KR20220123398A - 합성 가이드 rna, 이의 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히 자가-주형 접근법을 사용하여 합성 RNA를 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 합성 gRNA는 제1 RNA를 제2 RNA와 접촉시키는 단계로서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 상보적인 적어도 5개의 RNA 뉴클레오타이드를 포함하고, 접촉은 스템 구조 또는 스템 루프 구조를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계 및 (i) 스템 구조 내에서 또는 (ii) 스템 구조의 말단에서 제1 RNA와 제2 RNA를 결찰 효소로 결찰시켜 스템 구조의 말단에서 루프를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.

Description

합성 가이드 RNA, 이의 조성물, 방법 및 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 12월 3일자로 출원된 미국 특허 제62/943,158호 및 2020년 5월 28일자로 출원된 미국 특허 제63/031,262호에 대한 이익 및 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 본 명세서에 원용된다.

Cas 엔도뉴클레이스와 관련된 가이드 RNA 분자(Guide RNA molecule: gRNA) 및 염기 편집기를 포함한 관련 효소는 유전자 편집 응용 분야에 사용된다. 치료적 용도로 사용되는 일반적인 gRNA의 형태는 Cas9와 함께 리보핵단백질을 형성하는 대략 100개 뉴클레오타이드의 단일 비-천연 RNA이다. 포스포라미다이트 화학을 사용하는 플라스미드 DNA 및 고체상 합성은 치료용 sgRNA를 얻기 위한 전형적인 접근법이다. 합성 RNA의 사용은 sgRNA의 화학적 안정성을 증가시키며 원치 않는 위치(표적외)에서의 게놈 DNA의 편집을 감소시킬 수 있는 변형의 혼입을 가능하게 하므로 유리하다.

gRNA의 제조에는, 예를 들어, 다음과 같은 문제가 남아 있다: i) sgRNA 분자의 길이, 전형적으로 100개의 뉴클레오타이드 길이는 포스포라미다이트 화학의 한계를 뛰어 넘는다. 포스포라미다이트 화학은 약 0.985X(여기서 X는 뉴클레오타이드의 수임)의 RNA에 대한 커플링 효율을 가지고 있다. 예를 들어, 100nt 길이의 gRNA의 합성은 단리 전에 전체 길이의 대략 20%의 생성물을 생성한다. 이러한 길이는 현재 시판 중인 올리고뉴클레오타이드-기반 치료제(siRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide: ASO)는 전형적으로 20개 내지 50개 뉴클레오타이드 길이이므로 정제가 더 용이함)에 사용되는 것보다 훨씬 크다; ii) 불완전 커플링(절단 산물), 불완전 탈보호 및 뉴클레오타이드의 무작위 삽입(부가 생성물)으로부터 형성된 부산물의 완전한 제거는 현재 표준 정제 방법(예를 들어, 크로마토그래피, 전기영동)에 의해 이러한 길이 규모의 RNA에 대해 달성할 수 없다; 그리고 iii) 전장 생성물과 유사한 서열 상동성을 갖는 전장 생성물로 단리된 부산물은 리보핵단백질복합체의 활성을 감소시킬 것이며 표적외 편집으로 이어질 수 있다.

합성 RNA의 순도, 온전성 및 최종(정제 후) 수율을 제한하는 문제를 극복하는 화학적 및/또는 효소적 전략을 사용하여 gRNA를 합성하는 과정이 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 2개 이상의 합성 RNA가 효소를 사용하여 결찰되는 결찰-기반 접근법을 제공한다. 놀랍게도, 결찰-기반 접근법이 생성된 gRNA의 순도, 수율 및 온전성을 증가시킨다는 것이 발견되었다. 그 결과 생성된 gRNA의 순도, 수율 및 온전성은 이전의 gRNA 합성 방법과 비교하여 편집 효율을 증가시키고 표적외 편집을 줄일 수 있다. gRNA의 합성을 위한 결찰-기반 방법은 후속적으로 결찰되는 2개 이상의 부분적으로 상보적인 합성 RNA를 사용하는 방법("주형 접근법") 및 2개 이상의 합성 RNA 사이에 상보성을 필요로 하지 않는 방법("비-주형 접근법")을 포함한다.

일부 양태에서, 제1 RNA를 제2 RNA와 접촉시키는 단계로서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 상보적인 적어도 5개의 RNA 뉴클레오타이드를 포함하고, 접촉은 스템 구조 또는 스템 루프 구조(stem loop structure)를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계, 및 (i) 스템 구조 내에서 또는 (ii) 스템 구조의 말단에서 제1 RNA 및 제2 RNA를 결찰 효소로 결찰시켜 스템 구조의 말단에서 루프를 형성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 접촉은 스템 구조를 형성하고, 결찰 효소는 스템 구조의 말단에서 제1 RNA와 제2 RNA를 결찰시켜 스템 구조의 말단에서 루프를 형성한다.

일부 실시형태에서, 접촉은 스템 루프 구조를 형성하고, 결찰 효소는 스템 루프 구조의 스템 내에서 제1 RNA와 제2 RNA를 결찰한다.

일부 실시형태에서, 결찰 효소는 T4 RNA 라이게이스 1, T4 RNA 라이게이스 2, RtcB 라이게이스, 열-안정성 5' App DNA/RNA 라이게이스, 일렉트로라이게이스, T4 DNA 라이게이스, T3 DNA 라이게이스, T7 DNA 라이게이스, Taq DNA 라이게이스, SplintR 라이게이스 대장균 DNA 라이게이스, 9N DNA 라이게이스, CircLigase, CircLigase II, DNA 라이게이스 I, DNA 라이게이스 III 및 DNA 라이게이스 IV로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 T4 RNA 라이게이스 1이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 T4 RNA 라이게이스 2이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 RtcB 라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 열-안정성 5' App DNA/RNA 라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 일렉트로라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 T4 DNA 라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 T3 DNA 라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 T7 DNA 라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 Taq DNA 라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 SplintR 라이게이스 대장균 DNA 라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 9N DNA 라이게이스이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 CircLigase이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 CircLigase II이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 DNA 라이게이스 I이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 DNA 라이게이스 III이다. 일부 실시형태에서, 결찰 효소는 DNA 라이게이스 IV이다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 화학적으로 합성된다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복부(clustered regularly interspersed short palindromic repeat: CRISPR) RNA(crRNA)이고, 제2 RNA는 트랜스-활성화 RNA(trans-activating RNA: tracrRNA)이다.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA(gRNA)는 본 명세서의 방법에 따라 생성된다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 화학적으로 합성된다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 효소적으로 합성된다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 변형된 염기를 포함한다. 다양한 변형된 RNA 염기가 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 2'-O-메톡시-에틸 염기(2'-MOE), 예컨대, 2-메톡시에톡시 A, 2-메톡시에톡시 MeC, 2-메톡시에톡시 G, 2-메톡시에톡시 T를 포함한다. 다른 변형된 염기는, 예를 들어, 2'-O-메틸 RNA 염기 및 플루오로 염기를 포함한다. 다양한 플루오로 염기가 공지되어 있으며, 예를 들어, 플루오로 C, 플루오로 U, 플루오로 A, 플루오로 G 염기를 포함한다. 다양한 2'O메틸 변형이 또한 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음 2'O메틸 변형 중 하나 이상을 포함하는 RNA가 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다: 2'-OMe-5-메틸-rC, 2'-OMe-rT, 2'-OMe-rI, 2'-OMe-2-아미노-rA, 아미노링커-C6-rC, 아미노링커-C6-rU, 2'-OMe-5-Br-rU, 2'-OMe-5-I-rU, 2-OMe-7-데아자-rG.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 다음 변형 중 하나 이상을 포함한다: 포스포로티오에이트, 2'O-메틸, 2' 플루오로(2'F), DNA.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 3' 및 5'-말단에 2'OMe 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 다음 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2'-O-2-메톡시에틸(MOE), 잠금 핵산, 브리지된 핵산, 비잠금 핵산, 펩타이드 핵산, 모폴리노 핵산.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 다음 염기 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 슈도우라실, N1-메틸-슈도우라실, 5' 메틸 사이토신, 2'피리미디논(제부라린(zebularine)), 티민.

다른 변형된 염기는, 예를 들어, 2-아미노퓨린, 5-브로모 dU, 데옥시우리딘, 2,6-다이아미노퓨린(2-아미노-dA), 다이데옥시-C, 데옥시이노신, 하이드록시메틸 dC, 역 dT, 아이소-dG, 아이소-dC, 역 다이데옥시-T, 5-메틸 dC, 5-메틸 dC, 5-나이트로인돌, Super T®, 2'-F-r(C,U), 2'-NH2-r(C,U), 2,2'-안하이드로-U, 3'-데옥시-r(A,C,G,U), 3'-O-메틸-r(A,C,G,U), rT, rI, 5-메틸-rC, 2-아미노-rA, r스페이서(비염기성), 7-데아자-rG, 7-데아자-rA, 8-옥소-rG, 5-할로겐화된-rU, N-알킬화된-rN을 포함한다.

다른 화학적으로 변형된 RNA가 본 명세서에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는, 예를 들어, 5', Int, 3' 아자이드(NHS 에스터); 5' 헥신일; 5', Int, 3' 5-옥타다이인일 dU; 5', Int 바이오틴(아자이드); 5', Int 6-FAM(아자이드); 및 5', Int 5-TAMRA(아자이드)와 같은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있는 RNA 뉴클레오타이드 변형의 다른 예는, 예를 들어, 인산화 변형, 예컨대, 5'-인산화 및 3'-인산화를 포함한다. RNA는 또한 다음 변형 중 하나 이상을 가질 수 있다: 아미노 변형, 바이오티닐화, 티올 변형, 알카인 개질제, 아데닐화, 아자이드(NHS 에스터), 콜레스테롤-TEG 및 디곡시제닌(NHS 에스터).

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA를 결찰 효소로 결찰하면 제1 RNA와 제2 RNA 사이에 포스포다이에스터 연결이 생성된다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA 뉴클레오타이드는 비공유적 조립이 가능하도록 조작된다.

일부 실시형태에서, 스템 루프는 약 2개 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이이다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 완벽한 상보성을 갖는 적어도 2개의 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 완벽한 상보성을 갖는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 완벽한 상보성을 갖는 RNA 뉴클레오타이드는 상단(top) 스템 및/또는 하단(bottom) 스템에 존재한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 제1 RNA 및 제2 RNA에 의해 형성된 하단 스템에 상보적인 적어도 5개, 6개 또는 7개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 상부(upper) 스템에 상보적인 적어도 4개 내지 14개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 4개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 5개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 7개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 14개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 하부(lower) 스템에 상보적인 7개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 결찰 효소에 대한 결찰 부위를 생성하도록 조작된다.

일부 실시형태에서, 스템 루프는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 스템 루프는 본 명세서에서 테트라루프로도 지칭되는 4개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 5개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 6개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 7개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 8개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 9개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 10개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 11개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 12개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 13개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 14개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 15개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템 루프는 15개 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 1개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 2개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 3개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 4개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 5개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 6개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 7개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 8개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 9개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 10개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다.

일부 실시형태에서, 결찰 부위는 루프로부터 2개 또는 3개의 염기쌍이다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기(bulge)로부터 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 3개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 4개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 5개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 6개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 7개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 8개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 9개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 10개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 11개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 12개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 융기로부터 3개, 4개, 5개 또는 11개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 효소적으로 생성된다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 제2 RNA의 일부와 염기 페어링할 수 있는 3' 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 5' 말단에 포스페이트를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 공여체(donor) RNA이다.

일부 실시형태에서, 제2 RNA는 가변 프로토스페이서 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제2 RNA는 수용체(acceptor) RNA이다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 5' 말단에 아데노신 트라이포스페이트를 포함한다.

일부 실시형태에서, 약 8개 내지 50개의 뉴클레오타이드가 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 40개의 뉴클레오타이드가 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 30개의 뉴클레오타이드가 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 20개의 뉴클레오타이드가 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 10개의 뉴클레오타이드가 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다.

일부 실시형태에서, 8개 내지 50개의 뉴클레오타이드가 부분적으로 상보적이다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 40개의 뉴클레오타이드가 부분적으로 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 30개의 뉴클레오타이드가 부분적으로 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 20개의 뉴클레오타이드가 부분적으로 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 10개의 뉴클레오타이드가 부분적으로 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다.

일부 실시형태에서, 8개 내지 50개의 뉴클레오타이드는 약 50% 내지 99% 상보적이다.

일부 실시형태에서, 8개 내지 50개의 뉴클레오타이드가 완벽하게 상보적이다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 40개의 뉴클레오타이드가 완벽하게 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 30개의 뉴클레오타이드가 완벽하게 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 20개의 뉴클레오타이드가 완벽하게 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다. 일부 실시형태에서, 약 8개 내지 10개의 뉴클레오타이드가 완벽하게 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 상이한 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 20개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 20개 내지 90개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 20개 내지 80개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 20개 내지 70개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 20개 내지 60개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 20개 내지 40개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는다.

일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 20개 내지 70개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 20개 내지 60개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 20개 내지 40개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는다.

일부 실시형태에서, 염기 페어링은 하부 스템에서 발생한다.

일부 실시형태에서, 7개의 뉴클레오타이드가 하부 스템에서 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이에서 염기 페어링을 허용한다.

일부 실시형태에서, 염기 페어링은 상부 스템에서 발생한다.

일부 실시형태에서, 2개의 뉴클레오타이드가 상부 스템에서 상보적이며, 제1 RNA와 제2 RNA 사이에서 염기 페어링을 허용한다.

일부 실시형태에서, gRNA는 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 125개의 뉴클레오타이드, 약 150개의 뉴클레오타이드, 약 175개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 또는 약 200개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 따라서, 일부 실시형태에서, gRNA는 약 100개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 125개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 150개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 175개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 200개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 200개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

일부 실시형태에서, gRNA는 연장된 가이드 RNA, 프라임 편집기 가이드 RNA(prime editor guide RNA: pegRNA) 또는 Cas12 가이드 RNA, 예컨대, Cas12a 가이드 RNA, Cas12b 가이드 RNA, Cas12c 가이드 RNA, Cas12d, 가이드 RNA, Cas12e 가이드 RNA, Cas12f 가이드 RNA, Cas12g 가이드 RNA, Cas12h 가이드 RNA, Cas12i 가이드 RNA, Cas12j 가이드 RNA 또는 Cas12k 가이드 RNA이다. 따라서, 일부 실시형태에서, gRNA는 연장된 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 프라임 편집기 가이드 RNA(pegRNA)이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12 가이드 RNA이다. 다양한 Cas12가 공지되어 있으며, 예를 들어, 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템으로부터의 Cas12를 포함한다. 예시적인 Cas12는, 예를 들어, 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템으로부터의 임의의 Cas12를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j 및/또는 Cas12k에 대한 gRNA를 합성하는데 적합하다. 따라서, 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12a 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12b 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12c 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12d 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12e 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12f 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12g 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12h 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12i 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12j 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas12k 가이드 RNA이다.

일부 실시형태에서, gRNA는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 스페이서, 하부 스템, 융기, 상부 스템, 넥서스(nexus) 및 헤어핀.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6 또는 1:0.5의 비로 존재한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 0.5:1의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 0.6:1의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 0.7:1의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 0.8:1의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 0.9:1의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 1:1의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 1:0.9의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 1:0.8의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 1:0.7의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 1:0.6의 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 약 1:0.5의 비로 존재한다.

일부 실시형태에서, gRNA는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 수율로 생성된다. 따라서, 일부 실시형태에서, gRNA는 약 50%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 55%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 60%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 65%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 70%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 75%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 80%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 85%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 90%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 95%의 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 99% 초과의 수율로 생성된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상 개선된 수율로 생성된다. 따라서, 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 50% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 55% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 60% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 55% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 60% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 65% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 70% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 75% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 80% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 85% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 90% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 99% 개선된 수율로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 99% 초과의 개선된 수율로 생성된다.

일부 양태에서, 5'-모노포스페이트를 포함하는 제1 RNA를 제공하는 단계; 제2 RNA를 제공하는 단계; 제1 RNA 및 제2 RNA에 부분적으로 상보성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오타이드의 상보성은 제1 RNA와 제2 RNA와의 염기 페어링을 허용하는, 상기 제공하는 단계; 및 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 합성 gRNA를 생성하는 단계를 포함하는, 합성 가이드 RNA(gRNA)를 생성하는 방법이 제공된다.

일부 양태에서, 5'-모노포스페이트를 포함하는 제1 RNA를 제공하는 단계; 차단된 3' 말단을 포함하는 제2 RNA를 제공하는 단계; 및 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 합성 gRNA를 생성하는 단계를 포함하는, 합성 가이드 RNA(gRNA)를 생성하는 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA)이고, 제2 RNA는 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA)이다.

일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 100개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개의 뉴클레오타이드 길이이다.

일부 양태에서, 2개 이상의 RNA 단편을 제공하는 단계; 2개 이상의 RNA 단편에 부분적으로 상보성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오타이드의 상보성은 2개 이상의 RNA 단편과의 염기 페어링을 허용하는, 상기 제공하는 단계; 및 2개 이상의 RNA 단편 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 합성 가이드 RNA를 생성하는 단계를 포함하는, 합성 가이드 RNA(gRNA)를 생성하는 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 2개 이상의 RNA 단편은 돌출부, 평활 말단 또는 융기에서 결찰된다.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA(gRNA) 또는 프라임 편집 가이드 RNA(pegRNA)는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 합성된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 Cas9 가이드 RNA 또는 Cas12 가이드 RNA이다.

본 명세서에 기재된 방법은 Cas12 가이드 RNA, 예컨대, Cas12b 가이드 RNA를 합성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Cas12b RNA 헤어핀 루프 구조가 sgRNA를 분할하기 위한 위치로서 표적화될 수 있다. 다양한 헤어핀 루프 구조가, 예를 들어, 도 16에 도시된 바와 같은 헤어핀 루프 구조와 같은 sgRNA를 분할하기 위한 위치로서 표적화될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, Cas12 가이드 RNA는 하나 이상의 헤어핀 루프 구조를 표적화함으로써 본 명세서에 기재된 방법에 따라 합성될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas12 RNA 내의 하나 이상의 테트라루프가 결찰을 위해 표적화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Cas12b RNA 내의 하나 이상의 테트라루프가 결찰을 위해 표적화된다. 일부 실시형태에서, 표적화된 테트라루프는 Cas12 RNA의 5' 말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 테트라루프는 Cas12 RNA의 3' 말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 테트라루프는 Cas12 RNA의 3' 말단으로부터 약 5개 내지 30개의 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 테트라루프는 Cas12 RNA의 5' 말단으로부터 약 5개 내지 30개의 뉴클레오타이드이다.

일부 양태에서, 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피솜 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 위한 방법이 제공되며, 방법은 (a) 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 합성 가이드 RNA(gRNA); (b) 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질 또는 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하되; (a) 및 (b)와 염색체 DNA의 표적 서열 사이의 상호작용은 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피솜 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 유도한다.

일부 양태에서, 표적화된 RNA 변형을 위한 방법이 제공되며, 방법은 (a) 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 합성 가이드 RNA(gRNA); (b) 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질 또는 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하되; (a) 및 (b)와 염색체 DNA에 의해 발현되는 RNA 사이의 상호작용은 염색체 DNA에 의해 발현되는 RNA의 변형을 유도한다.

일부 실시형태에서, 염색체 DNA에 의해 발현되는 RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다.

일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 단백질은 Cas9, Cpf1, SaCas, Cas12, Cas13 또는 이들의 변형된 버전으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 합성 가이드 RNA(gRNA)를 생성하는 방법이 본 명세서에 기재된 방법에 따라 제공된다.

일부 실시형태에서, 제2 RNA는 제1 RNA의 일부와 염기 페어링을 할 수 있는 3' 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제2 RNA는 가변 프로토스페이서 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 5' 말단에 포스페이트를 포함한다.

일부 실시형태에서, 접촉은 스템 루프 구조를 형성하고, 결찰 효소는 스템 루프 구조의 스템 내에서 제1 RNA와 제2 RNA를 결찰한다.

일부 실시형태에서, 결찰 효소는 T4 RNA 라이게이스 2이다.

일부 실시형태에서, 스템 루프는 상부 스템에 GC 염기쌍을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAUACGACAGAAC와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCCG와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCCG와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCCG와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCCG와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCCG와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCCG와 적어도 약 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCCG와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGGCCGC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGGCCGC와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGGCCGC와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGGCCGC와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGGCCGC와 적어도 약 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGGCCGC와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCGC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCGC와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCGC와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCGC와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCGC와 적어도 약 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGCGC와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAU와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAU와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAU와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAU와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAU와 적어도 약 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상부 스템은 CGAU와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 스템 루프는 하부 스템에 GC 염기쌍을 포함한다.

일부 실시형태에서, 하부 스템은 GC 염기쌍을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 상부 스템은 GC 염기쌍을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 상부 스템은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5 또는 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 1개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 2개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 3개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 4개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 2개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 5개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 6개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 7개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 8개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 9개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 10개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 11개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스템은 적어도 12개의 GC 염기쌍을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 전장 생성물의 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 초과의 수율을 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 전장 생성물의 적어도 60%의 수율을 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 전장 생성물의 적어도 70%의 수율을 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 전장 생성물의 적어도 80%의 수율을 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 전장 생성물의 적어도 90%의 수율을 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 전장 생성물의 적어도 95%의 수율을 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA는 전장 생성물의 95% 초과의 수율을 초래한다.

일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 1그램의 양으로 생성된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 5그램, 10그램, 20그램, 30그램, 40그램, 50그램, 60그램, 70그램, 80그램, 90그램 또는 100그램의 양으로 생성된다. 따라서, 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 5그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 10그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 20그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 30그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 40그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 50그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 60그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 70그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 80그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 90그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 적어도 100그램의 양으로 생성된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 1그램 미만의 양으로 생성된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.05그램, 0.1그램, 0.2그램, 0.3그램, 0.4그램, 0.5그램, 0.6그램, 0.7그램, 0.8그램 또는 0.9그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.05그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.1그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.2그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.3그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.4그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.5그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.6그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.7그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.8그램의 양으로 생성된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 0.9그램의 양으로 생성된다.

일부 실시형태에서, 방법은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 초과의 순도로 gRNA를 생성한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 50%의 순도로 gRNA를 생성한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 60%의 순도로 gRNA를 생성한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 70%의 순도로 gRNA를 생성한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 80%의 순도로 gRNA를 생성한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 90%의 순도로 gRNA를 생성한다. 일부 실시형태에서, 방법은 90% 초과의 순도로 gRNA를 생성한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 3'에서 5' 방향으로 합성된다.

일부 실시형태에서, 제2 RNA는 3'에서 5' 방향으로 합성된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 125개의 뉴클레오타이드, 약 150개의 뉴클레오타이드, 약 175개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 또는 약 200개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 100개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 125개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 150개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 175개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 200개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 200개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

일부 실시형태에서, 루프는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 테트라루프로도 지칭되는 4개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 5개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 6개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 7개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 8개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 9개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 11개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 12개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 13개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 14개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 15개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 16개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA의 결찰은 루프로부터 적어도 약 3개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다.

일부 실시형태에서, 결찰 부위는 루프로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 10개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 루프로부터 1개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 2개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 3개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 4개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 5개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 6개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 7개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 8개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 9개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 결찰 루프로부터 10개의 염기쌍이다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 하나 이상의 백본 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2' O-메틸 또는 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2' O-메틸 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 포스포로티오에이트 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트, 2'O-메틸, 2'-리보 3'-포스포로티오에이트, 데옥시 또는 5' 포스페이트 변형으로부터 선택된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 2'-리보 3'-포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 데옥시 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 5' 포스페이트 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 결찰 부위에 존재한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 공여체 RNA 및/또는 수용체 RNA에 존재한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 공여체 RNA에 존재한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 수용체 RNA에 존재한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 공여체 및 수용체 RNA 둘 다에 존재한다.

일부 실시형태에서, 공여체 RNA의 3' 및/또는 5' 말단은 하나 이상의 백본 변형을 갖는다. 따라서, 일부 실시형태에서, 공여체 RNA의 3' 말단은 하나 이상의 백본 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 공여체 RNA의 5' 말단은 하나 이상의 백본 변형을 갖는다.

일부 실시형태에서, 수용체 RNA의 3' 및/또는 5' 말단은 하나 이상의 백본 변형을 갖는다. 따라서, 일부 실시형태에서, 수용체 RNA의 3' 말단은 하나 이상의 백본 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA의 5' 말단은 하나 이상의 백본 변형을 갖는다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA의 농도는 약 1 g/ℓ 내지 5 g/ℓ이다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA의 농도는 약 1 g/ℓ이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA의 농도는 약 2 g/ℓ이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA의 농도는 약 3 g/ℓ이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA의 농도는 약 4 g/ℓ이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA의 농도는 약 5 g/ℓ이다.

일부 실시형태에서, 5' 말단에 포스페이트를 포함하는 제1 RNA 및 가변 프로토스페이서 영역을 포함하는 제2 RNA를 포함하되 제1 RNA와 제2 RNA는 비공유적으로 결합된, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 조성물이 제공된다.

일부 실시형태에서, 5' 말단에 포스페이트를 포함하는 제1 RNA 및 가변 프로토스페이서 영역을 포함하는 제2 RNA를 포함하되 제1 RNA와 제2 RNA는 라이게이스에 결합되는, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 조성물이 제공된다.

일부 실시형태에서, 라이게이스는 T4 RNA 라이게이스 2이다.

일부 양태에서, CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGAUACGACAGAAC와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다.

일부 양태에서, CGCCG와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGCCG와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGCCG와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGCCG와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 CGCCG와 동일하다.

일부 양태에서, CGGCCGC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGGCCGC와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGGCCGC와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGGCCGC와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 CGGCCGC와 동일하다.

일부 양태에서, CGCGC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGCGC와 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGCGC와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, CGCGC와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 CGCGC와 동일하다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.

일부 양태에서, 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA) 서열을 포함하는 제1 RNA, 가변 프로토스페이서 영역을 포함하는 제2 RNA 및 라이게이스를 포함하는 키트가 제공된다.

일부 실시형태에서, 키트는 T4 RNA 라이게이스 2를 포함한다.

정의

본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 먼저 소정의 용어를 아래에 정의한다. 다음 용어 및 기타 용어에 대한 추가적인 정의는 명세서 전체에 걸쳐 명시되어 있다.

단수형: 단수형은 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.

대략 또는 약: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 명시된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되거나 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 명시된 참조 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).

와 관련된: 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것의 존재, 수준 및/또는 형태와 상관 관계가 있는 경우, 두 개의 이벤트 또는 엔티티는 해당 용어가 본 명세서에서 사용된 바와 같이 서로 "관련된다". 예를 들어, 특정 엔티티(예를 들어, 폴리펩타이드)는 이의 존재, 수준 및/또는 형태가 질환, 장애 또는 병태의 발생률 및/또는 이에 대한 민감성과 상관 관계가 있는 경우(예를 들어, 관련 집단 전반에 걸쳐) 특정 질환, 장애 또는 병태와 관련된 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 엔티티는 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 경우 서로 물리적으로 "관련"되어 서로 물리적으로 근접하며 그 상태로 유지된다. 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 관련된 2개 이상의 엔티티는 서로 공유적으로 연결되어 있고; 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 관련된 2개 이상의 엔티티는 서로 공유적으로 연결되어 있지 않지만, 예를 들어, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성 및 이들의 조합에 의해 비공유적으로 관련되어 있다.

염기 편집기: "염기 편집기(base editor: BE)" 또는 "핵염기 편집기(nucleobase editor: NBE)"는 폴리뉴클레오타이드에 결합하며 핵염기 변형 활성을 갖는 작용제를 의미한다. 다양한 실시형태에서, 염기 편집기는 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 가이드 RNA)와 함께 핵염기 변형 폴리펩타이드(예를 들어, 데아미네이스) 및 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 작용제는 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인, 즉, 핵산 분자(예를 들어, DNA) 내의 염기(예를 들어, A, T, C, G 또는 U)를 변형시킬 수 있는 도메인을 포함하는 생체분자 복합체이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능 DNA 결합 도메인은 데아미네이스 도메인에 융합되거나 또는 연결된다. 일 실시형태에서, 작용제는 염기 편집 활성을 갖는 하나 이상의 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 또 다른 실시형태에서, 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인은 가이드 RNA(예를 들어, 가이드 RNA 상의 RNA 결합 모티프 및 데아미네이스에 융합된 RNA 결합 도메인을 통해)에 연결된다. 일부 실시형태에서, 염기 편집 활성을 갖는 도메인은 핵산 분자 내의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 DNA 분자 내의 하나 이상의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 DNA 내의 사이토신(C) 또는 아데노신(A)을 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 DNA 내의 사이토신(C) 및 아데노신(A)을 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(cytidine base editor: CBE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기(adenosine base editor: ABE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기(ABE) 및 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미네이스에 융합된 뉴클레이스-불활성 Cas9(dCas9)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 염기 절단 복구의 저해제, 예를 들어, UGI 도메인 또는 dISN 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 데아미네이스 및 UGI 또는 dISN 도메인과 같은 염기 절단 복구의 저해제에 융합된 Cas9 닉케이스를 포함한다. 다른 실시형태에서, 염기 편집기는 비염기성 염기 편집기이다. 염기 편집기에 대한 세부사항은 국제 특허 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632)에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 또한, 그 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017), 및 Rees, H.A., et al., "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells." Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1] 참조.

염기 편집 활성: "염기 편집 활성"은 폴리뉴클레오타이드 내의 염기를 (예를 들어, 염기를 탈아미노화함으로써) 화학적으로 변경하는 작용을 하는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 제1 염기는 제2 염기로 전환된다. 일 실시형태에서, 염기 편집 활성은, 예를 들어, 표적 C·G를 T·A로 전환하는 사이티딘 데아미네이스 활성이다. 또 다른 실시형태에서, 염기 편집 활성은, 예를 들어, A·T를 G·C로 전환하는 아데노신 또는 아데닌 데아미네이스 활성이다. 또 다른 실시형태에서, 염기 편집 활성은, 예를 들어, 표적 C·G를 T·A로 전환하는 사이티딘 데아미네이스 활성 및, 예를 들어, A·T를 G·C로 전환하는 아데노신 또는 아데닌 데아미네이스 활성이다.

염기 편집기 시스템: 용어 "염기 편집기 시스템"은 표적 뉴클레오타이드 서열의 핵염기를 편집하기 위한 시스템을 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 염기 편집기(BE) 시스템은 (1) 표적 뉴클레오타이드 서열에서 핵염기를 탈아미노화하기 위한 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인(예를 들어, Cas9), 데아미네이스 도메인 및 사이티딘 데아미네이스 도메인; 및 (2) 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인과 함께 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 염기 편집기(BE) 시스템은 아데노신 데아미네이스 또는 사이티딘 데아미네이스로부터 선택되는 핵염기 편집기 도메인, 및 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기 시스템은 (1) 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능 DNA 결합 도메인 및 표적 뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 핵염기를 탈아미노화하기 위한 데아미네이스 도메인을 포함하는 염기 편집기(BE); 및 (2) 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능 DNA 결합 도메인과 함께 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능 DNA 결합 도메인이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE), 또는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다.

생물학적으로 활성인: 본 명세서에서 사용되는 어구 "생물학적으로 활성인"은 생물학적 시스템, 특히 유기체에서 활성을 갖는 임의의 작용제의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에게 투여될 때 해당 유기체에 생물학적 영향을 미치는 작용제는 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 펩타이드가 생물학적으로 활성인 경우, 펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 해당 펩타이드의 부분은 전형적으로 "생물학적으로 활성인" 부분으로 지칭된다.

절단: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 절단은 본 명세서에 기재된 CRISPR 시스템의 뉴클레이스에 의해 생성된 표적 핵산의 파손을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 절단 이벤트는 이중-가닥 DNA 파손이다. 일부 실시형태에서, 절단 이벤트는 단일-가닥 DNA 파손이다. 일부 실시형태에서, 절단 이벤트는 단일-가닥 RNA 파손이다. 일부 실시형태에서, 절단 이벤트는 이중-가닥 RNA 파손이다.

상보적인: "상보적인" 또는 "상보성"은 전통적인 왓슨-크릭 또는 후그스틴 염기 페어링에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성할 수 있음을 의미한다. 상보적인 염기 페어링은 G-C 및 A-T 염기 페어링을 포함할 뿐만 아니라 이노신과 같은 보편적인 염기를 포함하는 염기 페어링도 포함한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 서열(예를 들어, 10개의 뉴클레오타이드를 갖는 제2 핵산 서열과 염기쌍을 이루는 제1 올리고뉴클레오타이드의 총 10개의 뉴클레오타이드 중 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오타이드가 각각 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보성을 나타냄)과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 페어링)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내 연속 잔기의 백분율을 나타낸다. 상보성 백분율이 적어도 소정의 백분율인지를 결정하기 위해, 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 페어링)을 형성할 수 있는 핵산 분자의 연속 잔기의 백분율이 계산되고, 가장 가까운 정수로 반올림된다(예를 들어, 23개의 뉴클레오타이드를 갖는 제2 핵산 서열과 염기쌍을 이루는 제1 올리고뉴클레오타이드의 총 23개의 뉴클레오타이드 중 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 뉴클레오타이드가 각각 52%, 57%, 61%, 65%, 70% 및 74%이며; 각각 적어도 50%, 50%, 60%, 60%, 70% 및 70% 상보성을 가짐). 본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 상보적인"은 생물학적 조건하에서 혼성화할 수 있도록 하는 가닥 사이의 상보성을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 100% 상보성을 갖는다. 추가적으로, 뉴클레오타이드 서열을 조사함으로써 2개의 가닥이 생물학적 조건하에서 혼성화할 수 있는지 결정하는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.

클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR)-관련(Cas) 시스템: 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 CRISPR-Cas9 시스템은 CRISPR 효과기를 암호화하는 서열, RNA 가이드 및 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사체를 포함하여 CRISPR-효과기의 발현에 관여하거나 활성을 지시하는 핵산 및/또는 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 조작된 비자연적으로 발생된 CRISPR 시스템이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템의 구성 요소는 시스템의 하나 이상의 구성 요소를 암호화하는 핵산(들)(예를 들어, 벡터), 단백질 형태의 구성 요소(들) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

CRISPR 어레이: 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR 어레이"는 첫 번째 CRISPR 반복부의 첫 번째 뉴클레오타이드로 시작하여 마지막(말단) CRISPR 반복부의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 CRISPR 반복부 및 스페이서를 포함하는 핵산(예를 들어, DNA) 분절을 지칭한다. 전형적으로, CRISPR 어레이의 각 스페이서는 두 반복부 사이에 위치한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR 반복부" 또는 "CRISPR 직접 반복부" 또는 "직접 반복부"는 CRISPR 어레이 내에서 서열 변화를 거의 나타내지 않거나 또는 전혀 나타내지 않는 다중의 짧은 직접 반복 서열을 지칭한다.

CRISPR-관련 단백질(Cas): 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR-관련 단백질", "CRISPR 효과기", "효과기" 또는 "CRISPR 효소"는 효소적 활성을 수행하고/하거나 RNA 가이드에 의해 지정된 핵산의 표적 부위에 결합하는 단백질을 지칭한다. 상이한 실시형태에서, CRISPR 효과기는 엔도뉴클레이스 활성, 닉케이스 활성, 엑소뉴클레이스 활성, 트랜스포세이즈 활성 및/또는 절제 활성을 갖는다. 다른 실시형태에서, CRISPR 효과기는 뉴클레이스 불활성이다.

crRNA: 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR RNA" 또는 "crRNA"는 특정 핵산 서열을 표적화하기 위해 CRISPR 효과기에 의해 사용되는 가이드 서열을 포함하는 RNA 분자를 지칭한다. 전형적으로, crRNA는 표적 인식을 매개하는 서열 및 tracrRNA와 이중체를 형성하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, crRNA: tracrRNA 이중체는 CRISPR 효과기에 결합한다.

이중체: 본 명세서에서 사용되는 "이중체"는 2개의 단일 가닥 핵산의 상호작용에 의해 형성된 이중 나선 구조를 지칭한다. 이중체는 전형적으로 서로에 대해 역평행으로 배향된 2개의 단일 가닥 핵산 사이의 염기의 쌍별 수소 결합, 즉, "염기 페어링"에 의해 형성된다. 이중체의 염기 페어링은 일반적으로 왓슨-크릭 염기 페어링에 의해 발생하며, 예를 들어, 구아닌(G)은 DNA 및 RNA에서 사이토신(C)과 염기쌍을 형성하고, 아데닌(A)은 DNA에서 티민(T)과 염기쌍을 형성하며, 아데닌(A)은 RNA에서 우라실(U)과 염기쌍을 형성한다. 염기쌍이 형성될 수 있는 조건은 생리학적 또는 생물학적으로 관련된 조건(예를 들어, 세포내: pH 7.2, 140mM 포타슘 이온; 세포외 pH 7.4, 145mM 소듐 이온)을 포함한다. 또한, 이중체는 인접한 뉴클레오타이드 간의 상호작용을 스태킹함으로써 안정화된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이중체는 염기 페어링에 의해 또는 상호작용을 스태킹함으로써 확립 또는 유지될 수 있다. 이중체는 실질적으로 상보적이거나 또는 완전히 상보적일 수 있는 2개의 상보적인 핵산 가닥에 의해 형성된다. 다수의 염기에 걸쳐 염기쌍을 이루는 단일-가닥 핵산을 "혼성화"라고 한다.

생체외: 본 명세서에서 사용되는 용어 "생체외"는 다세포 유기체 내부가 아닌 외부에서 성장한 세포 또는 조직에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.

기능적 등가물 또는 유사체: 본 명세서에서 사용되는 용어 "기능적 등가물" 또는 "기능적 유사체"는 아미노산 서열의 기능적 유도체와 관련하여 원래 서열과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능 또는 구조적)을 유지하는 분자를 의미한다. 기능적 유도체 또는 등가물은 천연 유도체일 수 있거나 또는 합성적으로 제조될 수 있다. 예시적인 기능적 유도체는 단백질의 생물학적 활성이 보존된다면, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 치환은 바람직하게는 치환된 아미노산과 유사한 화학-물리적 특성을 갖는다. 바람직한 유사한 화학-물리적 특성은 전하의 유사성, 큰 부피, 소수성, 친수성 등을 포함한다.

반감기: 본 명세서에서 사용되는 용어 "반감기"는 단백질 농도 또는 활성과 같은 양이 기간의 시작에서 측정된 값의 절반으로 떨어지는데 필요한 시간이다.

혼성화하다: "혼성화하다"는 다양한 엄격한 조건하에서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전자) 또는 이의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하는 것을 의미한다(예를 들어, 문헌[Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조). 혼성화는 상보적인 핵염기 사이에서 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 역 후그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합에 의해 발생한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보적인 핵염기이다.

개선하다, 증가시키다 또는 감소시키다: 본 명세서에서 사용되는 용어 "개선하다", "증가시키다" 또는 "감소시키다" 또는 문법적 등가물은 본 명세서에 기재된 치료의 시작 전 동일한 개체에서의 측정 또는 본 명세서에 기재된 치료의 부재하에 대조군 대상체(또는 여러 대조군 대상체)에서의 측정과 같은 기준선 측정과 관련된 값을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료될 대상체와 거의 동일한 연령인 치료될 대상체와 동일한 형태의 질환을 앓고 있는 대상체이다.

Indel: 본 명세서에서 사용되는 용어 "indel"은 핵산 서열에서 염기의 삽입 또는 결실을 지칭한다. 이는 일반적으로 돌연변이를 일으키며, 유전적 변이의 일반적인 형태이다.

저해: 본 명세서에서 사용되는 용어 "저해", "저해하다" 및 "저해하는"은 관심 단백질 또는 유전자의 활성 및/또는 발현을 감소시키거나 또는 줄이는 과정 또는 방법을 지칭한다. 전형적으로, 단백질 또는 유전자를 저해하는 것은 본 명세서에 기재되거나 당업계에서 인지되는 하나 이상의 방법에 의해 측정되는 바와 같이 단백질 또는 유전자의 발현 또는 관련 활성을 적어도 10% 이상, 예를 들어, 20%, 30%, 40% 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 줄이는 것 또는 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배, 100-배 초과 또는 그 이상의 발현 또는 관련 활성의 감소를 지칭한다.

시험관내: 본 명세서에서 사용되는 용어 "시험관내"는 다세포 유기체 내에서가 아니라 인공 환경, 예를 들어, 테스트 튜브 또는 반응 용기, 세포 배양 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.

생체내: 본 명세서에서 사용되는 용어 "생체내"는 다세포 유기체, 예컨대, 인간 및 비인간 동물 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 용어는 살아있는 세포 내에서 발생하는 이벤트(예를 들어, 시험관내 시스템과 반대)를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.

올리고뉴클레오타이드: 본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA의 약 5개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 "올리고머" 또는 "올리고"로도 알려져 있으며, 유전자로부터 단리되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다.

PAM: 용어 "PAM" 또는 "프로토스페이서 인접한 모티프"는 CRISPR-Cas9와 같은 CRISPR 시스템에 의해 절단되도록 표적화된 핵산 영역을 따르는 짧은 핵산 서열(일반적으로 2개 내지 6개의 염기쌍 길이)을 지칭한다. PAM은 Cas 뉴클레이스를 절단하는데 필요할 수 있으며, 일반적으로 절단 부위의 하류에서 3개 내지 4개의 뉴클레오타이드에서 발견된다.

폴리펩타이드: 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적인 사슬을 지칭한다. 용어는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 지칭하기 위해 사용되지만, 당업자는 용어가 긴 사슬로 제한되지 않으며 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 2개의 아미노산을 포함하는 최소 사슬을 지칭할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 폴리펩타이드는 가공 및/또는 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 상호교환적으로 사용된다.

예방하다: 본 명세서에서 사용되는 용어 "예방하다" 또는 "예방"은 질환, 장애 및/또는 병태의 발생과 관련하여 사용될 때 질환, 장애 및/또는 병태가 발생할 위험을 감소시키는 것을 지칭한다.

프라임 편집 가이드 RNA: 용어 "프라임 편집 가이드 RNA" 또는 "pegRNA"는 표적 부위를 지정하고 목적하는 편집을 암호화하는 가이드 RNA의 유형을 지칭한다. 프라임 편집 가이드 RNA(pegRNA)는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 그 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Anzalone A.V., "Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA" Nature. 2019 Oct 21. doi: 10.1038/s41586-019-1711-4]에 이전에 기술되었다.

단백질: 본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질"은 별개의 단위로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 지칭한다. 단일 폴리펩타이드가 별개의 기능 단위이며 별개의 기능 단위를 형성하기 위해 다른 폴리펩타이드와의 영구적 또는 일시적인 물리적 회합을 필요로 하지 않는 경우, 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 별개의 기능적 단위가 물리적으로 서로 회합하는 하나 초과의 폴리펩타이드로 구성되는 경우, 용어 "단백질"은 물리적으로 커플링되고 별개의 단위로서 함께 기능하는 다중 폴리펩타이드를 지칭한다.

참조: "참조" 엔티티, 시스템, 양, 조건의 설정 등은 본 명세서에 기재된 바와 같이 테스트 엔티티, 시스템, 양, 조건의 설정 등이 비교되는 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, "참조" 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 조작되지 않은 대조군 항체이다.

RNA 가이드: 용어 RNA 가이드는 표적 핵산에 대한 본 명세서에 기재된 단백질의 표적화를 용이하게 하는 RNA 분자를 지칭한다. 예시적인 "RNA 가이드" 또는 "가이드 RNA"는 동족 tracrRNA와 조합된 crRNA 또는 crRNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 후자는 독립적인 RNA일 수 있거나 링커(sgRNA)를 사용하여 단일 RNA로 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 화학적 또는 생화학적 변형을 포함하도록 조작되며, 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

스플린트: 용어 "스플린트(Splint)"는 단일 가닥 RNA 또는 DNA 또는 적어도 2개, 3개 또는 그 이상의 단일 가닥 RNA 뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 다른 중합체를 지칭한다.

대상체: 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 진단, 예후예측 또는 요법이 필요한 임의의 대상체를 의미한다. 예를 들어, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류(예컨대, 유인원, 원숭이, 오랑우탄 또는 침팬지), 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소 또는 젖소일 수 있다.

sgRNA: 용어 "sgRNA", "단일 가이드 RNA" 또는 "가이드 RNA"는 (i) 가이드 서열(crRNA 서열) 및 (ii) Cas9 뉴클레이스-동원 서열(tracrRNA)을 포함하는 단일 가이드 RNA를 지칭한다.

실질적인 동일성: 어구 "실질적인 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개의 서열은 일반적으로 상응하는 위치에 동일한 잔기를 포함하는 경우 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN, 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭 BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상용 컴퓨터 프로그램에서 이용 가능한 것을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은 문헌[Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999]에 기술되어 있다. 동일한 서열을 식별하는 것 이외에도, 위에서 언급된 프로그램은 전형적으로 동일성의 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시형태에서, 2개의 서열은 상응하는 잔기의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이 잔기의 관련 신장부(stretch)에 걸쳐 동일한 경우 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 관련 신장부는 완전한 서열이다. 일부 실시형태에서, 관련 신장부는 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 225개, 250개, 275개, 300개, 325개, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475개, 500개 이상의 잔기이다.

표적 핵산: 본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 핵산"은 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 유사체인 CRISPR-Cas9 시스템이 결합하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)를 지칭한다. 표적 핵산은 3차원 구조를 가질 수 있고, 코딩 또는 논-코딩 영역을 포함할 수 있으며, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, cDNA, 플라스미드, 벡터, 외인성 서열, 내인성 서열을 포함할 수 있다. 표적 핵산은 메틸화된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 비-핵산 구성 요소 사이에 배치될 수 있다. 표적 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 기타 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체로 제한되지 않는다.

치료학적 유효량: 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험 비로 치료되는 대상체에게 치료 효과를 부여하는 치료적 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조작된 항체)의 양을 지칭한다. 치료적 효과는 객관적(즉, 일부 테스트 또는 마커에 의해 측정 가능함)이거나 또는 주관적(즉, 대상체가 효과를 나타내거나 느낌)일 수 있다. 특히, "치료학적 유효량"은 특정 질환 또는 병태를 치료, 개선 또는 예방하거나 또는, 예컨대, 질환과 관련된 증상을 개선시키고, 질환의 발병을 예방하거나 또는 지연시키고/시키거나 질환의 중증도 또는 빈도를 감소시킴으로써 검출 가능한 치료적 또는 예방적 효과를 나타내는데 효과적인 치료적 분자 또는 조성물의 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 다중 단위 용량을 포함할 수 있는 투여 양생법으로 투여될 수 있다. 임의의 특정 치료적 분자의 경우, 치료학적 유효량(및/또는 효과적인 투여 양생법 내 적절한 단위 용량)은, 예를 들어, 다른 약제학적 작용제와의 조합에 따른 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 또한, 임의의 특정 대상체에 대한 특정 치료학적 유효량(및/또는 단위 용량)은 치료될 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 약제학적 작용제의 활성; 사용되는 특정 조성물; 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 투여 시간, 투여 경로 및/또는 사용되는 특정 치료적 분자의 배설률 또는 대사율; 치료 기간; 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 것들과 같은 인자를 포함하여 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.

tracrRNA: 본 명세서에서 사용되는 용어 "tracrRNA" 또는 "트랜스-활성화 crRNA"는 CRISPR-관련 단백질이 특정 표적 핵산에 결합하는데 필요한 구조를 형성하는 서열을 포함하는 RNA를 지칭한다.

치료: 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완벽하게 완화, 개선, 경감, 저해, 지연시키고, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나 이의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생률을 감소시키는 치료적 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CRISPR-Cas 치료적 단백질 또는 시스템)의 임의의 투여를 지칭한다. 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체의 치료일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체의 치료일 수 있다.

도면은 단지 설명을 위한 것이며; 제한이 없다.
도 1은 합성 RNA의 표준 화학적 합성을 나타내는 개략도이다. 합성 RNA는 전형적으로 고체 지지체에서 서열-제어 중합을 통해 합성된다. 화학적 합성은 각각 도 1의 개략도에 예시된 바와 같이 다양한 단계를 포함하는 사이클에서 수행된다.
도 2는 표적 DNA 서열과 상호작용하는 sgRNA를 보여주는 일반적인 개략도이다. 개략도는 스페이서 영역, 하부 스템으로 구성된 스템 루프, 테트라루프 및 융기 영역, 넥서스 모티프 및 일련의 헤어핀 모티프를 포함하여 sgRNA에 존재하는 다양한 모티프를 예시한다.
도 3의 패널 A는 결찰-기반 방법을 사용한 sgRNA의 합성에 대한 두 가지 일반적인 접근법을 보여준다. 한 접근법(1)에서, 결찰은 스템 루프의 루프 부분에서 발생한다. 두 번째 접근법(2)에서, 결찰은 스템 루프의 나선에서 발생한다. 각 접근법에서, 스템 루프는 연장되며, 효소적 결찰을 위한 구간(section)을 회합하는데 사용된다. 도 3의 패널 B는 피크로 표시되는, RNA 단편과 단편을 결찰하여 생성된 gRNA 사이의 분리를 보여주는 개략적인 HPLC 그래프를 도시한다. 결찰 후, 결찰되지 않은 RNA 단편을 제거하기 위해 HPLC를 사용하여 최종 정제 단계가 수행된다. 전장 생성물(FLP)로부터 RNA 단편의 완전한 분리가 가능하다.
도 4는 약물 합성에 사용되는 전형적인 클릭 화학 반응의 예를 보여주는 개략도이다. 종래의 방법은 RNA 단편을 전장 sgRNA에 결합시키기 위해 "클릭 화학"을 사용하는 화학적 결찰을 사용하였다.
도 5의 패널 A 내지 패널 C는 효소적 결찰에 사용되는 다양한 기질을 도시한다. 도 5의 패널 A는 스플린트에 회합된 2개의 RNA 올리고를 도시한다. 이 시나리오에서, 닉(nick)(예를 들어, 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 연결 지점)은 라이게이스에 의해 봉인되어 천연 포스포다이에스터 백본 연결이 생성될 것이다. 도 5의 패널 B는 서로 부분적인 상보성을 갖고 염기쌍이 함께 스템 루프 구조를 형성하는 2개의 RNA 올리고를 도시한다. 효소적 결찰은 스템 루프의 루프 구간에서 고효율로 수행될 수 있다. 도 5의 패널 C는 스플린트와 염기쌍을 이루는 2개의 RNA를 도시한다. 결찰은 다양한 RNA 회합으로 수행될 수 있고, 사전 회합 없이 수행될 수 있다.
도 6의 패널 A는 가장 일반적으로 사용되는 sgRNA와 회합되는 서열 및 구성을 도시한다. 도 6의 패널 B는 루프 결찰을 위한 2개의 대표적인 RNA 서열 및 회합된 결찰 부위를 보여준다. 도 6의 패널 C는 나선 결찰을 위한 2개의 대표적인 RNA 서열 및 결찰 부위를 보여준다. 서열은 다음과 같다:
패널 A:

패널 B:

패널 C:

여기서 X는 임의의 뉴클레오타이드이고, "p"는 RNA가 도면에 예시된 바와 같이 공유적으로 연결되지 않은 유리 포스페이트를 나타낸다.
도 7의 패널 A는 결찰 실험에 사용된 단편의 서열을 도시한다. 수용체 및 공여체 서열 모두 나타나 있다. 염기 코드: A, 아데노신; G, 구아노신; U, 우리딘; C, 사이티딘; mA, 2'-O-메틸-아데노신; mU, 2'-O-메틸-우리딘; mC, 2'-O-메틸-사이티딘; pC, 5'-인산화된 사이티딘. 패널 B는 사전 결찰된 복합체의 제안된 구조를 보여준다. 수용체 및 공여체 서열이 나타나 있으며, 이는 도 7의 패널 A에 도시된 수용체 및 공여체 서열에 상응한다. 포스페이트는 원으로 표시된다. 패널 C는 다음을 나타내는 크로마토그램을 보여준다: 1, 수용체 단편; 2, 공여체 단편; 3, T4 RNA 라이게이스 2를 이용한 수용체와 공여체 단편 사이의 반응 생성물. 반응은 10μM의 공여체 단편, 10μM의 수용체 단편, 40㎕의 1x T4 RNA 라이게이스 2 반응 완충액(NEB) 및 20단위의 T4 RNA 라이게이스 2를 포함하였으며 37℃에서 수행되었다.
도 8의 패널 A는 RNA 공여체 1(Dnr-01), RNA 수용체 1(Acp-01) 디자인 및 결찰 복합체에 대한 RNA 단편 디자인을 도시한다. Dnr-01 및 Acp-01 서열은 표 4에 나타나 있다. 문자 "P"는 포스페이트 및 결찰의 위치를 나타낸다. 도 8의 패널 B는 T4 RNA 라이게이스 2를 사용하거나 사용하지 않은 Acp-1과 Dnr-1 사이의 반응에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. "FLP"는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 9의 패널 A는 RNA 수용체 2(Acp-02), RNA 공여체 2(Dnr-02) 및 결찰 복합체에 대한 RNA 단편 디자인을 도시한다. 문자 "P"는 포스페이트 및 결찰의 위치를 나타낸다. 도 9의 패널 B는 라이게이스 T4 RNA 라이게이스 1을 사용하거나 사용하지 않은 Acp-02와 Dnr-02 사이의 반응에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. Acp-02 및 Dnr-02 서열은 표 4에 나타나 있다. "FLP"는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 10의 패널 A는 RNA 수용체 3(Acp-03), RNA 수용체 3(Dnr-03) 및 결찰 복합체에 대한 RNA 단편 디자인을 도시한다. 문자 "P"는 포스페이트 및 결찰의 위치를 나타낸다. 도 10의 패널 B는 T4 RNA 라이게이스 2를 사용하거나 사용하지 않은 Acp-03과 Dnr-03 사이의 반응에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 도 10의 패널 C는 RNA 수용체 4(Acp-04), RNA 공여체 4(Dnr-04) 및 결찰 복합체에 대한 단편 디자인을 도시한다. 문자 "P"는 결찰 부위의 위치를 나타낸다. 도 10의 패널 D는 T4 RNA 라이게이스 2를 사용하거나 사용하지 않은 RNA 수용체 4(Acp-04)와 RNA 공여체 4(Dnr-04) 사이의 반응에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. Acp-03 및 Dnr-03 서열은 표 4에 나타나 있다. "FLP"는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 11의 패널 A는 RNA 수용체 5(Acp-05), RNA 공여체 5(Dnr-05) 및 결찰 복합체에 대한 RNA 단편 디자인을 도시한다. 문자 "P"는 결찰 부위의 위치를 나타낸다. 도 11의 패널 B는 라이게이스 2를 사용하거나 사용하지 않은 Acp-05와 Dnr-05 사이의 반응에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 도 11의 패널 C는 RNA 수용체 6(Acp-06), RNA 공여체 6(Dnr-06) 및 결찰 복합체에 대한 RNA 단편 디자인을 도시한다. 문자 "P"는 결찰 부위의 위치를 나타낸다. 도 11의 패널 D는 T4 RNA 라이게이스 2를 사용하거나 사용하지 않은 Acp-06과 Dnr-06 사이의 반응에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. Acp-05 및 Dnr-05 서열은 표 4에 나타나 있다. 문자 "P"는 결찰 부위의 위치를 나타낸다. "FLP"는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 12의 패널 A는 RNA 수용체 7(Acp-07), RNA 공여체 7(Dnr-07) 및 결찰 복합체에 대한 단편 디자인을 도시한다. 문자 "P"는 결찰 부위의 위치를 나타낸다. 도 12의 패널 B는 T4 RNA 라이게이스 2를 사용하거나 사용하지 않은 Acp-07과 Dnr-07 사이의 반응에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. Acp-07 및 Dnr-07 서열은 표 4에 나타나 있다. "FLP"는 "전장 생성물"을 의미한다. 반응에서 생성되는 부산물은 "*"로 표시된다.
도 13은 출발 단편 농도(g/ℓ)의 함수로서 반응물("FLP")의 수율을 보여주는 그래프이다. 이러한 연구를 위해, RNA 수용체 5/RNA 공여체 5(Acp/Dnr-05) 및 RNA 수용체 6/RNA 공여체 6(Acp/Dnr-6)이 사용되었다. "FLP"는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 14의 패널 A는 광범위하게 변형된 단편: RNA 수용체 8(Acp-08), RNA 공여체 8(Dnr-08) 및 결찰 복합체에 대한 단편 디자인을 도시한다. Acp-08 및 Dnr-08 서열은 표 4에 나타나 있다. 패널 A에서 강조 표시되고/음영 처리된 뉴클레오타이드는 2개의 O-메틸 변형으로 변형된 위치를 나타낸다. 문자 "P"는 결찰 부위의 위치를 나타낸다. 도 14의 패널 B는 이들 반응의 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 문자 "P"는 포스페이트 및 결찰의 위치를 나타낸다. 도 14의 패널 B는 라이게이스(T4 RNA 라이게이스 2)의 존재(실선) 및 부재(점선)하에 반응으로부터의 크로마토그램을 보여준다. "FLP"는 전장 생성물을 의미한다.
도 15는 아데닌 염기 편집기(ABE) 및 자가-주형 결찰 방법을 사용하여 합성된 3개의 가이드 RNA(AD-08, AD-05, AD-06) 중 하나를 사용한 섬유아세포에서의 편집 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 16은 바실러스 히사시이(Bacillus hisashii) bhCas12b sgRNA의 서열 및 2차 구조를 나타내는 개략도이다. 개략도는 sgRNA를 분할하기 위한 위치로서 표적화될 수 있는 헤어핀 루프 구조를 나타내는 "A", "B" 및 "C"로 표시된 영역을 보여준다. 서열에서 문자 "N"은 임의의 핵염기를 나타낸다.

본 발명은 합성 RNA를 생산하는 방법을 제공한다. 임의의 합성 RNA는 본 명세서에 기재된 방법으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제공된 결찰 방법은 Cas9, Cpf1, SaCas, Cas12, Cas13과 같은 부위-지정 변형 폴리펩타이드, 염기 편집기 및 프라임 편집기 등과 함께 사용될 때 표적 DNA 또는 RNA의 특정 유전자좌를 변형시키는데 유용한 가이드 RNA(gRNA)의 생성에 사용될 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 고순도, 온전성 및 최종(정제 후) 수율을 갖는 gRNA의 생성을 초래하는 RNA 단편으로부터 gRNA를 생산하는 방법을 발견하였다.

본 발명의 다양한 양태는 다음 부문에서 상세히 기재된다. 부문의 사용은 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 각 부문은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.

가이드 RNA(gRNA)

gRNA는 표적 서열에 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA는 표적 핵산 서열과 혼성화하고, 표적 핵산에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시한다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 표적 핵산 서열에 대해 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상보성을 갖는다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 gRNA는 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 250개의 뉴클레오타이드이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 gRNA는 약 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 205개, 210개, 215개, 220개, 225개, 230개, 235개, 240개, 245개 또는 250개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 50개 내지 75개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 75개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 100개 내지 125개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 125개 내지 150개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 150개 내지 175개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 175개 내지 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 200개 내지 225개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 225개 내지 250개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 "프라임 편집 가이드 RNA" 또는 "pegRNA"이다. 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Anzalone et al., Nature, 2019 Oct 21] 참조.

일부 실시형태에서, gRNA는 결찰된 crRNA 및 tracrRNA를 포함한다. 다양한 crRNA 및 tracrRNA 서열, 예를 들어, 여러 유형 II CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, WO2013/176772), 특히 Cpf1, SaCas, Cas12 및 프라임 편집 Cas와 회합되는 것들이 당업계에 공지되어 있다.

gRNA는 임의의 표적 서열을 표적으로 하도록 설계된다. 최적의 정렬은 바늘man-Wunsch 알고리즘, Smith-Waterman 알고리즘, Burrows-Wheeler 알고리즘, ClustlW, ClustlX, BLAST, Novoalign, SOAP, Maq 및 ELAND를 포함하는 서열을 정렬하기 위한 임의의 알고리즘을 사용하여 결정된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 세포 게놈 내의 고유의 표적 서열을 표적으로 하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 PAM 서열이 결여되도록 설계된다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열은 mFold 또는 Geneious를 포함하는 폴딩 알고리즘을 사용하여 최적의 2차 구조를 갖도록 설계된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 발현은 유도성 프로모터, 예를 들어, 호르몬 유도성, 테트라사이클린 또는 독시사이클린 유도성, 아라비노스 유도성 또는 광 유도성 프로모터하에 있을 수 있다.

일부 실시형태에서, gRNA 서열은 CRISPR-관련 단백질과 복합체를 형성하고 임의의 실질적인 뉴클레이스 활성 없이 특정 표적에 결합할 수 있는 "활성이 없는 crRNA(dead crRNA)", "활성이 없는 가이드" 또는 "활성이 없는 가이드 서열"이다.

일부 실시형태에서, gRNA는 당 포스페이트 백본 또는 염기에서 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 뉴클레이스 저항성 또는 염기 페어링을 개선하기 위해 다음 변형 2'O-메틸, 2'-F 또는 잠금 핵산 중 하나 이상을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 2-티오우리디엔 또는 N6-메틸아데노신과 같은 변형된 염기를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, gRNA는 다른 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 태그, 염료 또는 폴리에틸렌 글리콜과 접합된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 3차원 구조로 인해 특정 표적 분자에 결합하는 압타머 또는 리보스위치 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 루프 형성 서열은 3개, 4개, 5개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 루프는 서열 GAAA, AAAG, CAAA 및/또는 AAAC를 갖는다.

일부 실시형태에서, gRNA는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 헤어핀을 갖는다.

일부 실시형태에서, gRNA는 6개의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리T 서열을 포함하는 전사 종결 서열을 포함한다.

합성 가이드 RNA의 생산

가이드 RNA(gRNA)와 같은 합성 RNA를 제조하는 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 기재된 방법은 높은 온전성과 수율을 갖는 gRNA와 같은 합성 RNA를 생성한다.

본 명세서에 기재된 결찰 전략은 결찰 부위에서 천연 포스페이트 연결을 형성하기 때문에 gRNA와 같은 합성 RNA를 합성하는데 사용되는 이전에-보고된 화학적 결찰 전략과 상이하다. 분할된 합성 접근법(본 명세서에 기재된 바와 같은)을 사용하는 것의 이점은 RNA의 짧은 구간이 전장 gRNA에 비해 정제 후 더 높은 순도로 생성될 수 있다는 것이다. 이러한 접근법에서, 5' 수용체는 가장 작은 RNA 단편(약 30nt 내지 50nt)이므로, 결찰 전에 높은 수준으로 정제될 수 있다. 3' 공여체는 합성에 필요한 포스페이트로 종결되므로, 전장 단편만이 전장 생성물에 혼입될 것이다(즉, 절단은 기질이 아님).

본 명세서에 기재된 방법의 이점은 pegRNA 또는 Cas12b 가이드와 같이 100 nt보다 큰 gRNA를 고려할 때 증가된다. 본 명세서에 기재된 효소적 결찰의 유형은 매우 높은 수율(80% 초과)을 가지며, 올리고뉴클레오타이드 출발 물질은 높은 선택성으로 결찰된 생성물로부터 분리되어 전장 생성물이 매우 순수함을 보장할 수 있다. 이러한 유형의 효소적 결찰은 비교적 저렴하며 잘 확장된다.

합성 gRNA 생산을 위한 자가-주형 접근법

일부 양태에서, 합성 gRNA를 제조하는 방법은 상보성을 갖는 제1 RNA와 제2 RNA를 제공하는 단계로서, 상보성은 염기 페어링 및 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 스템 루프의 생성을 가능하게 하는, 상기 제공하는 단계; 스템 루프 내에서 제1 RNA와 제2 RNA를 결찰 효소로 결찰하여 합성 gRNA를 생성하는 단계를 포함한다. 이는 두 RNA의 효소적 결찰을 주형으로 하기 위해 제1 RNA와 제2 RNA 사이에 형성되는 나선 또는 다른 구조의 사용을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA와 제2 RNA 사이에 형성되는 구조의 길이 및 서열 조성은 비공유적 조립을 촉진하며 RNA 결찰에 적합한 효소에 대한 최적의 결찰 부위를 생성하도록 변형된다.

상보성은 제1 RNA와 제2 RNA의 뉴클레오타이드의 신장부 사이에서 부분적이거나 또는 완전할 수 있다. 상보성은 상보적인 뉴클레오타이드 간의 염기 페어링을 가능하게 한다. 부분적인 상보성이 있는 영역에서, 미스매치된 뉴클레오타이드는 제1 RNA와 제2 RNA 분자 사이에 융기 또는 루프 구조의 형성을 초래할 것이다. 두 RNA 분자 간의 혼성화에 기초하여 제1 RNA와 제2 RNA 분자 사이에 다양한 구조가 형성될 수 있다. 제1 RNA와 제2 RNA 분자 사이에 형성될 수 있는 예시적인 구조는 도 2에 예시되어 있다. 두 RNA 분자 사이의 결찰은 스템, 나선, 루프, 돌출부, 평활 말단 또는 융기에서 발생할 수 있다.

이러한 접근법을 사용하여, 제1 RNA는 다중 라이게이스 중 하나에 의해 가변 프로토스페이서 영역(수용체라 함)을 포함하는 제2 RNA의 3'-말단에 결찰된 5'-말단(공여체라 함)에서 포스페이트를 사용하여 합성된다.

일부 실시형태에서, 2개 이상의 RNA 단편은 이러한 접근법을 사용하여 결찰된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 RNA 단편이 자가-주형 접근법을 사용하여 결찰된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 합성 RNA를 생성하는 자가-주형 접근법은 2개 이상의 RNA 단편을 제공하는 단계; 2개 이상의 RNA 단편에 부분적으로 상보성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오타이드의 상보성은 2개 이상의 RNA 단편과의 염기 페어링을 허용하는, 상기 제공하는 단계; 및 2개 이상의 RNA 단편 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 합성 가이드 RNA를 생성하는 단계를 포함한다.

다양한 라이게이스가 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, T4 RNA 라이게이스 1, T4 RNA 라이게이스 2, RtcB 라이게이스, 열-안정성 5' App DNA/RNA 라이게이스, 일렉트로라이게이스, T4 DNA 라이게이스, T3 DNA 라이게이스, T7 DNA 라이게이스, Taq DNA 라이게이스, SplintR 라이게이스 대장균 DNA 라이게이스, 9N DNA 라이게이스, CircLigase, CircLigase II, DNA 라이게이스 I, DNA 라이게이스 III 및 DNA 라이게이스 IV 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, T4 RNA 라이게이스 1은 말단 루프에서 제1 RNA와 제2 RNA를 결찰하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, T4 RNA 라이게이스 2는 제1 RNA와 제2 RNA 사이에 형성된 스템 내에서 제1 RNA 및 제2 RNA를 결찰하는데 사용된다.

제1 RNA와 제2 RNA 사이에 형성된 헤어핀의 말단 루프 내에서 결찰과 같은 이러한 접근법을 사용하면 다양한 종류의 결찰이 가능하다. T4 RNA 라이게이스 1과 같은 다양한 라이게이스가 형성된 헤어핀의 말단 루프에서 결찰에 적합하다. 이러한 접근법으로 가능한 또 다른 종류의 결찰은 제1 RNA와 제2 RNA 사이에 형성된 이중체 내의 결찰이다. T4 RNA 라이게이스 2 및 DNA 라이게이스와 같은 다양한 라이게이스가 2개의 RNA 사이에 형성된 이중체에서 결찰하기에 적합하다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA)이고, 제2 RNA는 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA)이다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 10개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 25개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 40개 내지 45개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 45개 내지 60개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 60개 내지 75개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 75개 내지 90개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 약 90개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이이다.

일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 10개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 25개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 40개 내지 45개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 45개 내지 60개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 60개 내지 75개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 75개 내지 90개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA는 약 90개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이이다.

합성 RNA의 생산에서 스플린트 주형 접근법

일부 실시형태에서, 스플린트는 합성 RNA의 생산에 사용된다. 스플린트의 사용은 스플린트를 주형으로 사용하여 반응을 위해 하나 이상의 RNA 분자를 물리적으로 근접하게 할 수 있다. 2개 이상의 RNA가 연결되어야 하는 경우, 스플린트의 사용은 합성 RNA의 생산을 용이하게 한다.

스플린트는 하나 이상의 RNA 분자를 근접하게 할 수 있는 임의의 적합한 중합체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 스플린트는 RNA 분자 또는 DNA 분자이다.

일부 실시형태에서, 스플린트는 제1 RNA와 제2 RNA의 구간에 상보성을 갖는다. 상보성은 부분적이거나 또는 완전할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 5' 포스페이트를 포함하는 제1 RNA를 제공하는 단계; 유리 3'-하이드록실을 포함하는 제2 RNA를 제공하는 단계; 제1 RNA 및 제2 RNA에 부분적으로 상보성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오타이드의 상보성은 제1 RNA와 제2 RNA와의 염기 페어링을 허용하는, 상기 제공하는 단계; 및 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 gRNA를 생성하는 단계를 포함하는, 가이드 RNA와 같은 합성 RNA를 생산하는 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 스플린트는 커플링될 제1 RNA 및 제2 RNA의 구간에 상보성이 없다. 따라서, 일부 실시형태에서, 5' 포스페이트를 포함하는 제1 RNA를 제공하는 단계; 유리 3'-하이드록실을 포함하는 제2 RNA를 제공하는 단계; 커플링될 제1 RNA 및 제2 RNA의 뉴클레오타이드에 상보성이 없는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계; 및 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 gRNA를 생성하는 단계를 포함하는, 가이드 RNA와 같은 합성 RNA를 생산하는 방법이 제공된다.

합성 RNA를 생산하기 위한 비-주형 접근법

일부 실시형태에서, 비-주형 접근법은 가이드 RNA와 같은 합성 RNA를 생산하는데 사용된다.

비-주형 접근법의 일부 실시형태에서, 5' 포스페이트(예컨대, 5' 모노포스페이트)를 갖는 제1 RNA가 제공되고, 차단된 3' 말단(예컨대, 차단된 3' OH)을 포함하는 제2 RNA가 제공된다. 제2 RNA의 3' OH를 차단하는 목적은 제2 RNA가 결찰이 발생할 때 비주형 메커니즘을 통해 고리화될 수 없도록 하는 것이다. 예를 들어, 이러한 비-주형 접근법을 사용하면 화학적으로 차단되거나 또는 제거되는 공여체 분자(예를 들어, 다이데옥시뉴클레오타이드)의 3' 말단의 3' 하이드록실을 포함하는 제2 RNA를 포함할 수 있으며, 효소(특히 T4 RNA 라이게이스 1에 의해)는 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 적절한 결찰을 촉매할 것이다. 일부 실시형태에서, 이러한 결찰 전략은 고농도에서 수행된다.

따라서, 일부 양태에서, 합성 RNA를 생산하는 비-주형 접근법은 5'-모노포스페이트를 포함하는 제1 RNA를 제공하는 단계; 차단된 3' 말단을 포함하는 제2 RNA를 제공하는 단계; 및 제1 RNA와 제2 RNA 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 gRNA를 생성하는 단계를 포함한다.

화학적으로 변형된 RNA

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 이의 백본 또는 이의 염기 중 하나 이상에 대한 화학적 변형을 포함한다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA는 화학적 합성을 포함할 수 있으며, 천연 뉴클레오타이드와 유사하지 않은 변형된 당, 염기, 백본 또는 작용기를 포함하는 고도로 변형된 단량체를 끼워 넣는데 사용될 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 변형된 염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 RNA는 다음 2'-O-메톡시-에틸 염기(2'-MOE), 예컨대, 2-메톡시에톡시 A, 2-메톡시에톡시 MeC, 2-메톡시에톡시 G, 2-메톡시에톡시 T 중 하나 이상을 포함한다. 다른 변형된 염기는, 예를 들어, 2'-O-메틸 RNA 염기 및 플루오로 염기를 포함한다. 다양한 플루오로 염기가 공지되어 있으며, 예를 들어, 플루오로 C, 플루오로 U, 플루오로 A, 플루오로 G 염기를 포함한다. 다양한 2'O메틸 변형이 또한 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음 2'O메틸 변형 중 하나 이상을 포함하는 다음 RNA가 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다: 2'-OMe-5-메틸-rC, 2'-OMe-rT, 2'-OMe-rI, 2'-OMe-2-아미노-rA, 아미노링커-C6-rC, 아미노링커-C6-rU, 2'-OMe-5-Br-rU, 2'-OMe-5-I-rU, 2-OMe-7-데아자-rG.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 다음 변형 중 하나 이상을 포함한다: 포스포로티오에이트, 2'O-메틸, 2' 플루오로(2'F), DNA.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 3' 및 5'-말단에 2'OMe 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 다음 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2'-O-2-메톡시에틸(MOE), 잠금 핵산, 브리지된 핵산, 비잠금 핵산, 펩타이드 핵산, 모폴리노 핵산.

일부 실시형태에서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는 다음 염기 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 슈도우라실, N1-메틸-슈도우라실, 5' 메틸 사이토신, 2'피리미디논(제부라린), 티민.

다른 변형된 염기는, 예를 들어, 2-아미노퓨린, 5-브로모 dU, 데옥시우리딘, 2,6-다이아미노퓨린(2-아미노-dA), 다이데옥시-C, 데옥시이노신, 하이드록시메틸 dC, 역 dT, 아이소-dG, 아이소-dC, 역 다이데옥시-T, 5-메틸 dC, 5-메틸 dC, 5-나이트로인돌, Super T®, 2'-F-r(C,U), 2'-NH2-r(C,U), 2,2'-안하이드로-U, 3'-데옥시-r(A,C,G,U), 3'-O-메틸-r(A,C,G,U), rT, rI, 5-메틸-rC, 2-아미노-rA, r스페이서(비염기성), 7-데아자-rG, 7-데아자-rA, 8-옥소-rG, 5-할로겐화된-rU, N-알킬화된-rN을 포함한다.

다른 화학적으로 변형된 RNA가 본 명세서에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA는, 예를 들어, 5', Int, 3' 아자이드(NHS 에스터); 5' 헥신일; 5', Int, 3' 5-옥타다이인일 dU; 5', Int 바이오틴(아자이드); 5', Int 6-FAM(아자이드); 및 5', Int 5-TAMRA(아자이드)와 같은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있는 RNA 뉴클레오타이드 변형의 다른 예는, 예를 들어, 5'-인산화 및 3'-인산화와 같은 인산화 변형을 포함한다. RNA는 또한 다음 변형 중 하나 이상을 가질 수 있다: 아미노 변형, 바이오티닐화, 티올 변형, 알카인 개질제, 아데닐화, 아자이드(NHS 에스터), 콜레스테롤-TEG 및 디곡시제닌(NHS 에스터).

수용체 및 공여체 RNA 결찰

일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 수용체 RNA와 공여체 RNA 사이에 형성된 루프로부터 정해진 거리에 있는 결찰 부위에서 결찰된다. 예를 들어, 결찰 부위는 수용체 RNA와 공여체 RNA 사이에 형성된 루프로부터 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 결찰 부위는 루프로부터 2개 또는 3개의 염기쌍이다. 수용체 RNA와 공여체 RNA 사이에 형성된 루프 구조는 길이가 다양할 수 있다. 예를 들어, 수용체 RNA와 공여체 RNA 사이에 형성된 루프는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 루프 길이는 4이다. 4의 루프 길이는 본 명세서에서 테트라루프라 한다. 일부 실시형태에서, 루프는 7개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 수용체 및 공여체 RNA는 수용체 RNA와 공여체 RNA 사이에 형성된 융기로부터 정해진 거리에 있는 결찰 부위에서 결찰된다. 예를 들어, 수용체 RNA와 공여체 RNA의 결찰은 융기로부터 적어도 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 10개, 11개 또는 12개의 염기쌍이 떨어진 결찰 부위에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA와 공여체 RNA의 결찰은 융기로부터 3개, 4개, 5개 또는 11개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생한다.

수용체 RNA와 공여체 RNA 사이의 염기 페어링은 하부 스템 및/또는 상부 스템에서 발생할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 뉴클레오타이드 상보성을 갖는다. 뉴클레오타이드 상보성은 부분적일 수 있으며, 예를 들어, 수용체 RNA와 공여체 RNA 사이의 상보성은 약 50% 내지 약 99%의 상보성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 완벽하게 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다.

일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 약 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6 또는 1:0.5의 비로 존재한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 종래의 합성 방법을 사용하여 생성된 gRNA와 비교하여 개선된 수율을 갖는 gRNA를 생산할 수 있게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 수율이 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상 개선된다.

일부 실시형태에서, 상부 및/또는 하부 스템의 GC 함량은 RNA 결찰 반응의 수율, 생산성 및 순도에 영향을 미친다.

일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 상부 스템에 GC 염기쌍을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 단일 공여체 단편은 다양한 수용체 단편과 함께 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 공여체 단편은 다양한 수용체 단편의 하나 이상의 조합과 페어링될 수 있는 보편적인 공여체 단편으로 작용할 수 있다.

일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 상부 스템에 GC 염기쌍을 포함하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 상부 스템에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 GC 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 상부 스템에 2개의 GC 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 예시적인 상부 스템 뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: CGAUACGACAGAAC(서열번호 1); CGCCG(서열번호 2); CGGCCGC(서열번호 3); CGCGC(서열번호 4); 및 CGAU(서열번호 5).

일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 하부 스템에 GC 염기쌍을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 하부 스템에 GC 염기쌍을 포함한다.

일부 실시형태에서, 수용체 및 공여체 RNA의 농도는 약 1 g/ℓ 내지 5 g/ℓ이다. 일부 실시형태에서, 수용체 및 공여체 RNA의 농도는 생성된 gRNA의 수율, 생산성 및 순도에 영향을 미친다.

일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 RNA 결찰 반응의 수율 또는 생산성에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 또는 40℃이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 15℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 16℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 17℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 18℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 19℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 20℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 21℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 22℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 23℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 24℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 25℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 26℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 27℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 28℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 29℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 30℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 31℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 32℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 33℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 34℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 35℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 36℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 37℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 38℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 39℃이다. 일부 실시형태에서, 결찰 반응이 일어나는 온도는 약 40℃이다.

일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 완벽한 상보성을 갖는 적어도 2개의 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 하부 스템에 5개의 정규(canonical) 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 하부 스템에 2개의 비정규(non-canonical) 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 상부 스템에 2개의 정규 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 RNA 및 공여체 RNA는 8개의 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 염기쌍은 연속적이 아니다. 일부 실시형태에서, 염기쌍은 연속적이다.

gRNA를 사용한 유전자 편집

본 명세서에 기재된 합성 gRNA는 유전자 침묵 이벤트 또는 목적하는 표적 유전자의 발현에서 발현의 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)을 초래할 수 있는 표적화된 유전자 편집을 위한 적합한 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 gRNA는 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피솜 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 위한 방법에서 사용될 수 있으며, 방법은 진핵 세포에 (a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 합성 가이드 RNA(gRNA); (b) 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질 또는 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하되; (a) 및 (b)와 염색체 DNA의 표적 서열 간의 상호작용은 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피솜 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 유발한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 RNA는 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA로서, RNA 가이드는 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함하는, 상기 합성 가이드 RNA; 유전자 편집 단백질을 포함하는 유전자 편집 시스템에 사용될 수 있으며, 유전자 편집 효소는 RNA 가이드에 결합할 수 있고 RNA 가이드에 상보적인 표적 핵산 서열의 파손을 유발할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 RNA는 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA로서, RNA 가이드는 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함하는, 상기 합성 가이드 RNA; 및 유전자 편집 단백질을 포함하는 유전자 편집 시스템에 사용될 수 있으며; 유전자 편집 단백질은 데아미네이스에 융합되고, 유전자 편집 단백질 융합은 RNA 가이드에 결합할 수 있고 RNA 가이드에 상보적인 표적 핵산 서열을 편집할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 표적 핵산의 발현을 변경하는 방법을 제공하며, 세포를 유전자 편집 단백질 및 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하되, RNA 가이드는 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함하고, 유전자 편집 단백질은 RNA 가이드에 결합할 수 있고 RNA 가이드에 상보적인 표적 핵산 서열의 파손을 유발할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 표적 핵산의 발현을 변경하는 방법을 제공하며, 세포를 유전자 편집 단백질 및 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하되, RNA 가이드는 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함하고, 유전자 편집 단백질은 RNA 가이드에 결합할 수 있고 RNA 가이드에 상보적인 표적 핵산 서열을 편집할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공하며, 세포를 유전자 편집 단백질 및 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하되, RNA 가이드는 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함하고, 유전자 편집 단백질은 RNA 가이드에 결합할 수 있고 RNA 가이드에 상보적인 표적 핵산 서열을 편집할 수 있다.

일부 실시형태에서, 유전자 편집 방법 또는 시스템은 부위-특이적 방식으로 표적 DNA를 변형시키는 효과기를 갖는 융합 단백질을 포함하되, 변형 활성은 메틸트랜스퍼레이스 활성, 데메틸레이스 활성, 아세틸트랜스퍼레이스 활성, 데아세틸레이스 활성, 카이네이스 활성, 포스파테이스 활성, 유비퀴틴 라이게이스 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모화 활성, 탈수모화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 인테그레이스 활성, 트랜스포세이즈 활성, 리콤비네이스 활성, 폴리머레이스 활성, 라이게이스 활성, 헬리케이스 활성 또는 뉴클레이스 활성, DNA 또는 DNA-관련 폴리펩타이드를 변형시킬 수 있는 임의의 것(예를 들어, 히스톤 또는 DNA 결합 단백질)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 유전자 편집 방법 또는 시스템은 아데노신 또는 사이토신 염기를 변형시키며 부위-특이적 염기 편집기로 기능할 수 있는 데아미네이스 효소를 포함하여 뉴클레오타이드 염기를 화학적으로 변형시킴으로써 DNA 서열을 편집할 수 있는 효소와 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일반적으로 RNA를 기질로 사용하는 APOBEC1 사이티딘 데아미네이스는 Cas9에 융합될 때 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA를 표적으로 하여 사이티딘을 우리딘으로 직접 전환시킬 수 있으며, TadA 효소는 아데노신을 이노신으로 탈아미노화하도록 진화되었다. 따라서, 데아미네이스를 사용한 '염기 편집'은 하나의 표적 DNA 염기를 또 다른 염기로 프로그램 가능한 전환을 가능하게 한다. 다양한 염기 편집기가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기재된 방법 및 시스템에 사용될 수 있다. 예시적인 염기 편집기는, 예를 들어, 문헌[Rees and Liu Nature Review Genetics, 2018, 19(12): 770-788]에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 원용된다.

일부 실시형태에서, 염기 편집은 유전자를 침묵시키는 종결 코돈의 도입을 초래한다. 일부 실시형태에서, 염기 편집은 아미노산 서열을 변경시킴으로써 변경된 단백질 기능을 초래한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 표적 DNA의 전사를 조절하기 위한 유전자 편집 방법 또는 시스템에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 합성 가이드 RNA는 tRNA, rRNA, snoRNA, siRNA, miRNA 및 긴 ncRNA를 포함하여 표적 논-코딩 RNA의 발현을 조절하기 위한 유전자 편집 방법 또는 시스템에서 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 적합한 유전자 편집 시스템을 사용하여 염색질 루프 구조의 표적화 공학에 사용된다. 조절 게놈 영역 사이의 염색질 루프의 표적화 공학은 내인성 염색질 구조를 조작하고, 유전적 결함을 극복하거나 또는 비정상적인 인핸서-프로모터 연결을 저해하기 위해 새로운 인핸서-프로모터 연결의 형성을 가능하게 하는 수단을 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 유익한 임상적 변이체 또는 억제인자 돌연변이의 삽입에 의한 병원성 돌연변이의 교정을 위한 유전자 편집 시스템과 함께 사용된다.

치료적 적용

본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 다양한 치료적 적용을 위한 유전자 편집 시스템에서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 장애 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 장애 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 유전자 편집 시스템과 함께 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 유전자 편집 시스템이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, CRISPR-Cas9, Cpf1, SpCas9, SaCas, Cas12 및 프라임 편집 Cas 등을 포함한다. 본 명세서에 기재된 합성 gRNA는 임의의 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 다양한 질환 및 장애, 예를 들어, 유전적 장애(예를 들어, 단일유전성 질환), 뉴클레이스 활성에 의해 치료될 수 있는 질환 및 다양한 암 등을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 표적 핵산을 편집하여 표적 핵산을 변형시키기 위해(예를 들어, 하나 이상의 핵산 잔기를 삽입, 결실 또는 돌연변이시킴으로써) 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 본 명세서에 기재된 합성 gRNA와 함께 사용되고, 바람직한 핵산 서열을 포함하는 외인성 공여체 주형 핵산(예를 들어, DNA 분자 또는 RNA 분자)을 포함한다. CRISPR 시스템으로 유도된 절단 이벤트의 해결시, 세포의 분자 기구는 절단 이벤트를 복구 및/또는 해결하는데 외인성 공여체 주형 핵산을 이용할 것이다. 대안적으로, 세포의 분자 기구는 절단 이벤트를 복구 및/또는 해결하는데 내인성 주형을 이용할 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 표적 핵산을 변경하여 삽입, 결실 및/또는 점 돌연변이를 초래하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, 삽입은 무흔(scarless) 삽입이다(즉, 표적 핵산으로의 의도된 핵산 서열의 삽입은 절단 이벤트의 해결시 추가적인 의도하지 않은 핵산 서열이 발생하지 않음). 공여체 주형 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA)일 수 있다.

일 양태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 RNA, 독성 RNA 및/또는 돌연변이된 RNA(예를 들어, 스플라이싱 결함 또는 절단)의 과발현에 의해 야기되는 질환을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 다양한 질환을 유발하는 RNA-의존적 기능에 영향을 미치는 트랜스-작용 돌연변이를 표적화하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 스플라이싱 결함 및 질환을 유발할 수 있는 시스-작용 스플라이싱 코드를 파괴하는 돌연변이를 표적으로 하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 특히 RNA 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 위한 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 RNA 서열을 표적화하기 위해 선택된 적합한 합성 RNA 가이드를 사용하여 바이러스 RNA를 표적화하기 위해.

본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 암을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 비정상적(예를 들어, 점 돌연변이를 포함하거나 또는 대안적으로-스플라이싱됨)이며 암 세포에서 발견되어 암 세포에서 세포 사멸을 (예를 들어, 세포자멸사를 통해) 유도하는 RNA 분자를 표적화함으로써.

본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 대상체에서 감염성 질환을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 사용될 수 있다. 예를 들어, 감염원 세포에서 세포 사멸을 표적화하고 유도하기 위해 감염원(예를 들어, 세균, 바이러스, 기생충 또는 원생동물)에 의해 발현된 RNA 분자를 표적화함으로써. 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 세포내 감염원이 숙주 대상체의 세포를 감염시키는 질환을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 서열을 표적 DNA 서열에 삽입하는 것이 바람직한 적용에서, 삽입될 공여체 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 세포에 제공된다. "공여체 서열" 또는 "공여체 폴리뉴클레오타이드"는 부위-지정 변형 폴리펩타이드에 의해 유도된 절단 부위에 삽입되는 핵산 서열을 의미한다. 공여체 폴리뉴클레오타이드는 그것과 그것이 상동성을 지니는 게놈 서열 사이의 상동성-지정 복구를 지원하기 위해, 예를 들어, 절단 부위의 약 50개 이하의 염기 이내, 예를 들어, 절단 부위의 약 30 염기 이내, 약 15개의 염기 이내, 약 10개의 염기 이내, 약 5개의 염기 이내 또는 그 바로 측면에 위치하는 절단 부위의 게놈 서열에 대해 충분한 상동성, 예를 들어, 절단 부위의 측면에 있는 뉴클레오타이드 서열에 대해 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 상동성을 포함할 것이다. 공여체와 게놈 서열 간의 서열 상동성의 대략 25개, 50개, 100개 또는 200개의 뉴클레오타이드 또는 200개 초과의 뉴클레오타이드(또는 10개 내지 200개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상 사이의 임의의 정수 값)는 상동성-지정 복구를 지원할 것이다. 공여체 서열은, 예를 들어, 10개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 50개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 100개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 250개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 500개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 1000개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 5000개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상 등의 임의의 길이일 수 있다.

공여체 서열은 전형적으로 대체하는 게놈 서열과 동일하지 않다. 오히려, 공여체 서열은 상동성-지정 복구를 지원하기에 충분한 상동성이 존재하는 한 게놈 서열과 관련하여 적어도 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 역전 또는 재배열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공여체 서열은 표적 DNA 영역과 2개의 측면에 있는 서열 사이의 상동성-지정 복구가 표적 영역에서 비-상동성 서열의 삽입을 초래하도록 상동성의 2개의 영역이 측면에 위치하는 비-상동성 서열을 포함한다. 공여체 서열은 또한 관심 DNA 영역에 상동성이 아니며 관심 DNA 영역으로 삽입되도록 의도되지 않은 서열을 포함하는 벡터 백본을 포함할 수 있다. 일반적으로, 공여체 서열의 상동성 영역(들)은 재조합이 필요한 게놈 서열에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가질 것이다. 소정의 실시형태에서, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9%의 서열 동일성이 존재한다. 공여체 폴리뉴클레오타이드의 길이에 따라 1%와 100% 사이의 임의의 값의 서열 동일성이 존재할 수 있다.

공여체 서열은 게놈 서열과 비교하여 소정의 서열 차이, 예를 들어, 제한 부위, 뉴클레오타이드 다형성, 선별 마커(예를 들어, 약물 저항성 유전자, 형광 단백질, 효소 등) 등을 포함할 수 있으며, 이는 절단 부위에서 공여체 서열의 성공적인 삽입을 평가하는데 사용될 수 있거나 또는 일부 경우에 다른 목적을 위해(예를 들어, 표적화된 게놈 유전자좌에서 발현을 보여주기 위해) 사용될 수 있다. 일부 경우에, 코딩 영역에 위치하는 경우, 이러한 뉴클레오타이드 서열 차이는 아미노산 서열을 변경하지 않거나 또는 아미노산 변경(즉, 단백질의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 변경)을 침묵시킬 것이다. 대안적으로, 이러한 서열 차이는 마커 서열의 제거를 위해 나중에 활성화될 수 있는 FLP, loxP 서열 등과 같은 측면에 있는 재조합 서열을 포함할 수 있다.

공여체 서열은 단일-가닥 DNA, 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 DNA 또는 이중-가닥 RNA로서 세포에 제공될 수 있다. 이는 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여체 서열의 발단은 당업자에게 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 핵산말단 분해적 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이데옥시뉴클레오타이드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 추가될 수 있고/있거나 자가-상보적인 올리고뉴클레오타이드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하기 위한 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 추가 및, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 선형 공여체 서열의 말단을 보호하는 것에 대한 대안으로서, 재조합에 영향을 미치지 않고 분해될 수 있는 상동성 영역의 외부에 추가적인 길이의 서열이 포함될 수 있다. 공여체 서열은, 예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 항생제 저항성을 암호화하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 포함될 수 있다. 더욱이, 공여체 서열은 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 네이키드 핵산으로 도입될 수 있거나, 또는 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산에 대해 상기 기재된 바와 같이 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV)에 의해 전달될 수 있다.

위에 기재된 방법에 따라, 관심 DNA 영역은 생체외에서 절단되고 변형, 즉, "유전적으로 변형"될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선별 마커가 관심 DNA 영역에 삽입되었을 때, 세포 집단은 나머지 집단으로부터 유전적으로 변형된 세포를 분리함으로써 유전적 변형을 포함하는 것에 대해 농축될 수 있다. 농축 후, "유전적으로 변형된" 세포는 세포 집단의 약 1% 이상(예를 들어, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상)만을 구성할 수 있다. "유전적으로 변형된" 세포의 분리는 사용된 선별 마커에 적절한 임의의 편리한 분리 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 형광 마커가 삽입된 경우, 세포는 형광 활성화된 세포 분류에 의해 분리될 수 있는 반면, 세포 표면 마커가 삽입된 경우, 세포는 친화성 분리 기법, 예를 들어, 자성 분리, 친화성 크로마토그래피, 고체 매트릭스에 부착된 친화성 시약을 이용한 "패닝" 또는 기타 편리한 기법에 의해 이종 집단으로부터 분리될 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기법은 다중 색상 채널, 낮은 각도 및 둔각 광 산란 검출 채널, 임피던스 채널 등과 같이 다양한 정도의 정교함을 가질 수 있는 형광 활성화된 세포 분류기를 포함한다. 세포는 활성이 없는 세포와 관련된 염료(예를 들어, 프로피듐 아이오다이드)를 이용하여 활성이 없는 세포에 대해 선택될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포의 생존력에 과도하게 해를 끼치지 않는 임의의 기법이 사용될 수 있다. 변형된 DNA를 포함하는 세포에 대해 고도로 농축된 세포 조성물은 이러한 방식으로 달성된다. "고도로 농축된"은 유전적으로 변형된 세포가 세포 조성물의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 예를 들어, 세포 조성물의 약 95% 이상 또는 98% 이상일 것임을 의미한다. 다시 말해서, 조성물은 유전적으로 변형된 세포의 실질적으로 순수한 조성물일 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 유전적으로 변형된 세포는 즉시 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 액체 질소 온도에서 동결될 수 있고, 장기간 동안 보관될 수 있으며, 해동되고 재사용될 수 있다. 이러한 경우에, 세포는 일반적으로 10% 다이메틸설폭사이드(DMSO), 50% 혈청, 40% 완충 매질 또는 이러한 동결 온도에서 세포를 보존하기 위해 당업계에서 일반적으로 사용되는 일부 다른 용액에 동결되고, 동결된 배양 세포를 해동하기 위해 당업계에 일반적으로 알려진 방식으로 해동된다.

유전적으로 변형된 세포는 다양한 배양 조건하에 시험관내에서 배양될 수 있다. 세포는 배양에서 확장, 즉, 증식을 촉진하는 조건하에 성장될 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어, 아가, 메틸셀룰로스 등을 포함하는 액체 또는 반-고체일 수 있다. 세포 집단은 일반적으로 태아 송아지 혈청(약 5% 내지 10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-머캅토에탄올 및 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 Iscove의 변형된 DMEM 또는 RPMI 1640과 같은 적절한 영양 배지에 현탁될 수 있다. 배양물은 조절 T 세포가 반응하는 성장 인자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 성장 인자는 막관통 수용체에 대한 특이적인 효과를 통해 배양물 또는 온전한 조직에서 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진할 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 인자를 포함한다.

이러한 방식으로 유전적으로 변형된 세포는, 예를 들어, 질환을 치료하기 위한 유전자 요법과 같은 목적을 위해 대상체에게 이식되거나 또는 항바이러스, 항병원성 또는 항암 치료제로서, 농업에서 유전자 변형된 유기체를 생산하거나 또는 생물학적 연구를 위해 사용된다. 대상체는 신생아, 청소년 또는 성인일 수 있다. 특히 흥미로운 것은 포유동물 대상체이다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 포유동물 종은 개 및 고양이; 말; 소; 양; 등 및 영장류, 특히 인간을 포함한다. 동물 모델, 특히 소형 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼목(예를 들어, 토끼) 등)가 실험적 조사에 사용될 수 있다.

세포는 단독으로 또는, 예를 들어, 이식되는 조직에서의 성장 및/또는 조직화를 지원하기 위해 적합한 기질 또는 매트릭스와 함께 대상체에게 제공될 수 있다. 일반적으로, 적어도 1×10³개의 세포, 예를 들어, 5×10³개의 세포, 1×10⁴개의 세포, 5×10⁴개의 세포, 1×10⁵개의 세포, 1×10⁶개 이상의 세포가 투여될 수 있다. 세포는 임의의 다음 경로를 통해 대상체에게 도입될 수 있다: 비경구, 피하, 정맥내, 두개내, 척수내, 안구내 또는 척수액. 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 세포는 또한 형질전환 동물(예를 들어, 형질전환 마우스)을 생성할 목적으로 배아(예를 들어, 배반포)에 도입될 수 있다.

대상체에 대한 치료의 투여 횟수는 다양할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포를 대상체에게 도입하는 것은 일회성 이벤트일 수 있지만; 소정의 상황에서, 이러한 치료는 제한된 기간 동안 개선을 이끌어낼 수 있으며 지속적인 일련의 반복된 치료가 필요할 수 있다. 다른 상황에서, 효과가 관찰되기 전에 유전적으로 변형된 세포의 다중 투여가 필요할 수 있다. 정확한 프로토콜은 치료될 개별 대상의 질환 또는 병태, 질환의 단계 및 매개변수에 따라 다르다.

본 발명의 다른 양태에서, DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 질환을 치료하기 위한 유전자 요법과 같은 목적을 위해 또는 항바이러스, 항병원성 또는 항암 치료제로, 농업에서 유전자 변형된 유기체를 생산하거나 또는 생물학적 연구를 위해 다시 생체내에서 세포 DNA를 변형시키는데 사용된다. 이러한 생체내 실시형태에서, DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 개체에게 직접 투여된다. DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 펩타이드, 소분자 및 핵산을 대상체에게 투여하기 위한 임의의 다수의 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 투여될 수 있다. DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 다양한 제형에 혼입될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 적절한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와의 조합에 의해 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.

약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 비히클에 존재하는 하나 이상의 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이다. "약제학적으로 허용 가능한 비히클"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 인간과 같은 포유동물에서 사용하기 위한 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 비히클일 수 있다.

용어 "비히클"은 본 발명의 화합물이 포유동물에게 투여하기 위해 제형화되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다. 이러한 약제학적 비히클은 지질, 예를 들어, 리포솜, 예를 들어, 리포솜 덴드리머; 액체, 예컨대, 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 오일, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등, 식염수; 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 요소 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사제, 흡입제, 겔, 마이크로스피어 및 에어로졸과 같은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 이와 같이, DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 투여는 경구, 협측, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 기관내, 안구내 등의 투여를 비롯한 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 활성제는 투여 후 전신적일 수 있거나, 또는 국소 투여, 벽내(intramural) 투여의 사용 또는 이식 부위에서의 활성 용량을 유지하도록 작용하는 이식물의 사용에 의해 국부화될 수 있다. 활성제는 즉각적인 활성을 위해 제형화될 수 있거나, 또는 지속 방출을 위해 제형화될 수 있다.

일부 병태, 특히 중추 신경계 병태의 경우, 이는 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier: BBB)을 가로지르는 작용제로 제형화해야 할 수 있다. 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통한 약물 전달을 위한 한 가지 전략은 만니톨 또는 류코트라이엔과 같은 삼투압 수단에 의해 또는 브래디키닌과 같은 혈관활성 물질을 사용하여 생화학적으로 BBB의 파괴를 수반한다. 뇌종양에 대한 특정 작용제를 표적화하기 위해 BBB 개방을 사용할 가능성도 또한 하나의 옵션이다. BBB 파괴제는 혈관내 주사에 의해 투여될 때 본 발명의 치료적 조성물과 병용 투여될 수 있다. BBB를 통과하는 다른 전략은 카베올린-1 매개성 세포통과, 글루코스 및 아미노산 담체와 같은 담체-매개성 수송인자, 인슐린 또는 트랜스페린을 위한 수용체-매개성 세포통과 및 p-당단백질과 같은 능동 방출 수송인자를 포함한 내인성 수송 시스템의 사용을 수반할 수 있다. 능동 수송 모이어티는 또한 혈관의 내피 벽을 가로질러 수송을 촉진하기 위해 본 발명에서 사용하기 위한 치료적 화합물에 접합될 수 있다.

대안적으로, BBB의 배후에서의 치료제의 약물 전달은 국부 전달, 예를 들어, 척추강내 전달에 의한 것일 수 있다.

전형적으로, 유효량의 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 생체외 방법과 관련하여 위에 논의된 바와 같이, 생체내에서 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 유효량 또는 유효 용량은 음성 대조군, 예를 들어, 빈 벡터 또는 관련 없는 폴리펩타이드와 접촉된 세포에 비해 2개의 상동성 서열 사이에서 관찰된 재조합 양의 2배 이상의 증가를 유도하는 양이다. 재조합의 양은, 예를 들어, 위에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 편리한 방법에 의해 측정될 수 있다. 투여될 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 유효량 또는 유효 용량의 계산은 당업자의 기술 범위 내에 있으며 당업자에게 일상적일 것이다. 투여될 최종 양은 투여 경로 및 치료될 장애 또는 병태의 특성에 따라 달라질 것이다.

특정 환자에게 주어진 유효량은 다양한 인자에 따라 달라질 것이며, 그 중 몇 가지는 환자마다 다를 것이다. 숙련된 임상의는 필요에 따라 질환 병태의 진행을 멈추거나 역전시키기 위해 환자에게 투여할 치료제의 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 임상의는 LD50 동물 데이터 및 작용제에 대해 이용 가능한 기타 정보를 활용하여 투여 경로에 따라 개체에 대한 최대 안전 용량을 결정할 수 있다. 예를 들어, 정맥내로 투여된 용량은 치료적 조성물이 투여되는 더 많은 체액을 고려할 때 척추강내로 투여된 용량보다 더 많을 수 있다. 유사하게는, 체내에서 빠르게 제거되는 조성물은 치료적 농도를 유지하기 위하여 더 높은 용량으로 또는 반복된 용량으로 투여될 수 있다. 숙련된 임상의는 일상적인 기술을 활용하여 일상적인 임상 시험의 과정에서 특정 치료의 용량을 최적화할 수 있을 것이다.

약제에 포함시키기 위해, DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 적합한 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일반적인 제안으로서, 용량당 비경구적으로 투여되는 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 총 약제학적 유효량은 용량 반응 곡선에 의해 측정될 수 있는 범위에 있을 것이다.

DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드에 기반한 요법, 즉, 치료적 투여에 사용되는 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 제제는 멸균 상태여야 한다. 멸균은 멸균 여과 막(예를 들어, 0.2㎛ 막)을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 치료적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 있는 용기, 예를 들어, 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알에 배치된다. DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드에 기반한 요법은 단위 또는 다중-용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 또는 바이알에 수용액 또는 재구성을 위한 동결건조된 제형으로 보관될 수 있다. 동결건조된 제형의 예로서, 10㎖의 바이알에 5㎖의 멸균-여과된 1%(w/v)의 화합물 수용액을 넣고 생성된 혼합물을 동결건조시킨다. 주입 용액은 정균 주사용수를 사용하여 동결건조된 화합물을 재구성시킴으로써 제조된다.

약제학적 조성물은 목적하는 제형에 따라 동물 또는 인간 투여용 약제학적 조성물을 제형화하는데 일반적으로 사용되는 비히클로서 정의되는 약제학적으로 허용 가능한 희석제의 비-독성 담체를 포함할 수 있다. 희석제는 조합의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 완충수, 생리 식염수, PBS, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액이다. 또한, 약제학적 조성물 또는 제형은 다른 담체, 보조제 또는 비-독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제, 습윤제 및 세제와 같은 생리학적 조건을 근사화하기 위해 추가적인 물질을 포함할 수 있다.

조성물은 또한, 예를 들어, 항산화제와 같은 임의의 다양한 안정화제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물이 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 생체내 안정성을 향상시키거나 또는 그렇지 않으면 약리학적 특성을 향상시키는(예를 들어, 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키고, 독성을 감소시키고 용해도 또는 흡수를 향상시킴) 다양한 잘 알려진 화합물과 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 변형 또는 착화제의 예는 설페이트, 글루코네이트, 시트레이트 및 포스페이트를 포함한다. 조성물의 핵산 또는 폴리펩타이드는 또한 생체내 속성을 향상시키는 분자와 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 분자는, 예를 들어, 탄수화물, 폴리아민, 아미노산, 다른 펩타이드, 이온(예를 들어, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 망가니즈) 및 지질을 포함한다.

약제학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 활성 성분의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하는 것을 포함하여 세포 배양 및/또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 따라 결정될 수 있다. 독성과 치료적 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, LD50/ED50의 비로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 요법이 바람직하다.

세포 배양 및/또는 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에 대한 다양한 투여량을 공식화하는데 사용될 수 있다. 활성 성분의 투여량은 전형적으로 독성이 낮은 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다.

약제학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 성분은 바람직하게는 고순도이며, 잠재적으로 유해한 오염물질이 실질적으로 없다(예를 들어, 적어도 국립 식품(National Food: NF) 등급, 일반적으로 적어도 분석용 등급 및 보다 전형적으로 적어도 약제학적 등급). 더욱이, 생체내 사용을 위한 조성물은 일반적으로 멸균 상태이다. 주어진 화합물이 사용 전에 합성되어야 하는 정도까지, 생성된 생성물은 전형적으로 합성 또는 정제 과정 동안 존재할 수 있는 임의의 잠재적인 독성 물질, 특히 임의의 내독소가 실질적으로 없다. 비경구 투여를 위한 조성물도 또한 멸균되고, 실질적으로 등장성이며 GMP 조건하에 제조된다.

전달 시스템

본 명세서에 기재된 합성 RNA는 목적하는 유전자 편집 시스템 구성 요소와 함께 다양한 전달 시스템, 예컨대, 벡터, 예를 들어, 플라스미드 및 전달 벡터에 의해 관심 세포에 전달될 수 있다.

본 명세서에 기재된 합성 RNA는 유기 또는 무기일 수 있는 나노입자에 의해 전달될 수 있다. 나노입자 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 적합한 나노입자 디자인이 게놈 편집 시스템 구성 요소 또는 이러한 구성 요소를 암호화하는 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유기(예를 들어 지질 및/또는 중합체) 나노입자는 본 개시내용의 소정의 실시형태에서 전달 비히클로 사용하기에 적합할 수 있다. 나노입자 제형 및/또는 유전자 전달에 사용하기 위한 예시적인 지질은 표 1(하기)에 나타나 있다.

표 2는 유전자 전달 및/또는 나노입자 제형에 사용하기 위한 예시적인 중합체를 열거하고 있다.

표 3은 본 명세서에 기재된 Cas9를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 전달 방법을 요약한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 합성 gRNA를 포함하는 게놈 편집 시스템의 전달은 리보핵단백질(RNP)을 세포에 전달함으로써 달성될 수 있다. RNP는 표적화 gRNA와의 복합체로 핵산 결합 단백질, 예를 들어, Cas9를 포함한다. RNP는, 예를 들어, 문헌[Zuris, J.A. et al., 2015, Nat. Biotechnology, 33(1):73-80]에 의해 보고된 바와 같이 전기천공, 뉴클레오펙션 또는 양이온성 지질-매개성 방법과 같은 공지된 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. RNP는 CRISPR 염기 편집 시스템, 특히 일차 세포와 같이 형질감염이 어려운 세포에 사용하기에 유리하다. 또한, RNP는 또한 특히 CRISPR 플라스미드에 사용될 수 있는 진핵 프로모터, 예를 들어, CMV 또는 EF1A가 잘 발현되지 않을 때, 세포에서 단백질 발현과 함께 발생할 수 있는 어려움을 완화시킬 수 있다. 유리하게는, RNP의 사용은 외래 DNA를 세포에 전달할 필요가 없다. 더욱이, 핵산 결합 단백질 및 gRNA 복합체를 포함하는 RNP는 시간이 지남에 따라 분해되기 때문에, RNP의 사용은 표적외 효과를 제한할 가능성이 있다. 플라스미드 기반 기법과 유사한 방식으로, RNP는 결합 단백질(예를 들어, Cas9 변이체)을 전달하고 상동성 지정 복구(HDR)를 지시하기 위해 사용될 수 있다.

CRISPR 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 합성 gRNA를 포함)을 구동하는데 사용되는 프로모터는 AAV ITR를 포함할 수 있다. 이는 벡터에서 공간을 차지할 수 있는 추가적인 프로모터 요소의 필요성을 제거하는데 유리할 수 있다. 확보된 추가적인 공간은 추가적인 요소, 예컨대, 가이드 핵산 또는 선별 마커의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. ITR 활성은 상대적으로 약하므로, 선택된 뉴클레이스의 과발현으로 인해 잠재적인 독성을 줄이는데 사용될 수 있다.

임의의 적합한 프로모터는 Cas9 및 적절한 경우 가이드 핵산의 발현을 구동하는데 사용될 수 있다. 보편적인 발현의 경우, 사용될 수 있는 프로모터는 CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등을 포함한다. 뇌 또는 기타 CNS 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: 모든 뉴런의 경우 시냅신I, 흥분성 뉴런의 경우 CaMKII알파, GABA성 뉴런의 경우 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT 등. 간 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 알부민 프로모터를 포함한다. 폐 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 SP-B를 포함할 수 있다. 내피 세포의 경우, 적합한 프로모터는 ICAM을 포함할 수 있다. 조혈 세포의 경우, 적합한 프로모터는 IFN베타 또는 CD45를 포함할 수 있다. 골아세포의 경우, 적합한 프로모터는 OG-2를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 별도의 프로모터는 동일한 핵산 분자 내에서 염기 편집기 및 양립 가능한 가이드 핵산의 발현을 구동한다. 예를 들어, 벡터 또는 바이러스 벡터는 염기 편집기를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터 및 가이드 핵산에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함할 수 있다.

가이드 핵산의 발현을 구동하는데 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: Pol III 프로모터, 예컨대, U6 또는 H1, gRNA 아데노 관련 바이러스(AAV)를 발현하기 위한 Pol II 프로모터 및 인트로성 카세트의 사용.

Cas9 및 합성 gRNA는 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 사용하여, 특히, 예를 들어, 미국 특허 제8,454,972호(아데노바이러스에 대한 제형, 용량), 미국 특허 제8,404,658호(AAV에 대한 제형, 용량) 및 미국 특허 제5,846,946호(DNA 플라스미드에 대한 제형, 용량), 및 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스를 포함하는 임상 시험에 관한 임상 시험 및 간행물로부터의 제형 및 용량을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,454,972호 및 AAV를 포함한 임상 시험에서와 같을 수 있다. 아데노바이러스의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,404,658호 및 아데노바이러스를 포함하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 플라스미드 전달의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제5,846,946호 및 플라스미드를 포함하는 임상적 연구에서와 같을 수 있다. 용량은 평균 70㎏의 개체(예를 들어, 남성 성인 인간)를 기준으로 하거나 또는 이에 대해 추정될 수 있고, 상이한 체중 및 종의 환자, 대상체, 포유동물에 대해 조정될 수 있다. 투여 빈도는 연령, 성별, 일반적인 건강, 환자 또는 대상체의 기타 병태, 다루어지는 특정 병태 또는 증상을 포함하는 일반적인 요인에 따라 개업의 또는 수의 전문의(예를 들어, 의사, 수의사)의 범위 내에 있다. 바이러스 벡터가 관심 조직에 주사될 수 있다. 세포-유형 특이적 염기 편집의 경우, 염기 편집기 및 선택적 가이드 핵산의 발현은 세포-유형 특이적 프로모터에 의해 구동될 수 있다.

생체내 전달의 경우, AAV는 다른 바이러스 벡터보다 유리할 수 있다. 일부 경우에, AAV는 독성이 낮으며, 이는 면역 반응을 활성화할 수 있는 세포 입자의 초원심분리가 필요하지 않은 정제 방법으로 인한 것일 수 있다. 일부 경우에, AAV는 숙주 게놈에 통합되지 않기 때문에 삽입 돌연변이유발이 발생할 가능성이 낮다.

AAV의 패키징 제한은 4.5Kb 또는 4.75Kb이다. 4.5Kb 또는 4.75Kb보다 큰 작제물은 바이러스 생산을 크게 감소시킬 수 있다. 예를 들어, SpCas9는 꽤 크며, 유전자 자체가 4.1Kb를 초과하여 AAV에 패킹하기 어렵다. 따라서, 본 개시내용의 실시형태는 종래의 Cas9보다 길이가 짧은 개시된 Cas9를 이용하는 것을 포함한다.

AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다. 표적화될 세포와 관련하여 AAV의 유형을 선택할 수 있고; 예를 들어, 뇌 또는 신경 세포를 표적화하기 위해 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 임의의 이들의 조합을 선택할 수 있으며; 심장 조직을 표적화하기 위해 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달에 유용하다. 이들 세포에 관한 소정의 AAV 혈청형의 표는 문헌[Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)]에서 찾을 수 있다.

렌티바이러스는 유사분열 및 유사분열 후 세포 모두에서 유전자를 감염시키고 발현하는 능력을 갖는 복잡한 레트로바이러스이다. 가장 일반적으로 알려진 렌티바이러스는 다른 바이러스의 외피 당단백질을 사용하여 광범위한 세포 유형을 표적으로 하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다.

렌티바이러스는 다음과 같이 제조될 수 있다. pCasES10(렌티바이러스 전달 플라스미드 백본을 포함함)을 클로닝한 후, 10% 태아 소 혈청을 포함하고 항생제가 없는 DMEM에서 형질감염시키기 전날에 낮은 계대(p=5)의 HEK293FT를 T-75 플라스크에 50% 컨플루언스에 도달하도록 시딩한다. 20시간 후, 배지를 OptiMEM(무혈청) 배지로 교체하고, 4시간 후 형질감염을 수행한다. 세포를 10㎍의 렌티바이러스 전달 플라스미드(pCasES10) 및 다음 패키징 플라스미드: 5㎍의 pMD2.G(VSV-g 유사형) 및 7.5㎍의 psPAX2(gag/pol/rev/tat)로 형질감염시킨다. 양이온성 지질 전달제(50㎕의 리포펙타민 2000 및 100㎕의 Plus 시약)를 사용하여 4㎖의 OptiMEM에서 형질감염을 수행할 수 있다. 6시간 후, 배지를 10% 태아 소 혈청이 포함된 항생제 무함유 DMEM으로 교체한다. 이 방법은 세포 배양 중에 혈청을 사용하지만, 무혈청 방법이 바람직하다.

렌티바이러스는 다음과 같이 정제될 수 있다. 바이러스 상청액을 48시간 후 수확한다. 상청액은 먼저 찌꺼기를 제거하고, 0.45㎛의 저단백질 결합(PVDF) 필터를 통해 여과한다. 그런 다음, 이를 초원심분리기에서 24,000rpm에서 2시간 동안 회전시킨다. 바이러스 펠릿을 4℃에서 밤새 50㎕의 DMEM에 재현탁시킨다. 그런 다음, 이를 분취하여 즉시 -80℃에서 동결시킨다.

또 다른 실시형태에서, 말 감염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV)에 기반한 최소 비-영장류 렌티바이러스 벡터도 또한 상정된다. 또 다른 실시형태에서, 망막하 주사를 통해 전달되는 혈관억제 단백질 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현하는 말 감염성 빈혈 바이러스-기반 렌티바이러스 유전자 요법 벡터인 RetinoStat®이 상정된다. 또 다른 실시형태에서, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터의 사용이 상정된다.

시스템의 임의의 RNA, 예를 들어, 가이드 RNA 또는 Cas9-암호화 mRNA는 RNA의 형태로 전달될 수 있다. Cas9 암호화 mRNA는 시험관내 전사를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, Cas9 mRNA는 다음 요소를 포함하는 PCR 카세트를 사용하여 합성될 수 있다: T7 프로모터, 선택적 코작 서열(GCCACC), 뉴클레이스 서열 및 3' UTR, 예컨대, 베타 글로빈-폴리A 꼬리로부터의 3' UTR. 카세트는 T7 폴리머레이스에 의한 전사에 사용될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA)는 또한 T7 프로모터, 이어서 서열 "GG" 및 가이드 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 카세트로부터의 시험관내 전사를 사용하여 전사될 수 있다.

발현을 향상시키고 가능한 독성을 줄이기 위해, Cas9 서열 및/또는 가이드 핵산은, 예를 들어, 유사-U 또는 5-메틸-C를 사용하여 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하도록 변형될 수 있다.

일부 실시형태에서 본 개시내용은 세포 또는 유기체를 변형시키는 방법을 이해한다. 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 비인간 영장류, 소, 돼지, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 본 개시내용의 염기 편집기, 조성물 및 방법에 의해 세포에 도입되는 변형은 세포 및 세포의 자손이 항체, 전분, 알코올 또는 기타 목적하는 세포 산출물과 같은 생물학적 생성물의 개선된 생산을 위해 변경되도록 할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 세포에 도입된 변형은 세포 및 세포의 자손이 생성된 생물학적 생성물을 변화시키는 변경을 포함하도록 할 수 있다.

시스템은 하나 이상의 상이한 벡터를 포함할 수 있다. 일 양태에서, Cas9는 목적하는 세포 유형, 우선적으로 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 인간 세포의 발현을 위해 코돈 최적화된다.

일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열에서 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 50개 이상의 코돈)을 해당 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하지만 천연 아미노산 서열은 유지함으로써 관심 숙주 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 소정의 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체간 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA) 번역의 효율성과 상관관계가 있으며, 이는 결국 특히 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 달려 있는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는, 예를 들어, www.kazusa.orjp/codon/(2002년 7월 9일 방문)에서 이용 가능한 "코돈 사용 데이터염기"에서 쉽게 사용할 수 있으며, 이러한 표는 여러 방식으로 적합화될 수 있다. 문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)] 참조. Gene Forge(압타겐(Aptagen); 펜실베니아주 제이코버스 소재)와 같은 특정 숙주 세포에서의 발현을 위한 특정 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘도 또한 이용 가능하다. 일부 실시형태에서, 조작된 뉴클레이스를 암호화하는 서열에서 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 50개 이상 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 해당한다.

패키징 세포는 전형적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포 및 레트로바이러스를 패키징하는 psi.2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자에 패키징하는 세포주를 생산함으로써 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 내로의 후속 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 포함하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오타이드(들)에 대한 발현 카세트로 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로(in trans) 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈으로의 통합에 필요한 AAV 게놈으로부터의 ITR 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자를 암호화하는 헬퍼 플라스미드, 즉, rep 및 cap를 포함하지만 ITR 서열은 결여되어 있는 세포주에 패키징될 수 있다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스에 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진할 수 있다. 일부 경우에, 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열처리에 의해 감소될 수 있다.

약제학적 조성물

본 개시내용의 다른 양태는 유전자 편집 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 합성 gRNA를 포함)을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적 용도를 위해 제형화된 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 (예를 들어, 특이적 전달, 반감기 증가 또는 기타 치료적 화합물을 위해) 추가적인 작용제를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 화합물을 신체의 한 부위(예를 들어, 전달 부위)에서 또 다른 부위(예를 들어, 장기, 조직 또는 신체의 일부)로 운반하거나 또는 수송하는데 관여하는, 약제학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 활석 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아르산) 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 제형의 다른 성분과 양립 가능하며 대상체의 조직에 해롭지 않다(예를 들어, 생리학적으로 적합한, 멸균, 생리학적 pH 등)는 의미에서 "허용 가능"하다.

약제학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 (1) 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화된 트래거캔스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG); (12) 에스터, 예컨대, 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대, 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; (15) 알긴산; (16) 무발열원수; (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스터, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; (22) 벌킹제, 예컨대, 폴리펩타이드 및 아미노산; (23) 혈청 알코올, 예컨대, 에탄올; 및 (23) 약제학적 제형에 이용되는 다른 비-독성 상용성 물질을 포함한다. 습윤제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 향료, 방부제 및 항산화제가 또한 제형에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "약제학적으로 허용 가능한 담체", "비히클" 등과 같은 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

약제학적 조성물은 생리학적 pH를 반영하는 미리 결정된 수준, 예컨대, 약 5.0 내지 약 8.0의 범위로 제형의 pH를 유지하기 위해 1종 이상의 pH 완충 화합물을 포함할 수 있다. 수성 액체 제형에 사용되는 pH 완충 화합물은 히스티딘과 같은 아미노산 또는 아미노산의 혼합물, 또는 히스티딘 및 글리신과 같은 아미노산의 혼합물일 수 있다. 대안적으로, pH 완충 화합물은 바람직하게는 제형의 pH를 약 5.0 내지 약 8.0의 범위와 같은 미리 결정된 수준으로 유지하고 칼슘 이온을 킬레이트화하지 않는 작용제이다. 이러한 pH 완충 화합물의 예시적인 예는 이미다졸 및 아세테이트 이온을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. pH 완충 화합물은 제형의 pH를 미리 결정된 수준으로 유지하기에 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다.

약제학적 조성물은 또한 1종 이상의 삼투 조절제, 즉, 제형의 삼투 특성(예를 들어, 긴장성, 삼투질 농도 및/또는 삼투압)을 수용(recipient) 개체의 혈류 및 혈액 세포에서 허용 가능한 수준으로 조절하는 화합물을 포함할 수 있다. 삼투 조절제는 칼슘 이온을 킬레이트화하지 않는 작용제일 수 있다. 삼투 조절제는 제형의 삼투 특성을 조절하는 당업자에게 공지되거나 또는 이용 가능한 임의의 화합물일 수 있다. 당업자는 본 제형에 사용하기 위한 주어진 삼투 조절제의 적합성을 경험적으로 결정할 수 있다. 적합한 유형의 삼투 조절제의 예시적인 예는 염, 예컨대, 소듐 클로라이드 및 소듐 아세테이트; 당, 예컨대, 수크로스, 덱스트로스 및 만니톨; 아미노산, 예컨대, 글리신; 및 이들 작용제 및/또는 작용제의 유형 중 1종 이상의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 삼투 조절제(들)는 제형의 삼투 특성을 조절하는데 충분한 임의의 농도로 존재할 수 있다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 유전자 편집을 위해 대상체에게 전달하기 위해 제형화된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 투여하기에 적합한 경로는 제한 없이 다음을 포함한다: 국소, 피하, 경피, 피내, 병변내, 관절내, 복강내, 방광내, 경점막, 잇몸, 치아내, 와우내, 고실경유, 조직내, 경막외, 척추강내, 근육내, 정맥내, 혈관내, 골내, 안구주위, 종양내, 대뇌내 및 뇌실내 투여.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 병든 부위에 국부적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해 또는 이식물에 의해 대상체에게 투여되며, 이식물은 시알라스틱 막 또는 섬유와 같은 막을 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다.

다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(예를 들어, 제어 방출의 의학적 적용(문헌[Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974] 참조); 제어된 약물 생체이용률, 약물 제품 설계 및 성능(문헌[Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61])). 또한, 문헌[Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et ah, 1989, J. Neurosurg. 71: 105.] 참조. 다른 제어 방출 시스템, 예를 들어, 위의 Langer에 논의되어 있다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체, 예를 들어, 인간에게 정맥내 또는 피하 투여하기에 적합화된 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 일부 실시형태에서, 주사 투여용 약제학적 조성물은 가용화제로서 멸균 등장성 용액 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위한 리그노카인과 같은 국부 마취제이다. 일반적으로, 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰풀 또는 사셰와 같은 완전 밀폐 용기에 건조 동결건조 분말 또는 물이 없는 농축액으로 개별적으로 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합되어 공급된다. 의약품이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 의약품 등급의 물 또는 식염수가 들어 있는 주입 병과 함께 분배될 수 있다. 약제학적 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있다.

전신 투여를 위한 약제학적 조성물은 액체, 예를 들어, 멸균 식염수, 락테이트 링거 용액 또는 행크 용액일 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 고체 형태일 수 있고, 사용 직전에 재용해되거나 또는 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태도 또한 상정된다. 약제학적 조성물은 비경구 투여에도 적합한 리포솜 또는 미세결정과 같은 지질 입자 또는 소포 내에 포함될 수 있다. 입자는 조성물이 그 안에 포함되어 있는 한 단층 또는 다층과 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 화합물은 융해성 지질 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 낮은 수준(5몰% 내지 10몰%)의 양이온성 지질을 포함하는 "안정화된 플라스미드-지질 입자"(stabilized plasmid-lipid particle: SPLP)에 포획되고, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 코팅에 의해 안정화될 수 있다(문헌[Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47]). N-[l-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸-암모늄메틸설페이트 또는 "DOTAP"와 같은 양으로 하전된 지질은 이러한 입자 및 소포에 특히 바람직하다. 이러한 지질 입자의 제조는 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는, 미국 특허 제4,880,635호; 제4,906,477호; 제4,911,928호; 제4,917,951호; 제4,920,016호; 및 제4,921,757호 참조.

본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은, 예를 들어, 단위 용량으로 투여 또는 패키징될 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물과 관련하여 사용될 때 용어 "단위 용량"은 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 필요한 희석제; 즉, 담체 또는 비히클과 관련하여 목적하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 포함한다.

또한, 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태의 본 발명의 화합물을 포함하는 용기 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 희석제(예를 들어, 본 발명의 동결건조된 화합물의 재구성 또는 희석에 사용되는 멸균물)를 포함하는 제2 용기를 포함하는 약제학적 키트로 제공될 수 있다. 선택적으로 이러한 용기(들)와 관련된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형식의 통지일 수 있으며, 이 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.

또 다른 양태에서, 위에 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 포함하는 제조 물품이 포함된다. 일부 실시형태에서, 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 테스트 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 만들어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 용기는 본 명세서에 기재된 질환을 치료하는데 효과적인 조성물을 담고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다. 조성물 내 활성제는 본 발명의 화합물이다. 일부 실시형태에서, 용기 상의 라벨 또는 용기와 관련된 라벨은 조성물이 선택된 질환을 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 제조 물품은 인산 완충 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 일부로서 CRISPR 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 포함)이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 제공된 임의의 융합 단백질(예를 들어, LubCas9를 포함하는 본 명세서에 기재된 핵염기 편집기 포함)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 제공된 임의의 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 gRNA 및 양이온성 지질과 복합체를 형성하는 RNA-가이드된 뉴클레이스(예를 들어, Cas9)를 포함하는 리보핵단백질 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 gRNA, 핵산 프로그램 가능 DNA 결합 단백질, 양이온성 지질 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 치료적으로 활성인 물질을 포함할 수 있다.

키트

일 양태에서, 본 명세서에 기재된 합성 gRNA는 위의 방법 및 조성물에 개시된 요소 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트에 의해 제공되고/되거나 생성될 수 있다. 예를 들어, 키트는 수용체 RNA, 공여체 RNA, 라이게이스 및 적합한 완충 시약을 포함할 수 있다. 수용체 RNA, 공여체 RNA 및 라이게이스는 본 명세서에 개시된 임의의 것일 수 있다.

일부 실시형태에서, 키트는 핵염기 편집기를 더 포함한다.

일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 요소 중 하나 이상을 이용하는 과정에서 사용하기 위한 1종 이상의 시약을 포함한다. 시약은 임의의 적합한 용기에 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 반응 또는 보관 완충액을 제공할 수 있다. 시약은 특정 검정에 사용할 수 형태 또는 사용 전에 하나 이상의 다른 구성 요소를 추가할 필요가 있는 형태(예를 들어, 농축액 또는 동결건조된 형태)로 제공될 수 있다. 완충액은 소듐 카보네이트 완충액, 소듐 바이카보네이트 완충액, 보레이트 완충액, Tris 완충액, MOPS 완충액, HEPES 완충액 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 완충액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충액은 알칼리성이다. 일부 실시형태에서, 완충액은 약 7 내지 약 10의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 키트는 가이드 서열 및 조절 요소를 작동 가능하게 연결하기 위해 벡터 내로 삽입하기 위한 가이드 서열에 상응하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 상동성 재조합 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 참조에 의해 원용된다. 또한, 물질, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본 명세서에 기재되어 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 제조하고 실시하는 바람직한 모드의 일부를 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다.

실시예 1. RNA의 전통적인 합성

RNA의 전통적인 합성은 플라스미드 DNA의 사용 및 포스포라미다이트 화학을 사용한 고체상 합성("합성 RNA")을 포함한다. 합성 RNA의 화학적 합성 및 효소적-기반 합성의 비교가 아래에 상세히 설명된다.

방향성

합성 RNA는 전형적으로 3'에서 5' 방향으로 합성된다. sgRNA의 경우, 이는 대부분의 부산물이 5' 말단의 스페이서 영역에 절단이 있어 표적 편집이 더 낮아질 것임을 의미한다.

기질

화학적 합성 반응성이 높은 단량체를 이용한다. 이러한 단량체는 작용기에 의해 화학적으로 보호되어 부반응을 줄이고 목적하는 반응이 정확한 합성 단계에서 발생하도록 한다. 이러한 단량체는 그들 사이에서 공통적으로 포스포라미다이트 작용기를 지칭하는 "아미다이트"로 지칭된다. 포스포라미다이트 코어를 둘러싼 화학기는 크기 변형될 수 있으며, 자연 발생적 뉴클레오타이드와 유사할 필요는 없다. 이러한 이유로, 화학적 합성은 천연 뉴클레오타이드와 유사하지 않은 당, 염기, 백본 또는 작용기를 포함하는 고도로 변형된 단량체를 끼워 넣는데 사용될 수 있다.

순차성

합성 RNA는 전형적으로 고체 지지체에서 서열-제어 중합을 통해 합성된다. 화학적 합성은 각각 다양한 단계를 포함하는 주기로 수행된다(도 1 참조). 이러한 서열은 원치 않는 뉴클레오타이드 또는 결실을 최대한 방지하도록 설계된다. 임의의 주어진 단계에서 커지는 중합체에 혼입되지 않는 올리고는 혼입에 "실패"한 서열의 위치 이상으로 확장되는 것을 방지하기 위하여 "캐핑"된다. "커플링 효율"은 각 주기의 전체 효율을 지칭하는 용어이다. 이 값은 아미다이트의 특성에 크게 좌우되지만, 기기의 설계 또는 반응의 규모의 영향도 받을 수 있다. 전형적인 DNA 커플링 효율은 98% 내지 99.5% 정도이며, 일반적으로 RNA보다 DNA가 더 크다.

정제

올리고 생성물은 먼저 탈보호되고, 정제 전에 고체 지지체로부터 절단된다. 정제는 전형적으로 전기영동 분리(즉, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 "PAGE") 또는 보다 일반적으로 칼럼 크로마토그래피(즉, HPLC)에 의해 수행된다. HPLC는 음이온-교환 또는 역상 이온-페어링 매질의 고정상을 사용하여 수행된다. 두 방법은 모두 전장 생성물의 길이가 증가함에 따라 분해능이 기하급수적으로 손실된다. 이는 특히 정제 후 FLP와의 혼합물에서 가장 흔한 부산물이 전장 생성물과 길이가 유사할 것이기 때문에 문제가 된다. 또한, GMP-등급 물질에 필요한 대규모 합성은 전형적으로 커플링 효율이 낮기 때문에, 연구 목적으로 물질을 생산하는데 사용되는 소규모 합성에 비해 순도가 감소하고 부가 생성물의 수가 증가한다. 커플링 효율의 차이는 가장 일반적으로 합성 규모가 증가함에 따라 더 긴 커플링 시간이 필요하기 때문에 발생한다. 길이가 대략 100nt인 올리고(즉, 염기 편집에 사용되는 가이드 RNA)는 단지 몇 nt만이 더 짧은 올리고와 물리적으로 분리하기 어렵다. 이러한 제한으로 인해, CMO로부터의 gRNA의 순도는 50% 내지 90% 범위에서 가장 자주 얻어진다. 전형적인 합성 gRNA 합성 전략의 경우, 나머지 10% 내지 50%를 구성하는 대부분의 불순물은 스페이서 영역(주로 절단 생성물)의 결실 및 부가 생성물을 포함한다. 이러한 유형의 불순물은 불량한 편집 효율 및/또는 표적외 편집을 초래할 것이다.

긴 RNA의 생산을 위한 변형된 과정의 이점

화학적 합성에 의해 고순도의 긴 RNA(예를 들어, 100개의 뉴클레오타이드 이상)를 생산하는 방법은 다음과 같은 여러 가지 이유로 바람직하다: 감소된 표적외 편집, 고효율 편집, 전통적인 합성 접근법에 비해 증가된 순도, 증가된 수율, 비용 감소 및 합성된 RNA의 뉴클레오타이드의 변형을 위한 다양성.

RNA를 생산하기 위한 변형된 화학적 합성 접근법은 표적외 편집을 감소시킬 수 있다. 순도 및 표적외 편집은 상관관계가 있을 수 있다. 표적외 및 표적 편집 모두를 감소시키는 것으로 보이는 절단 산물(주요 부산물)에 대해 정반대를 시사하는 증거가 있지만; 부가 생성물은 표적외 편집을 증가시킬 가능성이 있다.

RNA를 생산하기 위한 변형된 화학적 합성 접근법은 고효율 편집을 초래할 있다. 이는 적어도 대부분의 불순물(예를 들어, 절단)이 편집 활성을 감소시키기 때문이다.

RNA를 생산하기 위한 변형된 화학적 합성 접근법은 전통적인 합성 접근법에 비해 순도를 증가시킬 수 있다. 합성 RNA의 증가된 순도는 인간 환자의 치료에 사용하기 위한 규제 기관 승인에 더욱 적합하다.

RNA를 생산하기 위한 변형된 화학적 합성 접근법은 수율을 증가시키고 비용을 줄일 수 있다. 합성 RNA 과정의 수율은 전형적으로 합성 RNA의 길이에 따라 기하급수적으로 감소한다. 전형적으로, 20% 내지 30%의 전장 생성물(FLP)이 반응에서 생성되지만(따라서, 반응에서 생성된 FLP의 90% 초과가 정제 동안 소실됨), 이론적 수율의 3% 내지 5%만이 정제 후에 얻어진다. 예로서, 비용은 5그램의 GMP-등급 FLP(10그램의 50% 순도의 물질)에 대해 "1백만 내지 2백만" 달러일 수 있다. FLP의 대부분이 정제 동안 단리될 수 있다면, 생산 비용은 5배 내지 10배 감소할 것이며, 이는 순도의 증가와 관련이 있다.

마지막으로, RNA를 생산하기 위한 변형된 화학적 합성 접근법은 효소적 합성을 사용하는 것이 불가능한 변형된 뉴클레오타이드 및 화학적 기능을 특이적으로 끼워 넣는 것을 가능하게 할 수 있다.

실시예 2: RNA 합성을 위한 결찰-기반 접근법

이 실시예에 기재된 결찰-기반 접근법은 전장 가이드 RNA(gRNA)를 생성하기 위해 후속적으로 결찰되는 하나 이상의 RNA 단편을 사용한다. 하나 이상의 RNA 단편을 생성하면 무엇보다도 부산물의 더 나은 분리로 인해 gRNA의 정제 후 수율이 향상된다.

결찰-기반 접근법의 한 양태는 생물학에서 사용되는 이중-가이드 RNA 시스템을 구성하는 crRNA와 tracrRNA 분자 사이에 형성된 나선(반복-항-반복 나선으로 알려짐)을 사용하여 두 합성 RNA의 효소적 결찰을 주형화한다. 이는 도 2에 도시되어 있다.

일부 실시형태에서, 이러한 나선의 길이 및 서열 조성은 적절한 비공유적 조립을 촉진하고 RNA 결찰에 적합한 효소에 대한 최적의 결찰 부위를 생성하도록 변형된다. 5개 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이가 이러한 유형의 회합에 바람직하다. 일부 실시형태에서, 효소적 결찰은 공여체 핵염기가 C이고 수용체가 A일 때 더 효율적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비공유적으로 조립된 RNA의 Tm(용융 온도)은 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 12℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃ 이상이다. 예를 들어, 스템의 길이는 결찰이 수행될 온도 이상에서 스템 루프의 형성을 촉진하고 또한 결찰이 적합하지 않은 자가-구조를 피하기 위해 충분히 길게 변형될 수 있다. 추가의 예로서, 스페이서 서열의 가변성은 결찰에 적합하지 않은 염기 페어링을 생성할 있으며, 이는 공여체 서열과 결합하기 전에 스페이서 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 추가함으로써 피할 수 있다.

일부 실시형태에서, tracrRNA 서열을 포함하는 RNA는 여러 라이게이스 중 하나에 의해 가변 프로토스페이서 영역("수용체"라 함)을 포함하는 제2 RNA의 3'-말단에 결찰되는 5'-말단("공여체"라 함)의 포스페이트로 합성된다. 일부 실시형태에서, tracrRNA 서열을 포함하는 RNA는 tracrRNA의 일부가 5'-말단에 포스페이트를 포함하도록 합성된다.

이러한 접근법으로 두 가지 형태의 결찰이 가능하며(도 3의 패널 A(1) 및 (2)), 이들 모두 스템 루프 영역 내에서 발견된다. 첫 번째 형태의 결찰은 T4 RNA 라이게이스 1의 천연 부위인 헤어핀의 말단 루프 내에서 발생한다. 두 번째 형태의 결찰은 T4 RNA 라이게이스 2 및 DNA 라이게이스의 천연 이중체 내에서 발생한다. 이러한 형태의 결찰의 이점 중 하나는 융합된 gRNA와 단편 불순물 사이의 용리 시간의 현저한 차이로 인해 단편 불순물이 쉽게 제거된다는 것이다(도 3의 패널 B).

본 발명의 또 다른 결찰-기반 접근법은 비-주형 접근법을 통한 2개 이상의 RNA 단편의 결찰을 포함한다. 이 접근법에서, 공여체 분자의 3' 말단의 3' 하이드록실은 화학적으로 차단되거나 또는 제거되고(예를 들어, 다이데옥시뉴클레오타이드), 효소(예를 들어, T4 RNA 라이게이스 1)는 두 분자 사이의 적절한 결찰을 촉매한다. 일반적으로, 이러한 결찰 전략은 더 높은 농도에서 선호된다.

이 실시예에 기재된 결찰 접근법은 핵산 구간을 서로 결합하는 효소의 클래스인 라이게이스를 사용한다. 이러한 라이게이스를 사용하는 것의 이점은 RNA 단편 사이에서 생성된 연결을 자연 발생적 RNA 또는 DNA와 구별할 수 없다는 것이다. 라이게이스는 RNA 또는 DNA에 작용하여 고효율로 반응을 수행한다.

일부 실시형태에서, 결찰을 위한 RNA 단편은 제1 RNA와 제2 RNA 단편에 상보성을 갖는 핵산 주형을 사용하여 결찰 반응을 위해 물리적으로 근접하게 될 수 있다. 이러한 주형은 본 명세서에서 스플린트로 지칭된다. 스플린트는 특정 라이게이스, 예를 들어, T4 RNA 라이게이스 1에 의해 결찰될 수 있는 루프를 생성하기 위해 불완전한 페어링으로 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 스플린트는 RNA의 2개 이상의 단편을 모으는데 사용된다.

일부 실시형태에서, RNA 단편은 결찰 반응 전에 서로 염기 페어링함으로써 회합될 수 있다. 이러한 접근법은 본 명세서에서 "자가-주형"으로 지칭된다. 자가-주형 접근법을 사용하여, RNA 단편의 결찰을 위해 선택될 수 있는 스템 루프의 위치는 루프 또는 올리고 중 하나가 짧은 스템-루프(예를 들어, 자가-주형 닉)를 포함하는 나선을 포함한다. 닉은 스플린트, 돌출부, 평활 말단에 포함될 수 있으며, 융기도 또한 사용될 수 있다(도 5 참조).

일부 실시형태에서, 결찰 반응은 미리 RNA 구간의 물리적 회합 없이도 고수율로 진행할 수 있다. 이러한 관점에서, 선택된 결찰 반응은 스플린트 또는 자가-주형을 사용할 필요가 없다.

본 발명의 상이한 결찰 접근법이 도 5에 도시되어 있다.

다양한 결찰 디자인이 본 명세서에 기재된 결찰-기반 접근법을 사용하여 조사되고 있다(도 6). 도 6에 도시된 바와 같이, 이들 디자인 중 하나는 스템 루프의 루프에 2개의 RNA 단편의 결찰을 포함한다(도 6의 패널 B); 또 다른 디자인은 스템 루프의 나선에 결찰을 포함한다(도 6의 패널 C).

이러한 결찰 전략은 결찰 부위에서 천연 포스페이트 연결을 형성하기 때문에 sgRNA를 합성하는데 사용되는 다른 보고된 화학적 결찰 전략과 다르다. 분할 합성 접근법을 사용하는 것의 이점은 전장 sgRNA와 비교하여 정제 후 RNA의 더 짧은 구간을 더 높은 순도로 생성할 수 있다는 것이다. 일부 실시형태에서, 5' 수용체는 가장 작은 RNA 단편(30개 내지 50개의 뉴클레오타이드)이므로, 결찰 전에 높은 수준으로 정제될 수 있다. 3' 공여체는 합성에 필요한 포스페이트로 종결되므로, 전장 단편만이 전장 생성물에 혼입될 것이다(즉, 절단은 기질이 아님).

이러한 이점은 pegRNA 또는 Cas12b gRNA와 같이 100개 초과의 뉴클레오타이드를 갖는 gRNA를 고려할 때 증가된다. 효소적 결찰의 유형은 수율이 매우 높으며(80% 초과), 올리고뉴클레오타이드 출발 물질이 결찰되는 생성물에서 높은 선택성으로 분리될 수 있어 전장 생성물이 매우 순수하도록 보장한다. 또한, 이러한 유형의 효소적 결찰은 비교적 저렴하고 확장성이 뛰어나다.

실시예 3: 예시적인 결찰-기반 RNA 합성 프로토콜

합성 RNA의 합성을 위한 예시적인 프로토콜이 아래에 제공된다.

1. 스템 크기 및 결찰 부위(루프 또는 나선)는 i) 사용된 라이게이스의 천연 기질에 대한 요구사항(예를 들어, 루프 대 나선 디자인) 및 ii) RNA 이중체 안정성에 대한 열역학적 알고리즘을 사용하여 결정되는 이분자 나선의 친화성을 기반으로 선택한다.

2. RNA 단편은 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 합성한다. 3' RNA 단편(공여체)은 합성의 마지막 단계에서 포함되는 말단 5' 포스페이트를 포함한다.

3. RNA 단편은 HPLC에 의해 정제한다(단편은 또한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 또는 이온-쌍 역상 크로마토그래피(IP-RP)를 사용하여 정제할 수 있음).

4. 어닐링: 각 올리고뉴클레오타이드(0.01mM 내지 1mM)를 어닐링 완충액(25mM KCl, 0.025mM EDTA)과 합한다. 80℃에서 0.5분 내지 5분 동안 가열한 다음 25℃가 될 때까지 0.1℃/초로 냉각시킨다.

5. 결찰: RNA 라이게이스 완충액을 첨가하여 1X 농도(20℃ 내지 37℃의 온도에서 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 1mM ATP(pH 7.5))를 달성한다. 5U 내지 10U의 T4 RNA 라이게이스 1/n㏖을 인산화된 5' 말단에 첨가한다. 20℃ 내지 37℃의 온도에서 밤새 인큐베이션한다. 0.5M EDTA를 첨가하여 종결시킨다.

6. 이온-쌍 역상 크로마토그래피(IP-RP)(잠재적으로 AEX도 가능)에 의한 정제를 사용한다.

7. SYBR Safe 및 IP-RP HPLC로 염색된 6% PAGE-D 겔에 의한 분석.

결찰 실험의 예시적인 결과는 도 7에 나타나 있다. 이 결찰을 위해, 10μM의 공여체 단편, 10μM의 수용체 단편, 1x T4 RNA 라이게이스 2 반응 완충액(NEB) 및 20 단위의 T4 RNA 라이게이스 2를 포함한 반응을 37℃에서 수행하였다. 도 7의 패널 A는 결찰 실험에 사용된 서열을 보여준다. 스템-결찰의 결과는 도 7의 패널 C에 나타나 있다. 전장 생성물을 HPLC뿐만 아니라 전장 생성물로부터의 RNA 수용체 및 공여체 단편의 분리에 의해 검출하였다.

실시예 4: 기재된 접근법과 선행 방법 간의 차이점

본 발명의 결찰 접근법은, 무엇보다도, 이전에 기재된 결찰 접근법이 단편 RNA 분자 사이의 비-천연 연결에 의존하고/하거나 비-천연 티라졸 연결을 통해 더 작은 RNA 분자를 sgRNA에 커플링하기 위해 아자이드-알카인 고리화 첨가 반응을 사용하는 것과 같은 비-주형 결찰 접근법을 사용하였기 때문에, 이전에 기재된 RNA 결찰 접근법과는 다르다. 이전에 기재된 바와 같은 비-천연 연결의 사용은 비-천연 연결이 생물학적 시스템에서 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있는 가능성을 포함하여 몇 가지 단점을 가지고 있다.

본 명세서에 기재된 결찰 접근법은 또한 RNA 단편을 전장 sgRNA로 결합시키기 위해 다른 버전의 "클릭-화학" 또는 기타 화학적 생체접합 방법을 사용하는 이전에 사용된 화학적 결찰 전략과 상이하다(도 4 참조). RNA 단편을 결합시키기 위해 이전에 기재된 다른 접근법은 아마이드-결찰 화학(예를 들어, 아마이드에 의한 18개의 원자 링커의 커플링) 및 자가-주형을 사용하여 sgRNA를 형성하는 것을 포함한다. 선행 접근법은 적어도 다음과 같은 이유로 불리하다: i) 결찰에 사용되는 화학기는 본 명세서에 기재된 본 발명에서 포스페이트의 혼입과 달리 높은 수율로 혼입될 가능성이 없으며; ii) 이전에 사용된 연결은 비-천연이며, 천연 포스포다이에스터 연결보다 훨씬 더 크다. 이러한 제한으로 인해, 이전에 기재된 RNA 결찰 접근법은 효능을 손상시키고 추가적인 규제 부담을 초래할 수 있다.

실시예 5: sgRNA의 생산 - 라이게이스의 비교

이 실시예에서, 하나는 결찰이 루프에서 발생하고 다른 하나는 결찰이 스템에서 발생한 2개의 작제물(도 3)을 평가하여 sgRNA 생성물의 가장 높은 수율을 초래한 라이게이스를 결정하였다. T4 RNA 라이게이스 1은 루프에서의 결찰에 사용하였고, T4 RNA 라이게이스 2는 스템에서의 결찰에 사용하였다.

도 3의 패널 A는 평가된 효소적 결찰을 위한 두 위치를 도시한다: (i) 스템-루프의 루프, 및 (ii) 나선. 두 경우 모두, 이 스템-루프를 연장하여 효소적 결찰을 위한 구간을 회합하는데 사용하였다. 도 3의 패널 B는 결찰 후 결찰되지 않은 RNA 단편을 제거하기 위해 HPLC를 포함하는 최종 정제 단계를 수행할 수 있음을 보여주는 대표적인 그래프를 도시한다. 전장 생성물로부터 RNA 단편의 정제가 가능하다.

합성 RNA의 순도 및 최종(정제 후) 수율을 제한하는 문제를 극복하는 조합된 화학적 및 효소적 전략을 사용하여 단일-가이드 RNA를 합성하는 과정을 개발하였다. L.O.N.G.E.S.T.(ligation of nucleic acid guides using enzymes and self-templating: 효소 및 자가-주형을 사용한 핵산 가이드의 결찰)라고 하는 이 접근법은 2개 이상의 부분적으로 상보적인 합성 RNA가 효소를 사용하여 결찰되는 결찰-기반 접근법을 사용한다. 일 실시형태에서, 생물학에서 SpCas9에 의해 사용되는 이중 가이드 RNA 시스템(반복-항-반복 나선으로 알려져 있음)을 구성하는 crRNA와 tracrRNA 분자 사이에서 나선이 형성되어 두 합성 RNA의 효소적 결찰을 주형화한다(도 3). 이러한 나선의 길이 및 서열 조성은 적절한 비공유적 조립을 촉진하고 RNP 복합체 활성의 감소 없이 RNA 결찰에 적합한 효소에 대한 최적의 결찰 부위를 생성하도록 변형될 수 있다. 대부분의 tracrRNA 서열을 포함하는 RNA는 T4 RNA 라이게이스 1 또는 T4 RNA 라이게이스 2에 의해 가변 프로토스페이서 영역(수용체라 함)을 포함하는 제2 RNA의 3'-말단에 결찰되는 5'-말단(공여체라 함)에서 포스페이트를 사용하여 합성될 수 있다. 두 가지 형태의 결찰이 이 접근법으로 예시되며(도 3), 첫 번째는 헤어핀의 말단 루프 내(T4 RNA 라이게이스 1의 기질)이고, 두 번째는 이중체 내(T4 RNA 라이게이스 2 및 DNA 라이게이스의 기질)이다.

이들 실험에서, T4 RNA 라이게이스 1 및 T4 RNA 라이게이스 2 둘 다와 공여체/수용체 RNA 단편 디자인을 평가하였다. 이들 gRNA에 대한 프로토스페이서는 알파 1이었다. T4 RNA 라이게이스 2가 T4 RNA 라이게이스 1과 비교하여 가장 높은 수율 및 최소 부산물을 생산하는 것으로 결정되었다. "표준" gRNA 디자인과 비교하여 최종 sgRNA 생성물에 2개의 염기만을 추가하고 본 명세서에서 조사한 조건하에 sgRNA의 정량적 수율을 생성하는 공여체/수용체 디자인이 또한 발견되었다.

실험 조건

T4 RNA 라이게이스 2를 포함한 모든 반응에는 10μM 공여체, 10μM 수용체, 1x T4 RNA 라이게이스 2 반응 완충액 및 20 단위의 T4 RNA 라이게이스 2를 포함시켰다. 모든 반응은 37℃에서 15시간 동안 수행하였다.

T4 RNA 라이게이스 1을 이용한 반응의 경우, 모든 반응에는 10μM 공여체, 10μM 수용체, NEB 반응 완충액, 1mM ATP 및 20 단위의 T4 RNA 라이게이스 1을 포함시켰다. 일부 반응에는 25%(wt/vol) PEG 8000도 포함시켰다. 반응은 25℃에서 15시간 동안 수행하였다.

모든 반응은 열순환기에서 50㎕에서 수행하였다. 결찰 전 복합체를 형성하기 위해, 용액을 먼저 라이게이스를 제외한 모든 구성 요소와 함께 70℃로 가열하고, T4 RNA 라이게이스 2 또는 T4 RNA 라이게이스 1의 경우 각각 37℃ 또는 25℃로 0.1℃/초로 천천히 냉각시켰다.

RNA 공여체 및 RNA 수용체 디자인 - T4 RNA 라이게이스 1 및 T4 RNA 라이게이스 2

RNA 수용체 1(Acp-01) 및 RNA 공여체 1(Dnr-1)로 구성된 스템-결찰 디자인을 먼저 평가하였다. 테트라루프의 결찰 후 나선은 상부 나선에 총 14개의 염기쌍(결찰 전 복합체의 단편 사이에 10개의 염기쌍)을 포함하고 혼합된 GCAU 함량을 가졌다(도 8의 패널 A). 이 반응은 T4 RNA 라이게이스 2가 존재하는 샘플에서 검출 가능한 단편의 양이 거의 없거나 전혀 없이 고수율이었다(도 8의 패널 B). 라이게이스 및 Dnr-01 또는 Acp-01만을 이용한 대조군 반응(미제시)은 부반응의 형성을 나타내지 않았다.

평가된 또 다른 RNA 공여체 및 RNA 수용체 디자인은 RNA 수용체 2(Acp-02) 및 RNA 공여체 2(Dnr-2)의 나선-결찰 디자인이었다. 결찰 후 나선은 상부 나선에 14개의 염기쌍을 포함하고 혼합된 GCAU 함량을 가졌다(도 9의 패널 A 및 패널 B). 이 반응은 T4 RNA 라이게이스 2를 사용한 반응보다 수율이 낮았다(약 60%). 라이게이스 및 (인산화된) Dnr-02만을 사용한 대조군 반응(미제시)은 부반응의 형성만을 보여주었다(Dnr-02의 고리화는 T4 RNA 라이게이스 1로 가능함). T4 RNA 라이게이스 2의 존재하에 Acp-02와 Dnr-02 사이의 반응은 T4 RNA 라이게이스 2가 이중 가닥 복합체를 필요로 하기 때문에 생성물을 형성하지 않았다. 이들 실험으로부터의 데이터는 T4 RNA 라이게이스 2가 T4 RNA 라이게이스 1보다 바람직함을 시사한다. 나머지 데이터는 T4 RNA 라이게이스 2를 사용하여 생성하였다.

RNA 공여체 및 RNA 수용체 디자인 - GC 함량 및 스템 뉴클레오타이드 길이의 영향

초기 Dnr-01/Acp-01 테트라루프 디자인과 비교하여 다음과 같은 특징을 공유하는 2개의 RNA 작제물을 평가하였다: i) 상부 및 하부 스템에서 더 높은 GC 함량 및 ii) 더 짧은 상부 스템(도 10의 패널 A 내지 패널 D). 하부 스템은 Cas9와 상호작용하는 것으로 이해되지만, 이전의 보고에 따르면 U 트랙의 4개의 염기 중 3개가 GC 염기쌍으로 대체될 수 있다. 이러한 치환을 갖는 sgRNA를 평가하였으며, 활성인 동안 이들의 활성은 표준 sgRNA 디자인보다 낮은 것으로 나타났다.

데이터는 라이게이스를 사용한 Acp-03과 Dnr-03 사이의 반응이 생산적이며, 고수율 합성에 적합함을 보여주었다. 라이게이스를 사용한 Acp-04와 Dnr-04 간의 반응은 생산적이었으며, Dnr-04 피크의 손실에 의해 표시된 바와 같이 완료되는 것처럼 보였다. Acp/Dnr-04 시스템은 Acp/Dnr-01 시스템보다 7개의 염기쌍이 더 짧지만 여전히 생산적이기 때문에 상당한 발전을 나타낸다.

하단 스템의 U 트랙이 부분적으로 GC 염기쌍으로 대체된 gRNA를 사용한 연구로부터 편집 결과가 감소한 후(Acp/Dnr-03 및 Acp/Dnr-04에 대해 나타낸 바와 같이), 하단 스템의 U 트랙을 변경하지 않고 더 짧은 상부 스템도 또한 포함하는 디자인을 평가하였다(도 11). Acp/Dnr-03의 결찰로부터 형성된 sgRNA의 상부 스템 서열과 유사한 상부 줄기 서열을 갖지만 결찰 부위는 테트라루프로부터 1bp 더 멀리 배치된 디자인(Acp/Dnr-06)도 또한 조사하였다.

데이터는 라이게이스를 사용한 Acp-05와 Dnr-05 사이의 반응이 Acp/Dnr-04 반응 시스템만큼 생산적임을 보여주었으며, 이는 이러한 초기 디자인에서 하부 스템 루프의 더 높은 GC 함량이 정량적 반응에 필요하지 않음(적어도 알파-1 프로토스페이서의 경우)을 나타낸다. 라이게이스를 사용한 Acp-06과 Dnr-06 사이의 반응도 또한 생산적이었다. 상부 스템 루프는 Acp/Dnr-03과 유사하며 결찰 부위의 위치만 바뀌었기 때문에, 이러한 결과는 테트라루프로부터 적어도 3개의 염기쌍이 떨어져 있는 결찰 부위가 효율적인 결찰을 가능하게 한다는 것을 나타낸다. Acp/Dnr-06 시스템은 "표준" sgRNA 디자인에 대한 최소한의 변경이 단일의 추가적인 염기쌍만을 보유하기 때문에 고수율 합성에 적합함을 보여준다.

결찰에 적합한지 확인하기 위해 "표준" sgRNA 디자인을 조사하였다(도 12). 상부 스템 루프는 4개의 염기쌍만을 포함하기 때문에, 결찰 부위는 테트라루프로부터 단지 2개의 염기쌍을 포함하였다. 라이게이스의 존재하에 Acp-07과 Dnr-07 사이의 반응은 수율이 낮았다(도 13). 추가적인 부반응도 존재하였으며, 이는 잘 조립된 이중체가 고수율 반응에 유용함을 추가로 나타낸다.

RNA 결찰 반응은 또한 공여체와 수용체 단편 사이의 자가-조립에 필요하지 않은 프로토스페이서 서열만 다른 2개의 상이한 수용체 단편(Acp-05 및 Acp-05_v2)과 함께 동일한 공여체 단편(Dnr-05)을 사용하여 수행하였다. 이는 다양한 수용체 단편과 조합하여 보편적인 공여체를 사용하는 개념을 설명한다.

RNA 공여체 및 RNA 수용체 디자인 - RNA 농도가 반응 생산성에 미치는 영향

RNA 농도가 반응 생산성에 미치는 영향을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 이러한 연구를 위해, Acp/Dnr-05 및 Acp/Dnr-6을 사용하였다. Acp/Dnr-05는 Acp/Dnr-6에 비해 더 안정적인 수용체/공여체 이중체를 가지고 있다. 이 연구에서, 두 단편의 농도가 sgRNA 생산성의 생산성과 관련이 있는 것으로 평가되었다(도 13). 데이터는 더 안정적인 A/D 이중체를 갖는 것이 더 높은 농도의 기질에서 더 높은 수율을 가능하게 한다는 것을 보여준다.

이러한 데이터에 기초하여, 제조에 적합한 농도는 1 ㎎/㎖ 이상이 될 수 있다. 또한, 결찰 반응의 온도도 또한 데이터에 영향을 미칠 것이다(본 명세서에 기재된 모든 실험은 37℃에서 수행하였음을 유의한다). 또한, T4 RNA 라이게이스 2가 20℃에서 효과적인 것으로 나타났다. 도 13은 수율이 최대 약 80%임을 보여주지만, 이는 결찰에 적합하지 않지만 여전히 출발 물질의 흡수를 위해 추가되는 공여체 단편으로부터의 절단과 같은 부산물이 있어 이 값이 과소평가되었기 때문일 수 있다.

sgRNA 생산성에 대한 열역학적 효과

테스트된 조건하에서, 더 열역학적으로 안정적인 이중체(길이 및/또는 GC 함량의 증가에 의해 형성됨)는 어느 정도까지는 더 높은 수율을 제공하였지만, 단지 약간의 변형이 훨씬 더 높은 수율을 가능하게 하는 동안 여전히 60%가 얻어졌기 때문에 "표준" 디자인에 대한 이러한 변경은 생성물을 형성하는데 필요하지 않으며, 이러한 이점은 1 및 10의 추가 bp가 모두 유사한 수율을 제공하는 반면 상부 나선에 4bp가 있는 "표준" sgRNA 디자인의 수율은 단지 1의 추가적인 bp가 상부 나선에서 사용되는 경우(AD-06)보다 상당히 낮다는 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 단지 1의 추가 bp에서 한계에 접근하므로 선형적으로 확장되지 않는다.

흥미로운 점은 본 명세서에 기재된 모든 연구는 37℃에서 수행하였으며, 이러한 T4 RNA 라이게이스 2는 더 낮은 온도에서도 견딜 수 있고, 그렇다면 더 낮은 온도에서 "표준" 4bp 상부 나선으로 더 높은 수율이 가능할 가능성이 있다는 것이다. 따라서, 조건을 변경하면 에너지 오프(energetic off) 조립이 변경된다. 따라서, RNA 디자인의 외부 또는 내부를 포함한 다양한 매개변수를 사용하여 이러한 목적을 달성할 수 있다. 이러한 조건은, 예를 들어, 반응 온도 및 RNA 농도의 변화를 포함한다.

결론

이들 데이터는 L.O.N.G.E.S.T. 접근법에 사용하기 위한 단편 및 라이게이스에 대한 설계 규칙을 확립하였다. 특히, T4 RNA 라이게이스 2는 T4 RNA 라이게이스 1보다 수율이 더 높고 부반응이 적다는 것을 발견하였다. 또한, T4 RNA 라이게이스 2는 테트라루프로부터 3개 이상의 염기쌍이 떨어져 있는 결찰 부위가 있는 이중 가닥 기질을 수용한다는 것을 발견하였다. 또한, 표준 sgRNA 디자인에 비해 고수율이며 하나의 추가적인 염기쌍만을 포함하는 단편 디자인(Acp/Dnr-06)이 발견되었다(각각 102개의 뉴클레오타이드 대 100개의 뉴클레오타이드). 추가의 연구는 편집 활성과 이 시스템에 대한 반응 확장과 관련하여 Acp/Dnr-06 디자인을 평가하는 것을 목표로 할 것이다.

실시예 6: 백본 변형에 대한 내성 및 온도 내성

백본 변형에 대한 내성

백본 변형에 대한 내성을 결정하기 위해 다양한 단편을 분석하였다. 다음과 같은 단편을 분석하였다: i) 완전한(fully) RNA, ii) 전형적으로 "말단 변형(end mod)"으로 지칭되는 말단에 2' O-메틸 및 포스포로티오에이트 기를 포함하는 것들, 및 iii) 결찰 부위의 변형을 포함하여 2' O-메틸기로 변형된 48개의 뉴클레오타이드(48%)를 포함하는 서열(5' 공여체 뉴클레오타이드 및 3' 수용체 뉴클레오타이드 모두). Acp/Dnr-05 및 Acp/Dnr-6 디자인을 기반으로 하는 두 세트의 변형된 가이드(각각 AD_09 및 AD_08)를 테스트하였다. 이들 연구로부터의 데이터는 도 14의 패널 A 및 패널 B에 나타나 있다. 이들 데이터는 광범위하게 변형된 단편의 성공적인 반응을 전체적으로 보여준다.

온도에 대한 내성

20℃ 및 37℃에서 gRNA를 생성하였다. 이들 실험으로부터의 데이터는 테스트된 온도 중 하나에서 반응이 생산적임을 보여주었다. 반응이 20℃(실온)에서도 기능한다는 발견은 반응이 강력하며 제조를 더 쉽게 만드는 온도에서 작동할 수 있음을 보여준다.

실시예 7: 세포에서의 염기 편집

정제된 생성물의 특정 유전자 표적에 대한 염기 편집 활성은 포유동물 세포에서 성공적으로 수행하였다. 이들 데이터는 각각 Acp-05 및 Dnr-05, Acp-06 및 Dnr-06 및 Acp-08 및 Dnr-08의 반응에서 DA-05, DA-06 및 AD-08을 사용하여 얻었다(도 15). 이 연구를 위해, 섬유아세포의 표적 부위를 아데닌 염기 편집기(ABE) 및 자가-주형 결찰 방법을 사용하여 합성된 세 가지 가이드 RNA(AD-08, AD-05, AD-06) 중 하나를 사용하여 편집하였다.

실시예 8: Cas12b 가이드 RNA

본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 Cas12b sgRNA를 합성할 수 있다. 도 16은 바실러스 히사시이로부터의 예시적인 Cas12b sgRNA인 bhCas12b sgRNA와 회합된 서열 및 구성을 도시하는 개략도이다. 테트라루프와 같은 다양한 2차 구조를 포함한 다양한 특징을 목적하는 Cas12b sgRNA를 생성하기 위해 분할 및 결찰을 위한 표적으로 사용할 수 있다.

도 16은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 sgRNA를 분할한 후 후속적으로 결찰하도록 표적화될 수 있는 다양한 예시적인 위치를 보여준다. 도 16은 가변 프로토스페이서 영역과 및 불변 영역을 모두 포함하는 bhCas12b sgRNA의 2차 구조를 보여준다. 라벨 A, B 및 C는 sgRNA를 분할하기 위한 위치로서 표적화될 수 있는 헤어핀 루프 구조를 나타낸다. C로 표기된 헤어핀의 이중체는 이 테트라루프가 Cas 단백질과 접촉하지 않기 때문에 루프 근위 위치에서 연장되어 공여체 및 수용체 혼성화를 촉진할 수 있다.

서열

표 4(하기)는 실시예 및 상응하는 도면에 참조된 서열을 나타낸다.

mN은 2'OMe 변형이 있는 뉴클레오타이드를 나타내고; N^*은 3' 포스포로티오에이트 변형이 있는 뉴클레오타이드를 나타내며; "p"는 포스페이트기가 있는 위치를 나타낸다.

등가물 및 범위

당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 단지 일상적인 실험만을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 위의 설명으로 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 하기 청구범위에 기재된 바와 같다.

SEQUENCE LISTING <110> Beam Therapeutics Inc. <120> SYNTHETIC GUIDE RNA, COMPOSITIONS, METHODS, AND USES THEREOF <130> BEM-002WO <140> PCT/US20/63084 <141> 2020-12-03 <150> 63/031,262 <151> 2020-05-28 <150> 62/943,158 <151> 2019-12-03 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 cgauacgaca gaac 14 <210> 2 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 cgccg 5 <210> 3 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 cggccgc 7 <210> 4 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 cgcgc 5 <210> 5 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 cgau 4 <210> 6 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 6 aucgacaaga aagggacuga guuuuagagc uaugcugu 38 <210> 7 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (79)..(81) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (79)..(81) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 7 cuuggaaaca agacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa 60 guggcaccga gucggugcuu uu 82 <210> 8 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 8 aucgacaaga aagggacuga guuuuagagc uaugcugucu ugcucga 47 <210> 9 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (73)..(75) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (73)..(75) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 9 uacaagacag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga aaaaguggca 60 ccgagucggu gcuuuu 76 <210> 10 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 10 aucgacaaga aagggacuga gcccuagagc g 31 <210> 11 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (68)..(70) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (68)..(70) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 11 gcgaaagccg caaguuaggg uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag ugggaccgag 60 ucggugcuuu u 71 <210> 12 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 12 aucgacaaga aagggacuga gcccuagagc cg 32 <210> 13 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (71)..(73) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (71)..(73) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 13 gcggaaacgc cggcaaguua ggguaaggcu aguccguuau caacuugaaa aagugggacc 60 gagucggugc uuuu 74 <210> 14 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 14 aucgacaaga aagggacuga guuuuagagc cg 32 <210> 15 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (71)..(73) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (71)..(73) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 15 gcggaaacgc cggcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aagugggacc 60 gagucggugc uuuu 74 <210> 16 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 16 aucgacaaga aagggacuga guuuuagagc 30 <210> 17 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (69)..(71) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (69)..(71) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 17 gcggaaacgc gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa gugggaccga 60 gucggugcuu uu 72 <210> 18 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 18 aucgacaaga aagggacuga guuuuagagc 30 <210> 19 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (67)..(69) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (67)..(69) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 19 uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu gggaccgagu 60 cggugcuuuu 70 <210> 20 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 20 uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu gggaccgagu 60 cggugcuuuu 70 <210> 21 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (41)..(72) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (69)..(71) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 21 gcggaaacgc gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga 60 gucggugcuu uu 72 <210> 22 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with 2'OMe modification <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide with a 3' phosphorothioate modification <400> 22 gaacacaaag cauagacugc guuuuagagc cg 32

Claims (123)

1. 방법으로서,
   제1 RNA와 제2 RNA를 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 상보적인 적어도 5개의 RNA 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 접촉은 스템 구조 또는 스템 루프 구조(stem loop structure)를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계, 및
   (i) 상기 스템 구조 내에서 또는
   (ii) 상기 스템 구조의 말단에서
   상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA를 결찰 효소로 결찰시켜 상기 스템 구조의 말단에서 루프를 형성하는 단계
   를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 스템 구조를 형성하고, 상기 결찰 효소는 상기 스템 구조의 말단에서 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA를 결찰하여 상기 스템 구조의 말단에서 루프를 형성하는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 스템 루프 구조를 형성하고, 상기 결찰 효소는 상기 스템 루프 구조의 스템 내에서 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA를 결찰하는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결찰 효소는 T4 RNA 라이게이스 1, T4 RNA 라이게이스 2, RtcB 라이게이스, 열-안정성 5' App DNA/RNA 라이게이스, 일렉트로라이게이스, T4 DNA 라이게이스, T3 DNA 라이게이스, T7 DNA 라이게이스, Taq DNA 라이게이스, SplintR 라이게이스 대장균 DNA 라이게이스, 9˚N DNA 라이게이스, CircLigase, CircLigase II, DNA 라이게이스 I, DNA 라이게이스 III 및 DNA 라이게이스 IV로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 결찰 효소는 T4 RNA 라이게이스 1인, 방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 결찰 효소는 T4 RNA 라이게이스 2인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA는 화학적으로 합성되는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA는 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복부(clustered regularly interspersed short palindromic repeat: CRISPR) RNA(crRNA)이고, 상기 제2 RNA는 트랜스-활성화 RNA(trans-activating RNA: tracrRNA)인, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA(gRNA)가 생성되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA는 화학적으로 합성되는, 방법.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA는 효소적으로 합성되는, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA를 결찰 효소로 결찰시키는 것은 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA 사이에 포스포다이에스터 연결을 생성하는, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA 뉴클레오타이드는 비공유적 조립이 가능하도록 조작되는, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스템 루프는 약 2개 내지 50개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 완벽한 상보성을 갖는 적어도 2개의 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 완벽한 상보성을 갖는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 완벽한 상보성을 갖는 RNA 뉴클레오타이드는 상단 스템 및/또는 하단 스템에 존재하는, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA에 의해 형성된 하부 스템에서 상보적인 적어도 5개, 6개 또는 7개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 적어도 4개 내지 14개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 4개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 5개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
22. 제19항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 7개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
23. 제19항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 상부 스템에 상보적인 14개의 연속 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 하부 스템에 상보적인 7개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA는 결찰 효소에 대한 결찰 부위를 생성하도록 조작되는, 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스템 루프는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개의 뉴클레오타이드의 루프를 포함하는, 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스템 루프는 테트라루프를 포함하는, 방법.
28. 제16항에 있어서, 상기 루프는 7개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA의 결찰은 상기 루프로부터 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생하는, 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 결찰 부위는 상기 루프로부터 2개 또는 3개의 염기쌍인, 방법.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA의 결찰은 융기(bulge)로부터 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생하는, 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA의 결찰은 상기 융기로부터 3개, 4개, 5개 또는 11개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생하는, 방법.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA는 효소적으로 생성되는, 방법.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA는 상기 제2 RNA의 일부와 염기 페어링할 수 있는 3' 서열을 포함하는, 방법.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA는 5' 말단에 포스페이트를 포함하는, 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 제1 RNA는 공여체(donor) RNA인, 방법.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 RNA는 가변 프로토스페이서 영역을 포함하는, 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 제2 RNA는 수용체(acceptor) RNA인, 방법.
39. 제35항에 있어서, 상기 제1 RNA는 5' 말단에 아데노신 트라이포스페이트를 포함하는, 방법.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약 8개 내지 50개의 뉴클레오타이드는 상보적이며, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA 사이의 염기 페어링을 허용하는, 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 8개 내지 50개의 뉴클레오타이드는 부분적으로 상보적인, 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 8개 내지 50개의 뉴클레오타이드는 약 50% 내지 99% 상보적인, 방법.
43. 제41항에 있어서, 상기 8개 내지 50개의 뉴클레오타이드는 완벽하게 상보적인, 방법.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 상이한 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 제1 RNA는 약 20개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 갖는, 방법.
46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 RNA는 약 20개 내지 70개의 뉴클레오타이드를 갖는, 방법.
47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 페어링은 하부 스템에서 발생하는, 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 7개의 뉴클레오타이드는 상기 하부 스템에서 상보적이며, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA 사이에서 염기 페어링을 허용하는, 방법.
49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 염기 페어링은 상부 스템에서 발생하는, 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 2개의 뉴클레오타이드는 상기 상부 스템에서 상보적이며, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA 사이에서 염기 페어링을 허용하는, 방법.
51. 제9항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 125개의 뉴클레오타이드, 약 150개의 뉴클레오타이드, 약 175개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 또는 약 200개 초과의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 방법.
52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 연장된 가이드 RNA, 프라임 편집기 가이드 RNA(pegRNA) 또는 Cas12 가이드 RNA 예컨대, Cas12a 가이드 RNA, Cas12b 가이드 RNA, Cas12c 가이드 RNA, Cas12d, 가이드 RNA, Cas12e 가이드 RNA, Cas12f 가이드 RNA, Cas12g 가이드 RNA, Cas12h 가이드 RNA, Cas12i 가이드 RNA, Cas12j 가이드 RNA 또는 Cas12k 가이드 RNA인, 방법.
53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 스페이서, 하부 스템, 융기, 상부 스템, 넥서스 및 헤어핀 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및 상기 제2 RNA는 약 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6 또는 1:0.5의 비로 존재하는, 방법.
55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 수율로 생성되는, 방법.
56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 종래의 합성 방법과 비교하여 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상 개선된 수율로 생성되는, 방법.
57. 합성 가이드 RNA(gRNA)를 생성하는 방법으로서,
    5'-모노포스페이트를 포함하는 제1 RNA를 제공하는 단계;
    제2 RNA를 제공하는 단계;
    상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA에 부분적으로 상보성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 상보성은 상기 제1 RNA와 제2 RNA와의 염기 페어링을 허용하는, 상기 제공하는 단계; 및
    상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 합성 gRNA를 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
58. 합성 가이드 RNA(gRNA)를 생성하는 방법으로서,
    5'-모노포스페이트를 포함하는 제1 RNA를 제공하는 단계;
    차단된 3' 말단을 포함하는 제2 RNA를 제공하는 단계; 및
    상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 합성 gRNA를 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 제1 RNA는 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA)이고, 상기 제2 RNA는 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA)인, 방법.
60. 제57항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 약 100개의 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
61. 합성 가이드 RNA(gRNA)를 생성하는 방법으로서,
    2개 이상의 RNA 단편을 제공하는 단계;
    상기 2개 이상의 RNA 단편에 부분적으로 상보성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 상보성은 2개 이상의 RNA 단편과의 염기 페어링을 허용하는, 상기 제공하는 단계; 및
    상기 2개 이상의 RNA 단편 사이의 결찰을 촉매하는 라이게이스를 제공하여 합성 가이드 RNA를 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
62. 제61항에 있어서, 상기 2개 이상의 RNA 단편은 돌출부, 평활 말단에서 또는 융기에서 결찰되는, 방법.
63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 합성된 가이드 RNA(gRNA) 또는 프라임 편집 가이드 RNA(pegRNA).
64. 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피솜 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 위한 방법으로서,
    (a) 제63항에 정의된 바와 같은 합성 가이드 RNA(gRNA);
    (b) 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질 또는 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 핵산
    을 진핵 세포에 도입하는 단계를 포함하되,
    (a) 및 (b)와 염색체 DNA의 표적 서열 간의 상호작용은 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피솜 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 유도하는, 방법.
65. 표적화된 RNA 변형을 위한 방법으로서,
    (a) 제63항에 정의된 바와 같은 합성 가이드 RNA(gRNA);
    (b) 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질 또는 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 핵산
    을 진핵 세포에 도입하는 단계를 포함하되,
    (a) 및 (b)와 염색체 DNA에 의해 발현되는 RNA 간의 상호작용은 상기 염색체 DNA에 의해 발현되는 상기 RNA의 변형을 유도하는, 방법.
66. 제65항에 있어서, 상기 염색체 DNA에 의해 발현되는 상기 RNA는 메신저 RNA(mRNA)인, 방법.
67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 단백질은 Cas9, Cpf1, SaCas, Cas12, Cas13 또는 이들의 변형된 버전으로부터 선택되는, 방법.
68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 합성 가이드 RNA(gRNA)를 생성하는 방법.
69. 제68항에 있어서, 상기 제2 RNA는 상기 제1 RNA의 일부와 염기 페어링을 할 수 있는 3' 서열을 포함하는, 방법.
70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 제2 RNA는 가변 프로토스페이서 영역을 포함하는, 방법.
71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA는 5' 말단에 포스페이트를 포함하는, 방법.
72. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 스템 루프 구조를 형성하고, 상기 결찰 효소는 상기 스템 루프 구조의 스템 내에서 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA를 결찰하는, 방법.
73. 제72항에 있어서, 상기 결찰 효소는 T4 RNA 라이게이스 2인, 방법.
74. 제73항에 있어서, 상기 스템 루프는 상기 상부 스템에 GC 염기쌍을 포함하는, 방법.
75. 제74항에 있어서, 상기 상부 스템은 CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
76. 제74항에 있어서, 상기 상부 스템은 CGCCG와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
77. 제74항에 있어서, 상기 상부 스템은 CGGCCGC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
78. 제74항에 있어서, 상기 상부 스템은 CGCGC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
79. 제74항에 있어서, 상기 상부 스템은 CGAU와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
80. 제72항에 있어서, 상기 스템 루프는 상기 하부 스템에 GC 염기쌍을 포함하는, 방법.
81. 제68항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하부 스템은 GC 염기쌍을 포함하지 않는, 방법.
82. 제68항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상부 스템은 GC 염기쌍을 포함하지 않는, 방법.
83. 제68항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상부 스템은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5 또는 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 GC 염기쌍을 포함하는, 방법.
84. 제83항에 있어서, 상기 스템의 상부 부분은 2개의 GC 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
85. 제68항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA의 결찰은 전장 생성물의 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 초과의 수율을 초래하는, 방법.
86. 제85항에 있어서, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA의 결찰은 적어도 약 60%의 수율을 초래하는, 방법.
87. 제1항 내지 제63항 또는 제68항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 적어도 1그램의 양으로 생성되는, 방법.
88. 제87항에 있어서, 대규모는 적어도 5그램, 10그램, 20그램, 30그램, 40그램, 50그램, 60그램, 70그램, 80그램, 90그램 또는 100그램을 포함하는, 방법.
89. 제1항 내지 제63항 또는 제68항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 1그램 미만의 양으로 생성되는, 방법.
90. 제89항에 있어서, 상기 gRNA는 약 0.05그램, 0.1그램, 0.2그램, 0.3그램, 0.4그램, 0.5그램, 0.6그램, 0.7그램, 0.8그램 또는 0.9그램의 양으로 생성되는, 방법.
91. 제68항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 초과의 순도로 gRNA를 생성하는, 방법.
92. 제68항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA는 3'에서 5' 방향으로 합성되는, 방법.
93. 제68항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 RNA는 3'에서 5' 방향으로 합성되는, 방법.
94. 제68항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 125개의 뉴클레오타이드, 약 150개의 뉴클레오타이드, 약 175개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 또는 약 200개 초과의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 방법.
95. 제68항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루프는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
96. 제95항에 있어서, 상기 루프는 테트라루프인, 방법.
97. 제95항에 있어서, 상기 루프는 7개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
98. 제68항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA의 결찰은 상기 루프로부터 적어도 약 3개의 염기쌍인 결찰 부위에서 발생하는, 방법.
99. 제98항에 있어서, 상기 결찰 부위는 루프로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 10개의 염기쌍인, 방법.
100. 제1항 내지 제63항 또는 제68항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA는 하나 이상의 백본 변형을 포함하는, 방법.
101. 제100항에 있어서, 상기 하나 이상의 백본 변형은 2' O-메틸 또는 포스포로티오에이트 변형을 포함하는, 방법.
102. 제100항에 있어서, 상기 하나 이상의 백본 변형은 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트, 2'O-메틸, 2'-리보 3'-포스포로티오에이트, 데옥시 또는 5' 포스페이트 변형으로부터 선택되는, 방법.
103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 상기 결찰 부위에 존재하는, 방법.
104. 제103항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 상기 공여체 RNA 및/또는 상기 수용체 RNA에 존재하는, 방법.
105. 제104항에 있어서, 상기 공여체 RNA의 3' 및/또는 5' 말단은 하나 이상의 백본 변형을 갖는, 방법.
106. 제104항에 있어서, 상기 수용체 RNA의 3' 및/또는 5' 말단은 하나 이상의 백본 변형을 갖는, 방법.
107. 제1항 내지 제63항 또는 제68항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA의 농도는 약 1g/ℓ 내지 5 g/ℓ인, 방법.
108. 제107항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA의 농도는 약 1 g/ℓ인, 방법.
109. 제107항에 있어서, 상기 제1 RNA 및/또는 상기 제2 RNA의 농도는 약 3 g/ℓ인, 방법.
110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 조성물로서, 5' 말단에 포스페이트를 포함하는 제1 RNA 및 가변 프로토스페이서 영역을 포함하는 제2 RNA를 포함하되, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA는 비공유적으로 결합된, 조성물.
111. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단에 포스페이트를 포함하는 제1 RNA 및 가변 프로토스페이서 영역을 포함하는 제2 RNA를 포함하되, 상기 제1 RNA와 상기 제2 RNA는 라이게이스에 결합되는, 조성물.
112. 제111항에 있어서, 상기 라이게이스는 T4 RNA 라이게이스 2인, 조성물.
113. 조성물로서, CGAUACGACAGAAC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는, 조성물.
114. 제113항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 CGAUACGACAGAAC와 동일한, 조성물.
115. 조성물로서, CGCCG와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는, 조성물.
116. 제115항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 CGCCG와 동일한, 조성물.
117. 조성물로서, CGGCCGC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는, 조성물.
118. 제117항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 CGGCCGC와 동일한, 조성물.
119. 조성물로서, CGCGC와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 포함하는, 조성물.
120. 제119항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 CGCGC와 동일한, 조성물.
121. 키트로서, 제110항 내지 제120항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 키트.
122. 키트로서, 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA) 서열을 포함하는 제1 RNA, 가변 프로토스페이서 영역을 포함하는 제2 RNA 및 라이게이스를 포함하는, 키트.
123. 제122항에 있어서, 상기 라이게이스는 T4 RNA 라이게이스 2인, 키트.

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