JP2023127483A - ２’位にアミノスルホニルアルコキシ基を有する新規人工核酸 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、生体内で分解されずにかつ標的核酸（特にＲＮＡ）に対する結合能を保持した人工核酸、及び該人工核酸を組み込んだ、臨床に適用可能なアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチジーン核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、又はリボザイムを提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、核酸の五炭糖の２’位にアミノスルホニルアルコキシ基を導入した人工核酸を製造し、該人工核酸を組み込んだアンチセンス核酸等が提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、生体内で分解されずにかつ標的核酸に対する結合能を保持した新規人工核酸に関する。さらに、本発明は、該人工核酸を組み込んだアンチセンス核酸等に関する。
核酸医薬の一つであるアンチセンス核酸（ＡＳＯ）の開発研究として、アンチセンス核酸に標的選択性の向上や生体内安定性の強化など、ＡＳＯの性質を変化させる修飾を付加することが重要であると考えられる。
これまでに承認されているＡＳＯの最も広く使用されている化学修飾は２’部位へのメトキシエチル基またはメチル基の導入やリン酸結合部位の硫化（ホスホロチオエート、Ｐ＝Ｓ結合）である。ＡＳＯとして用いられる際の２’部位はメチル基やメトキシエチル基とアルキル基による修飾に限られている。
２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾は人工核酸ＡＳＯに核酸分解酵素に対する耐性を付与し、ＲＮＡとの親和性を向上させることが報告されている（非特許文献１）。現在までに承認されているＡＳＯの一つであるＩｎｏｔｅｒｓｅｎ（非特許文献２）をみてみると、全ての２’部位の修飾にメトキシエチル基が用いられており、またリン酸結合部位がすべて硫化されたホスホロチオエート（ＰＳ）修飾と共に使用されている。
doi.10.1038/9304
https://www.nature.com/articles/s41573-020-0075-7
本発明は、生体内で分解されずにかつ標的核酸（特にＲＮＡ）に対する結合能を保持した人工核酸、及び該人工核酸を組み込んだ、臨床に適用可能なアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチジーン核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、及びリボザイムを提供することを目的とする。
本発明者らは、アンチセンス核酸（ＡＳＯ）の生体内安定性の向上などの性質を変化させる機能を付与するために２’部位に焦点を当てた。上記の通り、従来の核酸に導入されたメトキシエチル基の構造はメチルエチルエーテル構造であり、さらに修飾を施すことはできず、別の機能を付加させることは難しい。
これまでに標的となる配列との二重鎖を形成した際には安定性を損なわず、メトキシエチル基と同等の酵素耐性を有する２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］修飾核酸を含む様々なカルバモイルエチル型修飾核酸を開発してきた（doi: 10.1021/jo101963z）。これらすべてに共通する興味深い特性は、フェニル基などの嵩高い置換基、カルボキシ基などのアニオン性置換基、またはベンズイミダゾールなどのカチオン性置換基、オクチル基などの疎水性残基を導入しても、二本鎖の安定性が低下しないことである（doi: 10.1016/j.bmcl.2021.127779;doi:10.1039/C4OB01260G;doi: 10.1039/c9ob00668k）。そこで、カルバモイルエチル型修飾核酸と同様に種々の機能を付加が可能となるような２’－修飾の新たな基本骨格を開発しようと考えた。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、核酸の五炭糖の２’位にアミノスルホニルアルコキシ基を導入した人工核酸を製造し、該人工核酸を組み込んだアンチセンス核酸が生体内で分解されずにかつ標的核酸に対する結合能を保持することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］五炭糖の２’位にアミノスルホニルアルコキシ基を有する人工核酸。
［２］下記の式（Ｉ）：
［１］五炭糖の２’位にアミノスルホニルアルコキシ基を有する人工核酸。
［２］下記の式（Ｉ）：
［式中、
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基であり；
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なり、水素原子、水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、保護基で保護されたリン酸基、又は－Ｐ（ＯＲ４）Ｒ５〔ここで、Ｒ４は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり；Ｒ５は、－Ｎ（Ｒ６）２（ここで、Ｒ６は、独立して、Ｃ１～６アルキル基、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルであるか、又は２つのアルキル基が互いに結合して環を形成する）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基である〕であり；
Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヒドロキシアルキル、及びアミノアルキルからなる群から選択され；
Ｘは、Ｃ１～５アルキレン基である］
で表される、［１］に記載の人工核酸。
［３］Ｒ１が、水素原子、又は水酸基の保護基であり；
Ｒ２が、リン酸基であり；
Ｒ３が、メチル基である、
［１］に記載の人工核酸。
［４］アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチジーン核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、又はリボザイム導入するための、［１］～［３］のいずれか１つに記載の人工核酸。
［５］５～１５塩基のデオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有する架橋型のアンチセンス核酸であって、前記ウイング領域又はギャップ領域において、［１］～［４］のいずれか１つに記載の人工核酸が１個又は複数個が挿入され、及び／又は天然の塩基を有する核酸がそれにより置換されている、上記アンチセンス核酸。
［６］２’，４’－修飾された核酸が、下記：
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基であり；
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なり、水素原子、水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、保護基で保護されたリン酸基、又は－Ｐ（ＯＲ４）Ｒ５〔ここで、Ｒ４は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり；Ｒ５は、－Ｎ（Ｒ６）２（ここで、Ｒ６は、独立して、Ｃ１～６アルキル基、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルであるか、又は２つのアルキル基が互いに結合して環を形成する）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基である〕であり；
Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヒドロキシアルキル、及びアミノアルキルからなる群から選択され；
Ｘは、Ｃ１～５アルキレン基である］
で表される、［１］に記載の人工核酸。
［３］Ｒ１が、水素原子、又は水酸基の保護基であり；
Ｒ２が、リン酸基であり；
Ｒ３が、メチル基である、
［１］に記載の人工核酸。
［４］アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチジーン核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、又はリボザイム導入するための、［１］～［３］のいずれか１つに記載の人工核酸。
［５］５～１５塩基のデオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有する架橋型のアンチセンス核酸であって、前記ウイング領域又はギャップ領域において、［１］～［４］のいずれか１つに記載の人工核酸が１個又は複数個が挿入され、及び／又は天然の塩基を有する核酸がそれにより置換されている、上記アンチセンス核酸。
［６］２’，４’－修飾された核酸が、下記：
〔式中、
Ｒ７は、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ８及びＲ９は、同一であるか又は異なり、各々独立して、水素原子、又は構造：
Ｒ７は、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ８及びＲ９は、同一であるか又は異なり、各々独立して、水素原子、又は構造：
（式中、
は、隣接する核酸との結合点、又はＯＨであり；及び
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択される、［５］に記載のアンチセンス核酸。
［７］［１］～［４］のいずれか１つに記載の人工核酸を製造する方法であって、
下記の式（ＩＩ）：
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択される、［５］に記載のアンチセンス核酸。
［７］［１］～［４］のいずれか１つに記載の人工核酸を製造する方法であって、
下記の式（ＩＩ）：
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＢは、請求項１に定義される通りである〕
で表される出発物質をＣ１～５アルキレングリコールと反応させて、下記の式（ＩＩＩ）：
で表される出発物質をＣ１～５アルキレングリコールと反応させて、下記の式（ＩＩＩ）：
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＢは、請求項１に定義される通りであり；
Ｘ’は、Ｃ２～４アルキレン基である〕
で表される化合物を得、さらにＸに結合した水酸基をアルデヒドに酸化後、Ｈｏｒｎｅｒ－Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ－Ｅｍｍｏｎｓ（ＨＷＥ）反応により増炭させて、下記の式（Ｉ）：
Ｒ１、Ｒ２、及びＢは、請求項１に定義される通りであり；
Ｘ’は、Ｃ２～４アルキレン基である〕
で表される化合物を得、さらにＸに結合した水酸基をアルデヒドに酸化後、Ｈｏｒｎｅｒ－Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ－Ｅｍｍｏｎｓ（ＨＷＥ）反応により増炭させて、下記の式（Ｉ）：
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｂ、及びＸは、請求項１に定義される通りである〕
で表される生成物を得ることを含む方法。
で表される生成物を得ることを含む方法。
本発明によれば、新規人工核酸の提供により、生体内で分解されずにかつ標的核酸に対する結合能を保持したアンチセンス核酸医薬等を提供することができる。
本発明は、生体内で分解されずにかつ標的核酸に対する結合能を保持した新規人工核酸、及び該人工核酸を組み込んだアンチセンス核酸等に関する。
上記の通り、これまでに、本発明者らは、標的核酸配列との二重鎖を形成した際に安定性を損なわず、メトキシエチル基と同等の酵素耐性を有するカルバモイルエチル型修飾核酸を開発してきた。一般的に、カルバモイルエチル構造はカルボキシアミド構造を有しており、アミド構造は酸や塩基性条件に対して非常に安定である。そこで、本発明者らは、同じアミド構造を有するスルホンアミドに着目し、スルホンアミド構造を有し、核酸への機能付加可能な足場となる新たな２’－修飾基を導入した人工核酸を開発することにした。
本発明によれば、核酸の五炭糖の２’位にアミノスルホニルアルコキシ基が導入された人工核酸が提供される。以下、本発明にかかる新規人工核酸について詳述する。
（１）人工核酸
本発明の人工核酸は、五炭糖の２’位にアミノスルホニルアルコキシ基を有することによって特徴付けられ、より具体的には、下記の式（Ｉ）：
本発明の人工核酸は、五炭糖の２’位にアミノスルホニルアルコキシ基を有することによって特徴付けられ、より具体的には、下記の式（Ｉ）：
で表されるものである。
上記式中、Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基であり、核酸塩基は、天然核酸塩基又は非天然核酸塩基であり得る。「天然核酸塩基」とは、一般的に、自然界に存在する核酸を構成する核酸塩基であって、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルを指す。一方、「非天然核酸塩基」とは、天然核酸塩基以外の任意の核酸塩基を指し、天然核酸塩基と同様の又は類似して性質及び構造を有するものを指す。本発明では、保護基又は修飾基を有する核酸塩基は、非天然核酸塩基に含まれるものとする。
「保護基」には、水酸基、リン酸基、アミノ基、及びカルボニル基に対する保護基が含まれる。「水酸基の保護基」としては、限定されないが、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）を使用しているが、これに限定されず、例えば、ニトロベンジル基、ニトロフェニルエチルエステル基（ＮＰＥ）、ジメトキシニトロベンジルエステル基（ＤＭＮＢ）、ブロモヒドロキシクマリン（Ｂｈｃ）基、ジメトキシベンゾイン基、２－ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）基、２－ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）基、５’－（α－メチル－２－ニトロピペロニル）オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）基、２－（２－ニトロ－４－エチル－５－チオフェニルフェニル）プロピルオキシカルボニル（ＰｈＳＮＰＰＯＣ）基、α－メチル－２－ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）基、２，６－ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＤＮＢＯＣ）基、α－メチル－２，６－ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＭｅＤＮＢＯＣ）基、１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）基、１－メチル－１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＥＯＣ）基、９－アントラセニルメチルオキシカルボニル（ＡＮＭＯＣ）基、１－ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＭＯＣ）基、３’－メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）基、３’，５’－ジメトキシベンゾイルオキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）基、７－ニトロインドリニルオキシカルボニル（ＮＩＯＣ）基、５，７－ジニトロインドリニルオキシカルボニル（ＤＮＩＯＣ）基、２－アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）基、α，α－ジメチル－３，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、５－ブロモ－７－ニトロインドリニルオシキカルボニル（ＢＮＩＯＣ）基、トリアルキルシリル（例えば、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、トリエチルシリル、トリメチルシリル、トリイソプロピルシリル）等が挙げられる。
「リン酸基の保護基」としては、限定されないが、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基等が挙げられる。
「アミノ基の保護基」としては、限定されないが、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
「カルボニル基の保護基」としては、限定されないが、フェニル基、２，５－ジクロロフェニル基、３－クロロフェニル基、３，５－ジクロロフェニル基、２－ホルミルフェニル基、２－ナフチル基、４－メトキシフェニル基、４－クロロフェニル基、２－ニトロフェニル基、４－ニトロフェニル基、４－アセチルアミノフェニル基、ペンタフルオロフェニル基、４－ピバロイロキシベンジルアルコール、４－ニトロフェネチルアルコール、２－（メチルスルフォニル）エチル基、２－（フェニルスルフォニル）エチル基、２－シアノエチル基、２－（トリメチルシリル）エチル基、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルフェニルカルバモイル、１－ピロリジンカルバモイル、４－モルフォリンカルバモイル、ジフェニルカルバモイル等が挙げられる。
「修飾基」とは、核酸塩基に導入される保護基を含む概念であるが、特に、天然核酸塩基の構造と区別するために新たに付加される基である。「修飾基」には、上記の各種保護基の他、置換されてもよいアルキル基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン、アリール基、アミノ基、アルコキシ基等であり得る。「アルキル基」とは、直鎖、分枝鎖又は環状の１価の脂肪族飽和炭化水素基を指し、好ましくは炭素原子数１～６のアルキル基、より好ましは炭疽原子数１～３のアルキル基である。「アルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。「アラルキル基」とは、１又は２個以上のアリール基で置換されたアルキル基を指し、炭素原子数７～１５のアラルキル基が好ましく、炭素原子数７～１１のアラルキル基がより好ましい。「アラルキル基」としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、２－ナフチルメチル基等が挙げられる。「アルケニル基」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する直鎖、分枝鎖又は環状の１価の不飽和炭化水素基を指し、炭素原子数２～６のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２又は３のアルケニル基がより好ましい。「アルケニル基」としては、例えば、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、３－メチル－２－ブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、４－メチル－３－ペンテニル基、１－ヘキセニル基、３－ヘキセニル基、５－ヘキセニル基、２－シクロヘキセニル基等が挙げられる。「アルキニル基」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する直鎖、分枝鎖又は環状の１価の不飽和炭化水素基を指し、炭素原子数２～６のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２又は３のアルケニル基がより好ましい。「アルキニル基」としては、例えば、エチニル基、１－プロピニル基、プロパルギル、２－ブチニル基、３－ブチニル基、１－メチル－２－プロピニル基、２－ペンチニル基、３－ペンチニル、５－へキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基、ノニニル基、デシニル基、ドデシニル基、およびウンデシニル基等が挙げられる。「ハロゲン」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。「アリール基」とは、１価の芳香族炭化水素基を指し、炭素原子数６～１４のアリール基が好ましく、炭素原子数６～１０のアリール基がより好ましい。「アリール基」としては、例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なり、水素原子、水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、保護基で保護されたリン酸基、又は－Ｐ（ＯＲ４）Ｒ５〔ここで、Ｒ４は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり；Ｒ５は、－Ｎ（Ｒ６）２（ここで、Ｒ６は、独立して、Ｃ１～６アルキル基、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルであるか、又は２つのアルキル基が互いに結合して環を形成する）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基である〕であり得る。
Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、アルコキシ基であり得る。「アルキル」等は、前述のＢ、Ｒ１、及びＲ２の定義において示されたものであってもよい。
Ｘは、Ｃ１～５アルキレン基である。
好ましい人工核酸は、式（Ｉ）で表される人工核酸であって、Ｒ１が、水素原子、又は水酸基の保護基であり；Ｒ２がリン酸基であり；及びＲ３がメチル基であるものである。
本発明の人工核酸は、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチジーン核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、又はリボザイムに導入して使用することができる。「アンチセンス核酸」とは、一般的に、標的ｍＲＮＡを発現する細胞内の生理的条件下で、該標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、かつハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸を指す。アンチセンス核酸の種類は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。本発明によれば、アンチセンス核酸は、架橋型アンチセンス核酸であることが好ましく、該架橋型アンチセンス核酸は、デオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有するものであり得る。特に、本発明によれば、該ギャップ領域に本発明の上記人工核酸を有するアンチセンス核酸が提供される。
より具体的には、架橋型アンチセンス核酸は、標的とする核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるギャップ領域（「ＤＮＡ」からなる領域であって、各核酸同士を連結する結合様式は限定されないが、ホスホロチオエート結合又はホスホジエステル結合であり得、好ましくはホスホロチオエート結合である）（長さは任意であり得、好ましくは５～１５塩基）と、そのギャップ領域の両端にそれぞれ位置するウイング領域とからなる構造を有する従来のアンチセンス核酸に対して、該ギャップ領域において、該ギャップ領域において、本発明の上記人工核酸が１個又は複数個が挿入され、及び／又は天然の塩基を有する核酸がそれにより置換されている。
本発明の人工核酸を構成するウイング領域は、２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸を含む又はそれからなる（例えば、W. Brad Wan and Punit P. Seth, J. Med. Chem. 2016, 59, 9645-9667を参照されたい）。ウイング領域に含まれる２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸は好ましくは２～１０個である。また、各核酸同士を連結する結合様式もまた限定されないが、ホスホロチオエート結合又はホスホジエステル結合であり得、好ましくはホスホロチオエート結合である。なお、「ホスホロチオエート結合」は、天然の核酸間結合であるホスホジエステル結合のリン酸基の酸素原子の１つを硫黄原子に置換しホスホロチオエート化（ＰＳ化）したものである。
本発明によれば、２’，４’－修飾された核酸は、限定されないが、下記の構造式：
〔式中、
Ｒ７は、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ８及びＲ９は、同一であるか又は異なり、各々独立して、水素原子、又は構造：
Ｒ７は、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ８及びＲ９は、同一であるか又は異なり、各々独立して、水素原子、又は構造：
（式中、
は、隣接する核酸との結合点、又はＯＨであり；及び
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択されるものであり得る。各置換基の定義は、上記核酸塩基の定義における同一の用語の定義に従うものとする。
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択されるものであり得る。各置換基の定義は、上記核酸塩基の定義における同一の用語の定義に従うものとする。
公知の通り、天然核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）の糖部分は４つの炭素原子と１つの酸素原子とからなる５員環を有し、その糖部分はＮ型とＳ型の２種類のコンホメーションを取る。前述のＡＳＯの標的となるｍＲＮＡは主に糖鎖がＮ型でＡ型のらせん構造をとっているため、ＲＮＡに対する親和性を高めるという観点から、ＡＳＯの糖鎖もＮ型をとることが重要になる。このコンセプトのもとに開発されたのがＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ；２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－架橋化核酸（２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ））の修飾核酸である。例えば、ＬＮＡにおいては、２’位の酸素と４’位の炭素とをメチレン基によって架橋することにより、そのコンホメーションはＮ型に固定され、コンホメーション間のゆらぎは生じない。そのため、ＬＮＡを数ユニット組み込んで合成されたオリゴヌクレオチドは、従来の天然の核酸で合成されたオリゴヌクレオチドに比べて、ＲＮＡに対する結合力や配列特異性が極めて高く、かつ、優れた耐熱性とヌクレアーゼ耐性とを示す。他の人工核酸もかかる特性を有していることから、本発明において利用可能である。本発明によれば、２’，４’－修飾された核酸は、ＬＮＡであることが好ましい。なお、本発明のアンチセンス核酸は、固相合成の周知技術を通して簡便にかつルーチンに製造することができる。
「ｓｉＲＮＡ」とは、「低分子干渉ＲＮＡ」及び「ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ」と同義であり、標的遺伝子の一部に対応する塩基配列を有するセンス鎖（パッセンジャー鎖）とそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる低分子二本鎖ＲＮＡであって、通常は、２０～２５塩基対を有する。
「アプタマー」とは、「核酸アプタマー」と同義で使用することができ、特定の標的分子に結合する核酸分子であって、かつ、標的遺伝子の発現に負の影響を及ぼすものを指す。アプタマーは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡとの混合物であり得る。
「アンチジーン核酸」とは、遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、アンチジーン核酸によるプロモーターへのハイブリダイゼーションは標的遺伝子の発現を阻害する。
「デコイ核酸」は、標的遺伝子における転写因子結合領域を模倣する核酸分子を指し、標的遺伝子と転写因子の結合を競合的に阻害することによって、標的遺伝子の発現を阻害する。
「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、ＲＮＡ干渉を発生又は仲介させることができるＲＮＡ物質であり、長さは１０～５０個のヌクレオチドである。
「リボザイム」とは、一般的には、核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡを指すが、配列特異的な核酸切断活性を有するＲＮＡが好ましい。
（２）人工核酸を製造する方法
本発明によれば、本発明の上記人工核酸を製造する方法が提供される。本発明の人工核酸を製造する方法は、下記の工程を含むものであって、新規な核酸の合成方法である。
本発明によれば、本発明の上記人工核酸を製造する方法が提供される。本発明の人工核酸を製造する方法は、下記の工程を含むものであって、新規な核酸の合成方法である。
本発明では、出発物質として、下記の式（ＩＩ）：
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＢは、上記で定義されたものと同一である〕
で表される化合物と、Ｃ１～５アルキレングリコール（例えば、メチレングリコール、エチレングリコール）と反応させて、下記の式（ＩＩＩ）：
で表される化合物と、Ｃ１～５アルキレングリコール（例えば、メチレングリコール、エチレングリコール）と反応させて、下記の式（ＩＩＩ）：
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｂ、及びＸは、上記で定義されたものと同一である〕
で表される化合物を得、さらにＸに結合した水酸基をアルデヒドに酸化後、Ｈｏｒｎｅｒ－Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ－Ｅｍｍｏｎｓ（ＨＷＥ）反応により増炭させて、下記の式（Ｉ）：
で表される化合物を得、さらにＸに結合した水酸基をアルデヒドに酸化後、Ｈｏｒｎｅｒ－Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ－Ｅｍｍｏｎｓ（ＨＷＥ）反応により増炭させて、下記の式（Ｉ）：
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｂ、及びＸは、上記で定義されたものと同一である〕
で表される生成物を得ることができる。
で表される生成物を得ることができる。
上記のＨＷＥ反応は、当業者に周知であり、アルキルホスホン酸ジエステルから発生させたカルボアニオンをケトン又はアルデヒドと反応させ、アルケンを合成する反応であり、該反応により、炭素数を増加させることができる。
本発明の人工核酸を製造する方法は、本質的には、下記のチャートに示される合成戦略に基づくものであり、本発明をよりよく理解するために、スルホンアミド構造のアミド部位は初期検討としてメチル基を導入したメチルスルホンアミド構造を選択したもので説明する。
最初に化合物Ａの合成を目的とした。Ａの構造に誘導するために化合物Ｂから酸化反応によるアルデヒド体の合成から、前述のＨＷＥ反応で増炭させて合成することを考えた。そこで、Ｂを合成するために化合物Ｃのような５’位を適切に保護した２，２’－Ｏ－アンヒドロ－５－メチルウリジンを用いてエチレングリコールと反応させることを考案した。化合物Ａの合成スキームを以下に示す。
化合物Ａの具体的な合成手順及び化合物の同定等については、後述する実施例１に記載するため、ここでは、簡単に説明する。はじめに、ボラン－テトラヒドロフラン錯体とエチレングリコールを反応させボロン酸エステルを形成させたのち５’－ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基で保護された２，２’－Ｏ－アンヒドロ－５－メチルウリジンを１７０℃の高温条件下で反応させ、化合物２を収率７９％で得た。２’位と３’位のヒドロキシ基の保護にｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシランを反応させて得られた化合物３は９１％の収率で得られた。化合物３を４℃の低温化で酸性条件に付すことで一級アルコール保護のｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基のみを選択的に脱保護した化合物４を７８％の収率で得た。
その後、デス－マーチンペルヨージナンを用いてアルコールをアルデヒド体へ酸化し、塩化リチウムとジイソプロピルエチルアミン存在下でイソブチルホスフェートを活性化させた溶液に加えることでＨＷＥ反応により化合物５を２工程で８４％の収率で得た。その後、水素化ホウ素ナトリウムを用いて１，４－還元を行い、化合物６を８２％で得たのち、ヨウ化ナトリウムでイソブチル基の脱保護反応によりスルホン酸ナトリウム体である化合物７を収率８０％で得た。
スルホン酸ナトリウム体７をシアヌル酸クロリドと反応させ、スルホニルクロライドを反応系中で生成させ、そのクロロ体に対して過剰の１，２，４－トリアゾールを反応させた。その結果、トリアゾールで活性化された化合物８の合成を達成した。化合物８に対して過剰のメチルアミンを反応させることで化合物Ａに相当するメチルアミノスルホニルプロパン体９の合成を達成した。
その後、シリル系保護基の脱保護反応、５’位の４－モノメトキシトリチル化をおこない化合物１１の合成を行なった。
続いて、ホスフィチル化を行なったが生成した化合物が溶液中で非常に不安定であった。そこで、ホスフィチル化後は完全に精製は行わずにオリゴヌクレオチド（ＯＮ）への導入を行った。
（３）アンチ核酸治療薬
本発明は、生体内で分解されずにかつ標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＲＮＡ）に対して選択性及び結合能を保持した人工核酸を含むアンチセンス核酸を治療薬（医薬、製剤、又は医薬組成物）として提供することができる。本発明のアンチセンス核酸を治療薬として使用する場合、遺伝子疾患の種類は特に限定されない。アンチセンス核酸に組み込まれるギャップ領域を構成する「デオキシリボ核酸」は、生体内に存在するノンコーディングＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等を標的とすることができるため、これらの全配列又は一部配列を「標的核酸」として、標的核酸の塩基配列に完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる一本鎖核酸を含むアンチセンス核酸を標的核酸に対応した遺伝子疾患を治療及び／又は予防するための治療薬として用いることができる。また、デオキシリボ核酸の長さは、一般的に、１０塩基程度が適切であるが、５～１５塩基の範囲であれば特に限定されない。好ましくは８～１０塩基、より好ましくは１０塩基である。
本発明は、生体内で分解されずにかつ標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＲＮＡ）に対して選択性及び結合能を保持した人工核酸を含むアンチセンス核酸を治療薬（医薬、製剤、又は医薬組成物）として提供することができる。本発明のアンチセンス核酸を治療薬として使用する場合、遺伝子疾患の種類は特に限定されない。アンチセンス核酸に組み込まれるギャップ領域を構成する「デオキシリボ核酸」は、生体内に存在するノンコーディングＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等を標的とすることができるため、これらの全配列又は一部配列を「標的核酸」として、標的核酸の塩基配列に完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる一本鎖核酸を含むアンチセンス核酸を標的核酸に対応した遺伝子疾患を治療及び／又は予防するための治療薬として用いることができる。また、デオキシリボ核酸の長さは、一般的に、１０塩基程度が適切であるが、５～１５塩基の範囲であれば特に限定されない。好ましくは８～１０塩基、より好ましくは１０塩基である。
本明細書において、「（標的核酸の塩基配列に対して）十分に相補的な塩基配列からなる（一本鎖核酸）」とは、標的核酸の塩基配列の５０％以上１００％未満、好ましくは６０％以上１００％未満、より好ましくは７０％以上１００％未満、さらに好ましくは８０％以上１００％未満、さらにより好ましくは９０％以上１００％未満の塩基と対合し得る塩基配列からなるものであり得る。より具体的には、標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸鎖において、例えば、１又は２～４の塩基を他の塩基に置換した結果、その置換した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合（この場合、他の塩基に置換した位置を「ミスマッチ部位」という）；標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸鎖において、例えば、１又は２～４の塩基を欠失した結果、その欠失した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合等を挙げることができる。
本発明のアンチセンス核酸を医薬組成物として使用する場合、有効成分としてのアンチセンス核酸の他、医薬として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤等を含めることができる。用語「医薬として許容される」とは、患者に投与したとき、生理学的に忍容性であり、かつ一般的に急性胃蠕動等のアレルギー性反応又は類似の有害な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。用語「担体」は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。かかる医薬用担体は、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物、又は合成起源の油を含む油及び水等の不活性液体であってよい。水又は生理食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール水溶液は、担体として、特に注射液として使用されることが好ましい。
本発明のより具体的な実施形態では、医薬として許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／又は担体とともに治療有効量のアンチセンス核酸を含む医薬組成物が提供される。かかる組成物は、様々な緩衝物（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、洗剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、及びバルク物質（例えば、ラクトース、マンニトール）等の添加剤を含む。また、医薬組成物は、液体形態で調製されてもよく、凍結乾燥形態等の乾燥粉末であってもよい。
本発明に従って提供される医薬組成物は、限定されないが、注入、経口、肺、又は鼻経路によって投与されることが好ましい。さらには、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下投与経路によって送達されることがより好ましい。
（４）キット
本発明は、遺伝子疾患を有する患者を治療及び／又は予防するためのキットであって、好適な容器に包装されている少なくとも１つのアンチセンス核酸と、その使用説明書とを含むキットを提供する。
本発明は、遺伝子疾患を有する患者を治療及び／又は予防するためのキットであって、好適な容器に包装されている少なくとも１つのアンチセンス核酸と、その使用説明書とを含むキットを提供する。
キットの内容物は、凍結乾燥されていてもよく、また、キットは、凍結乾燥されている成分を再構成するための好適な溶媒をさらに含んでいてもよい。キットの個々の成分は、別々の容器に包装され、かかる容器とともに、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって定められている形態の通知であって、ヒトへの投与についての製造、使用、又は販売を規制する機関による認可を反映している通知を添付してもよい。
キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、前記液体溶液は、水溶液、例えば無菌水溶液であってよい。インビボで使用する場合、発現構築物を医薬として許容される注射用組成物に製剤化してもよい。この場合、容器手段は、単体で吸入器、注射器、ピペット、点眼器、又は他の同様の装置であってよく、これらから、動物の罹患領域に製剤を適用したり、動物に注射したり、更にはキットの他の成分に適用し、それと混合したりすることができる。
また、キットの成分は、乾燥形態又は凍結乾燥形態で提供されてもよい。試薬又は成分が乾燥形態として提供されるとき、一般的に、好適な溶媒の添加によって再構成が行われる。また、溶媒は、別の容器手段で提供されてもよいことが想到される。容器の数又は種類にかかわらず、本発明のキットは、動物の体内に最終的な複雑な組成物を注射／投与又は配置するのを補助するための機器を含むか、又はこれらと共に包装されてもよい。かかる機器は、吸入器、注射器、ピペット、ピンセット、計量スプーン、点眼器、又は任意の医学的に認められている送達ビヒクルであってもよい。
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。なお、本実施例で使用した試薬、合成及び精製装置、核酸オリゴマー、測定機器、培養細胞等については、実施例の最後にまとめて記載した。
実施例１：人工核酸の合成
本発明の人工核酸の典型例（化合物１２ａ及び１２ｂ）を下記の合成スキームに従って合成した。
本発明の人工核酸の典型例（化合物１２ａ及び１２ｂ）を下記の合成スキームに従って合成した。
一般的方法：１Ｈ、１３Ｃ、および３１Ｐ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、１Ｈ、１３Ｃ、および３１Ｐ ＮＭＲについて、それぞれ５００、１２６、２０２ＭＨｚで記録した。化学シフトは、１Ｈ ＮＭＲスペクトルではＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）、ＤＭＳＯ‐ｄ６（２．４９ｐｐｍ）、ＣＤ３ＯＤ－ｄ４（３．３１ｐｐｍ）の残留非重水素化溶媒、および１３Ｃ ＮＭＲスペクトルではＣＤＣｌ３（７７．１６ｐｐｍ）、ＤＭＳＯ‐ｄ６（３９．５２ｐｐｍ）、ＣＤ３ＯＤ－ｄ４（４９．００ｐｐｍ）の溶媒シグナル、および３１Ｐ ＮＭＲスペクトルでは８５％リン酸（０．００ｐｐｍ）から測定した。逆相（ＲＰ）Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った。
ＵＶ融解温度の測定：ＯＤＮを脱イオン蒸留水に溶解し、その濃度を２６０ｎｍでの吸光度測定から測定した。ＯＤＮの吸収係数は、Ｏｌｉｇｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｃａｌｃ／ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、最近隣法に従って計算した。吸収係数ＯＤＮ＃は、それらが５‐メチルＵの代わりにＵを組み込んだＯＤＮと同一であると仮定して計算した。
ＯＤＮ（各１．２ｎｍｏｌ）を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、６００μＬ）に溶解した。二重鎖の最終濃度は２μＭであった。この混合物を石英セル（１０ｍｍ）に入れ、９０℃でインキュベートした。１０分後、混合物を５℃に冷却し、次に０．５℃／分の速度で９０℃に加熱した。２６０ｎｍでの吸収を記録し、ＵＶ融解曲線を作成するために使用した。ＵＶ融解曲線は、各ＵＶ融解曲線の最初の偏差の最大値を与える温度として計算した。
ジエトキシホスホリルメタンスルホン酸イソブチル（＃０、ＨＷＥ試薬）ｒｅｆ
シクロヘキサン（６．０ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）中のｎ－ＢｕＬｉの２．０Ｍ溶液を、アルゴン雰囲気下、－７８℃でＴＨＦ（４．６ｍＬ）中のイソブチルメタンスルホン酸（１．３７ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくりと添加した。２０分後、ジエチルクロロホスフェート（１４ｍｍｏｌ、２．０ｍＬ）をゆっくりと添加した。反応混合物を－７８℃に３０分間保持し、次に－４０℃に９０分間保持した。混合物を飽和状態でクエンチした。ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＬ）および反応混合物を周囲温度に加温した。混合物をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（４０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（各６０ｍＬ）を３回抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（７０：３０－２０：８０、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ５０ｇ）カラム上のクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて＃０（＃ｇ、＃％）を得た。
ＣＤＣｌ３液を用いて１Ｈ－ＮＭＲを測定し、文献で報告されているものとの比較によりチェックした。ESI-TOF mass: calcd. for C9H21NaO6PS+ [M+Na]+ 311.0689, found 311.0693。
参照:Franchini, L.; Compostella, F.;; Colombo, D.;; Panza, L.;; Ronchetti, 化学 2010, 75, 5363-5366.
参照:Franchini, L.; Compostella, F.;; Colombo, D.;; Panza, L.;; Ronchetti, 化学 2010, 75, 5363-5366.
Ａ．５’－Ｏ－（４－メトキシトリチル）２’－Ｏ－［３－（Ｎ－メチルスルホニル）プロパン－１－イル］－５－メチルウリジン３’－Ｏ－（２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（１２ａ）の製造
構造（１２ａ）で示される人工核酸を後述する合成手順（１）～（１２）に従って合成した。
構造（１２ａ）で示される人工核酸を後述する合成手順（１）～（１２）に従って合成した。
（１）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－２，２’－アンヒドロ－５－メチルウリジンｒｅｆ（１）の合成
１Ｈ－ＮＭＲはＤＭＳＯ‐ｄ６溶液を用いて測定し、文献で報告されたものとの比較によりチェックした。
参考文献1)Prakash,T.P.;Kawasaki,A.M.;Franser,A.S.;Vasquez,G.;Manoharan,M.J.Org。 化学 2002, 67, 357-369. 2) Manoharan, M.; Cook, P 3)Freier, S. M.;Sarthy, A.;; McGonigal, T. 2004, US 20040077571A1。
参考文献1)Prakash,T.P.;Kawasaki,A.M.;Franser,A.S.;Vasquez,G.;Manoharan,M.J.Org。 化学 2002, 67, 357-369. 2) Manoharan, M.; Cook, P 3)Freier, S. M.;Sarthy, A.;; McGonigal, T. 2004, US 20040077571A1。
（２）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－２’－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）５－メチルウリジンｒｅｆ（２）の合成
ＴＨＦ中のボランの１．０Ｍ溶液（１０ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を、周囲温度で１，２－エタンジオール（８ｍＬ）の溶液に添加した。５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－２，２’－アンヒドロ－５－メチルウリジンｒｅｆ（１．９３ｇ、４．０ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（１７６．３ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１７０℃で２４時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、３回飽和させた。炭酸水素ナトリウム水和物（各２００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ２回（各２００ｍＬ）、ブライン２回（各２００ｍＬ）。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（７０：３０－０：１００、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ ｓｉｃａ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ １００ｇ）カラム上のカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２を含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて＃１（１．７２ｇ、７９％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 1.02 (s, 9H, t-Bu), 1.44 (s, 3H, 5-Me), 3.49-3.52 (m, 2H, 2'-O-CH2 CH 2-), 3.56-3.58 (m, 2H, 2'-O-CH 2CH2-), 3.81 (dd, 1H, J = 3.9, 11.6 Hz, H5'), 3.91 (dd, 1H, J = 2.9, 11.6 Hz, H5''), 3.93-3.96 (m, 1H, H4'), 4.03 (t, 1H, J = 5.4 Hz, H2'), 4.75 (t, 1H, J = 5.4 Hz, -CH2CH2-OH), 5.13 (d, 1H, J = 5.8 Hz, 3'-OH), 5.90 (d, 1H, J = 5.4 Hz), 7.38 (s, 1H), 7.38 (d, 1H, J = 1.4 Hz, 6-H), 7.40-7.48 (m, 6H, -Si(Ph)2-), 7.62-7.66 (m, 4H, -Si(Ph)2-), 11.38 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ 12.1, 19.6, 27.2, 61.7, 63.5, 69.2, 72.4, 82.9, 84.9, 86.9, 111.7, 128.1, 128.2, 130.2, 130.3, 132.4, 133.1, 135.1, 135.4, 135.7, 151.1, 164.0; ESI-TOF mass: calcd. for C28H36N2NaO7Si+ [M+Na]+ 563.2184, found 563.2170。
参考文献:Prakash, T. P.、Kawasaki, A. M.、Fraser, A. S.、Vasquez, G.、Manoharan, 化学 2001, 67, 357-369.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 1.02 (s, 9H, t-Bu), 1.44 (s, 3H, 5-Me), 3.49-3.52 (m, 2H, 2'-O-CH2 CH 2-), 3.56-3.58 (m, 2H, 2'-O-CH 2CH2-), 3.81 (dd, 1H, J = 3.9, 11.6 Hz, H5'), 3.91 (dd, 1H, J = 2.9, 11.6 Hz, H5''), 3.93-3.96 (m, 1H, H4'), 4.03 (t, 1H, J = 5.4 Hz, H2'), 4.75 (t, 1H, J = 5.4 Hz, -CH2CH2-OH), 5.13 (d, 1H, J = 5.8 Hz, 3'-OH), 5.90 (d, 1H, J = 5.4 Hz), 7.38 (s, 1H), 7.38 (d, 1H, J = 1.4 Hz, 6-H), 7.40-7.48 (m, 6H, -Si(Ph)2-), 7.62-7.66 (m, 4H, -Si(Ph)2-), 11.38 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ 12.1, 19.6, 27.2, 61.7, 63.5, 69.2, 72.4, 82.9, 84.9, 86.9, 111.7, 128.1, 128.2, 130.2, 130.3, 132.4, 133.1, 135.1, 135.4, 135.7, 151.1, 164.0; ESI-TOF mass: calcd. for C28H36N2NaO7Si+ [M+Na]+ 563.2184, found 563.2170。
参考文献:Prakash, T. P.、Kawasaki, A. M.、Fraser, A. S.、Vasquez, G.、Manoharan, 化学 2001, 67, 357-369.
（３）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［２－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）エチル］５－メチルウリジン（３）の合成
周囲温度で乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物２（１．７２ｇ、３．２ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１．５０ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）を撹拌した溶液に、１０分後、乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシラン（１．６４ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を周囲温度で１時間撹拌した。反応混合物をｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）に希釈し、ＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ、各々）とブライン（２００ｍＬ、各々）で２回飽和させた。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（９３：７～４０：６０、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ５０ｇ）カラム上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物３を含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物３（２．２３ｇ、９１％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ -0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), -0.02 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.04 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.06 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.80 (s, 9H, t-Bu), 0.84 (s, 9H, t-Bu), 1.02 (s, 9H, t-Bu), 1.48 (s, 3H, 5-Me), 3.48-3.55 (m, 2H, 2'-O-CH2 CH 2-), 3.66 (t, 2H, J = 5.2 Hz, 2'-O-CH 2CH2-), 3.75 (dd, 2H, J = 4.7, 12.8 Hz, H5'), 3.89-3.92 (m, 2H, H4' and H5''), 4.07 (t, 1H, J = 5.3 Hz, H2'), 4.32 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H3'), 5.87 (d, 1H, J = 5.4 Hz, H1') , 7.39-7.43 (m, 5H, -Si(Ph)2- and 6-H), 7.45-7.49 (m, 2H, -Si(Ph)2-), 7.61-7.64 (m, 4H, -Si(Ph)2-), 11.41 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.4, -5.4, -5.1, -4.8, 11.8, 17.7, 17.9, 18.9, 25.6, 25.7, 26.7, 62.0, 63.4, 70.0, 71.3, 80.2, 84.3, 86.3, 109.9, 127.9, 128.0, 130.0, 130.1, 132.3, 132.6, 135.0, 135.0 135.5, 150.5, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C40H64N2NaO7Si3 + [M+Na]+ 791.3914, found 791.3896.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ -0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), -0.02 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.04 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.06 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.80 (s, 9H, t-Bu), 0.84 (s, 9H, t-Bu), 1.02 (s, 9H, t-Bu), 1.48 (s, 3H, 5-Me), 3.48-3.55 (m, 2H, 2'-O-CH2 CH 2-), 3.66 (t, 2H, J = 5.2 Hz, 2'-O-CH 2CH2-), 3.75 (dd, 2H, J = 4.7, 12.8 Hz, H5'), 3.89-3.92 (m, 2H, H4' and H5''), 4.07 (t, 1H, J = 5.3 Hz, H2'), 4.32 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H3'), 5.87 (d, 1H, J = 5.4 Hz, H1') , 7.39-7.43 (m, 5H, -Si(Ph)2- and 6-H), 7.45-7.49 (m, 2H, -Si(Ph)2-), 7.61-7.64 (m, 4H, -Si(Ph)2-), 11.41 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.4, -5.4, -5.1, -4.8, 11.8, 17.7, 17.9, 18.9, 25.6, 25.7, 26.7, 62.0, 63.4, 70.0, 71.3, 80.2, 84.3, 86.3, 109.9, 127.9, 128.0, 130.0, 130.1, 132.3, 132.6, 135.0, 135.0 135.5, 150.5, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C40H64N2NaO7Si3 + [M+Na]+ 791.3914, found 791.3896.
（４）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）－５－メチルウリジン（４）
Ｈ２Ｏ（１１ｍＬ）およびＴＦＡ（１１ｍＬ）を、乾燥ＴＨＦ（４６ｍＬ）中の化合物３（３．４８ｇ、４．６ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を４℃で１時間撹拌した。反応混合物を４℃にて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（４４ｍＬ）に注意深く注いだ。１０分後、反応混合物を周囲温度に加温した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）に希釈し、飽和飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ、各々）で５回、ブライン（１００ｍＬ、各々）で３回洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（８８：１２～０：１００、ｖ／ｖ）を用いてシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ ＨＣ Ｄ １００ｇ）カラム上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物４を含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物４（２．３４ｇ、７８％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.04 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.07 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.84 (s, 9H, t-Bu), 1.03 (s, 9H, t-Bu), 1.49 (s, 3H, 5-Me), 3.45-3.52 (m, 4H, 2'-O-CH2 CH 2- and 2'-O-CH 2CH2-), 3.75 (dd, 1H, J = 4.6, 12.6 Hz, H5''), 3.89-3.93 (m, 2H, H4' and H5'), 4.08 (t, 1H, J = 5.3 Hz, H2'), 4.33 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H3'), 4.60 (t, 1H, J = 4.6 Hz, -CH2CH2-OH), 5.86 (d, 1H, J = 5.4 Hz, H1'), 7.40-7.44 (m, 5H, -Si(Ph)2- and 6-H), 7.45-7.49 (m, 2H, -Si(Ph)2-), 7.61-7.65 (m, 4H, -Si(Ph)2-), 11.39 (brs, 1H, N-H);13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.1, -4.7, 11.8, 17.8, 18.9, 25.6, 26.7, 60.1, 63.3, 70.0, 71.6, 80.2, 84.2, 86.5, 109.8, 128.0, 128.0, 130.0, 130.1, 132.3, 132.6, 135.0, 135.0, 135.7, 150.5, 163.7; ESI-TOF mass: calcd. for C34H50N2NaO7Si2 + [M+Na]+ 677.3049, found 677.3040.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.04 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.07 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.84 (s, 9H, t-Bu), 1.03 (s, 9H, t-Bu), 1.49 (s, 3H, 5-Me), 3.45-3.52 (m, 4H, 2'-O-CH2 CH 2- and 2'-O-CH 2CH2-), 3.75 (dd, 1H, J = 4.6, 12.6 Hz, H5''), 3.89-3.93 (m, 2H, H4' and H5'), 4.08 (t, 1H, J = 5.3 Hz, H2'), 4.33 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H3'), 4.60 (t, 1H, J = 4.6 Hz, -CH2CH2-OH), 5.86 (d, 1H, J = 5.4 Hz, H1'), 7.40-7.44 (m, 5H, -Si(Ph)2- and 6-H), 7.45-7.49 (m, 2H, -Si(Ph)2-), 7.61-7.65 (m, 4H, -Si(Ph)2-), 11.39 (brs, 1H, N-H);13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.1, -4.7, 11.8, 17.8, 18.9, 25.6, 26.7, 60.1, 63.3, 70.0, 71.6, 80.2, 84.2, 86.5, 109.8, 128.0, 128.0, 130.0, 130.1, 132.3, 132.6, 135.0, 135.0, 135.7, 150.5, 163.7; ESI-TOF mass: calcd. for C34H50N2NaO7Si2 + [M+Na]+ 677.3049, found 677.3040.
（５）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［３－（２－メチルプロパン－１－オキシ）スルホニル－（Ｅ）－プロパ－２－エン］５－メチルウリジン（５）の合成
デス－マーチンペルヨージナン（９８５．３ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１９ｍＬ）中の化合物４（１．２７ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を周囲温度で１時間撹拌した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ３と飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（６０ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）でクエンチした。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）に希釈し、２回ＣＨ２Ｃｌ２（各々９０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、減圧下で蒸発させて粗アルデヒド物質（１．３６ｇ、ｑｕａｎｔ）を得、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＬｉＣｌ（２２４．２ｍｇ、４．６６ｍｍｏｌ）および＃０（ＨＷＥ試薬）（５６５μＬ、２．３３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．２２ｍＬ、６．９８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を周囲温度で３０分間撹拌した後、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の粗アルデヒド物質（１．３６ｇ、ｑｕａｎｔ）の溶液を滴下した。反応混合物を周囲温度で２時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ（４０ｍＬ）でクエンチし、１０分間撹拌した。反応液をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で３回抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（８８：１２～２０：８０、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ５０ｇ）上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物５を含有する画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物５（１．２８ｇ、８４％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.05 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.83 (s, 9H, t-Bu), 0.86 (s, 3H, -CH(CH 3)2, 0.88 (s, 3H, -CH(CH 3)2), 1.02 (s, 9H, t-Bu), 1.47 (s, 3H, 5-Me), 1.87-1.95 (m, 1H, -CH(CH3)2), 3.77-3.85 (m, 3H, -CH 2CH(CH3)2 and H5'), 3.95-3.97 (m, 2H, H4' and H5''), 4.14-4.15 (t, 1H, J = 4.8 Hz, H2'), 4.27-4.31 (m, 1H, -CH 2CH=CH-), 4.35-4.42 (m, 2H, -CH 2CH=CH- and H3'), 5.87 (d, 1H, J = 4.1 Hz, H1'), 6.53 (dt, 1H, J = 2.2, 15.2 Hz, -CH2CH=CH-), 6.95 (dt, 1H, J = 3.5, 15.2 Hz, -CH2 CH=CH-), 7.40-7.49 (m, 7H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.61-7.65 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 11.42 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.1, -4.8, 11.8, 17.7, 18.3, 18.9, 25.6, 26.8, 27.6, 62.9, 67.3, 69.5, 76.0, 80.4, 83.8, 87.0, 109.8, 123.4, 128.0, 128.0, 128.0, 130.0, 130.1, 132.4, 132.6, 135.0, 135.0, 135.5, 145.8, 150.4, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C39H58N2NaO9SSi2 + [M+Na]+ 809.3294, found 809.3276.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.05 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.83 (s, 9H, t-Bu), 0.86 (s, 3H, -CH(CH 3)2, 0.88 (s, 3H, -CH(CH 3)2), 1.02 (s, 9H, t-Bu), 1.47 (s, 3H, 5-Me), 1.87-1.95 (m, 1H, -CH(CH3)2), 3.77-3.85 (m, 3H, -CH 2CH(CH3)2 and H5'), 3.95-3.97 (m, 2H, H4' and H5''), 4.14-4.15 (t, 1H, J = 4.8 Hz, H2'), 4.27-4.31 (m, 1H, -CH 2CH=CH-), 4.35-4.42 (m, 2H, -CH 2CH=CH- and H3'), 5.87 (d, 1H, J = 4.1 Hz, H1'), 6.53 (dt, 1H, J = 2.2, 15.2 Hz, -CH2CH=CH-), 6.95 (dt, 1H, J = 3.5, 15.2 Hz, -CH2 CH=CH-), 7.40-7.49 (m, 7H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.61-7.65 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 11.42 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.1, -4.8, 11.8, 17.7, 18.3, 18.9, 25.6, 26.8, 27.6, 62.9, 67.3, 69.5, 76.0, 80.4, 83.8, 87.0, 109.8, 123.4, 128.0, 128.0, 128.0, 130.0, 130.1, 132.4, 132.6, 135.0, 135.0, 135.5, 145.8, 150.4, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C39H58N2NaO9SSi2 + [M+Na]+ 809.3294, found 809.3276.
（６）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２'－Ｏ－［３－（２－メチルプロパン－３－オキシ）スルホニルプロパン－１－イル］５－メチルウリジン（６）の合成
ＮａＢＨ４（１０６．７ｍｇ、２．８２ｍｍｏｌ）にＥｔＯＨ（８ｍＬ）中の化合物５（１．２７ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）の溶液を４℃で添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌した。混合物を４℃にてＡｃＯＨ（２８０μＬ、４．８６ｍｍｏｌ）でクエンチした。混合物を撹拌し、周囲温度を１５分間加温した。混合物を減圧下で蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（６５ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（各６０ｍＬ）で３回、ブライン（各６０ｍＬ）で３回洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ５０ｇ）カラム上で、ＣＨ２Ｃｌ２－ＥｔＯＡｃ（９８：２～８０：２０、ｖ／ｖ）を用いてクロマトグラフィーにより精製し、化合物６を含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物６（１．０５ｇ、８２％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.06 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.84 (s, 9H, t-Bu), 0.88 (s, 3H, -CH(CH 3)2), 0.90 (s, 3H, -CH(CH 3)2), 1.03 (s, 9H, t-Bu), 1.49 (s, 3H, 5-Me), 1.88-1.95 (m, 3H, -CH(CH3)2 and -CH2 CH 2CH2S(O)3-), 3.28-3.30 (m, 2H, -CH 2CH2CH2S(O)3-), 3.53-3.61 (m, 2H, -CH2CH2 CH 2S(O)3-), 3.76 (dd, 1H, J = 4.6, 12.9 Hz, H5'), 3.92-3.95 (m, 4H, H5'' and H4' and -CH 2CH(CH3)2), 4.04 (t, 1H, J = 5.2 Hz, H2'), 4.30 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H3'), 5.85 (d, 1H, J = 5.1 Hz, H1'), 7.40-7.44 (m, 5H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.45-7.49 (m, 2H, t-BuSi(Ph)2), 7.61-7.65 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 11.40 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.1, -4.7, 11.8, 17.8, 18.4, 18.9, 23.9, 25.6, 26.8, 27.7, 45.7, 63.2, 67.4, 70.0, 75.7, 80.1, 84.2, 86.6, 109.9, 128.0, 128.0, 130.1, 130.2, 132.3, 132.6, 135.0, 135.0, 135.5, 150.5, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C39H60N2NaO9SSi2 + [M+Na]+ 811.3450, found 811.3442.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.06 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.84 (s, 9H, t-Bu), 0.88 (s, 3H, -CH(CH 3)2), 0.90 (s, 3H, -CH(CH 3)2), 1.03 (s, 9H, t-Bu), 1.49 (s, 3H, 5-Me), 1.88-1.95 (m, 3H, -CH(CH3)2 and -CH2 CH 2CH2S(O)3-), 3.28-3.30 (m, 2H, -CH 2CH2CH2S(O)3-), 3.53-3.61 (m, 2H, -CH2CH2 CH 2S(O)3-), 3.76 (dd, 1H, J = 4.6, 12.9 Hz, H5'), 3.92-3.95 (m, 4H, H5'' and H4' and -CH 2CH(CH3)2), 4.04 (t, 1H, J = 5.2 Hz, H2'), 4.30 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H3'), 5.85 (d, 1H, J = 5.1 Hz, H1'), 7.40-7.44 (m, 5H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.45-7.49 (m, 2H, t-BuSi(Ph)2), 7.61-7.65 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 11.40 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.1, -4.7, 11.8, 17.8, 18.4, 18.9, 23.9, 25.6, 26.8, 27.7, 45.7, 63.2, 67.4, 70.0, 75.7, 80.1, 84.2, 86.6, 109.9, 128.0, 128.0, 130.1, 130.2, 132.3, 132.6, 135.0, 135.0, 135.5, 150.5, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C39H60N2NaO9SSi2 + [M+Na]+ 811.3450, found 811.3442.
（７）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－（３－スルホニルプロパン－１－イル）－５－メチルウリジンナトリウム塩（７）の合成
ヨウ化ナトリウム（１．７９ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）を、アセトン（２４ｍＬ）中の化合物６（１．８７ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を７８℃で１６時間撹拌した。混合物を減圧下で蒸発させた。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２－ＭｅＯＨ（９８：２～８０：２０、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ５０ｇ）カラム上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物７を含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物７（１．４３ｇ、８０％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.06 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.84 (s, 9H, t-Bu), 1.02 (s, 9H, t-Bu), 1.50 (s, 3H, 5-Me), 1.76-1.81 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO3 -), 2.39-2.47 (m, 2H, -CH 2CH2CH2SO3 -), 3.46-3.53 (m, 2H, -CH2CH2 CH 2SO3 -), 3.73-3.77 (m, 1H, H5'), 3.89-3.93 (m, 2H, H4' and H5''), 4.01 (t, 1H, J = 5.3 Hz, H2'), 4.31 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H3'), 5.83 (d, 1H, J = 5.3 Hz, H1'), 7.40-7.43 (m, 5H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.44-7.48 (m, 2H, t-BuSi(Ph)2), 7.60-7.65 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 11.38 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.1, -4.7, 11.8, 17.8, 18.9, 25.6, 25.8, 26.7, 48.3, 63.3, 69.3, 70.1, 79.8, 84.3, 86.6, 109.8, 128.0, 128.0, 130.0, 130.1, 132.4, 132.6, 135.0, 135.0, 135.8, 150.5, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C35H51N2O9SSi2 - [M-Na]- 731.2859, found 731.2839.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.06 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.84 (s, 9H, t-Bu), 1.02 (s, 9H, t-Bu), 1.50 (s, 3H, 5-Me), 1.76-1.81 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO3 -), 2.39-2.47 (m, 2H, -CH 2CH2CH2SO3 -), 3.46-3.53 (m, 2H, -CH2CH2 CH 2SO3 -), 3.73-3.77 (m, 1H, H5'), 3.89-3.93 (m, 2H, H4' and H5''), 4.01 (t, 1H, J = 5.3 Hz, H2'), 4.31 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H3'), 5.83 (d, 1H, J = 5.3 Hz, H1'), 7.40-7.43 (m, 5H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.44-7.48 (m, 2H, t-BuSi(Ph)2), 7.60-7.65 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 11.38 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ -5.1, -4.7, 11.8, 17.8, 18.9, 25.6, 25.8, 26.7, 48.3, 63.3, 69.3, 70.1, 79.8, 84.3, 86.6, 109.8, 128.0, 128.0, 130.0, 130.1, 132.4, 132.6, 135.0, 135.0, 135.8, 150.5, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C35H51N2O9SSi2 - [M-Na]- 731.2859, found 731.2839.
（８）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［３－（（１，２，４－トリアゾール－１－イル）スルホニル）プロパン－１－イル］－５－メチルウリジン（８）の合成
化合物７（８９０．９ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を各々ピリジンおよびトルエンとともに４回共蒸発させ、アルゴン雰囲気下、乾燥アセトン（８ｍＬ）に溶解した。乾燥アセトン（３ｍＬ）および塩化シアヌル（３６３．９ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）中の１８－クラウン－６－エーテル（４９．８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を化合物７の溶液に添加した。混合物を７８℃で１時間撹拌した。その後、混合物を周囲温度まで冷却した。１，２，４－トリアゾール（１．６４ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を７８℃で１時間撹拌した。混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）上で濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（８８：１２～０：１００、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ５０ｇ）カラム上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物８を含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物８（７２８．２ｇ、７９％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.01 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.86 (s, 9H, t-Bu), 1.12 (s, 9H, t-Bu), 1.52 (d, 3H, J = 1.1 Hz, 5-Me), 2.02-2.08 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO2), 3.60-3.68 (m, 2H, -CH 2CH2CH2SO2), 3.70-3.76 (m, 2H, -CH2CH2 CH 2SO2), 3.79-3.84 (m, 2H, H2' and H5'), 3.99-4.01 (m, 1H, H4'), 4.08 (dd, 1H, J = 2.2, 12.0 Hz, H5''), 4.26 (t, 1H, J = 4.9 Hz, H3'), 5.99 (d, 1H, J = 4.5 Hz, H1'), 7.37-7.41 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 7.43-7.48 (m, 3H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.63-7.65 (m, 2H, t-BuSi(Ph)2), 7.67-7.69 (m, 2H, t-BuSi(Ph)2), 8.13 (s, 1H, triazole-H), 8.39 (brs, 1H, N-H), 8.68 (s, 1H, triazole-H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ -4.7, -4.3, 12.1, 18.2, 19.7, 23.9, 25.8, 27.3, 51.6, 63.0, 67.4, 70.1, 82.7, 85.2, 87.2, 111.6, 128.2, 128.2, 130.3, 130.4, 132.5, 132.9, 134.9, 135.4, 135.6, 145.3, 150.3, 154.5, 163.5; ESI-TOF mass: calcd. for C37H53N5NaO8SSi2 + [M+Na]+ 806.3046, found 806.3048.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.01 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.86 (s, 9H, t-Bu), 1.12 (s, 9H, t-Bu), 1.52 (d, 3H, J = 1.1 Hz, 5-Me), 2.02-2.08 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO2), 3.60-3.68 (m, 2H, -CH 2CH2CH2SO2), 3.70-3.76 (m, 2H, -CH2CH2 CH 2SO2), 3.79-3.84 (m, 2H, H2' and H5'), 3.99-4.01 (m, 1H, H4'), 4.08 (dd, 1H, J = 2.2, 12.0 Hz, H5''), 4.26 (t, 1H, J = 4.9 Hz, H3'), 5.99 (d, 1H, J = 4.5 Hz, H1'), 7.37-7.41 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 7.43-7.48 (m, 3H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.63-7.65 (m, 2H, t-BuSi(Ph)2), 7.67-7.69 (m, 2H, t-BuSi(Ph)2), 8.13 (s, 1H, triazole-H), 8.39 (brs, 1H, N-H), 8.68 (s, 1H, triazole-H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ -4.7, -4.3, 12.1, 18.2, 19.7, 23.9, 25.8, 27.3, 51.6, 63.0, 67.4, 70.1, 82.7, 85.2, 87.2, 111.6, 128.2, 128.2, 130.3, 130.4, 132.5, 132.9, 134.9, 135.4, 135.6, 145.3, 150.3, 154.5, 163.5; ESI-TOF mass: calcd. for C37H53N5NaO8SSi2 + [M+Na]+ 806.3046, found 806.3048.
（９）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［３－（Ｎ－メチルスルホニル）プロパン－１－イル］－５－メチルウリジン（９ａ）の合成
ＴＨＦ中の２．０Ｍメチルアミン（３．３ｍＬ、６．６５ｍｍｏｌ）溶液を、乾燥ＭｅＣＮ（１３ｍＬ）中の化合物８（１．０４ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を５０℃で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発させて粗物質を得た。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（８５：１５～０：１００、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ５０ｇ）カラム上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物９ａを含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物９ａ（８２９．４ｍｇ、８４％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.07 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.88 (s, 9H, t-Bu), 1.12 (s, 9H, t-Bu), 1.55 (d, 3H, J = 1.2 Hz, 5-Me), 2.05-2.11 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO2-), 2.80 (d, 3H, J = 5.3 Hz, -SO2NHMe), 3.09-3.21 (m, 2H, -CH 2CH2CH2SO2-), 3.63-3.67 (m, 1H, -CH2CH2 CH 2SO2-), 3.70-3.74 (m, 1H, -CH2CH2 CH 2SO2-), 3.81 (dd, 1H, J = 2.3, 11.9 Hz, H5'), 3.87 (t, 1H, J = 5.1 Hz, H2'), 4.00-4.02 (m, 1H, H4'), 4.07 (dd, 1H, J = 2.1, 11.8 Hz, H5''), 4.28 (t, 1H, J = 4.7 Hz, H3'), 4.54 (q, 1H, J = 5.3 Hz, -SO2 NHMe), 6.06 (d, 1H, J = 5.1 Hz, H1'), 7.38-7.42 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 7.43-7.48 (m, 3H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.63-7.69 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 8.68 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3): δ -4.7, -4.3, 12.1, 18.3, 19.6, 24.5, 25.8, 27.3, 29.5, 48.0, 63.2, 68.5, 70.5, 82.6, 85.5, 87.2, 111.8, 128.2, 128.2, 130.3, 130.4, 132.5, 132.9, 135.1, 135.4, 135.6, 150.7, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C36H55N3NaO8SSi2 + [M+Na]+ 768.3141, found 768.3143.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.03 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.07 (s, 3H, -Si(Me)2), 0.88 (s, 9H, t-Bu), 1.12 (s, 9H, t-Bu), 1.55 (d, 3H, J = 1.2 Hz, 5-Me), 2.05-2.11 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO2-), 2.80 (d, 3H, J = 5.3 Hz, -SO2NHMe), 3.09-3.21 (m, 2H, -CH 2CH2CH2SO2-), 3.63-3.67 (m, 1H, -CH2CH2 CH 2SO2-), 3.70-3.74 (m, 1H, -CH2CH2 CH 2SO2-), 3.81 (dd, 1H, J = 2.3, 11.9 Hz, H5'), 3.87 (t, 1H, J = 5.1 Hz, H2'), 4.00-4.02 (m, 1H, H4'), 4.07 (dd, 1H, J = 2.1, 11.8 Hz, H5''), 4.28 (t, 1H, J = 4.7 Hz, H3'), 4.54 (q, 1H, J = 5.3 Hz, -SO2 NHMe), 6.06 (d, 1H, J = 5.1 Hz, H1'), 7.38-7.42 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 7.43-7.48 (m, 3H, t-BuSi(Ph)2 and 6-H), 7.63-7.69 (m, 4H, t-BuSi(Ph)2), 8.68 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3): δ -4.7, -4.3, 12.1, 18.3, 19.6, 24.5, 25.8, 27.3, 29.5, 48.0, 63.2, 68.5, 70.5, 82.6, 85.5, 87.2, 111.8, 128.2, 128.2, 130.3, 130.4, 132.5, 132.9, 135.1, 135.4, 135.6, 150.7, 163.6; ESI-TOF mass: calcd. for C36H55N3NaO8SSi2 + [M+Na]+ 768.3141, found 768.3143.
（１０）２’－Ｏ－［３－（Ｎ－メチルスルホニル）プロパン－１－イル］－５－メチルウリジン（１０ａ）の合成
トリエチルアミン（４６０μＬ、３．３３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミントリヒドロフルオリド（１．１ｍＬ、６．６６ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ（１１ｍＬ）中の化合物９ａ（８２５ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を周囲温度で２４時間撹拌した。混合物をトリメチルエトキシシラン（４．２ｍＬ、２６．６ｍｍｏｌ）でクエンチした。６時間後、混合物を減圧下で蒸発させた。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２－ＭｅＯＨ（１００：０～８０：２０、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ２５ｇ）カラム上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物１０ａを含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物１０ａ（４０３．３ｍｇ、９２％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4): δ 1.88 (d, 3H, J = 1.2 Hz, 5-Me), 2.00-2.08 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO2-), 2.70 (s, 3H, -SO2NHMe), 3.18 (dt, 2H, J = 7.5, 7.7 Hz, -CH 2CH2CH2SO2-), 3.74-3.80 (m, 3H, -CH2CH2 CH 2SO2- and H5'), 3.89 (dd, 1H, J = 2.6, 12.3 Hz, H5''), 3.96-4.00 (m, 2H, H2' and H4'), 4.26 (t, 1H, J = 5.4 Hz, H3'), 5.95 (d, 1H, J = 4.1 Hz, H1'), 7.93 (d, 1H, J = 1.3 Hz, 6-H); 13C-NMR (126 MHz, CD3OD-d4): δ 12.5, 25.3, 29.2, 48.1, 61.8, 69.6, 70.0, 83.6, 86.3, 88.8, 111.5, 138.0, 152.4, 166.4; ESI-TOF mass: calcd. for C14H23N3NaO8S+ [M+Na]+ 416.1098, found 416.1088.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4): δ 1.88 (d, 3H, J = 1.2 Hz, 5-Me), 2.00-2.08 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO2-), 2.70 (s, 3H, -SO2NHMe), 3.18 (dt, 2H, J = 7.5, 7.7 Hz, -CH 2CH2CH2SO2-), 3.74-3.80 (m, 3H, -CH2CH2 CH 2SO2- and H5'), 3.89 (dd, 1H, J = 2.6, 12.3 Hz, H5''), 3.96-4.00 (m, 2H, H2' and H4'), 4.26 (t, 1H, J = 5.4 Hz, H3'), 5.95 (d, 1H, J = 4.1 Hz, H1'), 7.93 (d, 1H, J = 1.3 Hz, 6-H); 13C-NMR (126 MHz, CD3OD-d4): δ 12.5, 25.3, 29.2, 48.1, 61.8, 69.6, 70.0, 83.6, 86.3, 88.8, 111.5, 138.0, 152.4, 166.4; ESI-TOF mass: calcd. for C14H23N3NaO8S+ [M+Na]+ 416.1098, found 416.1088.
（１１）５’－Ｏ－（４－メトキシトリチル）－２'－Ｏ－［３－（Ｎ－メチルスルホニル）プロパン－１－イル］－５－メチルウリジン（１１ａ）の合成
化合物１０ａ（１７３．１ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をピリジンとともに８回蒸発させ、アルゴン雰囲気下、乾燥ピリジン（４ｍＬ）に溶解した。化合物１０ａの溶液に、４－メトキシトリチルクロリド（２１８．２ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を周囲温度で１８時間撹拌した。反応物をＥｔＯＨ（２ｍＬ）でクエンチした。混合物を減圧下で蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（各４０ｍＬ）で３回、ブライン（各４０ｍＬ）で２回洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（８０：２０～０：１００、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ２５ｇ）カラム上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物１１ａを含有する画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物１１ａ（２６０．６ｍｇ、８９％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1.38 (s, 3H, 5-Me), 2.15-2.20 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO2-), 2.81 (d, 3H, J = 5.2 Hz, -SO2NHMe), 3.00 (d, 1H, J = 6.9 Hz, 3'-OH), 3.13-3.18 (m, 1H, -CH 2CH2CH2SO2-), 3.21-3.27 (m, 1H, -CH 2CH2CH2SO2-), 3.43 (dd, 1H, J = 2.5, 11.0 Hz, H5'), 3.54 (dd, 1H, J = 1.7, 11.0 Hz, H5''), 3.80 (s, 6H, MMTr-OMe), 3.87-3.91 (m, 1H, -CH2CH2 CH 2SO2-), 3.94-3.98 (m, 1H, -CH2CH2 CH 2SO2-), 4.06 (dd, 1H, J = 3.8, 4.9 Hz, H2'), 4.09-4.11 (m, 1H, H4'), 4.47 (q, 1H, J = 5.9 Hz, H3'), 4.72 (q, 1H, J = 5.0 Hz, -SO2 NHMe), 6.00 (d, 1H, J = 3.5 Hz, H1'), 6.83-6.86 (m, 2H, MMTr-H), 7.24-7.32 (m, 7H, DMTr-H), 7.40-7.42 (m, 4H, MMTr-H), 7.65 (d, 1H, J = 0.7 Hz, 6-H), 9.01 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3): δ 11.9, 24.3, 48.0, 55.4, 62.5, 68.7, 69.3, 82.8, 83.8, 87.4, 111.6, 113.5, 127.5, 128.2, 128.5, 130.3, 134.9, 135.3, 143.8, 144.0, 150.7, 159.0, 163.8; ESI-TOF mass: calcd. for C34H39N3NaO9S+ [M+Na]+ 688.2299, found 688.2309.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1.38 (s, 3H, 5-Me), 2.15-2.20 (m, 2H, -CH2 CH 2CH2SO2-), 2.81 (d, 3H, J = 5.2 Hz, -SO2NHMe), 3.00 (d, 1H, J = 6.9 Hz, 3'-OH), 3.13-3.18 (m, 1H, -CH 2CH2CH2SO2-), 3.21-3.27 (m, 1H, -CH 2CH2CH2SO2-), 3.43 (dd, 1H, J = 2.5, 11.0 Hz, H5'), 3.54 (dd, 1H, J = 1.7, 11.0 Hz, H5''), 3.80 (s, 6H, MMTr-OMe), 3.87-3.91 (m, 1H, -CH2CH2 CH 2SO2-), 3.94-3.98 (m, 1H, -CH2CH2 CH 2SO2-), 4.06 (dd, 1H, J = 3.8, 4.9 Hz, H2'), 4.09-4.11 (m, 1H, H4'), 4.47 (q, 1H, J = 5.9 Hz, H3'), 4.72 (q, 1H, J = 5.0 Hz, -SO2 NHMe), 6.00 (d, 1H, J = 3.5 Hz, H1'), 6.83-6.86 (m, 2H, MMTr-H), 7.24-7.32 (m, 7H, DMTr-H), 7.40-7.42 (m, 4H, MMTr-H), 7.65 (d, 1H, J = 0.7 Hz, 6-H), 9.01 (brs, 1H, N-H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3): δ 11.9, 24.3, 48.0, 55.4, 62.5, 68.7, 69.3, 82.8, 83.8, 87.4, 111.6, 113.5, 127.5, 128.2, 128.5, 130.3, 134.9, 135.3, 143.8, 144.0, 150.7, 159.0, 163.8; ESI-TOF mass: calcd. for C34H39N3NaO9S+ [M+Na]+ 688.2299, found 688.2309.
（１２）５’－Ｏ－（４－メトキシトリチル）２’－Ｏ－［３－（Ｎ－メチルスルホニル）プロパン－１－イル］－５－メチルウリジン３’－Ｏ－（２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルホスホラミダイト）（１２ａ）の合成
化合物１１ａ（２５４．８ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）をピリジンおよびトルエンで各々４回共蒸発させ、アルゴン雰囲気下、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（３８μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（１８．６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および（２－シアノエトキシ）ビス（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（１７０μＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を化合物１１ａの溶液に添加した。混合物を周囲温度で２０時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（各４０ｍＬ）で６回、ブライン（各４０ｍＬ）で２回洗浄した。
有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（９０：１０～０：１００、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲルカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ２５ｇ）上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物１２ａを含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物１２ａ（２０２．１ｍｇ、６１％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 13C-NMR (126 MHz, CDCl3): 31P-NMR (202 MHz, CDCl3): ESI-TOF mass: calcd. for C43H56N5NaO10PS+ [M+Na]+ 888.3378, found 888.3395.
有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ｎ－ヘキサン－ＥｔＯＡｃ（９０：１０～０：１００、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲルカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｆｐａｒ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｄｕｏ ２５ｇ）上のクロマトグラフィーにより精製して、化合物１２ａを含む画分を得た。画分を集め、減圧下で蒸発させて化合物１２ａ（２０２．１ｍｇ、６１％）を得た。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 13C-NMR (126 MHz, CDCl3): 31P-NMR (202 MHz, CDCl3): ESI-TOF mass: calcd. for C43H56N5NaO10PS+ [M+Na]+ 888.3378, found 888.3395.
Ｂ．５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－［４－｛（Ｎ－イソプロピル）スルファモイル｝ブチル］－５－メチルウリジン ３’－（２－シアノエチル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（１２ｂ）の製造
構造（１２ｂ）で示される人工核酸を後述する合成手順（１）～（１２）に従って合成した。
構造（１２ｂ）で示される人工核酸を後述する合成手順（１）～（１２）に従って合成した。
（１）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－２’－Ｏ－［３－ヒドロキシプロピル］－５－メチルウリジン（１）の合成
１，３－プロパンジオール（２ｍＬ）に１Ｍ ＢＨ３・ＴＨＦ（５ｍＬ）をゆっくりと滴下し、撹拌した。その溶液に５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－２，２’－シクロチミジン（９５８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（５８ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を加え、１６０℃で２１時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）３回と飽和食塩水（１００ｍＬ）２回で洗浄操作を行った。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン-酢酸エチルにより精製し、目的化合物１（７７８ｍｇ、７０％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ8.25 (s, 1H), 7.68-7.65 (t, 4H), 7.49 (s, 1H), 7.46-7.43 (m, 2H), 7.41-7.38 (t, 4H), 6.07-6.06 (d, 1H), 4.42-4.40 (t, 1H), 4.11-4.10 (d, 1H), 4.06 (s, 1H), 4.00-3.98 (t, 1H), 3.91-3.88 (m, 2H), 3.84-3.76 (m, 3H), 1.87-1.86 (m, 2H), 1.54 (s, 3H), 1.11 (s, 9H)
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ8.25 (s, 1H), 7.68-7.65 (t, 4H), 7.49 (s, 1H), 7.46-7.43 (m, 2H), 7.41-7.38 (t, 4H), 6.07-6.06 (d, 1H), 4.42-4.40 (t, 1H), 4.11-4.10 (d, 1H), 4.06 (s, 1H), 4.00-3.98 (t, 1H), 3.91-3.88 (m, 2H), 3.84-3.76 (m, 3H), 1.87-1.86 (m, 2H), 1.54 (s, 3H), 1.11 (s, 9H)
（２）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－２’－Ｏ－［３－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）プロピル］－５－メチルウリジン（２）の合成
化合物１（１．１３ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン（２０ｍＬ）に溶解させ、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（８２９ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間反応させた。反応終了後、メタノール（２ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）３回と飽和食塩水（１００ｍＬ）２回で洗浄操作を行った。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン－酢酸エチルにより精製し、目的化合物２（１．１１ｇ、６３％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ7.95 (s, 1H), 7.68-7.65 (m, 4H), 7.44-7.37 (m, 9H), 7.31-7.30 (d, 4H), 7.27 (s, 1H), 7.21-7.18 (t, 1H), 6.82-6.81 (d, 4H), 5.98 (d, 1H), 4.35-4.31 (m, 1H), 4.09-4.06 (d, 1H), 3.97-3.94 (m, 1H), 3.92 (s, 2H), 3.88-3.86 (d, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.74-3.72 (m, 1H), 3.18-3.17 (m, 2H), 2.59-2.58 (d, 1H), 1.91-1.88 (m, 2H), 1.51 (s, 3H), 1.11 (s, 9H)
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ7.95 (s, 1H), 7.68-7.65 (m, 4H), 7.44-7.37 (m, 9H), 7.31-7.30 (d, 4H), 7.27 (s, 1H), 7.21-7.18 (t, 1H), 6.82-6.81 (d, 4H), 5.98 (d, 1H), 4.35-4.31 (m, 1H), 4.09-4.06 (d, 1H), 3.97-3.94 (m, 1H), 3.92 (s, 2H), 3.88-3.86 (d, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.74-3.72 (m, 1H), 3.18-3.17 (m, 2H), 2.59-2.58 (d, 1H), 1.91-1.88 (m, 2H), 1.51 (s, 3H), 1.11 (s, 9H)
（３）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［３－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）プロピル］－５－メチルウリジン（３）の合成
化合物２（１．１１ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（３６４ｍｇ、５．３５ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させた。その溶液にｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシラン（３８７ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解して加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、メタノール（１．５ｍＬ）を加えた後、ヘキサン-酢酸エチル混合溶媒（１：１、ｖ／ｖ、１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）３回と飽和食塩水（１００ｍＬ）２回で洗浄操作を行った。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン－酢酸エチルにより精製し、目的化合物３（１．０９ｇ、８８％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ7.87 (s, 1H), 7.68-7.67 (d, 2H), 7.64-7.63 (d, 2H), 7.44-7.34 (m, 9H), 7.30-7.28 (d, 4H), 7.26 (s, 1H), 7.20-7.19 (m, 1H), 6.82-6.80 (d, 4H), 6.02-6.01 (d, 1H), 4.30-4.29 (t, 1H), 4.03-4.01 (d, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.87-3.85 (t, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.74-3.69 (m, 1H), 3.61-3.56 (m, 1H), 3.13-3.11 (t, 2H), 1.89-1.86 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.11 (s, 9H), 0.85 (s, 9H), 0.03 (s, 3H), 0.01 (s, 3H)
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ7.87 (s, 1H), 7.68-7.67 (d, 2H), 7.64-7.63 (d, 2H), 7.44-7.34 (m, 9H), 7.30-7.28 (d, 4H), 7.26 (s, 1H), 7.20-7.19 (m, 1H), 6.82-6.80 (d, 4H), 6.02-6.01 (d, 1H), 4.30-4.29 (t, 1H), 4.03-4.01 (d, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.87-3.85 (t, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.74-3.69 (m, 1H), 3.61-3.56 (m, 1H), 3.13-3.11 (t, 2H), 1.89-1.86 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.11 (s, 9H), 0.85 (s, 9H), 0.03 (s, 3H), 0.01 (s, 3H)
（４）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［３－ヒドロキシプロピル］－５－メチルウリジン（４）の合成
化合物３（１．０９ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）に４％トリフルオロ酢酸－ジクロロメタン溶液（１１ｍＬ）を加え、室温で１０分反応させた。反応後、氷冷下で反応溶液をピリジン－メタノール混合溶媒（１：１、ｖ／ｖ、１１０ｍＬ）に滴下し、３０分撹拌した。溶媒を減圧留去して得られた残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）３回と飽和食塩水（１００ｍＬ）２回で洗浄操作を行った。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン－酢酸エチルにより精製し、目的化合物４（６８３ｍｇ、９１％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ8.12 (s, 1H), 7.69-7.68 (d, 2H), 7.66-7.64 (d, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.46-7.43 (m, 2H), 7.41-7.37 (m, 4H), 6.06-6.05 (d, 1H), 4.31-4.29 (t, 1H), 4.09-4.07 (d, 1H), 4.02-4.01 (m, 1H), 3.86-3.78 (m, 4H), 3.77-3.72 (m, 1H), 3.68-3.64 (m, 1H) 2.39-2.36 (m, 1H), 1.84-1.82 (m, 2H), 1.53 (s, 3H), 1.12 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.04 (s, 3H)
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ8.12 (s, 1H), 7.69-7.68 (d, 2H), 7.66-7.64 (d, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.46-7.43 (m, 2H), 7.41-7.37 (m, 4H), 6.06-6.05 (d, 1H), 4.31-4.29 (t, 1H), 4.09-4.07 (d, 1H), 4.02-4.01 (m, 1H), 3.86-3.78 (m, 4H), 3.77-3.72 (m, 1H), 3.68-3.64 (m, 1H) 2.39-2.36 (m, 1H), 1.84-1.82 (m, 2H), 1.53 (s, 3H), 1.12 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.04 (s, 3H)
（５）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［４－イソブチルオキシスルホニル－３－ブテン－１－イル］－５－メチルウリジン（５）の合成
化合物４（１．４０ｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、デスマーチンペルヨージナン（１．０８ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間反応させた。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液-飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１：１、ｖ／ｖ、２００ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（２００ｍＬ）３回で抽出操作を行った後、有機層の溶媒を減圧留去した。つづいて、脱水ＴＨＦ（１０ｍＬ）にイソブチルジエチルホスホリルメタンスルホネート（６１０μＬ、２．５２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１３２０μＬ、７．５６ｍｍｏｌ）、臭化リチウム（６６５ｍｇ、７．６６ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分間撹拌した。その溶液に、減圧留去後の残渣を脱水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶かして加え、室温で１８時間反応させた。反応終了後に水（２００ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（２００ｍＬ）３回で抽出操作を行った。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン－酢酸エチルにより精製し、目的化合物５（９８４ｍｇ、５８％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ7.94 (s, 1H), 7.70-7.64 (m, 4H), 7.48-7.38 (m, 7H), 6.94-6.88 (m, 1H), 6.32-6.29 (d, 1H), 6.02 (d, 1H), 4.32-4.30 (t, 1H), 4.10-4.08 (d, 1H), 4.02-4.01 (m, 1H), 3.88-3.87 (d, 3H), 3.85-3.84 (m, 1H), 3.79-3.76 (m, 1H), 3.66-3.62 (m, 1H), 2.59-2.55 (m, 2H), 2.05-1.99 (m, 1H), 1.53 (s, 3H), 1.13 (s, 9H), 0.98-0.96 (d, 6H), 0.89 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.05 (s, 3H)
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ7.94 (s, 1H), 7.70-7.64 (m, 4H), 7.48-7.38 (m, 7H), 6.94-6.88 (m, 1H), 6.32-6.29 (d, 1H), 6.02 (d, 1H), 4.32-4.30 (t, 1H), 4.10-4.08 (d, 1H), 4.02-4.01 (m, 1H), 3.88-3.87 (d, 3H), 3.85-3.84 (m, 1H), 3.79-3.76 (m, 1H), 3.66-3.62 (m, 1H), 2.59-2.55 (m, 2H), 2.05-1.99 (m, 1H), 1.53 (s, 3H), 1.13 (s, 9H), 0.98-0.96 (d, 6H), 0.89 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.05 (s, 3H)
（６）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［４－イソブチリルオキシスルホニルブチル］－５－メチルウリジン（６）の合成
化合物５（１．０２ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）をエタノール（６．４ｍＬ）に溶解させ、氷冷下で水素化ホウ素ナトリウム（７３ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ）を加えて２時間反応させた。反応終了後、酢酸（２２０μＬ）を加えて３０分撹拌し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）３回と飽和食塩水（１００ｍＬ）２回で洗浄操作を行った。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン－酢酸エチルにより精製し、目的化合物６（８０７ｍｇ、７９％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ7.93 (s, 1H), 7.69-7.67 (d, 2H), 7.65-7.64 (d, 2H), 7.47-7.45 (m, 3H), 7.41-7.39 (m, 4H), 6.04-6.03 (d, 1H), 4.30-4.29 (t, 1H), 4.08-4.05 (d, 1H) 4.01 (s, 1H), 3.99-3.97 (m, 3H), 3.84-3.83 (m, 1H), 3.64-3.61 (m, 1H), 3.55-3.51 (m, 1H), 3.15-3.11 (t, 2H), 2.03-1.98 (m, 3H), 1.76-1.73 (m, 2H), 1.53 (s, 3H), 1.12 (s, 9H), 0.99-0.97 (d, 6H), 0.88 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.03 (s, 3H)
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ7.93 (s, 1H), 7.69-7.67 (d, 2H), 7.65-7.64 (d, 2H), 7.47-7.45 (m, 3H), 7.41-7.39 (m, 4H), 6.04-6.03 (d, 1H), 4.30-4.29 (t, 1H), 4.08-4.05 (d, 1H) 4.01 (s, 1H), 3.99-3.97 (m, 3H), 3.84-3.83 (m, 1H), 3.64-3.61 (m, 1H), 3.55-3.51 (m, 1H), 3.15-3.11 (t, 2H), 2.03-1.98 (m, 3H), 1.76-1.73 (m, 2H), 1.53 (s, 3H), 1.12 (s, 9H), 0.99-0.97 (d, 6H), 0.88 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.03 (s, 3H)
（７）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［４－スルホナトブチル］－５－メチルウリジン（７）の合成
化合物６（７１７ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を脱水アセトン（９ｍＬ）に溶解させ、ヨウ化ナトリウム（６７２ｍｇ、４．４８ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１９時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてジクロロメタン－メタノールにより精製し、目的化合物７（８４９ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を得た。
1H NMR (DMSO, 500MHz) δ11.37 (s, 1H), 7.65-7.62 (m, 4H), 7.48-7.46 (m, 2H), 7.45-7.41 (m, 5H), 5.84-5.83 (d, 1H), 4.31 (m, 1H), 4.02-4.00 (t, 1H), 3.94-3.92 (m, 2H), 3.77-3.75 (d, 1H), 3.17-3.16 (d, 2H), 2.36-2.34 (m, 2H), 1.55-1.54 (m, 4H), 1.50 (s, 3H), 1.03 (s, 9H), 0.85 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.04 (s, 3H)
1H NMR (DMSO, 500MHz) δ11.37 (s, 1H), 7.65-7.62 (m, 4H), 7.48-7.46 (m, 2H), 7.45-7.41 (m, 5H), 5.84-5.83 (d, 1H), 4.31 (m, 1H), 4.02-4.00 (t, 1H), 3.94-3.92 (m, 2H), 3.77-3.75 (d, 1H), 3.17-3.16 (d, 2H), 2.36-2.34 (m, 2H), 1.55-1.54 (m, 4H), 1.50 (s, 3H), 1.03 (s, 9H), 0.85 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.04 (s, 3H)
（８）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［４－｛１－Ｎ－（１，２，４－トリアゾリル）スルホニル｝ブチル］－５－メチルウリジン（８）の合成
化合物７（３６８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンで３回、脱水トルエンで３回共沸し、脱水アセトン（４．８ｍＬ）に溶解させた。その溶液に１８－クラウン－６エーテル（１４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）とシアヌル酸クロリド（１４２ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で４時間反応させた。その後、１，２，４－トリアゾール（６９５ｍｇ、１０．０６ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１８時間反応させた。得られた反応溶液をセライトろ過し、ろ液を回収して溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン-酢酸エチルにより精製し、目的化合物８（２０６ｍｇ、５４％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ8.70 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.69-7.67 (d, 2H), 7.65-7.64 (d, 2H), 7.47-7.44 (m, 3H), 7.41-7.38 (m, 4H), 6.00-5.99 (d, 1H), 4.27-4.25 (t, 1H), 4.08-4.06 (d, 1H), 3.99 (s, 1H), 3.81-3.78 (m, 2H), 3.69-3.63 (m, 1H), 3.61-3.57 (m, 1H), 3.56-3.53 (t, 2H), 1.86-1.81 (m, 2H), 1.72-1.70 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.12 (s, 9H), 0.87 (s, 9H), 0.04 (s, 3H), 0.01 (s, 3H)
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ8.70 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.69-7.67 (d, 2H), 7.65-7.64 (d, 2H), 7.47-7.44 (m, 3H), 7.41-7.38 (m, 4H), 6.00-5.99 (d, 1H), 4.27-4.25 (t, 1H), 4.08-4.06 (d, 1H), 3.99 (s, 1H), 3.81-3.78 (m, 2H), 3.69-3.63 (m, 1H), 3.61-3.57 (m, 1H), 3.56-3.53 (t, 2H), 1.86-1.81 (m, 2H), 1.72-1.70 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.12 (s, 9H), 0.87 (s, 9H), 0.04 (s, 3H), 0.01 (s, 3H)
（９）５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－Ｏ－［４－｛（Ｎ－イソプロピル）スルファモイル｝ブチル］－５－メチルウリジン（９ｂ）の合成
化合物８（２８４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル（３．６ｍＬ）に溶解させ、イソプロピルアミン（１５３μＬ、１．７８ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で２４時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン－酢酸エチルにより精製し、目的化合物９ｂ（１９１ｍｇ、６８％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ8.07 (s, 1H), 7.69-7.67 (d, 2H), 7.65-7.64 (d, 2H), 7.47-7.44 (m, 3H), 7.42-7.40 (m, 4H), 6.09-6.07 (d, 1H), 4.47-4.45 (d, 1H), 4.27-4.26 (t, 1H), 4.06-4.03 (d, 1H), 4.01 (s, 1H), 3.86-3.84 (t, 1H), 3.81-3.78 (d, 1H), 3.64-3.59 (m, 2H), 3.48-3.45 (m, 1H), 3.03-3.01 (m, 2H), 1.97-1.88 (m, 1H), 1.87-1.82 (m, 1H), 1.72-1.68 (m, 2H), 1.57 (s, 3H), 1.25-1.22 (t, 6H), 1.12 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.02 (s, 3H)
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ8.07 (s, 1H), 7.69-7.67 (d, 2H), 7.65-7.64 (d, 2H), 7.47-7.44 (m, 3H), 7.42-7.40 (m, 4H), 6.09-6.07 (d, 1H), 4.47-4.45 (d, 1H), 4.27-4.26 (t, 1H), 4.06-4.03 (d, 1H), 4.01 (s, 1H), 3.86-3.84 (t, 1H), 3.81-3.78 (d, 1H), 3.64-3.59 (m, 2H), 3.48-3.45 (m, 1H), 3.03-3.01 (m, 2H), 1.97-1.88 (m, 1H), 1.87-1.82 (m, 1H), 1.72-1.68 (m, 2H), 1.57 (s, 3H), 1.25-1.22 (t, 6H), 1.12 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.02 (s, 3H)
（１０）２’－Ｏ－［４－｛（Ｎ－イソプロピル）スルファモイル｝ブチル］－５－メチルウリジン（１０ｂ）の合成
化合物９ｂ（１９１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（２．４ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（６７μＬ、０．４９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン３フッ化水素酸塩（１５７μＬ、０．９７ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２１時間反応させた。反応終了後、トリメチルエトキシシラン（３７８μＬ、２．４３ｍｍｏｌ）を加えて２１時間撹拌し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてジクロロメタン-メタノールにより精製し、目的化合物１０ｂ（８５ｍｇ、８０％）を得た。
1H NMR (DMSO, 500MHz) δ11.31 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 6.93-6.91 (d, 1H), 5.84-5.83 (d, 1H), 5.17-5.16 (t, 1H), 5.09-5.08 (d, 1H), 4.11-4.10 (d, 1H), 3.88-3.86 (t, 1H), 3.84-3.83 (d, 1H), 3.67-3.65 (m, 1H), 3.60-3.54 (m, 2H), 3.51-3.46 (m, 1H), 3.40-3.36 (m, 1H), 2.98-2.95 (t, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.69-1.66 (m, 2H), 1.64-1.60 (m, 2H), 1.09-1.08 (d, 6H)
1H NMR (DMSO, 500MHz) δ11.31 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 6.93-6.91 (d, 1H), 5.84-5.83 (d, 1H), 5.17-5.16 (t, 1H), 5.09-5.08 (d, 1H), 4.11-4.10 (d, 1H), 3.88-3.86 (t, 1H), 3.84-3.83 (d, 1H), 3.67-3.65 (m, 1H), 3.60-3.54 (m, 2H), 3.51-3.46 (m, 1H), 3.40-3.36 (m, 1H), 2.98-2.95 (t, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.69-1.66 (m, 2H), 1.64-1.60 (m, 2H), 1.09-1.08 (d, 6H)
（１１）５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－［４－｛（Ｎ－イソプロピル）スルファモイル｝ブチル］－５－メチルウリジン（１１ｂ）の合成
化合物１０ｂ（８４ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンで３回共沸し、脱水ピリジン（１．９ｍＬ）に溶解させた。その溶液に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（７２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間反応させた。反応終了後、メタノール（０．５ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）３回と飽和食塩水（４０ｍＬ）２回で洗浄操作を行った。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてジクロロメタン-メタノールにより精製し、目的化合物１１ｂ（１１４ｍｇ、８２％）を得た。
1H NMR (DMSO, 500MHz) δ11.38 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.40-7.38 (d, 2H), 7.33-7.30 (t, 2H), 7.27-7.25 (m, 5H), 6.94-6.92 (d, 1H), 6.91-6.89 (d, 4H), 5.84-5.83 (d, 1H), 5.18-5.17 (d, 1H), 4.23-4.20 (m, 1H), 3.98-3.97 (m, 2H), 3.74 (s, 6H), 3.65-3.61 (m, 1H), 3.58-3.54 (m, 1H), 3.40-3.35 (m, 1H), 3.27-3.24 (m, 1H), 3.21-3.19 (m, 1H), 3.00-2.97 (m, 2H), 1.73-1.71 (m, 2H), 1.67-1.63 (m, 2H), 1.41 (s, 3H), 1.09-1.08 (d, 6H)
1H NMR (DMSO, 500MHz) δ11.38 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.40-7.38 (d, 2H), 7.33-7.30 (t, 2H), 7.27-7.25 (m, 5H), 6.94-6.92 (d, 1H), 6.91-6.89 (d, 4H), 5.84-5.83 (d, 1H), 5.18-5.17 (d, 1H), 4.23-4.20 (m, 1H), 3.98-3.97 (m, 2H), 3.74 (s, 6H), 3.65-3.61 (m, 1H), 3.58-3.54 (m, 1H), 3.40-3.35 (m, 1H), 3.27-3.24 (m, 1H), 3.21-3.19 (m, 1H), 3.00-2.97 (m, 2H), 1.73-1.71 (m, 2H), 1.67-1.63 (m, 2H), 1.41 (s, 3H), 1.09-1.08 (d, 6H)
（１２）５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－［４－｛（Ｎ－イソプロピル）スルファモイル｝ブチル］－５－メチルウリジン ３’－（２－シアノエチル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（１２ｂ）の合成
化合物１１ｂ（１１４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンで５回、脱水トルエンで５回、脱水ジクロロメタンで３回共沸し、脱水ジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解させた。その溶液にジイソプロピルエチルアミン（８０μＬ、０．４６ｍｍｏｌ）と２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（５１μＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、ジクロロメタン（２０ｍＬ）で反応溶液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）３回と飽和食塩水（２０ｍＬ）２回で洗浄操作を行った。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてヘキサン－酢酸エチルにより精製し、目的化合物１２ｂ（１１４ｍｇ、７８％）を得た。
1H NMR (DMSO, 400MHz) δ11.39 (s, 1H), 7.55-7.54 (m, 1H), 7.41-7.38 (m, 2H), 7.34-7.23 (m, 7H), 6.94-6.87 (m, 5H), 5.84-5.82 (m, 1H), 4.45-4.35 (m, 1H), 4.15-4.07 (m, 2H), 3.83-3.71 (m, 7H), 3.67-3.62 (m, 1H), 3.60-3.49 (m, 4H), 3.43-3.36 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.25-3.21 (m, 1H), 2.98-2.93 (m, 2H), 2.79-2.76 (m, 1H), 2.61-2.57 (m, 1H), 1.71-1.64 (m, 4H), 1.42-1.38 (m, 3H), 1.13-1.07 (m, 15H), 0.97-0.95 (m, 3H)
1H NMR (DMSO, 400MHz) δ11.39 (s, 1H), 7.55-7.54 (m, 1H), 7.41-7.38 (m, 2H), 7.34-7.23 (m, 7H), 6.94-6.87 (m, 5H), 5.84-5.82 (m, 1H), 4.45-4.35 (m, 1H), 4.15-4.07 (m, 2H), 3.83-3.71 (m, 7H), 3.67-3.62 (m, 1H), 3.60-3.49 (m, 4H), 3.43-3.36 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.25-3.21 (m, 1H), 2.98-2.93 (m, 2H), 2.79-2.76 (m, 1H), 2.61-2.57 (m, 1H), 1.71-1.64 (m, 4H), 1.42-1.38 (m, 3H), 1.13-1.07 (m, 15H), 0.97-0.95 (m, 3H)
実施例３：アンチセンス核酸の合成及び評価
２’位にメチルスルホニルプロパン基を含むオリゴヌクレオチドの二重鎖安定性、酵素耐性、ルシフェラーゼアッセイを用いたアンチセンス活性について調べるために表１に示す配列（ＯＮ１、ＯＮ２ａ、ＯＮ２ｂ、ＯＮ３ａ、ＯＮ３ｂ、ＯＮ４ａ、ＯＮ４ｂ、ＯＮ６ａ、ＯＮ６ｂ、ＯＮ７ａおよびＯＮ７ｂ）をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機ｎＳ－８ＩＩで化合物１２ａ（実施例１参照）をオリゴヌクレオチド鎖中へと導入した。縮合時間は１２分２回おこない、標準のアミダイトより長い時間行なった。
２’位にメチルスルホニルプロパン基を含むオリゴヌクレオチドの二重鎖安定性、酵素耐性、ルシフェラーゼアッセイを用いたアンチセンス活性について調べるために表１に示す配列（ＯＮ１、ＯＮ２ａ、ＯＮ２ｂ、ＯＮ３ａ、ＯＮ３ｂ、ＯＮ４ａ、ＯＮ４ｂ、ＯＮ６ａ、ＯＮ６ｂ、ＯＮ７ａおよびＯＮ７ｂ）をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機ｎＳ－８ＩＩで化合物１２ａ（実施例１参照）をオリゴヌクレオチド鎖中へと導入した。縮合時間は１２分２回おこない、標準のアミダイトより長い時間行なった。
ＯＮ５、ｃＲＮＡ１とｃＲＮＡ２は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎから購入した。はじめに、２’－Ｏ－［３－（Ｎ－メチル）スルホニルプロパン］を含むオリゴヌクレオチドの二重鎖融解温度を測定した（表２）。ＯＮ１とＯＮ２ａ、ＯＮ２ｂの熱融解温度はそれぞれ５６．３、５５．１、５６．０℃と決定された。同様にＯＮ３ａとＯＮ３ｂ、ＯＮ４ａとＯＮ４ｂの熱融解温度は５５．１、５５．５、５５．５、５６．４℃となった。これらの結果から、すでに報告されているＭＣＥ修飾とほぼ同等の二重鎖安定性を有していることが示唆された。
つづいて、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ毒からの３’から５’－エキソヌクレアーゼであるホスホジエステラーゼＩを使用して、ＯＮ４ａとＯＮ４ｂ酵素耐性を評価した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液中、ＯＮ７ａとＯＮ７ｂの終濃度が２．５μＭになるように調整し、ＳＶＰＤＥ ０．００００２単位／μＬを用いて３７℃で反応させ、１０分、２０分、３０分、６０分、１２０分の時に２μＬ取り、０．１％ＢＰＢ、１０Ｍ尿素、５０ｍＭ ＥＤＴＡを８μＬ加えて反応停止した。そのうち４μＬをゲル電気泳動のサンプルとして用いた。ネイティブＰＡＧＥで分析し、各時間での残留している完全長オリゴヌクレオチドを、フルオロイメージャーを使用して定量した（図１参照）。図１の結果から、ＴＭＳＰを導入したＯＮ７ｂは比較として用いたＴＭＣＥが導入されたＯＮ７ａと同等の安定性であることを明確に示している。半減期はもとの完全長オリゴヌクレオチドの５０％が残ったポイントから計算され、ＯＮ７ａに対して正規化した。ＯＮ７ｂ４ｂの相対的な半減期は０．９とほぼ同等である。
ＭＣＥ修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＭＯＥ修飾されたオリゴヌクレオチドより３倍の半減期を示すことが以前に報告されている（https://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2019/ob/c9ob00668k）。ＯＮ７ａと比較してＴＭＳＰが導入されたＯＮ７ｂは２．１倍を示しており、ＴＭＣＥよりもヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの分解に対して安定であると考えられる。
本発明者らは、ＨＷＥ反応を用いた増炭反応を用いて炭素数３のスルホニルプロパン骨格を足場とした［３－（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｐｒｏｐａｎｅ］ ５－ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅを２’位の新たな修飾基を含むアミダイトユニットを合成するためのスキームを開発しました。トリアゾリル活性化体を用いることでカルバモイルエチル型修飾核酸と同様に種々のアミンを導入することが可能となった。ＴＭＳＰのオリゴヌクレオチドへの導入を行ったのちに、二重鎖安定性、エキソヌクレアーゼによる酵素耐性を評価した。その結果、すでに報告されているＭＣＥ修飾と同等の二重鎖融解温度を示すことを明らかとし、相補鎖への親和性を維持しながらＭＣＥより高い酵素耐性を示すことが明らかとした。今後、直鎖アルキル基やカチオン性、アニオン性の修飾基の導入や、末端にアジド基を有するアミンを使用することで外部アルケンとのクリック反応可能な官能基の共役リンカーとしてもちいてバイオオルソゴナルな反応も可能となれば、新たな機能性核酸の開発促進に貢献できる可能性がある。
本発明のアンチセンス分子及び該アンチセンス核酸等は、生体内で分解されずにかつ標的核酸に対する結合能を保持することができるため、実用性の高いアンチセンス核酸医薬の開発に大きく貢献するものである。
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
Claims (7)
- 五炭糖の２’位にアミノスルホニルアルコキシ基を有する人工核酸。
- 下記の式（Ｉ）：
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基であり；
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なり、水素原子、水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、保護基で保護されたリン酸基、又は－Ｐ（ＯＲ４）Ｒ５〔ここで、Ｒ４は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり；Ｒ５は、－Ｎ（Ｒ６）２（ここで、Ｒ６は、独立して、Ｃ１～６アルキル基、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルであるか、又は２つのアルキル基が互いに結合して環を形成する）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基である〕であり；
Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヒドロキシアルキル、及びアミノアルキルからなる群から選択され；
Ｘは、Ｃ１～５アルキレン基である］
で表される、請求項１に記載の人工核酸。 - Ｒ１が、水素原子、又は水酸基の保護基であり；
Ｒ２が、リン酸基であり；
Ｒ３が、メチル基である、
請求項１に記載の人工核酸。 - アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチジーン核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、又はリボザイムに導入するための、請求項１～３のいずれか１項に記載の人工核酸。
- ５～１５塩基のデオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有する架橋型のアンチセンス核酸であって、前記ウイング領域又はギャップ領域において、請求項１～４のいずれか１項に記載の人工核酸が１個又は複数個が挿入され、及び／又は天然の塩基を有する核酸がそれにより置換されている、上記アンチセンス核酸。
- ２’，４’－修飾された核酸が、下記：
Ｒ７は、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ８及びＲ９は、同一であるか又は異なり、各々独立して、水素原子、又は構造：
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択される、請求項５に記載のアンチセンス核酸。 - 請求項１～４のいずれか１項に記載の人工核酸を製造する方法であって、
下記の式（ＩＩ）：
で表される出発物質をＣ１～５アルキレングリコールと反応させて、下記の式（ＩＩＩ）：
Ｒ１、Ｒ２、及びＢは、請求項１に定義される通りであり；
Ｘ’は、Ｃ２～４アルキレン基である〕
で表される化合物を得、さらにＸに結合した水酸基をアルデヒドに酸化後、Ｈｏｒｎｅｒ－Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ－Ｅｍｍｏｎｓ（ＨＷＥ）反応により増炭させて、下記の式（Ｉ）：
で表される生成物を得ることを含む方法。
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