HU224248B1 - Terápiás szerek és autoimmun-betegségek - Google Patents

Terápiás szerek és autoimmun-betegségek Download PDF

Info

Publication number
HU224248B1
HU224248B1 HU9900147A HUP9900147A HU224248B1 HU 224248 B1 HU224248 B1 HU 224248B1 HU 9900147 A HU9900147 A HU 9900147A HU P9900147 A HUP9900147 A HU P9900147A HU 224248 B1 HU224248 B1 HU 224248B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
etxb
therapeutic agent
cells
antigenic determinant
agent
Prior art date
Application number
HU9900147A
Other languages
English (en)
Inventor
Timothy Raymond Hirst
Toufic Osman Nashar
Neil Andrew Williams
Original Assignee
University Of Bristol
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Bristol filed Critical University Of Bristol
Publication of HUP9900147A2 publication Critical patent/HUP9900147A2/hu
Publication of HUP9900147A3 publication Critical patent/HUP9900147A3/hu
Publication of HU224248B1 publication Critical patent/HU224248B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya terápiás szerek alkalmazása autoimmun betegség vagyhumán T-sejtes leukémia gyógyítására vagy megelőzésére szolgálógyógyszer előállításában, ahol (i) a terápiás szer Etx (E. coli hőrelabilis endotoxin), EtxB (E. coli hőre labilis enterotoxin, Balegység), Ctx (koleratoxin) és/vagy CtxB (koleratoxin, B alegység),(ii) ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt alkalmazzák,a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy együtt egyaktív terápiás szert képeznének. A találmány tárgya továbbá terápiásszer alkalmazása transzplantációs kilökődés vagy GVHD betegségmegelőzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában,ahol i) a terápiás szer Etx és/vagy EtxB, ii) ha a terápiás szert egyantigéndeterminánssal együtt adják be, a szer és az antigéndeterminánsnem kapcsolódik úgy, hogy egyetlen aktív terápiás szert képeznének. Atalálmány oltalmi körébe tartoznak még a fenti terápiás szerekettartalmazó, a fenti betegségek megelőzésére és/vagy kezeléséreszolgáló gyógyszerkészítmények is.

Description

állításában, ahol (i) a terápiás szer Etx (E. coli hőre labilis endotoxin), EtxB (E. coli hőre labilis enterotoxin, B alegység), Ctx (koleratoxin) és/vagy CtxB (koleratoxin, B alegység), (ii) ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt alkalmazzák, a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy együtt egy aktív terápiás szert képeznének.
A találmány tárgya továbbá terápiás szer alkalmazása transzplantációs kilökődés vagy GVHD betegség megelőzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában, ahol
i) a terápiás szer Etx és/vagy EtxB, ii) ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt adják be, a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy egyetlen aktív terápiás szert képeznének.
A találmány oltalmi körébe tartoznak még a fenti terápiás szereket tartalmazó, a fenti betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények is.
HU 224 248 Β1
A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 11 lap ábra)
HU 224 248 Β1
A találmány emlősök, különösen az ember autoimmun betegségeinek kezelésére alkalmas terápiás szerekre vonatkozik.
A találmány tárgya közelebbről terápiás szerek alkalmazása autoimmun betegség vagy humán T-sejtes leukémia gyógyítására vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállításában, ahol (i) a terápiás szer Etx (E. coli hőre labilis endotoxin), EtxB (E. coli hőre labilis enterotoxin, B alegység), Ctx (koleratoxin) és/vagy CtxB (koleratoxin, B alegység), (ii) ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt alkalmazzuk, a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy együtt egy aktív terápiás szert képeznének. A „Morphologic and Functional Alterations of Mucosal T Cells by Cholera Toxin and its B subunit” című cikkben (Charles O. Elsőn és munkatársai, The Journal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040) leírják, hogy a koleratoxin (Ctx) és a CtxB alegység gátolja a CD8+ és a CD4+ T-sejteket.
A „Prevention of Acute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with a Növel Immunosuppressant” (B. Yankelevich és munkatársai, The Journal of Immunology, 1995, 154; 3611-3617) a CtxB alegységet mint a csontvelő-átültetés során használt szert ismerteti, amely alkalmas az akut graft-versus-host betegség (GVHD) megelőzésére.
A WO 95/10301 számú nemzetközi szabadalmi leírás olyan immuntolerancia-indukáló szerről számol be, amely egy specifikus tolerogénhez kapcsolt nyálkahártyakötő molekulát tartalmaz.
A leírásban használt „Ctx” jelölés a koleratoxint, a „CtxB jelölés a koleratoxin B alegységet jelöli. Egyéb szövegekben ezeket az anyagokat „CT” vagy „Ct” és „CTB” vagy „CtB” jelöléssel azonosíthatják. A leírásban az „Etx” jelölés E. coli hőre labilis enterotoxint és az „EtxB” jelölés EtxB alegységet jelent. Egyéb szövegekben ezeket az anyagokat „LT” vagy „Lt” és „LTB” vagy „LtB” jelöléssel is jelölhetik.
A találmány alapja az a felismerés, hogy az EtxB (az E. coli hőre labilis enterotoxinjának tiszta B alegysége) kötődik az emlőssejtek felületén található GM1-gangliozid-receptorokhoz, és hogy ez a kötődés megkülönböztető hatásokat indukál limfocitapopulációkon, beleértve a CD8+ T-sejtek egy specifikus eltávolítását és a B-sejtek ezzel kapcsolatos aktivációját. Ezek a hatások nem mutatkoznak meg, ha egy GM 1-kötő aktivitást nem mutató mutáns EtxB fehérjét alkalmazunk.
Autoimmun betegségek
Az autoimmunitás kifejezést annak a mechanizmusnak a leírására használják, amely által a test egy immunválaszt generál saját antigénekkel szemben.
A találmány tárgya terápiás szer alkalmazása autoimmun betegségek kezelésére vagy megelőzésére használt gyógyszer előállítására, ahol a terápiás szer Etx, EtxB, Ctx és/vagy CtxB, és ahol, ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt adjuk be, a terápiás szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy együtt egy aktív terápiás szert képeznének.
Azt találtuk, hogy a találmány szerinti megoldásban alkalmazható terápiás szerek modulálják a limfocitapopulációkat, CD8+ T-sejtekben apoptózis indukálásához, CD4+ sejtek megnövekedett aktivációjához és B-sejtek poliklonális aktivációjához vezetve. Ezek az események valószínűleg eltolják az immunválaszt a Th2-vel kapcsolatos citokinek indukciójának az irányába. Ismert, hogy az ilyen, a saját vagy keresztreagáló antigénekkel szembeni válaszok védőhatást közvetítenek bizonyos autoimmun betegségekkel szemben.
A találmány szerinti megoldás első kiviteli módja szerint az alkalmazott terápiás szereket folyamatban lévő autoimmun betegségekben használjuk. Ekkor a terápiás szert a betegnek adott esetben egy saját vagy keresztreagáló antigénnel együtt adjuk be. Ebben az esetben a terápiás szer beadása az immunválasz jellegét a saját antigén felé irányítja, el a betegséget kiváltó gyulladás aktiválásától, és így védelmet nyújt az autoimmun betegséggel szemben.
A találmány szerinti megoldás második kiviteli módja szerint a terápiás szert valamilyen emlős autoimmun betegség elleni „vakcinálás”-ára használjuk, amelynek során a terápiás szert a betegséggel kapcsolatos saját vagy keresztreagáló antigéndeterminánssal együtt (vagy saját vagy keresztreagáló antigéndeterminánsok különféle kombinációjával együtt) adjuk be. Ilyen módon a betegnek a saját antigén felé vagy a keresztreagáló antigén felé adott immunválasza elmozdul a patogenezis aktivációjától, amely ezért véd egy jövőbeni, a saját antigén ellen irányuló autoimmunválasz ellen.
A találmány szerinti megoldásban a terápiás szert és a saját vagy keresztreagáló antigéndeterminánst együtt adjuk be vagy adhatjuk be a kezelendő személynek. Véleményünk szerint ilyen módon a terápiás szer és az antigéndetermináns beadásának helye és ideje olyan, hogy létrejön az immunrendszer szükséges modulációja. így, noha a terápiás szer és az antigéndetermináns beadható ugyanabban az időpillanatban és ugyanazon a helyen, előnyös lehet a terápiás szernek az antigéndeterminánstól eltérő időpontban és helyen való beadása.
Bár a terápiás szer és az antigéndetermináns egyszeres dózisai kielégítő hatásúak lehetnek, a többszörös dózisok is a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Előnyös az elkülönült beadás, amelynek során a terápiás szer és az antigéndetermináns nincs összekapcsolva úgy, hogy együttesen egy aktív szert képeznének, mert lehetővé teszi a különböző csoportok elkülönült beadását.
Az ilyen gyógyszerrel kezelhető specifikus autoimmun betegségek azok az autoimmun betegségek, amelyeknek a patológiája sejtvezérelt immunitással kapcsolatos; ilyen a reumatoid arthritis, sclerosis multiplex és a diabétesz.
A találmány oltalmi körébe tartoznak a humán autoimmun betegségek kezelésére használatos terápiás szert tartalmazó gyógyszerkészítmények is, ahol a terápiás szer Etx, EtxB, Ctx és/vagy CtxB, és ahol, ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt adjuk be, a terápiás szer és az antigéndetermináns nem kap2
HU 224 248 Β1 csolódik úgy, hogy együtt egy aktív terápiás szert képeznének.
A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket úgy formulálhatjuk, hogy azok a hatóanyagot nyálkahártyán keresztül adják le, ilyen készítmény például az orrspray; a készítményeket formulálhatjuk injektálható parenterális készítmény formájában is, amely a hatóanyagot például intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután úton adja le.
A gyógyszerkészítményt formulálhatjuk a megfelelő saját vagy keresztreagáló antigénnel együtt. Alternatív módon eljárva egy készlet állítható elő, amely a terápiás szer és az antigéndetermináns kompozíciókat elkülönülten tartalmazza.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazható terápiás szerek gyakorlatilag nem toxikus szerek kell legyenek, bár a toxicitás bizonyos foka tolerálható az ilyenfajta szigorú terápiákban.
A találmány oltalmi körébe tartozó, humán autoimmun betegség kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények terápiás szerként a Ctx, CtxB, Etx vagy EtxB fehérjéket tartalmazzák. A találmány előnyös megvalósítási módja értelmében előnyös az EtxB fehérje (amely öt azonos alegység pentamerje) alkalmazása ilyen kezelésekben.
T-limfocita-leukémiák
A találmány tárgyát képezi még egy terápiás szer alkalmazása T-sejt, így CD8 T-sejt-eredetű humán leukémiák kezelésére alkalmas gyógyszer előállításában, ahol a terápiás szer Etx, EtxB, Ctx és/vagy CtxB, és ahol ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt alkalmazzuk, akkor a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy együtt egy aktív terápiás szert képeznének.
A fenti alkalmazásban használt terápiás szerek gyakorlatilag nem toxikus szerek kell legyenek, bár a toxicitás bizonyos foka tolerálható az ilyenfajta szigorú terápiákban.
A találmány oltalmi körébe tartoznak továbbá a T-sejt-eredetű humán leukémiák kezelésére alkalmas terápiás szert tartalmazó gyógyszerkészítmények is, ahol a terápiás szer Etx, EtxB, Ctx és/vagy CtxB, és ahol, ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt alkalmazzuk, akkor a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy együtt egy aktív terápiás szert képeznének.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények úgy formulálhatók, hogy a hatóanyagot nyálkahártyán keresztül adják le, ilyen készítmény például az orrspray; a készítményeket formulálhatjuk injektálható parenterális készítmény formájában is, amely a hatóanyagot például intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután úton adja le.
A találmány tárgya még Ctx, CtxB, Etx vagy EtxB fehérje alkalmazása terápiás szerként T-sejt-eredetű humán leukémiák kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményekben. Előnyös a CtxB fehérje alkalmazása.
Transzplantációs kilökődés és GVHD
A fentieken kívül a találmány oltalmi körébe tartozik még egy terápiás szer alkalmazása transzplantációs kilökődés vagy GVHD (GVHD betegség: az átültetett szerv reakciója a befogadó szervezettel szemben) megelőzésére vagy kezelésére használható gyógyszer előállításában, ahol a terápiás szer Etx, EtxB, Ctx és/vagy CtxB, és ahol, ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt alkalmazzuk, akkor a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy együtt egy aktív terápiás szert képeznének.
A találmány fenti tárgyának előnyös megvalósítási módja szerint a fenti terápiás szerek allogén vagy xenogén szilárd szerv transzplantációs kilökődése megelőzésében használható gyógyszer előállításában alkalmazhatók. Alkalmazhatók akut GVHD betegség megelőzésére is, például csontvelő-transzplantációs eljárás során.
Abban az esetben, amikor a beteget a transzplantáció előtt kezeljük, a terápiás szert alloantigénnel vagy xenoantigénnel együtt kell beadni. A transzplantáció utáni kezelés esetén a terápiás szert antigén nélkül adjuk be.
Abban az esetben, amikor a terápiás szert és allovagy xenoantigéndeterminánst együtt adjuk be a páciensnek, véleményünk szerint a terápiás szer és az antigéndetermináns beadásának helye és ideje olyan, hogy az immunrendszer szükséges modulációja bekövetkezik. így, habár a terápiás szert és az antigéndeterminánst ugyanabban az időpillanatban és ugyanazon a helyen adhatjuk be, előnyös lehet ezek eltérő időben és eltérő helyen történő beadása. Az elkülönült beadás, amelyben a terápiás szer és az antigéndetermináns nincsenek így összekapcsolva, előnyös lehet, mert lehetővé teszi a különböző csoportok elkülönült beadását.
Bár a terápiás szer és az antigéndetermináns egyszeres dózisai kielégítők lehetnek, a többszörös dózisok is a találmány oltalmi körébe tartoznak.
A találmány ezen tárgyának megvalósítása szerint, abban az esetben, amikor a terápiás szert GVHD megelőzésére alkalmazzuk, a szert általában közvetlenül a transzplantálni kívánt sejtekhez, így például a csontvelősejtekhez kell juttatni.
A terápiás szer előnyösen gyakorlatilag nem toxikus, bár ilyen típusú szigorú terápiák esetén a toxicitás bizonyos foka tolerálható.
A találmány oltalmi körébe tartozik még a transzplantációs kilökődés kezelésében használt terápiás szert tartalmazó gyógyszerkészítmény is, ahol a terápiás szer Etx, EtxB, Ctx és/vagy CtxB, és ahol, ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt alkalmazzuk, akkor a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy együtt egy aktív terápiás szert képeznének.
A találmány szerinti fenti gyógyszerkészítmények úgy formulálhatók, hogy a hatóanyagot nyálkahártyán keresztül adják le, ilyen készítmény például az orrspray; a készítményeket formulálhatjuk injektálható parenterális készítmény formájában is, amely a hatóanyagot például intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután úton adja le.
A gyógyszerkészítményt a megfelelő allo- vagy xenoantigéndeterminánssal együtt is formulálhatjuk. Al3
HU 224 248 Β1 ternatív módon, egy készletet is létrehozhatunk, amely a terápiás szer és az antigéndetermináns elkülönült kompozícióját tartalmazza.
A találmány egy további megvalósítási formája szerint a találmány oltalmi körébe tartozik a Ctx, CtxB, Etx vagy EtxB fehérje alkalmazása terápiás szerként transzplantációs kilökődés kezelésére alkalmas gyógyszerben. Előnyös az EtxB fehérje (amely öt azonos alegység pentamerje) alkalmazása.
Vakcináciö
Az irodalomban már javasolták a CtxB és EtxB úgynevezett „vakcinahordozó”-ként való alkalmazását. A kutatások szerint ennek a hatásnak az alapja, legalábbis részben, az EtxB azon képessége, hogy a GM 1-receptorhoz való kötődés által képes modulálni limfocitapopulációkat, amint azt már az előzőekben ismertettük.
A szer képes az immunválasz modulálására akkor, ha egy nem rokon idegen antigéndeterminánssal együtt juttatjuk be. Ha a szer parenterálisan jut a szervezetbe, akkor az immunmoduláció az immunválasz tekintetében különösen kívánatos irányba „van irányítva”. Ha a szer nyálkahártyán keresztül jut be egy nem rokon antigénnel, egy úgynevezett „nyálkahártya-adjuváns”-sal együtt, a szer képes megkönnyíteni a nem rokon antigénre adott nyálkahártyái immunválaszt. Az antigént és a terápiás szert együtt juttathatjuk be a szervezetbe elkülönült csoportok formájában.
A szer előnyösen nem toxikus. Emellett, ha a szert nyálkahártyán felszívódva, a gasztrointesztinális nyálkahártyán keresztül kívánjuk bejuttatni, akkor a szernek képesnek kell lennie arra, hogy a gasztrointesztinális traktusban való tartózkodás alatt stabil maradjon; például ellenálló kell legyen a proteolitikus bomlással szemben, stabilnak kell lennie savas pH-nál, és ellen kell állnia az epe detergens hatásainak is.
Ha a találmány szerinti terápiás szer valamilyen fehérje, így EtxB alegység, akkor a találmány szerinti alkalmazás összes szempontját figyelembe véve olyan módszerrel állíthatjuk elő, ahol a fehérjét szolgáltató specifikus polipeptidláncot (vagy -láncokat) kódoló gént vagy géneket egy megfelelő vektorba visszük be, majd egy megfelelő gazdaszervezet transzfektálására használjuk. Például az EtxB forrásául szolgáló polipeptidlánc kódolására szolgáló gént egy pMMB68 plazmidba vihetjük be, amelyet azután gazdasejtek, így Vibrio sp. 60 transzfektálására használhatunk. A fehérjét ismert módon tisztíthatjuk és izoláljuk. Aktív mutáns EtxB fehérjét expresszáló mutáns gének ezután a vad típusú génből ismert módszerekkel állíthatók elő.
Amint az előzőekben már ismertettük, GM 1-kötő aktivitással rendelkező szerek, így specifikusan kigondolt humanizált monoklonális antitestek a fentiek szerint, az irodalomban ismert módon tervezhetők és állíthatók elő.
A találmány szerinti megoldás összes szempontját figyelembe véve a GM1-kötő aktivitással rendelkező szerek képesek lehetnek GM 1-receptorok keresztkötésére is. Az EtxB is egy ilyen szer, amely pentamer formájának köszönhetően képes GM 1-receptorok keresztkötésére.
A találmányt az alább következő rajzokkal és példákkal illusztráljuk.
A rajzok rövid ismertetése
Az 1. ábra az EtxB és az EtxB egy mutáns formája [EtxB (G33D)] fizikai-kémiai tulajdonságainak analízisét mutatja be;
a 2. ábra azt illusztrálja, hogy az EtxB által létrejött receptorkötés alapvető az EtxB erőteljes in vivő immunízálóhatása szempontjából;
a 3. ábra az EtxB-vel való injektálást követően a limfocitaproliferáció kinetikáját illusztrálja egérben;
a 4. ábra azt illusztrálja, hogy az EtxB B-sejtek megnövekedett aktivációját okozza;
az 5. ábra azt illusztrálja, hogy az EtxB CD4+ T-sejtek megnövekedett aktivációját és CD8+ sejtek tenyészetből való kiürülését okozza;
a 6. ábra OVA-reszponzív CD8+ T-sejtek EtxB okozta szelektív kiürülését illusztrálja; a 7. ábra azt illusztrálja, hogy az EtxB által létrejött receptorkötés módosulásokat hoz létre apoptózison átesett sejtek limfocitasejtmag-morfológiai karakterisztikájában;
a 8. ábra azt illusztrálja, hogy az EtxB CD8+ T-sejtek receptorvezérelt apoptózisát okozza sejtciklusanalízis-mérés alapján;
a 9a. és 9b. ábra azon kísérletek eredményeit foglalja össze, amelyeket annak illusztrálására végeztünk, hogy az EtxB által létrejött GM1-kötés gátolja kollagén indukálta arthritis kifejlődését egy állati modellben;
a 10. ábra azon kísérlet eredményeit foglalja össze, amelyet annak illusztrálására végeztünk, hogy az EtxB (G33D)-től eltérően az EtxB apoptózist indukál normál humán perifériás vér mononukleáris sejtek egy populációjában; és a 11. ábrán egy olyan kísérlet eredményeit mutatjuk be, amiből az látható, hogy a GM1-keresztkötődés apoptózishoz vezet patkány-CTLL-sejtek egy részében.
A rajzok részletes ismertetése
1. ábra
Az EtxB és EtxB (G33D) fizikai-kémiai tulajdonságainak analízise (A) EtxB vagy EtxB (G33D) SDS-PAGE-analizise: mindegyik fehérjéből 5 pg-ot redukciós körülmények között analizáltunk β-merkapto-etanol jelenlétében, az analizálást megelőzően melegítve, vagy melegítés nélkül. 1 vonal: vad típusú EtxB, melegítés nélkül; 2 vonal: EtxB (G33D), melegítés nélkül; 3 vonal: vad típusú EtxB, 95 “C-ra melegítve; 4 vonal: EtxB (G33D), 95 °C
HU 224 248 Β1 hőmérsékletre melegítve. Az ábra bal oldalán molekulatömeg-standardok (BioRad) láthatók.
(B) EtxB és EtxB (G33D) látszólagos molekulatömegének meghatározása gélszűréses kromatográfiával: standard görbét (körök) generáltunk, a görbe tetejétől az aljáig nézve, a következők felhasználásával: szarvasmarha-szérumalbumin (66 kDa), tyúktojásalbumin (45 KDa), szarvasmarhaeritrocita-szén-anhidráz (29 kDa) és lószívcitokrom c (12,4 kDa); az EtxB-t és EtxB (G33D)-t 36 kDa és 38 kDa-os látszólagos molekulatömegekkel eluáltuk; Ve - a fehérje elúciós térfogata, Vo - a gélfiltrációs oszlop üres térfogata.
(C) Az EtxB és EtxB (G33D) GM1-gangliozidhoz való komparatív kötődéseinek összehasonlítása ELISA-módszerrel: a lemezeket GM1-gyel vontuk be, blokkoltuk, és 1 pg/ml EtxB- vagy EtxB (G33D)-oldattal inkubáltuk, melyeket 1 pg/ml-es oldatból sorozathígítással (háromszor) állítottunk elő.
2. ábra
Az EtxB általi receptorkötés alapvető faktor erőteljes in vivő immunizálóhatása szempontjából
BALB/c egereket (mindegyik csoportban 4 egér) szubkután injektáltunk EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel, PBS-ben, vagy a fehérjéket orálisan adtuk be bikarbónát pufferban. A szérumokat 10 napon keresztül analizáltuk két szubkután injekciót követően (A), vagy 1 héten keresztül, 3 orális dózist követően (B), és bélváladékokat analizáltunk 1 héten keresztül 3 orális dózist követően (C). Kontroliegerekből származó mintákban egyáltalán nem figyeltünk meg reakciókat (ábrán nem mutatjuk). Az eredményeket a szérum átlagos IgG antitesttiterében fejeztük ki, míg a bélváladékban az IgA-t mint „specifikus aktivitást” fejeztük ki.
3. ábra
A limfocitaproliferáció kinetikája
Egereket intraperitoneálisan injektáltunk 30 pg EtxB (G33D)-vel komplett Freund-féle adjuvánsban. Mesenterialis nyirokmirigyeket izoláltunk 10 nappal később, és a sejteket antigén nélkül (üres karika), vagy a következők jelenlétében inkubáltuk: 80 pg/ml EtxB (sötét háromszögek), EtxB (G33D) (üres háromszögek), vagy EtxB 95 °C-os melegítéssel szétbontott monomer formája (sötét körök) és EtxB (G33D) 95 °C-os melegítéssel szétbontott monomer formája (üres körök). Mindegyik mintavételi nap utolsó 6 órája alatt a sejteket 1 pCi (3H)-Thd-vel radioaktívvá tettük. Az adatok három lyuk átlagos beütésszám/perc értékeit és szórását fejezik ki.
4. ábra
B-sejtek aktivációjának növekedése EtxB hatására
Egereket EtxB (G33D)-vel immunizáltunk CFA-ban. 10 nappal később sejteket izoláltunk mesenterialis nyirokmirigyekből és 80 pg/ml EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében, vagy a fehérjék 40-40 pg/ml-ének keveréke jelenlétében inkubáltuk. A sejteket biotinezett anti-CD25-tel (7D4) és fikoeritrin (PE) anti-B220-szal (Ra3-6D2) jelöltük. Streptavidin FITC-t használtunk másodlagos antitestkonjugátumként. Antitestkontrollokat is alkalmaztunk (ábrán nincs jelölve). A proliferáció 4. napján kettős áramláscitometrikus analízist (flow cytometric analysis) hajtottunk végre.
5. ábra
CD4+ T-sejtek aktivációjának növekedése és CD8*
T-sejtek kiürülése EtxB hatására
Az immunizációs módszer, a sejtizolálás és az in vitro támadás a 4. ábra leírásánál ismertetettek szerinti. A CD25 detektálásához biotinezett anti-CD25-öt (7D4) és Streptavidin FITC-t használtunk. CD4 és CD8 detektálásához FITC-jelzett anti-CD4-et (RNRM4-5) és FITC-jelzett anti-CD8a-t (53-6,7) használtunk. Megfelelő antitestkontrollokat is alkalmaztunk (az ábrán nem látható).
6. ábra
OVA-reszponzív CD8* T-sejtek szelektív kiürülése
EtxB hatására
OVA-val előkezelt egerekből vett mesenterialis nyirokmirigyekből nyert sejttenyészeteket hoztunk létre és 5 napon keresztül tároltunk antigén nélkül vagy OVA+EtxB, OVA+ETxB (G33D), vagy csak ÓVA jelenlétében, a mennyiségek: 100 pg ÓVA és 40-40 pg/ml EtxB vagy EtxB (G33D), csak ÓVA esetén 100 pg ÓVA. A sejteket a következő patkányantitestekkel jelöltük: FITC-anti-CD4 vagy FITC-anti-CD8a, és mindkettőt biotin-anti-CD25-tel (IL-2Ra), majd Streptavidin-fikoeritrinnel alkalmaztuk. A nem festett sejteket vagy a csak másodlagos antitesttel festett sejteket kontrollként használtuk. A sejteket FACS segítségével (Becton Dickinson) analizáltuk. A magasabb növekedés az összes AD25+-festett sejt arányában az olyan tenyészetek esetében, amelyek EtxB-t tartalmaztak, összehasonlítva más kezelésekkel, az ezt a markert expresszáló B-sejtek nagyobb arányának köszönhető (az ábrán nem mutatjuk). A fluoreszcenciaintenzitás-skála logaritmikus.
7. ábra
Az EtxB receptor kötődése átalakulásokat indukál apoptózison átesett sejtek limfocitasejtmag-morfológiai karakterisztikájában >90% CD3* T-sejteket tartalmazó és makrofágoktól mentesített mesenterialis nyirokmírigysejteket 18 órán keresztül inkubáltunk 80 pg/ml EtxB-vel vagy 80 pg/ml EtxB (G33D)-vel, és a tenyészetet megfestettük akridinnaranccsal. A sejteket közönséges vagy konfokális fluoreszcens mikroszkóp (Leica TCS 4D) alatt vizsgáltuk. Az ábrákon minden kezelésre vonatkozóan bemutatunk egy reprezentatív mikroszkópos területet (x 540) [EtxB, bal kéz felőli ábrák, EtxB (G33D), jobb kéz felőli ábrák]. Az antigén nélkül inkubált sejtek hasonló eredményt mutatnak, mint az EtxB (G33D)-vel kezelt sejtek (ábrán nincs mutatva).
8. ábra
CD8* T-sejtek EtxB receptorvezérelt apoptózisa sejtciklus-analízissel mérve A CD4* és CD8* SPLTC arányát a sejtciklus szub-Go/GT fázisában a DNS-tartalom áramláscitometriás analízisével határoztuk meg propidium-jodiddal történő festés után. SPLTC-t izoláltunk lépből negatív szelekcióval, a fent ismertetettek szerint eljárva. A sejteket 18 órán keresztül a következőkkel kezeltük: (a) semmiféle antigén, (b) 80 pg/ml EtxB (G33D) vagy (c) 80 pg/ml EtxB, majd festés FITC patkány-anti-CD4-gyel vagy FITC patkány-anti-CD8a-val. A sejte5
HU 224 248 Β1 két ezt követően propidium-jodiddal festettük. A propidium-jodíddal is megfestődött sejtek arányát úgy határoztuk meg, hogy kiszűrtük azokat a sejteket, amelyeket vagy anti-CD4, vagy anti-CD8 antitestekkel festettünk meg. Az eredmények a 7. ábrán és a 3. táblázatban láthatók.
Példák
1. példa
A példa azt illusztrálja, hogy a limfocitapopulációkra gyakorolt megkülönböztető hatásokhoz GM 1-kötés szükséges.
Anyagok és módszerek
Az EtxB egy receptorkötő mutánsának előállítása
Humán EtxB receptorkötő helyére Gly-33-»Asp szubsztitúciót vittünk be plazmid pTRH29 alkalmazásával, amely a fagemid vektor pBluescript IIKS+ származéka, mely az EtxA és -B alegységekhez szükséges géneket tartalmazza [Yu, J., Webb, H. & Hirst, T. R. (1992) Molec. Microbiol. 6, 1949-1958], Mutagenezist hajtottunk létre egy in vitro oligonukleotidirányított mutageneziskészlettel (Amersham International), templátként egyszálas pTRH29-et, mutagén primerként pedig egy szintetikus oligonukleotidot (5’-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3’, származási hely: Microanalytical Facility, IAPGR, Cambridge Research Station, Egyesült Királyság) használva. A pontos Gly->Asp szubsztitúciót didezoxiszekvenálással határoztuk meg szekvenáz ll-t használva (United States Biochemical Corp.), és a kapott plazmidot pTRH56 jelöléssel jelöltük. A mutáns etxB gént kimetszettük a pTRH56-ból EcoRI és Spel restrikciós enzimeket használva, és pMMB68-ba illesztettük [Sandkvist, M., Hirst, T. R. & Bagdasarian, M. (1987) J. Bacteriol. 169,4570-4576], ilyen módon előállítva a pTHR64 jelű, EtxB (G33D)-t expresszáló széles spektrumú (sokféle gazdasejtbe bevihető) expressziós vektort.
Antigének
Vibrio sp. 60 (pMMB68) és Vibrio sp. 60 (pTRH64) tenyészetek felülúszóiból származó vad típusú EtxB-t és EtxB (G33D)-t tisztítottunk Amin és Hirst [Amin, T., & Hirst, T. R. (1994) Prot. Express, and Purif. 5. 198-204] módosított módszerét alkalmazva. Összefoglalva, a fehérjéket diaszüréssel és hidrofób interakciós kromatográfiás eljárással tisztítottuk, és anioncserélő kromatográfiával koncentráltuk. A fehérjeoldatokat PD10 oszlopon (Pharmacia, UK) sómentesítettük, foszfátpufferes sóoldattal (PBS; 10 mmol-os nátrium-foszfát, 150 mmol NaCI, pH 7,4) egyensúlyoztuk ki, és -30 °C hőmérsékleten raktároztuk.
Az EtxB- és EtxB (G33D)-tisztaságot SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, az egyedi monomerek molekulatömegét lézerdeszorpciós tömegspektrometriával (Protein Science Facility, University of Kent) igazoltuk.
Az EtxB és EtxB (G33D) látszólagos molekulatömegeket gélszűréses kromatográfiával határoztuk meg, SMART rendszert (Pharmacia) alkalmazva. A fehérjéket egy Superdex 75 PC 3,2/30 oszlopról eluáltuk PBS-ben, pH=7,5 értéken.
A B alegység pentamerek irreverzíbilis denaturálását limfocitaproliferációs vizsgálatokban való alkalmazás céljára (lásd alább) úgy hajtottuk végre, hogy a fehérjéket 95 °C hőmérsékleten 5 percen át melegítettük.
Állatok, mintakollekció és immunizációs előírások
7-12 hetes BALB/c egereket (H-2d; erősen EtxB-reszponder) szereztünk be a Charles River Laboratoriestől, és a Kent Egyetem állatházában tartottunk. Az EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel szembeni antitestválaszokat 30 gg szubkután beadott PBS-es fehérjeinjekció után mértük, amelyet 10 nappal később megerősítettünk. Az egerek egy másik csoportját ugyanazzal a fehérjedózissal kezeltük, 1 hetes időközönként, három alkalommal, nátrium-hidrogén-karbonátban (50 pg/ml) orálisan beadva. A kontrollegerek PBS-t kaptak. Vért 10 nappal a legutolsó szubkután injekció után vagy egy héttel az utolsó orális beadás után vettünk. 1 héttel az utolsó etetés után élő egerekből bélváladékokat különítettünk el egy proteázinhibitor-oldatban, az előzőekben ismertetett módon Elsőn, C. O., Ealding, W. & Lefkowitz, J. [(1984) J. Immunoi. Meth. 67, 101-108] módszere szerint eljárva. A mintákat ezután ultrahanggal kezeltük és centrifugálással tisztítottuk (13,226 g, 10 perc, 4 °C hőmérséklet).
A proliferatív vizsgálatok céljából az egereket intraperitoneálisan 30 pg EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel injektáltuk, komplett Freund-féle adjuváns (CFA) oldatban, és 10 nappal később izoláltuk a mesenterialis nyirokmirigyeket. Kontroll immunizálatlan egereket szintén vizsgáltunk, és hasonló módon eljárva izoláltuk azok nyirokmirigyeit is.
Enzimkötéses immunoszorbens vizsgálatok (ELISA)
Az EtxB vagy EtxB (G33D) GM 1-hez való kötődését egy GM1-ELISA vizsgálattal vizsgáltuk [Amin, T., & Hirst, T. R. (1994) Prot. Express, and Purif. 5, 198-204],
Szérumokat és bélváladékokat vizsgáltunk anti-B alegység IgG és IgA antitestek jelenlétének meghatározására ELISA-módszerrel, melynek során a mintákat 5 pg/ml PBS-es EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel bevont mikrotiterlemezekre vittük fel (Immulon I, Dynateck, USA). Az anti-B alegység IgA antitesteket bélváladék-felülúszókban egy standard görbéből extrapoláltuk, melyet úgy vettünk fel, hogy mindegyik lemezen két lyuksort 1 Mg/ml PBS-es nyúl-antiegér IgA-val vontunk be (a lánc specifikus; Zymed Láb, USA), majd 1 pg/ml egérmielóma IgA-t (MOPC 315, Sigma, USA) adtunk hozzá. Az összes IgA mérése céljából a lyukakat nyúl-antiegér IgA-val vontuk be, majd bélváladék-felülúszókat adtunk hozzá. Valamennyi mintát sorozatban hígítottuk. Kecske-antiegér IgC (Fc-fragmens-specifikus; Jackson láb., USA) vagy kecske-antiegér IgA (láncspecifikus; Sigma) peroxidázkonjugátumot hígítottunk és adtunk minden lyukba. Meghatároztuk az anti-B alegység IgG titert, amely A450 nm>0,2 értéket adott. Az EtxB és EtxB (G33D)-re adott IgA anti-B alegység választ bélváladékokban mint „IgA-specifikus akvitást” számoltuk ki [átlagos IgA anti-B alegység (ug/ml)/összes IgA (pg/ml)].
HU 224 248 Β1
Egy ELISA-módszert használtunk az IL—2, IL—4, IL—5, IL—10 és IFN-γ citokinszintek előzőekben ismertetettek szerinti mérésére [Harper, Η. M., PhD tézis, Univeristy of Bristol (1995)]. Összefoglalva, mikrotiterlemezeket egér-IL-2, -IL-4, -IL—5, -IL-10 és -IFN-γ elleni patkányantitestekkel vontunk be. A lemezeket 2 tömeg/térfogat%-os szarvasmarha-szérumalbuminnal blokkoltuk. Tenyészetközegből származó felülúszókat adtunk a lyukakba és lehígítottuk. Egy sor mindegyik lemezen mindegyik citokinre vonatkozóan standard mennyiségű rekombináns citokint tartalmazott. A lemezeket ezután 0,5 pg/ml biotinezett anticitokin monoklonális antitestekkel inkubáltuk, majd avidin-peroxidázt és 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidin (TMB)-szubsztrátot adtunk hozzá, és A45o ππΊ'ηθ' leolvastuk az értékeket.
Limfocitaproliferációs vizsgálat
Az egereket a nyak kitekerésével elpusztítottuk, aszeptikusán kimetszettük a mesenterialis nyirokmirigyeket, és egy rozsdamentes acélszitán keresztül Hank-féle egyensúlyi sóoldatba (HBSS) (Flow laboratories, Irvine, Renfrewshire, Egyesült Királyság) sajtoltuk azokat. A sejteket centrifugálással (500xg, 10 perc, 4 °C) mostuk HBSS oldatban, és módosított Eagle-közegben (Flow) újraszuszpendáltuk, melyhez a következőket adtuk: 20 mM Hepes (Flow), 100 IU Penicillin, 100 pg/ml Streptomycin, 4 mM L-glutamin (Flow) és 2-merkapto-etanol (komplett közeg). Ezt követően immunizálatlan egerekből származó friss autológ normálegérszérumot adtunk a közeghez 0,5 tf/tf%-os végső koncentráció eléréséig. A tenyészetek ml-enként 2*106 életképes sejtet tartalmaztak vagy 2 ml térfogatban 24 lyukú lemezeken, vagy 8 ml térfogatban 25 cm3-es lombikokban (Nunc A/S, Roskide, Denmark). A tenyészeteket antigének jelenlétében vagy a nélkül létesítettük. A tenyészeteket ezután 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxidot és 95% levegőt tartalmazó párásított atmoszférában 6 napon át inkubáltuk. Meghatározott időpontokban 0,1 ml-es mintákat vettünk a tenyészetekből, 96 lyukú, U fenekű lyukakat tartalmazó lemezekre (Nunc) vittük, és 6 órán át kezeltük 1 pCi/lyuk [3H]-Thd-vel (Amersham, Egyesült Királyság), majd összegyűjtöttük a sejteket (Mach III Harvesting 96 Tomtec, Orange, Conn. USA) és standard folyadékszcintillációs berendezéssel (1450 Micro-β plus, LKB-Wallac, Turku, Finland) számoltuk. Hasonlóképpen, a tenyészetekből 0,5 ml-es felülúszómintákat is vettünk citokinanalízis céljára. A sejteket pelletizáltuk, és a felülúszókat -68 °C hőmérsékleten tároltuk a vizsgálatig.
Tenyésztett sejtek fenotípusanalizise
A tenyésztés 4. napján összegyűjtött tenyésztett sejteket mostunk, és 500 g értéken, 15 percig, 20 °C hőmérsékleten való centrifugálás után az életképes sejteket egy HBSS/18% metrizamid (Nyegaard and Co., Oslon, Norway) gradiens határfelületről kinyertük. A sejteket kétszer mostuk, és 0,2% nátrium-azidot (Sigma) és 10% normálpatkányszérumot tartalmazó HBSS-ben újraszuszpendáltuk. Az alábbi patkányantitesteket (Pharmingen, San Diego, USA) használtuk: fluoreszcein izotiocianát (FITC)-jelzett anti-CD4 (RNRM4-5), FITC-jelzett anti-CD8 (53-6,7), biotinjelzett anti-CD25 (7D4) és fikoeritrin (PE)-jelzett anti-B220 (RA3-6D2). A fentieken kívül biotinjelzett antitestek esetében Streptavidin-PE-t vagy Streptavidin-FITC-t (Seroteck, Egyesült Királyság) használtunk. Az antitesteket azidot tartalmazó HBSS-ben hígítottuk, és előre meghatározott koncentrációkban használtuk. 200 μΙ 2*106 sejtet és minden antitestből 200 μΙ-t összekevertünk, és 30 percen át inkubáltuk jégen. Ha Streptavidin-PE vagy -FITC szekunder antitestekre volt szükség, a sejteket ezekkel az antitestekkel további 30 percen át inkubáltuk. FITC és PE antitestekhez való megfelelő kontrollokat szintén alkalmaztunk. A sejteket HBSS-sel mostuk, majd 2 áramláscitometriával (Becton Dickinson) analizáltuk.
Eredmények
Az EtxB receptorkötő mutánsának előállitása és jellemzése
Gly->Asp szubsztitúciót végeztünk E. coli hőre labilis enterotoxin B alegységében EtxB oligonukleotid irányította mutagenezisével, azon célból, hogy egy receptorfelismerésben hibás mutáns B alegységet hozzunk létre. Az EtxB (G33D)-vel jelzett mutánst fehérjét és vad típusú EtxB-t homogenitásig tisztítottuk (lásd Anyagok és módszerek). A tisztított EtxB és EtxB (G33D) molekulatömegét lézerdeszorpciós tömegspektrometriával határoztuk meg. A tömegek a monomer EtxB-re és EtxB (G33D)-re vonatkozó 11 702 daltonos (Da) és 11 760 Da-os elméleti tömegértékeken belül voltak 20 Da-nal. Előzetes melegítés nélkül SDS-PAGE módszerrel analizálva, mind a vad típusú EtxB, mind az ExtB (G33D) különálló stabil oligomerek formájában migráltak, ezek látszólagos molekulatömege 42 kDa és 56 kDa volt (1A. ábra, 1 vonal és 2 vonal, megfelelőleg). Az EtxB megfigyelt elektroforetikus mozgékonysága és SDS-stabilitása a B alegység pentamer egy jellegzetes tulajdonsága [lásd Sandkvist, M., Hirst, T. R. & Bagdasarian, M. (1987) J. Bacteriol, 169, 4570-4567], Az oligomer EtxB (G33D) alacsonyabb elektroforetikus mozgékonysága nem a B alegységet felépítő monomerek számában rejlő különbség következménye, mivel nagy feloldású gélszűréses kromatográfiával vizsgálva az EtxB pentamer és EtxB (G33D) hasonló retenciós időket mutatott. így, az EtxB (G33D) oligomer elektroforetikus mozgékonyságában a vad típusú EtxB-hez viszonyítottan meglévő ellentmondásosság valószínűleg a bevitt negatív töltésű Asp-maradék következménye, az SDS-kötés redukcióját és ebből következően lassabb migrációt okozva.
Az ExtB-t és ExtB (G33D)-t összehasonlítottuk alacsony pH-jú pufferekben mutatott stabilitásuk szempontjából is, továbbá összehasonlítottuk 1,0 mg/ml tripszin vagy proteináz K szembeni ellenállásukat, valamint egymáshoz viszonyítva összehasonlítottuk anti-B alegység monoklonális és poliklonális antitestek egy paneljéhez mutatott reakcióképességüket. Ezekben a vizsgálatokban az EtxB (G33D) azonos tulajdonságokat mutatott a vad típusú EtxB-vel. Ezért azt a következtetést vontuk le, hogy egy Gly->Asp szubsztitúció
HU 224 248 Β1 az EtxB 33. maradékánál nem változtatja meg az oligomerkonfigurációt, sem az SDS-, pH- vagy proteázstabilitást vagy az antitesttel szembeni reaktivitást vad típusú EtxB-vel összehasonlítva.
Az EtxB (G33D) kötődési képességét GM1-receptorához egy GM1-ELISA vizsgálattal értékeltük (1C. ábra). A vizsgálat erőteljes csökkenést mutatott a mutáns GM 1-hez való kötődési képességében, a vad típusú fehérjével összehasonlítva (>99% csökkenés az A450 nm hullámhosszon leolvasva). Továbbá, ellentétben a vad típusú EtxB-vel, az EtxB (G33D) nem kötődött CHO-sejtekhez immunofluoreszcenciával vizsgálva. Azt a következtetést vontuk le, hogy az EtxB (G33D) GM1-gangliozidhoz való in vitro és in situ kötődési képessége károsodott.
Az EtxB erőteljes immunizálóképessége in vivő receptorkötésétől függ
A receptorhoz való kötődés fontosságát az EtxB immunizálóképességében egérben vizsgáltuk és értékeltük azután, hogy egereknek PBS-oldatban orálisan vagy szubkután injekcióban EtxB-t vagy EtxB (G33D)-t adtunk be. Az EtxB orális beadása után a szérumban magas IgG antitesttitert, bélváladékokban pedig magas IgA antitestaktivitást azonosítottunk (2. ábra). Ezzel ellentétben, EtxB (G33D)-vel történt hasonló mértékű orális immunizálás nem váltott ki semminemű értékelhető antitestaktivitást. Az ExtB (G33D) szubkután beinjektálás után szérumantitest-választ indukált, bár a válasz jelentősen kisebb volt, összehasonlítva azt a vad típusú EtxB-re adott antitestválasszal, nevezetesen az 1050-es és 171 000-es értékeket összehasonlítva >160-szoros csökkenés mutatkozott az átlagos antitesttiter-értékben. A fentiekből az következik, hogy az EtxB receptor kötése alapvető annak in vivő mutatott erőteljes immunizálóképességében.
A receptorkötés nem hat a limfocitaproliferáció kiterjedésére EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében Vizsgáltuk az EtxB vagy EtxB (G33D) hatását a limfocitaproliferációra in vitro. A limfocitákat EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel immunizált és fehérjével vagy egy hővel denaturált EtxB vagy EtxB (G33D) készítménnyel in vitro stimulált egerek poplitealis és mesenterialis nyirokmirigyeiből izoláltuk. A poplitealis vagy mesenterialis nyirokmirigy-eredetű limfociták proliferatív válasza hasonló volt. Mindegyik esetben, mindegyik fehérjekészítményre adott proliferációs válasz a B alegység-koncentrációnövekedésével növekedett. Az 1. táblázat egy mesenterialis nyirokmirigyeket vizsgáló kísérlet reprezentatív adatait tartalmazza. A válasz nagysága vad típusú és mutáns pentamerek esetében összehasonlítható volt, valamint összehasonlítható volt hődenaturált vad típusú és mutáns monomerek esetében is. A 3. ábra proliferatív válaszok kinetikáját mutatja, melyeket a fehérjekészítmények 80-80 pg/ml-jeinek jelenlétében kaptunk. A reakcióképesség az antigén jelenlététől függött, és mindegyik fehérje jelenlétében hasonló pályát mutatott. A reakcióképesség a tenyésztés 3. napján vált nyilvánvalóvá a [3H]-Thd beépülése alapján, majd a 4. napon elért egy csúcsot, és azután csökkent. A válaszcsúcsok időiben a 3. ábrán látható kis különbségek megismételt kísérletekben nem voltak láthatók, mutatva, hogy az EtxB-re és az EtxB (G33D)-re adott válaszok anamnesztikus karakterisztikája összehasonlítható. A fentiek alapján azt a következtetést vontuk le, hogy a stimuláció szintjére a natív fehérjék jelenlétében valószínűleg nem volt hatással a receptorkötés vagy a mutáció.
A toxinreceptor-kötés a B-sejtek és a T-sejt-alcsoportok immunmodulációját okozza
Annak vizsgálatára, hogy az EtxB receptorkötés mutat-e valamilyen in vitro hatást limfoid sejtek populációjára, limfocitákat izoláltunk egerek mesenteliális nyirokmirigyeiből, miután az egereket intraperitoneálisan EtxB (G33D)-vel előinjektáltuk, majd EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel, vagy ezek keverékével stimuláltuk. Végrehajtottunk olyan párhuzamos vizsgálatokat is, ahol olyan egerek mesenteliális nyirokmirigyeiből származó limfocitákat vizsgáltunk, amely egereket EtxB-vel injektáltunk, és lényegében ugyanolyan eredményeket kaptunk, mint az EtxB (G33D)-vel előkezelt egereknél.
(i) Az EtxB a B-sejtek megnövekedett aktivációját okozza
Az EtxB B-sejtekre gyakorolt hatását a CD25 (IL-2Ra) aktivációs markernek a B220 (CD45R) B-sejt markerrel kapcsolatos expressziója alapján vizsgáltuk. Mint azt a 4. ábra mutatja, az EtxB-vel stimulált tenyészetekben a B-sejtek száma az összes sejt 62,9%-a volt, melynek nagy része, 28,4%-a expresszálta a CD25 sejtaktivációs markert. Ezzel ellentétben, a B-sejtek aránya EtxB (G33D) jelenlétében végzett stimuláció után kisebb mint fele volt a vad típusú sejtek arányának (22,26%), és még kevesebb volt aktivált (5,6%). Annak megállapítására, hogy vajon az EtxB által kiváltott hatás domináns-e, a sejteket ekvimoláris koncentrációjú EtxB és EtxB (G33D) jelenlétében inkubáltuk. Az áramláscitometriás adatok hasonlóak voltak, mint amilyeneket vad típusú EtxB-vel való stimuláció után kaptunk (60,6% B-sejt, melynek 26%-a volt aktivált). Azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az EtxB receptorkötő tulajdonsága a B-sejtek megnövekedett aktivációját vezérli in vitro.
(ii) Az EtxB a CD4+ T-sejtek megnövekedett aktivációját és CD8+ T-sejtek teljes kiürülését okozza
A B alegység-receptorkötődés T-sejtekre gyakorolt hatásának vizsgálatára limfocitákat CD25 antitestekhez kötött CD4 vagy CD8 antitestekkel jelöltünk (5. ábra). Emellett néhány sejtet elkülönítetten CD3 marker elleni antitestekkel jelöltünk (az ábrán nem látható). A CD4 markert expresszáló T-sejtek aránya EtxB jelenlétében történő stimulálás után 36,7% volt, melynek nagy része (32,7%) volt aktivált. Ezzel szemben, az EtxB-tartalmú tenyészetben nem volt jelen azonosítható CD8+ T-sejt.
Az EtxB (G33D) jelenlétében stimulált tenyészetben CD4+ és CD8+ T-sejtek egyaránt jelen voltak. Ezek a tenyészetek nagy arányban tartalmaztak CD4+ T-sejtet (66,6%), de ezeknek csak 12%-a volt aktivált. Az EtxB (G33D) jelenlétében detektált CD8+ T-sejtek aránya az összes sejtszám 11,7%-a volt, de ebből csak
HU 224 248 Β1 nagyon kevés volt aktivált, amelyet a CD25 marker hiánya jelzett. Azonfelül, EtxB és EtxB (G33D) ekvimoláris koncentrációját tartalmazó keverék jelenlétében a választ adó sejtek képe hasonló volt a csak vad típusú EtxB jelenlétében választ adó sejtek képéhez, amelyben 41,68% CD4+ T-sejt (amelyből 28,6% volt CD25+) volt, és nem volt detektálható CD8+ T-sejt (5. ábra). Mindezekben az analízisekben a CD3-mal festődő sejtek mennyisége közelítőleg egyenlő volt a CD4 és CD8 markereket expresszáló sejtek összegével. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a B- és CD4+ T-sejtek aktivációjának növekedését és a CD8+ T-sejtek szelektív eltűnését toxinreceptorhely elfoglalása vezérli.
Citokinek termelődése
Annak vizsgálatára, hogy vajon az EtxB-nek a limfocitapopulációkra gyakorolt hatása függhet-e a citokintermelődés változásától, sejttenyészeteket inkubáltunk EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel, és analízis céljára felülúszókat szedtünk a 2., 3., 4., 5. és 6. napon. A 2. táblázatban az 5. napon összegyűjtött, maximum-citokinkoncentrációkat mutató mintákból kapott eredmények láthatók. IFN-γ-ΐ és IL-2-t egyaránt azonosítottunk az olyan tenyészetekből származó felülúszókban, amelyeket EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében stimuláltunk, bár ezeknek a citokineknek a relatív szintjei változtak. A vad típusú EtxB-vel inkubált, háromszor nagyobb koncentrációjú IL-2-t és 1,5-szer kevesebb IFN-γ-ί tartalmazó sejtekből származó közeget összehasonlítottuk az EtxB (G33D) jelenlétében stimulált tenyészetekből származó felülúszókkal. Annak a tapasztalásnak ellenére, hogy egyéb proliferáló T-sejt-tenyészetek egyéb antigénekre adott válaszul nagy mennyiségben termeltek IL—4-et, IL-5-öt és IL-1O-et, ezen citokinek egyike sem volt kimutatható az EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel stimulált tenyészetekben. Az IL-2-szint növekedése és az IFN-y-szint csökkenése az EtxB-vel történő stimuláció után, összehasonlítva az értékeket az EtxB (G33D) stimulációs értékekkel, legvalószínűbben a B- és CD4+ T-sejtek aktivációs állapotát tükrözi. Mindazonáltal az eredmények azt jelzik, hogy a vad típusú EtxB-nek CD8+ T-sejt-populációra gyakorolt erős hatását nem valószínű, hogy a receptorhely elfoglalásából következő citokinprofil jelentős megváltozása (major shift) vezérli.
Az eredmények értékelése
Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy egy egypontos mutáció (G33D) bevitele az EtxB receptorkötő helyére jelentősen lerontotta a GM 1-hez való kötési képességet. Fontos, hogy gélkromatográfiai mérések alapján konformáció tekintetében, valamint SDS-ben, savban és proteázokkal szemben mutatott stabilitás tekintetében a mutáns EtxB (G33D) azonos fizikai-kémiai tulajdonságokat mutatott, mint a vad típusú EtxB. Amikor az EtxB-vel vagy az EtxB (G33D)-vel történő immunizáció után mértük a specifikus antitestválaszokat, drámai különbségeket figyeltünk meg. Egereknek szubkután injekcióban beadott EtxB (G33D) nagymértékben szignifikáns (mintegy >160-szoros) esést eredményezett az antitesttiterben a vad típusú EtxB-vel való immunizáció után kapott értékekkel összehasonlítva, miközben orális beadás után semmiféle antitestválaszt nem érzékeltünk. Lehetséges, hogy ezek a különbségek egy olyan domináns epitop szétszakadásából erednek, amely vagy abban játszik szerepet, hogy az anitest felismerje a molekulát, vagy az anitestképzést elősegítő hatásos T-sejtek stimulációjában. Azonban figyelemre méltó, hogy a Gly->Asp szubsztitúciónak nincs hatása arra, hogy specifikus poliklonális és monoklonális antitestek egy panelje felismerje a B alegységet. Továbbá a proliferatív válaszok, melyeket akkor kaptunk, amikor EtxB-t vagy EtxB (G33D)-t adtunk a tenyészetekhez, összehasonlíthatók voltak, tekintet nélkül arra, hogy melyik fehérjét alkalmaztuk az in vivő előérzékenyítéshez; ez azt jelzi, hogy a T-sejt-reaktivitás nem specifikus egyik molekulához sem. Mindezekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az EtxB általi receptorkötés alapvető erőteljes in vivő immunizálóhatása szempontjából.
A receptorkötés fontossága az EtxB erőteljes immunizálóhatásában számos módon magyarázható. Elsősorban, az Etx és Ctx B alegység GM1-hez való kötődése növelheti ezen fehérjék felvételének a hatékonyságát, úgy megnövelve a helyi fehérjekoncentrációt, hogy az immunrendszer számára rendelkezésre álljon. Egyéb, nyálkahártya-felületekhez kötődni képes fehérjecsoportokat hatékony immunogéneknek találtak [De Aizpura, H. J. & Russell-Jones, G. J. (1988) J. Exp. Med. 167, 440-451], Az orális beadás után megfigyelt különbségek az EtxB és mutánsa immunizálóhatásában a bélüregből való hatékony EtxB-felvételnek köszönhető. Azonban a parenterális immunizáció után (ahol az antigén helyileg nagy koncentrációban kerül a szervezetbe) megfigyelt drámai különbségek más hatások miatt figyelemre méltók. Például az EtxB-nek GM 1-hez való kötődése hatással lehet az antigént létrehozó sejtaktivitás hatékonyságára. Az ilyen kötődés ll-csoport hordozó sejtek aktivációját okozhatja, különös tekintettel az esszenciális kostimulátor molekulák például B7 - által történő expressziójukra, aminek kapcsán antigénprezentáló aktivitásuk megnövekszik [Jenkins, Μ. K. & Johnson, J. G. (1993) Curr. Opin. Immunoi. 5, 361-367]. A receptorkötés közvetlen hatással is lehet limfociták alcsoportjaira. Ebből az irodalomból számos megfigyelés bizonyítja, hogy valójában ez az eset áll fenn.
Az in vitro vizsgálatok azt bizonyították, hogy az EtxB képes előkezelt nyirokmirigysejtek proliferációjának indukálására. Ez a tulajdonság nem receptorkötés-függő, mivel hasonló anamnesztikus jellemvonásokat kaptunk vad típusú EtxB, EtxB (G33D), vagy ezeknek a fehérjéknek a GM 1-kötésre nem képes hődenaturált monomer formái alkalmazásával is. Ezek a megfigyelések önmagukban is érdekesek, mivel az irodalomból általánosan ismert, hogy Ctx és CtxB kereskedelmi készítmények, vagy a tisztított rekombináns CtxB in vitro erőteljesen gátolják a limfocitaproliferációt. Ez a látszólagos ellentmondás abból a tényből eredhet, hogy az előző kísérleteket tisztított limfocitákkal hajtották végre, és széles körben használtak mitogénstimulált limfocitatenyészeteket (amelyek nem klonálisan
HU 224 248 Β1 korlátozott válaszokat adnak), ahol más mechanizmus játszódhat le. Ez összhangban van saját megfigyeléseinkkel, nevezetesen hogy Con A-stimulált limfociták proliferációját valóban gátolta az EtxB. Azonban, EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel előkezelt nyirokmirigysejtek tenyészeteiben lévő sejtpopulációk analízisei a B-sejtekre, valamint CD4- és CD8-viselő T-sejtekre vonatkozóan fontos különbözőségeket tártak fel.
B-sejteket detektáltunk 4 napos tenyésztés után EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében. Azonban az EtxB (G33D)-vel összehasonlítva, az EtxB-s tenyészetekben jelen lévő B-sejtek aránya körülbelül 100%-kal növekedett. Ez a növekedés a B-sejtek igen nagy arányában CD25-expresszióval kapcsolatos. A kísérletben az látszik, hogy a válaszoló limfociták EtxB (G33D)-vel voltak előkezelve in vivő. EtxB-vel immunizált egerekből származó sejtekkel végzett hasonló kísérletek összehasonlítható eredményeket adtak. így, tekintet nélkül bármilyen in vivő hatásra, amely receptorkötéssel kapcsolatos, a tenyészetek EtxB jelenlétében nagyobb arányban tartalmaztak B-sejtet, mint az EtxB (G33D)-stimulált tenyészetek. Ezek a B-sejtekre gyakorolt hatások in vitro részben szintén függetlennek látszanak a T-sejtek irányította szabályozástól, mert az eredmények nem mutatnak lényeges eltérést (major shift) a detektált citokinek profiljában. Ezért, in vitro az EtxB általi receptorkötések kapcsolatban látszanak lenni egy, a B-sejtekre gyakorolt közvetlen hatással, nagymértékű populációkiterjedést és aktivitásnövekedést eredményezve. Azt is megjegyezzük, hogy a CtxB megnöveli MHC II osztályú sejtek expresszióját szűz B-sejteken, és ez egy olyan tulajdonság, amit a GM1-kötő CtxB (G33E) mutáns nem mutatott [Francis, M. L., Ryan, J., Jobling, M. G., Holmes R. K., Moss, J., & Mond J. J. (1992) J. Immunoi, 148, 1999-2005], Ezeknek a kísérleteknek az eredményei azt feltételezik, hogy az EtxB-nek van egy közvetlen mitogénhatása antigénnel előkezelt B-sejtekre, és bizonyítják, hogy ezeket a hatásokat receptorkötés közvetíti.
Az EtxB-nek a tenyésztett B-sejtekre gyakorolt hatásai mellett, áramláscitometriás analízisek bizonyítják, hogy ez a toxoid minden kimutatható CD8+ sejttenyészetből való teljes kiürülését okozta. Erről a hatásról kimutatták, hogy receptorkötés-függő, mivel a T-sejteknek ez a populációja nem ürült ki EtxB (G33D)-tartalmú tenyészetekből. Továbbá, vad típusú EtxB-vel immunizált egerekből származó CD8+ sejtek teljes kiürülése volt megfigyelhető EtxB-tartalmú tenyészetekből. Három lehetséges mechanizmus képzelhető el, amely egy ilyen hatást közvetíthet. 1. Ismeretes, hogy a Ctx vagy CtxB GM1-hez való kötődése patkány mesenterialis nyirokmirigysejteken pecs (patch) és cap képződést indukál [Craig S. W. és Cuatrecasas P., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, 3844-3848]. Lehetséges, hogy ezekben a folyamatokban EtxB-GM1 komplexek és egyéb molekulák, beleértve a CD8-at, vannak jelen. Egy ilyen folyamat meghiúsítaná ezeknek a sejteknek az áramláscitometriás meghatározását markerként CD8-at használva, és halálukat okozhatná a felületi TCR-komplex-veszteség következtében. Habár az utóbbi magyarázatot adhat a CD8+ T-sejtek hiányára a tenyészetben, mások nem találtak TCR-komplex-csökkenést humán Jarkat T-sejtvonal felületén CtxB használata esetén [Imboden, J. B., Shoback, D. M., Pattison, G. & Stobo, J. D. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5673-5677]. A hatások elmaradása capping következményeként azzal az észleléssel van alátámasztva, hogy CD3 és CD4 markerek nem voltak érintettek. 2. Egy másik mechanizmus a citokinek tenyészetre gyakorolt hatásait foglalja magában. Ebben a vizsgálatban IL-2-t és IFN-y-t egyaránt detektáltak. Az eredmények azonban nem utalnak lényeges változásra a citokinprofilban, ami magyarázna egy ilyen drámai hatást a CD8+ T-sejtekre. 3. A CD8+ T-sejtek hiánya apoptózis aktív indukciójának következménye lehet. Az apoptózis által bekövetkező limfocitahalál cappinget feltételezne, amint azt az előzőekben már említettük, vagy capping hiánya esetén a sejtben lévő szignálozó események hatásai irányítanák. Aktivációindukált programozott sejthalál Ca2+-ion-függő, és foszfatázokat és kinázokat feltételez. A CtxB iimfocitákhoz való kötődéséről kimutatták, hogy gátolja a protein-kináz C függő proliferációt, és az intracelluláris Ca2+-ion hangsúlyozott megnövekedését indukálja, mely események nem kapcsolatosak CAMP-szint-növekedéssel. Az EtxB CD8+-kiürítő képessége, és hatástalansága CD4+ T-sejt-tenyészetből való kiürítésére azoknak a szignáloknak a megkülönböztető hatásaiból következhetne, amelyek ezeknek a limfocita-alcsoportoknak a felületén a GM1 által létrehozott keresztkötés eredményeképpen létrejött CD4/CD8-TCR komplexszel kapcsolatosak. Ez lehet a toxoid membránon létrejövő megkülönböztető kötésének eredménye, amint azt a CtxB esetében kimutattuk, vagy lehet a CD4+ és CD8+ T-sejtekben lévő diferenciális szignálozási mechanizmusok következménye.
Kimutatható CD8+ T-sejtek teljes hiánya esetén az EtxB megnövelte az aktivált CD4+ T-sejtek arányát, összehasonlítva a receptorkötő mutánssal kapott eredményekkel. A CD4+ T-sejtek Ctx-re adott válaszának alapvető előfeltételét in vivő demonstráltuk. Ezen T-sejt-alcsoport megnövekedett aktivációjára azonban még nincs magyarázat. Figyelemre méltó, hogy a CtxB kimutathatóan stimulálja a DNS-szintézist és a sejtosztódást néma nem transzformált egér-3T3-sejtek esetében. Találtak egy szelektív mitogénhatást is CD4+ T-sejtekre növényi lektinek jelenlétében, amelyek Gaip-1-3-3Ga1NAc-hez kötődnek, amely ugyanaz a komponens, amihez az EtxB kötődik a GM 1-ben. Nem zárható ki annak az eshetősége, hogy az EtxB közvetít egy GM 1-kötés-függő közvetlen hatást CD4+ T-sejtekre, ezzel aktivációjukat okozva. Azonban az is lehetséges, hogy a CD4+ T-sejtek megnövekedett aktivációja EtxB-t tartalmazó tenyészetekben azoknak a Β-sejt- és CD8+ T-sejt-populációkra gyakorolt változásoknak a következménye, amelyeket már ismertettünk. A B-sejt-aktivációról ismert, hogy kapcsolatban van megnövekedett kompetenciájával a CD4+ T-sejt elleni antigéntermelésben. Továbbá, a CD8+ T-sejtek széles körű regulátorszerepet mutatnak az immunreaktivitásban, in vivő és in vitro egyaránt. T-sejt-proliferatív te10
HU 224 248 Β1 nyészetekből való eltávolításuk ismételt és megnövekedett szintű CD4+ T-sejt-osztódással kapcsolatos.
Mindent összevetve az in vivő mutatott eredmények alapján az EtxB erős immunizálóképessége azon képességéből eredhet, hogy képes megnövelni a B-sejt-aktivációt, GM 1-hez való kötődést követően megnövekedett szabályozóhatások által. A CD4+ T-sejtek aktivációja és az EtxB képessége az IL-2-képződés megnövelésére in vitro tenyészetben, szolgáltathatja a szükséges szignált B-sejt-klónok további expanziójához. A CD8+ T-sejtek EtxB okozta kiürülése in vitro tenyészetből, amit ebben a vizsgálatban tapasztaltunk, a szisztemikus vagy orális beadás utáni in vivő immunizálóképesség más mechanizmusához szolgáltathat alapot, főként annak a ténynek a fényében, hogy ezek a sejtalcsoportok szerepet játszanak az immunválasz szuppressziójában és orális toleranciában. Ebben a tekintetben mind a Ctx-ről, mind az Etx-ről kimutatták, hogy megszünteti az orális toleranciát az együttesen beadott oldható fehérjékkel szemben, más vizsgálatokban pedig a Ctx-nek és CtxB-nek a bélben vagy a Peyer-plakk boltozatában lévő intraepithelialis limfocitákra gyakorolt kiürítő hatásait alkalmazták ennek a mechanizmusnak a magyarázatára. Azt is kimutatták, hogy a CtxB-nek CD8+ T-sejtekre gyakorolt gátlóhatásai in vitro kiküszöbölik a graft-versus-host reakciót.
Összefoglalva, kimutattuk az EtxB által az antitestválaszra gyakorolt erőteljes immunmodulációs hatások jelenlétét in vivő, és az EtxB limfocitapopulációkra gyakorolt hatását in vitro. Továbbá, kimutattuk, hogy ezeket a hatásokat receptorkötés vezérli. Eredményeink segítenek megérteni az Etx és Ctx azon képességét, hogy képesek erőteljes adjuvánsként, és más antigének számára potenciális fehérjehordozóként hatni. Eredményeink alapján az feltételezhető, hogy ezeknek a tulajdonságoknak tudható be ezen toxoidok gangliozidreceptor-kötő képessége limfoid sejtek felületén.
2. példa
Ez a példa azt illusztrálja, hogy a CD8 sejtekre gyakorolt hatások függetlenek az antigénfelismeréstől, és apoptózis vezérli azokat.
Az 1. példa szerint eljárva EtxB és EtxB (G33D) rekombináns készítményeket állítottunk elő. Mindkét fehérje jól jellemzett volt GM 1-hez való kötődés, monoklonális és poliklonális antitestek egy paneljához való kötődés és különféle egyéb fizikai-kémiai tulajdonságok tekintetében. Az ovalbumin (ÓVA) beszerzési forrása: Sigma (Poole, Egyesült Királyság). Mesenterialis nyirokmirigyeket (MLN) BALB/c izoláltunk egerekből [EtxB-re erősen reszponder törzs (Nashar, T. O. és Hirst, T. R. 1995)]. H-2 és intra-H-2 allélek antitestre gyakorolt immunregulációs szerepe megfelel Escherichia coli hőre érzékeny enterotoxin (rEtxB) és koleratoxin (rCtxB) rekombináns készítményeknek (Vaccine 13:803). 8-10 hetes egereket injektáltunk intraperitoneálisan 200 pg, inkomplett Freund-féle adjuvánsban (Sigma) emulgeált OVA-val (Sigma). 10 nappal az injektálás után eltávolítottuk a mesenterialis nyirokmirigyeket (MLN), rozsdamentes acélszitán át HBSS-be (Flow, Irvine, Egyesült Királyság) préseltük. A kinyert sejteket centrifugálással (500 g, 10 perc, 4 °C) mostuk HBSS-ben, és 20 mmol HEPES-t, 100 IU penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint, 4 mmol L-glutamint és 5*10-5 mól 2-merkapto-etanolt tartalmazó módosított Eagle-közegben (Flow) újraszuszpendáltuk, és a szuszpenzióhoz 0,5 tf/tf% friss autológ egérszérumot adtunk. 2*106 életképes sejt/ml tartalmú tenyészeteket 2 ml térfogatokban 24 lyukú lemezekre (Nunc, Roskide, Denmark) vittünk, és 100 pg/ml, komplett közegben erőteljesen dializált ÓVA jelenlétében önmagában, vagy 40 pg/ml EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel létrehoztuk a vizsgálni kívánt tenyészeteket. A tenyészeteket ezután 37 °C-on, 5% szén-dioxid- és 95% levegőatmoszférában 5 napon át inkubáltuk. Kívánt időpontokban 0,1 ml-es mintákat vettünk a tenyészetekből, és azokat 96 U fenekű lyukat tartalmazó lemezekre (Nunc) vittük, és 6 órán át 1 pCi/lyuk [3H]timidinnel (Amersham, Egyesült Királyság) kezeltük, majd összegyűjtöttük a sejteket (Mach III harvesting 96; Tomtec, Orange, CT), és standard folyadékszcintillációs berendezéssel (1450 Micro b plus; LKB-Wallac, Turku, Finnország) számoltuk. A T-sejtek áramláscitometriás analízise céljára (Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgium) a sejteket a következő patkányantitestekkel festettük (PharMingen, Cambridge, Egyesült Királyság): FITC-jelzett anti-CD4 (RNRM4-5) vagy FITC-anti-CD8a (53-6,7) és biotinjelzett anti-CD25 (IL-2Ra) (7D4), majd Streptavidin-fikoeritrin. Emellett, a biotinjelzett antitestekhez FITC-jelzett Streptavidint használtunk. A proliferációs csúcs napján, amelyet a [3H]-timidinbeépülés alapján határoztunk meg (4. nap), elvégeztük a kinyert sejtek FACS-analízisét.
Apoptózisvizsgálatok céljára friss mesenterialis nyirokmirigysejteket (MLNC) és lép-T-sejteket (SPLTC) izoláltunk 8-10 hetes BALB/c egerekből. >90% CD3+ T-sejtet tartalmazó MLNC-t (a sejteket áramláscitometriás analízissel határoztuk meg) inkubáltunk 2 órán át Petri-csészékben (Costar, Cambridge, MA) 10% FCS-t tartalmazó komplett közegben, 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxid- és 95% levegőatmoszférában, hogy eltávolíthassuk az adherens sejteket. A nem adherens frakciót ezután pipettával eltávolítottuk, centrifugáltuk, a felhasználás előtt kétszer mostuk HBSS-ben. Az SPLCT-t negatív szelekcióval tisztítottuk, normálegérszérummal, majd nyúi-antiegér γ-globulinokkal bevont üveggyöngyöket alkalmazva, a következő irodalomban ismertetettek szerint eljárva: Wigzell, H. 1976. Specific affinity fractionation of lymphocytes using glass or plastic bead columns. Scand. J. Immunoi. 5: (suppl. 5) 23. A T-sejtek szelektált populációja áramláscitometriás analízissel >90% CD3+ sejtnek bizonyult.
CD4+ és CD8+ T-sejteket különítettünk el, az alábbiak szerint eljárva: nem adherens MLNC-t jelöltünk patkány fikoeritrin antiegér CD4-gyel (4708-02) vagy FITC-antiegér CD8a-val (53-6,7) (PharMingen), majd a gyártó instrukciói szerint kecske-antipatkány IgG (H+L) F(ab’)2-vel (PharMingen) konjugált MACS-kolloid szuperparamágneses mikrogyöngyökkel inkubáltuk. Ezt követően az anyagot mini-MACS-oszlopokra vittük (Mil11
HU 224 248 Β1 tenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország), abból a célból, hogy elkülönítsük a CD4 és CD8+ T-sejtek áramláscitometriás analízissel meghatározott pozitívan szelektált (>99% tisztaság) és negatívan szelektált (>90% tisztaság) populációit.
Két módszert használtunk az apoptózis mennyiségi meghatározására: i) DNS-festés akridinnaranccsal a sejtmag morfológiai vizsgálata céljából, és ii) DNS-festés követően sejtciklus-analízis propidium-jodiddal és/vagy anti-CD4 vagy anti-CD8 antitestekkel. 2*106/ml MLNC-, SPLTC- és frakcionált MLNC-tenyészeteket hoztunk létre 10% FCS-t tartalmazó komplett közegben, 80 pg/ml EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében vagy anélkül, és 4-18 órán át vizsgáltuk. Inkubálást követően a sejteket centrifugáltuk, HBSS-sel mostuk és 5 gg/ml akridinnaranccsal (Sigma) festettük.
Timocitákat izoláltunk és kezeltünk 10-7 mól dexametazon jelenlétében vagy anélkül, ezt használtuk pozitív kontrollként az apoptózison átesett sejtekhez. A limfociták sejtmag-morfológiai változásait közönséges vagy konfokális fluoreszcens mikroszkóppal (Leica TCS 4D) vizsgáltuk. A sejtciklus szub-Go/G·, stádiumában a CD4+ és CD8+ SPLCT arányát a DNS-tartalom áramláscitometriás analízisével határoztuk meg propidium-jodidos festés után, O’Connor és társai munkájában ismertetettek szerint eljárva (O’Connor P. M., Jackman, J„ Jondle, D., Bhatia, K., Magrath, I. és Kohn, K. W. 1993. Role of p53 tumor supressor gene in cell cycle árrést and radiosensitivity of Burkitt’s lymphoma cell lines, Cancer. Rés. 53: 4776). Az önmagában, vagy 40 pg/ml EtxB-vel vagy EtxB (G33D)-vel inkubált SPLTC-tenyészetekből 18 óra elteltével izolált sejteket FITC patkány-anti-CD4-gyel vagy FITC-anti-CD8a-val festettük. A megfestett sejteket 1 *106/ml koncentrációra állítottuk be 20 mmol HEPES-t és 0,5 mmol EDTA-t tartalmazó hideg HBSS-ben, és cseppenként hozzáadott hideg etanollal fixáltuk. Ezt követően 50 μg/ml propidium-jodidot és 40 pg/ml ribonukleáz A-t (DNáz-mentes) adtunk a sejtekhez, és a sejteket 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A propidium-jodiddal megfestett CD4 és CD8+ T-sejtekben a DNS relatív intenzitását az egyes antitestekkel együtt megfestett sejtek kiszűrésével határoztuk meg.
Az 1. példában az a megfigyelés, hogy a CD8+ T-sejtek teljesen kiürültek az EtxB-re adott válaszban proliferált nyirokmirigysejtek tenyészeteiből, azt sugalmazta, hogy az EtxB egy poliklonális hatást gyakorol erre a T-sejt-alcsoportra. Annak vizsgálatára, hogy ezek a hatások függenek-e az EtxB reszponzív sejtek aktivációjától, tenyészeteket készítettünk OVA-val előkezelt egerekből, és csak OVA-val, vagy OVA+EtxB-vel vagy OVA+ mutáns EtxB (G33D)-vel stimuláltuk. Hasonló proliferációs csúcsszinteket (minden esetben a tenyésztés 4. napja) értünk el csak ÓVA, vagy OVA+EtxB vagy OVA+EtxB (G33D) jelenlétében (9734±347, 12,031±135 és 9305+290 cpm, megfelelőleg). Azonban, a tenyészetekben drámai különbség volt megfigyelhető a T-sejt-alcsoportok megoszlásában 4 nap után (6. ábra). Valamennyi tenyészet tartalmazott CD4+ T-sejteket, amelyekből hasonló arányokban koexpresszálódott a CD25 aktivációs marker. Azonban, a CD8+ T-sejtek kimutathatatlanok voltak az OVA+EtxB jelenlétében inkubált tenyészetekben, de nyilvánvalóan jelen voltak (bár nem aktiválódtak, amint a CD25-expresszió alapján látható volt) az OVA+ EtxB (G33D)-t vagy csak OVA-t tartalmazó tenyészetekben. Ez megalapozza azt a feltevést, hogy az EtxB a CD8+ T-sejtek tenyészetből való kiürülését okozza EtxB-től eltérő antigénekre adott válaszul. Továbbá az EtxB (G33D)-re adott válasz hiánya jelzi, hogy kiürülés inditódott be toxoidreceptor-interakciót követően. Megfigyeltük továbbá, hogy vad típusú EtxB jelenléte szignifikáns növekedést okozott a B-sejtek arányában, amelyek közül nagyszámban volt jelen CD25+ (ábrán nincs mutatva), mint ahogyan azt előzőleg az EtxB reszponzív tenyészeteknél láthattuk (1. példa). Mindezekből az következik, hogy az EtxB receptorhely-foglalása rejtett immunmodulátor-hatást gyakorol limfocitákra tekintet nélkül azok antigénspecifitására.
Vizsgáltuk annak lehetőségét, hogy CD8+ T-sejtek EtxB jelenlétében végzett tenyésztés során apoptózison esnek át. Előkezeletlen egerekből származó MLNC-t vagy tisztított SPLTC-t inkubáltunk EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében, és akridinnaranccsal való festés után 4-18 órás periódusban regisztráltuk a változásokat a sejtmag-morfológiában (3. táblázat és
7. ábra). A sejtmorfológiai változásokat a lobuláris (karéjos) megjelenését eredményező kromatinkondenzáció jelenlétével jellemeztük (7. ábra). Egyéb sejtjellemvonásokat is megfigyeltünk, mint a plazmamembrán felhólyagosodása és apoptotikus testek jelenléte. Ezek a morfológiai változások az EtxB-vel kezelt sejtpreparátumok közelítőleg 1/3-ában fordultak elő, míg jóval kevesebb előfordulás volt megfigyelhető EtxB (G33D) jelenlétében vagy exogén antigén nélkül tenyésztett sejtekben (3. táblázat). Mivel CD8+ T-sejtek képezték az MLNC- és SPLTC-preparátumok körülbelül 35-40%-át, ezeknek a sejteknek a kiürülése lehet felelős a megfigyelt apoptózisért. Az eset bizonyítására tisztított CD8 és CD4+ T-sejt-populációkat tenyésztettünk 18 órán keresztül antigének jelenlétében (3. táblázat). Százalékosan hasonló morfológiai változások indukálódtak CD4+ T-sejtek negatívan szelektált populációjában (amely több mint 90% CD4-viselő sejtet tartalmazott) EtxB-vel, EtxB (G33D)-vel történt kezelés vagy antigén nélküli kezelés után, jelezve, hogy az EtxB-nek ez a kötődése a receptorához nem okoz apoptózist ezekben a T-sejt-alcsoportokban. Ezzel ellentétben, negatívan szelektált CD8+ T-sejtek (>90% tisztaságú) több mint 70%-a mutatott morfológiai változásokat vad típusú EtxB-vel való tenyésztéskor; míg antigén nélkül, vagy EtxB (G33D) jelenlétében történő inkubáció csak 11-19%-os változást indukált ebben a T-sejt-populációban. Továbbá, kisszámú szennyező sejt jelenléte a használt tisztított sejtpopulációkban (körülbelül 10% minden esetben) nem igazolhatja a megfigyelt hatásokat, mivel nagy tisztaságú, >99% CD8 vagy CD4+ T-sejtet tartalmazó (pozitív szelekcióval izolált) populációk válaszoltak EtxB-re hasonló módon [60% volt apoptotikus EtxB jelenlétében, összehasonlítva az anti12
HU 224 248 Β1 gén nélküli és az EtxB (G33D)-vel történő kezeléskor kapott 7%-kal] (3. táblázat). A megfigyelések szerint apoptózis történt timociták 40%-ában és 98%-ában, óráig tartó, dexametazon jelenlétében vagy anélkül történt inkubációja után.
Annak bizonyítására, hogy a tenyészeteinkben megfigyelt morfológiai változások összhangban voltak az apoptózisindukcióval, értékeltük szubdiploid DNS megjelenését 18 órán át EtxB-vel kezelt SPLTC tenyészetekben. A sejteket áramláscitometriás analízisnek 10 vetettük alá, miután propidium-jodiddal és/vagy anti-CD8 vagy anti-CD4 antitestekkel együtt megfestettük azokat (8. ábra). Az EtxB-vel inkubált tenyészetekből származó CD8+ T-sejtek közel 48%-a esett a propidium-jodid-festés diploid Gq/G·, csúcsa alá, jelezve, 15 hogy apoptózis történt (O’Connor, P. M. és munkatársai, lásd fenn). Az EtxB jelenlétében létrehozott tenyészetekben a CD4-et expresszáló sejtek kis része szintén mutatott DNS szub-G0/G-| szinteket (körülbelül 11%; amely CD8+ T-sejtek ilyen nagy arányú elpusztu- 20 lásának eredménye lehet). Ezzel ellentétben, az antigén nélkül vagy CD4 vagy CD8+ T-sejtek többség tenyésztése antigén nélkül vagy EtxB (G33D) jelenlétében tenyésztett sejtek többsége <5% apoptózis mellett a sejtciklus Gq/G, fázisában volt. Azt a következtetést vontuk le, hogy a megfigyelt sejtmag-morfológiai változások és a DNS szub-G0/G·, szintek jelenléte az EtxB-vel kezelt CD8+ T-sejtek lényeges százalékában bizonyítja a koleraszerű enterotoxoid által előidézett szelektív apoptózist. Az a tény, hogy a receptorkötő 30 mutáns, az EtxB (G33D) képtelen hasonló hatásokat előidézni, azt bizonyítja, hogy a CD8+ T-sejt apoptózis indukciója az EtxB (G33D) GM1-gangliozid-kötő képességével kapcsolatos.
3. példa
A vizsgálatban 8 db hím DBA/1 egeret tartalmazó csoportokat használtunk. Egy csoportot kezelés nélkül hagytunk (A csoport), a többit a 0. napon 100 pg, CFAban készült szarvasmarha kollagénnel injektáltuk, az 40 oldalukba adott intradermális injekcióval. A kollagénnel injektált egerek egy csoportját védelem nélkül hagytuk (B csoport; pozitív kontroll), vagy a betegség kifejlődésének megelőzésére az előző injekció beadási helyével szomszédos helyre a következő injekciókat adtuk be intradermálisan: a 0. napon 100 pg EtxB IFA-ban (C csoport), a 14. napon 100 pg EtxB IFA-ban (D csoport) vagy a 0. napon 100 pg EtxB (G33D) IFA-ban (E csoport). Valamennyi állatnak, kivéve az A csoport állatait, 5 a 21. napon IFA-ban készült kollagén megemelt dózisát adtuk be intradermálisan, és a betegség súlyosságának megbecsülésére a 45. napon megmértük a jobb hátsó boka vastagságát (A kísérlet), vagy osztályoztuk minden hátsó lábujj duzzanatát (0-3 skála, ahol 0=normál és 3=maximális duzzadás; B kísérlet).
A kapott eredményeket a 9a. és 9b. ábrák szemléltetik. Az ábrák azt mutatják, hogy az EtxB (G33D)-vel ellentétben az EtxB szignifikánsan megvédi az egyedeket a kollagén indukálta arthritis kifejlődésétől.
4a. példa
Két elkülönített humán felülúszómintát (melyeket normál emberi vérdonoroktól nyertünk) használtunk mononukleáris sejtforrásként. A sejteket Ficoll-pakkon (Ficoll-paque) izoláltuk, és erőteljesen mostuk az antigén nélkül, vagy 80 pg/ml EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében végrehajtott tenyésztés előtt. A tenyésztést megelőzően a sejtpopuláció minden mintában a következőket tartalmazta, megfelelőleg: 24% CD8+, 27% 25 CD4+ és 27% CD8+, 22,9% CD4+. Tenyésztés után 18 órával apoptotikus sejtek megjelenését figyeltük meg az akridinnaranccsal megfestett mintákban (részletesen lásd a 2. példában). Az eredmények a 10. ábrán láthatók; ezek azt illusztrálják, hogy az EtxB (G33D)-vel összehasonlítva az EtxB apoptózist indukál egy normál humán perifériás vérből nyert mononukleáris sejtpopulációban.
4b. példa
CTLL-2-t (patkány T-sejtvonal) tenyésztettünk összefolyásig, majd a sejteket mostuk, mielőtt 1*106 sejt/ml koncentrációban újraoltottuk volna antigén nélkül, vagy 80 pg/ml EtxB, vagy 80 pg/ml EtxB (G33D) jelenlétében. 18 órával ezután mintákat vettünk, és akridinnarancs segítségével megbecsültük az apoptózis jeleit mutató sejtek %-os mennyiségét (részletesen lásd a 2. példában). A kapott eredményeket a 11. ábra szemlélteti. Az eredményekből látható, hogy a GM1-keresztkötés apoptózishoz vezet pat45 kány-CTLL-sejtek egy részénél.
1. táblázat
Limfocitaproliferáció EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében
Dózis (pg/ml) EtxB EtxB (G33D) EtxB* EtxB (G33D)*
0 117,9 146,8 124,5 116,1
(7,9) (3,5) (14,6) (6,35)
5 4928 2860 2424 1431,5
(98,7) (3,8) (88,3) (37,5)
10 6978 3681 2518 4231
(30,6) (4,6) (21,6) (96,4)
20 7084 6912 4396 5075
(100) (47,3) (42,1) (24,8)
HU 224 248 Β1
1. táblázat (folytatás)
Dózis (pg/ml) EtxB EtxB (G33D) EtxB* EtxB (G33D)*
40 8844 8586 7431 4368,5
(26) (143,7) (45,3) (118,9)
80 10 246 12 510 7986 7276
(30,7) (121,8) (210,3) (369,5)
160 11 311 13 525 - -
(247) (352,7)
Egereket injektáltunk intraperitoneálisan 30 pg EtxB (G33D)-vel komplett Freund-féle adjuváns oldatbán (CFA). Mesenterialis nyirokmirigyeket izoláltunk 10 nappal később. Sejteket izoláltunk és 4 napon keresztül inkubáltunk EtxB, EtxB (G33D) vagy ezeknek a fehérjéknek 95 °C hőmérsékletre való melegítéssel előállított szétbontott monomer formái jelenlétében (*).
A sejtproliferációt 1 pCi (3H)-dThd-nek a 4. nap utolsó 6. órájában való adagolásával határoztuk meg. Az adatok három párhuzamos lyuk átlagos cpm-jét (beütésszám/perc) és ezek szórását mutatják.
Az immunizálatlan egerekből származó sejtek <1500 cpm értéket mutattak (dózis 160 pg/ml). 25
2. táblázat
Citokinanalízis EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében
Protein IL-2 (pg/ml) IFN-γ (pg/ml)
EtxB 318 2700
EtxB (G33D) 67 4068
Egereket injektáltunk EtxB (G33D)-vel CFA-ban, és mesenterialis nyirokmirigysejteket izoláltunk 10 nappal később. A sejteket ezután in vitro inkubáltuk EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében, és felülúszómintákat analizáltunk a sejtproliferáció 5. napján citokintartalomra.
3. táblázat
EtxB receptor által közvetített apoptózis frakcionált limfocitákban
Sejtek Idő (óra) Antigén nélkül EtxB (G33D) EtxB
MLNC 4 0a (8) 2(0) 1 (3)
18 8(10) 5(18) 29 (35)
SPLTC 4 3(7) 2(6) 3(5)
18 17(5) 16,5 (12) 31 (32)
Negatív szelekció
CD4 18 5(37) 6(31) 9(35)
CD8 18 18(11) 19(15) 76 (73)
Pozitív szelekció
CD4 18 6 4 6
CD8 18 7 7 60
a apoptotikus sejtek %-ban
Vizsgáltuk a sejtmag-morfológiai változásokat frakcionált CD4 és CD8+ T-sejtekben 4 vagy 18 órás, antigén nélkül, vagy 80 pg EtxB vagy EtxB (G33D) jelenlétében történt inkubáció után, melynek során akridinnarancs-festést követően fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatot hajtottunk végre. Az egész mesenterialis nyirokmirigyből eltűntek az adherens sejtek. SPLTC-t izoláltunk negatív szelekcióval γ-globulinokkal és nyúl-antiegér szérummal, mint szekunder antitesttel bevont üveggyöngy ágyas oszlopon. Frakcionált SPLTC-t kaptunk patkányfikoeritrin-antiegér CD4-gyel vagy FITC-antiegér CD8a-val való jelölés után, amelyet az50 után MACS kolloid szuperparamágneses mikroágyon konjugált kecske-antipatkány IgG (H+L) F(ab’)2-vel inkubáltunk. Ezeket mini-MACS-oszlopon elválasztottuk, és ilyen módon pozitívan szelektált (>99% tisztaság) és negatívan szelektált (>90% tisztaság) CD4 és CD8+ T-sejt-frakciókat kaptunk. A sejtmag-morfológiai változásokat 4-18 órás állapotban vizsgáltuk 200 sejtet tartalmazó mintákban, a 7. ábránál leírt kezelést alkalmazva. Az apoptotikus sejtek maximuma 18 óra után jelentkezett. A zárójelben lévő adatok egy másik külön kísérlet eredményeit jelzik. Az MLN-re és SPLTC-re vonatkozó adatok négy kísérlet összegét reprezentálják.
HU 224 248 Β1

Claims (13)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Terápiás szer alkalmazása autoimmun betegség vagy humán T-sejtes leukémia megelőzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában, ahol
    i) a terápiás szer Etx (E. coli hőre labilis enterotoxin),
    EtxB (E. coli hőre labilis enterotoxin B alegység), Ctx (koleratoxin) és/vagy CtxB (koleratoxin B alegység), ii) ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt adjuk be, a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy egyetlen aktív terápiás szert képeznének.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás autoimmun betegség megelőzésére és/vagy kezelésére.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás reumatoid arthritis, sclerosis multiplex vagy diabétesz megelőzésére és/vagy kezelésére.
  4. 4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a terápiás szer EtxB.
  5. 5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkal- 20 mazás, ahol a terápiás szert saját vagy keresztreagáló antigéndeterminánssal együtt való beadás nélkül alkalmazzuk.
  6. 6. Autoimmun betegség vagy humán T-sejtes leukémia megelőzésére és/vagy kezelésére szolgáló terápiás szert tartalmazó gyógyszerkészítmény, ahol
    i) a terápiás szer Etx, EtxB, Ctx és/vagy CtxB, ii) ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együttesen adjuk be, a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy egyetlen aktív szert képez- 30 nének.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény autoimmun betegség megelőzésére és/vagy kezelésére.
  8. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény reumatoid arthritis, sclerosis multiplex vagy dia5 bétesz megelőzésére és/vagy kezelésére.
  9. 9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, ahol a terápiás szer EtxB.
  10. 10. A 6-9. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, ahol a terápiás szert saját vagy ke10 resztreagáló antigéndeterminánssal együttesen történő beadás nélkül alkalmazzuk.
  11. 11. Készlet, amely egy 6-9. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítményt és attól elkülönítve egy keresztreagáló antigéndeterminánst magában fog15 laló gyógyszerkészítményt tartalmaz.
  12. 12. Terápiás szer alkalmazása transzplantációs kilökődés vagy GVHD betegség megelőzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában, ahol
    i) a terápiás szer Etx (E. coli hőre labilis enterotoxin) és/vagy EtxB (E. coli hőre labilis enterotoxin B alegység), ii) ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együtt adjuk be, a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy egyetlen aktív terápiás szert ké25 peznének.
  13. 13. Transzplantációs kilökődés vagy GVHD betegség megelőzésére és/vagy kezelésére szolgáló terápiás szert tartalmazó gyógyszerkészítmény, ahol
    i) a terápiás szer Etx és/vagy EtxB, ii) ha a terápiás szert egy antigéndeterminánssal együttesen adjuk be, a szer és az antigéndetermináns nem kapcsolódik úgy, hogy egyetlen aktív szert képeznének.
    HU 224 248 Β1
    Int. Cl.7: A 61 K 39/00
    1a. ábra
    HU 224 248 Β1
    Int. Cl.7: A 61 K 39/00
    LÓG {ng)
    HU 224 248 Β1
    Int. Cl.7: A 61 K 39/00 <*>
    hV.VÍVúy.-iYiMiV.YiiMi £Öl X OSr™? snjfrj-roads ygj
    EtxB(G33D} EtxB EtxB(G33DJ
    CM
HU9900147A 1995-07-05 1996-07-05 Terápiás szerek és autoimmun-betegségek HU224248B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9513733.7A GB9513733D0 (en) 1995-07-05 1995-07-05 Therapeutic agents
PCT/GB1996/001614 WO1997002045A1 (en) 1995-07-05 1996-07-05 Therapeutic agents and autoimmune diseases

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9900147A2 HUP9900147A2 (hu) 1999-05-28
HUP9900147A3 HUP9900147A3 (en) 1999-11-29
HU224248B1 true HU224248B1 (hu) 2005-07-28

Family

ID=10777189

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9900147A HU224248B1 (hu) 1995-07-05 1996-07-05 Terápiás szerek és autoimmun-betegségek

Country Status (23)

Country Link
US (1) US6287563B1 (hu)
EP (1) EP0841939B1 (hu)
JP (1) JP4024298B2 (hu)
KR (1) KR100452000B1 (hu)
CN (1) CN1313150C (hu)
AT (1) ATE275968T1 (hu)
AU (1) AU724516B2 (hu)
CA (1) CA2225788C (hu)
CZ (1) CZ298670B6 (hu)
DE (1) DE69633393T2 (hu)
DK (1) DK0841939T3 (hu)
ES (1) ES2229276T3 (hu)
GB (1) GB9513733D0 (hu)
HK (1) HK1006496A1 (hu)
HU (1) HU224248B1 (hu)
MX (1) MX9800241A (hu)
NO (1) NO319747B1 (hu)
NZ (1) NZ311762A (hu)
PL (1) PL187266B1 (hu)
PT (1) PT841939E (hu)
RU (1) RU2203088C2 (hu)
SI (1) SI0841939T1 (hu)
WO (1) WO1997002045A1 (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9326174D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
US20010036917A1 (en) * 1995-07-05 2001-11-01 Williams Neil Andrew Therapeutic agents
US7097845B2 (en) * 1997-04-23 2006-08-29 Jacob Sten Petersen Combinations of antigen and mucosal binding component for inducing specific immunological tolerance
GB9800487D0 (en) * 1998-01-09 1998-03-04 Oratol Limited Therapies
GB9801871D0 (en) * 1998-01-28 1998-03-25 Univ Bristol Therapies
WO1999058145A2 (en) * 1998-05-08 1999-11-18 University Of Bristol Immunomodulators for vaccines
KR20010043441A (ko) * 1998-05-08 2001-05-25 더 유니버시티 오브 브리스톨 백신용 면역조절제
CA2391415C (en) * 1999-11-12 2013-08-06 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin b subunit
US7041296B1 (en) 1999-11-12 2006-05-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin B subunit
CA2358061A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-08 Stemcell Technologies Inc. Novel antibody compositions for the negative selection of specific rat leukocyte subsets
GB0115382D0 (en) * 2001-06-22 2001-08-15 Univ Bristol Mutant
US20050084967A1 (en) 2002-06-28 2005-04-21 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
AU2014216127B2 (en) 2013-02-14 2018-07-12 Cornell University Methods to protect against and treat multiple sclerosis

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5571787A (en) * 1993-07-30 1996-11-05 Myelos Corporation Prosaposin as a neurotrophic factor
US5681571A (en) * 1993-10-08 1997-10-28 Duotol Ab Immunological tolerance-inducing agent

Also Published As

Publication number Publication date
CZ1298A3 (cs) 1998-06-17
CN1313150C (zh) 2007-05-02
DK0841939T3 (da) 2005-01-24
WO1997002045A1 (en) 1997-01-23
CA2225788A1 (en) 1997-01-23
JP4024298B2 (ja) 2007-12-19
NO980005D0 (no) 1998-01-02
ES2229276T3 (es) 2005-04-16
PL187266B1 (pl) 2004-06-30
CA2225788C (en) 2010-09-21
JPH11508586A (ja) 1999-07-27
KR19990028578A (ko) 1999-04-15
US6287563B1 (en) 2001-09-11
CZ298670B6 (cs) 2007-12-19
KR100452000B1 (ko) 2004-11-20
AU724516B2 (en) 2000-09-21
DE69633393D1 (de) 2004-10-21
MX9800241A (es) 1998-11-30
EP0841939A1 (en) 1998-05-20
HUP9900147A3 (en) 1999-11-29
DE69633393T2 (de) 2005-11-10
PT841939E (pt) 2005-02-28
HUP9900147A2 (hu) 1999-05-28
EP0841939B1 (en) 2004-09-15
ATE275968T1 (de) 2004-10-15
AU6314296A (en) 1997-02-05
SI0841939T1 (en) 2005-04-30
RU2203088C2 (ru) 2003-04-27
CN1192693A (zh) 1998-09-09
HK1006496A1 (en) 1999-03-05
GB9513733D0 (en) 1995-09-06
NO319747B1 (no) 2005-09-12
NZ311762A (en) 2001-04-27
NO980005L (no) 1998-03-05
PL324424A1 (en) 1998-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kawamura et al. Cholera toxin activates dendritic cells through dependence on GM1‐ganglioside which is mediated by NF‐κB translocation
Tanaka et al. Depletion of CD4+ CD25+ regulatory cells augments the generation of specific immune T cells in tumor-draining lymph nodes
Santos et al. Oral tolerance to myelin basic protein induces regulatory TGF-β-secreting T cells in Peyer's patches of SJL mice
Trembleau et al. Deviation of pancreas‐infiltrating cells to Th2 by interleukin‐12 antagonist administration inhibits autoimmune diabetes
Hou et al. Pertussis toxin enhances Th1 responses by stimulation of dendritic cells
US20140322274A1 (en) Therapeutic Agents
HU224248B1 (hu) Terápiás szerek és autoimmun-betegségek
Stojanovic et al. Cell-based tolerogenic therapy, experience from animal models of multiple sclerosis, type 1 diabetes and rheumatoid arthritis
Martin et al. Distinct cytokine regulation by cholera toxin and type II heat-labile toxins involves differential regulation of CD40 ligand on CD4+ T cells
Ohmura et al. Nontoxic Shiga toxin derivatives from Escherichia coli possess adjuvant activity for the augmentation of antigen-specific immune responses via dendritic cell activation
Hisatsune et al. CD8+ T cells specific to the exogenous antigen. Mode of antigen recognition and possible implication in immunosuppression.
Kang et al. Regulatory T cells in lupus
Tkaczyk et al. Specific antigen targeting to surface IgE and IgG on mouse bone marrow‐derived mast cells enhances efficiency of antigen presentation
US20020004238A1 (en) Chimeric antigen-enterotoxin mucosal immunogens
Bardos et al. Continuous nasal administration of antigen is critical to maintain tolerance in adoptively transferred autoimmune arthritis in SCID mice
Kikuchi et al. Augmented induction of CD8+ cytotoxic T‐cell response and antitumour resistance by T helper type 1‐inducing peptide
Apostolaki et al. Nasal delivery of antigen with the B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin augments antigen-specific T-cell clonal expansion and differentiation
Glant et al. Mapping of arthritogenic/autoimmune epitopes of cartilage aggrecans in proteoglycan-induced arthritis
Bonnin et al. Mucosal modulation of immune responses to heat shock proteins in autoimmune arthritis
Tew et al. Dendritic cells as accessory cells
Myers et al. T cells stimulated with an analog peptide of type II collagen require the Fc receptor γ‐chain to secrete interleukin‐4 and suppress autoimmune arthritis in mice
Rempel et al. Failure of rIL-12 administration to inhibit established IgE responses in vivo is associated with enhanced IL-4 synthesis by non-B/non-T cells
US20020048579A1 (en) Ex vivo treatment of allogeneic and xenogeneic donor T-cells containing compositions (bone marrow) using gp39 antagonists and use thereof
Callis et al. IL-13 Production by Regulatory T Cells
Alexander Regulation of the Regulatory T Cell-Immunoglobulin A Pathway

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20050517

GB9A Succession in title

Owner name: TRIDENT PHARMACEUTICALS, INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): ORATOL LIMITED, GB; UNIVERSITY OF BRISTOL, GB

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees