CN102282173A - 用于治疗骨丢失的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗例如减少骨丢失例如皮质骨丢失且特别是手骨丢失的方法和组合物，其包括施用TNFα抑制剂例如人TNFα抗体或其抗原结合部分。

Description

用于治疗骨丢失的方法和组合物

相关申请

本申请要求于2008年3月24日提交的美国临时申请号61/039028，和于2009年1月29日提交的美国临时申请号61/148313的优先权利益。所有上文提及的优先权申请的内容在此整体引入作为参考。

发明背景

骨丢失的特征在于骨组织的结构退化，这可以导致骨脆性和对骨折的易感性增加。骨丢失与许多疾病相关，包括骨质疏松症、骨关节炎和类风湿性关节炎。

在类风湿性关节炎(RA)中，例如在放射照片上的骨伤害不仅呈现为侵蚀，而且还呈现为关节周围的骨质疏松症。[1]存在关于抑制炎症以避免RA中骨伤害的重要性的数据。通过几个随机化对照临床试验的结果，有效抗炎治疗已显示减少关节侵蚀的进展。[4-6]破骨细胞的炎性活化与两个特征都有关，[2，3]并且使用唑来膦酸二膦酸盐(bisphosphonatezoledronic acid)抑制破骨细胞活性已显示减少侵蚀的进展[3]。

少数研究已提示抗TNF疗法可能具有预防一般骨丢失的能力。例如，抗肿瘤坏死因子(抗TNF)疗法的抗炎作用已显示显著减少RA患者中的放射照相的关节伤害进展。[4-6]还存在抗炎治疗减少泛化的骨质疏松症的证据。[7-9]

由于其在评估早期RA中的炎性骨累及中的灵敏性，已推荐定量手骨测量。[10]然而，仅少数研究已检查抗炎治疗(包括抗TNF疗法)对RA中的手骨丢失的作用。[9，11，12]在采用定量超声(QUS)的一项研究中，抗TNF疗法的使用对关节周围的骨具有正面作用。[11]然而，仅执行了一个随机化对照试验，其中与安慰剂相比较泼尼松龙(每日7.5mg)的抗炎作用显示不仅显著减小放射照相的关节伤害的速率，还显著减小手骨丢失的速率。[12]然而，除其抗炎作用外，泼尼松龙还已知引起骨质疏松症。[12]同样，仍需要用于治疗骨丢失特别是手骨丢失的治疗剂。

发明概述

本发明提供了用于治疗受试者中的骨丢失例如减少和/或预防骨丢失的方法，其包括给受试者施用TNFα抑制剂，例如抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，治疗受试者手中的骨丢失。在一个实施方案中，治疗皮质手骨丢失。

在一个实施方案中，受试者具有与骨丢失相关的病症。在一个实施方案中，受试者具有骨质疏松症。在一个实施方案中，受试者具有骨关节炎。在另外一个实施方案中，受试者具有类风湿性关节炎(RA)。在一个实施方案中，受试者具有骨质疏松症和RA。

在本发明的一个实施方案中，TNFα抑制剂与另外试剂组合施用。在一个实施方案中，TNFα抑制剂与氨甲蝶呤组合施用。在另一个实施方案中，TNFα抑制剂与抗再吸收试剂(antiresorptive agent)组合施用，所述抗再吸收试剂例如阿仑特罗、阿仑特罗加上维生素D3、伊本膦酸钠、利塞膦酸钠、含钙的利塞膦酸钠、唑来膦酸、降钙素、雌激素和雷洛昔芬。在另外一个实施方案中，TNFα抑制剂与骨形成试剂组合施用，所述骨形成试剂例如甲状旁腺激素例如特立帕肽。

在一个实施方案中，施用TNFα抑制剂用于治疗骨丢失的受试者可以就具有骨丢失和/或处于具有骨丢失危险中进行选择。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗受试者中的手骨丢失的方法，其包括选择具有手骨丢失或处于具有手骨丢失危险中的受试者，并且给受试者施用TNFα抑制剂，从而治疗手骨丢失。在另一个实施方案中，本发明的方法对先前选择为具有骨丢失或处于具有骨丢失危险中的受试者执行。

本发明还提供了用于预测骨丢失包括但不限于手骨丢失的方法。本发明提供了可以用于预测受试者中的骨丢失例如手骨丢失的指标。例如，受试者的年龄和/或CRP水平可以用于预测受试者中的手骨丢失。

在本发明的一个实施方案中，TNFα抑制剂是TNFα抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，TNFα抗体或其抗原结合部分是人TNFα抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，TNFα抗体或其抗原结合部分是英夫单抗(inliximab)或戈利木单抗(golimumab)。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分以1×10^-8M或更少的Kd和1×10^-3s^-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离，两者都通过表面等离振子共振进行测定，并且在标准体外L929测定中以1×10^-7M或更少的IC₅₀中和人TNFα细胞毒性。在另一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分具有下述特征：如通过表面等离振子共振测定的，以1×10^-3s^-1或更少的K_off速率常数与人TNFα解离；具有轻链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、8和/或9上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列；并且具有重链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1-5个保守氨基酸取代由SEQID NO：4修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分包括具有CDR3结构域的轻链可变区(LCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列，并且包括具有CDR3结构域的重链可变区(HCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗(adalimumab)。在另一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分是戈利木单抗。

附图简述

图1是在本发明分析中检查的具有早期类风湿性关节炎的患者的流程图。与原始研究J相比较丢失X射线数目在括号中提供。MTX＝氨甲蝶呤；DXR＝数字X射线放射照片测量术(radiogrammetry)；MCI＝掌骨皮质指数；BMD＝骨量(bone mass)密度。

图2显示在研究J的3个治疗组中随着时间过去在DXR-MCI(百分比)和改良的Sharp得分(单位)中的改变(A＝中值，B＝平均值)。Mod.Sharp得分＝改良的总Sharp得分；MTX＝氨甲蝶呤；DXR＝数字X射线放射照片测量术；MCI＝掌骨皮质指数。

图3是累积概率图-在研究J中在104周时DXR-MCI和放射照相得分中的改变。Mod.Sharp得分＝改良的总Sharp得分；MTX＝氨甲蝶呤；DXR＝数字X射线放射照片测量术；MCI＝掌骨皮质指数。

发明详述

I.定义

如本文使用的，术语“人TNFα”(本文缩写为hTNFα，或简单地hTNF)意指作为17kD分泌形式和26kD膜结合形式存在的人细胞因子，其生物活性形式由非共价结合的17kD分子的三聚体组成。hTNFα的结构在例如Pennica，D.，等人(1984)Nature 312：724-729；Davis，J.M.，等人(1987)Biochemistry 26：1322-1326；和Jones，E.Y.，等人(1989)Nature 338：225-228中进一步描述。术语人TNFβ意欲包括重组人TNFα(rhTNFα)，其可以通过标准重组表达法进行制备或进行商业购买(R&D Systems，目录号210-TA，Minneapolis，Minn.)。TNFα在本文中也称为TNF。

术语“TNFα抑制剂”包括干扰TNFα活性的试剂。该术语还包括本文描述的抗TNFα人抗体和抗体部分中的每一种以及美国专利号6,090,382；6,258,562；6,509,015以及美国专利申请系列号09/801,185和10/302,356中描述的那些，所述专利文献各自引入本文作为参考。在一个实施方案中，在本发明中使用的TNFα抑制剂是抗TNFα抗体或其片段，包括英夫单抗(Johnson和Johnson；在引入本文作为参考的美国专利号5,656,272中描述)、CDP571(人源化单克隆抗TNFαIgG4抗体)、CDP 870(

人源化单克隆抗TNFα抗体片段)、抗TNF dAb(Peptech)、CNTO 148(戈利木单抗；Medarex和Centocor，参见WO 02/12502)、和阿达木单抗(

Abbott Laboratories，人抗TNF mAb，在美国专利号6,090,382中描述为D2E7)。可以在本发明中使用的另外TNF抗体在美国专利号6,593,458；6,498,237；6,451,983；和6,448,380中描述，所述专利各自引入本文作为参考。在另一个实施方案中，TNFα抑制剂是TNF融合蛋白，例如依那西普(Amgen；在引入本文作为参考的WO 91/03553和WO 09/406,476中描述)。在另一个实施方案中，TNFα抑制剂是重组TNF结合蛋白(r-TBP-I)(Serono)。

如本文使用的，术语“抗体”意指由4条多肽链——通过二硫键互联的2条重(H)链和2条轻(L)链——组成的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域——CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本发明的抗体在美国专利号6,090,382；6,258,562；和6,509,015中进一步详细描述，所述专利各自整体引入本文作为参考。

如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简单地“抗体部分”)指保留与抗原(例如，hTNFα)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括在铰链区由二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH或VL结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883))。此种单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包括其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且生成2个抗原结合部位(参见例如，Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人(1994)Structure 2：1121-1123)。本发明的抗体部分在美国专利号6,090,382、6,258,562、6,509,015中进一步详细描述，所述专利各自整体引入本文作为参考。

再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的，较大的免疫粘附分子的部分。此种免疫粘附分子的例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6：93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标记，以制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。抗体部分例如Fab和F(ab′)2片段可以使用常规技术由完整抗体进行制备，例如分别地完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，如本文描述的，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得。

如本文使用的，“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基由具有相似侧链的另一个氨基酸残基替换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中进行定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、非荷电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

“嵌合抗体”指这样的抗体，其中重和轻链的氨基酸序列各自的一部分与衍生自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的剩余区段与来自另一个物种的相应序列同源。在一个实施方案中，本发明的特征在于嵌合抗体或抗原结合片段，其中轻和重链的可变区模拟衍生自哺乳动物的一个物种的抗体可变区，而恒定部分与衍生自另一个物种的抗体中的序列同源。在本发明的优选实施方案中，嵌合抗体通过将来自小鼠抗体的CDRs嫁接到人抗体的构架区上进行制备。

“人源化抗体”指包括至少一条这样的链的抗体，所述链包括基本上来自人抗体链(被称为受体免疫球蛋白或抗体)的可变区构架残基和基本上来自非人抗体(例如，小鼠)的至少一个互补性决定区(CDR)。除CDRs嫁接外，人源化抗体一般经历进一步改变，以改善亲和力和/或免疫原性。

术语“多价抗体”指包括超过一个抗原识别位点的抗体。例如，“二价”抗体具有2个抗原识别位点，而“四价”抗体具有4个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性数目(与抗原识别位点数目不同)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点全部结合相同表位。“双特异性”或“双重特异性”抗体具有结合第一种表位的至少一个抗原识别位点和结合与第一种表位不同的第二种表位的至少一个抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有全部结合相同表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其中一些数目结合第一种表位，并且其中一些数目结合与第一种表位不同的第二种表位。

如本文使用的，术语“人抗体”意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点专一诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDRs且特别是CDR3中。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不意欲包括这样的抗体，其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上。

如本文使用的，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、生成或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)，从重组、组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287)，或通过任何其他方法制备、表达、生成或分离的抗体，所述其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接。此种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在特定实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管衍生自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内人抗体种系谱(repertoire)内不天然存在。

此种嵌合、人源化、人和双重特异性抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用下述专利文献中描述的方法：PCT国际申请号PCT/US86/02269；欧洲专利申请号184,187；欧洲专利申请号171,496；欧洲专利申请号173,494；PCT国际公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请号125,023；Better等人(1988)Science240：1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449；Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；美国专利号5,225,539；Jones等人(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等人(1988)Science 239：1534；和Beidler等人(1988)J.Immunol.141：4053-4060，Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)，美国专利号5,530,101，美国专利号5,585,089，美国专利号5,693,761，美国专利号5,693,762，Selick等人，WO 90/07861，和Winter，美国专利号5,225,539。

如本文使用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合hTNFα的分离的抗体基本上不含特异性结合除hTNFα外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hTNFα的分离的抗体与其他抗原例如来自其他物种的TNFα分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学制品。

如本文使用的，“中和抗体”(或“中和hTNFα活性的抗体”)意指其与hTNFα的结合导致hTNFα的生物活性抑制的抗体。hTNFα的生物活性的这种抑制可以通过测量hTNFα生物活性的一种或多种指示物进行评估，例如hTNFα诱导的细胞毒性(在体外或在体内)、hTNFα诱导的细胞活化和hTNFα与hTNFα受体的结合。hTNFα生物活性的这些指示物可以通过本领域已知的几种标准体外或体内测定中的一种或多种进行评估(参见，美国专利号6,090,382)。优选地，抗体中和hTNFα活性的能力通过抑制hTNFα诱导的L929细胞的细胞毒性进行评估。作为hTNFα活性的另外或可替代参数，可以评估抗体抑制hTNFα诱导的在HUVEC上的ELAM-1表达的能力，作为hTNFα诱导的细胞活化的量度。

如本文使用的，术语“表面等离振子共振”指允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度中的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典和Piscataway，N.J.)。关于进一步描述，参见美国专利号6,258,562的实施例1和等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19；

等人(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125；和Johnnson等人(1991)Anal.Biochem.198：268。

如本文使用的，术语“Koff”意指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。

如本文使用的，术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。

如本文使用的，术语“IC50”意指抑制目的生物终点例如中和细胞毒性活性所需的抑制剂浓度。

如本文使用的，术语“剂量”指施用于受试者的TNFα抑制剂的量。

如本文使用的，术语“给药”指施用物质(例如，抗TNFα抗体)以达到治疗目的(例如，治疗骨丢失)。

“给药方案”描述用于TNFα抑制剂的治疗时间表，例如在延长的时间段期间和/或治疗过程自始至终的治疗时间表，例如在第0周时施用TNFα抑制剂的第一剂，随后为在每两周一次给药方案上的TNFα抑制剂的第二剂。在一个实施方案中，给药方案包括每月一次或每4周一次施用TNFα抑制剂，例如人TNFα抗体或其抗原结合部分。

如本文使用的，术语“每两周一次给药方案”、“每两周一次给药”和“每两周一次施用”指给受试者施用物质(例如，抗TNFα抗体)以达到治疗目的的时间过程(time course)，例如治疗过程自始至终。每两周一次给药方案不意欲包括每周一次给药方案。可以例如每9-19天、更优选每11-17天、更加优选每13-15天、并且最优选每14天施用物质。在一个实施方案中，每两周一次给药方案在治疗第0周时在受试者中起始。在另一个实施方案中，维持剂量在每两周一次给药方案上施用。在一个实施方案中，起始和维持剂量根据每两周一次给药方案施用。在一个实施方案中，每两周一次给药包括这样的给药方案，其中在第0周时开始将TNFα抑制剂的剂量每隔一周施用于受试者。在一个实施方案中，每两周一次给药包括这样的给药方案，其中对于给定时间段连续每隔一周将TNFα抑制剂的剂量施用于受试者，例如4周、8周、16周、24周、26周、32周、36周、42周、48周、52周、56周等。每两周一次给药方法也在引入本文作为参考的US 20030235585中描述。

如在短语“与第二种试剂组合的第一种试剂”中的术语“组合”包括第一种试剂和第二种试剂的共施用，其例如可以在相同药学上可接受的载体中溶解或混合，或施用第一种试剂，随后为第二种试剂，或施用第二种试剂，随后为第一种试剂。因此，本发明包括组合治疗性治疗的方法和组合药物组合物。

如在短语“伴随治疗方案”中的术语“伴随”包括在第二种试剂的存在下施用试剂。伴随治疗性治疗方法包括其中共施用第一种、第二种、第三种或另外试剂的方法。伴随治疗性治疗方法还包括其中第一种或另外试剂在第二种或另外试剂的存在下施用的方法，其中第二种或另外试剂例如可以先前已施用。伴随治疗性治疗方法可以通过不同行动者(actor)逐步执行。例如，一个行动者可以给受试者施用第一种试剂，并且第二个行动者可以给受试者施用第二种试剂，并且施用步骤可以同时、或几乎同时或在远隔的时间执行，只要第一种试剂(和另外试剂)在第二种试剂(和另外试剂)的存在下后施用。行动者和受试者可以是相同实体(例如，人)。

如本文使用的，术语“联合治疗”指施用2种或更多种治疗物质，例如抗TNFα抗体和另一种药物。一种或多种其他药物可以在抗TNFα抗体的施用同时、之前或之后施用。

如在本发明的背景中使用的，术语“治疗”意欲包括用于治疗骨丢失例如手骨丢失例如皮质手骨丢失的治疗性治疗，以及预防或抑制措施。例如，术语治疗可以包括在骨丢失例如手骨丢失发作前或后施用TNFα抑制剂，从而预防或去除疾病或病症的症征。作为另一个例子，在骨丢失的临床表现后施用TNFα抑制剂以对抗与骨丢失相关的症状和/或并发症和病症构成疾病的“治疗”。此外，在发作后和在临床症状和/或并发症已发展后施用试剂构成骨丢失的“治疗”，其中施用影响疾病或病症的临床参数和可能疾病的改善。在一个实施方案中，治疗受试者中的骨丢失包括减少病征和症状。

“需要治疗的”那些包括已具有骨丢失的哺乳动物例如人，包括其中待预防疾病或病症的那些。

总的来说，本发明提供了关于用TNFα抑制剂如人TNFα抗体或其抗原结合部分治疗骨丢失例如手骨丢失例如皮质手骨丢失的改进的用途和组合物。涉及用于治疗骨丢失的方法和用途的组合物和制造物品包括试剂盒也预期作为本发明的部分。本发明的各个方面在本文中进一步详细描述。

II.用于治疗骨丢失的用途和组合物

本发明提供了通过给有此需要的受试者施用TNFα抑制剂例如TNFα抗体或其抗原结合部分，治疗骨丢失包括手骨丢失的方法。在一个实施方案中，本发明的方法可以用于治疗具有与另一种病症相关的骨丢失的受试者，所述另一种病症包括例如类风湿性关节炎、骨关节炎和/或骨质疏松症。可以受益于本发明的方法的受试者包括已诊断有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)的那些受试者，以及鉴定为处于关于骨丢失危险中的受试者(包括诊断有与骨丢失相关的病症的受试者)。在一个实施方案中，本发明的方对于治疗手的骨丢失有用。

在一个实施方案中，将TNFα抑制剂例如TNFα抗体或其抗原结合部分施用于具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)的受试者，从而阻止骨丢失的进展，或相当于无治疗的骨丢失减慢骨丢失的进展。因此，本发明的方法可以用于减少受试者中的骨丢失，以及预防进一步的骨丢失。

本发明的一个方面涉及出乎意料的发现：TNFα抑制剂例如人TNFα抗体或其抗原结合部分可以用于治疗手骨丢失。在这个发现之前，使用嵌合TNFα抗体英夫单抗的研究显示，即使治疗的受试者的髋和脊柱中的骨丢失被阻止，但手骨丢失不停止。[9]因此，在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗手骨丢失，包括与RA、骨关节炎和骨质疏松症相关的手骨丢失。本发明的方法和组合物可以用于治疗具有手骨丢失或可能发展手骨丢失的受试者中的手骨丢失。

在一个实施方案中，本发明的方法对于治疗皮质骨丢失有用。与骨小梁或松质骨形成对比，骨皮质或骨密质是致密的且形成骨的表面，促成人骨骼的80％重量。它是极硬的，由具有很少空隙的多个堆积层形成。它的主要功能是支持身体，保护器官，提供用于运动的杠杆，和(与松质骨共同分担)贮存矿物质。如本文描述的，下文提供的实施例的一个发现是TNFα抑制剂可以用于治疗皮质骨丢失。在一个实施方案中，本发明的方法可以用于治疗手的皮质骨丢失。

骨丢失例如皮质骨丢失或手骨丢失例如皮质手骨丢失的治疗可以使用本领域已知的方法进行评估，包括但不限于，数字X射线放射照片测量术(DXR)(Sectra，瑞典)。DXR测量在相同数字化的手上的骨矿物质密度(BMD)和掌骨皮质指数(MCI)，用于评估放射照相的关节伤害。DXR是传统放射照片测量技术的计算机形式。在手放射照片上，计算机自动识别在第二、第三和第四掌骨的最狭窄部分周围的目标区(ROI)，并且测量皮质厚度、骨宽度和孔隙率118次/cm。DXR-BMD定义为：c X VPAcomb X(1-p)，其中c是常数(通过平均起来DXR-BMD等于Hologic QDR-2000设备的中-远侧前臂区的结果决定)；VPA是体积/面积；并且p是孔隙率。DXR-MCI定义为组合皮质厚度除以外部皮质直径，并且是不依赖于骨大小、骨长度和图像捕获设置的相对骨量度。通过其可以测定骨丢失的其他方法的例子在Haugeberg(2008)Best Pract Res Clin Rheumatol 22(6)：1127-39中描述。

在一个实施方案中，本发明提供了改善具有骨丢失的受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分的方法，其包括给有此需要的受试者施用TNFα抑制剂，例如TNFα抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善是在用TNFα抑制剂治疗前受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分的维持。DXR-MCI和/或DXR-BMD得分的此种维持指示骨丢失不是进行性的。可替代地，在一个实施方案中，就骨丢失进行治疗的受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善可以通过DXR-MCI和/或DXR-BMD得分丧失降低的速率进行测量。受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善可以相对于在治疗前测定的起始基线得分进行测量。例如，在TNFα抑制剂治疗约26周或约13次TNFα抑制剂治疗后，受试者可以具有DXR-MCI得分中1.4或更少的减少(例如，相对于基线得分-1.4、-1.3、-1.2、-1.1.、-1.0、-0.9、-0.8、-0.7、-0.6、-0.5、-0.4、-0.3、-0.2、-0.1或0.0)。在另一个例子中，相对于基线得分，受试者的DXR-MCI得分中小于0.44(例如，-0.43、-0.42、-0.41、-0.40、-0.39、-0.38、-0.37、-0.36、-0.35、-0.34、-0.33、-0.32、-0.31、-0.30、-0.29、-0.28、-0.27、-0.26、-0.25、-0.24、-0.23、-0.22、-0.21、-0.20、-0.19、-0.18、-0.17、-0.16、-0.15、-0.14、-0.13、-0.12、-0.11、-0.10、-0.09、-0.08、-0.07、-0.06、-0.05、-0.04、-0.03、-0.02、-0.01)的减少指示受试者中骨丢失的治疗。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者中的骨丢失的方法，其包括在每两周一次给药方案上在第0周时给受试者施用人TNFα抗体或其抗原结合部分，例如人TNFα抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，根据每两周一次给药方案，给具有骨丢失(或处于具有骨丢失危险中)的受试者皮下施用人TNFα抗体或其抗原结合部分。可替代地，根据每月一次给药方案，或由此抗体或其抗原结合部分每4周施用一次的给药方案，给具有骨丢失(或处于具有骨丢失危险中)的受试者施用人TNFα抗体或其抗原结合部分。

在一个实施方案中，通过在每两周一次给药方案上施用人TNFα抗体或其抗原结合部分治疗骨丢失，进行至少约2周、至少约6周、至少约12周、至少约16周、至少约18周、至少约20周、至少约22周、至少约24周、至少约30周、至少约36周、至少约52周至少约72周、至少约96周、至少约104周等。任何上述值之间的值范围也预期包括在本发明的范围内，例如23周、60周、64周等。

在一个实施方案中，TNFα抑制剂例如抗体或其抗原结合部分也可以施用于受试者用于治疗骨丢失，进行以月限定的时间段，例如3个月、6个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、42个月、48个月、54个月、60个月等。任何上述值之间的值范围也预期包括在本发明的范围内，例如38个月、50个月、52个月。

在一个实施方案中，TNFα抑制剂例如抗体或其抗原结合部分也可以施用于受试者用于治疗骨丢失，进行以年限定的时间段，例如1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年等。任何上述值之间的值范围也预期包括在本发明的范围内，例如1.5年、2.2年、3.5年。

在本发明的方法中使用的TNFα抑制剂也可以根据本领域已知的给药决定进行施用。例如，在一个实施方案中，根据基于重量的给药方案，即mg/kg，将TNFα抑制剂施用于受试者用于治疗骨丢失，由此TNFα抑制剂的量由受试者的重量决定。可替代地，TNFα抑制剂可以根据固定剂量或总全身剂量进行施用，由此对于每次施用递送恒定固定量的TNFα抑制剂。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分以10-100mg的固定剂量施用于受试者。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分以40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg等的固定剂量施用于受试者。任何上述值之间的值范围也预期包括在本发明的范围内，例如85mg、95mg，基于上述剂量的范围也一样，例如20-80mg。

在一个实施方案中，TNFα抑制剂的施用是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施方案中，TNFα抑制剂通过静脉内输注或注射进行施用。在另一个实施方案中，TNFα抑制剂通过肌内注射或通过皮下注射(例如，每两周一次，皮下注射)进行施用。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分根据肺技术施用于受试者。

考虑到本文的教导，本文描述的给药方案可以进行调整，以提供最佳所需应答，例如治疗骨丢失。应当指出剂量值可以随着骨丢失的类型和严重程度而改变。应进一步理解对于任何具体受试者，根据规格的教导和个体需要以及施用组合物或监督组合物施用的个人的职业判断，随着时间过去可以调整特定给药方案，并且本文所述的剂量的量和范围仅是示例性的，并且不意欲限制请求保护的本发明的范围或实践。

在一个实施方案中，本发明的方法包括选择具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)或处于具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)危险中的受试者。在另一个实施方案中，本发明的方法包括给受试者施用TNFα抑制剂，所述受试者先前选择为具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)或选择为处于具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)危险中。

在一个实施方案中，手骨丢失的预测值(predictor)在本文描述的实施例中描述，并且包括年龄和/或CRP水平。

本发明的方法和组合物可以用于治疗与另一种病症相关的骨丢失。在一个实施方案中，TNFα抑制剂用于减少具有与骨丢失相关的病症的受试者中的骨丢失，例如手骨丢失。本文描述的方法可以用于预防具有与骨丢失相关的病症或处于具有与骨丢失相关的病症危险中的受试者中的骨丢失也在本发明的范围内。关于与骨丢失相关的病症的另外细节在下文描述。

类风湿性关节炎

肿瘤坏死因子(TNF)是类风湿性关节炎(RA)的发病机理中的关键细胞因子。TNFα已牵涉于激活组织炎症且引起类风湿性关节炎中的关节破坏(参见例如，Moeller，A.，等人(1990)Cytokine 2：162-169；授予Moeller等人的美国专利号5,231,024；Moeller，A.的欧洲专利公开号260610 B1；Tracey和Cerami，同上；Arend，W.P.和Dayer，J-M.(1995)Arth.Rheum.38：151-160；Fava，R.A.，等人(1993)Clin.Exp.Immunol.94：261-266)。除关节破坏外，具有RA的受试者还具有局部和全身骨丢失。

近年来，抑制TNF活性的生物应答调节物已变成用于RA的确定的疗法。阿达木单抗、依那西普和英夫单抗已证实在RA患者中的疾病控制以及放射照相的伤害的延迟和预防中的显著改善(Breedveld等人，Arthritis Rheum 2006；54：26-37；Genovese等人J Rheumatol 2005；32：1232-42；Keystone等人，Arthritis Rheum 2004；50：1400-11；Navarro-Sarabia等人，Cochrane Database Syst Rev 2005 Jul.20；(3)：CD005113；Smolen等人，Arthritis Rheum 2006；54：702-10；St.Clair等人Arthritis Rheum 2004；50：3432-43；van der Heijde等人，ArthritisRheum 2006；54：1063-74)。

就抗TNF疗法对具有类风湿性关节炎(RA)的受试者中的手骨丢失的作用而言，仅进行了少数研究。一个开放群组(open-cohort)研究考察在接受英夫单抗的RA患者中的手BMD改变。在这个群组中，关键发现是即使髋和脊柱中的骨丢失被阻止，但手骨丢失不停止。[9]。因此，尽管用TNFα抑制剂英夫单抗的治疗阻止具有RA的受试者中的全身骨丢失，但英夫单抗未能阻止手中的骨丢失。本发明提供了令人惊讶的发现：TNFα抑制剂例如人TNFα抗体可以用于治疗具有RA的受试者中的骨丢失，包括手骨丢失。

TNFα抑制剂可以用于治疗处于具有骨丢失危险中的受试者中的骨丢失也在本发明的范围内，所述受试者包括例如诊断有RA的受试者。在一个实施方案中，处于发展骨丢失危险中的受试者是具有早期RA或诊断有RA小于3年的受试者。

在一个实施方案中，骨丢失的治疗通过给具有类风湿性关节炎的受试者施用人TNFα抗体或其抗原结合部分来达到，其中人TNFα抗体或其抗原结合部分在每两周一次给药方案上施用。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分以约10-100mg的剂量施用，包括但不限于，约40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg的剂量。在一个实施方案中，人TNFα抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗或戈利木单抗。

令人惊讶的是，如本文所示，已发现人TNFα抗体或其抗原结合部分减少具有类风湿性关节炎(RA)的受试者中的骨丢失，例如皮质骨丢失，例如手的皮质骨丢失，这不依赖于其对临床评估的疾病活动性的作用。同样，TNFα抑制剂疗法的利益可以在具有RA的受试者中获得，所述受试者不显示临床改善，因为骨丢失可以不依赖于临床参数进行治疗。

骨质疏松症

本发明的方法可以用于治疗具有骨质疏松症或处于具有骨质疏松症危险中的受试者中的骨丢失，例如手骨丢失。骨质疏松症是特征在于低骨量和骨组织的结构退化的疾病。骨质疏松症可以导致骨脆性和对骨折的易感性增加，特别是髋、脊柱和腕，尽管任何骨都可以受影响。骨质疏松症的例子包括但不限于，特发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症和髋关节一过性骨质疏松症(transient osteoporosis of the hip)。

骨量减少是其中骨矿物质密度低于正常的状况，并且也可以根据本发明的方法进行治疗。骨量减少通常被视为骨质疏松症的前身。同样，TNFα抑制剂可以用于减少或预防具有骨量减少的受试者中的骨丢失，包括手骨丢失。

骨质疏松症和骨量减少不仅可以起因于衰老和生殖状态，还可以继发于众多疾病和病症，以及由于众多药物的延长使用，例如抗惊厥剂(例如，用于癫痫)、皮质类固醇(例如，用于类风湿性关节炎和哮喘)和/或免疫抑制剂(例如，用于癌症)。例如，糖皮质激素诱导的骨质疏松症是通过服用糖皮质激素药物引起的骨质疏松症形式，所述糖皮质激素药物例如泼尼松(强的松、Orasone等)、泼尼松龙(Prelone)、地塞米松(氟美松、甲氟烯索)和可的松(Cortone Acetate)。这些药物经常用于帮助控制许多风湿性疾病，包括类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病和风湿性多肌痛。其中骨质疏松症可以是继发性的其他疾病包括但不限于，青少年类风湿性关节炎、糖尿病、成骨作用不全、甲状腺功能亢进、甲状旁腺机能亢进、Cushing氏综合征、吸收不良综合征、神经性厌食和/或肾脏疾病。此外，众多行为已与骨质疏松症相关，例如长时间不活动或不动、营养不足(特别是钙，维生素D)、导致闭经(不存在月经期)的锻炼过度、吸烟和/或酗酒。

值得注意的是，具有风湿性病学病症如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、全身性红斑狼疮和多关节青少年特发性关节炎的患者处于骨质疏松症增加的危险中，作为其疾病的部分或由于其他危险因素(特别是皮质类固醇疗法)。同样，在一个实施方案中，本发明的方法可以用于治疗具有类风湿性关节炎的受试者中的骨质疏松症。

骨关节炎

本发明的方法可以用于治疗具有骨关节炎或处于具有骨关节炎危险中的受试者中的骨丢失，例如手骨丢失。肿瘤坏死因子已牵涉于骨关节炎的病理生理学(Venn等人(1993)Arthritis Rheum.36：819；Westacott等人(1994)J Rheumatol.21：1710)。骨关节炎(OA)也被称为肥大性骨关节炎、骨关节病和退行性关节病。OA是骨骼关节的慢性退行性疾病，其影响所有年龄成年人中的特定关节，通常是膝、髋、手关节和脊柱。OA的特征在于许多下述表现：包括关节软骨的退化和变薄伴随“溃疡”或缺损(craters)的相关发展、骨赘形成、在边缘处的骨肥大、以及滑膜中的改变和受累关节的膨大。此外，骨关节炎伴随疼痛和僵硬，特别是在长时间活动后。本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于治疗骨关节炎。骨关节炎的特征性放射照相的特征包括关节间隙变窄、软骨下硬化、骨赘病、软骨下囊肿形成、骨游离体(loose osseous body)(或“关节鼠”)。

用于治疗骨关节炎的药物包括多种非类固醇消炎药(NSAIDs)。此外，COX 2抑制剂包括西乐葆、洛芬昔布和伐地考昔(Bextra)以及依托考昔(Etoricoxib)也用于治疗OA。可以直接注射到关节内的类固醇也可以用于减少炎症和疼痛。在本发明的一个实施方案中，本发明的TNFα抗体与NSAID、COX2抑制剂和/或类固醇组合施用。

与骨丢失相关的其他病症

在另一个实施方案中，可以治疗在具有与骨丢失相关的病症或处于具有与骨丢失相关的病症危险中的受试者中的骨丢失，即其中存在骨密度进行性丢失和骨组织变薄的病症。此种状况包括但不限于侵蚀性关节炎、骨恶性肿瘤、骨软化、甲状旁腺机能亢进的骨骼变化、慢性肾衰竭(肾性骨营养不良症)、畸形性骨炎(骨的Paget氏病)和溶骨性转移。在一个实施方案中，本发明的方法用于治疗具有TNFα相关病症的受试者(参见例如，US20040126372和US6,090,382中描述的病症，所述专利文献各自的内容特别引入本文作为参考)。

在一个实施方案中，施用TNFα抑制剂用于治疗骨丢失的受试者可以就具有骨丢失和/或处于具有骨丢失危险中进行选择。例如，绝经后的受试者可能处于发展骨丢失危险中。在另一个例子中，诊断有骨关节炎的受试者可能具有骨丢失，包括手骨丢失，并且因此，可以受益于本发明的方法。因此，在一个实施方案中，本发明包括鉴定可能受益于本发明的方法的受试者，即骨丢失例如手骨丢失的治疗，并且随后给受试者施用TNFα抑制剂用于治疗。在一个实施方案中，本发明还提供了用于治疗受试者中的手骨丢失的方法，其包括选择具有手骨丢失或处于具有手骨丢失危险中的受试者，并且给受试者施用TNFα抑制剂，从而使得手骨丢失得到治疗。可替代地，本发明的方法可以对先前选择为具有骨丢失或处于具有骨丢失危险中的受试者执行，所述骨丢失包括手骨丢失。

III.TNF抑制剂

在本发明的方法和组合物中使用的TNFα抑制剂包括干扰TNFα活性的任何试剂。在优选实施方案中，TNFα抑制剂可以中和TNFα活性，特别是有害的TNFα活性。

在一个实施方案中，在本发明中使用的TNFα抑制剂是TNFα抗体(在本文中也称为TNFα抗体)或其抗原结合片段，包括嵌合、人源化和人抗体。可以在本发明中使用的TNFα抗体的例子包括但不限于，英夫单抗(

Johnson和Johnson；在引入本文作为参考的美国专利号5,656,272中描述)、CDP571(人源化单克隆抗TNFαIgG4抗体)、CDP 870(人源化单克隆抗TNFα抗体片段)、抗TNF dAb(Peptech)、CNTO 148(戈利木单抗；Medarex和Centocor，参见引入本文作为参考的WO 02/12502和US 7,250,165)、和阿达木单抗(

AbbottLaboratories，人抗TNF mAb，在美国专利号6,090,382中描述为D2E7)。可以在本发明中使用的另外TNF抗体(及其序列)在美国专利号6,593,458；6,498,237；6,451,983；7,250,165；和6,448,380中描述，所述专利各自特别引入本文作为参考。

可以在本发明的方法和组合物中使用的TNFα抑制剂的其他例子包括依那西普(Enbrel，在WO 91/03553和WO 09/406,476中描述)、可溶性TNF受体I型、加入聚乙二醇的可溶性TNF受体I型(PEGsTNF-R1)、p55TNFR1gG(来那西普(Lenercept))和重组TNF结合蛋白(r-TBP-I)(Serono)。

在一个实施方案中，术语“TNFα抑制剂”排除英夫单抗。在一个实施方案中，术语“TNFα抑制剂”排除阿达木单抗。在另一个实施方案中，术语“TNFα抑制剂”排除阿达木单抗和英夫单抗。

在一个实施方案中，术语“TNFα抑制剂”排除依那西普，和任选地阿达木单抗、英夫单抗、以及阿达木单抗和英夫单抗。

在一个实施方案中，术语“TNFα抗体”排除英夫单抗。在一个实施方案中，术语“TNFβ抗体”排除阿达木单抗。在另一个实施方案中，术语“TNFα抗体”排除阿达木单抗和英夫单抗。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或测定TNFα抑制剂用于治疗骨丢失的功效的用途和组合物，其中TNFα抗体是分离的人抗体或其抗原结合部分，其以高亲和力和低解离速率与人TNFα结合，并且还具有高中和能力。优选地，在本发明中使用的人抗体是重组、中和人抗hTNFα抗体。本发明最优选的重组、中和抗体在本文中被称为D2E7，也称为

或阿达木单抗(D2E7 VL区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1中；D2E7 VH区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2中)。D2E7(阿达木单抗/

)的性质已在Salfeld等人，美国专利号6,090,382、6,258,562和6,509,015中描述，所述专利各自引入本文作为参考。本发明的方法还可以使用嵌合和人源化鼠类抗hTNFα抗体执行，所述抗体已经历用于治疗类风湿性关节炎的临床测试(参见例如，Elliott，M.J.，等人(1994)Lancet 344：1125-1127；Elliot，M.J.，等人(1994)Lancet 344：1105-1110；Rankin，E.C.，等人(1995)Br.J.Rheumatol.34：334-342)。

在一个实施方案中，本发明的方法包括测定D2E7抗体和抗体部分、D2E7相关抗体和抗体部分、或具有与D2E7等价性质的其他人抗体和抗体部分用于治疗骨丢失的功效，所述性质例如与hTNFα的高亲和力结合伴随低解离动力学和高中和能力。在一个实施方案中，本发明提供了用分离的人抗体或其抗原结合部分的治疗，其以1×10-8M或更少的Kd和1×10-3s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离，两者都通过表面等离振子共振进行测定，并且在标准体外L929测定中以1×10-7M或更少的IC50中和人TNFα细胞毒性。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分以5×10-4s-1或更少的Koff与人TNFα解离，或甚至更加优选地，以1×10-4s-1或更少的Koff。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分在标准体外L929测定中以1×10-8M或更少的IC50中和人TNFα细胞毒性，甚至更加优选以1×10-9M或更少的IC50，和更加优选以1×10-10M或更少的IC50。在优选实施方案中，抗体是分离的人重组抗体或其抗原结合部分。

本领域众所周知的是抗体重和轻链CDR3结构域在抗体对于抗原的结合特异性/亲和力中起重要作用。因此，在另一个方面，本发明涉及通过施用人抗体治疗骨丢失，所述人抗体对于与hTNFα结合具有缓慢的解离动力学，并且具有在结构上与D2E7的那些等同或相关的轻和重链CDR3结构域。D2E7 VL CDR3的位置9可以由Ala或Thr占据，而基本上不影响Koff。因此，关于D2E7 VL CDR3的共有基序包括氨基酸序列：Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQ ID NO：3)。此外，D2E7 VH CDR3的位置12可以由Tyr或Asn占据，而基本上不影响Koff。因此，关于D2E7 VH CDR3的共有基序包括氨基酸序列：V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(SEQ ID NO：4)。此外，如美国专利号6,090,382的实施例2中证实的，D2E7重和轻链的CDR3结构域适合于由单个丙氨酸残基的取代(在VL CDR3内的位置1、4、5、7或8上，或在VH CDR3内的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上)，而基本上不影响Koff。再进一步地，技术人员将认识到，给定D2E7 VL和VH CDR3对由丙氨酸取代的适应性，在CDR3结构域内的其他氨基酸取代可以是可能的，同时仍保留抗体的低解离速率常数，特别是用保守氨基酸取代。优选地，在D2E7 VL和/或VH CDR3结构域内进行不超过1-5个保守氨基酸取代。更优选地，在D2E7 VL和/或VH CDR3结构域内进行不超过1-3个保守氨基酸取代。另外，保守氨基酸取代不应在对于与hTNFα结合关键的氨基酸位置上进行。D2E7 VL CDR3的位置2和5以及D2E7 VHCDR3的位置1和7看起来对于与hTNFα相互作用是关键的，并且因此，保守氨基酸取代优选不在这些位置上进行(尽管如上所述在D2E7 VLCDR3的位置5上的丙氨酸取代是可接受的)(参见美国专利号6,090,382)。

因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选包含下述特征：

a)如通过表面等离振子共振测定的，以1×10-3s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离；

b)具有轻链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列；

c)具有重链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列。

更优选地，抗体或其抗原结合部分以5×10-4s-1或更少的Koff与人TNFα解离。甚至更加优选地，抗体或其抗原结合部分以1×10-4s-1或更少的Koff与人TNFα解离。

在另外一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选包含具有CDR3结构域的轻链可变区(LCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ IDNO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列，以及具有CDR3结构域的重链可变区(HCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列。优选地，LCVR进一步具有包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2结构域(即，D2E7 VL CDR2)，并且HCVR进一步具有包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR2结构域(即，D2E7 VH CDR2)。甚至更加优选地，LCVR进一步具有包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR1结构域(即，D2E7 VL CDR1)，并且HCVR具有包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR1结构域(即，D2E7 VH CDR1)。关于VL的构架区优选来自VκI人种系家族，更优选来自A20人种系Vk基因，并且最优选来自美国专利号6,090,382的图1A和1B中所示的D2E7 VL构架序列。关于VH的构架区优选来自VH3人种系家族，更优选来自DP-31人种系VH基因，并且最优选来自美国专利号6,090,382的图2A和2B中所示的D2E7 VH构架序列。

因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，所述LCVR包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列(即，D2E7 VL)，所述HCVR包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列(即，D2E7 VH)。在特定实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可以包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括κ轻链恒定区。可替代地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。

在另外其他的实施方案中，本发明包括包含D2E7相关VL和VHCDR3结构域的分离的人抗体或其抗原结合部分的用途。例如，抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(LCVR)或重链可变区(HCVR)，所述LCVR具有包括选自下述的氨基酸序列的CDR3结构域：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，所述HCVR具有包括选自下述的氨基酸序列的CDR3结构域：SEQID NO：4、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：35。

在本发明的方法和组合物中使用的TNFα抗体可以进行修饰用于骨丢失的改善治疗。在一些实施方案中，TNFα抗体或其抗原结合片段进行化学修饰以提供所需作用。例如，本发明的抗体和抗体片段的加入聚乙二醇可以通过本领域已知的任何加入聚乙二醇反应进行，如例如在下述参考文献中描述的：Focus on Growth Factors 3：4-10(1992)；EP 0154316；和EP 0401384(所述文献各自整体引入本文作为参考)。优选地，加入聚乙二醇经由与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应执行。用于本发明抗体和抗体片段的加入聚乙二醇的优选水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。如本文使用的，“聚乙二醇”意欲包括已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(Cl-ClO)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。

用于制备本发明加入聚乙二醇的抗体和抗体片段的方法一般将包括步骤(a)在由此抗体或抗体片段变得与一个或多个PEG基团附着的条件下，使抗体或抗体片段与聚乙二醇例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应，和(b)获得反应产物。基于已知参数和所需结果选择最佳反应条件或酰化反应，对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

通过施用本文描述的TNFα抗体和抗体片段，加入聚乙二醇的抗体和抗体片段一般可以用于离析(educe)或预防骨丢失。一般地，与非加入聚乙二醇的抗体和抗体片段相比较，加入聚乙二醇的抗体和抗体片段具有增加的半衰期。加入聚乙二醇的抗体和抗体片段可以单独、一起或与其他药物组合物组合采用。

在本发明的另外一个实施方案中，可以改变TNFα抗体或其片段，其中修饰抗体的恒定区，以相对于未经修饰的抗体，减少至少一种恒定区介导的生物效应子功能。为了修饰本发明的抗体从而使得它显示出与Fc受体减少的结合，抗体的免疫球蛋白恒定区区段可以在对于Fc受体(FcR)相互作用所需的特定区域上进行突变(参见例如，Canfield，S.M.和S.L.Morrison(1991)J.Exp.Med.173：1483-1491；和Lund，J.等人(1991)J.of Immunol.147：2657-2662)。抗体的FcR结合能力中的减少也可以减少依赖于FcR相互作用的其他效应子功能，例如调理作用和吞噬作用以及抗原依赖性细胞毒性。

在本发明的方法中使用的抗体或抗体部分可以与另一种功能分子(例如，另一种肽或蛋白质)衍生或连接。因此，本发明的抗体和抗体部分预期包括衍生和以其他方式修饰形式的本文描述的人抗hTNFα抗体，包括免疫粘附分子。例如，本发明的抗体或抗体部分可以与一种或多种其他分子实体在功能上连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)，所述分子实体例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒剂、药学试剂和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如，链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标记)的结合的蛋白质或肽。

一种类型的衍生抗体通过使2种或更多种抗体(相同类型或不同类型，例如以生成双特异性抗体)交联而产生。合适交联剂包括其为异双功能(例如，m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能(例如，二琥珀酰亚胺辛二酸酯)的那些，所述异双功能的交联剂具有通过合适间隔臂分开的2种不同的反应基团。此种接头可从PierceChemical Company，Rockford，Ill获得。

本发明的抗体或抗体部分可以由其衍生的有用可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体也可以用可检测酶进行衍生，所述可检测酶例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当抗体由可检测酶进行衍生时，它通过加入酶用于产生可检测反应产物的另外试剂进行检测。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的添加导致可检测的有色反应产物。抗体也可以由生物素进行衍生，并且通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合进行检测。

在本发明的方法和组合物中使用的抗体或抗体部分可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻和重链基因进行制备。为了重组表达抗体，用携带DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述DNA片段编码抗体的免疫球蛋白轻和重链，从而使得轻和重链在宿主细胞中表达，并且优选地分泌到其中培养宿主细胞的培养基中，从所述培养基中可以回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重和轻链基因，将这些基因整合入重组表达载体内，并且将载体引入宿主细胞内，例如下述中描述的那些：Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，MolecularCloning；A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和在Boss等人的美国专利号4,816,397中。

为了表达阿达木单抗(D2E7)或阿达木单抗(D2E7)相关抗体，首先获得编码轻和重链可变区的DNA片段。这些DNAs可以通过使用聚合酶链反应(PCR)扩增和修饰种系轻和重链可变序列获得。关于人重和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域已知的(参见例如，“Vbase”人种系序列数据库；还参见Kabat，E.A.，等人(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH公开号91-3242；Tomlinson，I.M.，等人(1992)“The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about FiftyGroups of VH Segments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等人(1994)“A Directory of HumanGerm-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；其各自的内容特别引入本文作为参考)。为了获得编码D2E7或D2E7相关抗体重链可变区的DNA片段，通过标准PCR扩增人种系VH基因的VH3家族成员。最优选地，扩增DP-31 VH种系序列。为了获得编码D2E7或D2E7相关抗体轻链可变区的DNA片段，通过标准PCR扩增人种系VL基因的VκI家族成员。最优选地，扩增A20 VL种系序列。使用标准方法，基于上文引用的参考文献中公开的核苷酸序列，可以设计适合于用于扩增DP-31种系VH和A20种系VL序列的PCR引物。

一旦获得种系VH和VL片段，这些序列就可以进行突变以编码本文公开的D2E7或D2E7相关氨基酸序列。由种系VH和VL DNA序列编码的氨基酸序列首先与D2E7或D2E7相关VH和VL氨基酸序列进行比较，以鉴定D2E7或D2E7相关序列中与种系不同的氨基酸残基。随后，种系DNA序列的合适核苷酸这样进行突变，从而使得突变的种系序列编码D2E7或D2E7相关氨基酸序列，其中使用遗传密码以测定应进行哪些核苷酸改变。种系序列的诱变通过标准方法执行，例如PCR介导的诱变(其中将突变的核苷酸掺入PCR引物内，从而使得PCR产物包含突变)或位点定向诱变。

此外，应当指出如果通过PCR扩增获得的“种系”序列编码构架区中与真实种系构型中的氨基酸差异(即，与真实种系序列相比较，扩增的序列中的差异，例如由于体细胞突变)，那么可能希望改变这些氨基酸差异回到真实种系序列(即，构架残基“回复突变”成种系构型)。

一旦获得编码D2E7或D2E7相关VH和VL区段的DNA片段(如上所述，通过种系VH和VL基因的扩增和诱变)，这些DNA片段就可以通过标准重组DNA技术进行进一步处理，例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些处理中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一个DNA片段可操作地连接，所述另一种蛋白质例如抗体恒定区或柔性接头。如在这个背景中使用的，术语“可操作地连接”意指2个DNA片段这样连接，从而使得由2个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框内。

通过使编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一种DNA分子可操作地连接，可以使编码VH区的分离的DNA转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)，并且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一种DNA分子可操作地连接。

通过使编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一种DNA分子可操作地连接，可以使编码VL区的分离的DNA转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)，并且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ恒定区或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。

为了生成scFv基因，使编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一个片段可操作地连接，从而使得VH和VL序列可以作为邻接单链蛋白质表达，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554)。

为了表达在本发明中使用的抗体或抗体部分，将如上所述获得的编码部分或全长轻和重链的DNAs插入表达载体内，从而使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在这个背景中，术语“可操作地连接”意指抗体基因这样连接到载体内，从而使得在载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体内，或更一般地，将2种基因都插入相同表达载体内。通过标准方法将抗体基因插入表达载体内(例如，在抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，那么平端连接)。在插入D2E7或D2E7相关轻或重链序列前，表达载体可以已携带抗体恒定区序列。例如，将D2E7或D2E7相关VH和VL序列转变成全长抗体基因的一种方法是将它们分别插入已编码重链恒定和轻链恒定区的表达载体内，从而使得VH区段与载体内的一个或多个CH区段可操作地连接，并且VL区段与载体内的CL区段可操作地连接。另外地或可替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体内，从而使得信号肽与抗体链基因的氨基末端在框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除抗体链基因外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列”意欲包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此种调节序列例如在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中描述。本领域技术人员将认识到表达载体的设计，包括调节序列的选择可以依赖于此种因素如待转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如，Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等人的美国专利号4,510,245和Schaffner等人的美国专利号4,968,615。

除抗体链基因和调节序列外，在本发明中使用的重组表达载体可以携带另外序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如，全部为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，一般地，选择标记基因对载体已引入其内的宿主细胞赋予针对药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在dhfr-宿主细胞中与氨甲蝶呤选择/扩增一起使用)和neo基因(对于G418选择)。

对于轻和重链的表达，通过标准技术将编码重和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞内。各种形式的术语“转染”意欲包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞且最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为此种真核细胞且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配且分泌正确折叠和免疫活性的抗体。抗体基因的原核表达已报告对于活性抗体的高得率生产是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。

用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中描述的DHFR选择标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过使宿主细胞培养足够的时间段，以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内来生产抗体。抗体可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。

宿主细胞也可以用于产生完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。应当理解关于上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可能希望用编码本发明抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除编码轻和重链的任一或两者的一些或所有DNA，其对于与hTNFα结合不是必需的。由此种截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包括。此外，通过经由标准化学交联方法使本发明的抗体与第二种抗体交联可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重和轻链对于除hTNFα外的抗原特异。

在用于本发明的抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化体宿主细胞，以允许表达抗体重和轻链，并且从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞且从培养基中回收抗体。

考虑到前述，可以用于重组表达在本发明中使用的抗体和抗体部分的核酸、载体和宿主细胞组合物包括核酸，和包括所述核酸的载体，包括人TNFα抗体阿达木单抗(D2E7)。编码D2E7轻链可变区的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：36中。LCVR的CDR1结构域包括核苷酸70-102，CDR2结构域包括核苷酸148-168，并且CDR3结构域包括核苷酸265-291。编码D2E7重链可变区的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：37中。HCVR的CDR1结构域包括核苷酸91-105，CDR2结构域包括核苷酸148-198，并且CDR3结构域包括核苷酸295-330。本领域技术人员将认识到使用遗传密码和标准分子生物学技术，编码D2E7相关抗体或其部分(例如，CDR结构域，例如CDR3结构域)的核苷酸序列可以衍生自编码D2E7 LCVR和HCVR的核苷酸序列。

通过筛选使用人VL和VH cDNAs制备的重组组合抗体文库优选scFv噬菌体展示文库，可以分离除本文公开的D2E7或其抗原结合部分、或D2E7相关抗体外的本发明的重组人抗体，所述人VL和VH cDNAs由衍生自人淋巴细胞的mRNA制备。用于制备且筛选此种文库的方法是本领域已知的。除用于产生噬菌体展示文库的商购可得试剂盒(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAP^TM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)外，特别适合于用于在产生且筛选抗体展示文库中使用的方法和试剂的例子可以在例如下述中发现：Ladner等人美国专利号5,223,409；Kang等人PCT公开号WO 92/18619；Dower等人PCT公开号WO 91/17271；Winter等人PCT公开号WO 92/20791；Markland等人PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人PCT公开号WO 92/09690；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum AntibodHybridomas 3：81-65；Huse等人(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Gram等人(1992)PNAS89：3576-3580；Garrard等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas等人(1991)PNAS 88：7978-7982。

在优选实施方案中，为了分离对于hTNFα具有高亲和力和低解离速率常数的人抗体，对于hTNFα具有高亲和力和低解离速率的鼠类抗hTNFα抗体(例如MAK 195，关于其的杂交瘤具有保藏号ECACC 87050801)首先用于选择针对hTNFα具有相似结合活性的人重和轻链序列，其中使用Hoogenboom等人，PCT公开号WO 93/06213中描述的表位印迹方法。在这种方法中使用的抗体文库优选是如McCafferty等人，PCT公开号WO 92/01047，McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；和Griffiths等人，(1993)EMBO J 12：725-734中所述制备且筛选的scFv文库。scFv抗体文库优选使用重组人TNFα作为抗原进行筛选。

一旦选择起始人VL和VH区段，就执行“混合和匹配”实验，其中就hTNFα结合筛选不同对的起始选择的VL和VH区段，以选择优选VL/VH对组合。此外，为了进一步改善对于hTNFα结合的亲和力和/或降低解离速率常数，在类似于在天然免疫应答过程中负责抗体的亲和力成熟的体内体细胞突变过程的过程中，可以随机突变一个或多个优选VL/VH对的VL和VH区段，优选在VH和/或VL的CDR3区内。这种体外亲和力成熟可以通过使用分别与VH CDR3或VL CDR3互补的PCR引物扩增VH和VL区来完成，所述引物已在特定位置上用4种核苷酸碱基的随机混合物“掺加”，从而使得所得到的PCR产物编码随机突变已引入VH和/或VL CDR3区内的VH和VL区段。这些随机突变的VH和VL区段可以就与hTNFα的结合进行再筛选，并且可以选择对于hTNFα结合显示高亲和力和低解离速率的序列。

在从重组免疫球蛋白展示文库中筛选和分离本发明的抗hTNFα抗体后，可以从展示包装中(例如，从噬菌体基因组)回收编码所选择的抗体的核酸，并且通过标准重组DNA技术亚克隆到其他表达载体内。若需要，则可以进一步处理核酸以生成本发明的其他抗体形式(例如，与编码另外免疫球蛋白结构域的核酸例如另外恒定区连接)。为了表达通过筛选组合文库分离的重组人抗体，将编码抗体的DNA克隆到重组表达载体内，并且引入哺乳动物宿主细胞内，如上文进一步详细描述的。

分离对于hTNFα具有高亲和力和低解离速率常数的人中和抗体的方法在美国专利号6,090,382、6,258,562和6,509,015中描述，所述专利各自引入本文作为参考。

用于在本发明的方法中使用的抗体、抗体部分、和其他TNFα抑制剂，可以掺入适合于施用于受试者的药物组合物内。一般地，药物组合物包括抗体、抗体部分或其他TNFα抑制剂，和药学上可接受的载体。如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或多种，及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体、抗体部分或其他TNFα抑制剂的保存期限或有效性。

用于在本发明的方法和组合物中使用的组合物可以是多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式依赖于预期施用模式和治疗应用。一般优选组合物为可注射或可输注溶液的形式，例如类似于关于用其他抗体或其他TNFα抑制剂被动免疫接种人的那些的组合物。优选施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在优选实施方案中，抗体或其他TNFα抑制剂通过静脉内输注或注射进行施用。在另一个优选实施方案中，抗体或其他TNFα抑制剂通过肌内或皮下注射进行施用。

治疗组合物在制造和贮存条件下一般必须是无菌和稳定的。组合物可以配置为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以这样进行制备：通过将所需量活性化合物(即抗体、抗体部分或其他TNFα抑制剂)与上文列举的成分之一或组合掺入合适溶剂中，需要时，随后为过滤灭菌。一般地，通过将活性化合物掺入无菌媒介物内制备分散体，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自上文列出那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉剂。溶液的正确流动性可以例如下述得到维持：通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来引起。

在一个实施方案中，本发明包括药物组合物，其包括有效的TNFα抑制剂和药学上可接受的载体，其中有效的TNFα抑制剂可以用于治疗类风湿性关节炎。

在一个实施方案中，将用于在本发明的方法中使用的抗体或抗体部分掺入药物制剂内，如引入本文作为参考的PCT/IB03/04502和美国申请号20040033228中所述。这种制剂包括抗体D2E7(阿达木单抗)的50mg/ml浓度，其中一个预装填注射器包含40mg抗体用于皮下注射。

本发明的抗体、抗体部分和其他TNFα抑制剂可以通过本领域已知的多种方法进行施用，尽管对于许多治疗应用，优选施用途径/模式是肠胃外，例如皮下注射。在另一个实施方案中，施用经由静脉内注射或输注。

如技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将依赖于所需结果而改变。在特定实施方案中，活性化合物可以与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或本领域技术人员一般已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，Robinson，编辑，Dekker，Inc.，New York，1978。

在一个实施方案中，在本发明中使用的TNFα抗体和抑制剂皮下递送给受试者。在一个实施方案中，受试者给他/她自己施用TNFα抑制剂，包括但不限于，TNFα抗体或其抗原结合部分。

在本发明中使用的TNFα抗体和抑制剂也可以以蛋白质晶体制剂的形式施用，其包括封装在聚合载体内的蛋白质晶体的组合，以形成包被的颗粒。蛋白质晶体制剂的包被的颗粒可以具有球状形态学，并且可以是直径最高达500微米的小球体，或它们可以具有一些其他形态学且是微粒。蛋白质晶体的提高的浓度允许本发明的抗体皮下递送。在一个实施方案中，本发明的TNFα抗体经由蛋白质递送系统进行递送，其中将一种或多种蛋白质晶体制剂或组合物施用于具有TNFα相关病症的受试者。制备完整抗体晶体或抗体片段晶体的稳定化制剂的组合物和方法也在WO 02/072636中描述，其引入本文作为参考。在一个实施方案中，在引入本文作为参考的PCT/IB03/04502和美国申请号20040033228中描述的包括结晶化抗体片段的制剂使用本发明的治疗方法用于治疗类风湿性关节炎。

在特定实施方案中，本发明的抗体、抗体部分或其他TNFα抑制剂可以例如与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物(以及若需要，其他成分)也可以装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可以与赋形剂一起掺入，并且以可摄食片剂、口腔含化片剂、含锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能必须用预防其灭活的材料包被化合物，或使化合物与预防其灭活的材料共施用。

补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在特定实施方案中，用于在本发明的方法中使用的抗体或抗体部分与一种或多种另外治疗剂共配制和/或共施用，所述另外治疗剂包括类风湿性关节炎抑制剂或拮抗剂。例如，本发明的抗hTNFα抗体或抗体部分可以与下述共配制和/或共施用：结合与TNFα相关病症有关的其他靶的一种或多种另外抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)、一种或多种细胞因子、可溶性TNFα受体(参见例如，PCT公开号WO 94/06476)和/或抑制hTNFα生产或活性的一种或多种化学试剂(例如，如PCT公开号WO 93/19751中描述的环己烷-亚基衍生物)或其任何组合。此外，本发明的一种或多种抗体可以与2种或更多种前述治疗剂组合使用。此种联合治疗可以有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，从而避免通过与各种单一疗法相关的可能副作用、并发症或患者的低水平应答。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段下达到所需治疗结果有效的量。治疗有效量的抗体、抗体部分或其他TNFα抑制剂可以根据因素加以改变，所述因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及抗体、抗体部分、其他TNFα抑制剂在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体、抗体部分或其他TNFα抑制剂的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段下达到所需预防结果有效的量。一般地，因为预防剂量在疾病前或疾病早期时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。

关于包括TNFα抑制剂施用的本发明方法和用途的另外描述在本说明书的部分II中描述。

本发明还涉及关于施用本发明的抗TNF抗体用于治疗类风湿性关节炎的包装的药物组合物或试剂盒。在本发明的一个实施方案中，试剂盒包括TNFα抑制剂例如抗体，和关于施用TNFα抑制剂用于治疗骨丢失的说明书。说明书可以描述不同剂量的TNFα抑制剂应如何(例如皮下)和何时(例如在第0周、第2周、第4周等时)施用于受试者用于治疗。

本发明的另一个方面涉及试剂盒，其包含药物组合物，所述药物组合物包括TNFα抑制剂例如抗体以及药学上可接受的载体，和一种或多种药物组合物，其各自包括对于治疗骨丢失有用的另外治疗剂，和药学上可接受的载体。可替代地，试剂盒包括单一药物组合物，其包括抗TNFα抗体、对于治疗骨丢失有用的一种或多种药物和药学上可接受的载体。说明书可以描述不同剂量的TNFα抑制剂和/或另外治疗剂应如何(例如皮下)和何时(例如在第0周、第2周、第4周等时)施用于受试者用于治疗。

试剂盒可以包含关于药物组合物给药用于治疗骨丢失的说明书，关于本发明的制造物品的另外描述在小部分II中描述。

包装或试剂盒可替代地可以包含TNFα抑制剂，并且它可以用于在包装内或通过伴随信息一起被宣传用于本文描述的病症的使用或治疗。包装的药物或试剂盒进一步可以包括与说明书一起包装或共宣传的第二种试剂(如本文描述的)，所述说明书关于使用第二试剂与第一种试剂(如本文描述的)。

IV.制造物品

本发明还提供了包装的药物组合物，其中TNFα抑制剂例如TNFα抗体包装在试剂盒或制造物品内。本发明的试剂盒或制造物品包含对于治疗骨丢失包括诱导和/或减轻、预防和/或诊断有用的材料。试剂盒或制造物品包括容器和在容器上或与容器结合的标签或包装插页或印刷材料，其提供关于TNFα抑制剂例如TNFα抗体用于治疗骨丢失的用途的信息。

试剂盒或制造物品指包括与之一起施用TNFα抑制剂用于治疗骨丢失的组分的包装的产物。试剂盒优选包括容纳试剂盒的组分的盒或容器。盒或容器粘贴有标签或食品药品管理局(Food and DragAdministration)批准的标签，包括关于施用TNFα抑制剂的规程。盒或容器容纳本发明的组分，其优选包含在塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器内。容器可以是加盖管或瓶。试剂盒还可以包括关于施用本发明的TNFα抗体的说明书。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括包含人抗体阿达木单抗(或D2E7)的制剂，如引入本文作为参考的PCT/IB03/04502和美国申请系列号10/222,140中所述。

术语“包装插页”用于指照惯例包括在治疗产物的商业包装中的说明书，其包含关于涉及此种治疗产物使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。

在一个实施方案中，本发明的制造物品包括(a)具有其中包含组合物的第一种容器，其中组合物包括TNFα抗体；和(b)指示TNFα抗体可以用于治疗骨丢失的包装插页。

用于TNFα抑制剂例如TNFα抗体的合适容器包括例如瓶、小瓶、注射器、笔等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或当与另一种组合物组合时对于治疗、预防和/或诊断状况有用的组合物，并且可以具有无菌访问口。

在一个实施方案中，制造物品包括TNFα抑制剂例如TNFα抗体，和指示将施用TNFα抑制剂的受试者关于使用TNFα抑制剂用于治疗骨丢失的标签。标签可以在制造物品内或其上的任何地方。在一个实施方案中，制造物品包括包含TNFα抑制剂的容器例如盒，和提供涉及使用TNFα抑制剂用于治疗骨丢失的信息的包装插页或标签。在另一个实施方案中，信息印刷在标签上，所述标签在制造物品的外面，在预期购买者可见的位置中。

在一个实施方案中，本发明的包装插页告知读者，包括将施用TNFα抑制剂用于治疗的受试者例如购买者，TNFα抑制剂例如TNFα抗体例如阿达木单抗是骨丢失的指示的治疗。

本发明的包装插页还可以给将接受阿达木单抗的受试者提供关于安全与功效目的的组合用途的信息。本发明的包装插页可以包含关于TNFα抑制剂例如TNFα抗体例如阿达木单抗的用途的警告和预防措施。在一个实施方案中，本发明提供了制造物品，其包括包装材料；TNFα抗体或其抗原结合部分；和在包装材料内包含的标签或包装插页，指示在TNFα抗体或其抗原结合部分研究中，观察到特定不利事件，包括实施例中描述的那些中的任何一种。

本发明的标签可以包含关于TNFα抑制剂例如TNFα抗体例如阿达木单抗在关于骨丢失的临床研究中的用途的信息。在一个实施方案中，本发明的标签描述本文作为实施例整体或部分描述的研究。

在本发明的一个实施方案中，试剂盒包括TNFα抑制剂例如抗体，包括另外治疗剂的第二种治疗组合物，和关于施用2种试剂用于治疗骨丢失的说明书。说明书可以描述TNFα抗体和/或另外治疗剂的剂量应如何(例如皮下)和何时(例如在第0周、第2周时和其后每两周一次)施用于受试者用于治疗。

本发明的另一个方面涉及试剂盒，其包含药物组合物，其包括抗TNFα抗体和药学上可接受的载体，和一种或多种另外药物组合物，其各自包括对于治疗TNFα相关病症有用的药物和药学上可接受的载体。可替代地，试剂盒包括单一药物组合物，其包含抗TNFα抗体，对于治疗TNFα相关病症有用的一种或多种药物和药学上可接受的载体。试剂盒进一步包含关于药物组合物给药用于治疗TNFα相关病症的说明书。

包装或试剂盒可替代地可以包含TNFα抑制剂，并且它可以用于在包装内或通过伴随信息一起被宣传用于本文描述的病症的使用或治疗。包装的药物或试剂盒进一步可以包括与说明书一起包装或共宣传的第二种试剂(如本文描述的)，所述说明书关于使用第二试剂与第一种试剂(如本文描述的)。

V.另外治疗剂

本发明的方法、用途和组合物也包括TNFα抑制剂包括抗体和用于治疗骨丢失的其他治疗剂的组合，所述骨丢失包括但不限于手骨丢失。应当理解本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外的试剂例如治疗剂组合使用，所述另外的试剂由技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外的试剂可以是领域公认为治疗由本发明的抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外的试剂也可以是赋予治疗组合物有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。

应进一步理解将包括在本发明内的组合是对其预期目的有用的那些组合。下文所述试剂是举例说明性目的的且不希望是限制性的。作为本发明部分的组合可以是本发明的抗体和选自下列的至少一种另外的试剂。组合还可以包括超过一种另外的试剂，例如，2种或3种另外的试剂，如果组合是这样的，从而使得形成的组合物可以执行其预期功能的话。

在一个实施方案中，TNFα抑制剂与抗再吸收试剂组合施用，所述抗再吸收试剂包括但不限于阿仑特罗、阿仑特罗加上维生素D3、伊本膦酸钠、利塞膦酸钠、含钙的利塞膦酸钠、唑来膦酸、降钙素、雌激素和雷洛昔芬。在另外一个实施方案中，TNFα抑制剂与骨形成试剂组合施用，所述骨形成试剂例如甲状旁腺激素例如特立帕肽。

本文描述的TNFα抑制剂可以与另外治疗剂组合使用，所述另外治疗剂例如缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)或非类固醇消炎药(NSAID)或类固醇或其任何组合。DMARD的优选例子是羟氯喹、来氟洛米、氨甲蝶呤、肠胃外金、经口金和柳氮磺吡啶。一种或多种也称为NSAIDS的非类固醇消炎药的优选例子包括药物如布洛芬。其他优选组合是皮质类固醇，包括泼尼松龙；当与本发明的抗-TNFα抗体组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。本发明的抗体或抗体部分可以与之组合用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性例子包括下述：细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs)；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体包括CD154(gp39或CD40L)的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA。

治疗剂的优选组合可以在自身免疫和后续炎症级联中的不同点上进行干扰；优选例子包括TNFα抑制剂，例如可溶性p55或p75 TNF受体、其衍生物(p75TNFR1gG(Enbrel^TM)或p55TNFR1gG(来那西普)、嵌合、人源化或人TNF抗体或其片段，包括英夫单抗(

Johnson和Johnson；在引入本文作为参考的美国专利号5,656,272中描述)、CDP571(人源化单克隆抗TNFαIgG4抗体)、CDP 870(人源化单克隆抗TNFα抗体片段)、抗TNF dAb(Peptech)、CNTO 148(戈利木单抗；Medarex和Centocor，参见WO 02/12502)、和阿达木单抗(

Abbott Laboratories，人抗TNF mAb，在美国专利号6,090,382中描述为D2E7)。可以在本发明中使用的另外TNF抗体在美国专利号6,593,458；6,498,237；6,451,983；和6,448,380中描述，所述专利各自引入本文作为参考。其他组合包括TNFα转换酶(TACE)抑制剂；IL-抑制剂(白细胞介素-1-转换酶抑制剂，IL-1RA等)由于相同原因可以是有效的。其他组合包括IL-6抗体托西珠单抗(tocilizumab)(Actemra)。其他优选组合包括白细胞介素11。另外一个优选组合是自身免疫应答的其他关键参与物(player)，其可以与TNFα功能平行作用，依赖于TNFα功能作用或与TNFα功能协同作用；尤其优选的是IL-18拮抗剂包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体，或IL-18结合蛋白。已显示TNFα和IL-18具有重叠但不同的功能，并且针对两者的拮抗剂组合可以是最有效的。另外一个优选组合是非耗尽性抗CD4抑制剂，另外一个优选组合包括共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。

在一个实施方案中，本发明的方法和组合物提供TNFα抗体例如阿达木单抗和DMARD例如氨甲蝶呤的组合用途。

在本发明的方法和组合物中使用的TNFα抑制剂也可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪氯喹(chloroquinine)/羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶(TACE)抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如，可溶性p55或p75TNF受体和衍生物p75TNFR1gG(Enbrel和p55TNFR1gG(来那西普))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、托西珠单抗(tocilizumab)(Actemra)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、洛芬昔布、依那西普、英夫单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲基泼尼松龙、美洛昔康、乙酸甲基泼尼松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安缩松、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素(anakinra)、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、泼尼松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥希玛、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、和美苏帕玛(Mesopram)。优选组合包括氨甲蝶呤或来氟洛米，并且在中等或重度类风湿性关节炎的情况下，环孢菌素。

非限制性另外试剂还可以与TNFα抑制剂组合用于治疗与有害TNFα活性相关的病症和骨丢失。例如，在本发明的范围内包括的是TNFα抗体或其抗原结合部分，和用于治疗类风湿性关节炎的试剂的组合用途，所述用于治疗类风湿性关节炎的试剂包括但不限于下述：非类固醇消炎药(NSAIDs)；细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs)；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；Celltech/Bayer)；cA2/英夫单抗(嵌合抗TNFα抗体；Centocor)；75kdTNFR-IgG/依那西普(75kD TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)；55kdTNF-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9.1/SB 210396(非耗尽性灵长类动物源化(primatized)抗CD4抗体；IDEC/SmithKline；参见，例如Arthritis&Rheumatism(1995)第38卷，S185)；DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1993)第36卷，1223)；抗Tac(人源化抗IL-2Rα；Protein DesignLabs/Roche)；IL-4(抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-10(SCH52000；重组IL-10，抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10和/或IL-4激动剂(例如，激动剂抗体)；IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen)；阿那白滞素(

/Amgen)；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF结合蛋白；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and CirculatoryPhysiology(1995)第268卷，第37-42页)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；MK-966(COX-2抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S81)；伊落前列素(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S82)；氨甲蝶呤；沙立度胺(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)和沙立度胺相关药物(例如，Celgen)；来氟洛米(抗炎和细胞因子抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)第45卷，第103-107页)；氨甲环酸(纤溶酶原活化抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S284)；T-614(细胞因子抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；前列腺素E1(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；替尼达普(非类固醇消炎药；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S280)；萘普生(非类固醇消炎药；参见例如，Neuro Report(1996)第7卷，第1209-1213页)；美洛昔康(非类固醇消炎药)；布洛芬(非类固醇消炎药)；吡罗昔康(非类固醇消炎药)；扶他林(非类固醇消炎药)；吲哚美辛(非类固醇消炎药)；柳氮磺吡啶(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S281)；硫唑嘌呤(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S281)；ICE抑制剂(白细胞介素-1β转换酶抑制剂)；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管发生抑制剂)；皮质类固醇消炎药(例如，SB203580)；TNF-转变酶抑制剂；抗-IL-12抗体；抗-IL-18抗体；白细胞介素-11(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S296)；白细胞介素-13(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S308)；白细胞介素-17抑制剂(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S120)；金；青霉胺；氯喹；苯丁酸氮芥；羟氯喹；环孢菌素；环磷酰胺；全淋巴照射；抗-胸腺细胞球蛋白；抗-CD4抗体；CD5-毒素；经口施用的肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRAs)HP228和HP466(HoughtenPharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T CellSciences，Inc.)；泼尼松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺环素；抗-IL2R抗体；海生和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如，DeLuca等人(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21：759-777)；金诺芬；保泰松；甲氯灭酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；弃白通；阿托立平；霉酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose)(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；氨甲蝶呤；抗病毒剂；和免疫调谐剂。

在一个实施方案中，TNFα抗体或其抗原结合部分与下述试剂之一组合施用用于治疗类风湿性关节炎：KDR的小分子抑制剂(ABT-123)，Tie-2的小分子抑制剂；氨甲蝶呤；泼尼松；塞来昔布；叶酸；硫酸羟氯喹；洛芬昔布；依那西普；英夫单抗；来氟洛米；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲基泼尼松龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲基泼尼松龙；硫代苹果酸金钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安缩松；萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛；叶酸盐；萘普酮；扶他林；吡罗昔康；依托度酸；双氯酚酸钠；奥沙普嗪；盐酸羟可酮；重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛；双氯酚酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素，人重组体；盐酸曲马多；双水杨酸酯；舒林酸；氰钴胺素/fa/吡哆醇；扑热息痛；阿仑膦酸钠；泼尼松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟可酮/扑热息痛；盐酸奥洛帕定；米索前列醇；甲氧萘丙酸钠；奥美拉唑；霉酚酸酯；环磷酰胺；利妥希玛；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18BP；ABT-874；ABT-325(抗IL 18)；抗IL 15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；罗氟司特；IC-485；CDC-801；和美苏帕玛。在另一个实施方案中，施用与用于治疗类风湿性关节炎的上述试剂之一组合的TNF抗体或其抗原结合部分用于治疗TNF相关病症。

本发明的抗体或其抗原结合部分也可以与试剂组合，所述试剂例如阿来组单抗(alemtuzumab)、屈大麻酚、尤迈(Unimed)、达克珠单抗(daclizumab)、米托蒽醌、盐酸扎利罗登(xaliproden hydrochloride)、4-氨基吡定、乙酸格拉太咪尔、那他珠单抗、辛纳必醇(sinnabidol)、a-免疫因子(a-immunokine)NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、卡拉古林(calagualine)、CPI-1189、LEM(脂质体被囊化的米托蒽醌)、THC.CBD(大麻素激动剂)MBP-8298、美苏帕玛(PDE4抑制剂)、MNA-715、抗IL-6受体抗体、神经素(neurovax)、哌非尼酮allotrap 1258(RDP-1258)、sTNF-R1、他仑帕奈(talampanel)、特立氟胺(teriflunomide)、TGF-β2、替利莫肽(tiplimotide)、VLA-4拮抗剂(例如，TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干扰素γ拮抗剂、IL-4激动剂。

本发明通过下述实施例进一步举例说明，所述实施例不应以任何方式解释为限制性的。

实施例：抗TNFα治疗减少骨丢失

A.阿达木单抗疗法减少具有早期类风湿性关节炎的患者中的手骨丢失

总体概括

这个研究(研究J)的一个目的是横过3个治疗臂对具有早期类风湿性关节炎(RA)的患者中的皮质手骨丢失进行比较：阿达木单抗加上氨甲蝶呤(MTX)；阿达木单抗单一疗法；和MTX单一疗法。次级目的是搜索手骨丢失的预测值。

一般地，研究包括具有活动性RA＜3年的768个患者，其对于MTX是首次用于实验的。在基线时、以及在治疗26、52和104周后执行临床数据收集和手的放射照相检查。在用于关节伤害评估的相同放射照片上，通过数字X射线放射照片测量术(DXR)评估手骨丢失，主要作为掌骨皮质指数(MCI)。

结果显示在52周(-2.87与-2.16比较，p＝0.009)和104周(-4.62与-3.03比较，p＜0.001)时，DXR-MCI的中值百分比丧失与联合组比较在MTX组中显著更大。在52周(-2.87与-2.45比较，p＝0.19)和104周(-4.62与-4.03比较，p＝0.10)时，MTX组中的中值丧失在数字上比阿达木单抗组中的丧失更大。此外，较大的年龄、升高的基线CRP和不使用阿达木单抗是线性回归模型中手骨丢失的独立预测值。

总之，阿达木单抗在早期RA中保护免于手骨丢失。横过3个治疗臂的骨丢失次序类似于放射照相进展的次序。这个数据分析支持用于检测RA患者中的炎性骨伤害的手骨的定量测量。还证实手骨丢失和放射照相的骨伤害通过相似发病机制发生。

目的

这个分析的初级目的是比较研究J的3个臂中的皮质手骨丢失：阿达木单抗加上氨甲蝶呤(MTX)与阿达木单抗单一疗法比较与MTX单一疗法比较，所有都用于具有早期、攻击性RA的患者。其次，评估研究J RA患者中手骨丢失的潜在预测值。

方法

研究样品和设计

来自这个2年、多中心、双盲、随机化对照研究(研究J)的放射照相和临床数据先前已详细描述(参见Breedveld等人(2006)ArthritisRheum 54：26-37)。对于具有早期(＜3年)、攻击性RA(约12Sharp单位的平均侵蚀得分，约27Sharp单位的估计每年TSS进展)的799个成年患者，阿达木单抗加上MTX的功效和安全与阿达木单抗单一疗法和与MTX单一疗法进行比较，所述患者先前未用MTX、环磷酰胺、环孢菌素、硫唑嘌呤(azathioprin)或超过2种其他DMARDs治疗(Breedveld等人(2006)，同上)。联合组接受阿达木单抗40mg皮下(sc)每隔一周加上每周一次经口MTX(快速增加至20mg/周)，并且单一疗法组接受阿达木单抗40mg sc每隔一周加上安慰剂或每周一次经口MTX加上安慰剂。根据改良的Sharp得分(范围0-398)评分来自手和足的放射照片(Breedveld等人(2006)，同上)。

下述研究提供关于随访26、52和104周的手骨丢失数据。为了维持不知情的随机化对照试验的原始研究设计，治疗规则对于分析数据的研究者保持秘密，直至所有分析已完成。

DXR手骨测量

数字X射线放射照片测量术(DXR)(Sectra，

瑞典)用于测量在相同数字化的手X射线上的骨矿物质密度(BMD)和掌骨皮质指数(MCI)，所述X射线用于评估放射照相的关节伤害。DXR是传统放射照片测量技术的计算机形式，[13]并且已相当大地改善了方法及其精确性。DXR已得到详细描述。[14，15，16]在手放射照片上，计算机自动识别在第二、第三和第四掌骨的最狭窄部分周围的目标区(ROI)，并且测量皮质厚度、骨宽度和孔隙率118次/cm。DXR-BMD定义为：c X VPAcomb X(1-p)，其中c是常数(通过平均起来DXR-BMD等于Hologic QDR-2000设备的中-远侧前臂区的结果决定)；VPA是体积/面积；并且p是孔隙率。DXR-MCI定义为组合皮质厚度除以外部皮质直径，并且是不依赖于骨大小、骨长度和图像捕获设置的相对骨量度。[16.17]DXR-BMD和DXR-MCI提供相当大精确度。[17]

DXR-BMD预期是这个研究中的主要结果测量。然而，许多放射照片不能就BMD进行分析，这是因为未知图像分辨率。一般地，关于DXR-BMD的等式基于体积/面积且需要限定或已知的分辨率，因为当分辨率未知时，不能测量数字化放射照片中的距离。因此，其为不依赖于图像分辨率的相对测量的DXR-MCI用作主要结果测量。DXR-BMD和DXR-MCI之间的关联已显示是相当大的(r＞0.90)，不但在横截面上[18]而且在纵向上。[19]

为了比较，还提供了关于DXR-BMD的结果。通过假定254dpi(关于在评分前放射照片的扫描分辨率)分析未知分辨率的所有图像。然而，放射照片中的几个明显具有除254dpi外的分辨率，最可能是因为它们在扫描前已以非真实尺寸印刷。通过DXR-BMD和计算的平均掌骨宽度分析来自基线以及26、52和104周的所有可用图像。基于来自具有受控分辨率的其他研究的分析，[19]距离基线宽度大于2％的偏差被认为可能指示不正确值。用这个2％值作为截止值，23％的放射照片从进一步的DXR-BMD分析中排除。图1中的流程图举例说明在DXR-MCI和DXR-BMD分析中包括的患者。

为了避免关于优势与非优势手比较的偏差并且达到更好的准确度，使用来自2只手的平均值测量。[10]如果来自一只手的放射照片不能进行分析或丢失，那么使用在不同时间点时来自可获得手的放射照片用于所有分析。

统计学分析

因为数据并非正态分布，所以进行非参数分析。不执行插补(imputation)。在治疗组之间关于连续变量用Kruskall-Wallis方法比较基线值，并且关于分类变量(categorical variable)用卡方方法比较基线值。根据与原始研究J中采用的材料的那种平行和相似的方法，进行手BMD中改变的比较。[6]2个组用Mann-Whitney U检验以分层次序进行比较(即，联合组与MTX比较的双侧(two-sided)比较，随后为在单一疗法治疗臂之间的双侧比较，并且最后在阿达木单抗单一疗法和联合治疗之间的双侧比较)。仅当先前比较在统计上显著时进行每个逐对比较。随着时间过去的骨丢失表示为负值。

开发线性回归模型以搜索在104周时手BMD丧失的预测值。在使在104周时DXR-MCI中的改变与下述基线变量关联的尝试中进行Spearman相关分析：疾病持续时间；通过DAS28测量的疾病活动性；[20]CRP；健康评定问卷(HAQ DI)得分的能力丧失指数；[21]DMARDs和可的松的先前使用；放射照相的关节伤害；随机化治疗臂；和绝对DXR-MCI值。具有p值小于0.15的变量包括在多变量模型中，这也就年龄和性别进行调整。治疗臂作为虚变量(dummy variable)进行编码(MTX作为0，阿达木单抗作为1和联合组作为2)。

研究监督和伦理学

如报告的，研究J得到在每个参与场所处的中心机构评审委员会和独立伦理委员会的批准。[6]

结果

基线DXR-MCI值对于入组研究J的799患者的768可获得，并且DXR-MCI值对于完成研究的539个患者中的2个丢失(图1)。关于可获得的DXR-BMD数据(基于“方法”中描述的图像分辨率的截止值)的相应数目分别是765和369(图1)。人口统计学和基线临床特征在3个治疗组之间是可比较的(表1)。

表1.关于研究J中的早期类风湿性关节炎患者的基线特征 ^*

^*除其中关于连续变量所示结果以平均值±标准差，并且关于分类变量以数目和百分比给出外。

^**与氨甲蝶呤和联合组相比较，阿达木单抗组中显著更大的值。

RA＝类风湿性关节炎；DMARDs＝缓解疾病的抗风湿性药物；HAQ＝健康评定问卷；DAS28＝28关节疾病活动性得分；TSS＝总Sharp得分；DXR＝数字X射线放射照片测量术；BMD＝骨矿物质密度；MCI＝掌骨皮质指数。

治疗臂之间的唯一统计学显著差异是关于阿达木单抗单一疗法组的略微更大的平均HAQ得分。在入组前，皮质类固醇已由35％的患者(泼尼松龙的平均日剂量是6.6mg)使用，并且32％已用除MTX外的传统DMARDs治疗。基线放射照相的伤害得分在治疗组之间是相似的，具有14.0(19.3)的中值(平均值)Sharp得分(表1)。

关于所有患者的中值百分比DXR-MCI改变在26、52和104周后分别是-1.29、-2.45和-3.72。关于DXR-BMD的相应值是-1.07％、-1.72％和-2.63％。在DXR-MCI和DXR-BMD中距离基线的这些改变对于随访过程中所有时间点上的所有亚组都显著(对于所有p＜0.001)。皮质类固醇或DMARDs的使用不影响手骨丢失(数据未显示)。

在DXR-MCI和DXR-BMD改变之间的相关系数(r)在26、52和104周时分别是0.88、0.93和0.94(对于所有p＜0.001)。

治疗臂之间的DXR-MCI改变

在26、52和104周时，中值百分比DXR-MCI改变对于阿达木单抗加上MTX治疗组是-1.15、-2.16和-3.03，对于阿达木单抗单一疗法组是-1.33、-2.45和-4.03，并且对于MTX单一疗法组是-1.42、-2.87和-4.62(图2)。

在52周(p＝0.009)和104周(p＜0.001)时，与联合组相比较，DXR-MCI丧失的速率对于MTX组显著更大，并且在26周(p＝0.19)时也观察到相似趋势。在104周(p＝0.10)时阿达木单抗组中的骨丢失在数目上也低于MTX组。

治疗臂之间的DXR-BMD改变

联合组中的中值DXR-BMD百分比改变在26周时是-1.06，在52周时是-1.63，并且在104周时是-2.49。在阿达木单抗组中，在26、52和104周时的各自改变是-0.96、-1.97和-2.40；并且对于MTX组，改变是-1.20、-1.86和-3.58。在104周时观察到在MTX组和联合组中DXR-BMD改变之间的显著差异(p＝0.049)，以及在52周时朝向显著差异的趋势(p＝0.10)。此外，对于104周值，观察到MTX和阿达木单抗组之间朝向差异的趋势(p＝0.16)。

DXR-MCI和放射照相的伤害

在26、52和104周时，在改良的Sharp得分中的中值(平均值)放射照相的改变对于联合组分别是0(0.5)、0(0.9)和0(1.0)，并且对于阿达木单抗单一疗法组是0.5(2.1)、0.5(3.3)和1.0(4.8)。对于MTX单一疗法组，各自改变是1.0(3.4)、2.0(5.1)和2.0(6.4)(图2)。这个分析结果与原始研究J的发现比较中的不一致可能是研究参与者数目中的轻微差异(图1)，和此处未执行插补的事实的结果。在26、52和104周时，在DXR-MCI改变和在Sharp得分中的改变之间的关联(r)是r＝-0.12(p＝0.001)；r＝-0.23(p＜0.001)；和r＝-0.32(p＜0.001)。关于DXR-BMD和Sharp得分改变之间的关联的可比较r值分别是-0.15、-0.23和-0.33(对于所有p＜0.001)。

多变量模型

在最终多变量模型中包括的变量是疾病持续时间、DAS28得分、CRP、DXR-MCI、HAQ、放射照相的伤害和治疗组(虚变量)连同年龄和性别一起的基线值。

较大的年龄、较大的CRP和不使用阿达木单抗被证明是关于皮质手骨丢失的独立预测值，而更大的DAS28得分(即，更大的疾病严重程度)(p＝0.07)、和更短的疾病持续时间(p＝0.11)趋向于模型内的统计学显著性(表2)。

表2.关于通过多变量线性回归模型探究的515个RA关节炎患者， 在随访104周时关于百分比DXR-MCI丧失的预测值

^*治疗臂作为虚变量进行编码：0＝MTX，1＝阿达木单抗，2＝阿达木单抗加上MTX。

MCI基线、Sharp得分基线和HAQ不影响模型。

RA＝类风湿性关节炎；DXR＝数字X射线放射照片测量术；MCI＝掌骨皮质指数；HAQ＝健康评定问卷；DAS28＝28关节疾病活动性得分；

这个分析的关键发现是在具有特定类型RA，即早期攻击性RA的患者中，用阿达木单抗与MTX组合的抗TNF疗法提供比阿达木单抗或MTX单一疗法更佳的骨保护。在3个治疗臂中的手骨丢失次序与已在研究J中对于总体放射照相的伤害观察到的相同(图2)。此外，来自多变量模型的结果突出了炎症作为活动性RA中的骨伤害中的驱动力的重要性(用CRP评估)和TNF牵涉在这个过程中的重要性。

就机制而言，现在的分析支持侵蚀和骨质疏松症是相同病理生理学机制的结果的假设，所述相同病理生理学机制包括破骨细胞的激活。这个假设基于动物[2，22]和人研究的发现。[3]其为骨降解的主要细胞的破骨细胞通过滑液炎症驱动，并且通过TNF、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κ配体的受体激活剂(RANKL)刺激。这些细胞因子激活破骨细胞，其随后引起骨质疏松症(局部和全身的)和侵蚀。[23]

来自这个研究的发现支持通过抗TNF疗法抑制炎症减少手骨丢失的事实。此外，根据进行的多变量模型，CRP被证明是关于DXR-MCI丧失的强预测值。

不希望受理论束缚，联合组(阿达木单抗和MTX)中的骨丢失可以至少部分归因于参与研究J的早期RA患者中的相当大疾病活动性，及其就骨伤害(类风湿因子阳性和侵蚀性疾病)而言的不良预后[24]。

虽然活动性RA中的TNF拮抗剂疗法的正面作用看起来对于放射照相的关节伤害比对于手骨量更显著(图2)，但仍发现TNF拮抗剂疗法减少发展侵蚀的危险和炎症相关性手骨丢失的速率。虽然不希望受理论束缚，但关于这种不一致的一种解释可能是常规放射照片对于检测骨伤害不够灵敏。超声(US)和磁共振成像(MRI)已证实在检测侵蚀方面比放射照片更灵敏。25]此外，MRI可以在其在放射照片上变得可见前数年检测出侵蚀。[26]此外，MRI滑膜炎甚至已在临床和放射照相的减轻(“真实减轻”)状态中在RA患者中检测出。[27]通过DXA评估的手骨丢失也已显示是用于骨伤害的比常规放射照片更灵敏的标记。[10]因此，具有更大疾病活动性的患者中总是存在的炎症以及DXR检测骨量中小改变的能力的组合，可以解释即使在联合治疗组中也正在进行的手骨丢失。还必须指出在健康成年人尤其是绝经后女性中也发生的正常骨丢失的影响。关于DXR-MCI的正常骨丢失仅在报告每年骨丢失速率为0.7-0.9％的抽样研究中加以检查。[16，28，29]

当计划这个分析时，主要关于DXR-BMD的放射照片是最初待分析的。然而，由于“方法”中描述的原因，在分析关于DXR-BMD的放射照片的显著百分比中存在困难。这种研究基于研究J的事后(post-hoc)分析。通过使用相对DXR-MCI测量代替BMD的绝对测量，就孔隙率进行校正的机会是不可获得的。此外，与DXR-MCI形成对比，DXR-BMD就不同放射照相测量设备的模糊和特定品质进行校准。然而，DXR已改善了MCI的精确性，[17]并且在DXR-BMD和DXR-MCI之间存在强关联(r＞0.9)。[18，19]还已发现DXR-MCI和DXR-BMD与DXA-BMD极大关联。[19]这些事实暗示DXR-MCI是用于测量手骨量改变的有效替代物。

关于参与研究J的患者中的二膦酸盐使用的可用信息很少，然而，双盲、随机化对照试验的研究设计使潜在偏差的作用降到最低。此外，当进行研究J时，唑来膦酸并非用于骨质疏松症治疗出售。此外，在另一个研究中，发现英夫单抗在抑制关于骨的炎症的正面作用不依赖于二膦酸盐。[7]

总之，研究提供了有效抗TNF疗法不仅减少发展侵蚀的危险，而且还减少RA中炎症相关手骨丢失的速率的证据。这个研究还暗示骨伤害疾病过程在用TNF拮抗剂治疗的RA患者中可能仍存在，即使在放射照片上观察到的关节伤害看起来被阻止。

B.阿达木单抗不依赖于临床应答而减少类风湿性关节炎(RA)中的手骨丢失：研究J的子分析(subanalysis)

阿达木单抗减少具有早期RA的患者中的放射照相的关节伤害和手骨丢失的速率。放射照相的关节进展的速率已显示不依赖于患者对阿达木单抗的临床应答而减少。这先前未对于手骨丢失进行检查，所述手骨丢失是在炎症RA中的骨累及的次级特征。

本文描述的研究的目的是检查在研究J中接受氨甲蝶呤(MTX)单一疗法的患者和接受阿达木单抗加上MTX的患者中手骨丢失与临床应答之间的关系。

方法

如上所述，研究J比较在早期(＜3年)、活动性、MTX首次用于实验的RA患者中，阿达木单抗加上MTX与单独的MTX和单独的阿达木单抗中的功效。本文描述的子分析涉及MTX单一疗法和联合治疗组。手骨丢失通过数字X射线放射照片测量术掌骨皮质指数(DXR-MCI)进行评估，所述DXR-MCI由数字化放射照片(DXR，Sectra，瑞典)进行计算。MCI定义为组合掌骨皮质厚度除以外部骨直径，已显示与骨矿物质密度良好相关。对于具有不同临床应答的患者评估从基线到52周的MCI百分比改变。疾病活动性通过在4个亚组中在52周时的DAS28得分进行评估：减轻＝DAS28＜2.60；低疾病活动性＝DAS282.61-3.20；中等疾病活动性＝DAS283.21-5.20；和高疾病活动性＝DAS28＞5.20。执行非参数组比较。

结果

对于联合治疗组(MTX和阿达木单抗)，在具有减轻、低、中等和高疾病活动性的RA受试者中在骨丢失中不存在差异(p＝0.97)。对于MTX组，在4个临床疾病活动性亚组中存在数字差异(p＝0.10)(表3)。因为4个亚组的一些中的少量患者(参见表3)，我们将患者进一步分成2个其他亚组：减轻和低疾病活动性与中等和高疾病活动性比较。在MTX组中，具有中等和高DAS28的患者比具有低DAS 28的患者丧失显著更多的DXR-MCI(-4.65与-2.99比较，p＝0.01)，而在联合治疗组中未见统计学上显著的差异(-3.10与-2.70比较，p＝0.99)。在MTX组中疾病活动性和手骨丢失(百分比DXR-MCI)之间的关联是-0.14(p＝0.06)，并且对于联合治疗组是-0.07(p＝0.33)。

表3.用单独的MTX或用阿达木单抗+MTX(联合治疗)治疗的 具有减轻、低、中等和高疾病活动性的RA受试者中骨丢失中的差异

总之，这些数据暗示阿达木单抗不依赖于如先前对于放射照相的关节伤害显示的临床评估的疾病活动性减少手骨丢失。这些结果支持TNF不仅通过经由炎症刺激RANKL而且通过直接激活破骨细胞影响骨丢失的假设。

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29.Toledo VA，Jergas M.Age-related changes in cortical bone mass：datafrom a German female cohort.Eur Radiol 2006；16：811-17.

等同方案

本领域技术人员将认识到或使用不超过常规实验能够确定针对本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此种等同方案预期由下述权利要求包含。本申请自始至终引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请和专利申请的内容引入本文作为参考。

Claims (25)

1.一种用于治疗受试者中的骨丢失的方法，其包括给所述受试者施用人TNFα抗体或其抗原结合部分，从而使得骨丢失得到治疗。

2.权利要求1的方法，其中所述受试者具有类风湿性关节炎。

3.权利要求2的方法，其中所述治疗进一步包括氨甲蝶呤的施用。

4.权利要求1的方法，其中手骨丢失得到治疗。

5.权利要求1的方法，其中所述人TNFα抗体或其抗原结合部分选自

a)人抗体或其抗原结合部分，其以1×10-8M或更少的Kd和1×10-3s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离，两者都通过表面等离振子共振进行测定，并且在标准体外L929测定中以1×10-7M或更少的IC50中和人TNFα细胞毒性；

b)人抗体或其抗原结合部分，其具有下述特征：

i)如通过表面等离振子共振测定的，以1×10-3s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离；

ii)具有轻链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、8和/或9上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列；

iii)具有重链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列，

c)人TNFα抗体或其抗原结合部分，其包括具有CDR3结构域的轻链可变区(LCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列，并且包括具有CDR3结构域的重链可变区(HCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQID NO：4修饰的氨基酸序列；

d)人TNFα抗体或其抗原结合部分，其包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)；

e)阿达木单抗；和

f)戈利木单抗。

6.权利要求1的方法，其中所述受试者先前选择为具有骨丢失或处于具有骨丢失危险中。

7.一种用于治疗受试者中的手骨丢失的方法，其包括给所述受试者施用TNFα抑制剂，从而使得手骨丢失得到治疗。

8.权利要求7的方法，其中所述受试者具有类风湿性关节炎。

9.权利要求8的方法，其中所述治疗进一步包括氨甲蝶呤的施用。

10.权利要求7的方法，其中所述受试者具有骨质疏松症。

11.权利要求7的方法，其中所述受试者具有骨关节炎。

12.权利要求7的方法，其中皮质手骨丢失得到治疗。

13.权利要求7的方法，其中所述TNFα抑制剂是TNFα抗体或其抗原结合部分。

14.权利要求13的方法，其中所述TNFα抗体或其抗原结合部分是人TNFα抗体或其抗原结合部分。

15.权利要求14的方法，其中所述人TNFα抗体或其抗原结合部分选自

a)人抗体或其抗原结合部分，其以1×10-8M或更少的Kd和1×10-3s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离，两者都通过表面等离振子共振进行测定，并且在标准体外L929测定中以1×10-7M或更少的IC50中和人TNFα细胞毒性；

b)人抗体或其抗原结合部分，其具有下述特征：

i)如通过表面等离振子共振测定的，以1×10-3s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离；

ii)具有轻链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、8和/或9上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列；

iii)具有重链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列，

c)人TNFα抗体或其抗原结合部分，其包括具有CDR3结构域的轻链可变区(LCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列，并且包括具有CDR3结构域的重链可变区

(HCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQID NO：4修饰的氨基酸序列；

d)人TNFα抗体或其抗原结合部分，其包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)；

e)阿达木单抗；和

f)戈利木单抗。

16.权利要求7的方法，其中所述受试者先前选择为具有骨丢失或处于具有骨丢失危险中。

17.一种用于治疗受试者中的手骨丢失的方法，其包括选择具有手骨丢失或处于具有手骨丢失危险中的受试者，并且给所述受试者施用TNFα抑制剂，从而使得手骨丢失得到治疗。

18.权利要求17的方法，其中所述受试者具有类风湿性关节炎。

19.权利要求18的方法，其中所述治疗进一步包括氨甲蝶呤的施用。

20.权利要求17的方法，其中所述受试者具有骨质疏松症。

21.权利要求17的方法，其中所述受试者具有骨关节炎。

22.权利要求17的方法，其中皮质手骨丢失得到治疗。

23.权利要求17的方法，其中所述TNFα抑制剂是TNFα抗体或其抗原结合部分。

24.权利要求23的方法，其中所述TNFα抗体或其抗原结合部分是人TNFα抗体或其抗原结合部分。

25.权利要求24的方法，其中所述人TNFα抗体或其抗原结合部分选自

a)人抗体或其抗原结合部分，其以1×10-8M或更少的Kd和1×10-3s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离，两者都通过表面等离振子共振进行测定，并且在标准体外L929测定中以1×10-7M或更少的IC50中和人TNFα细胞毒性；

b)人抗体或其抗原结合部分，其具有下述特征：

i)如通过表面等离振子共振测定的，以1×10-3s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离；

ii)具有轻链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、8和/或9上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列；

iii)具有重链CDR3结构域，其包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列，

c)人TNFα抗体或其抗原结合部分，其包括具有CDR3结构域的轻链可变区(LCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列，并且包括具有CDR3结构域的重链可变区(HCVR)，所述CDR3结构域包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQID NO：4修饰的氨基酸序列；

d)人TNFα抗体或其抗原结合部分，其包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)；

e)阿达木单抗；和

f)戈利木单抗。

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