KR20240037299A

KR20240037299A - Crispr/cas 편집 시스템용 가이드 rna

Info

Publication number: KR20240037299A
Application number: KR1020247005580A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 캐퍼티; 마이클 패커; 이본 아라틴-샤우스; 로-아이 청
Original assignee: 빔 테라퓨틱스, 인크.
Priority date: 2021-07-23
Filing date: 2022-07-22
Publication date: 2024-03-21
Also published as: CA3226664A1; WO2023004409A1; EP4373931A1; AU2022313315A1

Abstract

본 발명은 특히 NLS 서열에 접합된 가이드 RNA(NLS-gRNA) 및 이의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 말단은 화학적 모이어티 및 펩타이드 스페이서를 포함하는 링커를 통해 핵 국재화 서열(NLS)의 N-말단에 접합된다.

Description

CRISPR/CAS 편집 시스템용 가이드 RNA

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2021년 7월 23일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/255,322호 및 2021년 10월 14일자로 출원된 제63/255,927호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 기초출원의 내용은 모든 목적을 위해 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

서열 목록의 참조에 의한 원용

2022년 7월 22일에 생성되고 크기가 59.9킬로바이트인 "BEM-011WO_ST26.xml"이라는 파일명의 내용 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

CRISPR/Cas 편집 시스템은 유전자 편집뿐만 아니라 염기 편집을 포함한 관련 시스템에서의 적용을 위해 Cas 엔도뉴클레이스 및 관련 효소와 회합된 가이드 RNA 분자(gRNA)의 사용을 포함한다. 간략하게는, 하나 이상의 gRNA 분자는 복합체 내 Cas 단백질과 조립되어 리보핵산 복합체(ribonucleic acid complex: RNP)를 특정 DNA(예를 들어, Cas9 및 Cas12 시스템에서) 및/또는 RNA(예를 들어, Cas13 시스템에서) 서열로 가이드한다.

치료적 적용에 사용되는 gRNA의 일반적인 형태는 Cas9와 같은 Cas 단백질과 함께 리보핵단백질을 형성하는 대략 100개의 뉴클레오타이드의 단일의 비천연 RNA이다. CRISPR/Cas 편집 시스템을 새로운 기술(예를 들어, 유전자 편집)에 적용하려면 가이드 RNA(gRNA)가 목적하는 편집이 가능하도록 표적 세포 내에서 충분히 오랫동안 지속될 필요가 있다. 뉴클레이스에 의한 gRNA의 분해는 목적하는 편집을 달성하는 데 있어 중요한 과제이다. 추가적으로, gRNA는 리보핵산(RNP)으로 조립되어 핵에 효율적으로 운반되어야 한다.

CRISPR-Cas 시스템에서 사용하기 위한 gRNA의 효능을 향상시키는 방법, 조성물 및 키트가 본 명세서에 제공된다. 일부 양태에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템에서 사용하기 위해 효능이 증가된, 예를 들어, 성공적인 편집 이벤트의 빈도가 증가된 NLS 서열에 접합된 gRNA(NLS-gRNA)를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 NLS-gRNA는 핵을 세포질의 RNase로부터 보호하고 RNP의 형성을 위한 gRNA의 더 높은 국부 농도를 증가시키기 위해 gRNA의 핵으로의 더 나은 수송을 제공할 수 있다. 본 발명의 NLS-gRNA는 NLS 서열이 없는 대응(counterpart) gRNA와 비교하여 상당히 더 높은 효능을 가지며, 또한 고도로 변형된 gRNA와 비교하여 더 높은 효능을 나타낸다.

일 양태에서, 본 발명은 특히 링커를 통해 gRNA에 연결된 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS)를 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 제공하되, 링커는 gRNA의 3' 말단에 접합된 시스테인 잔기를 포함한다.

일부 실시형태에서, 링커는 N-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 링커의 내부 부위에 시스테인 잔기를 포함한다.

일부 실시형태에서, 링커는 gRNA의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 gRNA의 5' 말단에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 gRNA의 내부 영역에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 gRNA의 제1 헤어핀 영역에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 gRNA의 제2 헤어핀 영역에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 gRNA의 벌지 영역(bulge)에 접합된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 2'OMe 변형이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 2'-플루오로 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 포스포로티오에이트 연결을 포함한다.

일부 실시형태에서, gRNA는 백본 변형을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 및 9개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 및 8개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 및 7개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및 6개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개 및 5개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개 및 4개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개 및 3개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개 및 2개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 3' 말단으로부터 1개의 뉴클레오타이드에서 발생한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 및 9개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 및 8개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 및 7개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및 6개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개 및 5개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개 및 4개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개 및 3개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1 및 2개의 뉴클레오타이드에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형이 gRNA의 5' 말단으로부터 1개의 뉴클레오타이드에서 발생한다.

일부 실시형태에서, gRNA의 10% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 20% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 30% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 35% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 40% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 45% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 50% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 55% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 60% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 65% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 70% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 75% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 80% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 85% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 88% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 90% 초과가 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 95% 초과가 변형된다.

일부 실시형태에서, gRNA의 10% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 20% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 30% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 35% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 40% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 45% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 50% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 55% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 60% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 65% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 70% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 75% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 80% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 85% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 88% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 90% 미만이 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 95% 미만이 변형된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 하나 이상의 NLS 서열에 접합된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 3' 말단 또는 그 근처에 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 NLS, 5' 말단 또는 그 근처에 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 NLS 또는 이들의 조합(예를 들어, 3' 말단에 하나 이상의 NLS 및 5' 말단에 하나 이상의 NLS)을 포함할 수 있다. 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 서로 독립적으로 선택될 수 있으므로, 단일 NLS는 하나 초과의 카피로 그리고/또는 하나 이상의 카피에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합하여 존재할 수 있다.

NLS의 비제한적인 예는 PKKKRKV(서열번호 41) 아미노산 서열을 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민으로부터의 NLS(예를 들어, KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 42) 서열을 갖는 뉴클레오플라스민 이분형(bipartite) NLS); PAAKRVKLD(서열번호 43) 또는 RQRRNELKRSP(서열번호 44) 아미노산 서열을 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(서열번호 45) 서열을 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(서열번호 46) 서열; 근종 T 단백질의 VSRKRPRP(서열번호 47) 및 PPKKARED(서열번호 48) 서열; 인간 p53의 POPKKKPL(서열번호 49) 서열; 마우스 c-abl IV의 SALIKKKKKMAP(서열번호 50) 서열; 인플루엔자에 바이러스 NS1의 DRLRR(서열번호 51) 및 PKQKKRK(서열번호 52) 서열; 간염 바이러스 델타 항원의 RKLKKKIKKL(서열번호 53) 서열; 마우스 M×1 단백질 REKKKFLKRR(서열번호 54) 서열; 인간 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이스의 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(서열번호 55) 서열; 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 RKCLQAGMNLEARKTKK(서열번호 56) 서열로부터 유래되는 NLS 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, NLS는 유인원 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, NLS는 KKRKV(서열번호 57)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS는 이분형 NLS를 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS는 SV40 NLS를 갖는 이분형 NLS를 포함한다.

일부 실시형태에서, 링커는 펩타이드 스페이서를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 2개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 3개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 4개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 5개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 6개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 7개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 8개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 9개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 10개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 12개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 15개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 18개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 20개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 25개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 30개 초과의 아미노산을 포함한다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 2개 내지 30개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 5개 내지 25개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 7개 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 7개 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 7개 내지 12개의 아미노산을 포함한다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 5개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 7개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 8개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 9개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 10개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 11개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 12개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 13개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 14개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 약 15개의 아미노산을 포함한다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP(서열번호 58)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 70% 동일하다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 75% 동일하다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 80% 동일하다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 85% 동일하다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 90% 동일하다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 92% 동일하다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 97% 동일하다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열과 99% 동일하다.

일부 실시형태에서, 링커는 gRNA를 펩타이드 스페이서 또는 NLS에 접합시키는 화학적 모이어티를 추가로 포함한다.

실시형태에서, gRNA는 링커를 통해 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 상기 링커는 화학적 모이어티(예를 들어, L) 및/또는 펩타이드성 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 포함한다.

실시형태에서, gRNA는 화학적 모이어티(예를 들어, L)를 통해 NLS에 직접 접합된다. 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 비펩타이드성이다. 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 gRNA와 NLS 둘 다에 공유적으로 부착된다.

실시형태에서, gRNA는 펩타이드성 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 통해 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 펩타이드성 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)는 gRNA와 NLS 둘 다에 공유적으로 부착된다.

실시형태에서, gRNA는 화학적 모이어티(예를 들어, L)와 펩타이드성 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서) 둘 다를 포함하는 링커를 통해 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 이러한 접합체는 화학식 (I)에 따른 구조를 가질 수 있으며, 여기서 화학적 모이어티 L(예를 들어, 비펩타이드성 화학적 모이어티)은 gRNA와 펩타이드 스페이서에 공유적으로 부착되되, 펩타이드 스페이서는 NLS에 공유적으로 부착된다.

(화학식 (I))

실시형태에서, gRNA는 펩타이드 스페이서 또는 NLS 아미노산 서열의 C-말단에 공유적으로 부착된 화학적 모이어티(예를 들어, L)를 통해 NLS에 접합된다.

실시형태에서, gRNA는 펩타이드 스페이서 또는 NLS 아미노산 서열의 N-말단에 공유적으로 부착된 화학적 모이어티(예를 들어, L)를 통해 NLS에 접합된다.

실시형태에서, gRNA는 gRNA의 3' 말단에 공유적으로 부착된 화학적 모이어티(예를 들어, L)를 통해 펩타이드 스페이서 또는 NLS에 접합된다.

실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 말단에 공유적으로 부착된 화학적 모이어티(예를 들어, L)를 통해 펩타이드 스페이서 또는 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 펩타이드 스페이서 또는 NLS의 티올 함유 잔기(예를 들어, 시스테인 잔기)에 유적으로 부착된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 펩타이드 스페이서 또는 NLS의 셀레늄 함유 잔기(예를 들어, 셀레노시스테인 잔기)에 공유적으로 부착된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 펩타이드 스페이서 또는 NLS의 아미노 함유 잔기(예를 들어, 라이신 잔기)에 공유적으로 부착된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 펩타이드 스페이서 또는 NLS의 페놀 함유 잔기(예를 들어, 타이로신 잔기)에 공유적으로 부착된다.

실시형태에서, 링커의 형성에 사용되는 아미노산 잔기(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 티올-, 셀레늄-, 아미노- 또는 페놀 함유 잔기)는 화학적 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 핵산 링커 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커 서열은 RNA 서열이다.

일부 실시형태에서, 핵산 링커 서열은 가이드 RNA 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 위치한다.

일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 45개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 35개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 15개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 5개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드, 약 15개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 25개의 뉴클레오타이드, 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 35개의 뉴클레오타이드, 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 45개의 뉴클레오타이드 또는 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 핵산 링커를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 1개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 2개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 3개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 4개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 5개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 6개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 7개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 8개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 9개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 11개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 12개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 13개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 14개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 15개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 16개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 17개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 18개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 19개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 21개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 22개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 23개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 24개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 25개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 50개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 100개 내지 150개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 150개 내지 200개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 링커는 약 200개 내지 500개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산 링커 서열은 선형 링커 서열이다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 비선형 서열이다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 RNA 2차 구조를 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산 링커 서열은 가이드 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한다.

일부 실시형태에서, NLS를 포함하는 gRNA는 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 염기 편집 효율을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, NLS를 포함하는 gRNA는 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 적어도 1.5-배 염기 편집 효율을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, NLS를 포함하는 gRNA는 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 적어도 2-배 염기 편집 효율을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, NLS를 포함하는 gRNA는 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 적어도 2.5-배 염기 편집 효율을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, NLS를 포함하는 gRNA는 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 적어도 3-배 염기 편집 효율을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, NLS를 포함하는 gRNA는 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 적어도 4-배 염기 편집 효율을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, NLS를 포함하는 gRNA는 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 적어도 5-배 염기 편집 효율을 개선시킨다.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 천연 CRISPR 시스템에서 발견되는 직접 반복 서열을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, gRNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 tracrRNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 crRNA이다.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(clustered regularly interspersed short palindromic repeat: CRISPR) RNA(crRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 트랜스 활성화 RNA(tracrRNA)를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, crRNA는 변형된다. 일부 실시형태에서, tracrRNA는 변형된다. 일부 실시형태에서, crRNA 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, tracrRNA는 접힘을 유지하는 추가적인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, crRNA, tracrRNA 및/또는 링커에 대한 변형은 1) 화학적 변형; 2) 2차 구조를 보존하는 임의의 뉴클레오타이드 치환; 3) GC 함량의 변화; 4) tracrRNA의 예측된 접힘을 유지하기 위한 서열의 추가 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA가 연장된 가이드 RNA, 또는 Cas9 가이드 RNA, 또는 Cas13 가이드 RNA 또는 Cas12 가이드 RNA, 예컨대, Cas12a 가이드 RNA, Cas12b 가이드 RNA, Cas12c 가이드 RNA, Cas12d 가이드 RNA, Cas12e 가이드 RNA, Cas12f 가이드 RNA, Cas12g 가이드 RNA, Cas12h 가이드 RNA, Cas12i 가이드 RNA, Cas12j 가이드 RNA, Cas12k 가이드 RNA인 방법이 본 명세서에 제공된다. 따라서, 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 연장된 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas9 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas13 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12a 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12b 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12c 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12d 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12e 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12f 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12g 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12h 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12i 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12j 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12k 가이드 RNA이다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 스페이서, 하부 스템(lower stem), 벌지, 상부 스템(upper stem), 넥서스(nexus) 및 헤어핀 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시형태에서, 스템 루프는 GC 염기쌍을 포함한다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA가 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 수율로 생산되는 방법이 본 명세서에 제공된다. 따라서, 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 50%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 55%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 60%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 65%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 70%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 75%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 80%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 85%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 90%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 95%의 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 99% 초과의 수율로 생산된다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상 개선된 수율로 생산된다. 따라서, 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 50% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 55% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 60% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 65% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 70% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 75% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 80% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 85% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 90% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 95% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 99% 개선된 수율로 생산된다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 기존의 합성 방법과 비교하여 99% 초과의 개선된 수율로 생산된다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 125개의 뉴클레오타이드, 약 150개의 뉴클레오타이드, 약 175개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 또는 약 200개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 따라서, 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 40개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 100개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 125개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 150개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 175개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 200개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 약 200개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA 길이는 Cas 의존적이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Cas12a에 대한 NLS-gRNA 길이는 40개 초과의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas9에 대한 NLS-gRNA 길이는 123개 초과의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas9에 대한 NLS-gRNA 길이는 125개 내지 200개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas9에 대한 NLS-gRNA 길이는 125개 내지 250개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas9에 대한 NLS-gRNA 길이는 125개 내지 300개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas9에 대한 NLS-gRNA 길이는 125개 내지 350개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas9에 대한 NLS-gRNA 길이는 125개 내지 400개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas9에 대한 NLS-gRNA 길이는 125개 내지 450개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas9에 대한 NLS-gRNA 길이는 125개 내지 500개의 뉴클레오타이드이다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 하나 이상의 백본 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2' O-메틸 또는 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2' O-메틸 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 포스포로티오에이트 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트, 2'-O-메틸, 2'-리보 3'-포스포로티오에이트, 2'-플루오로, 2'-O-메톡시에틸 모폴리노(PMO), 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA), 데옥시 또는 5' 포스페이트 변형으로부터 선택된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 백본 변형은 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 2'-리보 3'-포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 2'-플루오로 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 2'-O-메톡시에틸 모폴리노(PMO)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 잠금 핵산(LNA)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 데옥시 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 5' 포스페이트 변형을 포함한다.

다양한 변형된 RNA 염기가 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 2-메톡시에톡시 A, 2-메톡시에톡시 MeC, 2-메톡시에톡시 G, 2-메톡시에톡시 T와 같은 2'-O-메톡시-에틸 염기(2'-MOE)를 포함한다. 다른 변형된 염기는, 예를 들어, 2'-O-메틸 RNA 염기 및 플루오로 염기를 포함한다. 다양한 플루오로 염기가 공지되어 있으며, 예를 들어, 플루오로 C, 플루오로 U, 플루오로 A, 플루오로 G 염기를 포함한다. 다양한 2'-O메틸 변형이 또한 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음 2'-O메틸 변형 중 하나 이상을 포함하는 다음 RNA가 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다: 2'-OMe-5-메틸-rC, 2'-OMe-rT, 2'-OMe-rI, 2'-OMe-2-아미노-rA, 아미노링커-C6-rC, 아미노링커-C6-rU, 2'-OMe-5-Br-rU, 2'-OMe-5-I-rU, 2-OMe-7-데아자-rG.

일부 실시형태에서, RNA는 다음 변형 중 하나 이상을 포함한다: 포스포로티오에이트, 2'O-메틸, 2' 플루오로(2'F), 데옥시. 일부 실시형태에서, RNA는 3' 말단에 2'OMe 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA는 5' 말단에 2'OMe 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA는 3' 말단 및 5' 말단에 2'OMe 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA는 다음 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2'-O-2-메톡시에틸(MOE), 잠금 핵산, 브리지된 핵산, 비잠금 핵산, 펩타이드 핵산, 모폴리노 핵산. 일부 실시형태에서, RNA는 다음 염기 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 슈도우라실, N1-메틸-슈도우라실, 5' 메틸 사이토신, 2' 피리미디논(제불라린), 티민. 다른 변형된 염기는, 예를 들어, 2-아미노퓨린, 5-브로모 dU, 데옥시우리딘, 2,6-다이아미노퓨린(2-아미노-dA), 다이데옥시-C, 데옥시이노신, 하이드록시메틸 dC, 역 dT, 아이소-dG, 아이소-dC, 역 다이데옥시-T, 5-메틸 dC, 5-메틸 dC, 5-나이트로인돌, Super T®, 2'-F-r(C, U), 2'-NH2-r(C, U), 2,2'-무수-U, 3'-데옥시-r(A, C, G, U), 3'-O-메틸-r(A, C, G, U), rT, rI, 5-메틸-rC, 2-아미노-rA, r스페이서(무염기), 7-데아자-rG, 7-데아자-rA, 8-옥소-rG, 5-할로겐화-rU, N-알킬화-rN을 포함한다.

다른 화학적으로 변형된 RNA가 본 명세서에서 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA는, 예를 들어, 5' Int, 3' 아자이드(NHS 에스터); 5' 헥신일; 5' Int, 3' 5-옥타다이인일 dU; 5', Int 바이오틴(아자이드); 5', Int 6-FAM(아자이드); 및 5', Int 5-TAMRA(아자이드)와 같은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있는 RNA 뉴클레오타이드 변형의 다른 예는, 예를 들어, 5'-인산화 및 3'-인산화와 같은 인산화 변형을 포함한다. RNA는 또한 다음 변형 중 하나 이상을 가질 수 있다: 아미노 변형, 바이오티닐화, 티올 변형, 알킨 변성제, 아데닐화, 아자이드(NHS 에스터), 콜레스테롤-TEG 및 다이곡시게닌(NHS 에스터).

일부 실시형태에서, 방법은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 이상의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 방법은 약 50%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 60%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 70%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 80%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 90%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 99% 이상의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 91%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 92%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 93%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 94%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 95%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 96%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 97%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 98%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 99%의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 약 99% 초과의 순도로 NLS-gRNA를 생산한다.

일 양태에서, 본 발명은 특히 링커를 통해 gRNA에 연결된 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 조성물을 제공하되, 링커는 gRNA의 3' 말단에 접합된 시스테인 잔기를 포함하고, NLS-가이드 RNA는 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP)에 캡슐화된다. 일 양태에서, 본 발명은 특히 링커를 통해 gRNA에 연결된 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 조성물을 제공하되, 링커는 gRNA의 3' 말단에 접합된 시스테인 잔기를 포함하고, NLS-가이드 RNA는 지질 나노입자(LNP)와 회합된다.

일부 실시형태에서, 조성물은 뉴클레이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 뉴클레이스를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 포함한다.

일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 NLS에 접합된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 NLS에 접합된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 NLS를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 NLS에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 NLS를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 NLS에 접합되지 않는다.

일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 1:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 2:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 3:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 4:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 5:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 6:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 7:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 8:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 9:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 10:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 12:1 중량비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 NLS-gRNA 및 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 15:1 중량비로 포함한다.

일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 CRISPR 클래스 2 유형 II 효소이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 CRISPR 클래스 2 유형 V 효소이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 CRISPR 클래스 2 유형 VI 효소이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 Cas9, Cpf1, SaCas9, Cas12, Cas13 또는 이들의 변형된 버전이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 Cas9 또는 이의 변형된 버전이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 Cpf1 또는 이의 변형된 버전이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9(SaCas9) 또는 이의 변형된 버전이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 스트렙토코커스 써모필루스 1(Streptococcus thermophilus 1) Cas9(St1Cas9) 또는 이의 변형된 버전이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9) 또는 이의 변형된 버전이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 Cas12 또는 이의 변형된 버전이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스는 Cas13 또는 이의 변형된 버전이다.

일부 실시형태에서, Cas9는 뉴클레이스 활성이 없는 Cas9(dCas9)를 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas9는 Cas9 닉케이스(nickase)(nCas9)를 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas9는 뉴클레이스 활성이 있는 Cas9를 포함한다.

일부 실시형태에서, 뉴클레이스 도메인은 이종성 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 핵산(예를 들어, DNA)에 변형을 만들 수 있는 효과기 도메인을 포함한다. 예를 들어, DNA 효과기 도메인은 사이티딘 데아미네이스 도메인, 사이토신 도메인 또는 아데노신 데아미네이스 도메인과 같은 데아미네이스 도메인일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 데아미네이스 도메인은 APOBEC 또는 AID 사이티딘 데아미네이스와 같은 사이티딘 데아미네이스 도메인이다. DNA 분자에서 C에서 T로의 돌연변이를 유도하기 위해 사이티딘을 우리딘으로 탈아미노화할 수 있는 염기 편집 단백질의 경우, 사이티딘 데아미네이스는 아포지질단백질 B mRNA-편집 복합체(APOBEC) 패밀리 데아미네이스로부터의 데아미네이스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 사이티딘 또는 사이토신 데아미네이스 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 사이토신 데아미네이스 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 사이티딘 데아미네이스 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 아데노신 또는 아데닌 데아미네이스 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 아데노신 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 아데닌 도메인이다.

일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 서열번호 3과 관련하여 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 V82G를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 Y147T/D를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 Q154S를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 L36H를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 I76Y를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 F149Y를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 N157K를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 V82G, Y147T/D 및 Q154S를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 V82G, Y147T/D, Q154S 및 L36H를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 V82G, Y147T/D, Q154S 및 I76Y를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 V82G, Y147T/D, Q154S 및 F149Y를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 V82G, Y147T/D, Q154S 및 N157K를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 V82G, Y147T/D, Q154S 및 D167N을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 I76Y, V82G, Y147T 및 Q154S를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 L36H, V82G, Y147T, Q154S 및 N157K를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 V82G, Y147D, F149Y, Q154S 및 D167N을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 L36H, V82G, Y147D, F149Y, Q154S, N157K 및 D167N을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Q154S 및 N157K를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 I76Y, V82G, Y147D, F149Y, Q154S 및 D167N을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 Y147D, F149Y 및 D167N을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 L36H, I76Y, V82G, Q154S 및 N157K를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 I76Y, V82G 및 Q154S를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 도메인은 돌연변이 L36H, I76Y, V82G, Y147D, F149Y, Q154S, N157K 및 D167N을 포함한다.

일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레이스 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레이스 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레이스 도메인 내부에 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 Cas9의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 Cas9의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 Cas9 내부에 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 Cas9의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 Cas9의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 Cas9 내부에 있다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 CRISPR/Cas 시스템과 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 CRISPR 클래스 2 유형 II 효소와 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 CRISPR 클래스 2 유형 V 효소와 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 CRISPR 클래스 2 유형 VI 효소와 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas9, Cpf1, SaCas9, Cas12, Cas13 또는 이들의 변형된 버전과 함께 사용하기에 적합하다. 따라서, 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas9 또는 이의 변형된 버전과 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cpf1 또는 이의 변형된 버전과 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 SaCas9 또는 이의 변형된 버전과 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas12 또는 이의 변형된 버전과 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas13 또는 이의 변형된 버전과 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas 효소와 복합체를 이루고 있다.

일부 실시형태에서, Cas 단백질과의 조립 전 또는 도중에 gRNA를 선형화시키기 위해 일부 Cas, 예를 들어, Cas12a 및 Cas13의 엔도뉴클레이스 활성에 의해 절단될 RNA 서열이 포함된다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 NLS 서열이 없는 gRNA에 비해 세포 엑소뉴클레이스에 대한 증가된 안정성 및 저항성을 제공한다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 CRISPR/Cas 편집 시스템을 사용하여 표적 세포에서 증가된 편집 이벤트를 제공한다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 CRISPR 클래스 2 유형 II 효소와 복합체를 이루고 있다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 CRISPR 클래스 2 유형 V 효소와 복합체를 이루고 있다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 CRISPR 클래스 2 유형 VI 효소와 복합체를 이루고 있다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 Cas9, Cpf1, SaCas9, Cas12, Cas13 또는 이들의 변형된 버전과 복합체를 이루고 있다.

일부 양태에서, Cas 뉴클레이스와 NLS-gRNA를 포함하는 Cas 단백질 복합체가 제공된다.

일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 CRISPR 클래스 2 유형 II 효소이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 CRISPR 클래스 2 유형 V 효소이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 CRISPR 클래스 2 유형 VI 효소이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 Cas9, Cpf1, SaCas9, Cas12, Cas13 또는 이들의 변형된 버전으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피게놈(epigenome) 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 해당 방법은 진핵생물 세포에 (a) NLS 접합된 가이드 RNA(NLS-gRNA), (b) 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질 또는 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하되, (a) 및 (b)와 염색체 DNA의 표적 서열 사이의 상호작용은 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피게놈 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 유도한다.

일부 실시형태에서, 표적화된 RNA 변형을 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 해당 방법은 진핵생물 세포에 (a) NLS 접합된 가이드 RNA(NLS-gRNA) 및 (b) 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질 또는 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하되, (a) 및 (b)와 염색체 DNA에 의해 발현되는 RNA 사이의 상호작용은 염색체 DNA에 의해 발현되는 RNA의 변형을 유도한다.

일부 실시형태에서, 염색체 DNA에 의해 발현되는 RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다.

일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 NLS-gRNA 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은 특히 Cas 단백질, 링커를 통해 gRNA에 연결된 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 gRNA를 포함하는, 조작되거나 비자연 발생적인 CRISPR 관련 Cas(CRISPR-Cas) 시스템을 포함하는 조성물을 제공하되, 링커는 gRNA의 3' 말단에 접합된 시스테인 잔기를 포함하고; gRNA는 Cas 단백질과 복합체를 형성하고 Cas9 단백질을 표적 DNA에 표적화할 수 있다.

일부 실시형태에서, gRNA는 핵산 서열: 5'-CAGUAUGGACACUGUCCAAA-3'(서열번호 2)를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 특히 (a) saCas9 단백질; (b) Cas9 단백질에 융합된 아데노신 데아미네이스 변이체; 및 (c) 링커를 통해 gRNA에 연결된 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 gRNA를 포함하는, 조작되거나 비자연 발생적인 CRISPR 관련 Cas(CRISPR-Cas) 시스템을 포함하는 조성물을 제공하되; 링커는 gRNA의 3' 말단에 접합된 시스테인 잔기를 포함하고; gRNA는 saCas9 단백질과 복합체를 형성하고 saCas9 단백질을 표적 DNA에 표적화할 수 있고; 아데노신 데아미네이스 변이체는 서열번호 3과 관련하여 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상을 포함하고; gRNA는 서열번호 2를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 특히 본 발명의 조성물(예를 들어, NLS-gRNA)을 대상체에게 투여함으로써 유전자 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전자 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은 특히 본 발명의 조성물(예를 들어, NLS-gRNA)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 글리코겐 축적 질환 유형 1a(GSD1a)를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시형태에서, NLS에 접합된 gRNA를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공되되, 조성물의 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 약 2배 내지 5배 증가된다. 일부 실시형태에서, 조성물의 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 약 2배 증가된다. 일부 실시형태에서, 조성물의 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 약 3배 증가된다. 일부 실시형태에서, 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 약 4배 증가된다. 일부 실시형태에서, 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 약 5배 증가된다. 일부 실시형태에서, 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 약 2배 초과하여 증가된다. 일부 실시형태에서, 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 1.5배 내지 10배 증가된다. 일부 실시형태에서, 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 약 10배 초과하여 증가된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 70%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 75%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 85%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, NLS에 접합된 gRNA를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공되되, 유전자 편집 효율은 NLS가 없는 gRNA에 비해 약 2배 내지 5배 증가된다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 효율은 NLS가 없는 gRNA에 비해 약 2배 증가된다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 효율은 NLS가 없는 gRNA에 비해 약 3배 증가된다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 효율은 NLS가 없는 gRNA에 비해 약 4배 증가된다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 효율은 NLS가 없는 gRNA에 비해 약 5배 증가된다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 효율은 NLS가 없는 gRNA에 비해 약 1.5배 내지 10배 증가된다.

일부 실시형태에서, gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 70%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 75%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 70%, 80%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 85%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 100%의 동일성을 갖는다.

일부 실시형태에서, gRNA는 간, 신장, 뇌 및 심장으로부터 선택되는 기관 중 하나 이상을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 간을 표적으로 한다.

정의

본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위해, 소정의 용어가 먼저 아래에 정의된다. 다음 용어 및 기타 용어에 대한 추가적인 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 제시되어 있다.

단수형: "단수형" 관사는 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.

대략 또는 약: 본 명세서에서 사용되는 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 명시된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되지 않거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한 명시된 참조 값의 어느 방향(크거나 또는 작음)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외).

연관된: 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 하나의 것들과 상관관계가 있는 경우, 2개의 이벤트 또는 독립체(독립체)는 본 명세서에서 사용된 용어와 서로 "연관된다". 예를 들어, 특정 독립체(예를 들어, 폴리펩타이드)는 이의 존재, 수준 및/또는 형태가 질환, 장애 또는 병태의 발생률 및/또는 이에 대한 민감성과 상관관계가 있는 경우(예를 들어, 관련 집단 전반에 걸쳐), 특정 질환, 장애 또는 병태와 연관이 있는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 독립체가 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 경우, 이들은 서로 물리적으로 "연관"되어 서로 물리적으로 근접해 있으며 그 상태를 유지한다. 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 연관된 2개 이상의 독립체는 서로 공유적으로 연결되어 있고; 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 연관된 2개 이상의 독립체는 서로 공유적으로 연결되지 않지만, 예를 들어, 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자기작용 및 이들의 조합에 의해 비공유적으로 연관된다.

"아데노신 데아미네이스" 또는 "아데닌 데아미네이스"는 아데닌 또는 아데노신의 가수분해성 탈아미노화를 촉매할 수 있는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 의미한다. 일부 실시형태에서, 데아미네이스 또는 데아미네이스 도메인은 아데노신을 이노신으로 또는 데옥시 아데노신을 데옥시 이노신으로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매할 수 있는 아데노신 데아미네이스이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌 또는 아데노신의 가수분해성 탈아미노화를 촉매한다. 본 명세서에 제공된 아데노신 데아미네이스(예를 들어, 조작된 아데노신 데아미네이스, 진화된 아데노신 데아미네이스)는 조류, 세균, 곰팡이, 식물, 무척추동물(예를 들어, 곤충) 및 척추동물(예를 들어, 양서류, 포유동물)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유기체(예를 들어, 진핵생물, 원핵생물)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 하나 이상의 변경을 가지며 표적 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA, RNA)에서 아데닌과 사이토신을 모두 탈아미노화시킬 수 있는 아데노신 데아미네이스 변이체이다. 일부 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 DNA에서 아데닌과 사이토신을 모두 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 단일 가닥 DNA에서 아데닌과 사이토신을 모두 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 RNA에서 아데닌과 사이토신을 모두 탈아미노화시킬 수 있다.

"아데노신 데아미네이스 활성"은 폴리뉴클레오타이드에서 아데닌 또는 아데노신의 구아닌으로의 탈아미노화를 촉매하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 아데노신 데아미네이스 변이체는 아데노신 데아미네이스 활성(예를 들어, 참조 아데노신 데아미네이스(예를 들어, TadA*8.20 또는 TadA*8.19) 활성의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)을 유지한다.

"아데노신 염기 편집기(Adenosine Base Editor: ABE)"는 아데노신 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기를 의미한다.

"아데노신 염기 편집기 8(Adenosine Base Editor 8: ABE8) 폴리펩타이드" 또는 "ABE8"은 다음 참조 서열의 82번 및/또는 166번 아미노산 위치에 변경을 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체를 포함하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 염기 편집기를 의미한다:

일부 실시형태에서, ABE8은 참조 서열에 대해 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가 변경을 포함한다.

"아데노신 염기 편집기 8(ABE8) 폴리뉴클레오타이드"는 ABE8 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.

"아데노신 데아미네이스 폴리뉴클레오타이드"는 아데노신 데아미네이스 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 특정 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 폴리뉴클레오타이드는 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상을 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 폴리뉴클레오타이드는 다음 변경 조합 중 하나를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체를 암호화한다: V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; 또는 L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N.

일부 실시형태에서, 데아미네이스 또는 데아미네이스 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트 또는 마우스와 같은 유기체로부터의 자연 발생적 데아미네이스의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 데아미네이스 또는 데아미네이스 도메인은 자연에서 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 데아미네이스 또는 데아미네이스 도메인은 자연 발생적 데아미네이스와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9% 동일하다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 대장균(E. coli), S. 아우레우스, B. 서브틸리스(B. subtilis), S. 타이피(S. typhi), S. 푸트레파시엔스(S. putrefaciens), H. 인플루엔자에(H. influenzae), C. 크레센투스(C. crescentus) 또는 G. 설퍼리두센스(G. sulfurreducens)와 같은 세균으로부터 유래한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 데아미네이스이다. 일부 실시형태에서, TadA 데아미네이스는 대장균 TadA(ecTadA) 데아미네이스 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, ecTadA 데아미네이스는 절단된 ecTadA이다. 예를 들어, 절단된 ecTadA는 전장 ecTadA에 대해 하나 이상의 N-말단 아미노산이 누락되었을 수 있다. 일부 실시형태에서, 절단된 ecTadA는 전장 ecTadA에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 N-말단 아미노산 잔기가 누락되었을 수 있다. 일부 실시형태에서, 절단된 ecTadA는 전장 ecTadA에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락되었을 수 있다. 일부 실시형태에서, ecTadA 데아미네이스는 N-말단 메티오닌을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, TadA 데아미네이스는 N-말단 절단된 TadA이다. 특정 실시형태에서, TadA는 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 PCT/US2017/045381에 기술되어 있는 TadA 중 임의의 하나이다.

일부 실시형태에서, TadA 데아미네이스는 TadA 변이체이다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상을 포함하는 TadA*7.10이다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 다음 중에서 선택되는 변경 조합을 포함하는 TadA*7.10이다: V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; 또는 L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 MSP605, MSP680, MSP823, MSP824, MSP825, MSP827, MSP828 또는 MSP829이다.

염기 편집기: "염기 편집기(base editor: BE)" 또는 "핵염기 편집기(nucleobase editor: NBE)"는 폴리뉴클레오타이드에 결합하며 핵염기 변형 활성을 갖는 작용제를 의미한다. 다양한 실시형태에서, 염기 편집기는 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 가이드 RNA)와 함께 핵염기 변형 폴리펩타이드(예를 들어, 데아미네이스) 및 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 작용제는 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인, 즉, 핵산 분자(예를 들어, DNA) 내의 염기(예를 들어, A, T, C, G 또는 U)를 변형시킬 수 있는 도메인을 포함하는 생체 분자 복합체이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인은 데아미네이스 도메인에 융합되거나 연결된다. 일 실시형태에서, 작용제는 염기 편집 활성을 갖는 하나 이상의 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 또 다른 실시형태에서, 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인은 (예를 들어, 가이드 RNA 상의 RNA 결합 모티프 및 데아미네이스에 융합된 RNA 결합 도메인을 통해) 가이드 RNA에 연결된다. 일부 실시형태에서, 염기 편집 활성을 갖는 도메인은 핵산 분자 내의 염기를 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 DNA 분자 내의 하나 이상의 염기를 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 DNA 내의 질소성 염기를 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 RNA 내의 질소성 염기를 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 리보뉴클레오사이드를 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 데옥시리보뉴클레오사이드를 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 사이토신을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 사이티딘을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데노신을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 DNA 내의 사이토신(C) 또는 아데노신(A)을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 DNA 내의 사이토신(C) 및 아데노신(A)을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(cytidine base editor: CBE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기(ABE) 및 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미네이스에 융합된 뉴클레이스 불활성 Cas9(dCas9)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 염기 절단 복구의 저해제, 예를 들어, UGI 도메인 또는 dISN 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 데아미네이스에 융합된 Cas9 닉케이스 및 UGI 또는 dISN 도메인과 같은 염기 절단 복구의 저해제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 염기 편집기는 무염기 염기 편집기이다. 염기 편집기의 상세 사항은 각각 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 국제 PCT 출원 제PCT/2017/045381(WO2018/027078)호 및 제PCT/US2016/058344(WO2017/070632)호에 기술되어 있다. 또한, 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017) 및 Rees, H.A., et al., "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells." Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1]을 참조한다.

염기 편집 활성: "염기 편집 활성"은 폴리뉴클레오타이드 내의 염기를 화학적으로 변경하는(예를 들어, 염기를 탈아미노화시킴으로써) 작용을 하는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 첫 번째 염기는 두 번째 염기로 전환된다. 일 실시형태에서, 염기 편집 활성은, 예를 들어, 표적 C·G를 T·A로 전환시키는 사이티딘 데아미네이스 활성이다. 또 다른 실시형태에서, 염기 편집 활성은, 예를 들어, A·T를 G·C로 전환시키는 아데노신 또는 아데닌 데아미네이스 활성이다. 또 다른 실시형태에서, 염기 편집 활성은, 예를 들어, 표적 C·G를 T·A로 전환시키는 사이티딘 데아미네이스 활성과, 예를 들어, A·T를 G·C로 전환시키는 아데노신 또는 아데닌 데아미네이스 활성이다.

염기 편집기 시스템: 용어 "염기 편집기 시스템"은 표적 뉴클레오타이드 서열의 핵염기를 편집하기 위한 시스템을 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 염기 편집기(BE) 시스템은 (1) 표적 뉴클레오타이드 서열에서 핵염기를 탈아미노화시키기 위한 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인(예를 들어, Cas9), 데아미네이스 도메인 및 사이티딘 데아미네이스 도메인; 및 (2) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인과 함께 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 염기 편집기(BE) 시스템은 아데노신 데아미네이스 또는 사이티딘 데아미네이스로부터 선택되는 핵염기 편집기 도메인 및 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기 시스템은 (1) 표적 뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 핵염기를 탈아미노화시키기 위한 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인 및 데아미네이스 도메인을 포함하는 염기 편집기(BE); 및 (2) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인과 함께 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 일부 실시형태에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE) 또는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다.

생물학적 활성: 본 명세서에서 사용되는 어구 "생물학적 활성"은 생물학적 시스템, 특히 유기체에서 활성을 갖는 임의의 작용제의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에게 투여될 때 해당 유기체에 생물학적 효과를 갖는 작용제가 생물학적 활성이 있는 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 펩타이드가 생물학적 활성인 경우, 펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 해당 펩타이드의 부분은 전형적으로 "생물학적 활성" 부분으로 지칭된다.

절단: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 절단은 본 명세서에 기재된 CRISPR 시스템의 뉴클레이스에 의해 생성된 표적 핵산의 파손(break)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 절단 이벤트는 이중 가닥 DNA 파손이다. 일부 실시형태에서, 절단 이벤트는 단일 가닥 DNA 파손이다. 일부 실시형태에서, 절단 이벤트는 단일 가닥 RNA 파손이다. 일부 실시형태에서, 절단 이벤트는 이중 가닥 RNA 파손이다.

상보적: "상보적" 또는 "상보성"은 핵산이 전통적인 Watson-Crick 또는 Hoogsteen 염기 페어링에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성할 수 있음을 의미한다. 상보적 염기 페어링은 G-C 및 A-T 염기 페어링뿐만 아니라 이노신과 같은 보편적인 염기를 포함하는 염기 페어링도 포함한다. 상보성 퍼센트는 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, Watson-Crick 염기 페어링)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내 연속 잔기의 백분율을 나타낸다(예를 들어, 10개의 뉴클레오타이드를 갖는 제2 핵산 서열과 염기 페어링을 이루는 제1 올리고뉴클레오타이드의 총 10개의 뉴클레오타이드 중 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오타이드는 각각 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%의 상보성을 나타낸다). 상보성 퍼센트를 결정하기 위해, 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, Watson-Crick 염기 페어링)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내 연속 잔기의 백분율을 계산하고 가장 가까운 정수로 반올림하였다(예를 들어, 23개의 뉴클레오타이드를 갖는 제2 핵산 서열과 염기 페어링을 이루는 제1 올리고뉴클레오타이드의 총 23개의 뉴클레오타이드 중 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 뉴클레오타이드는 각각 52%, 57%, 61%, 65%, 70% 및 74%를 나타내고; 적어도 50%, 50%, 60%, 60%, 70% 및 70%의 상보성을 갖는다). 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 상보적인"은 생물학적 조건 하에서 혼성화될 수 있도록 하는 가닥들 사이의 상보성을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 100%의 상보성을 갖는다. 추가적으로, 두 가닥이 뉴클레오타이드 서열을 조사함으로써 생물학적 조건하에서 혼성화할 수 있는지를 결정하는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.

클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)-관련(Cas) 시스템: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, CRISPR-Cas9 시스템은 CRISPR 효과기, RNA 가이드 및 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사체를 암호화하는 서열을 포함하여 CRISPR-효과기의 발현 또는 이의 활성을 지시하는 데 관여하는 핵산 및/또는 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 조작된 비자연 발생적 CRISPR 시스템의 전사체이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템의 구성요소는 시스템의 하나 이상의 구성요소, 단백질 형태의 구성요소(들) 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산(들)(예를 들어, 벡터)을 포함할 수 있다.

CRISPR 어레이: 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR 어레이"는 CRISPR 반복 및 스페이서를 포함하는 핵산(예를 들어, DNA) 분절을 지칭한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 어레이는 제1 CRISPR 반복의 첫 번째 뉴클레오타이드로 시작하고 마지막(말단) CRISPR 반복의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 CRISPR 반복 및 스페이서를 포함한다. 전형적으로, CRISPR 어레이 내 각 스페이서는 두 개의 반복 사이에 위치한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR 반복" 또는 "CRISPR 직접 반복" 또는 "직접 반복"은 CRISPR 어레이 내에서 서열 변화가 거의 없거나 또는 전혀 없는 다중의 짧은 직접 반복 서열을 지칭한다.

CRISPR 연관 단백질(Cas): 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR 연관 단백질", "CRISPR 효과기", "효과기" 또는 "CRISPR 효소"는 효소적 활성을 수행하고/하거나 RNA 가이드에 의해 지정된 핵산의 표적 부위에 결합하는 단백질을 지칭한다. 상이한 실시형태에서, CRISPR 효과기는 엔도뉴클레이스 활성, 닉케이스 활성, 엑소뉴클레이스 활성, 유전자전위효소 활성 및/또는 절단 활성을 갖는다. 다른 실시형태에서, CRISPR 효과기는 뉴클레이스 불활성이다.

crRNA: 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR RNA" 또는 "crRNA"는 특정 핵산 서열을 표적으로 하기 위해 CRISPR 효과기에 의해 사용되는 가이드 서열을 포함하는 RNA 분자를 지칭한다. 전형적으로, crRNA는 표적 인식을 매개하는 서열 및 tracrRNA와 이중체를 형성하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, crRNA: tracrRNA 이중체는 CRISPR 효과기에 결합한다.

이중체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이중체"는 2개의 단일 가닥 핵산의 상호작용에 의해 형성된 이중 나선 구조를 지칭한다. 이중체는 전형적으로 서로에 대해 역평형하게 배향된 2개의 단일 가닥 핵산 사이의 염기의 쌍방향(pairwise) 수소 결합, 즉, "염기 페어링"에 의해 형성된다. 이중체의 염기 페어링은 일반적으로 Watson-Crick 염기 페어링에 의해 발생하며, 예를 들어, 구아닌(G)은 DNA 및 RNA의 사이토신(C)과 염기쌍을 형성하고, 아데닌(A)은 DNA의 티민(T)과 염기쌍을 형성하고, 아데닌(A)은 RNA의 우라실(U)과 염기쌍을 형성한다. 염기쌍이 형성될 수 있는 조건은 생리학적 또는 생물학적 관련 조건(예를 들어, 세포내: pH 7.2, 140mM 포타슘 이온; 세포외 pH 7.4, 145mM 소듐 이온)을 포함한다. 또한, 이중체는 인접 뉴클레오타이드 사이의 스태킹 상호작용(stacking interaction)에 의해 안정화된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이중체는 염기 페어링 또는 스태킹 상호작용에 의해 확립되거나 유지될 수 있다. 이중체는 실질적으로 상보적이거나 완전히 상보적일 수 있는 2개의 상보적 핵산 가닥에 의해 형성된다. 다수의 염기에 걸쳐 염기쌍을 이루는 단일 가닥 핵산은 "혼성화"한다고 한다.

생체외: 본 명세서에서 사용되는 용어 "생체외"는 다세포 유기체 내부가 아닌 외부에서 성장하는 세포 또는 조직에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.

기능적 등가물 또는 유사체: 본 명세서에서 사용되는 용어 "기능적 등가물" 또는 "기능적 유사체"는, 아미노산 서열의 기능적 유도체의 맥락에서, 원래 서열의 것과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능 또는 구조적)을 유지하는 분자를 의미한다. 기능적 유도체 또는 등가물은 천연 유도체이거나 합성적으로 제조될 수 있다. 예시적인 기능적 유도체는 단백질의 생물학적 활성이 보존된다는 전제하에 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산을 치환하면 바람직하게는 치환된 아미노산과 유사한 화학-물리적 특성을 갖는다. 바람직한 유사한 화학-물리적 특성은 전하의 유사성, 벌키성(bulkiness), 소수성, 친수성 등을 포함한다.

반감기: 본 명세서에서 사용되는 용어 "반감기"는 단백질 농도 또는 활성과 같은 양이 기간의 시작 시 측정된 값의 절반으로 떨어지는 데 필요한 시간이다.

혼성화하다: "혼성화하다"는 다양한 엄격한 조건하에서 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 유전자 본 명세서에 기재된) 또는 이의 일부 사이에 이중 가닥 분자를 형성하는 것을 의미한다(예를 들어, 문헌[Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조). 혼성화는 상보적 핵염기 사이의 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 수소 결합일 수 있는 수소 결합에 의해 발생한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보적 핵염기이다.

개선하다, 증가하다 또는 감소하다: 본 명세서에서 사용되는 용어 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다" 또는 문법적 동등어는 본 명세서에 기재된 치료 시작 전 동일한 개체에서의 측정값 또는 본 명세서에 기재된 치료 부재 시 대조군 대상체(또는 여러 대조군 대상체)에서의 측정값과 같은 기준 측정값에 상대적인 값을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료 중인 대상체와 대략 동일한 연령인 치료 중인 대상체와 동일한 형태의 질환을 앓고 있는 대상체이다.

Indel: 본 명세서에서 사용되는 용어 "indel"은 핵산 서열 내 염기의 삽입 또는 결실을 지칭한다. 이는 일반적으로 돌연변이를 초래하며, 유전적 변이의 일반적인 형태이다.

저해: 본 명세서에서 사용되는 용어 "저해", "저해하다" 및 "저해하는"은 관심 단백질 또는 유전자의 활성 및/또는 발현을 줄이거나 감소시키는 과정 또는 방법을 지칭한다. 전형적으로, 단백질 또는 유전자를 저해하는 것은 단백질 또는 유전자의 발현 또는 관련 활성을 적어도 10% 이상, 예를 들어, 20%, 30%, 40% 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 감소시키는 것 또는 본 명세서에 기재되거나 당업계에서 인식되는 하나 이상의 방법에 의해 측정되는 경우 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배, 100-배 이상의 발현 또는 관련 활성의 감소를 지칭한다.

시험관내: 본 명세서에서 사용되는 용어 "시험관내"는 다세포 유기체 내부가 아닌 인공 환경, 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양물 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.

생체내: 본 명세서에서 사용되는 용어 "생체내"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다. 세포 기반 시스템의 맥락에서, 해당 용어는 (예를 들어, 시험관내 시스템과는 반대되는) 살아있는 세포 내에서 발생하는 이벤트를 지칭하는 데 사용될 수 있다.

링커 또는 스페이서: 링커 또는 스페이서는 Cas 결합 및 gRNA의 기능을 가능하게 하기 위해 gRNA 서열의 말단 위치를 NSL 서열로부터 물리적으로 분리하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, 링커는 RNA이다. 일부 실시형태에서, 링커는 화학적 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 링커는 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 링커는 DNA이다. 일부 실시형태에서, 링커는 화학적 링커, 예를 들어, PEG9/18이다. 일부 실시형태에서, 링커는 DNA 링커이다.

올리고뉴클레오타이드: 본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA의 약 5개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드는 "올리고머" 또는 "올리고"로도 알려져 있으며, 유전자로부터 단리되거나 화학적으로 합성될 수 있다.

PAM: 용어 "PAM" 또는 "프로토스페이서 인접 모티프"는 CRISPR-Cas9와 같은 CRISPR 시스템에 의한 절단에 대해 표적화된 핵산 영역을 따르는 짧은 핵산 서열(일반적으로 2개 내지 6개의 염기쌍 길이)을 지칭한다. PAM은 Cas 뉴클레이스가 절단을 위해 필요할 수 있으며, 이는 일반적으로 절단 부위로부터 하류에 있는 3개 내지 4개의 뉴클레오타이드에서 발견된다.

폴리펩타이드: 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적 사슬을 지칭한다. 해당 용어는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 지칭하는 데 사용되지만, 당업자는 이 용어가 긴 사슬에 제한되지 않고 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 2개의 아미노산을 포함하는 최소한의 사슬을 지칭할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 폴리펩타이드는 처리되고/되거나 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 상호교환적으로 사용된다.

예방하다: 본 명세서에서 사용되는 용어 "예방하다" 또는 "예방"은 질환, 장애 및/또는 병태의 발생과 관련하여 사용될 때 질환, 장애 및/또는 병태가 발생할 위험을 줄이는 것을 의미한다.

단백질: 본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질"은 별개의 단위로 기능하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 지칭한다. 단일 폴리펩타이드가 별개의 기능 단위이며 별개의 기능 단위를 형성하기 위해 다른 폴리펩타이드와의 영구적 또는 일시적인 물리적 회합을 필요로 하지 않는 경우, 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 별개의 기능적 단위가 서로 물리적으로 회합하는 하나 초과의 폴리펩타이드로 구성되는 경우, 용어 "단백질"은 물리적으로 커플링되어 별개의 단위로서 함께 기능하는 다중 폴리펩타이드를 지칭한다.

참조: "참조(reference)" 독립체, 시스템, 양, 조건의 세트 등은 본 명세서에 기재된 바와 같이 테스트 독립체, 시스템, 양, 조건의 세트 등이 비교되는 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, "참조" 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 조작되지 않은 대조군 항체이다.

RNA 가이드: 용어 "RNA 가이드" 또는 "가이드 RNA"는 본 명세서에 기재된 단백질의 표적 핵산에 대한 표적화를 용이하게 하는 RNA 분자를 지칭한다. 예시적인 "RNA 가이드" 또는 "가이드 RNA"는 crRNA 또는 동족 tracrRNA와 조합된 crRNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 후자는 독립적인 RNA일 수 있거나 링커(sgRNA)를 사용하여 단일 RNA로 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 화학적 또는 생화학적 변형을 포함하도록 조작되고, 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 용어 "RNA 가이드" 또는 "가이드 RNA"는 또한 NLS-gRNA를 지칭한다.

단일 가닥 라이게이스: 본 명세서에서 사용되는 용어 "단일 가닥 라이게이스"는 결찰 활성을 위해 올리고뉴클레오타이드 스플린트(splint) 또는 주형을 필요로 하지 않는 라이게이스를 의미한다.

스플린트 또는 올리고뉴클레오타이드 스플린트: 용어 "스플린트" 또는 "올리고뉴클레오타이드 스플린트"는 적어도 2개, 3개 이상의 단일 가닥 RNA 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있는 단일 가닥 RNA 또는 DNA 또는 기타 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 스플린트는 올리고뉴클레오타이드 스플린트를 지칭할 수 있다.

대상체: 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 진단, 예후 또는 요법이 요구되는 임의의 대상을 의미한다. 예를 들어, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류(예컨대, 유인원, 원숭이, 오랑우탄 또는 침팬지), 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소 또는 암소일 수 있다.

sgRNA: 용어 "sgRNA", "단일 가이드 RNA", 또는 "가이드 RNA"는 (i) 가이드 서열(crRNA 서열) 및 (ii) Cas9 뉴클레이스 동원 서열(tracrRNA)을 포함하는 단일 가이드 RNA를 지칭한다.

실질적인 동일성: 어구 "실질적인 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개의 서열은 일반적으로 상응하는 위치에 동일한 잔기를 포함하는 경우 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, gapped BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상업용 컴퓨터 프로그램에서 이용 가능한 알고리즘을 포함하여 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은 문헌[Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999.]에 기술되어 있다. 동일한 서열을 식별하는 것 외에도, 위에 언급된 프로그램은 전형적으로 동일성의 정도에 대한 표시를 제공한다. 일부 실시형태에서, 2개의 서열은 상응하는 잔기의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이 잔기의 관련 신장부(stretch)에 걸쳐 동일한 경우 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 관련 신장부는 완전한 서열이다. 일부 실시형태에서, 관련 신장부는 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 225개, 250개, 275개, 300개, 325개, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475개, 500개 이상의 잔기이다.

표적 핵산: 본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 핵산"은 CRISPR-Cas9 시스템이 결합하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드), 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 표적 핵산은 3차원 구조를 가질 수 있고, 코딩 또는 논코딩 영역을 포함할 수 있고, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, cDNA, 플라스미드, 벡터, 외인성 서열, 내인성 서열을 포함할 수 있다. 표적 핵산은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 메틸화된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 비핵산 구성요소와 함께 산재될 수 있다. 표적 핵산은 단일-, 이중- 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함하는 중합체 또는 다른 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기에 제한되지 않는다.

치료학적 유효량: 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험 비로 치료 대상체에게 치료적 효과를 부여하는 치료적 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조작된 항체)의 양을 지칭한다. 치료적 효과는 객관적(즉, 일부 테스트 또는 마커에 의해 측정 가능함)이거나 주관적(즉, 대상체가 효과를 나타내거나 느낌)일 수 있다. 특히, "치료학적 유효량"은, 예컨대, 질환과 관련된 증상을 개선하거나, 질환의 발병을 예방하거나 지연시키고/시키거나 또한 질환 증상의 중증도 또는 빈도를 줄임으로써 검출 가능한 치료적 또는 예방적 효과를 나타내는 데 효과적인 치료적 분자 또는 조성물의 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 다중 단위 용량을 포함할 수 있는 투여 양생법으로 투여될 수 있다. 임의의 특정 치료적 분자의 경우, 치료학적 유효량(및/또는 효과적인 투여 양생법 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어, 투여 경로 또는 다른 약제와의 조합에 따라 달라질 수 있다. 또한, 임의의 특정 대상체에 대한 특정 치료학적 유효량(및/또는 단위 용량)은 치료 중인 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 약제의 활성; 사용되는 특정 조성물; 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및/또는 사용되는 특정 치료적 분자의 배설 또는 대사 속도; 치료 기간; 의학 분야에서 잘 알려진 것과 같은 요인 등을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

tracrRNA: 본 명세서에서 사용되는 용어 "tracrRNA" 또는 "트랜스 활성화 crRNA"는 CRISPR 연관 단백질이 특정 표적 핵산에 결합하는 데 필요한 구조를 형성하는 서열을 포함하는 RNA를 지칭한다.

치료: 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 완화, 개선, 경감, 저해하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나 이의 발생률을 감소시키는 치료적 분자(예를 들어, CRISPR-Cas 치료적 단백질 또는 시스템 본 명세서에 기재된)의 임의의 투여를 지칭한다. 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다.

도면은 설명의 목적으로만 제공되며 제한하고자 하는 것이 아니다.
도 1은 NLS 서열에 접합된 gRNA의 예시적인 개략도이다. 이 특정 설계에서, gRNA의 3' 말단이 펩타이드 스페이서의 N-말단에 접합되고 이어서 SV40으로부터 유래된 NLS 서열이 접합된다.
도 2는 spCas9의 N-말단에 융합된 아데닌 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기를 사용하여 달성된 아데닌에서 구아닌 염기로(A에서 G로)의 전환 백분율의 결과를 보여주는 예시적인 그래프이다. A에서 G로의 전환 백분율(y-축)은 다양한 비의 염기 편집기를 암호화하는 mRNA(1:1, 1:3 및 1:9)에서 NLS가 있거나 없는 다양한 가이드 RNA에 대해 플로팅되었다. "Lipo 대조군"은 리포펙타민 중 염기 편집기 gRNA(NLS 없음)를 암호화하는 mRNA를 포함한다. "Lipo 대조군"은 LNP 그룹에 대한 형질감염 대조군의 역할을 하도록 제형화되었다.
도 3a는 상이한 변형을 갖는 gRNA의 예시적인 개략도이다. "EM"(말단 변형) gRNA는 3' 및 5' 말단 모두에 2'OMe 변형이 있는 3개의 뉴클레오타이드를 갖는다. "HM1"(중질 변형(heavy modified) 1)은 2'OMe 변형으로 변형된 gRNA의 47%를 갖는다. "HM2"(중질 변형 2)는 2'OMe 변형으로 변형된 gRNA의 60%를 갖는다. "HM3"(중질 변형 3)은 2'OME 및 2'F 변형으로 변형된 gRNA의 88%를 갖는다. 실시예 2에서 사용된 NLS-gRNA는 말단 변형을 포함한다. 도 3b는 spCas9의 N-말단에 융합된 아데닌 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기를 사용하여 마우스에서 달성된 아데닌에서 구아닌 염기로(A에서 G로)의 전환 백분율의 결과를 보여주는 예시적인 그래프이다. A에서 G로 전환 백분율(y-축)은 NLS가 있거나 없는 그리고 gRNA에 다양한 변형이 있거나 없는 다양한 가이드 RNA에 대해 플로팅되었다.
도 4a는 spCas9의 N-말단에 융합된 아데닌 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기를 사용하여 비인간 영장류(NHP)에서 달성된 염기 편집 효율의 결과를 보여주는 예시적인 그래프이다. 간에서의 염기 편집 효율(y-축)은 NLS가 있거나 없는 그리고 gRNA에 다양한 변형이 있거나 없는 다양한 가이드 RNA에 대해 플로팅되었다. 도 4b는 독성학 결과를 보여주는 일련의 예시적인 그래프이다. AST 및 ALT 수준은 투여 후 24시간에 측정되었으며, 다양한 gRNA를 포함하는 제형을 사용한 투여 전 AST/ALT 수준과 비교한 배수 변화가 표시된다.
도 5는 saCas9의 N-말단에 융합된 아데닌 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기를 사용하여 마우스에서 달성된 아데닌에서 구아닌 염기로(A에서 G로)의 전환 백분율의 결과를 보여주는 예시적인 그래프이다. 표적 적중(on-target) 및 방관자(bystander) 편집 모두에 대한 A에서 G로의 전환 백분율(y-축)은 다양한 순도 및 변형이 있는 다양한 가이드 RNA에 대해 플로팅되었다.
도 6a 및 도 6b는 huG6PC-R83C에 대해 이형접합성인 트랜스제닉 마우스 모델의 간 추출물에서 GSD1a 돌연변이의 생체내 교정을 도시한다. 도 6a는 생체내 작업 흐름을 도시하는 개략도이다. 염기 편집기 mRNA 및 gRNA를 운반하는 지질 나노입자(LNP)는 R83C 돌연변이를 보유하는 huG6PC(huR83C HET)에 대해 이형접합성인 트랜스제닉 마우스에 IV 주사를 통해 투여되었다. 도 6b는 MSP828을 사용한 GSD1a R83C 돌연변이의 A에서 G로의 염기 편집 효율을 표적 적중 및 방관자 편집을 비교하여 도시하는 막대 그래프이다.
도 6c는 TadA 아데노신 데아미네이스 변이체 MSP605, MSP824, MSP825, MSP680, MSP828 및 MSP820을 사용하여 R83C 돌연변이를 보유하는 huG6PC에 대해 이형접합성인 트랜스제닉 마우스 모델에서 GSD1a R83C 돌연변이의 교정을 도시하는 막대 그래프이다. 시험관내 스크리닝이 R83C 교정을 위한 바람직한 염기 편집기의 선택을 위해 실행되었다. gRNA 및 대표적인 염기 편집기의 LNP 복합제형이 huG6PC-R83C에 대해 이형접합성인 트랜스제닉 마우스에 (1mpk의 포화 이하의 용량으로) 생체내 투여되었다. LNP 처리된 huG6PC-R83C 이형접합체 트랜스제닉 동물의 간에서 R83C 교정을 위한 변이체의 염기 편집 효능은 도 6c에 도시되어 있다. 변이체 MSP828은 이러한 조건하에서 높은 수준의 표적 적중 활성을 나타내었다. A에서 G로의 염기 편집 효율은 표적 적중 및 방관자 편집에 대해 표시된다.
도 7은 정상 및 기능 상실 g6pc 기능 및 관련 결과를 도시하는 개략도를 보여준다. GSD-Ia(또는 본 명세서에서는 GSD1a)는 g6pc 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 상염색체 열성 장애이다. 효소의 활성 부위에 위치한 R83C는 백인 GSD-Ia 환자에서 확인된 가장 널리 퍼진 병원성 돌연변이이며, G6Pase의 불활성화와 관련이 있다. G6Pase 기능의 상실은 생명을 위협하는 저혈당증, 발작 및 심지어 사망까지 초래할 수 있다. 저혈당증을 완화시키기 위해, 환자는 느린 포도당 방출 방식을 통해 밤낮으로 포도당의 보충을 엄격하고 빈번하게 준수하여야 한다. 복용을 놓치거나 지연하면 응급 저혈당증이 발생할 수 있다. 많은 합병증 중에서, 간 비대, 요산, 젖산 및 지질의 축적이 GSD-Ia 환자에서 흔하다.
도 8은 본 명세서에 기재된 바와 같은 염기 편집기가 편집 창에서 영구적이고 예측된 뉴클레오타이드 치환을 생성한다는 것을 예시하는 개략도를 보여준다. R83C 돌연변이는 g6pc 유전자에 단일 G>A 전환을 도입한다. 아데닌 염기 편집기(ABE)는 게놈 DNA에서 A에서 G로의 프로그래밍 가능한 전환을 가능하게 하므로, 이 돌연변이를 교정하는 데 사용될 수 있다. 도 8은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ABE 및 염기 편집의 유용성을 도시한다. ABE는 가이드 RNA에 상보적인 표적 DNA에 결합하여 단일 가닥 DNA의 신장부를 노출시킨다. 데아미네이스는 표적 아데닌을 이노신으로 전환시키고, Cas 효소는 반대 가닥에 닉을 형성한 다음 복구시켜 염기쌍 전환을 완료한다. 점 돌연변이의 직접적인 복구는 유전자 기능의 회복 가능성을 가지고 있다.
도 9a 및 도 9b는 표적 뉴클레오타이드 부위, 방관자 및 PAM 뉴클레오타이드에 대한 묘사 및 불멸화된 HEK293 세포에 사용된 ABE가 R83C의 상당한 비율의 정확한 교정을 생성함을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. g6pc 유전자에서 A에서 G로의 전환을 위한 염기 편집기는 R83C의 교정을 위해 최적화되었다. GSD-Ia R83C 돌연변이에 대한 표적 DNA 서열(CCACCAGTATGGACACTGTCCAAAGAGAAT(서열번호 17)) 및 밑줄이 그어져 있는 아미노산 번역(WWYPCQGFLI; 서열번호 18)이 도 9a에 도시되어 있다. 표적 편집은 위치 12번 위치에 이중 밑줄로 표시된다. 편집 창은 또한 6번 위치에 단일 밑줄로 표시된 가능한 방관자 및 10번 위치에 표시된 동의 전환(synonymous conversion)이 발생할 수 있는 편집을 포함한다. 스크리닝을 위해, R83C 돌연변이를 보유하는 g6pc 이식유전자를 발현시키기 위해 HEK293 세포주가 생성되고, 염기 편집기 mRNA 및 gRNA로 형질감염되었다. 대립유전자 빈도는 고속대량 표적화 앰플리콘 차세대 시퀀싱(Next-Generation Sequencing: NGS)에 의해 평가되었다. 변이체 1 내지 변이체 5는 최적화된 표적 교정을 위해 조작된 gRNA와 염기 편집기 RNA의 조합을 나타낸다. 변이체 5는 제한된 방관자 편집을 사용하여 R83C 교정에 대해 대략 60%의 표적화된 염기 편집 효율을 나타내었다(도 9b).
도 10은 3주령의 동형접합성 huR83C(Hom huR83C) 마우스가 GSD-1a의 예상되는 성장 장애 및 대사 결함 특징을 나타냄을 보여주는 사진 이미지 및 막대 그래프를 제시한다. 실험을 위해, 마우스 G6PC 대신 인간 G6PC-R83C 이식유전자를 발현하는 GSD-Ia 마우스가 생체내 염기 편집을 검증하기 위해 생성되었다. 표시된 결과는 huR83C에 대해 동형접합성인 마우스가 출생 후 치사성을 나타내었음(사산되었거나 24시간 내에 죽었음)을 확인시켜 준다. 포도당 보충 요법에서, 동물은 적어도 3주령까지 생존하였고, GSD-Ia의 특징적인 병리학적 시그니처는 한배 새끼 대조군과 비교하여 임상 및 발표된 보고서와 일치하는 표현형인 체중 감소, 간 비대, 상당한 G6Pase 저해 및 비정상적인 혈청 대사산물을 나타내었다.
도 11a 및 도 11b는 본 명세서에 기재된 염기 편집기(ABE)에 의해 달성된 생체내 교정의 점 플롯을 보여준다. 도 11a는 성체 및 신생아 이형접합성 huR83C 마우스의 간에서의 효율적인 지질 나노입자(LNP) 매개성 염기 편집(huG6PC-R83C 교정)을 예시한다. 생체내 R83C 교정에 대한 염기 편집 효율을 검증하기 위해, LNP 매개성 전달은 먼저 huR83C에 대해 이형접합성인 덜 취약한 트랜스제닉 마우스에서 최적화되었다. 도 6a의 개략도는 IV 주사를 통해 투여된 지질 나노입자(LNP) 또는 염기 편집기 mRNA와 gRNA의 LNP 복합제형을 사용하는 이러한 실험에 대한 생체내 작업 흐름을 도시한다. 동형접합성 마우스의 신생아 치사성을 고려하여, 출생 직후 이형접합성 huR83C 마우스의 중측두 정맥을 통한 LNP-투여가 사용되었으며, 활성은 꼬리 정맥을 통해 LNP를 투여받은 성체 이형접합성 huR83C 마우스에서 관찰된 것과 비교되었다. 전체 간 추출물에 대한 NGS 분석은 성체에서는 대략 40%의 염기 편집 효율 그리고 신생에서는 최대 약 60%의 효율을 나타내었으며, 효율의 범위는 더 광범위하였다. 방관자 편집은 성체 및 신생에서 낮게 유지되었다. 도 11b는 간에서의 LNP 매개성 R83C 교정이 신생아 동형접합성 huR83C 마우스 및 한배 새끼 이형접합성 huR83C 마우스의 생존과 연관되어 있음을 보여준다. 간략하게는, huR83C에 대해 동형접합성인 신생아 마우스는 가이드 RNA 및 ABE를 암호화하는 mRNA를 포함하는 LNP로 처리되었다. 처리된 마우스는 포도당 요법의 부재하에 저혈당증 유도성 발작 없이 3주령까지 정상적으로 성장하였다. 처리된 동형접합성 huR83C 마우스는 총 간 추출물에서 최대 약 60%의 편집 효율(즉, 약 60%의 R83C 교정)을 나타내었으며, 이는 huR83C에 대해 이형접합성인 한배 새끼 대조군과 일치한다.
도 12a 및 도 12b는 huG6PC-R83C에 대해 동형접합성인 마우스에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 염기 편집이 대사 기능을 거의 정상으로 회복시켜 GSD-Ia 병리를 역전시킴을 보여주는 막대 그래프 및 면역조직화학적 염색 이미지를 보여준다. 3주에, 처리된 동형접합성 huR83C 마우스는 도 12a의 그래프의 가장 어두운 막대로 표시된 바와 같이 포도당, 트라이글리세리드, 콜레스테롤, 젖산 및 요산을 포함한 혈청 대사 산물 마커를 거의 정상으로 회복시켜 적절한 대사 기능을 나타내는 것으로 검증되었다. 더욱이, LNP 처리된 동형접합성 huR83C 마우스에서의 G6PC 활성의 생화학적 검정(생화학적으로 그리고 납-인산 염색을 통해 평가됨)은 한배 새끼 대조군의 것과 일치하였다. GSD-Ia의 또 다른 임상 증상인 간비대증은 주로 과도한 글리코겐 및 지질 침착으로 인해 발생한다. 면역조직화학적 분석을 통해 LNP 처리된 마우스에서 정상적인 간세포 크기 및 지질 침착이 밝혀졌다(도 12b). 결과는 R83C 돌연변이 및 GSD-Ia와 연관된 대사 결함을 교정하기 위한 염기 편집의 가능성을 보여준다.
도 13은 동형접합성 huG6PC-R83C 마우스에서의 단일 LNP 용량 투여가 본 명세서에 기재된 바와 같은 염기 편집을 통해 24시간 금식 동안 정상혈당을 유지하였음을 입증하는 막대 그래프를 보여준다.
도 14는 ABE mRNA를 통한 염기 편집 후 또는 처리되지 않은 huG6PC-R83C에 대해 동형접합성인 신생아 트랜스제닉 마우스의 생존을 추정하기 위해 생성된 Kaplan-Meier 생존 곡선을 보여준다. 신생아 마우스는 다음 프라이머: 보편적인 정방향 프라이머(5'-ACCTACTGATGATGCACCTTTGATCAA태그AT-3'(서열번호 61)), 마우스 특정 역방향 프라이머(5'-CATCACCCCTCGGGATGGTTCTT-3'(서열번호 62)), 인간 특정 역방향 프라이머 1(5'-CAGCCCAGAATCCCAACCACAAAAT-3'(서열번호 63) 및 인간 특정 역방향 프라이머 2(5'-AGACCAGCTCGACTTGGGATGG-3'(서열번호 64))를 사용하여 게놈 꼬리 DNA에 대한 PCR 분석을 통해 유전자형이 분석되었다. huG6PC-R83C에 대해 동형접합성인 트랜스제닉 마우스에 대한 생존에 주목하였다. 처리되지 않은 마우스는 사산(n=6)되거나 8시간(n=6) 및 24시간(n=1)에 죽었다. 15% 포도당 주사의 투여로 인해 생존은 32시간(n=5), 48시간(n=2) 및 56시간(n=2)까지 연장되었다. huG6PC-R83C에 대해 동형접합성인 모든 ABE-처리된 마우스는 연구 종료 후 3주까지 생존하였다.
도 15a는 Cy5 염료로 형광 태깅된 gRNA의 개략도이다. 도 15b는 Cy5 염료로 형광 태깅된 NLS에 접합된 gRNA의 개략도이다. 도 15c는 Nuc Blue를 사용한 핵 염색을 보여준다. 도 15d는 Cy5를 사용한 핵 염색 및 ALAS1/sg23 gRNA 국재화를 보여준다. 도 15e는 NLS-gRNA의 향상된 핵 국재화를 보여준다.
도 16은 3' 말단에서 saCas9 효과기에 결합된 NLS 접합체의 모델이다.
도 17a는 예시적인 5% 말단 변형 gRNA 및 예시적인 25% 중질 변형 saHM03 gRNA의 서열을 제공한다. 도 17b는 말단 변형 gRNA 및 중질 변형 saHM03 gRNA에 대한 예시적인 NLS에 접합된 gRNA의 A에서 G로의 염기 편집 효율의 결과를 보여주는 그래프이다.

CRISPR-Cas 시스템에서 사용하기 위한 gRNA의 효능을 향상시키는 방법, 조성물 및 키트가 본 명세서에 제공된다. 일부 양태에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템에서 사용하기 위한 효능이 증가되어 성공적인 편집 이벤트의 빈도가 증가된 NLS 서열에 접합된 gRNA(NLS-gRNA)를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 NLS-gRNA는 핵을 세포질의 RNase로부터 보호하고 RNP의 형성을 위한 gRNA의 더 높은 국부 농도를 증가시키기 위해 gRNA의 핵으로의 더 나은 수송을 제공할 수 있다. 본 발명의 NLS-gRNA NLS 서열이 없는 대응 gRNA와 비교하여 상당히 더 높은 효능을 가지며, 또한 고도로 변형된 gRNA와 비교하여 더 높은 효능을 나타낸다.

NLS 서열에 접합된 gRNA(NLS-gRNA)는, 예를 들어, 증가된 효능을 포함하는 잠재적인 수많은 이점을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 NLS-gRNA은 NLS 서열이 없는 대응 gRNA에 비해 상당히 더 높은 염기 편집 효율을 제공한다. 더욱이, 말단 변형이 있는 NLS-gRNA(예를 들어, 3' 말단 및/또는 5' 말단에 2'OMe 변형을 포함)는 고도로 변형된(예를 들어, 40% 초과, 60% 초과 또는 88% 초과 변형된) gRNA와 비교하여 더 높은 효능을 제공한다.

본 발명의 다양한 양태는 다음 부문에서 자세히 설명된다. 부문의 사용은 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 각 부문은 본 발명의 임의의 양태에 적용할 수 있다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.

가이드 RNA(gRNA)

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 가이드 RNA(gRNA)는 또한 달리 명시되지 않는 한 NLS 서열에 접합된 가이드 RNA(NLS-gRNA)를 지칭한다. gRNA는 표적 서열과 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA는 표적 핵산 서열과 혼성화되고, CRISPR 복합체의 표적 핵산에 대한 서열 특이적 결합을 지시한다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 표적 핵산 서열과 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상보성을 갖는다.

일부 실시형태에서, gRNA는 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 250개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 500개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 1,000개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 205개, 210개, 215개, 220개, 225개, 230개, 235개, 240개, 245개 또는 250개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 50개 내지 75개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 75개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 100개 내지 125개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 125개 내지 150개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 150개 내지 175개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 175개 내지 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 200개 내지 225개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 약 225개 내지 250개의 뉴클레오타이드 길이이다.

일부 실시형태에서, gRNA는 결찰된 crRNA 및 tracrRNA를 포함한다. 다양한 crRNA 및 tracrRNA 서열, 예를 들어, 특히 몇몇의 유형 II CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, WO2013/176772), Cpf1, SaCas9, Cas12와 연관된 것들이 당업계에 공지되어 있다.

gRNA는 임의의 표적 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다. 최적의 정렬은 Needleman-Wunsch 알고리즘, Smith-Waterman 알고리즘, Burrows-Wheeler 알고리즘, ClustlW, ClustlX, BLAST, Novoalign, SOAP, Maq 및 ELAND를 비롯한 서열을 정렬하기 위한 임의의 알고리즘을 사용하여 결정된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 세포 게놈 내의 고유한 표적 서열을 표적화하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 PAM 서열이 결여되도록 설계된다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열은 mFold 또는 Geneious를 비롯한 접힘 알고리즘을 사용하여 최적의 2차 구조를 갖도록 설계된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 발현은, 예를 들어, 호르몬 유도성, 테트라사이클린 또는 독시사이클린 유도성, 아라비노스 유도성 또는 광 유도성과 같은 유도성 프로모터하에서 이루어질 수 있다.

일부 실시형태에서, gRNA 서열은 CRISPR 연관 단백질과 복합체를 형성하고 임의의 실질적인 뉴클레이스 활성이 없이 특정 표적에 결합할 수 있는 "활성이 없는 crRNA", "활성이 없는 가이드" 또는 "활성이 없는 가이드 서열"이다.

일부 실시형태에서, gRNA는 당 포스페이트 백본 또는 염기에서 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 뉴클레이스 저항성 또는 염기 페어링을 개선하기 위해 다음 변형 2'O-메틸, 2'-F 또는 잠금 핵산 중 하나 이상을 갖는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 2-티오우리딘 또는 N6-메틸아데노신과 같은 변형된 염기를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, gRNA는 다른 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 태그, 염료 또는 폴리에틸렌 글리콜과 접합된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 3차원 구조로 인해 특정 표적 분자에 결합하는 압타머 또는 리보스위치 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, gRNA는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 헤어핀을 갖는다.

일부 실시형태에서, gRNA는 6개의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리T 서열을 포함하는 전사 종결 서열을 포함한다.

핵 국재화(NLS) 서열에 대한 gRNA의 접합

일 양태에서, 본 발명은 gRNA의 3' 말단을 통해 NLS 서열에 접합된 gRNA를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 gRNA의 5' 말단을 통해 NLS 서열에 접합된 gRNA를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 gRNA의 내부 부위를 통해 NLS 서열에 접합된 gRNA를 제공한다.

실시형태에서, gRNA는 화학적 모이어티(예를 들어, L)와 펩타이드성 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 둘 다 포함하는 링커를 통해 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 이러한 접합체는 화학식 (I)에 따른 구조를 가질 수 있되, 화학적 모이어티 L(예를 들어, 비펩타이드성 화학적 모이어티)은 gRNA 및 펩타이드 스페이서에 공유적으로 부착되고, 펩타이드 스페이서는 NLS에 공유적으로 부착된다.

(화학식 (I))

일부 실시형태에서, NLS 서열의 N-말단은 화학적 모이어티(예를 들어, L)와 펩타이드 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 둘 다 포함하는 링커를 통해 gRNA의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시형태에서, NLS 서열의 C-말단은 화학적 모이어티(예를 들어, L)와 펩타이드 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 둘 다 포함하는 링커를 통해 gRNA의 5' 말단에 접합된다. 일부 실시형태에서, NLS 서열의 내부 아미노산은 화학적 모이어티(예를 들어, L)와 펩타이드 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 둘 다 포함하는 링커를 통해 gRNA의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시형태에서, NLS 서열의 내부 아미노산은 화학적 모이어티(예를 들어, L)와 펩타이드 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 둘 다 포함하는 링커를 통해 gRNA의 5' 말단에 접합된다. 일부 실시형태에서, NLS 서열의 내부 아미노산은 화학적 모이어티(예를 들어, L)와 펩타이드 모이어티(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 둘 다 포함하는 링커를 통해 gRNA의 내부 뉴클레오타이드에 접합된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 펩타이드 스페이서 또는 NLS의 티올 함유 잔기(예를 들어, 시스테인 잔기)에 공유적으로 부착된다.

일부 실시형태에서, gRNA는 환원적 아미노화를 통해 NLS에 접합된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 NLS 고유(천연) 화학적 결찰에 접합된다. gRNA는 티올렌 클릭을 통해 NLS에 접합된다.

링커를 제조하는 데 유용한 예시적인 화학물질이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 화학적 모이어티는 하위구조 L¹ 및/또는 L²를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 L¹ 및 L²는 각각 독립적으로 C_1-12 알킬렌 또는 C_2-12 헤테로알킬렌인 선택적으로 치환된 그룹이다. 실시형태에서, L¹ 및 L²는 옥소(=O) 치환기(예를 들어, 1개 또는 2개의 옥소 치환기)를 포함한다.

말레이미드-티올/말레이미드-셀렌올 부가물

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 말레이미드-티올 부가물을 포함한다.

실시형태에서, gRNA는 말레이미드기와 티올기 사이의 첨가 반응 또는 티올렌 클릭 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 말레이미드-티올 부가물 함유 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 말레이미드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 말레이미드-티올 부가물 함유 모이어티는 말레이미드기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 말레이미드-셀렌올 부가물을 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 말레이미드기와 셀렌올기 사이의 첨가 반응을 사용하여 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 말레이미드-셀렌올 부가물 함유 모이어티는 셀렌올기를 포함하는 gRNA와 말레이미드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 말레이미드-셀렌올 부가물 함유 모이어티는 말레이미드기를 포함하는 gRNA와 셀렌올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함하되, Y는 S 또는 Se이다.

실시형태에서, Y는 S이다. 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 말레이미드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 말레이미드-티올 부가물 함유 모이어티는 말레이미드기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, Y는 Se이다. 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 셀렌올기를 포함하는 gRNA와 말레이미드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 말레이미드-셀렌올 부가물 함유 모이어티는 말레이미드기를 포함하는 gRNA와 셀렌올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티 L은 하기 구조 (A)를 갖되, Y는 S 또는 Se이다:

(구조 (A)).

실시형태에서, Y는 S이다. 실시형태에서, *는 gRNA에 대한 공유 부착을 나타낸다. 실시형태에서, **는 펩타이드 스페이서 또는 NLS에 대한 공유 부착을 나타낸다. 실시형태에서, **는 펩타이드 스페이서에 대한 공유 부착을 나타낸다.

티오에터/셀레노에터

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 티오에터기를 포함한다.

실시형태에서, gRNA는 아이오도아세트아마이드기와 티올기 사이의 접합 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 티오에터 함유 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 아이오도아세트아마이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 티오에터 함유 모이어티는 아이오도아세트아마이드기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 셀레노에터 모이어티를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 아이오도아세트아마이드기와 셀렌올기 사이의 접합 반응을 사용하여 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 셀레노에터 함유 모이어티는 셀렌올기를 포함하는 gRNA와 아이오도아세트아마이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 셀레노에터 함유 모이어티는 아이오도아세트아마이드기를 포함하는 gRNA와 셀렌올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, Y는 S이다. 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 아이오도아세트아마이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아이오도아세트아마이드기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, Y는 Se이다. 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 셀렌올기를 포함하는 gRNA와 아이오도아세트아마이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아이오도아세트아마이드기를 포함하는 gRNA와 셀렌올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

다이설파이드(티올-다이설파이드 교환 화학)

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 다이설파이드기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 다이설파이드 함유기와 티올기 사이의 티올-다이설파이드 교환 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 다이설파이드 함유 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 다이설파이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 다이설파이드 함유 모이어티는 다이설파이드기를 포함하는 gRNA 및 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 다이설파이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 다이설파이드기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

옥사다이아졸 티오에터

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 옥사다이아졸 티오에터기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 티올기와 설폰일옥사다이아졸기 사이의 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 옥사다이아졸 티오에터 함유 모이어티는 설폰일옥사다이아졸기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 옥사다이아졸 티오에터 함유 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 설폰일옥사다이아졸기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 설폰일옥사다이아졸기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 설폰일옥사다이아졸기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

우레아/티오우레아/다이티오카바메이트(아이소(티오)사이아네이트 화학)

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 우레아기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기와 아이소아이아네이트기 사이의 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 우레아 함유 모이어티는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 gRNA와 아이소아이아네이트기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 우레아 함유 모이어티는 아이소아이아네이트기를 포함하는 gRNA와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 티오우레아기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기와 아이소티오사이아네이트기 사이의 반응을 사용하여 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 티오우레아 함유 모이어티는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 gRNA와 아이소티오사이아네이트기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 티오우레아 함유 모이어티는 아이소티오사이아네이트기를 포함하는 gRNA 및 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함하되, X는 S 또는 O이다.

실시형태에서, X는 O이다. 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 gRNA와 아이소아이아네이트기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아이소아이아네이트기를 포함하는 gRNA와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, X는 S이다. 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 gRNA와 아이소티오사이아네이트기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아이소티오사이아네이트기를 포함하는 gRNA와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 다이티오카바메이트기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 티올기와 아이소티오사이아네이트기 사이의 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 다이티오카바메이트 함유 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 아이소티오사이아네이트기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 다이티오카바메이트 함유 모이어티는 아이소티오사이아네이트기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 티올기를 포함하는 gRNA와 아이소티오사이아네이트기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아이소티오사이아네이트기를 포함하는 gRNA와 티올기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

다이아젠일페놀

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 다이아젠일페놀기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 페놀기와 다이아조늄기 사이의 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 다이아젠일페놀 함유 모이어티는 페놀기를 포함하는 gRNA 및 다이아조늄기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 다이아젠일페놀 함유 모이어티는 다이아조늄기를 포함하는 gRNA 및 페놀기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 페놀기를 포함하는 gRNA와 다이아조늄기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 다이아조늄기를 포함하는 gRNA와 페놀기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

트라이아졸리딘다이온일페놀

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 트라이아졸리딘다이온일페놀기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 페놀기와 환식 다이아조다이카복사마이드기 사이의 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 트라이아졸리딘다이온일페놀 함유 모이어티는 페놀기를 포함하는 gRNA와 환식 다이아조다이카복사마이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 트라이아졸리딘다이온일페놀 함유 모이어티는 환식 다이아조다이카복사마이드기를 포함하는 gRNA와 페놀기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 페놀기를 포함하는 gRNA와 환식 다이아조다이카복사마이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 환식 다이아조다이카복사마이드기를 포함하는 gRNA와 페놀기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

트라이아졸(클릭 화학)

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 트라이아졸기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 알킨기와 아자이드기 사이의 1,3-쌍극성 고리화 첨가를 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 트라이아졸 함유 모이어티는 알킨기를 포함하는 gRNA와 아자이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 트라이아졸 함유 모이어티는 아자이드기를 포함하는 gRNA와 알킨기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 1,3-쌍극성 고리화 첨가는 구리 촉매화된 고리화 첨가이다. 실시형태에서, 1,3-쌍극성 고리화 첨가는 변형 촉진된 고리화 첨가이다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 알킨기를 포함하는 gRNA와 아자이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아자이드기를 포함하는 gRNA와 알킨기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함하되, 고리 A 및 고리 B는 각각 선택적으로 치환된 아릴기이다. 실시형태에서, 고리 A가 존재한다. 실시형태에서, 고리 A가 존재하지 않는다. 실시형태에서, 고리 B가 존재한다. 실시형태에서, 고리 B가 존재하지 않는다. 실시형태에서, 고리 A와 고리 B가 둘 다 존재한다. 실시형태에서, 고리 A와 고리 B가 둘 다 존재하지 않는다. 실시형태에서, 모이어티는 알킨기를 포함하는 gRNA와 아자이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아자이드기를 포함하는 gRNA와 알킨기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

다이아자노르카라다이엔

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 다이아자노르카라다이엔기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 사이클로프로펜기와 테트라진기 사이의 Diels-Alder 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 다이아자노르카라다이엔 함유 모이어티는 사이클로프로펜기를 포함하는 gRNA와 테트라진기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 다이아자노르카라다이엔 함유 모이어티는 테트라진기를 포함하는 gRNA와 사이클로프로펜기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함하되, R은 C_1-6 알킬이다. 실시형태에서, 모이어티는 사이클로프로펜기를 포함하는 gRNA와 테트라진기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 테트라진기를 포함하는 gRNA와 사이클로프로펜기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

아마이드/설폰아마이드

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 아마이드기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 카복실기와 아미노기(예를 들어, 일차 아민) 사이의 접합 반응을 사용하여 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 아마이드 함유 모이어티는 카복실기를 포함하는 gRNA 및 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 아마이드 함유 모이어티는 아미노기(예를 들어, 일차 아민)를 포함하는 gRNA와 카복실기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 카복실기는 활성화된 카복실기이다. 실시형태에서, 카복실기는 1-에틸-3-(3-다이메틸-아미노프로필) 카보다이이미드(EDC) 또는 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC)와 같은 카보다이이미드에 의해 활성화된다. 실시형태에서, 카복실기는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 유도체(예를 들어, 설포-NHS)에 의해 활성화된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 카복실기를 포함하는 gRNA와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아미노기(예를 들어, 일차 아민)를 포함하는 gRNA와 카복실기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 설폰아마이드기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 설폰일기와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기 사이의 접합 반응을 사용하여 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 설폰아마이드 함유 모이어티는 설폰일기를 포함하는 gRNA와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 아마이드 함유 모이어티는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 gRNA와 설폰일기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 설폰일기를 포함하는 gRNA와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 gRNA와 설폰일기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

아민(글루타르알데하이드 화학)

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 아미노기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 아미노기(예를 들어, 일차 아민)와 알데하이드기 사이의 접합 반응에 이어 환원 반응을 사용하여 아민 함유 모이어티를 형성함으로써 NLS에 접합된다.

실시형태에서, 아민 함유 모이어티는 아미노기(예를 들어, 일차 아민)를 포함하는 gRNA와 알데하이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 아민 함유 모이어티는 알데하이드기를 포함하는 gRNA 및 아미노기(예를 들어, 일차 아민)를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 아민 함유 모이어티는 이작용성 가교 시약(예를 들어, 글루타르알데하이드와 같은 다이알데하이드)으로부터 형성된다. 실시형태에서, 아민 함유 모이어티는 아미노기(예를 들어, 일차 아민)를 포함하는 gRNA, 아미노기(예를 들어, 일차 아민)를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서) 및 다이알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드)로부터 형성된다. 실시형태에서, 아민 함유 모이어티는 알데하이드기를 포함하는 gRNA, 알데하이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서) 및 다이아미노알케인으로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함하되, L³은 C_1-6 알킬이다. 실시형태에서, 모이어티는 아미노기(예를 들어, 일차 아민)를 포함하는 gRNA, 아미노기(예를 들어, 일차 아민)를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서) 및 다이알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 알데하이드기를 포함하는 gRNA, 알데하이드기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서) 및 다이아미노알케인으로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 아미노기를 포함한다. 실시형태에서, gRNA는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기와 트레실(2,2,2-트라이플루오로에테인설폰일)기 사이의 접합 반응을 사용하여 NLS에 접합된다. 실시형태에서, 아민 모이어티는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 gRNA와 트레실(2,2,2-트라이플루오로에테인설폰일)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 아민 함유 모이어티는 트레실(2,2,2-트라이플루오로에테인설폰일)기를 포함하는 gRNA와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

실시형태에서, 화학적 모이어티(예를 들어, L)는 를 포함한다. 실시형태에서, 모이어티는 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 gRNA와 트레실(2,2,2-트라이플루오로에테인설폰일)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다. 실시형태에서, 모이어티는 트레실(2,2,2-트라이플루오로에테인설폰일)기를 포함하는 gRNA와 아미노(예를 들어, 일차 아민)기를 포함하는 NLS(또는 펩타이드 스페이서)로부터 형성된다.

일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 tracrRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 crRNA 및 NLS-gRNA를 포함한다.

일부 실시형태에서, 선형 가이드 RNA가 먼저 합성된다. 이 접근법에서, 2개 이상의 개별 RNA가 함께 결찰된다. 일부 실시형태에서, 제1 RNA는 트랜스 활성화 RNA(tracrRNA)를 포함하고, 제2 RNA는 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR) RNA(crRNA)를 포함한다.

일부 실시형태에서, tracrRNA 서열을 포함하는 RNA는 tracrRNA의 일부가 5'-말단에 포스페이트를 포함하도록 합성된다. 이 접근법을 사용하면 두 가지 형태의 결찰이 가능하며, 둘 다 스템 루프 영역 내에서 발견된다. 첫 번째 형태의 결찰은 T4 RNA 라이게이스 1의 천연 부위인 헤어핀의 말단 루프 내에서 발생한다. 두 번째 형태의 결찰은 천연 T4 RNA 라이게이스 2 및 DNA 라이게이스인 이중체 내에서 발생한다. 이러한 형태의 결찰의 장점 중 하나는 융합된 gRNA와 단편 불순물 사이의 용리 시간이 현저하게 다르기 때문에 단편 불순물을 쉽게 제거할 수 있다는 것이다.

화학적으로 변형된 NLS-gRNA

일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 제1 말단 및/또는 가이드 RNA의 제2 말단은 백본 또는 염기 중 하나 이상에 화학적 변형을 포함한다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA는 화학적 합성을 포함할 수 있으며, 천연 뉴클레오타이드와 유사하지 않은 변형된 당, 염기, 백본 또는 작용기를 포함하여 고도로 변형된 단량체를 도입하는 데 사용될 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 제1 말단 및/또는 가이드 RNA의 제2 말단은 변형된 염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 RNA는 다음 2'-O-메톡시-에틸 염기(2'-MOE), 예컨대, 2-메톡시에톡시 A, 2-메톡시에톡시 MeC, 2-메톡시에톡시 G, 2-메톡시에톡시 T 중 하나 이상을 포함한다. 다른 변형된 염기는, 예를 들어, 2'-O-메틸 RNA 염기 및 플루오로 염기를 포함한다. 다양한 플루오로 염기가 공지되어 있으며, 예를 들어, 플루오로 C, 플루오로 U, 플루오로 A, 플루오로 G 염기를 포함한다. 다양한 2'-O-메틸 변형이 또한 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음 2'O메틸 변형 중 하나 이상을 포함하는 다음 RNA가 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다: 2'-OMe-5-메틸-rC, 2'-OMe-rT, 2'-OMe-rI, 2'-OMe-2-아미노-rA, 아미노링커-C6-rC, 아미노링커-C6-rU, 2'-OMe-5-Br-rU, 2'-OMe-5-I-rU, 2-OMe-7-데아자-rG.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 제1 말단 및/또는 가이드 RNA의 제2 말단은 다음 변형 중 하나 이상을 포함한다: 포스포로티오에이트, 2'O-메틸, 2' 플루오로(2'F), DNA.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 제1 말단 및/또는 가이드 RNA의 제2 말단은 3' 및 5' 말단에 2'OMe 변형을 포함한다.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 제1 말단 및/또는 가이드 RNA의 제2 말단은 다음 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2' -O-2-메톡시에틸(MOE), 잠금 핵산, 브리지된 핵산, 비잠금 핵산, 펩타이드 핵산, 모폴리노 핵산.

일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 제1 말단 및/또는 가이드 RNA의 제2 말단은 다음 염기 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 슈도우라실, N1-메틸-슈도우라실, 5' 메틸 사이토신, 2'피리미디논(제불라린), 티민.

다른 변형된 염기는, 예를 들어, 2-아미노퓨린, 5-브로모 dU, 데옥시우리딘, 2,6-다이아미노퓨린(2-아미노-dA), 다이데옥시-C, 데옥시이노신, 하이드록시메틸 dC, 역 dT, 아이소-dG, 아이소-dC, 역 다이데옥시-T, 5-메틸 dC, 5-메틸 dC, 5-나이트로인돌, Super T®, 2'-F-r(C, U), 2'-NH2-r(C, U), 2,2'-무수-U, 3'-데스옥시-r(A, C, G, U), 3'-O-메틸-r(A, C, G, U), rT, rI, 5-메틸-rC, 2-아미노-rA, r스페이서(무염기), 7-데아자-rG, 7-데아자-rA, 8-옥소-rG, 5-할로겐화-rU, N-알킬화-rN을 포함한다.

다른 화학적으로 변형된 RNA가 본 명세서에 사용될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 제1 말단 및/또는 가이드 RNA의 제2 말단은, 예를 들어, 5', Int, 3' 아자이드(NHS 에스터); 5' 헥신일; 5', Int, 3' 5-옥타다이인일 dU; 5', Int 바이오틴(아자이드); 5', Int 6-FAM(아자이드); 및 5', Int 5-TAMRA(아자이드)와 같은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있는 RNA 뉴클레오타이드 변형의 다른 예는, 예를 들어, 5'-인산화 및 3'-인산화와 같은 인산화 변형을 포함한다. RNA는 또한 다음 변형 중 하나 이상을 가질 수 있다: 아미노 변형, 바이오티닐화, 티올 변형, 알킨 변성제, 아데닐화, 아자이드(NHS 에스터), 콜레스테롤-TEG 및 다이곡시게닌(NHS 에스터).

핵염기 편집기

폴리뉴클레오타이드의 표적 뉴클레오타이드 서열을 편집, 변형 또는 변경하는 핵염기 편집기가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 유용하다. 본 명세서에 기재된 핵염기 편집기는 전형적으로 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미네이스 또는 사이티딘 데아미네이스)을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인은 결합된 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA)와 결합할 때 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합할 수 있으며 이에 의해 염기 편집기를 편집하고자 하는 표적 핵산 서열에 국재화시킬 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵염기 편집기는 염기 편집 활성을 개선시키는 하나 이상의 특징을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 핵염기 편집기 중 임의의 것은 감소된 뉴클레이스 활성을 갖는 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵염기 편집기 중 임의의 것은 뉴클레이스 활성(dCas9)을 갖지 않는 Cas9 도메인 또는 이중체화된 DNA 분자의 한 가닥을 절단하는 Cas9 닉케이스(nCas9)로도 지칭되는 Cas9 도메인을 가질 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 촉매 잔기(예를 들어, H840)의 존재는 표적화된 핵염기 반대편의 비편집된(예를 들어, 탈아미노화되지 않은) 가닥을 절단하는 Cas9의 활성을 유지한다. 촉매 잔기의 돌연변이(예를 들어, D10에서 A10으로)는 표적화된 잔기(예를 들어, A 또는 C)를 포함하는 편집된(예를 들어, 탈아미노화된) 가닥의 절단을 방지한다. 이러한 Cas9 변이체는 gRNA 정의된 표적 서열을 기반으로 특정 위치에서 단일-가닥 DNA 파손(닉)을 생성하여 비편집된 가닥을 복구하고, 궁극적으로 비편집된 가닥에서 핵염기 변화를 초래할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인

폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, RNA, DNA)에 결합한다. 염기 편집기의 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인은 그 자체로 하나 이상의 도메인(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레이스 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인의 뉴클레이스 도메인은 엔도뉴클레이스 또는 엑소뉴클레이스를 포함할 수 있다. 엔도뉴클레이스는 이중 가닥 핵산의 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자의 두 가닥 모두를 절단할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 뉴클레오타이드 결합 도메인의 뉴클레이스 도메인은 표적 폴리뉴클레오타이드의 0개, 1개 또는 2개의 가닥을 절단할 수 있다.

내부 삽입이 있는 융합 단백질

핵산 프로그래밍 가능 핵산 결합 단백질, 예를 들어, 핵산 프로그래밍 가능 DNA 결합 단백질(napDNAbp)에 융합된 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 본 명세서에 제공된다. 이종성 폴리펩타이드는 천연 또는 야생형 napDNAbp 폴리펩타이드 서열에서 발견되지 않는 폴리펩타이드일 수 있다. 이종성 폴리펩타이드는 napDNAbp의 C-말단 말단, napDNAbp의 N-말단 말단에서 napDNAbp에 융합될 수 있거나 napDNAbp의 내부 위치에 삽입될 수 있다.

일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 napDNAbp의 내부 위치에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 데아미네이스(예를 들어, 아데노신 데아미네이스) 또는 이의 기능적 단편이다. 예를 들어, 융합 단백질은 Cas9 폴리펩타이드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 측접하는 데아미네이스(예를 들어, 아데노신 데아미네이스)를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 데아미네이스는 아데노신 데아미네이스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA(예를 들어, TadA*7.10 또는 이의 변이체)이다.

일부 실시형태에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다;

NH2-[napDNAbp의 N-말단 단편]-[데아미네이스]-[napDNAbp의 C-말단 단편]-COOH;

NH2-[Cas9의 N-말단 단편]-[아데노신 데아미네이스]-[Cas9의 C-말단 단편]-COOH;

여기서, "]-["의 각각의 경우는 선택적 링커이다.

데아미네이스는 원형 치환체(circular permutant) 데아미네이스일 수 있다. 예를 들어, 데아미네이스는 원형 치환체 아데노신 데아미네이스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 데아미네이스는 TadA 참조 서열에서 넘버링된 116번 아미노산 잔기에서 원형으로 치환된 원형 치환체 TadA이다. 일부 실시형태에서, 데아미네이스는 TadA 참조 서열에서 넘버링된 136번 아미노산 잔기에서 원형으로 치환된 원형 치환체 TadA이다. 일부 실시형태에서, 데아미네이스는 TadA 참조 서열에서 넘버링된 65번 아미노산 잔기에서 원형으로 치환된 원형 치환체 TadA이다.

융합 단백질은 하나 초과의 데아미네이스를 포함할 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 데아미네이스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 1개의 데아미네이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 2개의 데아미네이스를 포함한다. 융합 단백질 중 2개 이상의 데아미네이스는 아데노신 데아미네이스, 사이티딘 데아미네이스 또는 이들의 조합일 수 있다. 2개 이상의 데아미네이스는 동종이량체일 수 있다. 2개 이상의 데아미네이스는 이종이량체일 수 있다. 2개 이상의 데아미네이스는 napDNAbp에 나란히 삽입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 데아미네이스 napDNAbp에 나란히 있지 않을 수 있다.

일부 실시형태에서, 융합 단백질의 napDNAbp는 Cas9 폴리펩타이드 또는 이의 단편이다. Cas9 폴리펩타이드는 변이체 Cas9 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas9 폴리펩타이드는 Cas9 닉케이스(nCas9) 폴리펩타이드 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, Cas9 폴리펩타이드는 뉴클레이스 활성이 없는 Cas9(dCas9) 폴리펩타이드 또는 이의 단편이다. 융합 단백질의 Cas9 폴리펩타이드는 전장 Cas9 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 경우에, 융합 단백질의 Cas9 폴리펩타이드는 전장 Cas9 폴리펩타이드가 아닐 수 있다. Cas9 폴리펩타이드는, 예를 들어, 자연 발생적 Cas9 단백질에 대해 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있다. Cas9 폴리펩타이드는 원형으로 치환된 Cas9 단백질일 수 있다. Cas9 폴리펩타이드는 여전히 표적 폴리뉴클레오타이드 및 가이드 핵산 서열에 결합할 수 있는 Cas9 폴리펩타이드의 단편, 부분 또는 도메인일 수 있다.

일부 실시형태에서, Cas9 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9), 스타필로코커스 아우레우스 Cas9(SaCas9), 스트렙토코커스 써모필루스 1 Cas9(St1Cas9) 또는 이들의 단편 또는 변이체이다.

Cas9 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 단편에 측접하는 이종성 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질도 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에서 염기 편집에 유용하다. Cas9 및 하나 이상의 데아미네이스 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미네이스를 포함하거나 Cas9 서열에 측접하는 아데노신 데아미네이스 도메인을 포함하는 융합 단백질도 표적 서열의 매우 특이적이고 효율적인 염기 편집에 유용하다. 실시형태에서, 키메라 Cas9 융합 단백질은 Cas9 폴리펩타이드 내에 삽입된 이종성 촉매 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미네이스, 사이티딘 데아미네이스 또는 아데노신 데아미네이스 및 사이티딘 데아미네이스)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 Cas9 내에 삽입된 아데노신 데아미네이스 도메인 및 사이티딘 데아미네이스 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 Cas9 내에 융합되고, 사이티딘 데아미네이스는 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 Cas9 내에 융합되고, 사이티딘 데아미네이스 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 사이티딘 데아미네이스는 Cas9 내에 융합되고, 아데노신 데아미네이스는 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 사이티딘 데아미네이스는 Cas9 내에 융합되고, 아데노신 데아미네이스는 N-말단에 융합된다.

아데노신 데아미네이스 및 사이티딘 데아미네이스 및 Cas9를 갖는 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:

NH2-[Cas9(아데노신 데아미네이스)]-[사이티딘 데아미네이스]-COOH;

NH2-[사이티딘 데아미네이스]-[Cas9(아데노신 데아미네이스)]-COOH;

NH2-[Cas9(사이티딘 데아미네이스)]-[아데노신 데아미네이스]-COOH; 또는

NH2-[아데노신 데아미네이스]-[Cas9(사이티딘 데아미네이스)]-COOH.

일부 실시형태에서, 위의 일반 구조에 사용된 "-"는 선택적 링커의 존재를 나타낸다.

다양한 실시형태에서, 촉매 도메인은 아데노신 데아미네이스 활성과 같은 DNA 변형 활성(예를 들어, 데아미네이스 활성)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA(예를 들어, TadA*7.10)이다. 일부 실시형태에서, TadA는 TadA 변이체이다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 Cas9 내에 융합되고, 사이티딘 데아미네이스는 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 Cas9 내에 융합되고, 사이티딘 데아미네이스는 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 사이티딘 데아미네이스는 Cas9 내에 융합되고, TadA 변이체는 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 사이티딘 데아미네이스는 Cas9 내에 융합되고, TadA 변이체는 N-말단에 융합된다. TadA 변이체 및 사이티딘 데아미네이스 및 Cas9를 갖는 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:

NH2-[Cas9(TadA 변이체)]-[사이티딘 데아미네이스]-COOH;

NH2-[사이티딘 데아미네이스]-[Cas9(TadA 변이체)]-COOH;

NH2-[Cas9(사이티딘 데아미네이스)]-[TadA 변이체]-COOH; 또는

NH2-[TadA 변이체]-[Cas9(사이티딘 데아미네이스)]-COOH.

다른 실시형태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호(예를 들어, 이분형 핵 국재화 신호)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 핵 국재화 신호의 아미노산 서열은 MAPKKKRKVGIHGVPAA(서열번호 4)이다. 위의 양태의 다른 실시형태에서, 핵 국재화 신호는 다음 서열에 의해 암호화된다: ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCC(서열번호 5). 다른 실시형태에서, Cas12b 폴리펩타이드는 RuvC 도메인의 촉매 활성을 침묵시키는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, Cas12b 폴리펩타이드는 D574A, D829A 및/또는 D952A 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 태그(예를 들어, 인플루엔자에 헤마글루티닌 태그)를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 융합 단백질은 내부 융합된 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 데아미네이스 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미네이스 도메인의 전부 또는 일부)과 함께 napDNAbp 도메인(예를 들어, Cas12 유래 도메인)을 포함한다. 일부 실시형태에서, napDNAbp는 Cas12b이다.

비제한적인 예로서, 아데노신 데아미네이스(예를 들어, TadA*8.13)는 핵산 서열을 효과적으로 편집하는 융합 단백질(예를 들어, TadA*8.13-BhCas12b)을 생산하기 위해 BhCas12b에 삽입될 수 있다.

gRNA를 사용한 유전자 편집

본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 목적하는 표적 유전자의 발현에서 유전자 침묵 이벤트 또는 발현의 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)을 초래할 수 있는 표적화된 유전자 편집에 적합한 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피게놈 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 위한 방법에 사용될 수 있으며, 해당 방법은 진핵생물 세포에 (a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 NLS-gRNA; (b) 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질 또는 적어도 하나의 CRISPR/Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하되; (a) 및 (b)와 염색체 DNA의 표적 서열 사이의 상호작용은 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 에피게놈 변형 또는 표적화된 게놈 변형을 유도한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA(여기서, RNA 가이드는 직접 반복 서열 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 스페이서 서열을 포함함); 유전자 편집 단백질(여기서, 유전자 편집 효소는 RNA 가이드에 결합할 수 있으며 RNA 가이드와 상보적인 표적 핵산 서열에 파손을 일으킬 수 있음)을 포함하는 유전자 편집 시스템에서 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA(여기서, RNA 가이드는 직접 반복 서열 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 스페이서 서열을 포함함); 및 유전자 편집 단백질(여기서, 유전자 편집 단백질은 데아미네이스에 융합되고, 유전자 편집 단백질 융합은 가이드에 결합할 수 있으며 RNA 가이드와 상보적인 표적 핵산 서열을 편집할 수 있음)을 포함하는 유전자 편집 시스템에 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 세포를 유전자 편집 단백질 및 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 진핵생물 세포에서 표적 핵산의 발현을 변경시키는 방법을 제공하되, NLS-gRNA는 직접 반복 서열 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 스페이서 서열을 포함하고, 유전자 편집 단백질은 NLS-gRNA에 결합할 수 있으며 NLS-gRNA와 상보적인 표적 핵산 서열에 파손을 일으킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 세포를 유전자 편집 단백질 및 본 명세서에 기재된 합성 NLS-gRNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 진핵생물 세포에서 표적 핵산의 발현을 변경시키는 방법을 제공하되, NLS-gRNA는 직접 반복 서열 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 스페이서 서열을 포함하고, 유전자 편집 단백질은 NLS-gRNA에 결합할 수 있으며 NLS-gRNA와 상보적인 표적 핵산 서열을 편집할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 세포를 유전자 편집 단백질 및 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 진핵생물 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공하되, NLS-gRNA는 직접 반복 서열 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 스페이서 서열을 포함하고, 유전자 편집 단백질은 NLS-gRNA에 결합할 수 있으며 NLS-gRNA와 상보적인 표적 핵산 서열을 편집할 수 있다.

일부 실시형태에서, 유전자 편집 방법 또는 시스템은 부위 특이적 방식으로 표적 DNA를 변형시키는 효과기와의 융합 단백질을 포함하되, 변형 활성은 메틸트랜스퍼레이스 활성, 데메틸레이스 활성, 아세틸트랜스퍼레이스 활성, 데아세틸레이스 활성, 카이네이스 활성, 포스파테이스 활성, 유비퀴틴 라이게이스 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모화 활성, 탈수모화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 인테그레이스 활성, 유전자전위효소 활성, 재조합효소 활성, 폴리머레이스 활성, 라이게이스 활성, 헬리케이스 활성 또는 뉴클레이스 활성을 포함하며, 이들 중 어느 것도 DNA 또는 DNA 연관 폴리펩타이드(예를 들어, 히스톤 또는 DNA 결합 단백질)를 변형시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 유전자 편집 방법 또는 시스템은 아데노신 또는 사이토신 염기를 변형시키며 부위 특이적 염기 편집기로 기능할 수 있는 데아미네이스 효소를 포함하는 뉴클레오타이드 염기를 화학적으로 변형시킴으로써 DNA 서열을 편집할 수 있는 효소와의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로 RNA를 기질로서 사용하는, 예를 들어, APOBEC1 사이티딘 데아미네이스는 Cas9에 융합될 때 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA에 표적화되어 사이티딘을 우리딘으로 직접 전환할 수 있고, ADAR 효소는 아데노신을 이노신으로 탈아미노화시킨다. 따라서, 데아미네이스를 사용하는 '염기 편집'은 하나의 표적 DNA 염기의 또 다른 염기로의 프로그래밍 가능한 전환을 가능하게 한다. 다양한 염기 편집기가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기재된 방법 및 시스템에 사용될 수 있다. 예시적인 염기 편집기는, 예를 들어, 내용이 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Rees and Liu Nature Review Genetics, 2018, 19(12): 770-788]에 기술되어 있다.

일부 실시형태에서, 염기 편집은 유전자를 침묵시키기 위한 정지 코돈의 도입을 초래한다. 일부 실시형태에서, 염기 편집은 아미노산 서열을 변경시킴으로써 단백질 기능을 변경시킨다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 표적 DNA의 전사를 조절하기 위해 유전자 편집 방법 또는 시스템에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, NLS-gRNA는 tRNA, rRNA, snoRNA, siRNA, miRNA 및 긴 ncRNA를 포함한 표적 논코딩 RNA의 발현을 조절하기 위해 유전자 편집 방법 또는 시스템에 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 적합한 유전자 편집 시스템을 사용하여 염색질 루프 구조의 표적화 엔지니어링에 사용된다. 조절 게놈 영역 사이의 염색질 루프의 표적화 엔지니어링은 내인성 염색질 구조를 조작하고, 새로운 인핸서-프로모터 연결의 형성을 가능하게 하여 유전적 결함을 극복하거나 비정상적인 인핸서-프로모터 연결을 저해하는 수단을 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 유익한 임상 변이체 또는 억제 돌연변이의 삽입에 의한 병원성 돌연변이의 교정을 위한 유전자 편집 시스템과 함께 사용된다.

A에서 G로의 편집

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 염기 편집기는 아데노신 데아미네이스 도메인을 포함한다. 염기 편집기의 이러한 아데노신 데아미네이스 도메인은 A를 탈아미노화시켜 G의 염기 페어링 특성을 나타내는 이노신(I)을 형성함으로써 아데닌(A) 핵염기에서 구아닌(G) 핵염기로의 편집을 용이하게 할 수 있다. 아데노신 데아미네이스는 데옥시리보핵산(DNA)의 데옥시아데노신 잔기의 아데닌을 탈아미노화(즉, 아민기 제거)시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, A에서 G로의 염기 편집기는 이노신 염기 절단 복구의 저해제, 예를 들어, 우라실 글리코실레이스 저해제(uracil glycosylase inhibitor: UGI) 도메인 또는 촉매적으로 불활성인 이노신 특이적 뉴클레이스를 추가로 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, UGI 도메인 또는 촉매적으로 불활성인 이노신 특이적 뉴클레이스는 탈아미노화된 아데노신 잔기(예를 들어, 이노신)의 염기 절단 복구를 저해하거나 방지할 수 있으며, 이는 염기 편집기의 활성 또는 효율을 개선시킬 수 있다.

아데노신 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한 임의의 폴리뉴클레오타이드에 작용할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기는 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 표적 A를 탈아미노화시킬 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기는 RNA 폴리뉴클레오타이드 및/또는 DNA-RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 표적 A를 탈아미노화시킬 수 있는 아데노신 데아미네이스 도메인을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 염기 편집기에 혼입된 아데노신 데아미네이스는 RNA(ADAR, 예를 들어, ADAR1 또는 ADAR2) 또는 tRNA(ADAT)에 작용하는 아데노신 데아미네이스의 전부 또는 일부를 포함한다. 아데노신 데아미네이스 도메인을 포함하는 염기 편집기는 또한 DNA 폴리뉴클레오타이드의 A 핵염기를 탈아미노화시킬 수 있다. 실시형태에서, 염기 편집기의 아데노신 데아미네이스 도메인은 ADAT가 DNA의 표적 A를 탈아미노화시키도록 허용하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 ADAT의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, 염기 편집기는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 에스케리키아 콜라이(EcTadA)으로부터의 ADAT의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다: D108N, A106V, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 염기 편집기는 아데노신 데아미네이스 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 TadA*7.10 아미노산 서열에 변경의 조합을 포함하며, 조합은 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, TadA*7.10 아미노산 서열에서의 변경의 조합은 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; 또는 L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경이다. 염기 편집기의 이러한 아데노신 데아미네이스 도메인은 A를 탈아미노화시켜 G의 페어링 특성을 나타내는 이노신(I)을 형성함으로써 아데닌(A) 핵염기에서 구아닌(G) 핵염기로의 편집을 용이하게 할 수 있다. 아데노신 데아미네이스는 데옥시리보핵산(DNA)의 데옥시아데노신 잔기의 아데닌을 탈아미노화(즉, 아민기 제거)시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵염기 편집기는 하나 이상의 단백질 도메인과 함께 융합하여 융합 단백질을 생성함으로써 만들어질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질은 융합 단백질의 염기 편집 활성(예를 들어, 효율, 선택성 및 특이성)을 개선시키는 하나 이상의 특징을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 융합 단백질은 감소된 뉴클레이스 활성을 갖는 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질은 뉴클레이스 활성(dCas9)을 갖지 않는 Cas9 도메인 또는 이중체화된 DNA 분자의 한 가닥을 절단하는 Cas9 닉케이스(nCas9)로 지칭되는 Cas9 도메인을 가질 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 촉매 잔기(예를 들어, H840)의 존재는 표적화된 A 반대편의 T를 포함하는 비편집된(예를 들어, 탈아미노화되지 않은) 가닥을 절단하는 Cas9의 활성을 유지한다. Cas9의 촉매 잔기의 돌연변이(예를 들어, D10에서 A10으로)는 표적화된 A 잔기를 포함하는 편집된 가닥의 절단을 방지한다. 이러한 Cas9 변이체는 gRNA 정의된 표적 서열을 기반으로 특정 위치에서 단일-가닥 DNA 파손(닉)을 생성하여 비편집된 가닥을 복구하고, 궁극적으로 비편집된 가닥에서 T에서 C로의 변화를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, A에서 G로의 염기 편집기는 이노신 염기 절단 복구의 저해제, 예를 들어, 우라실 글리코실레이스 저해제(UGI) 도메인 또는 촉매적으로 불활성인 이노신 특이적 뉴클레이스를 추가로 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, UGI 도메인 또는 촉매적으로 불활성인 이노신 특이적 뉴클레이스는 탈아미노화된 아데노신 잔기(예를 들어, 이노신)의 염기 절단 복구를 저해하거나 방지할 수 있으며, 이는 염기 편집기의 활성 또는 효율을 개선시킬 수 있다.

아데노신 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한 임의의 폴리뉴클레오타이드에 작용할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기는 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 표적 A를 탈아미노화시킬 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기는 RNA 폴리뉴클레오타이드 및/또는 DNA-RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 표적 A를 탈아미노화시킬 수 있는 아데노신 데아미네이스 도메인을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 염기 편집기에 혼입된 아데노신 데아미네이스는 RNA(ADAR, 예를 들어, ADAR1 또는 ADAR2)에 작용하는 아데노신 데아미네이스의 전부 또는 일부를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 염기 편집기에 혼입된 아데노신 데아미네이스는 tRNA(ADAT)에 작용하는 아데노신 데아미네이스의 전부 또는 일부를 포함한다. 아데노신 데아미네이스를 포함하는 염기 편집기 도메인은 또한 DNA 폴리뉴클레오타이드의 A 핵염기를 탈아미노화시킬 수 있다. 실시형태에서, 염기 편집기의 아데노신 데아미네이스 도메인은 ADAT가 DNA의 표적 A를 탈아미노화시키도록 허용하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 ADAT의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, 염기 편집기는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 에스케리키아 콜라이(EcTadA)으로부터의 ADAT의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다: D108N, A106V, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이.

아데노신 데아미네이스는 임의의 적합한 유기체(예를 들어, 대장균)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 원핵생물로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 세균으로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 에스케리키아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 쉬와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 대장균으로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데닌 데아미네이스는 본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, ecTadA의 돌연변이)에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 자연 발생적 아데노신 데아미네이스이다. 임의의 상동성 단백질의 상응하는 잔기는, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 임의의 돌연변이(예를 들어, ecTadA에서 확인된 임의의 돌연변이)에 상응하는 임의의 자연 발생적 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA와 상동성을 가짐)의 돌연변이가 생성될 수 있다.

아데노신 데아미네이스

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 하나 이상의 아데노신 데아미네이스 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 아데노신 데아미네이스는 아데닌을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 아데노신 데아미네이스는 DNA의 데옥시아데노신 잔기에서 아데닌을 탈아미노화시킬 수 있다. 아데노신 데아미네이스는 임의의 적합한 유기체(예를 들어, 대장균)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데닌 데아미네이스는 본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, ecTadA의 돌연변이)에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 자연 발생적 아데노신 데아미네이스이다. 당업자라면, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질에서 상응하는 잔기를 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 당업자는 본 명세서에 기재된 임의의 돌연변이, 예를 들어, ecTadA에서 확인된 임의의 돌연변이에 상응하는 임의의 자연 발생적 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA와 상동성을 가짐)에서 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 원핵생물로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 세균으로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 에스케리키아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 타이피, 쉬와넬라 푸트레파시엔스, 헤모필루스 인플루엔자에, 카울로박터 크레센투스 또는 바실러스 서브틸리스로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 대장균으로부터 유래한다.

증가된 효율(50% 내지 60% 초과)과 특이성을 갖는 아데노신 데아미네이스 변이체가 본 명세서에 제공되고 기재된다. 특히, 본 명세서에 기재된 아데노신 데아미네이스 변이체는 폴리뉴클레오타이드 내의 목적하는 염기를 편집할 가능성이 더 높으며, 변경할 의도가 없는 염기를 편집할 가능성은 적다(즉, "방관자").

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 데아미네이스이다. 특정 실시형태에서, TadA는 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 PCT/US2017/045381(WO 2018/027078)에 기술되어 있는 TadA 중 어느 하나이다.

야생형 TadA(wt) 아데노신 데아미네이스는 다음 서열(TadA 참조 서열이라고도 함)을 갖는다:

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 전장 대장균 TadA 데아미네이스이다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 원핵생물로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 세균으로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 에스케리키아 콜라이(대장균), 스타필로코커스 아우레우스(S. 아우레우스), 살모넬라 타이피무리움(S. 타이피무리움), 쉬와넬라 푸트레파시엔스(S. 푸트레파시엔스), 헤모필루스 인플루엔자에(H. 인플루엔자에), 카울로박터 크레센투스(C. 크레센투스), 지오박터 설퍼리두센스(G. 설퍼리두센스) 또는 바실러스 서브틸리스로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 대장균으로부터 유래한다.

그러나, 본 출원에 유용한 추가적인 아데노신 데아미네이스는 당업자에게 명백할 것이며 본 개시내용의 범위 내에 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 아데노신 데아미네이스는 tRNA(ADAT)에 작용하는 아데노신 데아미네이스의 상동체일 수 있다. 제한 없이, 예시적인 AD AT 상동체의 아미노산 서열은 다음을 포함한다:

스타필로코커스 아우레우스(S. 아우레우스) TadA:

바실러스 서브틸리스(B. 서브틸리스) TadA:

살모넬라 타이피무리움(S. 타이피무리움) TadA:

쉬와넬라 푸트레파시엔스(S. 푸트레파시엔스) TadA:

헤모필루스 인플루엔자에 F3031(H. 인플루엔자에) TadA:

카울로박터 크레센투스(C. 크레센투스) TadA:

지오박터 설퍼리두센스(G. 설퍼리두센스) TadA:

대장균 TadA(ecTadA)의 실시형태는 다음을 포함한다:

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 본 명세서에 제공된 임의의 아데노신 데아미네이스에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에 제공된 아데노신 데아미네이스는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 개시내용은 소정의 퍼센트 동일성을 갖는 임의의 데아미네이스 도메인과 본 명세서에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이들의 조합을 제공한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 참조 서열 또는 본 명세서에 제공된 임의의 아데노신 데아미네이스와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 21개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 160개 또는 적어도 170개의 동일한 연속 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, TadA 참조 서열을 기반으로 함)는 대장균 TadA(ecTadA), S. 아우레우스 TadA(saTadA)와 같은 다른 아데노신 데아미네이스 또는 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, 세균 아데노신 데아미네이스)에 도입될 수 있음을 이해하여야 한다. 추가적인 데아미네이스가 본 명세서에 제공된 바와 같이 돌연변이될 수 있는 상동성 아미노산 잔기를 확인하기 위해 유사하게 정렬될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, TadA 참조 서열에서 확인된 임의의 돌연변이는 상동성 아미노산 잔기를 갖는 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)에서 만들어질 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이는 TadA 참조 서열 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 만들어질 수 있다는 것도 이해하여야 한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 D108X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 D108G, D108N, D108V, D108A 또는 D108Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 그러나, 추가적인 데아미네이스는 본 명세서에 제공된 바와 같이 돌연변이될 수 있는 상동성 아미노산 잔기를 확인하기 위해 유사하게 정렬될 수 있음을 이해하여야 한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A106X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A106V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 E155X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 E155D, E155G 또는 E155V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 D147X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 D147Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A106X, E155X 또는 D147X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 E155D, E155G 또는 E155V 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 D147Y를 포함한다.

본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, TadA 참조 서열의 ecTadA 아미노산 서열에 기반함)는 S. 아우레우스 TadA(saTadA)와 같은 다른 아데노신 데아미네이스 또는 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, 세균 아데노신 데아미네이스)에 도입될 수 있음을 이해하여야 한다. ecTadA의 돌연변이된 잔기와의 상동성을 확인하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, ecTadA에서 확인된 임의의 돌연변이는 상동성 아미노산 잔기를 갖는 다른 아데노신 데아미네이스에서 만들어질 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이는 ecTadA 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 만들어질 수 있음도 이해되어야 한다.

예를 들어, 아데노신 데아미네이스는 돌연변이의 조합(예를 들어, V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; 또는 L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N)을 포함하며, 하나 이상의 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가적인 돌연변이는, 예를 들어, TadA 참조 서열에 D108N, A106V, E155V 및/또는 D147Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 다음과 같은 돌연변이 그룹(돌연변이 그룹은 ";"로 구분됨) 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다: D108N 및 A106V; D108N 및 E155V; D108N 및 D147Y; A106V 및 E155V; A106V 및 D147Y; E155V 및 D147Y; D108N, A106V 및 E155V; D108N, A106V 및 D147Y; D108N, E155V 및 D147Y; A106V, E155V 및 D147Y; 및 D108N, A106V, E155V 및 D147Y. 그러나, 본 명세서에 제공된 상응하는 돌연변이의 임의의 조합은 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)에서 만들어질 수 있음을 이해하여야 한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, T17X, L18X, W23X, L34X, W45X, R51X, A56X, E59X, E85X, M94X, I95X, V102X, F104X, A106X, R107X, D108X, K110X, M118X, N127X, A138X, F149X, M151X, R153X, Q154X, I156X 및/또는 K157X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, T17S, L18E, W23L, L34S, W45L, R51H, A56E 또는 A56S, E59G, E85K 또는 E85G, M94L, I95L, V102A, F104L, A106V, R107C 또는 R107H 또는 R107P, D108G 또는 D108N 또는 D108V 또는 D108A 또는 D108Y, K110I, M118K, N127S, A138V, F149Y, M151V, R153C, Q154L, I156D 및/또는 K157R 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, D108X 및/또는 N127X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, D108N 및/또는 N127S 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, R26X, M61X, L68X, M70X, A106X, D108X, A109X, N127X, D147X, R152X, Q154X, E155X, K161X, Q163X 및/또는 T166X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, R26W, M61I, L68Q, M70V, A106T, D108N, A109T, N127S, D147Y, R152C, Q154H 또는 Q154R, E155G 또는 E155V 또는 E155D, K161Q, Q163H 및/또는 T166P 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, D108X, N127X, D147X, R152X 및 Q154X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, M61X, M70X, D108X, N127X, Q154X, E155X 및 Q163X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, D108X, N127X, E155X 및 T166X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 H8X, A106X 및 D108X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 H8X, R26X, L68X, D108X, N127X, D147X 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, R126X, L68X, D108X, N127X, D147X 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, D108X, A109X, N127X 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, D108N, N127S, D147Y, R152C 및 Q154H로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, M61I, M70V, D108N, N127S, Q154R, E155G 및 Q163H로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, D108N, N127S, E155V 및 T166P로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, A106T, D108N, N127S, E155D 및 K161Q로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, R26W, L68Q, D108N, N127S, D147Y 및 E155V로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, D108N, A109T, N127S 및 E155G로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이 또는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 D108N, D108G 또는 D108V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A106V 및 D108N 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R107C 및 D108N 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, D108N, N127S, D147Y 및 Q154H 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, D108N, N127S, D147Y 및 E155V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 D108N, D147Y 및 E155V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, D108N 및 N127S 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A106V, D108N, D147Y 및 E155V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 S2X, H8X, I49X, L84X, H123X, N127X, I156X 및/또는 K160X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 S2A, H8Y, I49F, L84F, H123Y, N127S, I156F 및/또는 K160S 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 L84X 돌연변이 아데노신 데아미네이스를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 L84F 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H123X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H123Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 I156X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 I156F 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 L84X, A106X, D108X, H123X, D147X, E155X 및 I156X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 S2X, I49X, A106X, D108X, D147X 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8X, A106X, D108X, N127X 및 K160X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 L84F, A106V, D108N, H123Y, D147Y, E155V 및 I156F로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 S2A, I49F, A106V, D108N, D147Y 및 E155V로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H8Y, A106T, D108N, N127S 및 K160S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 E25X, R26X, R107X, A142X 및/또는 A143X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, E25Y, R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, R26K, R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H, R107S, A142N, A142D, A142G, A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열에 상응하는 본 명세서에 기재된 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 E25X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S 또는 E25Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R26X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L 또는 R26K 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R107X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H 또는 R107S 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A142X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A142N, A142D, A142G 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A143X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H36X, N37X, P48X, I49X, R51X, M70X, N72X, D77X, E134X, S146X, Q154X, K157X 및/또는 K161X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H36L, N37T, N37S, P48T, P48L, I49V, R51H, R51L, M70L, N72S, D77G, E134G, S146R, S146C, Q154H, K157N 및/또는 K161T 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H36X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 H36L 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 N37X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 N37T 또는 N37S 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 P48X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 P48T 또는 P48L 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R51X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R51H 또는 R51L 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 S146X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 S146R 또는 S146C 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 K157X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 K157N 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 P48X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 P48S, P48T 또는 P48A 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A142X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 A142N 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 W23X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 W23R 또는 W23L 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R152X 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함하되, X는 야생형 아데노신 데아미네이스의 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열의 R152P 또는 R52H 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 H36L, R51L, L84F, A106V, D108N, H123Y, S146C, D147Y, E155V, I156F 및 K157N 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA 참조 서열에 대해 다음과 같은 돌연변이 조합을 포함할 수 있되, 조합의 각 돌연변이는 "_"로 분리되고, 각 돌연변이의 조합은 괄호 안에 표시된다:

(A106V_D108N),

(R107C_D108N),

(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H),

(H8Y_D108N_N127S_D147Y_E155V),

(D108N_D147Y_E155V),

(H8Y_D108N_N127S),

(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H),

(A106V_D108N_D147Y_E155V),

(D108Q_D147Y_E155V),

(D108M_D147Y_E155V),

(D108L_D147Y_E155V),

(D108K_D147Y_E155V),

(D108I_D147Y_E155V),

(D108F_D147Y_E155V),

(A106V_D108N_D147Y),

(A106V_D108M_D147Y_E155V),

(E59A_A106V_D108N_D147Y_E155V),

(E59A cat dead_A106V_D108N_D147Y_E155V),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156Y),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(D103A_D104N),

(G22P_D103A_D104N),

(D103A_D104N_S138A)

(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),

(E25G_R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),

(E25D_R26G_L84F_A106V_R107K_D108N_H123Y_A142N_A143G_D147Y_E155V_I156F),

(R26Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(E25M_R26G_L84F_A106V_R107P_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),

(R26C_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_A143L_D147Y_E155V_I156F),

(R26G_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(E25A_R26G_L84F_A106V_R107N_D108N_H123Y_A142N_A143E_D147Y_E155V_I156F),

(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),

(A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),

(R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),

(E25D_R26G_A106V_R107K_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V),

(R26G_A106V_D108N_R107H_A142N_A143D_D147Y_E155V),

(E25D_R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),

(A106V_R107K_D108N_A142N_D147Y_E155V),

(A106V_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V),

(A106V_D108N_A142N_A143L_D147Y_E155V),

(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(N37T_P48T_M70L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_I49V_E155V_I156F),

(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_Q154H_E155V_I156F),

(N72S_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F),

(H36L_P48L_L84F_A106V_D108N_H123Y_E134G_D147Y_E155V_I156F),

(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_ D147Y_E155V_I156F_K157N)

(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(N37S_R51H_D77G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(D24G_Q71R_L84F_H96L_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K160E),

(H36L_G67V_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146T_D147Y_E155V_I156F),

(Q71L_L84F_A106V_D108N_H123Y_L137M_A143E_D147Y_E155V_I156F),

(E25G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),

(L84F_A91T_F104I_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(N72D_L84F_A106V_D108N_H123Y_G125A_D147Y_E155V_I156F),

(P48S_L84F_S97C_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(W23G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(D24G_P48L_Q71R_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(L84F_A106V_D108N_D147Y_E155V_I156F),

(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K161T),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E_K161T),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E),

(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(R74A_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_R98Q_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_R129Q_D147Y_E155V_I156F),

(P48S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(P48S_A142N),

(P48T_I49V_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_L157N),

(P48T_I49V_A142N),

(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_156F_K157N),

(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_ I156F_K157N),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152H_E155V_I156F_K157N),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155 V_I156F_K157N).

일부 실시형태에서, TadA 데아미네이스는 TadA 변이체이다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 TadA*7.10이다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 단일 TadA*7.10 도메인(예를 들어, 단량체로 제공됨)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 TadA*7.10 및 이종이량체를 형성할 수 있는 TadA(wt)를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 Cas9 닉케이스에 연결된 TadA*7.10에 연결된 야생형 TadA를 포함한다.

일부 실시형태에서, TadA*7.10은 적어도 하나의 변경을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 다음과 같은 서열에 변경을 포함한다:

TadA*7.10

일부 실시형태에서, TadA*7.10은 82번 및/또는 166번 아미노산에 변경을 포함한다. 특정 실시형태에서, TadA*7.10은 다음 변경 중 하나 이상을 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R 및/또는 Q154R. 다른 실시형태에서, TadA*7.10의 변이체는 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택되는 변경의 조합을 포함한다.

일부 실시형태에서, TadA*7.10의 변이체는 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K 및/또는 D167N의 군으로부터 선택되는 변경 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, TadA*7.10의 변이체는 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상을 포함한다. 다른 실시형태에서, TadA*7.10의 변이체는 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합을 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체(예를 들어, TadA 변이체)는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 C 말단의 결실을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 149번, 150번, 151번, 152번, 153번, 154번, 155번, 156번 및 157번 잔기에서 시작하는 C 말단의 결실 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체(예를 들어, TadA*8)는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R 및/또는 Q154R 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 단량체이다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체(TadA*8)는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 단량체이다.

다른 실시형태에서, 본 개시내용의 염기 편집기는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경: R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체(예를 들어, TadA*8) 단량체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체(TadA*8) 단량체는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체(예를 들어, MSP828)는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K 및/또는 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 단량체이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체(예를 들어, MSP828)는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 단량체이다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체(TadA 변이체)는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 단량체이다.

다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 각각 다음 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R 및/또는 Q154R 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 각각 2개의 아데노신 데아미네이스 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 각각 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 갖는 2개의 아데노신 데아미네이스 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이다.

다른 실시형태에서, 본 개시내용의 염기 편집기는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 각각 다음 변경 R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 갖는 2개의 아데노신 데아미네이스 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체(예를 들어, TadA*8) 동종이량체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 각각 R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 갖는 2개의 아데노신 데아미네이스 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 각각 다음 변경 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K 및/또는 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 갖는 2개의 아데노신 데아미네이스 도메인(예를 들어, TadA*7.10)을 포함하는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 각각 다음 변경 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 갖는 2개의 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, MSP828)을 포함하는 동종이량체이다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 각각 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 갖는 2개의 아데노신 데아미네이스 도메인(예를 들어, TadA*7.10)을 포함하는 동종이량체이다.

다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 야생형 아데노신 데아미네이스 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R 및/또는 Q154R 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 야생형 아데노신 데아미네이스 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이다.

다른 실시형태에서, 염기 편집기는 야생형 아데노신 데아미네이스 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이다. 다른 실시형태에서, 염기 편집기는 야생형 아데노신 데아미네이스 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체를 포함한다.

다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 야생형 아데노신 데아미네이스 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K 및/또는 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 야생형 아데노신 데아미네이스 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 갖는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, MSP828)을 포함하는 이종이량체이다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 야생형 아데노신 데아미네이스 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체이다.

다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA*7.10 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R 및/또는 Q154R 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA*7.10 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이다.

다른 실시형태에서, 염기 편집기는 TadA*7.10 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이다. 다른 실시형태에서, 염기 편집기는 TadA*7.10 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체를 포함한다.

다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA*7.10 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K 및/또는 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA*7.10 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 변경 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 갖는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, MSP828)을 포함하는 이종이량체이다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 TadA*7.10 도메인과 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택되는 변경의 조합 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체이다.

일부 실시형태에서, TadA*8은 표 8A, 표 10, 표 11 또는 표 13에 나타낸 바와 같은 변이체이다. 표 8A, 표 10, 표 11 및 표 13은 TadA 아미노산 서열의 소정의 아미노산 위치 번호 및 TadA-7.10 아데노신 데아미네이스의 해당 위치에 존재하는 아미노산을 보여준다. 표 8A, 표 10, 표 11 및 표 13은 또한 다음 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[M. Richter et al., 2020, Nature Biotechnology, doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z]에 기술된 바와 같은 파지 보조 비연속 진화(phage-assisted non-continuous evolution: PANCE) 및 파지 보조 연속 진화(phage-assisted continuous evolution: PACE) 후 TadA-7.10에 대해 TadA 변이체에서의 아미노산 변화를 보여준다. 일부 실시형태에서, TadA*8은 TadA*8a, TadA*8b, TadA*8c, TadA*8d 또는 TadA*8e이다. 일부 실시형태에서, TadA*8은 TadA*8e이다.

특정 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 이종이량체는 TadA*8 도메인과 스타필로코커스 아우레우스(S. 아우레우스) TadA, 바실러스 서브틸리스(B. 서브틸리스) TadA, 살모넬라 타이피무리움(S. 타이피무리움) TadA, 쉬와넬라 푸트레파시엔스(S. 푸트레파시엔스) TadA, 헤모필루스 인플루엔자에 F3031(H. 인플루엔자에) TadA, 카울로박터 크레센투스(C. 크레센투스) TadA, 지오박터 설퍼리두센스(G. 설퍼리두센스) TadA 또는 TadA*7.10으로부터 선택되는 아데노신 데아미네이스 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 TadA*8이다. 일 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 아데노신 데아미네이스 활성을 갖는 다음 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지는 TadA*8이다:

일부 실시형태에서, TadA*8은 절단된다. 일부 실시형태에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 6개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 N-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 실시형태에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 6개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 전장 TadA*8이다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 기재되고/되거나 예시된 바와 같은 융합 단백질은 Cas9 닉케이스에 연결된 본 명세서에 기재된 아데노신 데아미네이스 변이체(예를 들어, TadA*8)에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 단일 TadA*8 도메인(예를 들어, 단량체로서 제공됨)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 염기 편집기는 TadA*8 및 TadA(wt)를 포함하며, 이는 이종이량체를 형성할 수 있다.

일부 실시형태에서, TadA*8은 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23 또는 TadA*8.24이다.

일부 실시형태에서, TadA 변이체는 표 6에 나타낸 바와 같은 변이체이다. 표 6은 TadA 아미노산 서열의 소정의 아미노산 위치 번호 및 TadA*7.10 아데노신 데아미네이스의 해당 위치에 존재하는 아미노산을 보여준다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 MSP605, MSP680, MSP823, MSP824, MSP825, MSP827, MSP828 또는 MSP829이다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 MSP828이다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 MSP829이다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 Cas9 닉케이스에 연결된 본 명세서에 기재된 아데노신 데아미네이스 변이체에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 단일 변이체 TadA 도메인(예를 들어, 단량체로서 제공됨)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 변이체 TadA 및 TadA(wt)를 포함하며, 이는 이종이량체를 형성할 수 있다.

일부 실시형태에서, TadA 변이체는 절단된다. 일부 실시형태에서, 절단된 TadA는 전장 TadA 변이체에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 6개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 N-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 실시형태에서, 절단된 TadA 변이체는 전장 TadA 변이체에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 6개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스 변이체는 전장 TadA 변이체이다.

특정 실시형태에서, TadA*8은 굵은 글씨로 표시된 임의의 다음 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, TadA*8은 밑줄로 나타낸 임의의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다:

예를 들어, TadA*8은 82번 및/또는 166번 아미노산 위치에 단독으로(예를 들어, V82S, T166R) 또는 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 다음 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H 및/또는 Q154R 중 임의의 하나 이상과 조합하여 변경 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

특정 실시형태에서, 변경의 조합은 TadA 참조 서열인 TadA*7.10에 대해 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이의 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 다음 변경: R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R 및 A158K 중 하나 이상을 포함한다. 하나 이상의 변경은 위의 서열에 밑줄과 굵은 글씨로 나타나 있다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 다음 변경의 조합: V82S + Q154R + Y147R; V82S + Q154R + Y123H; V82S + Q154R + Y147R+ Y123H; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y+ V82S; V82S + I76Y; V82S + Y147R; V82S + Y147R + Y123H; V82S + Q154R + Y123H; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y; V82S + Y147R; V82S + Y147R + Y123H; V82S + Q154R + Y123H; V82S + Q154R + Y147R; V82S + Q154R + Y147R; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y + V82S; I76Y_V82S_Y123H_Y147R_Q154R; Y147R + Q154R + H123H; 및 V82S + Q154R 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 다음 변경의 조합: E25F + V82S + Y123H, T133K + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R; Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R; L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R; P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K; N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; 및 M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 다음 변경의 조합: Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 V82S + Q154R; N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 및 M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 단량체로서 발현된다. 다른 실시형태에서, 아데노신 데아미네이스는 이종이량체로서 발현된다. 일부 실시형태에서, 데아미네이스 또는 다른 폴리펩타이드 서열은, 예를 들어, 융합 단백질의 구성요소로서 포함될 때 메티오닌이 결여되어 있다. 이로 인해 위치의 넘버링이 변경될 수 있다. 그러나, 당업자라면 이러한 상응하는 돌연변이가 동일한 돌연변이, 예를 들어, Y73S 및 Y72S 및 D139M 및 D138M을 지칭한다는 것을 이해할 것이다.

일부 실시형태에서, TadA*9 변이체는 단량체이다. 일부 실시형태에서, TadA*9 변이체는 야생형 TadA 아데노신 데아미네이스를 갖는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, TadA*9 변이체는 또 다른 TadA 변이체(예를 들어, TadA*8, TadA*9)를 갖는 이종이량체이다. TadA*9 아데노신 데아미네이스의 추가적인 자세한 내용은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 국제 PCT 출원 제PCT/2020/049975호에 기술되어 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 Cas9 닉케이스에 연결된 본 명세서에 기재된 아데노신 데아미네이스 변이체(예를 들어, TadA 변이체)에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 단일 TadA 변이체 도메인(예를 들어, 단량체로서 제공됨)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 염기 편집기는 TadA*8 및 TadA(wt)를 포함하며, 이는 이종이량체를 형성할 수 있다.

특정 실시형태에서, 융합 단백질은 단일(예를 들어, 단량체로서 제공됨) TadA 변이체 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 Cas9 닉케이스에 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 융합 단백질은 TadA 변이체에 연결된 야생형 TadA(TadA(wt))의 이종이량체로서 포함된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 융합 단백질은 TadA 변이체에 연결된 TadA*7.10의 이종이량체로서 포함된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 TadA 변이체 단량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 TadA 변이체와 TadA(wt)의 이종이량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 TadA 변이체와 TadA*7.10의 이종이량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 2개의 TadA 변이체의 이종이량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, TadA 변이체는 아래 표 5, 표 6 또는 본 명세서에 제공된 임의의 다른 TadA 변이체로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 데아미네이스 또는 다른 폴리펩타이드 서열은, 예를 들어, 융합 단백질의 구성요소로서 포함될 때 메티오닌이 결여되어 있다. 이로 인해 위치의 넘버링이 변경될 수 있다. 그러나, 당업자라면 이러한 상응하는 돌연변이가 동일한 돌연변이를 지칭함을 이해할 것이다.

본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이 및 임의의 추가적인 돌연변이(예를 들어, ecTadA 아미노산 서열에 기반함)는 임의의 다른 아데노신 데아미네이스에 도입될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 돌연변이는 TadA 참조 서열 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스(예를 들어, ecTadA)에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 만들어질 수 있다.

A에서 G로의 핵염기 편집 단백질에 대한 자세한 내용은 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 국제 PCT 출원 제PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 문헌[Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage" Nature, 551, 464-471 (2017)]에 기술되어 있다.

G6PC 유전자에서 뉴클레오타이드를 표적화하기 위한 핵염기 편집기의 사용

G6PC 유전자에서 뉴클레오타이드를 표적화하기 위한 핵염기 편집기의 적합성은 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가된다.

핵염기 편집기의 활성은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 즉, 표적 유전자를 시퀀싱하여 표적 서열에서 변경을 검출함으로써 평가된다. Sanger 시퀀싱의 경우, 정제된 PCR 앰플리콘은 플라스미드 백본에 클로닝되고, 형질전환되고, 미니프랩되고, 단일 프라이머로 시퀀싱된다. 시퀀싱은 또한 차세대 시퀀싱 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 차세대 시퀀싱을 사용하는 경우, 앰플리콘은 의도된 절단 부위가 비대칭으로 배치된 300bp 내지 500bp일 수 있다. PCR 후, 차세대 시퀀싱 어댑터 및 바코드(예를 들어, Illumina 다중화 어댑터 및 지수)가, 예를 들어, 고속 대량 시퀀싱(예를 들어, Illumina MiSeq에서)에 사용하기 위해 앰플리콘의 말단에 추가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 핵염기 편집기는 관심 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 데 사용된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵염기 편집기는 핵산 서열, 예를 들어, GSD1a 연관 돌연변이를 보유하는 G6PC 폴리뉴클레오타이드를 표적화하여 표적 유전자, 즉, G6PC를 변경하는 데 사용되는 가이드 RNA와 함께 세포(예를 들어, 간세포)에 전달된다.

일부 실시형태에서, 염기 편집기는 관심 유전자(예를 들어, G6PC)의 서열에 하나 이상의 편집을 도입하기 위해 가이드 RNA에 의해 표적화된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변경이 글루코스-6-포스파테이스(G6PC) 유전자에 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변경은 R83C이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변경은 Q347X이다. 일부 실시형태에서, 변경은 NCBI 참조 서열 번호 AAA16222.1에서 찾을 수 있는 대표적인 호모 사피엔스 G6PC 단백질에 도입된다. 일부 실시형태에서, 변경은 GenBank 참조 서열 번호 U01120.1에서 찾을 수 있는 대표적인 호모 사피엔스 G6PC 핵산 서열에 도입된다.

치료적 적용

본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 다양한 치료적 적용을 위한 유전자 편집 시스템에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 장애 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 장애 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 해당 방법은 유전자 편집 시스템과 함께 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 유전자 편집 시스템이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, CRISPR-Cas9, Cpf1, SaCas9, Cas12를 포함한다. 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 임의의 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 스트렙토코커스(Streptococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 스타필로코커스(Staphylococcus), 파르비바쿨룸(Parvibaculum), 로세부리아(Roseburia), 네이세리아(Neisseria), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 아조스피릴룸(Azospirillum), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 락토바실러스(Lactobacillus), 에우박테리움(Eubacterium), 코리네박터(Corynebacter), 카르노박테리움(Carnobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 리스테리아(Listeria), 팔루디박터(Paludibacter), 클로스트리디움(Clostridium), 라크노스피라(Lachnospira), 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae), 클로스트리디아리디움(Clostridiaridium), 렙토트리키아(Leptotrichia), 프란시셀라(Francisella), 레지오넬라(Legionella), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 메타노메티오필루스(Alicyclobacillus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 헬코코커스(Helcococcus), 렙토스피라(Leptospira), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 데설포나트로눔(Desulfonatronum), 오피투타세아에(Opitutaceae), 투베리바실러스(Tuberibacillus), 바실러스(Bacillus), 브레비바실러스(Brevibacilus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 부티비브리오(Butyvibrio), 페리그리니박테리움(Butyvibrio), 파레우박테리움(Pareubacterium), 모라셀라(Moraxella), 티오마이크로스피라(Thiomicrospira) 또는 아시다미노코커스(Acidaminococcus)를 포함하는 속의 유기체로부터 유래한다. 특정 실시형태에서, Cpfl 효과기 단백질은 에우박테리움, 라크노스피라세아에, 렙토트리키아, 프란시셀라, 메타노메티오필루스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 렙토스피라, 부티비브리오, 페리그리니박테리움, 파레우박테리움, 모라셀라, 티오마이크로스피라 또는 아시다미노코커스로부터 선택되는 속의 유기체로부터 선택된다.

Cas 종의 비제한적인 예는 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필레스(Streptococcus thermophiles), 스트렙토코커스 아우레아스(Streptococcus aureas), 네이세리아 메닌지티데스(Neisseria meningitides), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 스피로플라스마 시르피디콜라(Spiroplasma syrphidicola), 프레보텔라 인테르메디아(Prevotella inter배지), 스피로플라스마 타이와넨세(Spiroplasma taiwanense), 스트렙토코커스 이니아에(Streptococcus iniae), 벨리엘라 발티카(Belliella baltica), 사이크로플렉서스 토르쿠이스(Psychroflexus torquis), 스트렙토코커스 써모필루스, 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua), 지오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 스트렙토코커스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus), 샤르페아 종(Sharpea spp.) 단리체 RUG017, 베일로넬라 파르불라(Veillonella parvula), 에자키엘라 페루엔시스(Ezakiella peruensis), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 균주 AF15-40LB 및 펩토니필루스 종(Peptoniphilus sp.) Marseille-P3761을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 다양한 질환 및 장애, 예를 들어, 유전적 장애(예를 들어, 단일기원 질환), 뉴클레이스 활성에 의해 치료될 수 있는 질환 및 다양한 암 등을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 표적 핵산을 편집하여 표적 핵산을 변형시키기 위해(예를 들어, 하나 이상의 핵산 잔기를 삽입, 결실 또는 돌연변이시킴으로써) 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA와 함께 사용되며, 바람직한 핵산 서열을 포함하는 외인성 공여체 주형 핵산(예를 들어, DNA 분자 또는 RNA 분자)을 포함한다. CRISPR 시스템으로 유도된 절단 이벤트의 해결 시, 세포의 분자 기구는 절단 이벤트를 복구 및/또는 해결하는 데 외인성 공여체 주형 핵산을 이용할 것이다. 대안적으로, 세포의 분자 기구는 절단 이벤트를 복구 및/또는 해결하는 데 내인성 주형을 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 표적 핵산을 변경하여 삽입, 결실 및/또는 점 돌연변이를 초래하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, 삽입은 무흔(scarless) 삽입(즉, 의도된 핵산 서열을 표적 핵산으로 삽입하여 절단 이벤트의 해결 시 추가적인 의도되지 않은 핵산 서열이 생성되지 않음)이다. 공여체 주형 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA)일 수 있다.

일 양태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 RNA, 독성 RNA 및/또는 돌연변이된 RNA(예를 들어, 스플라이싱 결함 또는 절단)의 과발현에 의해 유발된 질환을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 다양한 질환을 유발하는 RNA 의존적 기능에 영향을 미치는 트랜스 작용(trans-acting) 돌연변이를 표적으로 하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 스플라이싱 결함 및 질환을 유발할 수 있는 시스 작용(cis-acting) 스플라이싱 코드를 파괴하는 돌연변이를 표적으로 하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 특히 RNA 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 RNA 서열을 표적화하기 위해 선택된 적합한 NLS-gRNA를 사용하여 바이러스 RNA를 표적화하기 위해.

본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 암을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 비정상적(예를 들어, 점 돌연변이를 포함하거나 대안적으로 스플라이싱됨)이고 암세포에서 세포 사멸을 유도하기 위해(예를 들어, 세포자멸사를 통해) 암세포에서 발견되는 RNA 분자를 표적화함으로써.

본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 대상체에서 감염성 질환을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 감염원 세포에서 세포 사멸을 표적화하고 유도하기 위해 감염원(예를 들어, 세균, 바이러스, 기생충 또는 원생동물)에 의해 발현되는 RNA 분자의 표적화를 통해. 본 명세서에 기재된 합성 가이드 RNA는 세포내 감염원이 숙주 대상체의 세포를 감염시키는 질환을 치료하기 위해 유전자 편집 시스템과 함께 사용될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 서열을 표적 DNA 서열에 삽입시키는 것이 바람직한 적용에서, 삽입될 공여체 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 세포에 제공된다. "공여체 서열" 또는 "공여체 폴리뉴클레오타이드"는 부위 지정 변형 폴리펩타이드에 의해 유도된 절단 부위에 삽입되는 핵산 서열을 의미한다. 공여체 폴리뉴클레오타이드는 그것과 상동성을 갖는 게놈 서열 사이의 상동성 지정 복구를 지원하기 위해 절단 부위의 게놈 서열과 충분한 상동성, 예를 들어, 절단 부위, 예를 들어, 절단 부위의 약 50개 이하의 염기 내, 예를 들어, 약 30개 염기 내, 약 15개의 염기 내, 약 10개의 염기 내, 약 5개의 염기 내에 측접하거나 절단 부위에 바로 측접하는 뉴클레오타이드 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 상동성을 포함할 것이다. 공여체와 게놈 서열 사이의 서열 상동성의 대략 25개, 50개, 100개 또는 200개의 뉴클레오타이드 또는 200개 초과의 뉴클레오타이드(또는 10개 내지 200개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상의 임의의 정수 값)가 상동성 지정 복구를 지원할 것이다. 공여체 서열은 임의의 길이, 예를 들어, 10개의 뉴클레오타이드 이상, 50개의 뉴클레오타이드 이상, 100개의 뉴클레오타이드 이상, 250개의 뉴클레오타이드 이상, 500개의 뉴클레오타이드 이상, 1000개의 뉴클레오타이드 이상, 5000개의 뉴클레오타이드 이상 등일 수 있다.

공여체 서열은 전형적으로 이것이 대체하는 게놈 서열과 동일하지 않다. 오히려, 상동성 지정 복구를 지원하기에 충분한 상동성이 존재하는 한, 공여체 서열은 게놈 서열과 관련하여 적어도 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공여체 서열은 2개의 상동성 영역이 측접하는 비상동성 서열을 포함하여, 표적 DNA 영역과 2개의 측접 서열 사이의 상동성 지정 복구로 인해 표적 영역에 비상동성 서열이 삽입된다. 공여체 서열은 또한 관심 DNA 영역과 상동성이 아니며 관심 DNA 영역에 삽입되도록 의도되지 않은 서열을 포함하는 벡터 백본을 포함할 수 있다. 일반적으로, 공여체 서열의 상동성 영역(들)은 재조합이 요구되는 게놈 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 가질 것이다. 소정의 실시형태에서, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9%의 서열 동일성이 존재한다. 공여체 폴리뉴클레오타이드의 길이에 따라 1% 내지 100%의 서열 동일성 사이의 임의의 값이 존재할 수 있다.

공여체 서열은 게놈 서열, 예를 들어, 제한 부위, 뉴클레오타이드 다형성, 선별 마커(예를 들어, 약물 저항성 유전자, 형광 단백질, 효소 등) 등과 비교하여 소정의 서열 차이를 포함할 수 있으며, 이는 절단 부위에 공여체 서열이 성공적으로 삽입되었는지 평가하기 위해 사용될 수 있거나 일부 경우에 다른 목적을 위해(예를 들어, 표적화된 게놈 유전자좌에서의 발현을 보여주기 위해) 사용될 수 있다. 일부 경우에, 코딩 영역에 위치하는 경우, 이러한 뉴클레오타이드 서열 차이는 아미노산 서열을 변경하지 않거나 아미노산 변화를 침묵시킬 것이다(즉, 단백질의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 변화). 대안적으로, 이러한 서열 차이는 마커 서열의 제거를 위해 나중에 활성화될 수 있는 FLP, loxP 서열 등과 같은 측접 재조합 서열을 포함할 수 있다.

공여체 서열은 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA 또는 이중 가닥 RNA로서 세포에 제공될 수 있다. 이는 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여체 서열의 말단은 당업자에게 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 핵산외 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이데옥시뉴클레오타이드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 추가되고/되거나 자가 상보적 올리고뉴클레오타이드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 외인성 폴리뉴클레오타이드를 분해로부터 보호하기 위한 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 선형 공여체 서열의 말단을 보호하는 것에 대한 대안으로서, 재조합에 영향을 주지 않고 분해될 수 있는 상동성 영역의 외부에 추가적인 길이의 서열이 포함될 수 있다. 공여체 서열은, 예를 들어, 복제 기원, 프로모터 및 항생제 저항성을 암호화하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 더욱이, 공여체 서열은 네이키드 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, DNA 표적화 RNA를 암호화하는 핵산 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드에 대해 위에 기재된 바와 같이 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV)에 의해 전달될 수 있다.

위에 기재된 방법에 따라, 관심 DNA 영역은 생체외에서 절단되고 변형될 수 있고, 즉 "유전자 변형"될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선별 마커가 관심 DNA 영역에 삽입되었을 때, 유전적으로 변형된 세포를 나머지 집단으로부터 분리함으로써 세포 집단은 유전자 변형을 포함하는 세포 집단으로 농축될 수 있다. 농축 전, "유전적으로 변형된" 세포는 세포 집단의 약 1% 이상(예를 들어, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상)만을 구성할 수 있다. "유전적으로 변형된" 세포의 분리는 사용된 선별 마커에 적절한 임의의 편리한 분리 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 형광 마커가 삽입된 경우에 세포는 형광 활성화 세포 분류에 의해 분리될 수 있는 반면, 세포 표면 마커가 삽입된 경우에 세포는 친화성 분리 기법, 예를 들어, 자성 분리, 친화성 크로마토그래피, 고체 매트릭스에 부착된 친화성 시약을 사용한 "패닝" 또는 기타 편리한 기법에 의해 이종 집단으로부터 분리될 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기법은 다중 색상 채널, 낮은 각도 및 둔광 산란 검출 채널, 임피던스 채널 등과 같은 다양한 정도의 정교함을 가질 수 있는 형광 활성화 세포 분류기를 포함한다. 세포는 죽은 세포와 관련된 염료(예를 들어, 프로피듐 아이오다이드)를 사용함으로써 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포의 생존률에 지나치게 해를 끼치지 않는 임의의 기법이 사용될 수 있다. 변형된 DNA를 포함하는 세포에 대해 고도로 농축된 세포 조성물은 이러한 방식으로 달성된다. "고도로 농축된"은 유전적으로 변형된 세포가 세포 조성물의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 예를 들어, 세포 조성물의 약 95% 이상 또는 98% 이상일 것임을 의미한다. 즉, 조성물은 유전적으로 변형된 세포의 실질적으로 순수한 조성물일 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 세포는 즉시 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 액체 질소 온도에서 동결되어 장기간 동안 보관될 수 있으며, 해동되어 재사용될 수 있다. 이러한 경우에, 세포는 일반적으로 10% 다이메틸설폭사이드(DMSO), 50% 혈청, 40% 완충 배지 또는 이러한 동결 온도에서 세포를 보존하기 위해 당업계에서 일반적으로 사용되는 어떤 다른 이러한 용액에서 동결되고, 동결된 배양된 세포를 해동시키기 위해 당업계에 일반적으로 알려져 있는 방식으로 해동될 것이다.

유전적으로 변형된 세포는 다양한 배양 조건 하에 시험관내에서 배양될 수 있다. 세포는 배양을 통해 확장될 수 있으며, 즉, 이들의 증식을 촉진하는 조건하에서 성장할 수 있다. 배양 배지는 액체 또는 반고체, 예를 들어, 함유 아가, 메틸셀룰로스 등일 수 있다. 세포 집단은 일반적으로 송아지 태아 혈청(약 5% 내지 10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-머캅토에탄올 및 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 이스코브의 변형된 DMEM 또는 RPMI 1640과 같은 적절한 영양 배지에 현탁될 수 있다. 배양물은 조절 T 세포가 반응하는 성장 인자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 성장 인자는 막횡단 수용체에 대한 특정 효과를 통해 배양물 또는 온전한 조직에서 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진할 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩타이드 및 비폴리펩타이드 인자를 포함한다.

이러한 방식으로 유전적으로 변형된 세포는, 예를 들어, 질환을 치료하거나 항바이러스, 항병원성 또는 항암 치료제로서 유전자 요법과 같은 목적을 위해, 농업에서 유전적으로 변형된 유기체를 생산하기 위해 또는 생물학적 연구를 위해 대상체에게 이식될 수 있다. 대상체는 신생아, 청소년 또는 성인일 수 있다. 특히 관심 있는 것은 포유동물 대상체이다. 본 방법으로 치료될 수 있는 포유동물 종은 개 및 고양이; 말; 소; 양; 등 및 영장류, 특히 인간을 포함한다. 동물 모델, 특히 작은 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼목(예를 들어, 토끼) 등)이 실험적 조사에 사용될 수 있다.

세포는, 예를 들어, 이식되는 조직의 성장 및/또는 조직화를 지원하기 위해 단독으로 또는 적합한 기질 또는 매트릭스와 함께 대상체에게 제공될 수 있다. 일반적으로, 적어도 1×10³개의 세포, 예를 들어, 5×10³개의 세포, 1×10⁴개의 세포, 5×10⁴개의 세포, 1×10⁵개의 세포, 1×10⁶개의 세포 또는 그 이상이 투여될 것이다. 세포는 임의의 다음 경로: 비경구, 피하, 정맥내, 두개내, 척수내, 안구내 또는 척수액 내를 통해 대상체에게 도입될 수 있다. 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 세포는 또한 트랜스제닉 동물(예를 들어, 트랜스제닉 마우스)을 생성할 목적으로 배아(예를 들어, 배반포)에 도입될 수 있다.

대상체에 대한 치료제의 투여 횟수는 다양할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포를 대상체에게 도입하는 것은 일회성 이벤트일 수 있지만; 소정의 상황에서, 이러한 치료는 제한된 기간 동안 개선을 유도할 수 있고, 지속적인 일련의 반복된 치료가 필요할 수 있다. 다른 상황에서, 효과가 관찰되기 전 유전적으로 변형된 세포의 다중 투여가 필요할 수 있다. 정확한 프로토콜은 치료 중인 개별 대상체의 질환 또는 병태, 질환의 병기 및 매개변수에 따라 달라진다.

본 발명의 다른 양태에서, DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 질환을 치료하거나 항바이러스, 항병원성 또는 항암 치료제로서 유전자 요법과 같은 목적을 위해, 농업에서 유전적으로 변형된 유기체를 생산하기 위해 또는 생물학적 연구를 위해 생체내에서 세포 DNA를 변형시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 생체내 실시형태에서, DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 개체에게 직접 투여된다. DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 펩타이드, 소분자 및 핵산을 대상체에게 투여하기 위한 당업계에 잘 알려진 다수의 방법에 의해 투여될 수 있다. DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 다양한 제형에 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 적절한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.

약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 비히클에 존재하는 하나 이상의 DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이다. "약제학적으로 허용 가능한 비히클"은 미국 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 열거된 비히클일 수 있다.

인간과 같은 포유동물에 사용하기 위한 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전. 용어 "비히클"은 본 발명의 화합물을 포유동물에게 투여하기 위해 함께 제형화되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다. 이러한 약제학적 비히클은 지질, 예를 들어, 리포솜, 예를 들어, 리포솜 덴드리머; 액체, 예컨대, 물 및 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 오일, 식염수; 아카시아검, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정하제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사제, 흡입제, 겔, 마이크로스피어 및 에어로졸과 같은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 이와 같이, DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 투여는 경구, 협측, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 기관내, 안구내 투여 등을 포함하는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 활성제는 투여 후 전신적일 수 있거나, 국소 투여, 벽내 투여의 사용 또는 이식 부위에서 활성 용량을 유지하는 역할을 하는 이식물의 사용에 의해 국부화될 수 있다. 활성제는 즉각적인 활성을 위해 제형화될 수 있거나 지속 방출을 위해 제형화될 수 있다.

일부 병태, 특히 중추신경계 병태의 경우, 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier: BBB)을 통과하도록 작용제를 제형화하는 것이 필요할 수 있다. 혈액 뇌 장벽(BBB)을 통한 약물 전달을 위한 전략 중 하나는 만니톨 또는 류코트리엔과 같은 삼투압 수단 또는 브래디키닌과 같은 혈관활성 물질을 생화학적으로 사용함으로써 BBB를 파괴를 수반한다. 뇌종양에 대한 특정 작용제를 표적으로 하기 위해 BBB 개방을 사용할 가능성도 옵션이다. BBB 파괴제는 조성물이 혈관내 주사에 의해 투여되는 경우 본 발명의 치료적 조성물과 함께 공동 투여될 수 있다. BBB를 통과하기 위한 다른 전략은 카베올린-1 매개성 통과세포외배출(transcytosis), 포도당 및 아미노산 운반체와 같은 담체 매개성 수송체, 인슐린 또는 트랜스페린에 대한 수용체 매개성 통과세포외배출 및 p-당단백질과 같은 활성 유출 수송체를 포함하는 내인성 수송 시스템의 사용을 수반할 수 있다. 활성 수송 모이어티는 또한 혈관 내피 벽을 가로지르는 수송을 용이하게 하기 위해 본 발명에 사용하기 위한 치료적 화합물에 접합될 수 있다.

대안적으로, BBB 뒤로의 치료제의 약물 전달은 국부 전달, 예를 들어, 경막내 전달에 의해 이루어질 수 있다.

전형적으로, DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 유효량이 제공된다. 생체외 방법과 관련하여 위에 논의된 바와 같이, 생체내 DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 유효량 또는 유효 용량은 음성 대조군, 예를 들어, 빈 벡터 또는 관련 없는 폴리펩타이드와 접촉된 세포에 비해 2개의 상동성 서열 사이에서 관찰되는 재조합 양의 2배 이상의 증가를 유도하는 양이다. 재조합의 양은, 예를 들어, 위에 기재되고 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 임의의 편리한 방법에 의해 측정될 수 있다. 투여되는 DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 유효량 또는 유효 용량의 계산은 당업자의 기술 내에 있으며 당업자에게 일상적일 것이다. 투여되는 최종 양은 투여 경로 및 치료될 장애 또는 병태의 성질에 따라 달라질 것이다. 일부 실시형태에서, 약 0.01mpk 내지 1mpk의 예시적인 용량이 사용된다.

특정 환자에게 요구되는 유효량은 다양한 요인에 따라 달라질 것이며, 그 중 몇몇 요인은 환자마다 다를 것이다. 유능한 임상의는 필요에 따라 질환 병태를 중단시키거나 이의 진행을 역전시키기 위해 환자에게 투여할 치료제의 유효량을 결정할 수 있을 것이다. LD50 동물 데이터 및 작용제에 대해 이용 가능한 기타 정보를 사용하여, 임상의는 투여 경로에 따라 개체에 대한 최대 안전 용량을 결정할 수 있다. 예를 들어, 정맥내로 투여된 용량은 치료적 조성물이 투여되는 유체의 양이 더 많을 경우 경막내로 투여된 용량보다 클 수 있다. 유사하게는, 신체로부터 빠르게 제거되는 조성물은 치료적 농도를 유지하기 위해 더 높은 용량 또는 반복된 용량으로 투여될 수 있다. 숙련된 임상의는 일반적인 기술을 이용하여 일상적인 임상 시험 과정에서 특정 치료제의 복용량을 최적화할 수 있을 것이다.

약제에 포함시키기 위해, DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 적합한 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일반적인 제안으로서, 용량당 비경구로 투여되는 DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 총 약제학적 유효량은 용량 반응 곡선에 의해 측정될 수 있는 범위 내에 있을 것이다.

DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드에 기반한 요법, 즉, 치료적 투여에 사용되는 DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 제제는 멸균되어야 한다. 멸균은 멸균 여과막(예를 들어, 0.2㎛ 막)을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 치료적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘로 관통할 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 배치된다. DNA 표적화 RNA 및/또는 부위 지정 변형 폴리펩타이드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드에 기반한 요법은 단위 또는 다중 용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 또는 바이알에 수용액으로 또는 재구성을 위한 동결건조된 제형으로 보관될 수 있다. 동결건조된 제형의 예로서, 10㎖ 바이알에 화합물의 멸균 여과된 1%(w/v) 수용액 5㎖을 채우고, 생성된 혼합물은 동결건조된다. 수액은 정균 주사용수를 사용하여 동결건조된 화합물을 재구성함으로써 제조된다.

약제학적 조성물은 목적하는 제형에 따라 약제학적으로 허용 가능한 무독성 희석제의 담체를 포함할 수 있으며, 이는 동물 또는 인간 투여용 약제학적 조성물을 제형화하는 데 일반적으로 사용되는 비히클로서 정의된다. 희석제는 조합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 완충수, 생리학적 식염수, PBS, 링거액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액이다. 또한, 약제학적 조성물 또는 제형은 다른 담체, 보조제 또는 무독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제, 습윤제 및 세제와 같은 생리학적 조건을 근사화하는 추가적인 물질을 포함할 수 있다.

조성물은 또한, 예를 들어, 항산화제와 같은 임의의 다양한 안정화제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물이 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 생체내 안정성을 향상시키거나 그렇지 않으면 약리학적 특성을 향상시키는(예를 들어, 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키고, 독성을 감소시키고, 용해도 또는 흡수를 향상시키는) 잘 알려진 다양한 화합물과 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 변형제 또는 착화제의 예는 설페이트, 글루코네이트, 시트레이트 및 포스페이트를 포함한다. 조성물의 핵산 또는 폴리펩타이드는 또한 이들의 생체내 속성을 향상시키는 분자와 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 분자는, 예를 들어, 탄수화물, 폴리아민, 아미노산, 다른 펩타이드, 이온(예를 들어, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 망가니즈) 및 지질을 포함한다.

약제학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 활성 성분의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료학적으로 유효한 용량)을 결정하는 것을 포함하는 세포 배양물 및/또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 따라 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료적 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 요법이 바람직하다.

세포 배양 및/또는 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간을 위한 다양한 투여량을 공식화하는 데 사용될 수 있다. 활성 성분의 투여량은 전형적으로 독성이 낮은 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 이용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다.

약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용되는 성분은 바람직하게는 고순도이고, 잠재적으로 해로운 오염물질이 실질적으로 없다(예를 들어, 적어도 국가 식품(National Food: NF) 등급, 일반적으로 적어도 분석적 등급, 보다 전형적으로 적어도 약제학적 등급). 더욱이, 생체내 사용을 위한 조성물은 일반적으로 무균이다. 주어진 화합물이 사용 전 합성되어야 하는 경우, 생성된 제품은 전형적으로 임의의 잠재적으로 독성이 있는 물질, 특히 합성 또는 정제 과정 중에 존재할 수 있는 임의의 내독소가 실질적으로 없다. 비경구 투여를 위한 조성물은 또한 무균이고, 실질적으로 등장성이며, GMP 조건하에서 제조된다.

전달 시스템

본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 목적하는 유전자 편집 시스템 구성요소와 함께 벡터, 담체, 예를 들어, 지질 나노입자와 같은 다양한 전달 시스템에 의해 관심 세포에 전달될 수 있다.

본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 유기 또는 무기일 수 있는 나노입자에 의해 전달될 수 있다. 나노입자는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 적합한 나노입자 디자인이 게놈 편집 시스템 구성요소 또는 이러한 구성요소를 암호화하는 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유기(예를 들어, 지질 및/또는 중합체) 나노입자는 본 개시내용의 소정의 실시형태에서 전달 비히클로 사용하기에 적합할 수 있다. 나노입자 제형 및/또는 유전자 전달에 사용하기 위한 예시적인 지질은 표 2(아래)에 나타나 있다.

표 3은 유전자 전달 및/또는 나노입자 제형에 사용하기 위한 예시적인 중합체가 나열되어 있다.

표 4는 본 명세서에 기재된 Cas9를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 전달 방법을 요약하고 있다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA를 포함하는 게놈 편집 시스템의 전달은 리보핵단백질(RNP)을 세포에 전달함으로써 달성될 수 있다. RNP는 표적화 gRNA와의 복합체로 핵산 결합 단백질, 예를 들어, Cas9를 포함한다. RNP는, 예를 들어, 문헌[Zuris, J.A. et al., 2015, Nat. Biotechnology, 33(1):73-80]에 의해 보고된 전기천공, 뉴클레오펙션 또는 양이온성 지질 매개성 방법과 같은 공지된 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. RNP는 CRISPR 염기 편집 시스템, 특히 일차 세포와 같이 형질감염시키기 어려운 세포에 사용하기에 유리하다. 또한, RNP는 또한 특히 CRISPR 플라스미드에 사용될 수 있는 진핵생물 프로모터, 예를 들어, CMV 또는 EF1A가 잘 발현되지 않는 경우에 세포 내 단백질 발현에서 발생할 수 있는 어려움을 완화시킬 수 있다. 유리하게는, RNP를 사용하면 외부 DNA를 세포에 전달할 필요가 없다. 더욱이, 핵산 결합 단백질과 gRNA 복합체를 포함하는 RNP는 시간이 지남에 따라 분해되기 때문에, RNP를 사용하면 표적외 효과를 제한할 가능성이 있다. 플라스미드 기반 기법과 유사한 방식으로, RNP는 결합 단백질(예를 들어, Cas9 변이체)을 전달하고 상동성 지정 복구(homology directed repair: HDR)를 지시하는 데 사용될 수 있다.

CRISPR 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 합성 gRNA 포함)을 유도하는 데 사용되는 프로모터는 AAV ITR을 포함할 수 있다. 이는 벡터에서 공간을 차지할 수 있는 추가적인 프로모터 요소의 필요성을 제거하는 데 유리할 수 있다. 확보된 추가적인 공간은 가이드 핵산 또는 선별 마커와 같은 추가적인 요소의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. ITR 활성은 상대적으로 약하므로, 이는 선택한 뉴클레이스의 과발현으로 인한 잠재적인 독성을 줄이는 데 사용될 수 있다.

Cas9 및 적절한 경우 가이드 핵산의 발현을 유도하기 위해 임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 편재적 발현의 경우, 사용될 수 있는 프로모터는 CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등을 포함한다. 뇌 또는 기타 CNS 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 모든 뉴런의 경우 SynapsinI, 흥분성 뉴런의 경우 CaMKIIalpha, GABA성 뉴런의 경우 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT 등을 포함할 수 있다. 간 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 알부민 프로모터를 포함한다. 폐 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 SP-B를 포함할 수 있다. 내피 세포의 경우, 적합한 프로모터는 ICAM을 포함할 수 있다. 조혈 세포의 경우, 적합한 프로모터는 IFN베타 또는 CD45를 포함할 수 있다. 조골세포의 경우, 적합한 프로모터는 OG-2를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 별도의 프로모터는 동일한 핵산 분자 내에서 가이드 핵산과 상용성인 염기 편집기의 발현을 유도한다. 예를 들어, 벡터 또는 바이러스 벡터는 염기 편집기를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터 및 가이드 핵산에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함할 수 있다.

가이드 핵산의 발현을 유도하는 데 사용되는 프로모터는 U6 또는 H1과 같은 Pol III 프로모터를 포함할 수 있다. gRNA 아데노 관련 바이러스(AAV)를 발현시키기 위한 Pol II 프로모터 및 인트론성 카세트의 사용.

Cas9는 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 사용하여, 특히, 예를 들어, 미국 특허 제8,454,972호(아데노바이러스에 대한 제형, 용량), 미국 특허 제8,404,658호(AAV에 대한 제형, 용량) 및 미국 특허 제5,846,946호(DNA 플라스미드에 대한 제형, 용량) 및 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스와 관련된 임상 시험에 관한 임상 시험 및 간행물로부터의 제형 및 용량을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,454,972호 및 AAV와 관련된 임상 시험에서와 같을 수 있다. 아데노바이러스의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,404,658호 및 아데노바이러스와 관련된 임상 시험에서와 같을 수 있다. 플라스미드 전달의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제5,846,946호 및 플라스미드와 관련된 임상 연구에서와 같을 수 있다. 용량은 평균 70㎏의 개체(예를 들어, 성인 남성)를 기준으로 하거나 이에 대해 추정될 수 있으며, 다양한 체중과 종의 환자, 대상체, 포유동물에 대해 적합화될 수 있다. 투여 빈도는 연령, 성별, 일반적인 건강 상태, 환자 또는 대상체의 다른 병태 및 해결하려는 특정 병태 또는 증상을 포함한 일반적인 요인에 따라 의료 또는 수의 종사자(예를 들어, 의사, 수의사)의 영역 내에 있다. 바이러스 벡터는 관심 조직에 주입될 수 있다. 세포 유형 특이적 염기 편집의 경우, 염기 편집기 및 선택적 가이드 핵산의 발현은 세포 유형 특이적 프로모터에 의해 유도될 수 있다.

생체내 전달의 경우, AAV는 다른 바이러스 벡터에 비해 유리할 수 있다. 일부 경우에, AAV는 낮은 독성을 허용하며, 이는 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 세포 입자의 초원심분리가 필요하지 않은 정제 방법 때문일 수 있다. 일부 경우에, AAV는 숙주 게놈에 통합되지 않기 때문에 삽입 돌연변이유발 가능성을 낮춘다.

AAV는 4.5kb 또는 4.75Kb의 패키징 제한을 갖는다. 4.5kb 또는 4.75Kb보다 큰 작제물은 바이러스 생산을 크게 감소시킬 수 있다. 예를 들어, SpCas9는 상당히 크고, 유전자 자체가 4.1Kb를 초과하여 AAV에 패키징하기 어렵다. 따라서, 본 개시내용의 실시형태는 기존의 Cas9보다 길이가 더 짧은 개시된 Cas9를 이용하는 것을 포함한다.

AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 표적화할 세포와 관련하여 AAV의 유형을 선택할 수 있고; 예를 들어, 뇌 또는 신경 세포를 표적화하기 위해 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합을 선택할 수 있고; 심장 조직을 표적화하기 위해 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달에 유용하다. 이들 세포에 관한 소정의 AAV 혈청형의 표는 문헌[Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)]에서 찾을 수 있다.

렌티바이러스는 유사분열 및 유사분열 후 세포 모두에서 유전자를 감염시키고 발현시키는 능력을 갖는 복합 레트로바이러스이다. 가장 일반적으로 공지된 렌티바이러스는 다른 바이러스의 외피 당단백질을 사용하여 광범위한 세포 유형을 표적으로 하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다.

렌티바이러스는 다음과 같이 제조될 수 있다. pCasES10(렌티바이러스 전달 플라스미드 백본을 포함함)을 클로닝한 후, 형질감염 전날 T-75 플라스크에 낮은 계대(p=5)의 HEK293FT를 50% 컨플루언스까지 10% 소태아 혈청을 함유한 항생제가 없는 DMEM에 시딩한다. 20시간 후, 배지는 OptiMEM(무혈청) 배지로 변경하고, 4시간 후에 형질감염을 수행한다. 세포를 10㎍의 렌티바이러스 전달 플라스미드(pCasES10)와 다음 패키징 플라스미드: 5㎍의 pMD2.G(VSV-g 슈도유형) 및 7.5㎍의 psPAX2(gag/pol/rev/tat)로 형질감염시킨다. 형질감염은 양이온성 지질 전달제(50㎕ 리포펙타민 2000 및 100㎕ Plus 시약)를 사용하여 4㎖ OptiMEM에서 수행할 수 있다. 6시간 후, 배지를 10% 소태아 혈청을 함유한 항생제가 없는 DMEM으로 변경한다. 이러한 방법은 세포 배양 중에 혈청을 사용하지만, 무혈청 방법이 바람직하다.

렌티바이러스는 다음과 같이 정제될 수 있다. 48시간 후에 바이러스 상청액을 수거한다. 상청액에서 먼저 찌꺼기를 제거하고, 0.45㎛의 낮은 단백질 결합(PVDF) 필터를 통해 여과한다. 그런 다음, 이를 초원심분리기에서 24,000rpm으로 2시간 동안 회전시킨다. 바이러스 펠릿을 4℃에서 밤새 50㎕의 DMEM에 재현탁시킨다. 그런 다음, 이를 분취하고, 즉시 -80℃에서 동결시킨다.

또 다른 실시형태에서, 말 감염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV)에 기반한 최소 비영장류 렌티바이러스 벡터도 상정된다. 또 다른 실시형태에서, 망막하 주사를 통해 전달되는 것으로 상정되는 혈관신생 억제성 단백질인 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현하는 말 감염성 빈혈 바이러스 기반 렌티바이러스 유전자 요법 벡터인 RetinoStat®가 상정된다. 또 다른 실시형태에서, 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터의 사용이 상정된다.

시스템의 임의의 RNA, 예를 들어, NLS-gRNA 또는 Cas9 암호화 mRNA는 RNA의 형태로 전달될 수 있다. Cas9 암호화 mRNA는 시험관내 전사를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, Cas9 mRNA는 다음 요소: T7 프로모터, 선택적 코작(kozak) 서열(GCCACC), 뉴클레이스 서열 및 베타 글로빈-폴리A 꼬리로부터의 3' UTR과 같은 3' UTR을 포함하는 PCR 카세트를 사용하여 합성될 수 있다. 카세트는 T7 폴리머레이스에 의한 전사에 사용될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA)는 또한 T7 프로모터, 이어서 "GG" 서열 및 가이드 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 카세트로부터 시험관내 전사를 사용하여 전사될 수 있다.

발현을 향상시키고 가능한 독성을 감소시키기 위해, Cas9 서열 및/또는 가이드 핵산은, 예를 들어, 슈도-U 또는 5-메틸-C를 사용하여 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하도록 변형될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포 또는 유기체를 변형시키는 방법을 포함한다. 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 비인간 영장류, 소, 돼지, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 본 개시내용 염기 편집기, 조성물 및 방법에 의해 세포에 도입된 변형은 항체, 전분, 알코올 또는 다른 목적하는 세포 생산물(output)과 같은 생물학적 산물의 개선된 생산을 위해 세포 및 세포의 자손이 변경되도록 하는 것일 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 세포에 도입된 변형은 세포 및 세포의 자손이 생산된 생물학적 산물을 변화시키는 변경을 포함하도록 하는 것일 수 있다.

시스템은 하나 이상의 상이한 벡터를 포함할 수 있다. 양태에서, Cas9는 목적하는 세포 유형, 우선적으로 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 인간 세포의 발현을 위해 코돈 최적화된다.

일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 50개 또는 그 이상의 코돈)을 천연 아미노산 서열을 유지하면서 해당 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에의 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 소정의 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있으며, 이는 무엇보다도 번역되는 코돈의 특성과 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 가용성에 따라 달라지는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는, 예를 들어, www.kazusa.orjp/codon/(2002년 7월 9일 방문)에서 이용 가능한 "코돈 사용 데이터베이스"에서 쉽게 입수할 수 있으며, 이러한 표는 다양한 방식으로 적합화될 수 있다. 문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]을 참조한다. 발현 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 최적화하는 코돈에 대한 컴퓨터 알고리즘도 이용 가능하며, 예컨대, Gene Forge(Aptagen; 펜실베니아 자코부스 소재.)도 이용 가능하다. 일부 실시형태에서, 조작된 뉴클레이스를 암호화하는 서열의 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 50개 이상 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 해당한다.

패키징 세포 전형적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포 및 레트로바이러스를 패키징하는 psi.2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자에 패키징하는 세포주를 생산함으로써 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주로의 후속 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 포함하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오타이드(들)에 대한 발현 카세트로 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로(in trans) 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈으로의 통합에 필요한 AAV 게놈으로부터의 ITR 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap를 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 포함하지만 ITR 서열이 결여되어 있는 세포주에 패키징될 수 있다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스에 감염될 수도 있다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진할 수 있다. 일부 경우에, 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 충분한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.

약제학적 조성물

본 개시내용의 다른 양태는 유전자 편집 시스템을 포함(예를 들어, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA 포함)하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적 용도로 제형화되는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 추가적인 작용제(예를 들어, 특정 전달, 반감기를 증가를 위한 것 또는 다른 치료적 화합물)를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 신체의 한 부위(예를 들어, 전달 부위)에서 또 다른 부위(예를 들어, 기관, 조직 또는 신체의 일부)로의 화합물의 운반 또는 수송에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 활석 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아르산) 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이 있고 대상체의 조직에 해를 끼치지 않는다는(예를 들어, 생리학적으로 적합, 멸균, 생리학적 pH 등) 의미에서 "허용 가능"하다.

약제학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대, 락토스, 포도당 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트래거캔트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG); (12) 에스터, 예컨대, 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대, 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; (15) 알긴산; (16) 무발열원수; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스터, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 증량제, 예컨대, 폴리펩타이드 및 아미노산; (23) 혈청 알코올, 예컨대, 에탄올; 및 (23) 약제학적 제형에 사용되는 기타 무독성 상용 물질. 습윤제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 향료, 방부제 및 항산화제도 제형에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "약제학적으로 허용 가능한 담체", "비히클" 등과 같은 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

약제학적 조성물은 제형의 pH를 약 5.0 내지 약 8.0의 범위와 같은 생리학적 pH를 반영하는 미리 결정된 수준으로 유지하기 위해 1종 이상의 pH 완충 화합물을 포함할 수 있다. 수성 액체 제형에 사용되는 pH 완충 화합물은 아미노산 또는 아미노산의 혼합물, 예컨대, 히스티딘 또는 히스티딘과 글리신의 혼합물과 같은 아미노산의 혼합물일 수 있다. 대안적으로, pH 완충 화합물은 바람직하게는 제형의 pH를 약 5.0 내지 약 8.0의 범위와 같은 미리 결정된 수준으로 유지하고 칼슘 이온을 킬레이트화하지 않는 작용제이다. 이러한 pH 완충 화합물의 예시적인 예는 이미다졸 및 아세테이트 이온을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. pH 완충 화합물은 제형의 pH를 미리 결정된 수준으로 유지하는 데 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다.

약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 삼투 조절제, 즉, 제형의 삼투 특성(예를 들어, 긴장성, 삼투질 농도 및/또는 삼투압)을 수용자 개인의 혈류 및 혈액 세포에 허용 가능한 수준으로 조절하는 화합물을 포함할 수 있다. 삼투 조절제는 칼슘 이온을 킬레이트화하지 않는 작용제일 수 있다. 삼투 조절제는 제형의 삼투 특성을 조절하는 당업자에게 공지되거나 당업자가 이용 가능한 임의의 화합물일 수 있다. 당업자는 본 발명의 제형에 사용하기 위한 주어진 삼투 조절제의 적합성을 경험적으로 결정할 수 있다. 삼투 조절제의 적합한 유형의 예시적인 예는 염, 예컨대, 소듐 클로라이드 및 소듐 아세테이트; 당, 예컨대, 수크로스, 덱스트로스 및 만니톨; 아미노산, 예컨대, 글리신; 및 이러한 작용제 및/또는 작용제의 유형 중 하나 이상의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 삼투 조절제(들)는 제형의 삼투 특성을 조절하기에 충분한 임의의 농도로 존재할 수 있다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 유전자 편집을 위해 대상체에게 전달하기 위해 제형화된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 투여하기에 적합한 경로는 제한 없이 국소, 피하, 경피, 피내, 병변내, 관절내, 복강내, 방광내, 경점막, 치은, 치아내, 달팽이관내, 경고막, 기관내, 경막외, 경막내, 근육내, 정맥내, 혈관내, 골내, 안구주위, 종양내, 뇌내 및 뇌실내 투여를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 병든 부위에 국부적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 주사, 카테터, 좌약, 또는 시알라스틱(sialastic) 막 또는 섬유와 같은 막을 포함하는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질인 이식물에 의해 대상체에게 투여된다.

다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61] 참조). 또한, 문헌[Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et ah, 1989, J. Neurosurg. 71: 105]도 참조한다. 다른 제어 방출 시스템도, 예를 들어, 상기 Langer에 논의되어 있다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체, 예를 들어, 인간에게 정맥내 또는 피하 투여하기 위해 적합화된 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 일부 실시형태에서, 주사 투여용 약제학적 조성물은 가용화제로서 사용되는 멸균 등장성 용액과 주사 부위의 통증을 완화시키기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제이다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 공급되거나, 예를 들어, 활성제의 양이 표시되어 있는 앰풀 또는 사셰와 같은 완전 밀폐된 용기에 건조 동결건조된 분말 또는 무수 농축액으로서 함께 혼합되어 공급된다. 주입 방식으로 의약품이 투여되는 경우, 멸균된 약제학적 등급의 물 또는 식염수가 들어 있는 주입 병과 함께 제공될 수 있다. 약제학적 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분이 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 식염수 앰풀이 제공될 수 있다.

전신 투여용 약제학적 조성물은 액체, 예를 들어, 멸균 식염수, 젖산 링거액 또는 행크 용액일 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 고체 형태일 수 있고, 사용 직전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태도 상정된다. 약제학적 조성물은 리포솜 또는 미세결정과 같은 지질 입자 또는 소포 내에 포함될 수 있으며, 이 또한 비경구 투여에 적합하다. 입자는 조성물이 그 안에 포함되어 있는 한 단일층 또는 복수층과 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 화합물은 낮은 수준(5몰% 내지 10몰%)의 양이온성 지질인 융해성 지질 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 포함하는 "안정화된 플라스미드-지질 입자"(stabilized plasmid-lipid particle: SPLP)에 포획되고, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 코팅에 의해 안정화될 수 있다(Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47). N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸-암모늄메틸설페이트 또는 "DOTAP"와 같은 양으로 하전된 지질이 이러한 입자 및 소포에 특히 바람직하다. 이러한 지질 입자의 제조는 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제4,880,635호; 제4,906,477호; 제4,911,928호; 제4,917,951호; 제4,920,016호; 및 제4,921,757호를 참조한다.

본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은, 예를 들어, 단위 용량으로 투여되거나 패키징될 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물과 관련하여 사용될 때 용어 "단위 용량"은 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 필요한 희석제와 관련하여 목적하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 포함하는 단위; 즉, 담체 또는 비히클이다.

또한, 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태의 본 발명의 화합물을 함유하는 용기 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 함유하는 제2 용기(예를 들어, 동결건조된 본 발명의 화합물의 재구성 또는 희석에 사용되는 멸균 용기)를 포함하는 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 선택적으로 이러한 용기(들)에는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형식의 통지문이 포함될 수 있으며, 이는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.

또 다른 양태에서, 위에 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 포함하는 제품이 포함된다. 일부 실시형태에서, 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 만들어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 용기는 본 명세서에 기재된 질환을 치료하는 데 효과적인 조성물을 담으며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 정맥내 주사액 백 또는 바이알일 수 있다. 조성물 내 활성제는 본 발명의 화합물이다. 일부 실시형태에서, 용기 위 또는 이와 관련된 라벨은 조성물이 선택한 질환을 치료하는 데 사용된다는 것을 나타낸다. 제품은 인산 완충 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 지침이 포함된 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 일부로서 CRISPR 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 포함)이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 제공된 임의의 융합 단백질(예를 들어, LubCas9를 포함하는 본 명세서에 기재된 핵염기 편집기 포함)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 제공된 임의의 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 gRNA 및 양이온성 지질과 복합체를 형성하는 RNA 가이드된 뉴클레이스(예를 들어, Cas9)를 포함하는 리보핵단백질 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 gRNA, 핵산 프로그래밍 가능 DNA 결합 단백질, 양이온성 지질 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 치료적으로 활성인 물질을 포함할 수 있다.

키트

일 양태에서, 본 명세서에 기재된 NLS-gRNA는 위의 방법 및 조성물에 개시된 요소 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트에 의해 제공되고/되거나 생산될 수 있다. 예를 들어, 키트는 NLS-gRNA, 라이게이스 및 적합한 완충 시약을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 키트는 핵염기 편집기를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 요소 중 하나 이상을 사용하는 과정에 사용하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 시약은 임의의 적합한 용기에 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 반응 또는 보관 완충액을 제공할 수 있다. 시약은 특정 검정에 사용할 수 있는 형태 또는 사용 전 하나 이상의 다른 구성요소의 첨가를 필요로 하는 형태(예를 들어, 농축액 또는 동결건조된 형태)로 제공될 수 있다. 완충액은 소듐 카보네이트 완충액, 소듐 바이카보네이트 완충액, 보레이트 완충액, Tris 완충액, MOPS 완충액, HEPES 완충액 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 완충액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충액은 알칼리성이다. 일부 실시형태에서, 완충액은 pH가 약 7 내지 약 10이다. 일부 실시형태에서, 키트는 가이드 서열과 조절 요소에 작동 가능하게 연결하기 위해 벡터에 삽입하기 위한 가이드 서열에 상응하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 상동성 재조합 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 전체가 참조에 의해 원용된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐 제한하려는 의도는 아니다. 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본 명세서에 기재되어 있다.

실시예

다음 실시예는 본 발명을 제조하고 실시하는 바람직한 방식 중 일부를 설명한다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다.

실시예 1: NLS-gRNA의 생체외 효능

본 실시예는 본 발명의 NLS에 접합된 예시적인 gRNA(NLS-gRNA) 및 이의 생체외 효능을 기술한다. NLS 서열 및 펩타이드 스페이서를 포함하는 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성에 의해 합성하였다. 합성된 펩타이드를 도 1에 도시된 바와 같이 티올기를 통해 gRNA의 3' 말단에 접합시켰다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 링커 및 펩타이드 스페이서는 본 발명의 실시에서 변형될 수 있다. 추가적으로, NLS, gRNA 및/또는 링커의 서열이 변형될 수 있다.

NLS-sgRNA를 제조하고, CRISPR-Cas9 기반 편집기를 암호화하는 mRNA와 함께 지질 나노입자로 제형화하였다. 제형을 3가지 상이한 비 의 mRNA:sgRNA(1:1, 3:1 및 9:1)로 간세포에 전달하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, NLS-sgRNA는 NLS 서열이 없는 gRNA와 비교하여 상당히 더 높은 염기 편집 효율을 보여주었다.

본 실시예의 데이터는 CRISPR-Cas 시스템(예를 들어, 염기 편집)이 NLS 서열에 접합된 gRNA를 사용함으로써 개선될 수 있음을 보여준다. 특정 이론에 얽매이지 않고, CRISPR-Cas 시스템의 개선은 부분적으로 gRNA를 세포질의 RNase로부터 보호하는 NLS-gRNA의 핵으로의 더 나은 수송, gRNA의 국부 농도의 증가와 이에 따른 리보핵산 복합체(RNP) 형성 및 핵으로의 더 높은 수송률로 인한 것일 수 있다. 또한, 양이온성 NLS 서열은 부분적으로 엔도솜 탈출을 촉진함으로써 작용할 수 있다.

실시예 2: NLS-gRNA의 생체내 효능

본 실시예는 NLS-gRNA가 고도로 변형된 gRNA와 비교하여도 생체내 염기 편집을 상당히 개선시킨다는 것을 예시한다. 본 실시예에서, spCas9 gRNA를 spCas9 닉케이스 및 아데노신 데아미네이스를 포함하는 아데닌 염기 편집기(ABE)와 함께 사용하였다.

다양한 변형을 갖는 gRNA를 제조하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 말단 변형된(EM) gRNA는 6% 변형을 포함하고, 중질 mod1(HM1) gRNA는 47% 변형을 포함하고, 중질 mod2(HM2) gRNA는 60% 변형을 포함하고, 중질 mod3(HM3) gRNA는 88% 변형을 포함한다. NLS-gRNA는 gRNA의 3' 말단에 접합된 NLS 서열 및 6% 변형을 포함한다. 동일한 염기 편집기를 암호화하는 2개의 상이한 mRNA를 제조하였다. mRNA 2와 비교하여, mRNA 1은 3' 및 5' UTR 서열로 코돈 최적화시켰다. mRNA1 또는 mRNA2와 gRNA의 다양한 조합을 LNP로 제형화시키고, 도 3b에 도시된 바와 같이 0.03mpk 또는 0.01mpk의 포화 이하의 용량으로 마우스에 전달하였다.

결과는 NLS-gRNA가 모든 EM, HM1, HM2 또는 HM3 gRNA와 비교하여 더 높은 염기 편집 효능을 나타냄을 보여준다. 특히, 초저용량(0.01mpk)에서도, NLS-gRNA의 경우 염기 편집이 가능하였으며 중질 변형(HM1, HM2 및 HM3) gRNA보다 상당히 더 높았다. 추가적으로, NLS-gRNA를 덜 강력한 mRNA(mRNA2)와 조합시키면 mRNA의 품질이 보상된다 - 말단 변형 gRNA가 있는 mRNA2의 염기 편집 효율은 약 5%인 반면, gRNA를 NLS-gRNA로 치환하면 염기 편집 효율이 30%보다 크게 증가하였다.

실시예 3: 비인간 영장류(NHP)에서의 NLS-gRNA의 효능

본 실시예는 NLS-gRNA의 사용에 의한 염기 편집 효율의 개선이 NHP에서도 관찰됨을 예시한다. 본 실시예에서, spCas9 gRNA를 spCas9 기반 아데닌 염기 편집기(ABE)와 함께 사용하였다.

다양한 gRNA와 염기 편집기를 암호화하는 mRNA를 도 4a에 도시된 바와 같이 지질 나노입자로 제형화하였다. 제형을 1.0mpk로 NHP에 전달하고, 간에서 염기 편집 효율을 결정하였다. 결과는 mRNA1와 NLS-gRNA(g5-BVN) 및 mRNA1과 HM3 gRNA(g4-BVB)가 가장 높은 염기 편집 효율을 나타내었으며, g2-BVI, g3-BVV 및 g1-BVE가 그 뒤를 이음을 보여준다. 특히, 말단 변형이 있는 NLS-gRNA(g1-BVN 및 g7-BG3IN)는 각각 말단 변형된 NLS가 없는 gRNA와 비교하여(각각 g1-BVE 및 g6-BG3IE와 비교하여) 2-배 이상의 염기 편집 효율을 보여주었다.

다음으로, NHP에서 독성학 연구를 수행하였다. 임상 병리를 평가하기 위해, 알라닌 아미노트랜스퍼레이스(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼레이스(AST) 수준을 측정하였다. ALT 및 AST의 수준이 높을수록 간 손상과 상관관계가 있다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 모든 테스트 물품에 대해 투여 후 24시간에 AST 및/또는 ALT의 최소 내지 경미한 증가가 관찰되었다. 특히, 말단 변형이 있는 NLS-gRNA를 포함하는 g5-BVN은 가장 낮은 AST 및 ALT 증가를 보여주었다. 추가적으로, 임상 병리 매개변수의 다른 유의미한 변화는 관찰되지 않았다.

전반적으로, 본 실시예의 데이터는 NLS-gRNA가 독성을 감소시키면서 NHP에서 CRISPR-Cas 시스템(예를 들어, 염기 편집 효율)을 개선시킴을 예시한다.

실시예 4: saCas9에 NLS-gRNA의 적용

본 실시예는 NLS-gRNA가 다양한 Cas 단백질에 적용될 수 있음을 예시한다. 이 특정 실시예에서, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9(saCas9)를 사용하였다. 특히, saCas9는 이전 실시예에 나타낸 spCas9 편집과 상용성이 아닌 고유한 가이드를 필요로 한다.

글리코겐 축적 질환 유형 1a(GSD1a)은 글루코스-6-포스파테이스(G6PC) 유전자의 돌연변이로 인해 발생하며, GSD1a 환자의 약 80%에 영향을 미친다. R83C 돌연변이는 매년 글리코겐 축적 질환 유형 1a(GSD1a)로 진단을 받는 약 900명의 미국 환자에게 영향을 미친다. 이 돌연변이는 G6PC 단백질의 83번 위치에 시스테인(R83C)을 도입하는 단일 염기 치환이다. 정확한 R83C의 교정은 G6PC의 발현을 회복시키고 포도당 대사를 정상화시킬 가능성이 높을 것이다.

gRNA를 제조하고, 이의 순도를 결정하였다. 2개의 상이한 백본 화학을 갖는 gRNA를 연구에 사용하였다(sg029 대 sg093). Sg093 가이드는 2'-OMe 및 포스포티오에이트 변형을 포함한 말단 변형을 갖고 있다. 다양한 gRNA와 염기 편집기를 암호화하는 mRNA를 gRNA: mRNA의 1:1 비로 LNP로 제형화하였다. huG6PC-R83C에 대해 이형접합성인 성체 트랜스제닉 마우스에게 LNP 제형을 1mpk의 포화 이하의 용량으로 투여하였다.

도 5는 염기 편집 효율과 gRNA의 순도 사이의 상관관계를 보여주며, 80% 순도에서 최대 염기 편집 수준이 생성되었다. 추가적으로, NLS-gRNA는 NLS 서열이 없는 다른 sg093 가이드에 비해 spCas9 단백질을 사용한 효능의 개선을 보여주었으며, 본 발명의 NLS-gRNA는 다중 Cas 단백질에 걸쳐 적용될 수 있음을 예시한다.

실시예 5: NLS-gRNA를 사용한 GSD1a R83C 마우스에서의 대사 결함에 대한 생체내 염기 편집 교정

본 실시예에서, GSD1a R83C 마우스의 대사 결함을 교정하기 위해 아데닌 염기 편집기(ABE)의 변이체를 NLS-gRNA와 함께 사용하였다. R83C 돌연변이는 g6pc 유전자에 단일 G>A 전환을 도입한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 NLS-gRNA와 조합된 ABE는 게놈 DNA에서 A에서 G로의 프로그래밍 가능한 전환에 영향을 미치므로, 이 돌연변이를 교정하기 위한 이들의 유용성을 뒷받침한다.

G6PC gRNA 서열은 아래에 나타낸 G6PC 표적 서열의 상보체에 혼성화된다:

NNGRRT PAM 서열(즉, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9(saCas9))은 위에 밑줄이 그어져 있다. gRNA 서열은 다음과 같다:

TadA 변이체 MSP605, MSP824, MSP825, MSP680, MSP828 및 MSP829(표 1 참조) 및 saCas9n을 사용한 아데노신 데아미네이스 염기 편집기(ABE)의 염기 편집 효율을 글리코겐 축적 질환 유형 1a(GSD1a)에 대한 R83C 돌연변이를 보유하는 huG6PC에 대해 이형접합성인 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 생체내에서 평가하였다(도 6b 및 도 6c). 효율적인 생체내 게놈 편집 및 saCas9 sgRNA 스캐폴드의 예시를 위한 saCas9의 사용은 문헌[A. Ran et al. (2015, Nature, Vol. 520, pages 186-191)]에 기술되어 있다.

도 6a은 염기 편집기를 트랜스제닉 마우스에 도입하는 데 사용되는 생체내 작업 흐름을 묘사한다. 염기 편집기 mRNA 및 NLS-gRNA를 운반하는 지질 나노입자(LNP)를 정맥내(IV) 주사를 통해 트랜스제닉 마우스에 1 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였다. 전체-간 추출물의 차세대 시퀀싱 데이터는 R83C에 대한 상당한 교정을 나타내었다(도 6b 및 도 6c). TadA 변이체 MSP828은 R83C 돌연변이의 약 40%의 정확한 교정을 보여주었으며, 방관자 편집은 낮았다. 이러한 수준의 돌연변이 교정은 포도당 항상성을 회복시킬 것으로 예상된다.

실시예 6: GSD1a R83C 마우스에서의 대사 결함에 대한 생체내 염기 편집 교정

GSD1a 개요

도 7에 개략적으로 도시된 바와 같이, (GSD1a)는 G6PC 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 상염색체 열성 장애이다. 백인 GSD1a 환자에서 확인된 가장 널리 퍼진 병원성 돌연변이는 효소의 활성 부위에 위치하며 G6Pase의 불활성화와 관련된 R83C이다. G6Pase 기능의 상실은 생명을 위협하는 저혈당증, 발작 및 심지어 사망을 초래할 수 있다. 저혈당증을 완화시키기 위해, 환자는 느린 포도당 방출 방식을 통해 밤낮으로 포도당의 보충을 엄격하고 빈번하게 준수하여야 한다. 복용을 놓치거나 지연하면 응급 저혈당증이 발생할 수 있다. 많은 합병증 중에서, 간 비대, 요산, 젖산 및 지질의 축적이 GSD1a 환자에서 흔하다.

영구적이고 예측 가능한 단일 뉴클레오타이드 치환을 생성하기 위한 기재된 염기 편집기의 유용성

R83C 돌연변이는 g6pc 유전자에 단일 G>A 전환을 도입한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 아데닌 염기 편집기(ABE)는 게놈 DNA에서 A에서 G로의 프로그래밍 가능 전환에 영향을 미치므로, 이 돌연변이를 교정하기 위한 이들의 유용성을 뒷받침한다. 도 8에 개략적으로 도시된 바와 같이, 아데닌 염기 편집기는 CRISPR-Cas 효소에 연결된 진화된 TadA 데아미네이스를 포함하는 융합 단백질이다. 염기 편집기는 가이드 RNA(CRISPR-Cas9 효소에 중첩됨)과 상보적인 표적 DNA에 결합하고, 단일 가닥 DNA의 신장부를 노출시킨다. 데아미네이스는 표적 아데닌을 이노신으로 전환하고, Cas 효소는 반대 가닥에 닉을 형성한 다음 복구하여 염기쌍 전환을 완료한다. 따라서, 점 돌연변이의 직접 복구는 유전자 기능의 회복 가능성을 가지고 있다.

본 실시예에서, g6pc 유전자에서 A>G 전환을 위한 염기 편집기를 R83C의 교정에 대해 최적화시켰다. 도 9a에 표적 DNA 서열(CCACCAGTATGGACACTGTCCAAAGAGAAT(서열번호 17)) 및 GSD1a R83C 돌연변이에 대해 밑줄이 그어져 있는 아미노산 번역(WWYPCQGFLI; 서열번호 18)이 나타나 있다. 편집될 표적 핵염기는 12번 위치에 이중 밑줄로 표시된다. 편집창은 6번 위치에 단일 밑줄로 표시된 가능한 방관자도 포함한다. 동의 전환이 발생할 수 있는 편집은 10번 위치에 표시된다.

스크리닝을 위해, R83C 돌연변이를 보유하는 G6PC 이식유전자를 발현하는 HEK293 세포주를 생성하고, 염기 편집기 mRNA 및 gRNA로 형질감염시켰다. 고속대량 표적화된 앰플리콘 차세대 시퀀싱으로 대립유전자 빈도를 평가하였다. 변이체 1 내지 변이체 5는 최적화된 표적 교정을 위해 조작된 gRNA와 염기 편집기 RNA의 조합을 나타낸다. 변이체 5는 R83C 교정 및 제한된 방관자 편집에 대해 대략 60%의 표적화된 염기 편집 효율을 제공하였다(도 9b).

마우스 생체내 질환 모델 및 R83C 단일 뉴클레오타이드 돌연변이의 생체내 교정 입증

R83C 염기 편집의 생체내 교정

생체내 R83C 교정의 염기 편집 효율을 검증하기 위해, 마우스 G6pc 대신에 인간 G6PC-R83C 이식유전자를 발현하는 신규한 GSD1a 마우스를 생성하였다. huR83C에 대해 동형접합성인 마우스는 출생 후 치사성을 나타내었으며 이유기(21일)까지 거의 생존하지 못하는 것으로 확인되었다. 포도당 보충 요법에서, 동물은 적어도 3주령까지 생존하였으며, 한배 새끼 대조군과 비교하여 체중 감소, 간 비대, 상당한 G6Pase 저해 및 비정상적인 혈청 대사산물과 같은 GSD1a의 특징적인 병리학적 시그니처를 나타내었다(도 7). 이 표현형은 인간에 대한 발표된 임상 보고서와 일치한다.

생체내 실험을 위해, 동형접합성 마우스의 신생아 치사성으로 인해 huR83C에 대해 이형접합성인 트랜스제닉 마우스에서 LNP 매개성 전달을 테스트하였다. 도 6a의 개략도는 IV 주사를 통해 투여된 지질 나노입자 또는 LNP, 염기 편집기 mRNA와 gRNA의 복합제형을 사용한 생체내 작업 흐름을 묘사한다. 동형접합성 마우스의 신생아 치사성을 고려하여, LNP 투여는 출생 직후 중측두 정맥을 통해 투여하였고, 활성을 성인 마우스에서의 활성과 비교하였다. 전체 간 추출물의 차세대 시퀀싱(NGS) 분석은 성체에서 대략 40%의 염기 편집 효율, 신생아에서 최대 약 60%의 효율을 나타내었으며, 효율성의 범위는 더 넓었다(도 11a). 방관자 편집은 성체와 신생아에서 낮게 유지되었다(도 11a).

huR83C에 대해 동형접합성인 신생아 마우스를 가이드 RNA 및 ABE를 암호화하는 mRNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)로 처리하였다. 처리된 마우스는 포도당 요법의 부재하에 저혈당증 유도성 발작 없이 3주령까지 생존하고 정상적으로 성장한 것으로 나타났다. 처리된 동형접합성 huR83C 마우스는 총 간 추출물에서 최대 약 60%의 편집 효율을 나타내었으며, 이는 huR83C에 대해 이형접합성인 한배 새끼 대조군과 일치한다(도 11b). 따라서, LNP 매개성 R83C 교정이 동형접합성 huR83C 마우스의 생존과 연관되어 있음이 입증되었다.

생체내 R83C의 교정을 위한 염기 편집을 통한 GSD-1a 병리의 역전

3주째에, 처리된 동형접합성 huR83C 마우스가 적절한 대사 기능을 나타내었으며, 대조군과 비교하여 도 12a에 더 어두운 색상의 막대로 나타낸 바와 같이 포도당, 트라이글리세리드, 콜레스테롤, 젖산 및 요산을 포함하여 거의 정상인 혈청 대사산물이 회복되었음이 검증되고 확인되었다. 더욱이, LNP 처리된 동형접합성 huR83C 마우스에서 G6PC 활성(생화학적으로 그리고 납-인산 염색을 통해 평가됨)에 대한 생화학적 검정의 결과는 한배 새끼 대조군의 결과와 일치하였다(도 12a).

간비대증은 GSD1a의 또 다른 임상 표현이며, 이는 주로 간에서의 과도한 글리코겐 및 지질 침착에 의해 유발된다. 염기 편집 후 동형접합성 huG6PC-R83C 마우스에서 간비대증의 정도를 평가하기 위해, 3주령의 신생아 마우스로부터 간 절편을 수집하고, 면역조직화학적 분석을 헤마톡실린 및 에오신(H&E), Oil red O 염색을 통해 수행하였다(도 12b). GSD-1a과 일치하는 무시할 수 있는 수준의 G6Pase 활성(도 12b, 중앙 패널, H&E)을 나타내는 동형접합성 마우스로부터의 간 절편에서 상당한 지질 침착(과도한 H&E 염색) 및 확대된 간세포를 시각화되었다. 회복된 G6PC 활성("HOM huR83C", 오른쪽 패널, 도 12b)을 보이는 염기 편집된 동형접합성 huG6PC-R83C 마우스의 경우에, 지질 침착은 상당히 감소되고 대조군과 일치하였으며(왼쪽 패널)(도 12b, 지질), 간세포 크기의 회복이 명백하였다. 따라서, 면역조직화학적 분석은 LNP 처리된 마우스에서의 정상적인 간세포 크기 및 지질 침착을 나타내었다(도 12b). 종합하면, 데이터는 R83C 돌연변이를 교정하며 GSD1a와 연관된 대사 결함 및 병리를 역전시키는 염기 편집의 능력을 보여준다. 또한, 이러한 데이터는 GsD-1a에 대한 염기 편집을 통해 기능 복원 및 긍정적인 임상 결과를 추가로 뒷받침한다.

본 실시예에 기술된 바와 같이, 시험관내 및 생체내에서 정확한 R83C의 교정을 달성한 신규한 아데닌 염기 편집기 및 가이드 RNA를 생성하고 검증하였다. ABE 및 gRNA의 LNP 매개성 전달은 대조군과 일치하는 간 G6Pase 활성 및 대사 기능의 회복과 함께 상당한 염기 편집 효율, 즉, 최대 약 60%의 염기 편집 효율을 나타내었다.

단일 LNP 용량 투여는 염기 편집을 통해 24시간 금식 동안 정상혈당을 유지한다

GSD-1a 병리의 특징적인 증상은 몇 분 이내에 혈당 수준이 급격히 감소하는 공복 저혈당증이다. huG6PC-R83C에 대해 동형접합성인 GSD-1a 트랜스제닉 마우스에서 전체 개념 입증 연구를 수행하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 염기 편집 치료 후 24시간(hr) 금식을 유지할 수 있는지 여부를 테스트하였다. 이 연구에서, LNP 처리된(1.5mpk) GSD-1a 동물 및 건강한 대조군에서 24시간 금식 후 100%의 동물 생존이 달성되었다. 또한, 정상적인 공복 혈당 수준을 대조군 마우스 및 처리된 마우스에서 24시간 금식 전후에 측정하였으며, 이는 저혈당 치료 역치(60 ㎎/㎗ 초과) 이상의 수준을 유지하였다(도 13).

R83C 돌연변이를 교정하기 위해 염기 편집기와 함께 사용하기 위한 G6PC 표적 서열

실시예 1에 기술된 G6PC 표적 서열 및 가이드 RNA 이외에, 본 명세서에 기재된 바와 같이 R83C 돌연변이를 교정하기 위한 염기 편집을 수행하기 위해 염기 편집기와 함께 사용될 수 있는 대체 G6PC 표적 서열은 표 7에 나타나 있는 것들을 포함한다. 도시된 바와 같이, 표적 서열은 PAM 및 사용하기에 적합한 본 명세서에 기재된 바와 같은 IBE와 같은 염기 편집기의 유형을 포함한다. 표 7의 프로토스페이서 서열에서, 표적화된 "A" 뉴클레오타이드(즉, A8 내지 A15)의 위치는 굵은 글씨/밑줄로 표시된다. G6PC gRNA 서열은 표 7에 표시된 G6PC 표적 서열의 상보체에 혼성화된다. PAM 서열(예를 들어, SpCas9)은 표 7에 밑줄이 그어져 있다.

표 7에 언급된 인레이된 염기 편집기(IBE)는 데아미네이스 도메인이 CRISPR-Cas 단백질, 예를 들어, Cas9의 내부에 있는(내부에 포매된) 구조를 갖는 Cas9 및 TadA의 구조를 지칭한다. IBE 구조는 다른 염기 편집기에 비해 더 광범위한 잠재적인 염기 편집 표적을 허용하며, 적절하게 배치된 Cas9 프로토스페이서 인접 모티프 서열의 요구 사항에 의해 제한되지 않는다. 이러한 IBE는 이동된 편집 창을 나타내고 더 큰 편집 효율을 나타내므로, DNA 및 RNA 표적외 편집 빈도가 감소하여 표준 편집 창 외부의 표적의 편집이 가능해졌다. 따라서, IBE는 표적 DNA를 표적화하는 데 사용되는 임의의 주어진 CRISPR-Cas 단백질에 대해 생성될 수 있는 편집 창의 범위를 확장시킴으로써 잠재적인 염기 편집 표적의 폭을 확장한다. 다양한 전략적 위치에서의 데아미네이스의 CRISPR 단백질로의 삽입을 통해, 데아미네이스의 활성 부위가 재배치되어 IBE가 전통적인 편집 창 외부에서 편집을 할 수 있게 된다. IBE 구조는 본 명세서의 상기 및 문헌[S. Haihua Chu et al., The CRISPR Journal, Vol. 4, No. 2; 2021년 4월 20일에 온라인 공개됨 (DOI: 10.1089/crispr.2020.0144)]에 기술되어 있다.

표 7의 G6PC 표적 서열의 상보체에 혼성화되는 gRNA 서열은 다음과 같다(5'에서 3'): CCACCAGUAUGGACACUGUC(서열번호 19); CACCAGUAUGGACACUGUCC(서열번호 20); ACCAGUAUGGACACUGUCCA(서열번호 21); CCAGUAUGGACACUGUCCAA(서열번호 22); CAGUAUGGACACUGUCCAAA(서열번호 23); AGUAUGGACACUGUCCAAAG(서열번호 24); GUAUGGACACUGUCCAAAGA(서열번호 25); 및 UAUGGACACUGUCCAAAGAG(서열번호 26).

본 명세서에 기재된 제품, 조성물 및 방법에 사용하기 위한 프로토스페이서 및 PAM 서열(5'에서 3')은 CAGTATGGACACTGTCCAAAGAGAAT(서열번호 17)이며, 여기서 PAM 서열인 GAGAAT에 밑줄이 그어져 있다. 위에 제시된 바와 같이, 표적 서열의 상보체에 혼성화되는 gRNA 서열은 CAGUAUGGACACUGUCCAAA(위 서열에 도시된 바와 같은 3' PAM 서열인 GAGAAT)(서열번호 2)이다.

본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 gRNA 서열은 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 gRNA 서열은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 2개의 예시적인 서열이 아래에 제공된다:

sgRNA_096: 23 nt 프로토스페이서

sgRNA_097: 34 nt 프로토스페이서

RNA 변형의 맥락에서, "s"는 선행하는 뉴클레오타이드가 3' 포스포티오에이트를 보유함을 나타내고, "m"은 다음 뉴클레오타이드가 2' OMe임을 나타낸다. 예를 들어, 포스포티오에이트 및 2'OMe를 갖는 뉴클레오타이드는 "mNs" 형태를 갖는다. 포스포티오에이트와 2'OMe를 둘 다 포함하는 2개의 연속 뉴클레오타이드가 있는 경우, 이는 "mNsmNs"로 표시된다.

실시예 7: 물질 및 방법

상기에 기술된 바와 같은 실시예 및 실험에 이용된 물질 및 방법이 아래에 제시되어 있다.

동물 관리

모든 동물 연구는 Taconic의 Excluded Flora 건강 표준에 따라 수행하였다. huG6PC-R83C 마우스의 생존을 유지시키기 위해, 포도당 요법은 마우스당 15% 포도당 100㎕ 내지 150㎕를 매일 피하 주사로 투여하는 것으로 이루어졌다. 염기 편집기 mRNA 및 gRNA를 사용한 LNP 처리 후 마우스에는 포도당 주사를 투여하지 않았다.

생체내 LNP 투여 작업 흐름

huG6PC-R83C 동형접합성 마우스에서 p.R83C 돌연변이를 교정하기 위해, 염기 편집기 mRNA와 gRNA의 LNP 복합제형을 생후 1일(P1)에 마우스의 중측두 정맥을 통해 1.5mpk(킬로그램당 밀리그램) 용량으로 투여하였다. LNP 처리된 마우스에는 포도당 요법을 투여하지 않았다. LNP 처리된 마우스는 표현형이 결정되는 시점인 이유기(21일)까지 각각의 어미에 의해 한배 새끼 대조군과 함께 계속 보살핌을 받았다. 모든 연구의 경우, 연령이 일치하는 야생형 및 이형접합성 huG6PC-R83C 한배 새끼를 대조군으로서 사용하였다. 제21일에, 간으로부터 채취한 게놈 DNA, 성장 특징 및 혈청 및 간 마커를 분석하였다.

지질 나노입자(LNP) 제형

염기 편집기(염기 편집기를 암호화하는 mRNA)와 가이드 RNA를 지질 나노입자에 1:1 중량비로 공동 캡슐화하였다. pH 3.0의 RNA 수용액과 다음 4가지 지질 구성요소: 이온화 가능한 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 지질 고정 PEG를 포함하는 에탄올 용액을 빠르게 혼합하여 LNP를 생성하였다. Precision Nanosystems의 벤치탑 미세유체 장치를 사용하여 두 용액을 혼합하였다. 혼합 후, 제형을 1x TBS(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 94158)에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다. 이후 100K MWCO Amicon Ultra 원심분리 튜브(Millipore Sigma, 카탈로그 번호 UFC910096)를 사용하여 농축시키고, 0.2미크론 필터(Pall corperation, 카탈로그 번호 4602)로 여과하였다. Quant-iT Ribogreen(ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 R11491)을 사용하여 총 RNA 농도를 결정하고; Malvern Panalytical Zetasizer를 사용하여 입자 크기를 결정하였다.

차세대 시퀀싱(NGS)

차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 LNP 처리된 동물의 전체 간 추출물로부터의 게놈 DNA에서 염기 편집된 대립유전자의 빈도를 결정하였다. LNP-치료 후, 마우스를 안락사시키고, 간 전체를 적출하여 액체 질소에 급속 동결시켰다. 동결된 마우스의 간을 Geno/Grinder 2010(Ops Diagnostics, 미국, 뉴저지주 레바논 소재)을 사용하여 분말 형태로 분쇄하고, 제조업체의 사양에 따라 Quick Extract 용해 완충액을 사용하여 간 분말로부터 게놈 DNA를 단리하였다. 게놈 DNA를 후속 PCR 증폭 단계에서 직접 사용하여 다음 프라이머 쌍: 정방향 프라이머, GGGCATTAAACTCCTTTGGG(서열번호 31) 및 역방향 프라이머, AGTCTCACAGGTTACAGGGA(서열번호 32)을 사용하여 huG6PC 엑손 2를 보유하는 약 170개의 뉴클레오타이드 단편을 생성하였다. NGS 어댑터를 추가하고, 제조업체의 지시에 따라 Illumina MiSeq 기기를 사용하여 생성된 앰플리콘을 시퀀싱하였다.

혈청 대사산물

혈청 대사산물을 측정하기 위해, R83C 인간화된 트랜스제닉 마우스로부터 혈액을 수집하였다. 그런 다음, 전혈로부터 혈청을 분리하여 추출하고, 이후 이를 대사 산물 검정에 사용하였다. 적절하고 포괄적인 연구 후 평가를 위해, 혈청 포도당, 혈청 콜레스테롤 및 혈청 트라이글리세리드를 모두 분석하였다. 혈청 포도당 및 혈청 콜레스테롤은 각각 ThermoFisher Scientific(미국, 매사추세츠주 월섬 소재) Infinity Glucose Liquid Stable 시약(카탈로그 번호: TR15421) 및 Infinity Cholesterol Liquid Stable 시약(카탈로그 번호: TR13421)을 사용하여 측정하였다. 혈청 트라이글리세리드는 Sigma-Aldrich(미국, 미주리주 세인트루이스 소재)의 Serum Triglyceride 정량 키트(카탈로그 번호: MAK266)를 사용하여 측정하였다. 요산은 제조업체 사양(Thermo Fisher Scientific(미국, 매사추세츠주 월섬 소재)에 따라 Uric Acid Liquid Stable 시약을 사용하여 측정하였다. 혈청 락테이트는 BioAssay Systems(미국, 캘리포니아주 헤이워드 소재)의 EnzyFluo L-락테이트 검정 키트를 사용하여 분석하였다.

마우스의 공복 혈당 분석은 음식 부족 24시간 전 및 후에 꼬리 정맥을 통한 혈액 샘플링을 포함하였다. 혈당 수준은 HemoCue Glucose 201 System(HemoCue America, 미국, 캘리포니아주 소재)을 사용하여 측정하였다.

동형접합성 hu G6PC -R83C 마우스에 대한 Kaplan-Meier 생존 추정치

Kaplan-Meier 생존 곡선을 생성하여 ABE mRNA(청록색)를 통한 염기 편집 후 또는 처리되지 않은(회색, 도 14) huG6PC-R83C에 대해 동형접합성인 신생아 트랜스제닉 마우스의 생존을 추정하였다. 다음 프라이머: 보편적인 정방향 프라이머(5'-ACCTACTGATGATGCACCTTTGATCAA태그AT-3'(서열번호 59)), 마우스 특정 역방향 프라이머(5'-CATCACCCCTCGGGATGGTTCTT-3'(서열번호 60)), 인간 특정 역방향 프라이머 1(5'-CAGCCCAGAATCCCAACCACAAAAT-3'(서열번호 61)) 및 인간 특정 역방향 프라이머 2(5'-AGACCAGCTCGACTTGGGATGG-3'(서열번호 62))를 사용하여 게놈 꼬리 DNA에 대한 PCR 분석을 통해 신생아 마우스의 유전자형을 분석하였다. huG6PC-R83C에 대해 동형접합성인 트랜스제닉 마우스에 대한 생존에 주목하였다. 처리되지 않은 마우스는 사산(n=6)되거나 8시간(n=6) 및 24시간(n=1)에 죽었다. 15% 포도당 주사를 투여하면 생존이 32시간(n=5), 48시간(n=2) 및 56시간(n=2)으로 연장되었다. huG6PC-R83C에 대해 동형접합성인 모든 ABE-처리된 마우스는 연구 종료 후 3주까지 생존하였다.

글루코스-6-포스파테이스-알파 활성 검정

간 마이크로솜 단리 및 마이크로솜 포스포하이드롤레이스 검정은 문헌[Lei, K.-J., et al., 1996, Nature Genetics, 13(2):203-9]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 문헌[Arnaotova et al. (2021, Mol. Therapy., Vol. 29, No 4)]의 검정 방법론은 다음 문헌["Glucose-6-phosphatase dependent substrate transport in the glycogen storage disease type-1a mouse. Nat. Genet. 13, 203-209]에서와 같이 설명된다. 포스포하이드롤레이스 검정에서, 50mM 소듐 카코딜레이트 완충액(pH 6.5), 2mM EDTA, 10mM 글루코스-6-포스페이트(G6P) 및 적절한 양의 마이크로솜 제제를 포함하는 반응 혼합물(50㎕)을 30℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 온전한 막을 0.2% 데옥시콜레이트에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 파괴된 마이크로솜 막을 제조하였다. 산에 불안정한 G6Pase-알파를 불활성화시키기 위해 파괴된 마이크로솜 제제를 pH 5에서 37℃에서 10분 동안 사전 인큐베이션하여 비특이적 포스파테이스 활성을 추정하였다. G6Pase-알파 활성의 1단위는 마이크로솜 단백질 ㎎당 분당 1n㏖의 G6P 가수분해를 나타낸다. 마이크로솜 G6Pase-알파 검정에 대한 낮은 정량 수준은 2 단위이다.

G6Pase-알파의 효소 조직화학적 분석은 문헌[Lee, Y.M., Jun, H.S. Pan, C.-J. Lin, S.R., Wilson, L.H., Mansfield, B.C., and Chou, J.Y. (2012). Prevention of hepatocyellular adenoma and correction of metabolic abnormalities in murine glycogen storage disease type Ia by gene therapy. Hepatology 56, 1719-1729]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 문헌[Arnaotova et al., (2021, Mol. Therapy., Vol. 29, No 4)]에 기술되어 있는 바와 같이, 10㎛ 두께의 간 조직 절편을 40mM Tris-말리에이트(pH 6.5), 10mM G6P, 300mM 수크로스 및 3.6mM 질산납을 포함하는 용액에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 헹군 후, 간 절편을 0.09% 암모늄 설파이드 용액에서 실온에서 2분 동안 인큐베이션하고, 포획된 인산납을 갈색의 황화납으로 전환한 다음 시각화하였다.

면역조직화학

면역조직화학적 절차는 문헌[Arnaotova et al., 2021, Mol. Therapy., Vol. 29, No 4]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 간략하게는, 10% 중성 완충 포르말린에 보존된 간 절편에 대해 H&E 염색을 수행하고, 표준 절차에 따라 냉동 보존된 최적의 절단 온도 화합물(OCT)에 포매된 간 절편에 대해 Oil Red O 염색을 수행하였다. 염색된 절편을 Axiocam 506 카메라와 Zen 2.6 소프트웨어(Carl Zeiss, 미국, 뉴욕주 화이트 플레인스 소재)를 갖춘 Imager A2m 현미경을 사용하여 시각화하였다.

실시예 8: NLS는 가이드 RNA의 핵 유입을 촉진한다

본 실시예에서, 가이드 RNA의 핵 유입에 대한 핵 국재화 신호의 효과를 평가하였다.

간략하게는, 핵 국재화 신호(NLS) 펩타이드(도 15a)에 융합된 gRNA 및 NLS가 없는 동족 대조군 gRNA(도 15b)를 Cy5.5 염료로 형광 표지하였다. 비변형된 그리고 NLS 변형된 gRNA로 인간 간세포를 리포펙션시키고, 리포펙션 후 24시간 및 48시간에 형광을 현미경으로 측정하였다. 정량화를 위해 NucBlue 염색을 사용하여 핵 외피를 청색으로 대조염색하였다(도 15c).

결과는 NLS 펩타이드에 접합되지 않은 gRNA(도 15d)와 비교하여 NLS 펩타이드에 접합된 경우(도 15e) gRNA가 핵에 더 효율적으로 국재화됨을 보여주었다.

상대 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI)는 도 15f에 도시된 바와 같이 정량화되었다. 결과는 ABE 8.8을 단독으로 사용하여 관찰된 MFI가 PBS 처리를 사용한 배경 형광과 비슷하였지만, gRNA를 사용한 ABE 8.8은 약 300 MFI 단위까지 형광을 증가시킨 것으로 나타났다. 그러나, gRNA가 NLS에 접합된 경우, 형광이 약 500 MFI 단위로 증가하였다. gRNA 단독은 약 300 MFI 단위의 형광을 보인 반면, NLS에 접합된 gRNA를 첨가하면 약 550 MFI 단위까지 형광을 증가시켰다.

전반적으로, 이 연구로부터의 결과는 gRNA가 NLS에 접합될 때 핵에 효과적으로 국재화됨을 보여주었다.

실시예 9: NLS-gRNA는 마우스의 간에서 높은 효능의 유전자 편집을 보여준다

본 실시예에서, 낮은 용량의 NLS gRNA를 투여한 huG6PC-R83C 동형접합성 마우스의 간에서 유전자 편집의 효능을 조사하였다.

간략하게는, huG6PC-R83C 동형접합성 마우스에서 p.R83C 돌연변이를 교정하기 위해, 실시예 7에 이전에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 유형 1 말단 변형이 있는 NLS-gRNA(EM1)를 생후 1일(P1)에 마우스의 중측두 정맥을 통해 0.25mpk(킬로그램당 밀리그램) 용량의 포화 이하의 용량으로 투여하였다. NLS 접합체는 3' 말단에 접합될 때 saCas9 효과기와 상용성인 것으로 밝혀졌다(도 16). 본 실시예에서, 5% 말단 변형 gRNA 및 또는 25% 중질 변형 saHM03 gRNA도 동시에 테스트하였다. 서열은 아래와 도 17a에 제공된다.

도 17b의 결과에 도시된 바와 같이, NLS-gRNA는 말단 변형 gRNA 또는 중질 변형 saHM03의 경우 5% 미만인 것에 비해 10% 초과의 A에서 G로의 염기 편집을 나타내었다.

전반적으로, 결과는 NLS-gRNA가 말단 변형 gRNA에 비해 효능이 2배 이상 증가하였음을 보여주었다. 결과는 NLS-gRNA가 높은 효능의 유전자 편집을 초래한다는 것을 보여주었다.

기타 실시형태

전술한 설명으로부터, 다양한 용도 및 조건에 적합화되도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 실시형태에 변형 및 수정이 이루어질 수 있다는 것이 명백해질 것이다. 이러한 실시형태도 다음 청구범위의 범위 내에 있다.

본 명세서에서 변수의 임의의 정의에 포함된 요소 목록의 설명은 나열된 요소의 임의의 단일 요소 또는 조합(또는 하위 조합)으로서의 해당 변수의 정의를 포함한다. 본 명세서의 실시형태에 대한 설명은 해당 실시형태를 임의의 단일 실시형태로서 또는 임의의 다른 실시형태 또는 이의 일부와 조합된 형태로서 포함한다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 원용되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 달리 명시하지 않으면, 본 명세서에 언급된 간행물, 특허 및 특허 출원은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

등가물 및 범위

당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 제한되는 것이 아니라, 다음의 청구범위에 제시된 바와 같다.

Claims

가이드 RNA(gRNA)로서, 링커를 통해 gRNA에 연결된 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS)를 포함하되, 상기 링커는 상기 gRNA의 3' 또는 5' 말단에 접합된 시스테인 잔기를 포함하는, gRNA.
제1항에 있어서, 상기 gRNA는 하나 이상의 변형을 포함하는, gRNA.
제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 2'-OMe, 2'-플루오로 또는 포스포로티오에이트 연결인, gRNA.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 gRNA는 상기 3' 말단 및/또는 상기 5' 말단에 하나 이상의 변형을 포함하는, gRNA.
제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 상기 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 뉴클레오타이드에서 발생하는, gRNA.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 상기 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 뉴클레오타이드에서 발생하는, gRNA.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA의 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과의 뉴클레오타이드가 변형되는, gRNA.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLS는 유인원 바이러스 40(SV40)으로부터 유래되는, gRNA.
제8항에 있어서, 상기 NLS는 KKKRKV의 아미노산 서열(서열번호 57)을 포함하는, gRNA.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 펩타이드 스페이서를 추가로 포함하는, gRNA.
제10항에 있어서, 상기 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열(서열번호 58)을 포함하는, gRNA.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 gRNA를 상기 펩타이드 스페이서 또는 상기 NLS에 접합시키는 화학적 모이어티를 추가로 포함하는, gRNA.
제12항에 있어서, 상기 화학적 모이어티는 상기 펩타이드 스페이서 또는 상기 NLS 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 상기 gRNA의 3' 말단에 공유적으로 부착되는, gRNA.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 화학적 모이어티는 상기 펩타이드 스페이서 또는 상기 NLS의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는, gRNA.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학적 모이어티는 말레이미드-티올 부가물을 포함하는, gRNA.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLS를 포함하는 gRNA는 상기 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 염기 편집 효율을 개선시키는, gRNA.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 단일-가이드 RNA(sgRNA), tracrRNA 또는 crRNA인, gRNA.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 SaCas9 백본 서열을 포함하는, gRNA.
제18항에 있어서, 상기 gRNA는 SaCas9 또는 이의 변이체에 결합될 때 상기 핵산 서열 5'-NNGRRT-3' 또는 5'-GAGAAT-3'에 대한 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif: PAM) 특이성을 갖는, gRNA.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 핵산 서열: 5'-CAGUAUGGACACUGUCCAAA-3'(서열번호 2)를 포함하는, gRNA.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 다음 핵산 서열:

중 하나를 포함하거나 이로 이루어지는, gRNA.
지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP)와 회합되거나 이에 캡슐화되는 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 gRNA를 포함하는 조성물.
제22항에 있어서, 상기 LNP는 염기 편집기를 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하며;
(i) 선택적으로 상기 염기 편집기는 Cas9 도메인 및 적어도 하나의 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인을 포함하되, 상기 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 하기 아미노산 서열:

의 82번 아미노산 위치의 글리신(G), 147번 아미노산 위치의 트레오닌(T) 또는 아스파르트산(D), 154번 아미노산 위치의 세린(S)과, 36번 아미노산 위치의 히스티딘(H), 76번 아미노산 위치의 타이로신, 149번 아미노산 위치의 타이로신, 157번 아미노산 위치의 라이신(K) 및 167번 아미노산 위치의 아스파라긴(N) 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경을 포함하고, 상기 아데노신 데아미네이스는 상기 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성을 갖고;
(ii) 선택적으로 상기 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 하기 서열번호 3:

과 관련하여 임의의 다음 변경의 조합,
a) I76Y + V82G + Y147T + Q154S;
b) L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K;
c) V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N;
d) L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N;
e) L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K;
f) I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N;
g) Y147D + F149Y + D167N;
h) L36H; I76Y; V82G; Q154S; 및 N157K;
i) I76Y; V82G; Q154S; 또는
j) L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N
또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경의 조합을 포함하고;
(iii) 선택적으로 상기 아데노신 데아미네이스 변이체는 서열번호 3의 다음 변경의 조합 I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경을 포함하고;
(iv) 선택적으로 상기 Cas9 도메인은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9(SaCas9)이고;
(v) 선택적으로 상기 mRNA는 하기 아미노산 서열:

또는 이와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어지는 염기 편집기를 암호화하는, 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 gRNA를 포함하는 조성물로서, 뉴클레이스 또는 상기 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 gRNA를 포함하는 조성물로서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 조성물.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 gRNA 및 상기 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 1:1 내지 10:1 비로 포함하는, 조성물.
제26항에 있어서, 상기 조성물은 gRNA 및 상기 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 1:1 비로 포함하는, 조성물.
제26항에 있어서, 상기 조성물은 gRNA 및 상기 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 3:1 비로 포함하는, 조성물.
제20항에 있어서, 상기 조성물은 gRNA 및 상기 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 9:1 비로 포함하는, 조성물.
제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레이스 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인은 Cas 단백질인, 조성물.
제30항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9인, 조성물.
제30항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cpf1, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j, Cas12k 또는 Cas13인, 조성물.
제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레이스 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인은 닉케이스인, 조성물.
제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레이스 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인은 변형되는, 조성물.
제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레이스 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인은 이종성 폴리펩타이드에 융합되는, 조성물.
제35항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 데아미네이스 도메인인, 조성물.
복합체로서,
(i) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인 및 적어도 하나의 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인으로서, 상기 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 하기 아미노산 서열

의 82번 아미노산 위치의 글리신(G), 147번 아미노산 위치의 트레오닌(T) 또는 아스파르트산(D), 154번 아미노산 위치의 세린(S)과 36번 아미노산 위치의 히스티딘(H), 76번 아미노산 위치의 타이로신, 149번 아미노산 위치의 타이로신, 157번 아미노산 위치의 라이신(K) 및 167번 아미노산 위치의 아스파라긴(N) 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경을 포함하되, 상기 아데노신 데아미네이스는 상기 아미노산 서열과 적어도 약 85%의 동일성을 갖는, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인 및 적어도 하나의 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인; 및
(ii) 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 gRNA
를 포함하는, 복합체.
복합체로서,
(i) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인 및 적어도 하나의 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인으로서, 상기 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 하기 서열번호 3:

과 관련하여 임의의 다음 변경의 조합:
a) I76Y + V82G + Y147T + Q154S;
b) L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K;
c) V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N;
d) L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N;
e) L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K;
f) I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N;
g) Y147D + F149Y + D167N;
h) L36H; I76Y; V82G; Q154S; 및 N157K;
i) I76Y; V82G; Q154S; 또는
j) L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N
또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경의 조합을 포함하는, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인 및 적어도 하나의 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인; 및
(ii) 제1항 내지 제21항 중 임의의 gRNA
를 포함하는, 복합체.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스는 서열번호 3과 적어도 약 90% 또는 약 95%의 동일성을 갖는, 복합체.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스는 서열번호 3을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지는, 복합체.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스 변이체는 서열번호 3의 다음 변경의 조합 I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경을 포함하는, 복합체.
제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인은 Cas9인, 복합체.
제42항에 있어서, 상기 Cas9는 뉴클레이스 활성이 없는 Cas9(dCas9), Cas9 닉케이스(nCas9) 또는 뉴클레이스 활성이 있는 Cas9를 포함하는, 복합체.
제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 Cas9는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9(SaCas9), 스트렙토코커스 써모필루스 1(Streptococcus thermophilus 1) Cas9(St1Cas9), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9) 또는 이들의 변이체인, 복합체.
제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능 DNA 결합 도메인 내부에 있는, 복합체.
약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 gRNA, 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항의 복합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하는 데 사용하기 위한 제46항의 약제학적 조성물.
조성물로서,
(a) Cas 단백질;
(b) 링커를 통해 gRNA에 연결된 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 gRNA
를 포함하는 조작되거나 비자연 발생적인 CRISPR 관련 Cas(CRISPR-Cas) 시스템을 포함하되;
상기 링커는 상기 gRNA의 3' 말단에 접합된 시스테인 잔기를 포함하고; 그리고
상기 gRNA는 Cas 단백질과 복합체를 형성하고 상기 Cas 단백질을 표적 DNA로 표적화할 수 있는, 조성물.
제48항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 이종성 폴리펩타이드에 융합되는, 조성물.
제49항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 데아미네이스 도메인인, 조성물.
제50항에 있어서, 상기 데아미네이스 변이체 도메인은 하기 아미노산 서열

의 82번 아미노산 위치의 글리신(G), 147번 아미노산 위치의 트레오닌(T) 또는 아스파르트산(D), 154번 아미노산 위치의 세린(S)과 36번 아미노산 위치의 히스티딘(H), 76번 아미노산 위치의 타이로신, 149번 아미노산 위치의 타이로신, 157번 아미노산 위치의 라이신(K) 및 167번 아미노산 위치의 아스파라긴(N) 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경을 포함하되, 상기 아데노신 데아미네이스는 상기 아미노산 서열과 적어도 약 85%의 동일성을 갖는, 조성물.
제51항에 있어서, 상기 데아미네이스 변이체 도메인은 서열번호 3

과 관련하여 임의의 다음 변경의 조합
a) I76Y + V82G + Y147T + Q154S;
b) L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K;
c) V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N;
d) L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N;
e) L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K;
f) I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N;
g) Y147D + F149Y + D167N;
h) L36H; I76Y; V82G; Q154S; 및 N157K;
i) I76Y; V82G; Q154S; 또는
j) L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N
또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경의 조합
을 포함하는, 조성물.
제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스는 서열번호 3과 적어도 약 90%의 동일성을 갖는, 조성물.
제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스는 서열번호 3과 적어도 약 95%의 동일성을 갖는, 조성물.
제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스는 서열번호 3을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지는, 조성물.
제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스 변이체는 서열번호 3의 다음 변경의 조합 I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N 또는 또 다른 아데노신 데아미네이스의 상응하는 변경을 포함하는, 조성물.
제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 Cas9인, 조성물.
제57항에 있어서, 상기 Cas9는 뉴클레이스 활성이 없는 Cas9(dCas9), Cas9 닉케이스(nCas9) 또는 뉴클레이스 활성이 있는 Cas9를 포함하는, 조성물.
제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 Cas9는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9(SaCas9), 스트렙토코커스 써모필루스 1 Cas9(St1Cas9), 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9) 또는 이들의 변이체인, 조성물.
제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 핵산 서열: 5'-CAGUAUGGACACUGUCCAAA-3'(서열번호 2)를 포함하는, 조성물.
제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미네이스 변이체 도메인은 상기 Cas 단백질 내부에 있는, 조성물.
제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 하나 이상의 변형을 포함하는, 조성물.
제62항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 2'-OMe, 2'-플루오로 또는 포스포로티오에이트 연결인, 조성물.
제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 상기 3' 말단 및/또는 상기 5' 말단에 하나 이상의 변형을 포함하는, 조성물.
제64항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형이 상기 gRNA의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 뉴클레오타이드에서 발생하는, 조성물.
제64항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형이 상기 gRNA의 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 뉴클레오타이드에서 발생하는, 조성물.
제51항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA의 뉴클레오타이드40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과가 변형되는, 조성물.
제51항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLS는 유인원 바이러스 40(SV40)으로부터 유래되는, 조성물.
제68항에 있어서, 상기 NLS는 KKKRKV의 아미노산 서열(서열번호 57)을 포함하는, 조성물.
제51항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 펩타이드 스페이서를 추가로 포함하는, 조성물.
제70항에 있어서, 상기 펩타이드 스페이서는 KRTADGSEFESP의 아미노산 서열(서열번호 58)을 포함하는, 조성물.
제51항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 gRNA를 상기 펩타이드 스페이서 또는 상기 NLS에 접합시키는 화학적 모이어티를 추가로 포함하는, 조성물.
제51항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLS를 포함하는 gRNA는 상기 NLS가 없는 gRNA와 비교하여 염기 편집 효율을 개선시키는, 조성물.
제40항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 단일-가이드 RNA(sgRNA), tracrRNA 또는 crRNA인, 조성물.
유전자 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전자 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 gRNA, 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물, 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항의 복합체, 제46항 또는 제47항의 약제학적 조성물 또는 제48항 내지 제74항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
글리코겐 축적 질환 유형 1a(Glycogen Storage Disease Type 1a: GSD1a)를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항 또는 표 7의 G6PC 표적 서열의 상보체에 혼성화되는 gRNA, 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물, 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항의 복합체, 제46항 또는 제47항의 약제학적 조성물 또는 제51항 내지 제74항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조성물로서,
(a) saCas9 단백질;
(b) Cas9 단백질에 융합된 아데노신 데아미네이스 변이체;
(c) 링커를 통해 gRNA에 연결된 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 gRNA
를 포함하는 조작되거나 비자연 발생적인 CRISPR 관련 Cas(CRISPR-Cas) 시스템을 포함하되;
상기 링커는 상기 gRNA의 3' 말단에 접합된 시스테인 잔기를 포함하고; 그리고
상기 gRNA는 saCas9 단백질과 복합체를 형성하고 saCas9 단백질을 표적 DNA에 표적화할 수 있고;
상기 아데노신 데아미네이스 변이체는 서열번호 3과 관련하여 V82G, Y147T/D, Q154S와 L36H, I76Y, F149Y, N157K 및 D167N 중 하나 이상을 포함하고; 그리고
상기 gRNA는 서열번호 2를 포함하는, 조성물.
세포에서 표적 핵산을 변경시키는 방법으로서,
상기 세포를 뉴클레이스 및 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 gRNA와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 gRNA는 직접 반복 서열 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 스페이서 서열을 포함하고,
상기 Cas9 단백질은 상기 gRNA에 결합할 수 있고, 상기 gRNA와 상보적인 표적 핵산 서열에 변형을 일으킬 수 있는, 방법.
진핵생물 세포에서 표적 핵산의 발현을 변경시키는 방법으로서,
상기 세포를 뉴클레이스 및 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 gRNA와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 sRNA는 직접 반복 서열 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 스페이서 서열을 포함하고,
상기 Cas9 단백질은 상기 gRNA에 결합할 수 있고, 상기 gRNA와 상보적인 표적 핵산 서열에 변형을 일으킬 수 있는, 방법.
제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 방법은 유전자의 염기 편집을 초래하는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 gRNA를 포함하는 조작된 비자연 발생적 CRISPR-Cas 시스템.
핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 가이드 RNA를 제조하는 방법으로서,
3' 말단에 아민기를 포함하는 gRNA를 NLS 서열 및 N-말단에 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드와 접촉시켜 gRNA가 상기 NLS에 접합되도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
조성물로서, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 gRNA를 포함하되, 상기 조성물의 핵 전달은 NLS가 없는 gRNA를 포함하는 조성물에 비해 약 2배 내지 5배 증가되는, 조성물.
제83항에 있어서, 상기 gRNA는 표 8의 서열 중 어느 하나와 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 조성물.
제46항 내지 제74항 및 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집 효율은 NLS가 없는 gRNA에 비해 약 2배 내지 5배 증가되는, 조성물.
제76항에 있어서, 상기 gRNA 표적 서열은 서열번호 17과 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 방법.
제76항에 있어서, 상기 gRNA는 간, 신장, 뇌 및 심장으로부터 선택되는 기관 중 하나 이상을 표적으로 하는, 방법.
제87항에 있어서, 상기 gRNA는 간을 표적으로 하는, 방법.