集方法またはシステムにおいて使用され得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、好適な遺伝子編集システムを使用してクロマチンループ構造の標的化された操作のために使用される。調節ゲノム領域間のクロマチンループの標的化された操作は、遺伝的欠陥を克服するか、または異常なエンハンサー－プロモーター接続を阻害するために、内因性クロマチン構造を操作し、新しいエンハンサー－プロモーター接続の形成を可能にする手段を提供する。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、有益な臨床バイリアントまたは抑制変異の挿入による病原性変異の修正のための遺伝子編集システムと併せて使用される。

治療用途
本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、様々な治療用途のための遺伝子編集システムにおいて使用され得る。したがって、一部の実施形態では、障害または疾患の治療を必要とする対象において障害または疾患を治療する方法が提供され、本方法は、対象に、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡを遺伝子編集システムとともに投与することを含む。様々な遺伝子編集システムが当該技術分野で知られており、例えば、とりわけＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ、Ｃａｓ１２、およびプライム編集Ｃａｓが含まれる。本明細書に記載の合成ｇＲＮＡは、任意の遺伝子編集システムとともに使用され得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集システムと併せて使用され、様々な疾患および障害、例えば、遺伝的障害（例えば、単一遺伝子疾患）、ヌクレアーゼ活性によって治療され得る疾患、ならびに様々ながんなどを治療し得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集システムと併せて使用され、（例えば、１つ以上の核酸残基を挿入、欠失、または変異させることによって）標的核酸を修飾するために標的核酸を編集し得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムが本明細書に記載の合成ｇＲＮＡとともに使用され、所望の核酸配列を含む外因性ドナーテンプレート核酸（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）を含む。ＣＲＩＳＰＲシステムで誘導される開裂事象が解消される際、細胞の分子機構は、外因性ドナーテンプレート核酸を開裂事象の修復および／または解消に利用する。代替的に、細胞の分子機構は、開裂事象の修復および／または解消において内因性テンプレートを利用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集システムと併せて使用され、標的核酸を変化させ、挿入、欠失、および／または点変異をもたらす。一部の実施形態では、挿入は、瘢痕のない挿入である（すなわち、開裂事象の解決時に追加の意図されない核酸配列をもたらさない、標的核酸への意図された核酸配列の挿入）。ドナーテンプレート核酸は、二本鎖または一本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。

一態様では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの過剰発現、毒性ＲＮＡ、および／または変異ＲＮＡ（例えば、スプライシング欠陥またはトランケーション）によって引き起こされる疾患を治療するために遺伝子編集システムと併せて使用され得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集システムと併せて使用され、様々な疾患を引き起こす、ＲＮＡ依存性機能に影響を及ぼすトランス作用変異を標的化し得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集システムと併せて使用され、スプライシング欠陥および疾患を引き起こし得るシス作用スプライシングコードを破壊する変異を標的化し得る。

本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、抗ウイルス活性、特にＲＮＡウイルスに対する遺伝子編集システムＣＡＮと併せて使用され得る。例えば、ウイルスＲＮＡ配列を標的化するために選択された好適な合成ＲＮＡガイドを使用して、ウイルスＲＮＡを標的化する。

本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集システムと併せて使用され、対象（例えば、ヒト対象）におけるがんを治療し得る。例えば、異常（例えば、点変異を含む、または代替的スプライシングされる等）でありがん細胞に見出されるＲＮＡ分子を標的化することにより、そのがん細胞における細胞死（例えば、アポトーシスを介して）を誘発することによる。

本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集システムと併せて使用され、対象における感染症を治療し得る。例えば、感染体細胞における細胞死を標的化し、誘導するために、感染体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫または原生動物）によって発現されるＲＮＡ分子を標的化することによる。本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集システムと併せて使用され、細胞内感染体が宿主対象の細胞に感染する疾患を治療し得る。

ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列中に挿入することが望ましい用途においては、挿入されるドナー配列を含むポリヌクレオチドも細胞に提供される。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」とは、部位指向性修飾ポリペプチドによって誘導される開裂部位に挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、開裂部位でのゲノム配列に対して十分な相同性、例えば、開裂部位に隣接する、例えば、開裂部位の約５０塩基以下以内、例えば、約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０塩基以内、約５塩基以内、または開裂部位に直接隣接するヌクレオチド配列と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を含有し、それと相同性を有するゲノム配列との間の相同性指向性修復を支持する。ドナーとゲノム配列との間の配列相同性のおよそ２５、５０、１００、もしくは２００個のヌクレオチド、または２００個超のヌクレオチド（または１０～２００個のヌクレオチドまたはそれ以上の任意の整数値）は、相同性指向性修復を支持するであろう。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上などであり得る。

ドナー配列は、典型的には、置換するゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同性指向性修復を支持するのに十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して、少なくとも１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、または転位を含み得る。一部の実施形態では、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の相同性指向性修復が標的領域に非相同配列の挿入をもたらすように、２つの相同領域と隣接する非相同配列を含む。ドナー配列はまた、目的のＤＮＡ領域に相同ではなく、目的のＤＮＡ領域への挿入を意図していない配列を含有するベクター骨格を含んでもよい。概して、ドナー配列の相同領域は、組換えが所望されるゲノム配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。特定の実施形態において、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％～１００％の任意の値の配列同一性が存在し得る。

ドナー配列は、ゲノム配列と比較して特定の配列の差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、開裂部位でのドナー配列の挿入の成功を評価するために使用され得るか、または場合によっては、他の目的のために（例えば、標的化されたゲノム遺伝子座での発現を示すために）使用され得る。場合によっては、コード領域内に位置する場合、かかるヌクレオチド配列の差異は、アミノ酸配列を変化させないか、またはサイレントアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響を与えない変化）を行う。代替的に、これらの配列の差異には、マーカー配列の除去のために後で活性化され得るＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などの隣接組換え配列が含まれ得る。

ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＲＮＡとして細胞に提供され得る。細胞内に直鎖状形態または環状形態で導入され得る。直鎖状形態で導入された場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレオチド分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３’末端に付加され、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端端にライゲーションされる。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ならびにＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間連結の使用が挙げられるが、これらに限定されない。直鎖状ドナー配列の末端を保護する代替として、配列の追加の長さは、組換えに影響を与えることなく分解され得る相同性の領域の外側に含まれてもよい。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー配列は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について上に記載されるように、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの薬剤と複合体化された核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＡＶ）によって送達され得る。

上に記載の方法に従って、エクスビボで目的のＤＮＡ領域を開裂および修飾、すなわち、「遺伝子組換え」し得る。一部の実施形態では、選択可能なマーカーが目的のＤＮＡ領域に挿入されている場合と同様に、細胞の集団は、遺伝子組換え細胞を残りの集団から分離することによって、遺伝子組換えを含むものに対して濃縮され得る。濃縮する前に、「遺伝子組換え」細胞は、細胞集団の約１％以上（例えば、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１５％以上、または２０％以上）しか構成しない可能性がある。「遺伝子組換え」細胞の分離は、使用される選択可能なマーカーに適切な任意の好都合な分離技術によって達成され得る。例えば、蛍光マーカーが挿入されている場合、細胞は、蛍光活性化細胞選別によって分離され得、細胞表面マーカーが挿入されている場合、細胞は、親和性分離技術、例えば、磁気分離、親和性クロマトグラフィー、固体マトリックスに親和性試薬が結合した「パニング」、または他の好都合な技術によって、不均一集団から分離され得る。正確な分離を提供する技術としては、蛍光活性化細胞選別機が挙げられ、これは、複数のカラーチャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの様々な程度の洗練を有することができる。細胞は、死細胞と関連する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって、死細胞に対して選択され得る。遺伝子組換え細胞の生存率に過度に有害でない任意の技術が用いられ得る。修飾されたＤＮＡを含む細胞に対して高度に濃縮された細胞組成物は、この様式で達成される。「高度に濃縮された」とは、遺伝子組換え細胞が、細胞組成物の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば、約９５％以上、または９８％以上であることを意味する。言い換えれば、組成物は、遺伝子組換え細胞の実質的に純粋な組成物であり得る。

本明細書に記載の方法によって産生される遺伝子組換え細胞は、直ちに使用され得る。代替的に、細胞を、液体窒素温度で凍結し、長時間保管し、解凍して再利用可能であり得る。かかる場合、細胞は、通常、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％の血清、４０％の緩衝培地、またはかかる凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般的に使用されるいくつかの他のかかる溶液中で凍結され、凍結された培養細胞を解凍するために当該技術分野で一般的に既知の様式で解凍される。

遺伝子組換え細胞は、様々な培養条件下で、インビトロで培養され得る。細胞は、培養で増殖し得る、すなわち、細胞の増殖を促進する条件下で増殖し得る。培地は、例えば、寒天、メチルセルロースなどを含有する液体または半固体であり得る。細胞集団は、通常、ウシ胎仔血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された、Ｉｓｃｏｖｅの改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０などの適切な栄養培地に懸濁され得る。培養物は、制御性Ｔ細胞が応答性である成長因子を含有し得る。本明細書で定義される成長因子は、膜貫通受容体に対する特定の効果を介して、培養物中または無傷の組織中のいずれかで、細胞の生存、増殖および／または分化を促進することができる分子である。成長因子には、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子が含まれる。

このように遺伝子組換えされた細胞は、例えば、疾患を治療するために、もしくは抗ウイルス薬、抗病原薬、または抗がん治療薬として、遺伝子治療などの目的のために、農業における遺伝子組換え生物の産生のために、または生物学的研究のために、対象に移植され得る。対象は、新生児、若年者、または成人であり得る。特に目的であるのは、哺乳動物の対象である。本方法で治療され得る哺乳動物種としては、イヌおよびネコ、ウマ、ウシ、ヒツジなど、ならびに霊長類、特にヒトが含まれる。動物モデル、特に小型哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラゴモルファ（例えば、ウサギ）など）を実験調査のために使用してもよい。

細胞は、対象に単独で、または、例えば、細胞が移植される組織内の細胞の成長および／または組織化を支持するための好適な基質もしくはマトリックスとともに、提供され得る。通常、少なくとも１×１０^３個の細胞、例えば、５×１０^３個の細胞、１×１０^４個の細胞、５×１０^４個の細胞、１×１０^５個の細胞、１×１０^６個以上の細胞またはそれ以上が投与される。細胞は、以下の経路、非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、または脊髄液中のうちのいずれかを介して対象に導入され得る。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。細胞はまた、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）を生成する目的のために、胚（例えば、胚盤胞）に導入されてもよい。

対象への治療の投与回数は変化し得る。遺伝子組換え細胞を対象内に導入することは、１回の事象であってもよいが、特定の状況においては、かかる治療は、限られた期間にわたって改善を誘発し、一連の継続的な反復治療を必要とする場合がある。他の状況においては、効果が観察される前に、遺伝子修飾細胞の複数回投与が必要とされる場合がある。正確なプロトコルは、疾患または状態、疾患のステージ、および治療される個々の対象のパラメータに依存する。

本発明の他の態様では、例えば、疾患を治療するために、または抗ウイルス薬、抗病原薬、もしくは抗がん治療薬として、遺伝子治療などの目的のために、農業における遺伝子組換え生物の産生のために、または生物学的研究のために、再び、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドが用いられ、細胞ＤＮＡをインビボで修飾する。これらのインビボ実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、個体に直接投与される。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、ペプチド、小分子および核酸の対象への投与のための当該技術分野におけるいくつかの周知の方法のうちのいずれかによって投与され得る。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、様々な製剤に組み込まれ得る。より具体的には、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤との組合せによって薬学的組成物に製剤化され得る。

薬学的調製物は、薬学的に許容されるビヒクルに存在する１つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを含む組成物である。「薬学的に許容されるビヒクル」とは、連邦または州政府の規制機関によって承認された、または米国においてリスト化されたビヒクルであり得る。

薬局方またはヒトなどの哺乳動物において使用するための他の一般に認められた薬局方。「ビヒクル」という用語は、哺乳動物に投与するために本発明の化合物が製剤化される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体を指す。かかる薬学的ビヒクルは、脂質、例えば、リポソーム、例えば、リポソームデンドリマー；水、ならびに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源のものを含む油、生理食塩水などの液体；アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤を使用してもよい。薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、微粒子剤、およびエアロゾル剤などの固体、半固体、液体または気体形態の調製物に製剤化され得る。したがって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの投与は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、眼内などの投与を含む様々な方式で達成され得る。活性剤は、投与後に全身性であってもよく、または、局所投与の使用、壁内投与、または移植部位に活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって局所的であってもよい。活性剤は、即時活性のために製剤化され得るか、または持続放出のために製剤化され得る。

いくつかの状態、特に中枢神経系の状態の場合、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するための薬剤を製剤化する必要がある場合がある。血液脳関門（ＢＢＢ）を介した薬物送達のための１つの戦略は、マンニトールまたはロイコトリエンなどの浸透手段によって、または生化学的にブラジキニンなどの血管作用性物質の使用によってのいずれかで、ＢＢＢの破壊を伴う。ＢＢＢ開口部を使用して特定の薬剤を脳腫瘍に標的化する可能性も１つの選択肢である。ＢＢＢ破壊剤は、組成物が血管内注射によって投与されるときに、本発明の治療用組成物と共投与され得る。ＢＢＢを通過するための他の戦略には、カベオリン１媒介性トランスサイトーシス、グルコースおよびアミノ酸担体などの担体媒介性トランスポーター、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介性トランスサイトーシス、ならびにｐ－糖タンパク質などの活性流出トランスポーターを含む、内因性トランスポーターシステムの使用を伴ってもよい。血管の内皮壁を横断する輸送を容易にするために、能動輸送部分もまた本発明において使用するための治療用化合物にコンジュゲートされてもよい。

代替的に、ＢＢＢの背後への治療薬の薬物送達は、局所送達、例えば、くも膜下腔内送達によってであってもよい。

典型的には、有効量のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドが提供される。エクスビボ方法に関して上で考察されたように、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効用量は、陰性対照、例えば、空のベクターまたは無関係なポリペプチドと接触させた細胞と比較して、２つの相同配列間で観察される組換えの量の２倍以上の増加を誘導する量である。組換えの量は、例えば、上に記載され、当該技術分野において知られているような、任意の好都合な方法によって測定され得る。投与されるＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効用量の計算は、当業者の技能の範囲内であり、当業者にとっては日常的である。投与される最終量は、投与経路および治療される障害または状態の性質に依存する。

特定の患者に与えられる有効量は、様々な要因に依存し、そのうちのいくつかは患者ごとに異なる。有能な臨床医は、必要に応じて疾患状態の進行を停止または逆転させるために、患者に投与する治療剤の有効量を決定することができるであろう。ＬＤ５０動物データ、および薬剤についての利用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体の最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内投与される用量は、治療用組成物が投与される流体のより大きい体積を考えると、髄腔内投与される用量よりも多い場合がある。同様に、治療濃度を維持するために、身体から急速に除去される組成物は、より高い用量で、または反復用量で投与されてもよい。通常の技術を利用して、有能な臨床医は、日常的な臨床試験の過程で特定の治療薬の投薬量を最適化することができるであろう。

薬剤に含めるために、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、好適な商業的供給源から入手し得る。一般的な提案として、用量当たりの非経口的に投与されるＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの総薬学的有効量は、用量応答曲線によって測定され得る範囲にある。

ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドに基づく療法、すなわち、治療的投与に使用されるＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの調製物は、無菌である必要がある。無菌状態は、滅菌濾過膜（例えば、０．２μηι膜）を通して濾過することによって容易に達成される。治療用組成物は、概して、滅菌取り出し口を有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルに配置される。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位指向性修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドに基づく療法は、水溶液として、または再構築のための凍結乾燥製剤として、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに保管され得る。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬのバイアルを、５ｍｌの滅菌濾過１％（ｗ／ｖ）の化合物の水溶液で充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、静菌注射用水を使用して凍結乾燥化合物を再構成することによって調製される。

薬学的組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与のための薬学的組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される希釈剤の薬学的に許容される非毒性の担体を含むことができる。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。加えて、薬学的組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療用、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含み得る。組成物はまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤ならびに洗剤などの、生理学的条件に近似する追加の物質を含み得る。

組成物はまた、例えば抗酸化物質などの様々な安定化剤のうちのいずれも含み得る。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの安定性を増強するか、またはそれ以外の場合、その薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させ、その毒性を低減し、溶解性または取り込みを増強する）様々な周知の化合物と複合体化され得る。そのような修飾または複合体化剤の例としては、サルフェート、グルコネート、シトレートおよびホスフェートが挙げられる。組成物の核酸またはポリペプチドはまた、それらのインビボ属性を増強する分子と複合体化され得る。そのような分子には、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質が含まれる。

薬学的組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。活性成分の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して治療的に有効な用量）を決定することを含む、細胞培養物および／または実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定し得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指標を示す療法が好ましい。

細胞培養および／または動物研究から得られたデータを、ヒトについての投薬量の範囲の製剤化において使用することができる。活性成分の投薬量は、典型的には、低毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内のラインである。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。

薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、高純度であることが好ましく、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（ＮＦ）グレード、概して少なくとも分析グレード、およびより典型的には少なくとも医薬グレード）。さらに、インビボでの使用を意図した組成物は、通常、無菌である。所与の化合物を使用する前に合成しなければならない範囲で、得られる産物は、典型的には、合成または精製プロセス中に存在し得る任意の潜在的な毒性剤、特に任意のエンドトキシンを実質的に含まない。親投与のための組成物はまた、無菌であり、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。

送達システム
本明細書に記載の合成ＲＮＡを、所望の遺伝子編集システム成分とともに、ベクター、例えば、プラスミド、および送達ベクターなどの様々な送達システムによって、目的の細胞に送達することができる。

本明細書に記載の合成ＲＮＡを、有機または無機であり得るナノ粒子によって送達することができる。ナノ粒子は、当該技術分野で周知である。任意の好適なナノ粒子設計を使用して、ゲノム編集システムの成分、またはかかる成分をコードする核酸を送達することができる。例えば、有機（例えば脂質および／またはポリマー）ナノ粒子は、本開示の特定の実施形態では、送達ビヒクルとして使用するのに好適であり得る。表１（以下）に、ナノ粒子製剤、および／または遺伝子導入に使用するための例示的な脂質を示す。

表２は、遺伝子導入および／またはナノ粒子製剤に使用される例示的なポリマーを列挙する。

表３は、本明細書に記載のＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドのための送達方法を要約する。

別の態様では、本明細書に記載の合成ｇＲＮＡを含むゲノム編集システムの送達は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に送達することによって達成され得る。ＲＮＰは、標的ｇＲＮＡとの複合体中に、核酸結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含む。ＲＮＰは、例えば、Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３３（１）：７３－８０によって報告されているように、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、またはカチオン性脂質媒介性の方法などの既知の方法を使用して細胞に送達され得る。ＲＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ塩基エディターシステムでの使用に有利であり、特に、トランスフェクトが困難な細胞（例えば、初代細胞）に有利である。加えて、ＲＮＰはまた、特に、ＣＲＩＳＰＲプラスミドにおいて使用され得る真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＥＦ１Ａ）が十分に発現していない場合、細胞内のタンパク質発現で生じ得る困難を緩和することができる。有利には、ＲＮＰの使用は、細胞内への外来ＤＮＡの送達を必要としない。さらに、核酸結合タンパク質とｇＲＮＡ複合体とを含むＲＮＰは、時間とともに分解されるため、ＲＮＰの使用は、オフターゲット効果を制限する可能性がある。プラスミドベースの技術の場合と同様の様式で、ＲＮＰを使用して、結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９バリアント）を送達し、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘導することができる。

ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載の合成ｇＲＮＡを含む）を駆動するために使用されるプロモーターは、ＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。これは、ベクター内の空間を占有し得る追加のプロモーターエレメントの必要性を排除するために有利であり得る。解放された追加の空間を使用して、追加のエレメント（例えば、ガイド核酸または選択可能なマーカー）の発現を駆動することができる。ＩＴＲ活性は比較的弱いため、選択されたヌクレアーゼの過剰発現による潜在的な毒性を低減するために使用することができる。

任意の好適なプロモーターを使用して、Ｃａｓ９および該当する場合、ガイド核酸の発現を駆動し得る。遍在的な発現の場合、使用され得るプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖などが挙げられる。脳または他のＣＮＳ細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、すべてのニューロンに対してシナプシンＩ、興奮性ニューロンに対してＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対してＧＡＤ６７もしくはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴなどが挙げられ得る。肝細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、アルブミンプロモーターが挙げられる。肺細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、ＳＰ－Ｂが挙げられ得る。内皮細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＩＣＡＭが挙げられ得る。造血細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＩＦＮβまたはＣＤ４５が挙げられ得る。骨芽細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＯＧ－２が挙げられ得る。

場合によっては、別個のプロモーターが、同じ核酸分子内の塩基エディターおよび適合するガイド核酸の発現を駆動する。例えば、ベクターまたはウイルスベクターは、塩基エディターをコードする核酸に作動可能に連結された第１のプロモーターと、ガイド核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターとを含むことができる。

ガイド核酸の発現を駆動するために使用されるプロモーターとしては、Ｕ６またはＨ１などのＰｏｌＩＩＩプロモーターが挙げられ得る。ｇＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を発現するには、ＰｏｌＩＩプロモーターおよびイントロンカセットを使用する。

Ｃａｓ９および合成ｇＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスまたは他のプラスミドまたはウイルスベクタータイプを使用して、米国特許第８，４５４，９７２号（アデノウイルスのための製剤、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号（ＡＡＶのための製剤、用量）、および米国特許第５，８４６，９４６号（ＤＮＡプラスミドのための製剤、用量）、ならびにレンチウイルス、ＡＡＶ、およびアデノウイルスを伴う臨床試験に関する臨床試験および刊行物からの製剤および用量を使用して送達され得る。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤、および用量は、米国特許第８，４５４，９７２号およびＡＡＶを伴う臨床試験と同様であり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤、および用量は、米国特許第８，４０４，６５８号およびアデノウイルスを伴う臨床試験と同様であり得る。プラスミド送達の場合、投与経路、製剤、および用量は、米国特許第５，８４６，９４６号およびプラスミドを伴う臨床試験と同様であり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）に基づくか、または推定され得、患者、対象、異なる体重および種の哺乳動物に対して調整され得る。投与頻度は、年齢、性別、全般的な健康状態、患者もしくは対象の他の状態、および対処される特定の状態もしくは症状を含む通常の要因に応じて、医師または獣医（例えば、医師、獣医）の範疇である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射され得る。細胞型特異的塩基エディターの場合、塩基エディターおよび任意のガイド核酸の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。

インビボでの送達の場合、ＡＡＶは、他のウイルスベクターよりも有利であり得る。場合によっては、ＡＡＶは低毒性を可能にし、これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る。場合によっては、ＡＡＶは、宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入変異誘発を引き起こす可能性が低くなる。

ＡＡＶは４．５Ｋｂまたは４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。４．５Ｋｂまたは４．７５Ｋｂを超える構築物は、ウイルス産生の著しい低下をもたらし得る。例えば、ＳｐＣａｓ９はかなり大きく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超え、ＡＡＶへのパッケージングが困難になる。したがって、本開示の実施形態は、従来のＣａｓ９よりも長さが短い開示されるＣａｓ９の利用を含む。

ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはそれらの任意の組合せであり得る。標的化される細胞に関してＡＡＶのタイプを選択することができ、例えば、脳または神経細胞を標的化するためのＡＡＶ血清型１、２、５、またはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはそれらの任意の組合せを選択することができ、心組織を標的化する場合、ＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の表は、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）に見出すことができる。

レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、分裂細胞と分裂終了細胞の両方において感染し、それらの遺伝子を発現する能力を有する。最も一般的に知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して、広範囲の細胞型を標的化する。

レンチウイルスは、以下のように調製することができる。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルス転写プラスミド骨格を含む）をクローニングした後、トランスフェクションの前日に、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを、１０％ウシ胎仔血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で、Ｔ－７５フラスコ内で５０％コンフルエンスに播種した。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞を、１０μｇのレンチウイルス導入プラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）および以下のパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトする：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）、および７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）。トランスフェクションは、カチオン性脂質送達剤（５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００および１００μｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で行うことができる。６時間後、培地を、１０％胎仔ウシ血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭに交換する。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清の方法が好ましい。

レンチウイルスは、以下のように精製することができる。ウイルス上清を４８時間後に回収する。上清は、最初にデブリを除去し、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターを通して濾過する。次いで、超遠心分離機で、２４，０００ｒｐｍで２時間スピンする。ウイルスペレットを、５０μｌのＤＭＥＭ中に、４℃で一晩再懸濁する。次いで、それらをアリコートし、－８０℃ですぐに凍結する。

別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく最小非霊長類レンチウイルスベクターも企図される。別の実施形態では、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）は、ウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであり、血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチンおよびアンジオスタチンを発現し、これは、網膜下注射によって送達されることが企図される。別の実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターの使用が企図される。

システムの任意のＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡまたはＣａｓ９コードｍＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達され得る。Ｃａｓ９コードｍＲＮＡは、インビトロ転写を使用して生成することができる。例えば、Ｃａｓ９のｍＲＮＡは、以下のエレメントを含むＰＣＲカセットを使用して合成することができる：Ｔ７プロモーター、任意のｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、ヌクレアーゼ配列、およびβグロビン－ポリＡテール由来の３’ＵＴＲなどの３’ＵＴＲ。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、Ｔ７プロモーター、続いて、配列「ＧＧ」、およびガイドポリヌクレオチド配列を含むカセットからのインビトロ転写を使用して転写することもできる。

発現を増強し、可能性のある毒性を低減するために、Ｃａｓ９配列および／またはガイド核酸は、例えば、シュードＵまたは５－メチルＣを使用して、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含むように修飾され得る。

本開示は、一部の実施形態では、細胞または生物を修飾する方法を包含する。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞の多くは、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類、またはマウス細胞であり得る。本開示の塩基エディター、組成物、および方法によって細胞に導入される修飾は、抗体、デンプン、アルコール、または他の所望の細胞出力などの生物学的産物の産生の改善のために細胞および細胞の子孫が変化されるようにすることができる。本開示の方法により細胞に導入される修飾は、細胞および細胞の子孫が、産生された生物学的産物を変化させる変化を含むようにすることができる。

システムは、１つ以上の異なるベクターを含むことができる。一態様では、Ｃａｓ９は、所望の細胞型、好ましくは真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞の発現のために、コドン最適化される。

概して、「コドン最適化」とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１または約１より大きい、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれ以上のコドン）を、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、目的の宿主細胞における発現を増強させるための核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、これは次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、概して、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用率表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００２年７月９日に参照）で入手可能な「コドン使用率データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方式で適合され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ： ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００” Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列を最適化するためのコドンに関するコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）も利用可能である。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはそれ以上のコドン、またはすべてのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。

パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ．２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を産生することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株にパッケージングすることができる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスで感染され得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進することができる。場合によっては、ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くために、かなりの量でパッケージ化されない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減され得る。

薬学的組成物
本開示の他の態様は、（例えば、本明細書に記載の合成ｇＲＮＡを含む）遺伝子編集システムを含む薬学的組成物に関する。「薬学的組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、薬学的使用のために製剤化された組成物を指す。一部の実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、追加の薬剤（例えば、特異的送達用、半減期の増加、または他の治療用化合物）を含む。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、化合物を体のある部位（例えば、送達部位）から別の部位（例えば、臓器、組織、または体の一部分）に運搬もしくは輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、または立体酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ））、または溶媒封入材などの、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」ものであり、対象の組織に害を及ぼさない（例えば、生理学的に適合する、無菌、生理学的ｐＨなど）。

薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの非限定的な例としては、以下が挙げられる：（１）乳糖、グルコースおよびスクロースなどの糖類、（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、（４）粉末トラガント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの潤滑剤、（８）ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物、（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの膨張剤、（２３）エタノールなどの血清アルコール、ならびに（２３）薬学的製剤に用いられる他の非毒性の適合性物質。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、および抗酸化剤も、製剤中に存在してもよい。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」、「ビヒクル」などの用語は、本明細書において互換的に使用される。

薬学的組成物は、製剤のｐＨを、生理学的ｐＨを反映する所定のレベルに（例えば、約５．０～約８．０の範囲に）維持するために、１つ以上のｐＨ緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤に使用されるｐＨ緩衝化合物は、アミノ酸、またはアミノ酸の混合物（例えば、ヒスチジン、またはヒスチジンおよびグリシンなどのアミノ酸の混合物）であり得る。代替的に、ｐＨ緩衝化合物は、好ましくは、製剤のｐＨを所定のレベルに（例えば、約５．０～約８．０の範囲に）維持し、かつカルシウムイオンをキレートしない薬剤である。かかるｐＨ緩衝化合物の例示的な例としては、イミダゾールおよび酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルに維持するのに好適な任意の量で存在してもよい。

薬学的組成物はまた、１つ以上の浸透圧調節剤、すなわち、製剤の浸透圧特性（例えば、張力、オスモラリティ、および／または浸透圧）を、レシピエント個体の血流および血液細胞で許容されるレベルに調節する化合物を含み得る。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であり得る。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節する、当業者に既知または利用可能な任意の化合物であり得る。当業者は、本発明の製剤で使用される所与の浸透圧調節剤の適合性を経験的に決定することができる。好適なタイプの浸透圧調節剤の例示的な例としては、塩（例えば、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウム）、糖（例えば、スクロース、デキストロース、およびマンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、ならびにこれらの薬剤および／または薬剤のタイプのうちの１つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節するのに十分な任意の濃度で存在してもよい。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、遺伝子編集のために、対象への送達のために製剤化される。本明細書に記載の薬学的組成物を投与する好適な経路としては、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、鼓室内、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、疾患部位に局所的に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって、対象に投与され、インプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜または繊維などの膜を含む、多孔性、非多孔性、またはゲル状物質である。

他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、制御放出システムにおいて送達される。一実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３；、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい。また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８： １９０、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｈ，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照されたい）。他の制御放出システムは、例えば、上記のＬａｎｇｅｒで考察されている。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、対象（例えば、ヒト）への静脈内または皮下投与に適した組成物として、通常の手順に従って製剤化される。一部の実施形態では、注射による投与のための薬学的組成物は、可溶化剤としての滅菌等張使用における溶液、および注射部位の疼痛を緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔剤である。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは単位剤形で一緒に混合されてのいずれかで供給される。医薬品が注入によって投与される場合、医薬品は、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて分注され得る。薬学的組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。

全身投与のための薬学的組成物は、液体、例えば、滅菌生理食塩水、乳酸リンゲル溶液、またはハンクス溶液であってもよい。加えて、薬学的組成物は、固体形態であってもよく、使用の直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も企図される。薬学的組成物は、脂質粒子または小胞（例えば、非経口投与にも好適なリポソームまたは微結晶）内に含まれ得る。粒子は、組成物がその中に含まれている限り、単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）または多層（ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ）などの任意の好適な構造の粒子であり得る。化合物は、融合脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５～１０ｍｏｌ％）の陽イオン性脂質を含む「安定化プラスミド脂質粒子」（ＳＰＬＰ）に封入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化され得る（Ｚｈａｎｇ Ｙ．Ｐ．ｅｔ ａｈ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９，６： １４３８－４７を参照されたい）。かかる粒子および小胞には、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルサルフェートまたは「ＤＯＴＡＰ」などの正に帯電した脂質が特に好ましい。そのような脂質粒子の調製は周知である。例えば、米国特許第４，８８０，６３５号、同第４，９０６，４７７号、同第４，９１１，９２８号、同第４，９１７，９５１号、同第４，９２０，０１６号、および同第４，９２１，７５７号を参照されたい（それらの各々は、参照により本明細書に援用される）。

本明細書に記載の薬学的組成物は、例えば、単位用量として投与または包装され得る。「単位用量」という用語は、本開示の薬学的組成物に関して使用される場合、対象のための単位投薬量として好適な物理的に分離された単位を指し、各単位は、必要な希釈剤（すなわち、担体またはビヒクル）と関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性物質を含む。

さらに、薬学的組成物は、薬学的キットとして提供され得、（ａ）凍結乾燥形態の本発明の化合物を含む容器、および（ｂ）薬学的に許容される希釈剤（例えば、本発明の凍結乾燥化合物の再構築または希釈に使用される滅菌物）を含む第２の容器を含む。任意選択的に、かかる容器に付随するものが、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定される形態の通知であってもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。

別の態様では、上に記載の疾患の治療に有用な材料を含む製造品（ａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）が含まれる。一部の実施形態では、製造品は、容器およびラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。一部の実施形態では、容器は、本明細書に記載の疾患を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈内輸液バッグまたはバイアルであり得る。組成物中の活性剤は、本発明の化合物である。一部の実施形態では、容器上の、または容器に付随するラベルは、組成物が、選択された疾患を治療するために使用されることを示す。製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。これには、商業および使用者の観点から望ましい他の材料がさらに含まれ得、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書が挙げられる。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載のＣａｓ９を含む）は、薬学的組成物の一部として提供される。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかを含む（例えば、ＬｕｂＣａｓ９を含む、本明細書に記載の核酸塩基エディターを含む）。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される複合体のいずれかを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｇＲＮＡとカチオン性脂質との複合体を形成するＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質複合体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｇＲＮＡ、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、カチオン性脂質、および薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加の治療活性物質を含むことができる。

キット
一態様では、本明細書に記載の合成ｇＲＮＡは、上記の方法および組成物に開示されるエレメントのうちのいずれか１つ以上を含有するキットによって提供され得、および／または産生され得る。例えば、キットは、アクセプターＲＮＡ、ドナーＲＮＡ、リガーゼ、および好適な緩衝試薬を含み得る。アクセプターＲＮＡ、ドナーＲＮＡ、およびリガーゼは、本明細書に開示される任意のものであり得る。

一部の実施形態では、キットは、核酸塩基エディターをさらに含む。

一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載のエレメントのうちの１つ以上を利用するプロセスで使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器に提供され得る。例えば、キットは、１つ以上の反応または保管緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態）で提供され得る。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない、任意の緩衝液であり得る。一部の実施形態では、緩衝液は、アルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、ｐＨが、約７～約１０である。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列および調節エレメントを作動可能に連結するように、ベクターに挿入するためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により援用される。加えて、材料、方法、および実施例は、例証にすぎず、限定するようには意図されていない。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料が本明細書に記載されている。

以下の実施例は、本発明の作製および実施の好ましいモードのいくつかを説明する。しかしながら、これらの実施例は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。

実施例１．ＲＮＡの伝統的な合成
ＲＮＡの伝統的な合成は、プラスミドＤＮＡの使用およびホスホロアミダイト化学（「合成ＲＮＡ」）を使用する固相合成を含む。合成ＲＮＡの化学合成および酵素ベースの合成の比較を以下に詳述する。

指向性
合成ＲＮＡは、典型的には、３’から５’方向に合成される。ｓｇＲＮＡについては、これは、ほとんどの副産物が、５’末端のスペーサー領域にトランケーションを有するものでありより低いオンターゲット編集につながることを意味する。

基質
化学合成は反応性の高いモノマーを利用する。これらのモノマーは、副反応を減少させるために官能基によって化学的に保護され、所望の反応が合成の正しい段階で生じることを確実にする。これらのモノマーは、それらの間で共通のホスホロアミダイト官能基を指して、「アミダイト」と称される。ホスホロアミダイトコアを取り囲む化学基は、大幅に修飾することができ、天然に存在するヌクレオチドに類似する必要はない。このため、化学合成は、天然ヌクレオチドに類似しない修飾された糖、塩基、骨格、または官能基を含むより高度に修飾されたモノマーを導入するために使用され得る。

連続的に
合成ＲＮＡは、典型的には、固体支持体上での配列制御重合を介して合成される。化学合成は、各々が様々なステップを含むサイクルで実施される（図１参照）。この手順は、望ましくないヌクレオチドの挿入または欠失を可能な限り防止するように設計されている。いずれかの段階で成長ポリマーに組み込まれることに失敗したオリゴは、それらが組み込まれることに「失敗した」配列の位置を越えて伸長することを防止するために、化学的に「キャップ」される。「カップリング効率」は、各サイクルの全体的な効率を指す用語である。この値は、アミダイトの性質に大きく依存するが、器具の設計または反応のスケールによって影響を受ける可能性もある。典型的なＤＮＡカップリング効率は、約９８～９９．５％であり、ＤＮＡについては、一般に、ＲＮＡよりも高い。

精製
オリゴ産物は、精製の前に最初に脱保護され、固体支持体から開裂される。精製は、典型的には、電気泳動分離（すなわち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または「ＰＡＧＥ」）、またはより一般的には、カラムクロマトグラフィー（すなわち、ＨＰＬＣ）のいずれかによって実施される。ＨＰＬＣは、陰イオン交換または逆相イオン対形成媒体のいずれかの固定相を使用して実施される。両方の方法は、全長産物の長さが増加するにつれて指数関数的に分解能を失う。精製後のＦＬＰとの混合物中の最も一般的な副産物は、全長産物と長さが類似するため、これは特に問題である。さらに、ＧＭＰグレードの材料に必要な大規模合成は、典型的には、より低いカップリング効率を特徴とし、研究目的の材料を産生するために使用される、より一般的に使用される小規模合成と比較して、純度が低下し、付加産物の数の増加をもたらす。カップリング効率の違いは、最も一般的には、合成スケールが増加するにつれて、より長いカップリング時間を必要とすることから生じる。長さが約１００ｎｔのオリゴ（すなわち、塩基編集に使用されるガイドＲＮＡ）は、わずか数ｎｔ短いだけのものから物理的に分離することが困難である。これらの制限に起因して、ＣＭＯ由来のｇＲＮＡの純度は、５０～９０％の範囲で得られることが最も多い。典型的な合成ｇＲＮＡ合成戦略の場合、残りの１０～５０％を含む不純物の大部分は、スペーサー領域中の欠失（主にトランケーション産物）および付加産物を含有する。これらのタイプの不純物は、編集効率の乏しさおよび／またはオフターゲット編集をもたらすであろう。

長いＲＮＡの産生のための改変プロセスの利点
化学合成によって高純度の長いＲＮＡ（例えば、１００ヌクレオチド以上）を産生する方法は、例えば、オフターゲット編集の減少、高効率の編集、伝統的な合成アプローチと比較した純度の増加、収率の増加、コストの低減、および合成されたＲＮＡにおけるヌクレオチドの修飾の汎用性を含むいくつかの理由で望ましい。

ＲＮＡを産生するための改変された化学合成アプローチは、オフターゲット編集の低減をもたらし得る。純度およびオフターゲット編集は相関している可能性が高い。オフターゲット編集とオンターゲット編集の両方を減少させると見られるトランケーション産物（主要な副産物）については、その逆を示唆する証拠がある。しかし付加産物はオフターゲット編集を増加させる可能性が高い。

ＲＮＡを産生するための改変された化学合成アプローチは、高効率の編集をもたらし得る。これは、少なくとも、ほとんどの不純物（例えば、トランケーション）が編集の活性を減少させるためである。

ＲＮＡを産生するための改変された化学合成アプローチは、伝統的な合成アプローチと比較して、純度の増加をもたらし得る。合成ＲＮＡの純度の増加により、ヒト患者を治療する用途のための規制機関の承認を受けやすくなるであろう。

ＲＮＡを産生するための改変された化学合成アプローチは、収率の増加およびコストの減少をもたらし得る。合成ＲＮＡプロセスの収率は、典型的には、合成ＲＮＡの長さとともに指数関数的に減少する。典型的には、２０～３０％の全長産物（ＦＬＰ）が反応で作製されるが、理論収率の３～５％しか精製後に得られない（したがって、反応で作製されたＦＬＰの＞９０％は、精製中に失われる）。例として、５グラムのＧＭＰグレードＦＬＰ（５０％純度で１０グラムの材料）についてのコストは、１００～２００万ドルの可能性がある。もしＦＬＰの大部分を精製中に単離することができれば、産生コストは５～１０倍減少し、純度の増加を伴うであろう。

最後に、ＲＮＡを産生するための改変された化学合成アプローチは、酵素的合成を使用しては不可能である、修飾されたヌクレオチドおよび化学的官能基を特異的に導入する能力を可能にすることができる。

実施例２：ＲＮＡの合成に対するライゲーションベースのアプローチ
本実施例に記載のライゲーションベースのアプローチは、１つ以上のＲＮＡ断片を使用し、続いてライゲーションして全長ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を作製する。１つ以上のＲＮＡ断片の作製は、とりわけ副産物の分離がより良好であるために、ｇＲＮＡのより高い精製後収率を可能にする。

ライゲーションベースのアプローチの一態様は、生物学において使用されるデュアルガイドＲＮＡシステムを構成するｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ分子との間に形成されるヘリックス（リピートアンチリピートヘリックスとして知られる）を使用して、２つの合成ＲＮＡの酵素ライゲーションのテンプレートとする。これを図２に示す。

一部の実施形態において、このヘリックスの長さおよび配列組成は、適切な非共有結合の会合を促進し、ＲＮＡライゲーションと適合する酵素のための最適なライゲーション部位を作製するように改変される。５～５０個のヌクレオチド長さは、これらのタイプの会合に望ましい。一部の実施形態では、ドナー核酸塩基がＣであり、アクセプターがＡである場合、酵素ライゲーションがより効率的となり得る。一部の実施形態では、非共有結合で会合したＲＮＡのＴｍ（融解温度）は、０℃より大きく、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１２℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、またはそれ以上である。例えば、ステムの長さは、ライゲーションが実施される温度より上でのステムループの形成を促進し、かつライゲーション非適合性自己構造を回避するのに十分な長さに改変され得る。さらなる例として、スペーサー配列の可変性により、ライゲーションと適合しない塩基対形成がもたらされる可能性があるが、これは、ドナー配列と組み合わせる前にスペーサー配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを添加することによって回避することができる。

一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡが、５’末端にホスフェートを有して合成され（「ドナー」と呼ばれる）、それが複数のリガーゼのうちの１つによって、可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡの３’末端（「アクセプター」と呼ばれる）にライゲーションされる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分が５’末端にホスフェートを含有するように合成される。

このアプローチでは、２つの形態のライゲーションが可能であり（図３のパネルＡ（１）および（２））、これらの両方は、ステムループ領域内に見出される。第１の形態のライゲーションは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１の自然部位であるヘアピンの末端ループ内で生じる。第２の形態のライゲーションは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２およびＤＮＡリガーゼにとって自然である二本鎖内で生じる。この形態のライゲーションの利点のうちの１つは、融合ｇＲＮＡと断片不純物との間の溶出時間の顕著な差異のために、断片不純物が容易に除去可能であることである（図３のパネルＢ）。

本発明の別のライゲーションベースのアプローチは、非テンプレート化アプローチを介した２つ以上のＲＮＡ断片のライゲーションを伴う。このアプローチでは、ドナー分子の３’末端の３’ヒドロキシルが化学的にブロックまたは除去され（例えば、ジデオキシヌクレオチド）、酵素（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１）が２つの分子間の適切なライゲーションを触媒する。概して、このライゲーション戦略は、より高い濃度で好まれる。

この実施例に記載されるライゲーションアプローチは、核酸のセクションを互いに組み合わせる酵素のクラスであるリガーゼを使用する。このようなリガーゼを使用する利点は、得られるＲＮＡの断片間の連結が、天然に存在するＲＮＡやＤＮＡと区別できないことである。リガーゼはＲＮＡまたはＤＮＡに対して機能し、高効率で反応を実施する。

一部の実施形態では、ライゲーションのために意図されるＲＮＡ断片は、第１および第２のＲＮＡ断片に対する相補性を有する核酸テンプレートの使用によって、ライゲーション反応のために物理的に近接するようにすることができる。本テンプレートは、本明細書では、スプリントと称される。スプリントは、特定のリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１によるライゲーションに適したループを生成するように、不完全な塩基対形成で設計され得る。一部の実施形態では、スプリントは、２つより多くのＲＮＡ断片を一緒にするために使用される。

一部の実施形態では、ＲＮＡ断片は、ライゲーション反応の前に互いに塩基対形成することによって会合することができる。本アプローチは、本明細書において「自己テンプレート化」と称される。自己テンプレート化アプローチを使用したＲＮＡ断片のライゲーションのために選択され得るステムループの位置としては、ループ、または、オリゴのうちの１つが短いステムループを含むヘリックス（例えば、自己テンプレート化ニック）が挙げられる。スプリント、オーバーハング、平滑末端にニックを含めることもでき、バルジも使用され得る（図５参照）。

一部の実施形態では、ライゲーション反応は、事前にＲＮＡセクションの物理的会合を必要とせずに、高収率で進行することができる。このことを考慮すると、選択されたライゲーション反応は、スプリントまたは自己テンプレート化の使用を必要としない。

本発明の異なるライゲーションアプローチを図５に示す。

本明細書に記載のライゲーションに基づくアプローチを使用して、様々なライゲーション設計が調べられている（図６）。図６に示すように、これらの設計のうちの１つは、ステムループのループでの２つのＲＮＡ断片のライゲーションを伴う（図６、パネルＢ）。別の設計は、ステムループのヘリックスにおけるライゲーションを伴う（図６のパネルＣ）。

これらのライゲーション戦略は、記載されるライゲーション戦略がライゲーション部位において天然のホスフェート連結を形成するため、ｓｇＲＮＡの合成に使用される他の報告される化学ライゲーション戦略とは異なる。セグメント化された合成アプローチを使用する利点は、完全長ｓｇＲＮＡと比較してＲＮＡの短いセクションは精製後により高い純度で産生し得ることである。一部の実施形態では、５’アクセプターは、最小のＲＮＡ断片（３０～５０ヌクレオチド）であり、したがって、ライゲーションの前に高レベルまで精製することができる。３’ドナーは、合成に必要なホスフェートを有して終結され、したがって、完全長断片のみが全長産物に組み込まれる（すなわち、トランケーションは基質とならない）。

ｐｅｇＲＮＡまたはＣａｓ１２ｂ ｇＲＮＡなどの１００ヌクレオチドより大きいｇＲＮＡを考慮する場合に、この利点は増大する。酵素ライゲーションのタイプは、非常に高い収率（＞８０％）であり、オリゴヌクレオチド出発物質は、高い選択性でライゲーションされた産物から分離され得、全長産物が非常に純粋であることを保証する。さらに、これらのタイプの酵素性ライゲーションは、比較的安価であり、スケール化しやすい。

実施例３：例示的なライゲーションベースのＲＮＡ合成プロトコル
合成ＲＮＡの合成のための例示的なプロトコルを以下に提供する。

１．ステムのサイズおよびライゲーション部位（ループまたはヘリックス）は、ｉ）使用されるリガーゼの天然基質についての要件（例えば、ループ対ヘリックス設計）ならびにｉｉ）ＲＮＡ二本鎖安定性についての熱力学的アルゴリズムを使用して決定される二分子ヘリックスの親和性に基づいて選択される。

２．ＲＮＡ断片は、標準的なホスホロアミダイト化学を使用して合成される。３’ＲＮＡ断片（ドナー）は、合成の最後のステップに含まれる末端５’ホスフェートを含有する。

３．ＲＮＡ断片をＨＰＬＣによって精製する（断片は、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）またはイオン対逆相クロマトグラフィー（ＩＰ－ＲＰ）のいずれかを使用することによっても精製され得る）。

４．アニーリング：各オリゴヌクレオチド（０．０１～１ｍＭ）をアニーリング緩衝液（２５ｍＭのＫＣｌ、０．０２５ｍＭのＥＤＴＡ）と組み合わせる。８０℃に０．５～５分間加熱し、０．１℃／秒で２５℃まで冷却する。

５．ライゲーション：ＲＮＡリガーゼ緩衝液を添加して、１Ｘ濃度（２０～３７℃の温度で５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．５）を達成する。５～１０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ１／ｎｍｏｌリン酸化５’末端を添加する。２０～３７℃の温度で一晩培養する。０．５ＭのＥＤＴＡを添加して停止する。

６．イオン対逆相クロマトグラフィー（ＩＰ－ＲＰ）（潜在的にはＡＥＸも）による精製が使用される。

７．ＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色した６％ＰＡＧＥ－ＤゲルおよびＩＰ－ＲＰ ＨＰＬＣによる分析。

ライゲーション実験の例示的な結果を図７に示す。このライゲーションの場合、反応物は、１０μＭのドナー断片、１０μＭのアクセプター断片、１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２反応緩衝液（ＮＥＢ）、および２０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を含有し、３７℃で実施された。図７のパネルＡは、ライゲーション実験に使用された配列を示す。ステムライゲーションの結果を図７のパネルＣに示す。全長産物をＨＰＬＣによって検出し、全長産物からのＲＮＡアクセプターおよびドナー断片の分離もＨＰＬＣによって検出された。

実施例４：記載されたアプローチと先の方法との間の差異
とりわけ、以前に記載されたライゲーションアプローチが、断片ＲＮＡ分子間の非天然の連結に依存していること、および／またはアジド－アルキン環化反応の使用を介して、非天然チラゾール連結を介してより小さいＲＮＡ分子をｓｇＲＮＡにカップリングするなどの非テンプレート化ライゲーションアプローチを使用していることから、本発明のライゲーションアプローチは、以前に記載されたＲＮＡライゲーションアプローチとは異なる。前述のような非天然の連結の使用は、非天然の連結が生物学的システムにおいて望ましくない効果を有し得る可能性を含めいくつかの欠点を有する。

本明細書に記載のライゲーションアプローチは、「クリック化学」の他のバージョンまたは他の化学生体複合体法を使用してＲＮＡ断片を完全長ｓｇＲＮＡに組み合わせる以前に使用された化学ライゲーション戦略とも異なる（図４参照）。ＲＮＡ断片を組み合わせるための他の以前に記載されたアプローチとしては、アミド－ライゲーション化学（例えば、アミドによる１８原子リンカーのカップリング）および自己テンプレート化を使用してｓｇＲＮＡを形成することが挙げられる。先のアプローチは、少なくとも以下の理由により不利である。ｉ）ライゲーションに使用される化学基は、本明細書に記載の本発明におけるホスフェートの組込みとは異なり、高収率で組み込まれる可能性が低い。ｉｉ）以前に使用された連結は非天然であり、天然のホスホジエステル連結よりも顕著に大きい。これらの制限のため、以前に記載されたＲＮＡライゲーションアプローチは、効力を損ない、さらなる規制上の負荷をもたらす可能性がある。

実施例５：ｓｇＲＮＡの産生－リガーゼの比較
この実施例では、２つの構築物、すなわち一方はループにおいてライゲーションが生じ、他方はステムにおいてライゲーションが生じる（図３）構築物を評価して、どのリガーゼがｓｇＲＮＡ産物の最高収率をもたらしたかを決定した。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１をループでのライゲーションに使用し、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２をステムでのライゲーションに使用した。

図３のパネルＡは、評価された酵素ライゲーションのための２つの位置を示す。（ｉ）ステムループのループ、および（ｉｉ）ヘリックス。両方の場合において、このステムループは伸長され、酵素ライゲーションのためにセクションを会合させることに使用された。図３のパネルＢは、ライゲーション後に、ライゲーションしなかったＲＮＡ断片を除去するために、ＨＰＬＣを含む最終精製ステップを行うことができることを示す代表的なグラフを示す。全長産物からのＲＮＡ断片の精製が可能である。

合成ＲＮＡの純度および最終的な（精製後の）収率を制限する課題を克服する、化学的および酵素的な組合せの戦略を使用して単一ガイドＲＮＡを合成するためのプロセスを開発した。このアプローチは、L.O.N.G.E.S.T.（酵素および自己テンプレート化を使用した核酸ガイドのライゲーション、ligation of nucleic acid guides using enzymes and self-templating）と呼ばれ、部分的に相補的な２つ以上の合成ＲＮＡが酵素を使用してライゲーションされるライゲーションベースのアプローチを使用する。一実施形態では、生物学においてＳｐＣａｓ９によって使用されるデュアルガイドＲＮＡシステムを構成するｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ分子との間にヘリックス（リピートアンチリピートヘリックスとして知られる）が形成されて、２つの合成ＲＮＡの酵素ライゲーションがテンプレート化される（図３）。このヘリックスの長さおよび配列組成は、適切な非共有結合会合を促進し、ＲＮＰ複合体の活性を減少させることなく、ＲＮＡライゲーションと適合する酵素のための最適なライゲーション部位を作製するように改変され得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の大部分を含むＲＮＡは、５’末端にホスフェートを有して合成され（ドナーと呼ばれる）、これがＴ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２のいずれかによって、可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡの３’末端（アクセプターと呼ばれる）にライゲーションされる。このアプローチとともに、２つの形態のライゲーションが例示され（図３）、第一は、ヘアピンの末端ループ内（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１の基質）、第二は、二本鎖内（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２およびＤＮＡリガーゼの基質）である。

これらの実験では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ２の両方、ならびにドナー／アクセプターＲＮＡ断片の設計を評価した。これらのｇＲＮＡのプロトスペーサーは、アルファ１であった。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１と比較して、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２が、最高収率および最小限の副産物を産生したと判断された。また、「標準的な」ｇＲＮＡ設計と比較して、最終的なｓｇＲＮＡ産物に２つの塩基しか追加せず、ここで調べた条件下でｓｇＲＮＡの定量的収率を産生するドナー／アクセプター設計も見出された。

実験条件。
Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を含有するすべての反応は、１０μＭのドナー、１０μＭのアクセプター、１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２反応緩衝液、および２０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を含有した。すべての反応を３７℃で１５時間実施した。

Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１との反応の場合は、すべての反応は、１０μＭのドナー、１０μＭのアクセプター、ＮＥＢ反応緩衝液、１ｍＭのＡＴＰ、および２０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼ１を含有した。いくつかの反応はまた、２５％（重量／体積）のＰＥＧ８０００を含有した。反応を２５℃で１５時間実施した。

すべての反応をサーモサイクラー中、５０μＬで実施した。ライゲーション前の複合体を形成するために、まず、リガーゼを除くすべての成分を含む溶液を７０℃まで加熱し、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ１について、それぞれ３７℃または２５℃のいずれかまで０．１℃／秒でゆっくりと冷却した。

ＲＮＡドナーおよびＲＮＡアクセプター設計－Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ２
ＲＮＡアクセプター１（Ａｃｐ－０１）およびＲＮＡドナー１（Ｄｎｒ－１）からなるステムライゲーション設計を最初に評価した。テトラループのライゲーション後ヘリックスは、混合されたＧＣＡＵ含量を有する上部ヘリックスにおいて合計１４個の塩基対（ライゲーション前の複合体中の断片間に１０塩基対）を含有した（図８のパネルＡ）。この反応は、高収率であり、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２が存在する試料中で、検出可能な量の断片がほとんどないか、または全くなかった（図８のパネルＢ）。リガーゼとＤｎｒ－０１またはＡｃｐ－０１とのみを用いた対照反応（図示せず）は、副反応の形成を示さなかった。

評価された別のＲＮＡドナーおよびＲＮＡアクセプターの設計は、ＲＮＡアクセプター２（Ａｃｐ－０２）およびＲＮＡドナー２（Ｄｎｒ－２）のヘリックスライゲーション設計であった。ライゲーション後のヘリックスは、混合されたＧＣＡＵ含量を有する上部ヘリックスにおいて１４個の塩基対を含有した（図９のパネルＡおよびＢ）。この反応は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２による反応よりも低い収率（約６０％）であった。リガーゼおよび（リン酸化された）Ｄｎｒ－０２のみを用いる対照反応（図示せず）は、副反応の形成を示した（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１でＤｎｒ－０２の環化が可能である）。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は二本鎖複合体を必要とするため、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の存在下でのＡｃｐ－０２とＤｎｒ－０２との間の反応は産物を形成しなかった。これらの実験から得られたデータは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１よりもＴ４ ＲＮＡリガーゼ２が望ましくなり得ることを示唆している。残りのデータは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を使用して生成した。

ＲＮＡドナーおよびＲＮＡアクセプター設計－ＧＣ含量およびステムヌクレオチド長さの影響
初期のＤｎｒ－０１／Ａｃｐ－０１テトラループ設計と比較して、以下の特徴を共有する２つのＲＮＡ構築物を評価した。ｉ）上部および下部ステムにおけるより高いＧＣ含量、ならびにｉｉ）より短い上部ステム（図１０のパネルＡ～Ｄ）。下部ステムは、Ｃａｓ９と相互作用すると理解されているが、以前の報告では、Ｕトラックの４つの塩基のうちの３つが、ＧＣ塩基対によって置き換えられ得ることが示されている。これらの置換を有するｓｇＲＮＡを評価し、活性ではあるが、それらの活性は、標準的なｓｇＲＮＡ設計のものよりも低いことが見出された。

データは、Ａｃｐ－０３とＤｎｒ－０３との間のリガーゼを用いた反応が、産生的であり、高収率の合成と適合性があることを示した。Ａｃｐ－０４とＤｎｒ－０４との間のリガーゼを用いた反応は、産生的であり、Ｄｎｒ－０４ピークの喪失によって示されるように、完了に向かうように見えた。Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０４システムは、７塩基対短いが依然として産生的であり、Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０１システムよりも著しい進歩を示す。

底部ステムのＵトラックをＧＣ塩基対で部分的に置き換えたｇＲＮＡを使用する研究（Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０３およびＡｃｐ／Ｄｎｒ－０４について示されるように）での編集が減少するという結果の後、底部ステムのＵトラックを変更せず、かつ、より短い上部ステムを含んだ設計を評価した（図１１）。Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０３のライゲーションから形成されたｓｇＲＮＡのものと類似の上部ステム配列を有する設計（Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０６）もまた調べたが、ライゲーション部位は、テトラループからさらに１ｂｐ離れた位置に配置された。

データは、Ａｃｐ－０５とＤｎｒ－０５との間のリガーゼを用いる反応が、Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０４反応システムと同様に産生的であることを示し、これらの初期の設計における下部ステムループにおけるより高いＧＣ含量が、（少なくともアルファ－１プロトスペーサーを用いる）定量的反応に必要ではないことを示した。Ａｃｐ－０６とＤｎｒ－０６との間のリガーゼを用いる反応もまた、産生的であった。上部ステムループは、ライゲーション部位の位置のみが変化するＡｃｐ／Ｄｎｒ－０３のものに類似していたため、これらの結果は、テトラループから少なくとも３塩基対離れたライゲーション部位が、効率的なライゲーションを可能にすることを示す。Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０６システムは単一の追加の塩基対を有するのみであるため、「標準的な」ｓｇＲＮＡ設計に対して最小の変更が高収率合成に適合性があることを実証した。

「標準的な」ｓｇＲＮＡ設計を調べ、それがライゲーションと適合するかどうかを調べた（図１２）。上部ステムループは４つの塩基対のみを含有するため、ライゲーション部位は、テトラループからちょうど２塩基対離れて含まれた。リガーゼの存在下でのＡｃｐ－０７とＤｎｒ－０７との間の反応は、低収率であった（図１３）。さらなる副反応も存在し、よく会合した二本鎖が高収率反応のために有用であることをさらに示す。

また、同じドナー断片（Ｄｎｒ－０５）を使用して、ドナーとアクセプター断片との間の自己会合に必要とされないプロトスペーサー配列においてのみで変化する２つの異なるアクセプター断片（Ａｃｐ－０５およびＡｃｐ－０５＿ｖ２）とのＲＮＡライゲーション反応を行った。これは、様々なアクセプター断片と組み合わせてユニバーサルドナーを使用する概念を示す。

ＲＮＡドナーおよびＲＮＡアクセプター設計－ＲＮＡ濃度が反応の産生性に及ぼす影響
反応の産生性に対するＲＮＡ濃度の影響を評価するために研究を実施した。これらの研究では、Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０５およびＡｃｐ／Ｄｎｒ－６を使用した。Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０５は、Ａｃｐ／Ｄｎｒ－６と比較して、より安定なアクセプター／ドナー二本鎖を有する。これらの研究では、両方の断片の濃度は、ｓｇＲＮＡ産生性の産生性に関連しているとして評価された（図１３）。データは、より安定したＡ／Ｄ二本鎖を有することにより、より高い濃度の基質でより高い収率を可能にすることを示す。

これらのデータに基づいて、１ｍｇ／ｍｌ以上が製造に好適な濃度であり得る。また、ライゲーション反応の温度もデータに影響を及ぼすであろう（ここで記載したすべての実験は３７℃で実施されたことに留意されたい）。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は、２０℃で有効であることも示されている。図１３は、収率がおよそ８０％で最大となることを示しているが、これは、ドナー断片からくる、ライゲーションとは適合しないが出発物質の吸収には寄与するトランケーションのような副産物があるためであり得、従ってこの値は過小評価である可能性がある。

ｓｇＲＮＡの産生性に対する熱力学的影響
試験した条件下では、（長さおよび／またはＧＣ含量を増加させることによって形成される）より熱力学的に安定な二本鎖は、ある程度まではより高い収率を提供したが、「標準」設計に対するこれらの変更は、産物を形成するために必要ではなく、６０％が依然として得られる。ただし、適度な改変のみではるかに高い収率を可能にすることができる。この利点は、１および１０追加ｂｐの両方が同様の収率を提供し、一方、上部ヘリックスに４ｂｐを有する「標準」ｓｇＲＮＡデザインの収量は上部ヘリックスにわずか１追加ｂｐを使用した場合（ＡＤ－０６）よりも顕著に低いという結果からもわかり得るように、わずか１追加ｂｐで限界に近づくので、直線的に拡大しない。

注目すべきは、ここに記載の研究のすべては、３７℃で実施され、このＴ４ ＲＮＡリガーゼ２は、より低い温度も耐容し得、そうであるならば、「標準的な」４ｂｐの上方ヘリックスでより低い温度での高い収率が可能である可能性が高いことである。したがって、条件を変更すると、会合のエネルギー論に変更が生じる。したがって、ＲＮＡ設計について外的または固有であるものを含む様々なパラメータを使用して、この目的を得ることができる。これらの条件には、例えば、反応温度およびＲＮＡの濃度の変化が含まれる。

結論
これらのデータは、L.O.N.G.E.S.T.アプローチに使用する断片およびリガーゼの設計ルールを確立した。特に、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１よりも収率が高く、副反応が少なく産生することが見出された。また、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は、テトラループから３つ以上の塩基対離れたライゲーション部位を有する二本鎖基質を受け入れることも見出された。また、高収率であり、標準的なｓｇＲＮＡ設計のものと比較して１つの追加の塩基対のみを含有する断片設計（Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０６）も見出された（それぞれ１０２ヌクレオチド対１００ヌクレオチド）。さらなる研究は、このシステムでの編集活性および反応のスケールアップに関してＡｃｐ／Ｄｎｒ－０６設計を評価することを目的とする。

実施例６：骨格修飾に対する寛容および温度寛容
骨格修飾に対する寛容
様々な断片を分析して、骨格修飾に対する寛容を決定した。以下の断片が分析された。ｉ）完全なＲＮＡ、ｉｉ）末端に２’Ｏ－メチル基およびホスホロチオエート基を含有するもの、典型的には「末端ＭＯＤ」と称される、ならびにｉｉｉ）ライゲーション部位での修飾（５’ドナーヌクレオチドおよび３’アクセプターヌクレオチドの両方）を含め、２’Ｏ－メチル基で修飾された４８個のヌクレオチド（４８％）を含有する配列。Ａｃｐ／Ｄｎｒ－０５およびＡｃｐ／Ｄｎｒ－６設計に基づく２組の修飾されたガイドが試験された（それぞれＡＤ＿０９およびＡＤ＿０８）。これらの研究からのデータを図１４のパネルＡおよびＢに示す。これらのデータは、全体として、広範囲に修飾された断片の成功裏の反応を示している。

温度に対する寛容
ｓｇＲＮＡを２０℃および３７℃のいずれかで産生した。これらの実験から得られたデータは、試験した温度のいずれでの反応も産生的であることを示した。反応が２０℃（室温）でも機能しているという知見は、反応が堅牢であり、製造を容易にする温度で働くことができることを示す。

実施例７：細胞における塩基編集
精製された産物についての、特定の遺伝子標的に対する塩基編集活性を、哺乳動物細胞において成功裏に実施した。これらのデータは、それぞれ、Ａｃｐ－０５およびＤｎｒ－０５、Ａｃｐ－０６およびＤｎｒ－０６、ならびにＡｃｐ－０８およびＤｎｒ－０８の反応からの、ＤＡ－０５、ＤＡ－０６およびＡＤ－０８を使用して得られた。（図１５）。これらの研究のために、線維芽細胞における標的部位を、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）と自己テンプレート化ライゲーション方法を使用して合成した３つのガイドＲＮＡ（ＡＤ－０８、ＡＤ－０５、ＡＤ－０６）のうちの１つとを使用して編集した。

実施例８：Ｃａｓ１２ｂガイドＲＮＡ
本明細書に開示される方法を使用して、Ｃａｓ１２ｂ ｓｇＲＮＡを合成することができる。図１６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ、ｂｈＣａｓ１２ｂ ｓｇＲＮＡからの例示的なＣａｓ１２ｂ ｓｇＲＮＡと関連する配列および構成を示す概略図である。テトラループなどの様々な二次構造を含む様々な特徴を、所望のＣａｓ１２ｂ ｓｇＲＮＡを作製するための分割およびライゲーションの標的として使用することができる。

図１６は、本明細書に記載の方法に従って、ｓｇＲＮＡを分割し、続いてその後のライゲーションを標的化し得る、様々な例示的な位置を示す。図１６は、可変プロトスペーサー領域および不変領域の両方を含有する、ｂｈＣａｓ１２ｂ ｓｇＲＮＡの二次構造を示す。標識Ａ、Ｂ、およびＣは、ｓｇＲＮＡを分割する位置として標的化され得るヘアピンループ構造を示す。Ｃとして標識されたヘアピンの二本鎖は、このテトラループはＣａｓタンパク質に接触しないためそのループ近位位置で伸長されてドナーおよびアクセプターのハイブリダイゼーションを促進させることができる。

配列
表４（以下）は、実施例および対応する図面で参照される配列を示す。

ｍＮは、２’ＯＭｅ修飾を有するヌクレオチドを示し、Ｎ＊は、３’ホスホロチオエート修飾を有するヌクレオチドを示し、「ｐ」は、ホスフェート基を有する位置を示す。

同等物および範囲
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、またはただ通常の実験を使用するだけで確認することができるであろう。本発明の範囲は上記の説明に限定されることが意図されるものではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

Claims (123)

1. 第１のＲＮＡを第２のＲＮＡと接触させ、
   前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、相補的である少なくとも５つのＲＮＡヌクレオチドを含み、前記接触させることが、ステム構造またはステムループ構造を形成することと、
   ライゲーション酵素で、前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡを、
   （ｉ）前記ステム構造内でライゲーションするか、または
   （ｉｉ）前記ステム構造の末端でライゲーションし、それによって前記ステム構造の末端でループを形成することと、
   を含む、方法。
2. 前記接触させることが、ステム構造を形成し、前記ライゲーション酵素が、前記ステム構造の末端で前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡをライゲーションし、それによって前記ステム構造の前記末端でループを形成する、請求項１に記載の方法。
3. 前記接触させることが、ステムループ構造を形成し、前記ライゲーション酵素が、前記ステムループ構造のステム内で前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡをライゲーションする、請求項１に記載の方法。
4. 前記ライゲーション酵素が、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、ＥｌｅｃｔｒｏＬｉｇａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、およびＤＮＡリガーゼＩＶからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ライゲーション酵素が、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１である、請求項２に記載の方法。
6. 前記ライゲーション酵素が、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である、請求項３に記載の方法。
7. 前記第１および／または第２のＲＮＡが、化学的に合成される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１のＲＮＡが、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり、前記第２のＲＮＡが、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
9. ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１のＲＮＡおよび／または前記第２のＲＮＡが、化学的に合成される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第１および／または前記第２のＲＮＡが、酵素的に合成される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡをライゲーション酵素でライゲーションすることが、前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとの間にホスホジエステル連結を作製する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡのヌクレオチドが、非共有結合の会合を可能にするように操作される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記ステムループが、約２～５０ヌクレオチドの長さを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、完全な相補性を有する少なくとも２つのＲＮＡヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、完全な相補性を有する少なくとも３、４、５、６、または７個の連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。
17. 完全な相補性を有する前記ＲＮＡヌクレオチドが、上部ステムおよび／または下部ステムに存在する、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡによって形成される下部ステムにおいて相補的である少なくとも５、６、または７個の連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、上部ステムにおいて相補的である少なくとも４～１４個の連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、上部ステムにおいて相補的である４つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第１および前記第２のＲＮＡが、上部ステムにおいて相補的である５つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
22. 前記第１および前記第２のＲＮＡが、上部ステムにおいて相補的である７つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
23. 前記第１および前記第２のＲＮＡが、上部ステムにおいて相補的である１４個の連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
24. 前記第１および前記第２のＲＮＡが、下部ステムにおいて相補的である７つの連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記第１のＲＮＡおよび／または前記第２のＲＮＡが、ライゲーション酵素のためのライゲーション部位を作製するように操作される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記ステムループが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のヌクレオチドのループを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ステムループが、テトラループを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ループが、７個のヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
29. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡをライゲーションすることが、前記ループから少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基対にあるライゲーション部位で生じる、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ライゲーション部位が、前記ループから２または３塩基対にある、請求項２９に記載の方法。
31. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡをライゲーションすることが、バルジから少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２塩基対にあるライゲーション部位で生じる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡをライゲーションすることが、前記バルジから３、４、５、または１１塩基対にあるライゲーション部位で生じる、請求項３１に記載の方法。
33. 前記第１のＲＮＡおよび／または第２のＲＮＡが、酵素的に産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記第１のＲＮＡが、前記第２のＲＮＡの一部分と塩基対形成することができる３’配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記第１のＲＮＡが、５’末端にホスフェートを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記第１のＲＮＡが、ドナーＲＮＡである、請求項３５に記載の方法。
37. 前記第２のＲＮＡが、可変プロトスペーサー領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記第２のＲＮＡが、アクセプターＲＮＡである、請求項３７に記載の方法。
39. 前記第１のＲＮＡが、前記５’末端にアデノシン三リン酸を含む、請求項３５に記載の方法。
40. 約８～５０個のヌクレオチドが相補的であり、前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記８～５０個のヌクレオチドが、部分的に相補的である、請求項４０に記載の方法。
42. 前記８～５０個のヌクレオチドが、約５０％～９９％相補的である、請求項４１に記載の方法。
43. 前記８～５０個のヌクレオチドが、完全に相補的である、請求項４１に記載の方法。
44. 前記第１および前記第２のＲＮＡが、異なるヌクレオチド長を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記第１のＲＮＡが、約２０～１００個のヌクレオチドを有する、請求項４４に記載の方法。
46. 前記第２のＲＮＡが、約２０～７０個のヌクレオチドを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
47. 塩基対形成が、下部ステムにおいて生じる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
48. ７個のヌクレオチドが、前記下部ステムにおいて相補的であり、前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする、請求項４７に記載の方法。
49. 前記塩基対形成が、上部ステムにおいて生じる、請求項４７または４８に記載の方法。
50. ２個のヌクレオチドが、前記上部ステムにおいて相補的であり、前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとの間の塩基対形成を可能にする、請求項４９に記載の方法。
51. 前記ｇＲＮＡが、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、または約２００ヌクレオチド超の長さを有する、請求項９～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記ｇＲＮＡが、伸長ガイドＲＮＡ、プライムエディターガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、またはＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｂガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｃガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｄ、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｅガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｆガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｇガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｈガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｉガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｊガイドＲＮＡ、もしくはＣａｓ１２ｋガイドＲＮＡなどのＣａｓ１２ガイドＲＮＡである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記ｇＲＮＡが、スペーサー、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、およびヘアピンのうちの１つ以上を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、約０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、または１：０．５の比で存在する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記ｇＲＮＡが、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上の収率で産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記ｇＲＮＡが、従来の合成方法と比較して、収率が５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上改善して産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
57. ５’－モノホスフェートを含む第１のＲＮＡを提供することと、
    第２のＲＮＡを提供することと、
    前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡに対して部分的な相補性を有するオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの前記相補性が前記第１および第２のＲＮＡとの塩基対形成を可能にする、オリゴヌクレオチドを提供することと、
    前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとの間のライゲーションを触媒するリガーゼを提供し、したがって合成ｇＲＮＡを産生することと、
    を含む、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法。
58. 合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法であって、
    ５’－モノホスフェートを含む第１のＲＮＡを提供することと、
    ブロックされた３’末端を含む第２のＲＮＡを提供することと、
    前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとの間のライゲーションを触媒するリガーゼを提供し、したがって前記合成ｇＲＮＡを産生することと、を含む、方法。
59. 前記第１のＲＮＡが、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり、前記第２のＲＮＡが、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である、請求項５７または５８に記載の方法。
60. 前記オリゴヌクレオチドが、約１００ヌクレオチド長である、請求項５７に記載の方法。
61. ２つ以上のＲＮＡ断片を提供することと、
    前記２つ以上のＲＮＡ断片に対して部分的な相補性を有するオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの前記相補性が、前記２つ以上のＲＮＡ断片との塩基対形成を可能にする、オリゴヌクレオチドを提供することと、
    前記２つ以上のＲＮＡ断片間のライゲーションを触媒するリガーゼを提供し、したがって前記合成ガイドＲＮＡを産生することと、
    を含む、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法。
62. 前記２つ以上のＲＮＡ断片が、オーバーハング、平滑末端、またはバルジにおいてライゲーションされる、請求項６１に記載の方法。
63. 請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法によって合成されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）。
64. 標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、または標的化されたゲノム修飾のための方法であって、前記方法が、
    （ａ）先行請求項のいずれか一項に定義される合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
    （ｂ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、またはそれをコードする核酸
    を真核細胞中に導入することを含み、
    （ａ）および（ｂ）と染色体ＤＮＡ中の標的配列との相互作用が、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、または標的化されたゲノム修飾をもたらす、方法。
65. 標的化されたＲＮＡ修飾のための方法であって、前記方法が、
    （ａ）先行請求項のいずれか一項に定義される合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
    （ｂ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、またはそれをコードする核酸
    を真核細胞中に導入することを含み、
    （ａ）および（ｂ）と染色体ＤＮＡによって発現されたＲＮＡとの相互作用が、前記染色体ＤＮＡによって発現された前記ＲＮＡの修飾をもたらす、方法。
66. 前記染色体ＤＮＡによって発現された前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項６５に記載の方法。
67. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、またはそれらの改変されたバージョンから選択される、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 請求項１～６７のいずれか一項に記載の合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生するための、方法。
69. 前記第２のＲＮＡが、前記第１のＲＮＡの一部分と塩基対形成することができる３’配列を含む、請求項６８に記載の方法。
70. 前記第２のＲＮＡが、可変プロトスペーサー領域を含む、請求項６８または６９に記載の方法。
71. 前記第１のＲＮＡが、５’末端にホスフェートを含む、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記接触させることが、ステムループ構造を形成し、前記ライゲーション酵素が、前記ステムループ構造のステム内で前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡをライゲーションする、請求項６８～７１のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記ライゲーション酵素が、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である、請求項７２に記載の方法。
74. 前記ステムループが、上部ステムにおいてＧＣ塩基対を含む、請求項７３に記載の方法。
75. 前記上部ステムが、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項７４に記載の方法。
76. 前記上部ステムが、ＣＧＣＣＧに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項７４に記載の方法。
77. 前記上部ステムが、ＣＧＧＣＣＧＣに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項７４に記載の方法。
78. 前記上部ステムが、ＣＧＣＧＣに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項７４に記載の方法。
79. 前記上部ステムが、ＣＧＡＵに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項７４に記載の方法。
80. 前記ステムループが、下部ステムにおいてＧＣ塩基対を含む、請求項７２に記載の方法。
81. 下部ステムが、ＧＣ塩基対を含まない、請求項６８～７９のいずれか一項に記載の方法。
82. 上部ステムが、ＧＣ塩基対を含まない、請求項６８～８１のいずれか一項に記載の方法。
83. 上部ステムが、少なくとも１、２、３、４、５、または６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＧＣ塩基対を含む、請求項６８～８１のいずれか一項に記載の方法。
84. 前記ステムの上部分が、２個のＧＣヌクレオチドを含む、請求項８３に記載の方法。
85. 前記第１および前記第２のＲＮＡをライゲーションすることが、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％超の全長産物の収率をもたらす、請求項６８～８４のいずれか一項に記載の方法。
86. 前記第１および前記第２のＲＮＡをライゲーションすることが、少なくとも約６０％の収率をもたらす、請求項８５に記載の方法。
87. 前記ｇＲＮＡが、少なくとも１グラムの量で産生される、請求項１～６３または６８～８６のいずれか一項に記載の方法。
88. 大型スケールが、少なくとも５グラム、１０グラム、２０グラム、３０グラム、４０グラム、５０グラム、６０グラム、７０グラム、８０グラム、９０グラム、または１００グラムを含む、請求項８７に記載の方法。
89. 前記ｇＲＮＡが、１グラム未満の量で産生される、請求項１～６３または６８～８８のいずれか一項に記載の方法。
90. 前記ｇＲＮＡが、約０．０５グラム、０．１グラム、０．２グラム、０．３グラム、０．４グラム、０．５グラム、０．６グラム、０．７グラム、０．８グラム、または０．９ｇの量で産生される、請求項８９に記載の方法。
91. 前記方法が、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超の純度でｇＲＮＡを産生する、請求項６８～９０のいずれか一項に記載の方法。
92. 前記第１のＲＮＡが、３’から５’方向に合成される、請求項６８～９１のいずれか一項に記載の方法。
93. 前記第２のＲＮＡが、３’から５’方向に合成される、請求項６８～９２のいずれか一項に記載の方法。
94. 前記ｇＲＮＡが、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、または約２００ヌクレオチド超の長さを有する、請求項６８～９３のいずれか一項に記載の方法。
95. 前記ループが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のヌクレオチドを含む、請求項６８～９４のいずれか一項に記載の方法。
96. 前記ループが、テトラループである、請求項９５に記載の方法。
97. 前記ループが、７個のヌクレオチドを含む、請求項９５に記載の方法。
98. 前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡをライゲーションすることが、前記ループから少なくとも約３塩基対にあるライゲーション部位で生じる、請求項６８～９７のいずれか一項に記載の方法。
99. 前記ライゲーション部位が、前記ループから１、２、３、４、５、６、または１０塩基対にある、請求項９８に記載の方法。
100. 前記第１および／または第２のＲＮＡが、１つ以上の骨格修飾を含む、請求項１～６３または６８～９９のいずれか一項に記載の方法。
101. 前記１つ以上の骨格修飾が、２’Ｏ－メチルまたはホスホロチオエート修飾を含む、請求項１００に記載の方法。
102. 前記１つ以上の骨格修飾が、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエート、２’Ｏ－メチル、２’－リボ３’－ホスホロチオエート、デオキシ、または５’ホスフェート修飾から選択される、請求項１００に記載の方法。
103. 前記１つ以上の修飾が、ライゲーションの部位に存在する、請求項１０１または１０２に記載の方法。
104. 前記１つ以上の修飾が、ドナーＲＮＡおよび／またはアクセプターＲＮＡに存在する、請求項１０３に記載の方法。
105. 前記ドナーＲＮＡの３’および／または５’の末端が、１つ以上の骨格修飾を有する、請求項１０４に記載の方法。
106. 前記アクセプターＲＮＡの３’および／または５’の末端が、１つ以上の骨格修飾を有する、請求項１０４に記載の方法。
107. 前記第１および／または第２のＲＮＡの濃度が、約１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌである、請求項１～６３または６８～１０６のいずれか一項に記載の方法。
108. 第１および／または第２のＲＮＡの濃度が、約１ｇ／Ｌである、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記第１および／または第２のＲＮＡの濃度が、約３ｇ／Ｌである、請求項１０７に記載の方法。
110. ５’末端にホスフェートを含む第１のＲＮＡと可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡとを含み、前記第１および前記第２のＲＮＡが、非共有結合で結合している、先行請求項のいずれか一項に記載の方法によって産生された、組成物。
111. ５’末端にホスフェートを含む第１のＲＮＡと可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡとを含み、前記第１および前記第２のＲＮＡがリガーゼに結合している、請求項１～１０３のいずれか一項に記載の方法によって産生された、組成物。
112. 前記リガーゼが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である、請求項１１１に記載の組成物。
113. ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む、組成物。
114. 前記ヌクレオチド配列が、ＣＧＡＵＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣと同一である、請求項１１３に記載の組成物。
115. ＣＧＣＣＧに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む、組成物。
116. 前記ヌクレオチド配列が、ＣＧＣＣＧと同一である、請求項１１５に記載の組成物。
117. ＣＧＧＣＣＧＣに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む、組成物。
118. 前記ヌクレオチド配列が、ＣＧＧＣＣＧＣと同一である、請求項１１７に記載の組成物。
119. ＣＧＣＧＣに対して少なくとも約８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む、組成物。
120. 前記ヌクレオチド配列が、ＣＧＣＧＣと同一である、請求項１１９に記載の組成物。
121. 請求項１１０～１２０のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
122. トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む第１のＲＮＡ、可変プロトスペーサー領域を含む第２のＲＮＡ、およびリガーゼを含む、キット。
123. 前記リガーゼが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である、請求項１２２に記載のキット。
     

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