CN107709555A - 用于Cas9介导的基因编辑的合成的单向导RNA - Google Patents
用于Cas9介导的基因编辑的合成的单向导RNA Download PDFInfo
- Publication number
- CN107709555A CN107709555A CN201680028148.3A CN201680028148A CN107709555A CN 107709555 A CN107709555 A CN 107709555A CN 201680028148 A CN201680028148 A CN 201680028148A CN 107709555 A CN107709555 A CN 107709555A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rna
- synthesis
- unidirectional
- oligonucleotides
- nucleotides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
Abstract
本发明提供了包含通过接头连接的两个独立功能序列(通常称为crRNA和tracrRNA)的合成的单向导RNA。当与真核细胞中的RNA向导的内切核酸酶例如cas9一起使用时,这些合成的单向导RNA分子可用于基因编辑。合成的单向导RNA的可用性使高通量基因编辑的筛选变得简单和方便。
Description
发明领域
本发明涉及基因编辑领域。
发明背景
多年来,研究人员研究了寡核苷酸用于控制细胞内活性的用途。已探索的方法是那些依赖于反义技术和RNA干扰(“RNAi”)技术的方法。这些技术中的每一种都利用了寡核苷酸基于相关核苷酸序列的互补程度来靶向一个或多个其它核酸的一个或多个区域的能力。
最近研究的与控制DNA活性有关的一个领域是使用CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统利用约40%-60%的细菌和约90%的古细菌中天然存在的蛋白质。天然存在的CRISPR蛋白与某些类型的非翻译RNA的结合已经显示赋予这些原核生物对外源DNA的抗性。在这些原核生物中,CRISPR基因座由排列在操纵子中的cas基因和CRISPR阵列组成,CRISPR阵列由独特的基因组靶向序列组成,所述基因组靶向序列被称为间隔区并且穿插有相同的重复序列。
最近,研究人员报告开发了使用Cas9来控制基因表达的方法,Cas9是使用来自II型CRISPR系统的RNA向导的DNA内切核酸酶。典型地,他们描述了当与向导RNA(“gRNA”)共表达时,使用衍生自化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9蛋白的成功的基因编辑。在这种情况下,gRNA是两个单独的RNA分子的嵌合分子,即DNA靶向序列(crRNA)与非靶向反式激活序列(tracrRNA)融合。或者,可以通过在表达Cas9的细胞中使用两种单独合成的RNA(crRNA和tracrRNA)或通过两种单独合成的RNA(crRNA和tracrRNA)和Cas9表达载体、Cas9蛋白或Cas9mRNA共转染入细胞来实现有效的基因编辑。不幸的是,由于其大小(~116nt)和低产量,单向导RNA分子的化学合成尚不可能实际应用。本发明解决了这个问题。
发明概述
本发明涉及用于调节和/或修饰DNA的多种化学合成的单向导RNA分子。通过使用本文公开的各种技术,包括寡核苷酸及寡核苷酸:蛋白质复合物,本领域技术人员可以高效地和有效地控制细胞或生物体内的细胞中的活性。
根据第一个实施方案,本发明提供了合成的单向导RNA,其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸,所述第一寡核苷酸含有与靶DNA中的序列互补的序列,所述第二寡核苷酸含有与定点修饰多肽相互作用的序列,其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸通过非磷酸二酯共价键连接。第一寡核苷酸的长度通常为约25-60个核苷酸,第二寡核苷酸的长度通常为约40-100个核苷酸。其中的任一核苷酸可以被化学修饰,例如2'-修饰。
共价键的实例包括但不限于具有选自以下组的化学部分的那些:氨基甲酸酯、醚、酯、酰胺、亚胺、脒、氨基三嗪、腙、二硫化物、硫醚、硫酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磺酰胺、磺酸酯、砜(fulfones)、亚砜、脲、硫脲、酰肼、肟、三唑、光不稳定键、C-C键形成基团如Diels-Alder环加成对或闭环复分解反应对(ring-closing metathesis pair)和Michael反应对。
定点修饰多肽是RNA-向导的DNA内切核酸酶,其具有与合成的单向导RNA相互作用的RNA结合部分和显示定点酶促活性例如双链DNA切割的活性部分。定点修饰多肽的一个实例是衍生自II型CRISPR系统的Cas9,并且Cas9多肽可以是天然存在的野生型蛋白质、突变型Cas9(例如点突变,缺失突变或截短的)、或与另一种功能性肽融合的嵌合多肽。靶DNA是任何DNA,优选真核生物DNA,更优选哺乳动物DNA,最优选人DNA。靶序列可以是DNA的模板链的编码区、DNA的非模板链的编码区、非编码区如DNA的模板链的启动子区或DNA的非模板链的启动子区、模板链或非模板链的增强子区、或模板链或非模板链的绝缘子区(insulatorregion)。靶序列也可以是编码长非编码RNA(lncRNA)的非编码序列。
根据第二个实施方案,本发明提供了包含第一个实施方案的合成的单向导RNA和定点修饰多肽或编码定点修饰多肽的多核苷酸的组合物。定点修饰多肽的一个实例是衍生自II型CRISPR系统的Cas9,并且Cas9多肽可以是天然存在的野生型蛋白质、突变型Cas9(例如点突变,缺失突变或截短的)、或与另一种功能性肽融合的嵌合多肽。在某些实施方案中,编码修饰多肽的多核苷酸是已经在体外转录的cas9mRNA。在其他实施方案中,编码修饰多肽的多核苷酸是表达修饰蛋白的质粒DNA或表达修饰多肽的病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)。
根据第三个实施方案,本发明提供了靶DNA的位点特异性修饰的方法,所述方法包括将第一个实施方案的合成单向导RNA和定点修饰多肽或编码定点修饰多肽的多核苷酸引入细胞或与细胞接触。定点修饰多肽的一个实例是衍生自II型CRISPR系统的Cas9,并且Cas9多肽可以是天然存在的野生型蛋白质、突变型Cas9(例如点突变,缺失突变或截短的)、或与另一种功能性肽融合的嵌合多肽。在某些实施方案中,编码修饰多肽的多核苷酸是已经在体外转录的cas9mRNA。在其他实施方案中,编码修饰多肽的多核苷酸是表达修饰蛋白的质粒DNA或表达修饰多肽的病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)。
此外,本发明提供了第一个实施方案的合成的单向导RNA的文库。文库可以由至少10、30、50、75或至少100种RNA分子、至少500种RNA分子或至少1000种RNA分子组成,每种RNA分子靶向靶DNA中的不同序列。在这种情况下,靶DNA可以是由多种sgRNA靶向的相同基因或由例如每种靶向不同基因的sgRNA所靶向的多个基因。该文库还可以是至少2种合成的单向导RNA的池的形式或是每个孔中单独的RNA的多孔格式。
本发明的各种实施方案提供增加的基因编辑效率、特异性和易用性中的一种或两种。
附图说明
图1显示了制备3'-叠氮基-腺苷聚苯乙烯支持物的步骤。
图2显示了制备5'-己炔亚磷酰胺的步骤。
图3举例说明了本发明的单向导RNA的合成步骤。
图4显示了T7E1错配检测试验的结果,证实了与通过使用以crRNA:tracrRNA复合的两个单独分子进行相同靶基因的切割(泳道C)相比,已经被接头连接的99个核苷酸的合成单向导RNA能够以可比的效率水平切割人类PPIB基因(泳道D和泳道E);泳道A:未缀合的合成99聚体;泳道B:未缀合的合成81聚体。
发明详述
本发明提供了寡核苷酸分子、复合物、系统、其他组合物以及用于产生和使用这些分子、复合物、系统和其他组合物的方法,以调节和/或修饰真核生物DNA和/或染色质和/或与DNA和/或染色质相关的其他部分的内源区域。通过本发明的各种实施方案,本领域技术人员可以以期望的特异性水平高效且有效地改变体外和体内活性。
定义
除非上下文中另有说明或提示,否则以下单词、短语、缩写和首字母缩略词具有以下提供的含义:
缩写“Cas”是指CRISPR相关部分,例如来自II型系统的蛋白质如Cas9或其衍生物。Cas9蛋白质构成天然存在的情况下依赖于活化tracrRNA和靶向crRNA之间形成的碱基配对结构以切割双链DNA的酶家族(即RNA向导的DNA内切核酸酶)。在天然存在的tracrRNA:crRNA二级结构中,crRNA的3'端22个核苷酸与成熟tracrRNA的5'端附近的片段之间碱基配对。这种相互作用产生了一种结构,其中例如crRNA的5'端20个核苷酸可以在不同的crRNA中变化,并且当crRNA与Cas蛋白结合时可用于与靶DNA结合。
缩写“CRISPR”是指规律成簇间隔短回文重复。CRISPR也被称为SPIDR——间隔穿插直接重复,并构成DNA基因座家族。这些基因座通常由短的和高度保守的DNA重复组成,例如重复1-40次且至少部分回文结构的24-50个碱基对。重复序列通常是物种特异性的,并且通过恒定长度例如20-58个碱基对的可变序列间隔开。CRISPR基因座也可以编码一种或多种蛋白质和一种或多种不翻译成蛋白质的RNA。因此,“CRISPR-Cas”系统是与细菌或古细菌相同或衍生自细菌或古细菌并含有至少一个由CRISPR基因座编码或衍生的Cas蛋白的系统。例如,化脓性链球菌SF370II型CRISPR基因座由四个基因组成,包括Cas9核酸酶的基因以及两个非编码RNA:包含由相同重复(DR)间隔的核酸酶向导序列(间隔区)的tracrRNA和pre-crRNA阵列。
缩写“crRNA”是指CRISPR RNA。crRNA可以得自CRISPR阵列,其可以被组成型地转录为单链长RNA,然后在特定位点加工。crRNA也可以化学合成。crRNA分子包含DNA靶向区段和形成靶向DNA的RNA的蛋白质结合区段的不完全dsRNA双链体的一半的一段核苷酸。
术语“向导RNA”和“单向导RNA”在本文中可互换使用。当通过化学手段制备向导RNA(gRNA)时,其被称为“合成的单向导RNA”或“合成的sgRNA”。向导RNA是指包含两种不同功能序列(crRNA和tracrRNA)(以它们的天然大小或形式或经修饰)的多核苷酸序列。gRNA可以用表达载体表达或化学合成。合成的sgRNA可以包含核糖核苷酸或其类似物或其修饰形式、或修饰形式的类似物、或非天然核苷。合成的单向导RNA也可以含有修饰的骨架或非天然的核苷间键。
如本文所用,术语“接头”是指连接至少两个单独的寡核苷酸分子的化学实体。在一些实施方案中,第一寡核苷酸和第二寡核苷酸通过第一寡核苷酸的3'端和第二寡核苷酸的5'端共价连接。或者,第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可以通过第一寡核苷酸的5'端和第二寡核苷酸的3'端共价连接。
术语“核苷酸”包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中,每个核苷酸是核糖核苷酸或其类似物或其修饰形式,或修饰形式的类似物。核苷酸包括包含嘌呤核碱基的物质,例如腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物,以及嘧啶,例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物。
经修饰的碱基的实例包括但不限于核苷酸,例如以下核苷酸:腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和辫苷,其中已有通过置换或添加一个或多个原子或基团的修饰。置换或添加可能导致核苷酸在一个或多个位置被烷基化、卤化、硫醇化、胺化、酰胺化或乙酰化。
经修饰的碱基的更具体实例包括但不限于5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、脱氮核苷酸如7-脱氮腺苷、6-氮尿苷(6-azouridine)、6-氮胞苷(6-azocytidine)、6-氮胸苷(6-azathymidine)、5-甲基-2-硫代尿苷、和其它硫代碱基如2-硫代尿苷和4-硫代尿苷和2-硫代胞苷、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷、萘基和取代的萘基、任何O-烷基化和N-烷基化的嘌呤和嘧啶如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧代乙酸、吡啶-4-酮和吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基如氨基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯、用作G-夹核苷酸的经修饰的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶(azapyrimidine)、羧基羟基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。
经修饰的核苷酸还包括那些对糖部分修饰的核苷酸,以及具有不是核糖基的糖或其类似物的核苷酸。例如,糖部分可以是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4'-硫代核糖、以及其它糖、杂环或碳环。糖部分的一种修饰是2'位置的修饰。2'-核糖修饰的实例包括但不限于用诸如-H(氢)、-F、-NH3、-OCH3和其它O-烷基部分(例如-OC2H5和-OC3H7)、烯基部分、炔基部分和原酸酯部分的部分置换-OH基团。
术语“互补”是指多核苷酸与另一多核苷酸形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的多核苷酸链或区域中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补多核苷酸链或区域可以以Watson-Crick方式(如A与T、A与U、C与G)、或以其他任何允许形成稳定双链体的方式碱基配对。不完全互补是指两个链或两个区域的一些核苷酸单元(但不是全部)可以彼此氢键结合的情况。本文公开的合成的单向导RNA包含与靶DNA中的序列互补的长度为例如10-20个核苷酸的核苷酸序列。然而这种互补性不必是连续的,只要合成的单向导RNA能够以序列依赖的方式用于修饰靶DNA中的序列即可。
短语“定点修饰多肽”是指结合RNA并被靶向至特定DNA序列的多肽或蛋白质。可用于本发明的定点修饰多肽是RNA-向导的DNA内切核酸酶,其通过与其结合的合成单向导RNA分子被靶向特定DNA序列,从而切割双链靶DNA。用于本发明的优选的RNA-向导的DNA内切核酸酶是来自II型CRISPR-Cas系统的Cas9蛋白或其衍生物,其为天然存在的野生型蛋白,突变体Cas9,包含截短的Cas9蛋白或具有与天然Cas9蛋白或Cas9蛋白片段融合的不同功能结构域(例如转录激活因子)的嵌合cas9多肽。
首字母缩略词“PAM”是指前间区序列邻近基序。PAM通常长度为3-5个核苷酸,并位于CRISPR基因序列中前间区邻近、非靶向链的下游或3'端位置。PAM序列和位置可以根据CRISPR-Cas系统类型而变化。例如,在化脓性链球菌II型系统中,PAM具有含有两个G:C碱基对的NGG共有序列,并且在靶DNA内的前间区衍生序列的下游存在一个碱基对。PAM序列存在于靶DNA的非互补链上(前间区),并且PAM的反向互补位于靶DNA序列的5'端。PAM序列对于系统例如衍生定点修饰蛋白的系统可以是特异性的。
如本文中所用,术语“嵌合”应用于核酸或多肽时是指由衍生自不同来源的结构所定义的两个组分。例如,在嵌合多肽背景下使用嵌合,嵌合多肽包括衍生自两种不同多肽的氨基酸序列。嵌合多肽可以含有经修饰的或天然存在的多肽序列。可以与本发明的合成的单向导RNA一起使用的嵌合定点修饰多肽的实例包括但不限于具有修饰靶DNA的酶活性的多肽,例如甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、DNA修复活性、聚合酶活性、重组酶活性、解旋酶活性、整合酶活性。
术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用,并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式,其可以包括化学或生物化学修饰的编码或非编码氨基酸或衍生的氨基酸、和具有经修饰的肽骨架的多肽。
无论何时在说明书中给出范围,例如温度范围、时间范围、序列相同性百分比、序列互补性范围、长度范围或组成或浓度范围、所有中间范围和子范围、以及包含在给定范围内的所有单个值都意图被包括在本公开中。
如本文所使用的,“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”是同义词,并且是包含性的或开放式的,并且不排除额外的未列举的元素或方法步骤。如本文所用,“由......组成”排除权利要求要素中未指定的任何元素、步骤或成分。如本文所用,“基本上由......组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每种情况下,术语“包括”,“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一种可以用另外两个术语中的任一种来代替。本文中说明性地描述的公开内容可适当地在没有本公开中未具体描述任何元素、限制的情况下实施。
合成的单向导RNA
本发明提供了合成的单向导RNA,当与定点修饰多肽如Cas9一起使用时,其可用于修饰靶DNA中的特定基因座。合成的单向导RNA由两个共价连接的寡核苷酸组成。第一寡核苷酸(称为crRNA)含有与靶DNA中的核苷酸序列互补的序列和与tracrRNA相关的序列。第二寡核苷酸(也称为tracrcRNA)由与定点修饰多肽(例如Cas9)相互作用的核苷酸序列和与第一寡核苷酸相关的序列组成。合成的单向导RNA和定点修饰多肽形成复合物,其在以第一寡核苷酸中的互补序列确定的特定序列靶向和裂解靶DNA。
本发明的合成的单向导RNA与通过其它方式(例如载体表达或体外转录)制备的指导RNA相比具有以下几个优点;i)易于设计、制备和测试它们的功能性;ii)如果需要,可以对核苷酸进行化学修饰以增强稳定性和特异性;以及iii)可以构建大量单链gRNA用于高通量(HTP)筛选目的。此外,使用缀合化学连接两个单独的寡核苷酸避免了较长RNA的化学合成收率低的问题。
本发明的合成的单向导RNA通常长约65-160个核苷酸,例如长约66-120个核苷酸、约70-110个核苷酸、约81-99个核苷酸。在一个实施方案中,第一寡核苷酸长约25-60个核苷酸,第二寡核苷酸长约40-100个核苷酸。在一些实施方案中,第一寡核苷酸的长度为约30-55个核苷酸、长度为约35-50个核苷酸、或长度为约40-45个核苷酸。在第一寡核苷酸中,存在与靶序列互补的区域或序列(“靶向序列”)。在一些实施方案中,靶向序列长18、19或20个核苷酸。应该理解,靶向序列不需要与靶序列100%互补。靶向序列可以包含与靶序列至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%互补性。在一些实施方案中,第二寡核苷酸的长度为约50-90个核苷酸、长度为约60-80个核苷酸或长度为约70-75个核苷酸。在某些情况下,第一寡核苷酸可包含长度为18个核苷酸的靶向序列和长度为至少7个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸或至少22个核苷酸的tracr相关序列。在一些情况下,第一核苷酸长约42个核苷酸且第二核苷酸长约74个核苷酸。在某些实例中,第一核苷酸长约34个核苷酸且第二核苷酸长约65个核苷酸。在另一实例中,第一核苷酸长34个核苷酸且第二核苷酸长47个核苷酸。
在某些实施方案中,第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的至少一个核苷酸可以被化学修饰。例如,第一和第二寡核苷酸中的任何核苷酸可以包含2'-修饰。在其他实施方案中,合成的sgRNA的第一个核苷酸、第二个核苷酸和最后一个核苷酸可以单独或组合地被化学修饰。在一些实施方案中,除了第一个核苷酸、第二个核苷酸和最后一个核苷酸之外的每个核苷酸在其核糖上含有2'OH基团。在一些情况下,第一寡核苷酸或第二寡核苷酸或者第一和第二寡核苷酸两者可以含有经修饰的寡核苷酸。
本发明的合成的sgRNA可以包含天然存在的任何相应的crRNA和tracrRNA对。本领域已知来自II型CRISPR-Cas9系统的crRNA和tracRNA序列(WO2013/176772)。
缀合第一寡核苷酸和第二寡核苷酸
本发明的合成的单向导RNA典型长度为约65至160个核苷酸并且可以由下式表示:
A-L-B
其中A是长约25-60个核苷酸的第一寡核苷酸,L是柔性接头基团,B是长约40-100个核苷酸的第二寡核苷酸。
为了制备本发明的单向导RNA,首先使用标准亚磷酰胺合成方案(Herdewijn,Ρ.,ed.,Methods in Molecular Biology Col 288,Oligonucleotide Synthesis:Methodsand Applications,Humana Press,New Jersey(2012))合成两种单独的寡核苷酸(第一寡核苷酸和第二寡核苷酸)。在一些情况下,当合成完成时,第一寡核苷酸或第二寡核苷酸含有用于与第二或第一寡核苷酸连接的合适官能团。然而,如果第一寡核苷酸或第二寡核苷酸不含有用于连接的合适官能团,则可以使用本领域已知的标准方案(Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press(2013))对其进行功能化。
官能团的实例包括但不限于羟基、胺、羧酸、羧酸卤化物、羧酸活性酯、醛、羰基、氯羰基、咪唑基羰基、酰肼(hydrozide)、氨基脲、硫代氨基脲、硫醇、马来酰亚胺、卤代烷基、磺酰基、烯丙基、炔丙基、二烯烃、炔烃和叠氮化物。一旦第一寡核苷酸和第二寡核苷酸被功能化,则可以在两个寡核苷酸之间形成共价化学键或连接。化学键的实例包括但不限于基于氨基甲酸酯、醚、酯、酰胺、亚胺、脒、氨基三嗪、腙、二硫化物、硫醚、硫酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磺酰胺、磺酸酯、砜、亚砜、脲、硫脲、酰肼、肟、三唑、光不稳定键、C-C键形成基团如Diels-Alder环加成对或闭环复分解反应对和Michael反应对的那些。
使用衍生自化脓性链球菌SF370的II型CRISPR-Cas9系统来举例说明本发明。在这个系统中,crRNA长度为42个核苷酸,tracrRNA在其天然存在的状态下长度为74个核苷酸。已经显示在crRNA的3'端22个核苷酸与tracrRNA的5'端附近的片段之间存在碱基配对,这使得与Cas9形成复合物并导致以序列特异性的方式切割双链DNA。
本文公开的合成的单向导RNA的一个实例长99个核苷酸:34聚体的第一寡核苷酸与65聚体的第二寡核苷酸缀合(参见表1,ODN-6)。
第一寡核苷酸(34聚体)的碱基配对区的核苷酸序列如下所示(来自化脓性链球菌SF370):
5'-N20-GUUUUAGAGCUAGA-3'(SEQ ID NO:1),其中N20表示与靶序列互补的序列。
第二寡核苷酸(65聚体)的核苷酸序列如下所示(来自化脓性链球菌SF370):
5'-AAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU-3'(SEQ ID NO:2)
虽然所公开的实例基于衍生自化脓性链球菌的crRNA、tracrRNA和Cas9多肽,本领域技术人员可以调整来自任何II型CRISPR-Cas9系统的crRNA、tracrRNA和cas9多肽的序列以实施本发明。已知的II型CRISPR-Cas9系统包括但不限于那些在嗜热链球菌(S.thermophilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、变异链球菌(S.mutants)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、脑膜炎奈瑟球菌(Ν.meningitides)、多杀巴斯德氏菌(Ρ.multocida)、Μ.mobile中发现的。因此,本领域技术人员可以利用来自这些系统的crRNA和tracrRNA序列,设计和合成如本文所述的sgRNA,以与相应的Cas9多肽、功能同源物或嵌合Cas9一起使用以实现修饰靶DNA。有关细节,包括crRNA和相应的tracrRNA以及Cas9蛋白的核苷酸序列,参见WO2013/176772。
合成的单向导RNA和蛋白复合物
当合成的单向导RNA的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成适当的二级结构时,不管修饰的类型如何,合成的sgRNA都能够与定点修饰多肽结合。定点修饰蛋白包含RNA结合区域和活性区域。RNA结合区域能够与位于或靠近双链区域的sgRNA结合,并且活性区域能够引起针对靶或针对与靶相关的分子或部分的作用。
在一些实施方案中,修饰蛋白是具有内切核酸酶活性的天然存在的Cas9。在其他实施方案中,修饰蛋白是缺乏内切核酸酶活性的非天然存在的Cas9。例如,它可以是衍生自化脓性链球菌的Cas9蛋白,其含有RuvC1和HNH核酸酶结构域的失活性突变(例如D10A和H841A,WO2013/141680)或缺少这些结构域,但任选地被改造以具有不同的活性结构域或失活的活性结构域。
在一些实施方案中,修饰蛋白能够识别靶DNA的前间区序列邻近基序(PAM)和/或直接与DNA元件结合。DNA元件可以是DNA核苷酸或染色质的单链或双链区段,或染色质内的蛋白质(例如组蛋白)。在一些实施方案中,位点特异性活性(例如靶的切割)发生在由以下两者确定的位置:(1)第一寡核苷酸的靶向区域与靶之间的碱基配对互补性;和(ii)靶中的PAM序列。
或者或额外的,修饰蛋白具有解旋酶活性。解旋酶活性允许蛋白质解旋由第一寡核苷酸的靶向序列指定的DNA靶序列。当DNA解旋时,靶向序列可以与DNA靶碱基配对。
方法
本发明的寡核苷酸和复合物可以用于体外或体内以引起细胞内或生物体内的变化。例如,根据本发明,本领域技术人员可以将单链寡核苷酸即合成的单向导RNA引入细胞中,所述合成的单向导RNA包含如上所述连接的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
本领域技术人员还可以引入定点修饰蛋白。修饰蛋白可以在从细胞外部引入单链合成sgRNA之前、之后或同时引入,所述单链合成sgRNA包含通过接头连接到第二寡核苷酸区段的第一寡核苷酸区段。这些组分可以作为复合物引入,或者它们可以在细胞内形成复合物。
引入可以被动地或通过载体引入,并且合成的gRNA和修饰蛋白可以在引入时存在于缓冲液中。因此,在一些实施方案中,修饰蛋白或合成的gRNA或编码修饰蛋白的载体可以是试剂盒的一部分。或者,编码修饰蛋白的信使RNA也可与合成的gRNA一起用于基因编辑。
或者,修饰蛋白可能已经存在于细胞内,或者其可以由细胞内的载体产生。例如,载体可以是包含编码修饰蛋白的DNA多肽的重组表达载体。在一些实施方案中,当使用载体时,其含有诱导型启动子。
在另一个实施方案中,本领域技术人员可以将包含如上所述的化学修饰的寡核苷酸的合成的sgRNA引入细胞中。与其他方法一样,本领域技术人员也可以引入修饰蛋白。修饰蛋白可以在引入向导RNA之前,之后或同时从细胞外部引入。或者,修饰蛋白可能已经存在于细胞内,或者其可以由细胞内的载体产生。在一些实施方案中,当使用载体时,其含有诱导型启动子。
一旦所有组分都在细胞内或细胞核内并形成复合物,则第一寡核苷酸的靶向序列或位于第一寡核苷酸5'端或其附近的靶向区将复合物通过靶向区域与靶的互补性引导至靶。然后复合物的活性区域作用于靶序列,表达靶序列或靶序列附近的部分。
如果一种或多种组分由诱导型启动子产生,则应在开始本方法之前或在实施本方法时引入诱导启动子的分子。
该方法可以引起蛋白质的表达或表达率的增加或降低,或引起转录率的增加或降低。作为非限制性实例,所述方法可引起靶DNA的定点修饰。作为进一步的实例,该方法可以通过修饰蛋白的一个或多个以下活性区引起DNA或相关蛋白的变化:核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、乙二醇酯酶活性、乙酰转移酶活性、去酰基转移酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性或去肉豆蔻酰化活性。例如,如果活性位点是核酸酶,则当进行该方法时,修饰蛋白在靶DNA中引入双链断裂。活性区域可以是天然存在的修饰蛋白的一部分或衍生自天然存在的修饰蛋白,或者可以与天然存在的蛋白或非天然存在的嵌合蛋白的一部分融合。
在一些实施方案中,该方法在允许非同源末端连接或同源性定向修复的条件下进行。此外,在一些实施方案中,该方法包括使靶DNA与供体多肽接触。然后供体多肽可以整合到靶DNA中。有关详细信息,请参见Maggio et al.Trends Biotechnol 2015May 33(5)280-294和Chen et al Nature Methods2011Sept:8(9)753-757。
系统
本发明还提供了系统。该系统包含复合物的每个组分,或可以产生复合物的任何一种或多种组分的载体的组合,和一种或多种寡核苷酸,例如含有crRNA和tracrRNA作为单链RNA分子的寡核苷酸。
在一个实施方案中,本发明提供了用于改变细胞中的部分(moiety)或细胞中的部分(moiety)的表达的系统。该系统包含表达定点修饰蛋白的载体和合成的单向导RNA。细胞可以是或成为经遗传修饰的细胞。在一些情况下,细胞是或衍生自选自以下的细胞:古细菌细胞、细菌细胞、真核细胞、真核单细胞生物体、体细胞、生殖细胞、干细胞、植物细胞、藻类细胞、动物细胞、无脊椎动物细胞、脊椎动物细胞、鱼细胞、蛙细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞、猪细胞、牛细胞、山羊细胞、绵羊细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、非人灵长类动物细胞和人类细胞。
当存在时,载体能够通过转录成可转录成蛋白质的RNA序列表达修饰蛋白。修饰蛋白包含如上所述的寡核苷酸结合区域和活性区域。任选地,载体可以含有诱导型启动子。当使用载体时,载体可以是例如质粒DNA或病毒颗粒。在一个实施方案中,Cas9蛋白由含有ColE1复制起点的质粒上的脱水四环素(aTC)诱导型启动子表达。在另一个实例中,使用强力霉素诱导型表达系统。
在编码修饰蛋白的载体内,可以有编码荧光蛋白和/或选择标记蛋白如嘌呤霉素或杀稻瘟菌素的序列。编码荧光蛋白或标记蛋白的序列可以处于编码修饰蛋白的相同启动子的控制下,或者可以在相同的载体上但是在不同启动子的控制下。或者,它可以存在于不同的载体上在单独的启动子控制下。当存在负责荧光蛋白或选择标记蛋白的单独启动子时,该启动子可以由能够诱导编码修饰蛋白的序列转录的相同或不同分子或刺激诱导。
实施例
在此描述的实施例是用于说明的目的。除非另有规定或从内容明显看出,否则所记载的与一个实施方案有关的任何特征可以与任何其他实施方案来结合使用。
实施例1.制备3'-叠氮基腺苷聚苯乙烯支持物(图1)
1.
N6-异丁酰基-2'-O-[2-(2-羟基乙基)甲基氨基甲酸酯]-3',5'-O-(四异丙基-二
硅氧烷-1,3-二基)腺苷(2):
向含有化合物1(10.0g,17.2mmol)的170mL二氯甲烷(DCM)溶液中加入CDI(1,1'-羰基二咪唑)(2.9g,18.1mmol)。搅拌18小时后,加入2-(甲基氨基)乙醇(5.2g,68.8mmol)。1.5小时后停止反应并蒸发至干燥。在Biotage Isolera上使用100g Ultra柱用乙酸乙酯:MeOH梯度(0→10%)纯化粗物质,得到白色泡沫状物的2(10.8g,93%)。通过RP-HPLC分析化合物2:10.54min,99.4%。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.65(s,1Η)、8.63(s,1Η)、8.10(s,1Η)、6.04(d,J=8.8Hz,1Η)、5.64(d,J=5.3Hz,1Η)、5.15(m,1Η)、4.16-3.98(m,4Η)、3.76(m,2Η)、3.56-3.15(m,3Η)、3.05和2.96(各自为s,3Η)、2.86(s,1Η)、2.59(m,1Η)、1.27(d,J=6.8Hz,6Η)、1.08-1.01(m,28Η)。
N6-异丁酰基-2'-O-[2-(2-叠氮基乙基)甲基氨基甲酸酯]腺苷(3):
向含有化合物2(6.0g,8.8mmol)的44mL DCM溶液中加入三乙胺(2.7g,26.4mmol)。溶液在冰浴上冷却,然后在5分钟内缓慢加入甲磺酰氯(1.2g,10.6mmol)。搅拌30分钟后,反应物用100mL DCM稀释并转移到分液漏斗中。有机相依次用10%柠檬酸(2×50mL),水(1×50mL)和饱和NaCl(1×50mL)洗涤。将有机相通过Na2SO4垫并浓缩至剩下N6-异丁酰基-2'-O-[2-(2-甲磺酸酯-氧基乙基)甲基氨基甲酸酯]-3',5'-O-(四异丙基-二硅氧烷-1,3-二基)腺苷,其为白色泡沫,通过RP-HPLC分析:10.97min,96.7%。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.62(s,1H)、8.58(s,1H)、8.11(s,1H)、6.06(s,1H)、5.64(d,J=4.7Hz,1H)、5.15(m,1H)、4.39-4.26(m,2H)、4.15-3.99(m,3H)、3.85-3.68(m,1H)、3.60-3.41(m,1H)、3.23-3.17(m,1H)、3.07和3.02(各自为s,3H)、1.27(d,J=6.8Hz,6H),1.08-1.00(m,28H)。
将该物质直接溶于20mL二甲基亚砜(DMSO)中,向该溶液中加入叠氮化钠(1.9g,29.2mmol)。然后将悬浮液加热至60℃10小时,然后用100mL水稀释。用Et2O(3×100mL)萃取反应混合物。将混合的乙醚萃取物用水(1×50mL)洗涤,然后用饱和NaCl(1×50mL)洗涤。用Na2SO4干燥溶液,然后浓缩,得到N6-异丁酰基-2'-O-[2-(2-叠氮基乙基)甲基氨基甲酸酯]-3',5'-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)腺苷,为白色泡沫(5.5g,89%),其通过RP-HPLC分析:11.88min,94.1%。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.64(s,1H)、8.61(s,1H)、6.04(d,J=3.1Hz,1H)、5.65(m,1H)、4.16-3.99(m,3H)、3.54-3.37(m,3H)、3.27-3.18(m,1H)、3.05和2.97(各自为s,3H)、1.27(d,J=6.8Hz,6H)、1.08-1.00(m,28H)。
将该物质不经任何额外纯化地置于脱硅烷化步骤上。在0℃向TEMED(4.50g,39.0mmol)的31mL CH3CN溶液中逐滴加入48%HF(1.0mL,27.3mmol)。将该溶液搅拌10分钟并于另一个烧瓶中加入到N6-异丁酰基-2'-O-[2-(2-叠氮基乙基)甲基氨基甲酸酯]-3',5'-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)腺苷(5.5g,7.8mmol)。将反应物搅拌2小时并浓缩至干燥。在Biotage Isolera上使用50g Ultra柱用85:15乙酸乙酯:己烷(0.1%TEMED)至乙酸乙酯中的6%MeOH(0.1%TEMED)的梯度纯化粗物质,得到化合物3,为白色泡沫(3.3g,2%为81%)。通过RP-HPLC分析化合物3:4.78min,96.1%。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ9.08(bs,1H)、8.63(s,1H)、8.21(d,J=3.6Hz,1H)、6.18(d,J=6.1Hz,1H)、5.66和5.59(各自为m,1H)、4.76(m,1H)、4.27(m,1H)、3.00-2.94(m,1H)、3.81-7.77(m,1H)、3.57-73.38(m,1H)、3.31-3.20(m,4H)、2.94和2.84(各自为s,3H)、1.24(d,J=6.8Hz,6H)。
5'-O-二甲氧基三苯甲基-N6-异丁酰基-2'-O-[2-(2-叠氮基乙基)甲基氨基甲酸
酯]-腺苷(4):
向含有化合物3(3.3g,7.1mmol)的70mL DCM溶液中加入N-甲基吗啉(2.3g,21.3mmol)。将DMT-氯化物(2.63g,7.8mmol)以0.2当量增量滴定到反应物中,使得在加入之间红色消失。1.1当量的DMT-氯化物加入花费约20min,反应完成。用50mL DCM稀释反应物,并用饱和NaCl(1×50mL)洗涤。溶液经Na2SO4干燥并浓缩。在Biotage Isolera上使用50gUltra柱用DCM-丙酮梯度(0-30%)纯化粗物质,得到4,为白色泡沫状物(4.7g,86%)。通过RP-HPLC分析化合物4:8.64min,98.9%。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.63(s,1H)、8.57(s,1H)、8.5(s,1H)、7.40-7.16(m,9H)、6.76(d,J=8.6Hz,4Η)、6.32-6.28(m,1H)、5.75和5.67(各自为m,1Η)、4.81-4.75(m,1Η)、4.25(m,1H)、3.75(s,6H)、3.69-3.59(m,5H)、3.51-3.35(3H)、2.98和2.71(各自为s,3H)、1.26(d,J=6.8Hz,6H)。
5'-O-二甲氧基三苯甲基-N6-异丁酰基-2'-O-[2-(2-叠氮基乙基)甲基氨基甲酸
酯]-腺苷-3'-O-谷氨酸三乙基铵盐(5):
向含有化合物4(4.7g,6.1mmol)的50mL DCM溶液中加入N-甲基咪唑(0.25g,3.1mmol)和三乙胺(3.7g,36.6mmol)。向反应混合物中加入戊二酸酐(1.1g,9.8mmol),并在室温下搅拌该溶液18小时。用50mL的DCM稀释反应物并用饱和的5%(重量/体积)KH2PO4(1×40mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥并浓缩。在Biotage Isolera上使用50g Ultra柱用带有2%TEA作为助溶剂的DCM-MeOH梯度(0-13%)纯化粗物质,得到作为白色泡沫的化合物5(4.9g,82%)。通过RP-HPLC分析化合物5:7.47min,95.2%。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.90(bs,1H)、8.64(s,1H)、8.16(d,J=6.3Hz,1H)、7.39(d,J=7.3Hz,2Η)、7.30-7.15(m,7H)、6.78(d,=8.5Hz,4H)、6.34(m,1H)、5.97(m,1H)、5.69(m,1H)、4.33(s,3H)、3.39-3.30(m,6H)、3.12-3.98(m,3H)、2.89和2.87(各为s,3H),2.49-2.30(m,5H),1.97-1.91(m,2H),1.25(m,10H)。
氨基甲基化聚苯乙烯支持物的衍生化(6):
向含有化合物5(0.044g,0.045mmol)的13mL DMF的溶液中加入三乙胺(0.009g,0.09mmol)、BOP(0.022g,0.05mmol)和HOBt(0.007g,0.054mmol)。使溶液活化5min,然后将10.8mL(1.3当量)的该溶液加入到含有氨基甲基化的聚苯乙烯支持物(5g)的30mL DMF的悬浮液中。摇动悬浮液1小时,然后通过DMT测定监测装载。装载确定为6.4umol/g。然后将悬浮液在粗多孔漏斗中过滤并用丙酮(300mL)洗涤。将干燥的载体转移到烧瓶中并在真空干燥器中干燥。干燥过夜后,经装载的支持物用10%乙酸酐和10%N-甲基咪唑的CH3CN溶液封端。振荡该悬浮液3小时,然后通过粗多孔漏斗过滤。剩余的固体材料用丙酮(300mL)洗涤,然后在真空干燥器中干燥备用。
实施例2.制备5'-己炔亚磷酰胺(8)(图2)
用烧瓶中的10mL DCM溶解化合物7(己-5-炔-1-醇,1.4mL),向该溶液中加入N,N-二异丙基胺(1.82mL)。在无水条件下在另一个烧瓶中,用DCM(2mL/mmol膦)稀释亚磷酰化试剂双-(N,N-二异丙基氨基)-氰基乙基膦(1.5当量/每当量的7),将含有0.45M 1H-四唑的MeCN(0.5当量四唑/当量的7)加入并摇动5min。接下来,将活化的亚磷酰化试剂的溶液在室温下加入到充分搅拌的化合物7的溶液中,并在室温下搅拌直到TLC分析反应完成。为了猝灭多余的膦,添加乙醇并将反应混合物再搅拌30min,并在旋转蒸发仪上干燥。产物在硅胶上纯化,得到0.8g亚磷酰胺8。31P NMR(CDCl3,121.5MHz)δ147.0(s)。
实施例3.缀合的寡核苷酸合成(表1和图3)
在MerMade合成仪((Bioautomation Corporation,Irving,ΤX)上化学合成2'-ACE保护的RNA寡核苷酸(ODN-1.1、ODN-2、ODN-3.1、ODN-4、ODN-5、ODN-7和ODN-8),使用聚苯乙烯固体支持物和2'-双(乙酰氧基乙氧基)-甲基醚(2'-ACE)亚磷酰胺。对于ODN-2和ODN-4,使用氨基甲基化的聚苯乙烯支持物6(参见实施例1)。对于ODN-5,使用5'-己炔亚磷酰胺8。完成合成循环后,将支持物上的寡核苷酸在室温下用Na2S2溶液处理,然后用水洗涤。用40%的N-甲基胺水溶液(NMA)从支持物上切割寡核苷酸,在55℃下加热,然后冷冻干燥。将粗RNA进行脱盐,通过HPLC纯化,并且通过UPLC和ESI-MS确认纯化的样品的身份。
ODN-1.2和ODN-3.2:合成后将溶于DMF中的叠氮基乙酸NHS酯(Click ChemicalTools)加入到含有冷冻干燥的3'-氨基烷基修饰的寡核苷酸(2'-ACE保护的ODN-1.1或ODN-3.1)的Na2CO3/NaHCO3缓冲液中。叠氮化物标记的寡核苷酸脱盐并通过反相HPLC纯化。
在Cu(I)存在下的连接反应:5'-己炔修饰的寡核苷酸(2'-ACE保护的ODN-5)(50nmol)溶于水和2M TEAA缓冲液(pH7.0)中。然后加入3'-叠氮化物标记的寡核苷酸(2'-ACE保护的ODN-3.2)(75nmol,10mM溶于DMSO的贮液)。加入5mM抗坏血酸(175μL)的贮液,然后用氩气使溶液脱气。将Cu(II)-TBTA(87uL)的预制溶液(10mM,在55%DMSO中)加入到混合物中。使混合物在室温下反应过夜。使用相同的连接条件,可以将ODN-2或ODN-4与ODN-5缀合以制备靶向两个不同的靶基因的合成sgRNA。
缀合的寡核苷酸(2'-ACE保护的ODN-6)用丙酮沉淀。沉淀物用丙酮洗涤,干燥,并通过反相HPLC纯化。通过加入Dharmacon的2'-脱保护缓冲液(100mM乙酸-TEMED,pH 3.4-3.8)在室温下孵育30min除去2'-ACE基团。缀合的RNA寡核苷酸(ODN-6)通过乙醇沉淀脱盐并备用。
表1:合成寡核苷酸
其中L是:
实施例4.合成的单向导RNA的基因编辑活性
将稳定表达化脓性链球菌Cas9蛋白的HEK293T细胞以每孔10,000个细胞的密度接种在96孔板中。第二天,将crRNA(42聚体,5'-GUGUAUUUUGACCUACGAAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3':SEQ ID NO:13)和tracrRNA(74聚体,5'-AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUU GAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU-3':SEQ ID NO:14)或三种合成的sgRNA,81聚体(ODN-8)、99聚体(ODN-7)和缀合的99聚体(ODN-6)分别重悬于10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl和1mM EDTA至100μM。一起加入crRNA和tracrRNA形成复合物,并使用无菌1XsiRNA缓冲液(Dharmacon,B-002000-UB-100)将RNA进一步稀释至5μM。最终浓度为25nMcrRNA:tracrRNA复合物(25nM的每种crRNA和tracrRNA)或合成的sgRNA用于转染。使用DharmaFECT 1转染试剂(Dharmacon,#T-2001-03)和25nM crRNA:tracrRNA复合物或合成的sgRNA转染细胞。
转染72小时后,通过Phusion HF缓冲液(Thermo Scientific,#F-518L)、蛋白酶K和RNase A在56℃下直接裂解细胞20min,之后在96℃热灭活5min来分离基因组DNA。用在靶基因PPIB中的切割位点侧翼的引物进行PCR。用T7核酸内切酶I(T7EI;NEB,#M0302L)在37℃处理500ng PCR产物25min,并在2%琼脂糖凝胶上分离样品。使用ImageJ计算每个样本中编辑百分比(indel形成)。
如图4所示,如T7E1错配检测测定所证实的,已经缀合的合成sgRNA(表1中99聚体标记为ODN-6)对基因编辑有活性(参见泳道D和E)。在图4中还显示了几个对照RNA分子;泳道A是99聚体的合成的RNA(未缀合),泳道B是81聚体的合成的RNA(未缀合),两者均在基因编辑中有活性。81聚体具有与99聚体相同的crRNA(34个核苷酸),但序列从tracrRNA的3'端截短(5-GUGUAUUUUGACCUACGAAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3':SEQ ID NO:12)。与crRNA:tracrRNA复合物(泳道C)相比,未纯化的一批缀合物(D区)和纯化的一批缀合物(泳道E)产生显著的编辑。如泳道F所示,缀合反应的前体不产生编辑。设计20聚体靶向序列(5'-GUGUAUUUUGACCUACGAAU-3';SEQ ID NO:15)以靶向人PPIB基因的外显子2的起点,chrl5:64,454,334-64,454,353。
本申请中引用的所有参考文献以与本文不矛盾的程度通过引用整体并入本文。
序列表
<110> 达尔马科恩有限公司
K·何
E·M·安德森
M·O·德莱尼
<120> 用于Cas9介导的基因编辑的合成的单向导RNA
<130> 281174-2
<140> To be determined
<141> 2016-04-07
<150> US 62/162209
<151> 2015-05-15
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n at positions 1 to 20 is a, g, c or u.
<400> 1
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaga 34
<210> 2
<211> 65
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 2
aauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu 60
gcuuu 65
<210> 3
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> A at position 34 is linked to C6-NH2 moiety.
<400> 3
gcugaauuac ucacgcccca guuuuagagc uaga 34
<210> 4
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> A at position 34 is linked to C6-N3 moiety.
<400> 4
gcugaauuac ucacgcccca guuuuagagc uaga 34
<210> 5
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> A at position 34 is linked to
2'-O-[2-(2-azidoethyl)methylcarbamate]).
<400> 5
gcugaauuac ucacgcccca guuuuagagc uaga 34
<210> 6
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> A at position 34 is linked to C6-NH2.
<400> 6
guguauuuug accuacgaau guuuuagagc uaga 34
<210> 7
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> A at position 34 is linked to C6-N3.
<400> 7
guguauuuug accuacgaau guuuuagagc uaga 34
<210> 8
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> A at position 34 is linked to
2'-O-[2-(2-azidoethyl)methylcarbamate].
<400> 8
guguauuuug accuacgaau guuuuagagc uaga 34
<210> 9
<211> 65
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> A at position 1 is linked to hexyne.
<400> 9
aauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu 60
gcuuu 65
<210> 10
<211> 99
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(35)
<223> A at position 34 is joined via a linker (L) to A at position 35.
<400> 10
guguauuuug accuacgaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 99
<210> 11
<211> 99
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 11
guguauuuug accuacgaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 99
<210> 12
<211> 81
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 12
guguauuuug accuacgaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu g 81
<210> 13
<211> 42
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 13
guguauuuug accuacgaau guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 14
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 14
aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60
ucggugcuuu uuuu 74
<210> 15
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 15
guguauuuug accuacgaau 20
Claims (26)
1.合成的单向导RNA,包括:
(i)含有与靶DNA中的序列互补的序列的第一寡核苷酸;
(ii)含有与定点修饰多肽相互作用的序列的第二寡核苷酸,
其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸通过非磷酸二酯共价键连接。
2.权利要求1的合成的单向导RNA,其中所述第一寡核苷酸的长度为约25-60个核苷酸,且所述第二寡核苷酸的长度为约40-100个核苷酸。
3.前述权利要求中任一项的合成的单向导RNA,其中所述共价键包含选自以下的化学部分:氨基甲酸酯、醚、酯、酰胺、亚胺、脒、氨基三嗪、腙、二硫化物、硫醚、硫酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磺酰胺、磺酸酯、砜、亚砜、脲、硫脲、酰肼、肟、三唑、光不稳定键、C-C键形成基团如Diels-Alder环加成对或闭环复分解反应对、和Michael反应对。
4.前述权利要求中任一项的合成的单向导RNA,其中所述定点修饰多肽是Cas9多肽。
5.前述权利要求中任一项的合成的单向导RNA,其中所述Cas9多肽衍生自化脓性链球菌(S.pyogenes)。
6.权利要求1-4的合成的单向导RNA,其中所述Cas9多肽衍生自嗜热链球菌(S.thermophilis)。
7.前述权利要求中任一项的合成的单向导RNA,其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸的至少一个核苷酸是经化学修饰的。
8.权利要求7的合成的单向导RNA,其中所述经化学修饰的至少一个核苷酸包含2'-修饰。
9.前述权利要求中任一项的合成的单向导RNA,其中所述定点修饰多肽是嵌合定点修饰多肽。
10.前述权利要求中任一项的合成的单向导RNA,其中所述靶DNA是哺乳动物DNA。
11.权利要求10的合成的单向导RNA,其中所述哺乳动物DNA是人类DNA。
12.前述权利要求中任一项的合成的单向导RNA,其中所述Cas9多肽包含至少一个突变,使得酶活性降低或消除。
13.一种组合物,包括:
(i)合成的单向导RNA,包括:
(a)含有与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列的第一寡核苷酸;
(b)含有与定点修饰多肽相互作用的序列的第二寡核苷酸,其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸通过非磷酸二酯共价键连接;
(ii)定点修饰多肽或者编码其的多核苷酸,所述定点修饰多肽包括:
(a)与所述合成的单向导RNA相互作用的RNA结合部分;和
(b)展现定点的酶活性的活性部分,其中所述酶活性的位点由所述合成的单向导RNA的核苷酸序列确定。
14.权利要求13的组合物,其中所述合成的单向导RNA的长度为约65-160个核苷酸。
15.权利要求13-14的组合物,其中所述共价键包含选自以下的化学部分:氨基甲酸酯、醚、酯、酰胺、亚胺、脒、氨基三嗪、腙、二硫化物、硫醚、硫酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磺酰胺、磺酸酯、砜、亚砜、脲、硫脲、酰肼、肟、三唑、光不稳定键、C-C键形成基团如Diels-Alder环加成对或闭环复分解反应对和Michael反应对。
16.权利要求13-15的组合物,其中所述定点修饰多肽是Cas9多肽。
17.权利要求13-16的组合物,其中所述合成的单向导RNA含有至少一个经化学修饰的核苷酸。
18.权利要求17的组合物,其中所述经化学修饰的核苷酸包含2'-修饰。
19.一种靶DNA的位点特异性修饰的方法,所述方法包括:使所述靶DNA与以下接触:
(i)合成的单向导RNA,其中所述合成单向导RNA包括:
(a)含有与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列的第一寡核苷酸;
(b)含有与定点修饰多肽相互作用的序列的第二寡核苷酸,其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸通过非磷酸二酯共价键连接;和
(ii)定点修饰多肽或者编码其的多核苷酸,其中所述定点修饰多肽包括:
(a)与合成的单向导RNA相互作用的RNA结合部分;和
(b)展现定点酶活性的活性部分。
20.权利要求19的方法,其中所述合成的单向导RNA的长度为约65-160个核苷酸。
21.权利要求19-20的方法,其中所述共价键包含选自以下一组的化学部分:氨基甲酸酯、醚、酯、酰胺、亚胺、脒、氨基三嗪、腙、二硫化物、硫醚、硫酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磺酰胺、磺酸酯、砜、亚砜、脲、硫脲、酰肼、肟、三唑、光不稳定键、C-C键形成基团如Diels-Alder环加成对或闭环复分解反应对和Michael反应对。
22.权利要求19-21的方法,其中所述定点修饰多肽是Cas9多肽。
23.权利要求19-22的方法,其中所述合成的单向导RNA含有至少一个经化学修饰的核苷酸。
24.权利要求19-23中任一项的方法,其中所述靶DNA是体内染色体的一部分。
25.权利要求19-23的方法,其中所述靶DNA是体外染色体的一部分。
26.权利要求1的合成的单向导RNA的文库,其中所述文库包含至少10种RNA分子。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562162209P | 2015-05-15 | 2015-05-15 | |
US62/162,209 | 2015-05-15 | ||
PCT/US2016/026444 WO2016186745A1 (en) | 2015-05-15 | 2016-04-07 | Synthetic single guide rna for cas9-mediated gene editing |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107709555A true CN107709555A (zh) | 2018-02-16 |
Family
ID=57320191
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680028148.3A Pending CN107709555A (zh) | 2015-05-15 | 2016-04-07 | 用于Cas9介导的基因编辑的合成的单向导RNA |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180142236A1 (zh) |
EP (1) | EP3294880A4 (zh) |
JP (1) | JP2018515142A (zh) |
CN (1) | CN107709555A (zh) |
WO (1) | WO2016186745A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111088357A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-01 | 深圳大学 | 针对escc的肿瘤标志物及其应用 |
CN114144202A (zh) * | 2019-05-02 | 2022-03-04 | 达尔马科恩有限公司 | 用于载体的多重shRNA |
Families Citing this family (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6261500B2 (ja) | 2011-07-22 | 2018-01-17 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善 |
US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US9840699B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for nucleic acid editing |
WO2016022363A2 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
US10059940B2 (en) * | 2015-01-27 | 2018-08-28 | Minghong Zhong | Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents |
WO2017004261A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof |
US11279928B2 (en) | 2015-06-29 | 2022-03-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same |
US20190225955A1 (en) | 2015-10-23 | 2019-07-25 | President And Fellows Of Harvard College | Evolved cas9 proteins for gene editing |
US11845933B2 (en) | 2016-02-03 | 2023-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Structure-guided chemical modification of guide RNA and its applications |
WO2018005873A1 (en) | 2016-06-29 | 2018-01-04 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas systems having destabilization domain |
KR102547316B1 (ko) | 2016-08-03 | 2023-06-23 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도 |
AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
EP3565895A1 (en) * | 2016-12-30 | 2019-11-13 | Editas Medicine, Inc. | Synthetic guide molecules, compositions and methods relating thereto |
US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
EP3592777A1 (en) | 2017-03-10 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
AU2018234825B2 (en) | 2017-03-15 | 2020-12-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Novel CAS13B orthologues CRISPR enzymes and systems |
US11268082B2 (en) | 2017-03-23 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
CN110799645A (zh) | 2017-04-12 | 2020-02-14 | 博德研究所 | 新型vi型crispr直系同源物和系统 |
WO2018204777A2 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identification and modification of lncrna associated with target genotypes and phenotypes |
US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
WO2019005884A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR / CAS-ADENINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION |
WO2019014564A1 (en) | 2017-07-14 | 2019-01-17 | Editas Medicine, Inc. | SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES |
WO2019023680A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE) |
WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
EP3749764A1 (en) | 2018-02-08 | 2020-12-16 | Zymergen, Inc. | Genome editing using crispr in corynebacterium |
WO2019183000A1 (en) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | University Of Massachusetts | Modified guide rnas for crispr genome editing |
JP2021523745A (ja) | 2018-05-16 | 2021-09-09 | シンテゴ コーポレイション | ガイドrna設計および使用のための方法およびシステム |
US20210269799A1 (en) * | 2018-06-29 | 2021-09-02 | Editas Medicine, Inc. | Synthetic guide molecules, compositions and methods relating thereto |
KR20210053898A (ko) | 2018-07-31 | 2021-05-12 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 신규 crispr 효소 및 시스템 |
KR20210056329A (ko) | 2018-08-07 | 2021-05-18 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 신규 cas12b 효소 및 시스템 |
US20210317429A1 (en) | 2018-08-20 | 2021-10-14 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9 |
WO2020051507A1 (en) | 2018-09-06 | 2020-03-12 | The Broad Institute, Inc. | Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery |
SG11202105083XA (en) | 2018-11-14 | 2021-06-29 | Broad Inst Inc | Crispr system based droplet diagnostic systems and methods |
WO2020124050A1 (en) | 2018-12-13 | 2020-06-18 | The Broad Institute, Inc. | Tiled assays using crispr-cas based detection |
KR20210123309A (ko) * | 2019-01-25 | 2021-10-13 | 신테고 코포레이션 | Crispr 활성을 조절하는 시스템 및 방법 |
US20220119871A1 (en) | 2019-01-28 | 2022-04-21 | The Broad Institute, Inc. | In-situ spatial transcriptomics |
CA3130488A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | David R. Liu | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
WO2020206036A1 (en) | 2019-04-01 | 2020-10-08 | The Broad Institute, Inc. | Novel nucleic acid modifier |
WO2020236972A2 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | The Broad Institute, Inc. | Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems |
WO2020236967A1 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | The Broad Institute, Inc. | Random crispr-cas deletion mutant |
CN115244176A (zh) * | 2019-08-19 | 2022-10-25 | 钟明宏 | 向导rna-cas蛋白复合物的缀合物 |
US20220325296A1 (en) | 2019-09-12 | 2022-10-13 | The Broad Institute, Inc. | Engineered adeno-associated virus capsids |
WO2021055874A1 (en) | 2019-09-20 | 2021-03-25 | The Broad Institute, Inc. | Novel type vi crispr enzymes and systems |
AU2020391215A1 (en) * | 2019-11-27 | 2022-06-02 | Bayer Healthcare Llc | Methods of synthesizing RNA molecules |
GB2614813A (en) | 2020-05-08 | 2023-07-19 | Harvard College | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
US20210388348A1 (en) * | 2020-05-12 | 2021-12-16 | University Of Massachusetts | Modified guide rnas for crispr genome editing |
WO2023192384A1 (en) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | University Of Massachusetts | Tetrazine-derived linkers for single guide rnas |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130046084A1 (en) * | 2011-08-16 | 2013-02-21 | Tom Brown | Oligonucleotide ligation |
WO2013176772A1 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription |
CN104109687A (zh) * | 2014-07-14 | 2014-10-22 | 四川大学 | 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用 |
WO2015070083A1 (en) * | 2013-11-07 | 2015-05-14 | Editas Medicine,Inc. | CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6383808B1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-05-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of clusterin expression |
US6277967B1 (en) * | 1998-07-14 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages |
AU3497701A (en) * | 2000-02-08 | 2001-08-20 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleozymes with endonuclease activity |
CA2512484A1 (en) * | 2003-01-16 | 2004-05-08 | Hybridon, Inc. | Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides |
MX2013000986A (es) * | 2010-07-28 | 2013-07-03 | Alcon Res Ltd | Sirna dirigido al vegfa y metodos de tratamiento in vivo. |
US9637739B2 (en) * | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
EP2970997A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-01-20 | Regents of the University of Minnesota | Engineering plant genomes using crispr/cas systems |
DK3004349T3 (en) * | 2013-05-29 | 2018-06-06 | Cellectis Sa | A method for producing precise DNA cleavage using CAS9 nickase activity |
EP3998344A1 (en) * | 2014-10-09 | 2022-05-18 | Life Technologies Corporation | Crispr oligonucleotides and gene editing |
CA3013179A1 (en) * | 2016-01-30 | 2017-08-03 | Bonac Corporation | Artificial single guide rna and use thereof |
-
2016
- 2016-04-07 JP JP2018511590A patent/JP2018515142A/ja active Pending
- 2016-04-07 US US15/571,532 patent/US20180142236A1/en not_active Abandoned
- 2016-04-07 EP EP16796879.1A patent/EP3294880A4/en not_active Withdrawn
- 2016-04-07 CN CN201680028148.3A patent/CN107709555A/zh active Pending
- 2016-04-07 WO PCT/US2016/026444 patent/WO2016186745A1/en active Search and Examination
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130046084A1 (en) * | 2011-08-16 | 2013-02-21 | Tom Brown | Oligonucleotide ligation |
WO2013176772A1 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription |
WO2015070083A1 (en) * | 2013-11-07 | 2015-05-14 | Editas Medicine,Inc. | CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS |
CN104109687A (zh) * | 2014-07-14 | 2014-10-22 | 四川大学 | 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114144202A (zh) * | 2019-05-02 | 2022-03-04 | 达尔马科恩有限公司 | 用于载体的多重shRNA |
CN111088357A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-01 | 深圳大学 | 针对escc的肿瘤标志物及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016186745A1 (en) | 2016-11-24 |
US20180142236A1 (en) | 2018-05-24 |
EP3294880A4 (en) | 2018-12-26 |
JP2018515142A (ja) | 2018-06-14 |
EP3294880A1 (en) | 2018-03-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107709555A (zh) | 用于Cas9介导的基因编辑的合成的单向导RNA | |
Flamme et al. | Chemical methods for the modification of RNA | |
JP2693643B2 (ja) | キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチド | |
JP3512818B2 (ja) | 合成触媒オリゴヌクレオチド及び核酸の目標配列の切断方法 | |
US6423493B1 (en) | Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers | |
DE60024660T2 (de) | Menschliche rnase h und entsprechende oligonukleotidverbindungen | |
KR101750640B1 (ko) | 치료제를 위한 올리고머 | |
US8063198B2 (en) | Processes and reagents for desilylation of oligonucleotides | |
RU2719641C1 (ru) | Новые способы получения олигонуклеотидов | |
Venkatesan et al. | Novel phosphoramidite building blocks in synthesis and applications toward modified oligonucleotides | |
WO2008140126A1 (ja) | 1本鎖環状rnaおよびその製造方法 | |
JPH06511155A (ja) | ギャップを有する2′修飾オリゴヌクレオチド | |
BRPI0417830B1 (pt) | métodos para síntese de uma molécula compreendendo uma porção funcional operativamente ligada a um oligonucleotídeo de codificação | |
EP1210357A1 (en) | OLIGONUCLEOTIDE N3'$m(7)P5' THIOPHOSPHORAMIDATES: THEIR SYNTHESIS AND USE | |
PT2172566E (pt) | Método para gerar aptámeros com taxas de dissociação melhoradas | |
TW202113078A (zh) | 於半合成生物體中複製、轉錄及轉譯之試劑及方法 | |
Beaudry et al. | An efficient strategy for the synthesis of circular RNA molecules. | |
KR20200136363A (ko) | 헤어핀형 1개쇄 rna 분자의 제조 방법 | |
US20230392140A1 (en) | Reverse transcription of polynucleotides comprising unnatural nucleotides | |
US20090081679A1 (en) | Compositions and methods for in vivo SELEX | |
EP3187584B1 (en) | Method for non-enzymatic combination of nucleic acid chains | |
WO2021024467A1 (ja) | 一本鎖rnaの製造方法 | |
Masaki et al. | Modification of oligonucleotides with weak basic residues via the 2′-O-carbamoylethyl linker for improving nuclease resistance without loss of duplex stability and antisense activity | |
Mack | Biochemical investigation of lariat debranching enzyme and spliceosomal RNA through the use of backbone branched RNA | |
Alam et al. | Preparation and application of triple helix forming oligonucleotides and single strand oligonucleotide donors for gene correction |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180216 |