CN102821782B - 促卵泡激素的液体配制品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促卵泡激素(hFSH)的水性配制品，该配制品被稳定从而将hFSH的活性维持延长的时间段。

Description

促卵泡激素的液体配制品

相关申请

本申请与2010年2月12日提交的印度临时申请384/MUM/2010相关，并且将其内容通过引用结合在此。

技术领域

本发明涉及一种新颖的人类促卵泡激素(FSH)的水性配制品，该配制品可以在环境温度或体温下长时间保持稳定，以保证合理的保质期。更确切地说，它涉及一种人类促卵泡激素的水性配制品，该配制品包括稳定在一种缓冲剂中的治疗有效量的人类FSH，该缓冲剂包含一种或多种稳定剂、一种非离子型表面活性剂、一种抗氧化剂、无机盐、和一种或多种防腐剂。

背景技术

人类促卵泡激素(FSH)是一种激素，它在促黄体激素(LH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)的协同下，在生殖功能中发挥重要作用。从结构上，FSH是一种异二聚体糖蛋白，由α和β亚基非共价缔合形成。α亚基由92个氨基酸残基构成，而β亚基由111个氨基酸残基构成，每种亚基都保留两个个天冬氨酸连接的糖基化位点。

直到20世纪80年代，FSH的主要来源都是怀孕妇女的尿液。一种进一步纯化形式的、尿液衍生的FSH在20世纪90年代被引入，并且之后从1998年开始，一种重组FSH被开发并广泛使用。随着重组DNA技术的出现，变得有可能在用编码α和β链的核酸序列进行了转染的细胞培养物中生产人类FSH。编码α和β链的DNA序列，和生产重组FSH的方法披露于WO88/10270、WO86/04589和WO0735139中。FSH刺激女性卵巢滤泡的生长和成熟。因此，FSH是一种负责雌性排卵的关键激素，并且被用于治疗无排卵性不孕妇女的不孕症。

当前，在市场上，有四种商业化的重组人类FSH产品；Merck Serono的和及Organon(Schering Plough)的和Follistim都是通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(CHO)中生产的。

总体而言，蛋白质具有非常短的半衰期，并且因暴露在不同因素下如不适宜温度、气液界面、高压、物理/机械压力、有机溶剂和微生物污染中，会经历变性(如聚合、解离和容器表面吸附)。结果，变性蛋白不再具有本身的物理化学特性和生理活性。蛋白质的变性通常是不可逆的，并且因此，蛋白质一旦发生变性，可能不会再将它们的天然特性恢复到初始状态。

具体地讲，具有由两个不同的亚基构成的异二聚体结构的蛋白质如FSH，具有在水溶液中解离以及吸附在容器内表面上的趋势。解离的蛋白质不再具有它们自身的生理活性，并且解离后的单体容易对解离和聚集敏感。另外，吸附在容器内表面删的蛋白质易通过变性过程聚集。当聚合的蛋白质被给予到人体内后，它们可能会是引起多种抗体形成的原因，这些抗体所针对的是一种注入蛋白以及在人体内自然产生的蛋白。因此，所关注的蛋白应该在一个足够稳定的状态下给予。为此，对于发展一种防止蛋白质在溶液中变性的方法进行了大量的研究。

为克服蛋白质的稳定性问题，一些基于蛋白质的药物产品通过冻干(冷冻-干燥)变得更稳定。作为一个实例，US5270057披露了一种冻干配制品，包括用它的多元羧酸或盐稳定的促性腺激素，优选为柠檬酸和一种非还原二糖，蔗糖。US5650390披露了一种冻干配制品，包括通过蔗糖和甘氨酸的组合稳定的FSH、LH或hCG。然而，冻干产品的不方便之处在于：在使用它们之前必须将它们溶解于注射用水(WFI)中进行复水。另外，冻干产品的生产工艺包括一个可能导致冻干的蛋白质被冻伤的冻干步骤。

US5929028披露了一种促性腺激素的稳定液体配制品，通过溶解促性腺激素[例如，LH、TSH(促甲状腺激素)、FSH和hCG]来制备，使用的是由一个稳定量的多元羧酸或其盐、一个稳定量的硫醚化合物、一种非还原二糖(如蔗糖)和一种非离子型表面活性剂组成的一种稀释剂。根据此工艺，柠檬酸钠被描述为多元羧酸或其盐的最优选的形式，并且该配制品包含1.47％的柠檬酸钠。这种组合物在被配药前应该在2℃-8℃下冷藏贮存。在配药后，该产品可以由患者在2℃-8℃下贮存至有效期，或在25℃(77°F)及更低的温度下贮存三个月，以最先发生者为准。

EP1610822的申请描述了FSH、LH、以及FSH与LH的混合物的药物配制品，以及生产此类配制品的方法。该发明描述了FSH或LH或FSH和LH的一种液体或冻干配制品，包括一种选自F77、F87、F88、和F68的表面活性剂。此专利申请中描述的组合物在被配药前需要在2℃-8℃下冷藏。在用稀释剂进行复水后，包含药物产品的Pen装置可能由患者在2℃-8℃下贮存至有效期，或者在室温20℃-25℃下贮存长达三个月或者到有效期，以先发生者为准。

WO2007/037607披露了一种FSH的水性配制品，该配制品被稳定以长时间地保持FSH的活性。该专利申请要求了一种水性配制品，该配制品包括一个治疗有效量的FSH，被稳定在一种包含甘氨酸、甲硫氨酸和一种非离子型表面活性剂(优选为聚山梨醇20)的磷酸盐缓冲剂中，能够将FSH的活性维持一个延长的时间段。该组合物包含甘氨酸、甲硫氨酸、作为稳定剂的聚山梨醇20以及在室温下长达六个月保持稳定并且经历较少氧化的、纯度为90％的FSH。

WO2009/098318的申请披露了一种液体药用组合物，包括一种FSH多肽，以及氯化苄烷铵和苯甲醇作为防腐剂。该组合物进一步包括，可任选地一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，该组合物包含甲硫氨酸作为抗氧化剂。该组合物在2℃至8℃下贮存时表现出良好的贮存稳定性。此FSH水性配制品包括聚山梨醇20作为表面活性剂、甘露醇作为紧张调节剂、磷酸盐作为缓冲剂、甲硫氨酸作为稳定剂、以及苯甲醇和氯化苄烷铵作为防腐剂，它防止蛋白质损耗以及蛋白质解离成构成单体，由此将FSH稳定一个延长的时间段。

从以上工艺中可以看出，在将该FSH组合物配药之前必须将其冷藏贮存在2℃-8℃下。在配药后，该产品可以由患者在2℃-8℃下贮存至有效期，或在25℃(77°F)及以下温度，贮存3个月，以先发生者为准。因此，对于发展一种新颖的、热稳定的FSH水性配制品存在需要，该配制品被稳定以便维持其活性，即使是处于升高的温度(如体温)下，因为FSH是自给药的，并且因此，在旅行中或贮存过程中会便于携带，从而避免将产品维持在冷藏(2℃-8℃)条件下的需要。

本发明是鉴于最终用户所面临的问题而产生的，最终用户可能需要在室温、环境温度或体温下以一种液体形式携带该产品而无需冷藏延长的时间段以保证合理的保质期。

发明内容

本发明提供了一种新颖的人类促卵泡激素(FSH)的水性配制品，该配制品可以在环境温度或体温下长时间保持稳定，以此维持合理的保质期。

在一个方面，本发明提供了一种人类FSH的水性配制品，该配制品包括稳定在一种缓冲系统中的一个治疗有效量的人类FSH，该缓冲系统包括一种或多种稳定剂、一种非离子型表面活性剂、一种抗氧化剂、无机盐、以及一种或多种防腐剂。

在另一方面，本发明提供了一种人类FSH或其变体的配制品，以及一种选自下组的无机盐，该组由以下各项组成：氯化钠、氯化钙和作为耐热剂的氯化钾。

在又另一方面，该配制品包含一种多元醇，该多元醇是蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、或木糖醇，单独或以它们的组合的形式。

人类FSH配制品还由以下各项组成：一种基于聚山梨醇酯的非离子型表面活性剂或一种基于泊洛沙姆的非离子型表面活性剂、或它们的组合。

在一个方面，该新颖的人类FSH水性配制品还包括选自下组的抗氧化剂，该组由以下各项组成：L-甲硫氨酸、亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸(EDTA)盐、丁羟甲苯(BHT)和丁羟苯甲醚(BAH)。

本发明还提供了在人类FSH配制品中加入一种或多种选自下组的防腐剂，该组由以下各项组成：苯酚、间甲苯酚、对苯甲酚、邻甲苯酚、氯甲酚、烷基防腐剂、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞，或它们的组合。

该新颖的人类FSH水性配制品在一个缓冲系统中被维持在pH约6.5到7.2，该缓冲系统选自下组，该组由以下各项组成：磷酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、TRIS和组氨酸，或它们的组合。

本发明提供了一种人类FSH的配制品，该配制品包括氯化钠、海藻糖、甘露醇、聚山梨醇20、L-甲硫氨酸、苯酚、磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠二水合物，并且维持在pH约6.5到7.2。

本发明还提供了一种人类FSH的配制品，包括蔗糖、L-甲硫氨酸、聚山梨醇20、苯酚、磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠脱水物并且维持在pH大约6.5到7.2之间。

附图说明

图1示出了重组人类促卵泡激素组合物的α和β亚基在40℃下保持7天后的解离比较。

条带1：预染标准参照物

条带2：缓冲剂样品

条带3：表1给出的组合物(负载4.4μg的蛋白质)

条带4：参比医药产品(Gonal F RFF-Pen)(负载4.4μg的蛋白质)

条带5：0.22μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的5.0％)

条带6：0.11μg完整FSH(4.4μg的2.5％)

条带7：缓冲剂样品

图2示出了重组人类促卵泡激素组合物的α和β亚基在2℃-8℃下放置3个月的解离比较。

条带1：预染标准参照物

条带2：表1给出的组合物(负载2.2ug的蛋白质)

条带3：0.44μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的10.0％)

条带4：0.22μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的5.0％)

条带5：0.11μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的2.5％)

条带6：0.04μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的1.0％)

条带7：0.02μg无损伤FSH(4.4μg的0.5％)

条带8：0.04μg无损伤FSH(4.4μg的1.0％)

条带9：表1给出的组合物(负载4.4μg的蛋白质)

条带10：表1给出的组合物(负载4.4μg的蛋白质)

条带11：表1给出的组合物(负载4.4μg的蛋白质)

图3示出了重组人类促卵泡激素组合物的α和β亚基在25℃下放置3个月的解离比较。

条带1：预染标准参照物

条带2：表1给出的组合物(负载2.2μg的蛋白质)

条带3：0.44μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的10.0％)

条带4：0.22μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的5.0％)

条带5：0.11μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的2.5％)

条带6：0.04μg解离(通过煮沸)的FSH(4.4μg的1.0％)

条带7：0.04μg无损伤FSH(4.4μg的1.0％)

条带8：0.02μg无损伤FSH(4.4μg的0.5％)

条带9：表1给出的组合物(负载4.4μg的蛋白质)

条带10：表1给出的组合物(负载4.4μg的蛋白质)

条带11：表1给出的组合物(负载4.4μg的蛋白质)

图4示出了表1中给出的组合物与参比医药产品相比的RP-HPLC特征曲线。

图5示出了表1中给出的组合物(红线)与参比医药产品(蓝线)相比的SE-HPLC特征曲线。

具体实施方式

本发明涉及一种新颖的FSH水性配制品，该配制品被稳定以便在升高的温度下维持其活性，其中在55℃下两小时后的解离量小于5％。

在一个实施方案中，本发明的水性配制品包括重组人类促卵泡激素，连同合适的缓冲剂、抗氧化剂、非离子型表面活性剂、一种或多种稳定剂、无机盐、以及可任选的一种或多种防腐剂。

人类促卵泡激素(FSH)由重组DNA技术产生。FSH作为一种复杂的异二聚体蛋白，已选择了一种真核细胞系进行表达工作(中国仓鼠卵巢细胞)。重组人类FSH(rFSH)的药物制品在批量蛋白质来源、纯度、比活性、批次间一致性和促黄体激素活性的完全缺失方面与人类绝经期促性腺素(hMG)以及第一代泌尿FSH(uFSH)不同。

缓冲剂被用于维持该配制品的pH。在另一个实施方案中，在本配制品中使用的缓冲系统包括磷酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、精氨酸、TRIS缓冲剂、组氨酸，单独或者以给出所希望的pH范围(从6.5到8)的合适组合的形式。优选地，所使用的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂，单独或者以组合形式。

如在此使用的，抗氧化剂是指一种在包含FSH的溶液中减少被氧化的FSH杂质/种类的化学品。本发明中使用的抗氧化剂选自下组，该组由以下各项组成：L-甲硫氨酸、亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸(EDTA)盐、丁羟甲苯(BHT)和丁羟苯甲醚(BAH)。更优选地，该抗氧化剂是L-甲硫氨酸。

在本发明中使用非离子型表面活性剂是为了阻止FSH或FSH变异体在小瓶、安瓿、卡普耳(carpoule)、药筒(cartridge)或注射器表面的吸附作用。非离子型表面活性剂使蛋白质溶液的表面张力降低，由此阻止蛋白质对疏水表面的吸附或聚集作用。本发明中使用的非离子型表面活性剂的优选实例可以包括一种基于聚山梨醇酯的非离子型表面活性剂和一种基于泊洛沙姆的非离子型表面活性剂，单独或以组合形式。

本发明使用的稳定剂选自下组，该组由以下各项组成：氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸，单独或以组合形式；单糖，如葡萄糖、果糖、木糖和甘露糖，单独或以组合形式；多元醇，如蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇和木糖醇，单独或以组合形式。在相对高的温度下贮存时，多元醇的存在保护了分子。

防腐剂是指添加到配制品中的赋形剂或物质，当作为多剂量被填充时，其作用为抑菌剂。包含本发明的配制品的一种防腐的FSH或FSH变体优选满足法定的或规定的防腐有效性指导原则，以成为一种商业可行的多剂量产品，优选用于人类。本发明中使用的防腐剂是选自下组，该组由以下各项组成：苯酚、间甲苯酚、对苯甲酚、邻甲苯酚、氯甲酚、烷基防腐剂(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞，单独或以组合形式。

本发明的无机盐包括但不限于氯化钠、氯化钙和氯化钾。这些盐通过升高产品的熔融温度并且同时降低分子的非特异性交互作用而充当耐热剂，由此提高产品在较高温度下的稳定性。它们还防止完整的FSH解离成α和β亚基。

以下实例展示了本发明描述的药用组合物以及实施本发明以获得人类FSH的热稳定的药物配制品的手段。然而，这些实例不应被理解为限制本发明的范围。

实例1

通过重组DNA技术生产重组人类FSH

重组人类FSH是通过标准方法在转染的CHO宿主细胞中生产的。

实例2

使用海藻糖和甘露醇制备hFSH水性配制品

使用包括磷酸二氢钠一水合物与磷酸氢二钠脱水物的配制品缓冲剂制备pH 7.0的磷酸盐缓冲剂。甘露醇、海藻糖和氯化钠作为紧张调节剂及稳定剂被添加到该磷酸盐缓冲剂中。L-甲硫氨酸作为抗氧化剂并且聚山梨醇20作为稳定剂被添加到溶液中，以形成一种配制品缓冲剂，用磷酸溶液或氢氧化钠溶液来调节pH以获得7.0±0.2的pH。用WFI使容量达到100％并且将溶液搅拌均匀。将所要求量的配制品缓冲剂与苯酚混合，以形成均匀的混合物。加入计算出的量的rHu FSH原料药，同时持续搅拌直到均匀的混合物完全形成。

表1：hFSH的配制品

序号	成分	浓度
			1.	促卵泡激素(hFSH)	0.05mg/ml
2.	海藻糖	30mg/ml
			3.	甘露醇	30mg/ml
4.	氯化钠	5.8mg/ml
			5.	磷酸二氢钠一水合物	0.45mg/ml
6.	磷酸氢二钠二水合物	1.1mg/ml
			7.	L-甲硫氨酸	0.5mg/ml
8.	聚山梨醇20	0.1mg/ml
			9.	苯酚	3mg/ml
10.	注射用水

实例3：hFSH水性配制品的稳定性测试

遵照欧洲药典规范进行了生物测试。

通过SE-HPLC检验蛋白质浓度

使用尺寸排阻HPLC法对实例1的配制品评估了FSH的蛋白质含量。

在零时刻以及将配制品在5±3℃、25±2℃下贮存1、2、3和6个月后测量蛋白质含量。结果在表1中作为每克溶剂的FSH微克数列出。

反相HPLC氧化分析

使用反相HPLC方法对实例1的水性配制品评估了FSH的蛋白质含量。

在零时刻以及将配制品在5±3℃、25±2℃下贮存1、2、3和6个月后测量纯度。结果在表2中列出。

解离

对于表1中给出的配制品，通过SDS-PAGE评估了自由亚基的百分比。测量是在零时刻以及将配制品在5±3℃、25±2℃下贮存1、2、3和6个月后进行的。结果在表2中报告。

FSH的体内试验

使用体内生物测定在零时刻以及将配制品在5±3℃、25±2℃下贮存1、2、3和6个月后对表1中配制品的FSH活性进行了测试。结果在表2中作为每克溶剂的国际单位数提供。

pH

在零时刻以及在5±3℃、25±2℃下将配制品贮存1、2、3和6个月后对表1中配制品的pH进行了测量。结果在表2中列出。

SE-HPLC的低聚物测定

表1中的配制品的低聚物百分比，在零时刻以及将配制品在5±3℃、25±2℃下贮存1、2、3和6个月后使用SE-HPLC进行了测量。结果在表2中提供。

实例4：hFSH水性配制品的稳定性测试

通过SE-HPLC检测蛋白质浓度

使用尺寸排阻HPLC法对表1中提供的配制品中FSH的蛋白质含量进行评估。

在40℃下，在零时刻和将配制品贮存1、3、7和15天时进行蛋白质含量的测量。结果作为每克溶剂的FSH微克数在表3中列出。

反相HPLC纯度分析

使用反相HPLC法对实例1中的水性配制品的FSH的蛋白质含量进行评估。

在零时刻以及将配制品在40℃下贮存1、3、7和15天后对纯度进行测量。结果在表3中列出。

氧化

使用反相HPLC法对FSH的氧化形式的百分比进行了测量。

在零时刻以及将配制品在40℃下贮存1、3、7和15天后对氧化形式的FSH的百分比进行了测量。结果在表3中列出。

解离

如表1中的配制品，使用SDS-PAGE估算自由亚基的百分比。在40℃下，在零时刻和贮存配制品的1、3、7和15天时进行测定。结果在表3中提供。

FSH体内试验

使用体内生物测定在零时刻下以及将配制品在40℃下贮存1、3、7和15天后对表1中的配制品的FSH活性进行了测试。结果作为每克溶剂的国际单位数在表2中列出。

pH

实例1的配制品的pH在40℃下，在零时刻和贮存配制品的1、3、7和15天后进行测定。结果在表3中列出。

表3：hFSH配制品的稳定性测试的结果

从以上结果中清楚的是，本发明的水性配制品(如表1中提供)防止解离、氧化、变性并且可以将rHu FSH的活性稳定地维持延长的时间段，该水性配制品包括海藻糖和甘露醇作为稳定剂、聚山梨醇酯作为表面活性剂、甲硫氨酸作为抗氧化剂、以及苯酚作为防腐剂，并且根据本发明使用磷酸盐作为缓冲剂将pH维持在大约6.7到7.2之间。

通过所述发明制备的配制品包括一个有效量的、具有生物活性的人类促卵泡激素，该人类促卵泡激素可以被用于治疗人类不孕症。它们优选的使用方法是作为可注射的水溶液使用。

一种在本发明中描述的新颖的、热稳定的人类促卵泡激素水性配制品具有以下优点：

1.涉及操作简单。

2.涉及使用防止人类促卵泡激素的α和β亚基解离的无机盐。

3.为该水性配制品提供了更好的稳定性以将它的活性维持一个延长的时间段，从而保证一个合理的保质期。

4.为该水性配制品在升高的温度下提供了更好的稳定性。

Claims (3)

1.一种人类FSH的热稳定的水性配制品，包括浓度为5.8mg/ml的氯化钠作为热稳定剂、浓度为30mg/ml的海藻糖作为稳定剂、浓度为30mg/ml的甘露醇作为稳定剂、浓度为0.5mg/ml的L-甲硫氨酸、浓度为0.1mg/ml的聚山梨醇20、浓度为3mg/ml的苯酚、浓度为0.45mg/ml的磷酸二氢钠一水合物和浓度为1.1mg/ml的磷酸氢二钠二水合物，从而将该配制品的pH维持在7.0±0.2。

2.如权利要求1所述的配制品，其中该人类FSH是一种重组FSH。

3.如权利要求1所述的配制品，在升高的温度55℃下热稳定2小时，以及在40℃下热稳定7天。