NO333157B1 - Fosfolipidblaere, modifiserte antigen-presenterende celler, fremgangsmate for inkorporering av antigener inn i dendrittiske celler og farmasoytisk sammensetning. - Google Patents

Abstract

Denne oppfinnelse dreier seg om fremgangsmåter og blandinger som innfører kjemiske enheter i antigen-presenterende celler.Den resulterende presentasjon av nevnte antigener på overflaten av de antigen-presenterende celler gir en effekt på immunsystemet. Oppfinnelsen dreier seg også om de resulterende modifiserte antigen-presenterende celler og farmasøytiske blandinger som inneholder disse cellene. Oppfinnelsen beskriver ny forståelse om adjuvanser og preparater av disse, deriblant en serie med relaterte peptider, og fosfolipidblærer som inkorporerer de nevnte peptider.

Description

Den foreliggende oppfinnelse dreier seg spesielt om fosfolipidblære, modifiserte antigen-presenterende celler, fremgangsmåte for inkorporering av antigener inn i dendritiske celler og farmasøytisk sammensetning. Anvendelse av fremgangsmåten og sammensetningen resulterer i presentasjon av de nevnte antigener på overflaten av de antigen-presenterende celler og har virkning på immunsystemet.

For tiden er det betydelig interesse for å manipulere pattedyrs immunsystem ved å inkorporere antigener i overflaten av antigen-presenterende celler, både generelt og spesielt i dendrittiske cellers overflate. Ved å inkorporere antigener i overflaten av antigen-presenterende celler kan immunsystemet ledes til å målrette seg mot spesifikke antigener. Dette har blitt anvendt i mange terapeutiske områder, deriblant kreftbehandling. Mange kreftantigener har blitt publisert, og blir for tiden anvendt i utprøvinger av human dendrittisk celle-basert immunterapi mot kreft, for eksempel som beskrevet i US 5990294 og 5874290 til Northwest Biotherapeutics, LLC.

Det er imidlertid vanskelig å fremstille dendrittiske celler med modifiserte antigener på deres overflate. En rekke fremgangsmåter har tidligere blitt vurdert i faget. Fremgangsmåter som for tiden er kjent inkluderer å "pulse" antigene peptider direkte på overflaten av antigen-presenterende celler, eller å inkubere antigen-presenterende celler med hele proteiner eller proteinfragmenter som så blir tatt opp av de antigen-presenterende cellene. Disse peptidene blir fordøyet til små fragmenter av de antigen-presenterende celler og presentert på deres celleoverflater. Disse fremgangsmåter har alle begrenset effektivitet og reprodusibilitet, og de dreier seg bare om peptidantigener.

Andre fremgangsmåter har blitt publisert. For eksempel beskriver WO96/30030 til Baxter International Inc. og W098/46785 til Dana-Farber Cancer Institute fremgangsmåter for å sammensmelte egne dendrittiske celler fra en pasient med ikke-dendrittiske celler, for eksempel kreftceller som uttrykker et celleoverflateantigen som det er ønskelig å fremskaffe en immunrespons mot. Slike celler kan så dyrkes og bli injisert i en vert, nær dennes lymfesystem, noe som fører til en immunrespons mot det ønskete antigen. Imidlertid er denne prosess kompleks og langsom, og den krever genetisk modifikasjon av en pasients cellelinjer for å inkludere et gen som koder for det interessante antigen. Videre frembringer de ikke en fremgangsmåte for å fremvise antigener som ikke er proteiner, som blir prosessert av det protein-modifiserende maskineri i de resulterende dendrittiske/ikke-dendrittiske cellehybrider. Videre anvender disse fremgangsmåter en pasients kreftcellelinjer, og det ville være nødvendig med stor grad av forsiktighet under arbeidet med å behandle disse cellelinjer for å unngå videre utvikling av svulster. Kreftcellelinjer er selvfølgelig bare tilgjengelige i pasienter med kreft, og det er ikke klart om disse terapeutiske fremgangsmåter kan appliseres til pasienter der udødelige cellelinjer ikke er tilgjengelige.

US Patent 5976546 til Rockefeller University frembringer en fremgangsmåte for å presentere antigener på overflaten av dendrittiske celler ved å kombinere dendrittiske celler med et kompleks av (a) et protein som binder dendrittiske celler, (b) et polypeptid antigen, og (c) en kopler. Det er ikke klart i hvilken grad nærvær av et dendrittisk celle-bindende protein og en kopler vil affisere evnen som antigenet har til å fremkalle en T-avhengig immunrespons. Denne fremstilling dreier seg også bare om antigener som er polypeptider.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fosfolipidblære for å fremskaffe en immunrespons,

idet fosfolipidblæren har en multilamellær, lamellær-legemelignende struktur og fosfolipidsammensetningen av fosfolipidblæren omfatter:

fosfatidylcholin 44% til 60%,

sfingomyelin 15% til 25%,

fosfatidyletanolamin 6% til 10%,

fosfatidylserin 2% til 6%,

fosfatidylinositol 2% til 4%

og kolesterol 4% til 12%

der tallene er prosentdel per vektenhet, idet fosfolipidblæren har et eksogent antigen eller en polynukleinsyre kodende for et antigen deri, idet fosfolipidblæren er tilpasset og blir fagocytert av antigen-presenterende celler.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre modifisert antigenpresenterende celler for indusering av en cellulær immunrespons som omfatter antigenpresenterende celler isolert fra et pattedyrlegeme, modifisert ved opptak av fosfolipidblærer ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre modifisert antigenpresenterende celler ifølge krav 15, idet de antigenpresenterende cellene er dendrittiske celler.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre farmasøytisk sammensetning for indusering av en immunrespons som omfatter en fosfolipidblære ifølge kravene 1 til 7, eller modifisert antigenpresenterende celler ifølge kravene 15 og 16 og farmasøytisk akseptabel bærer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for inkorporering av antigener inn i dendrittiske celler, omfattende trinnet av å blande fosfolipidblærer ifølge kravene 1 til 7 med dendrittiske celler. Det frembringer en rask og effektiv fremgangsmåte for å inkorporere molekyler i dendrittiske celler slik at dendrittiske celler og andre antigen-presenterende celler blir stimulert til å fremvise de ønskete molekyler på deres overflate. Det dreier seg spesielt om dendrittiske celler og antigen-presenterende celler som er modifisert ved denne fremgangsmåten. Det er ønskelig å frembringe en fremgangsmåte for å inkorporere antigener i overflatemembranen til dendrittiske celler slik at antigenene blir presentert for T celler. Alternativt kan polynukleinsyrer som koder for antigener bli levert til dendrittiske celler, for anvendelse i kjente genterapeutiske fremgangsmåter.

Adjuvanseffekt er et fenomen der et middel eller en kombinasjon av midler, anvendt sammen med antigenet, frembringer en forsterket immunrespons hos en vert. Freunds komplette adjuvans består egentlig av et antigen som er emulsifisert i olje sammen med cellevegger fra mykobakterier. Det blir vanligvis godtatt at Freunds adjuvans er den sterkeste immunostimulant som foreløpig er oppdaget. Imidlertid har det faktum at dette adjuvans ved vaksinasjoner regelmessig fører til dannelse av vevsgranulomer ført til at det ikke lenger anvendes, ikke bare hos mennesker men heller ikke hos forsøksdyr. Denne avgjørelse overser totalt den selvfølgelige og godt etablerte patologiske kunnskap at de kraftigste og mest langvarige immunresponser hos virveldyr kommer fra mikroorganismer eller forbindelser som frembringer granulomer.

Heri beskrives videre adjuvans, som har en effektivitet som nærmer seg Freunds adjuvans, men som ikke har de samme ubehagelige bivirkninger.

I denne spesifikasjon dreier begrepet "antigen-presenterende celler" seg om enhver immunsystem-celle som presenterer antigener for komponenter av immunsystemet. Dette begrep inkluderer derfor dendrittiske celler.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fosfolipidblære ifølge krav 1, idet fosfolipidsammensetningen omfatter

fosfatidylcholin 54%,

sfingomyelin 19%,

fosfatidyletanolamin 8%,

fosfatidylserin 4%,

fosfatidylinolsitol 3%

og kolesterol 10%

der tallene er prosentdel per vektenhet.

Eventuelt kan fosfolipidsammensetningen av fosfolipidblæren inneholde lysolecitin. Fortrinnsvis er fosfolipidsammensetningen av fosfolipidblæren 0-3% lysolecitin. Mest fordelaktig er fosfolipidsammensetningen av fosfolipidblæren 2% lysolecitin.

Fosfolipidblæren kan være et lamellært legeme som er isolert fra en pattedyrkropp.

Ifølge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse blir det frembrakt fosfolipidblærer til anvendelse som et vaksinemiddel.

Fortrinnsvis er de antigen-presenterende celler dendrittiske celler.

Ifølge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse blir det frembrakt fosfolipidblære ifølge kravene 1 til 7, som har deri et protein som har en peptidsekvens som er homolog eller identisk med den angitt i sekvens ID NO 1 eller NO 2, og som videre har en ytterligere peptidsekvens som er homolog eller identisk med de som er angitt i sekvens ID NO 3 eller NO 4, idet det resulterende peptidet har evne til å virke som en adjuvans for å fremkalle en immunrespons.

Ifølge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse blir det frembrakt fosfolipidblære ifølge krav 8, idet peptidsekvensen som er homolog viser mellom 99% og 75% homologi med henholdsvis SEKV ID NO 1, SEKV ID NO 2, SEKV ID NO 3 eller SEKV ID NO 4.

Ifølge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse blir det frembrakt fosfolipidbærer ifølge krav 8, idet peptidsekvensen som er homolog viser 99% homologi med henholdsvis SEKV ID NO 1, SEKV ID NO 2, SEKV ID NO 3 eller

SEKV ID NO 4.

Ifølge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse blir det frembrakt fosfolipidblære ifølge krav 8, som har deri et protein som har en peptidsekvens som angitt i sekvens ID NO 1 eller ID NO 2, og som videre har en peptidsekvens som angitt i sekvens ID NO 3 eller ID NO 4.

Ifølge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse blir det frembrakt fosfolipidblære ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, som har deri trehalose dimykolat.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer også fosfolipidblære ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, som inkorporerer SP-A peptidsekvens 77 til 110 for presentering av antigen til autologe profesjonelle og ikke-profesjonelle antigen-presenterende celler in vitro for å påvirke en immunterapeutisk respons i en vert.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer også fosfolipidblære ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, som inkorporerer trehalose dimykolat SP-A peptidsekvens 77 til 110.

Et eksempel på den foreliggende oppfinnelse vil nå bli vist, med henvisning til de følgende figurer, der: Figur 1 er et skjematisk diagram av en prosess for å inkorporere materiale i dendrittiske celler, og Figur 2 er et skjematisk diagram av dendrittiske celler som skal anvendes i et farmasøytisk preparat.

Dendrittiske celler er celler fra benmarg som tilhører en cellelinje som skiller seg fra makrofager. De karakteriseres ved at de har en uregelmessig form, de har høy konstitutiv ekspresjon av MHC klasse I og klasse II molekyler og de har få lysosomer og endocytotiske blærer. De blir funnet som 'omslørte celler' i tilførende, afferente lymfeårer, som 'interdigiterende celler' i T celle-områder i sekundære lymfoide organer, og i margen i tymus (brissel) (Male et al., 1991). Det er nå etablert at dendrittiske celler er de viktigste antigen-presenterende celler som medvirker med høy effektiv under utløsing av primære T celle-medierte immunresponser (Banchereau J., Stinman R.M., 1998). I tillegg er evnen til å stimulere primære responser bundet til deres konstitutive ekspresjon av ko-stimulerende aktivitet, i kontrast til andre antigen-presenterende celler som kreves i tillegg til MHC/peptid for å aktivere hvilende, men tidligere sensitiviserte T celler. Dendrittiske celler er kjent for å ha lav endocytotisk aktivitet, og det er fremdeles uklart på hvilken måte antigen blir tatt opp av cellene, selv om såkalte Birbeck granula ('racket-formete granula) av noen antas å ta opp det antigene materiale og behandle det før det blir presentert for T cellene. Dendrittiske celler er tilstede som en liten prosentdel av de perifere blod mononukleære celler (PBMCer), der de sirkulerer ut i vev, og vandrer videre fra vevet via den afferente lymfe til de drenerende lymfeknuter, der de danner de interdigiterende dendrittiske celler i lymfeknutens paracortex og der de presenterer antigen til de T celler som vandrer gjennom knuten. Dendrittiske celler som går gjennom overhuden (epidermis) er kjent som Langerhans' celler (LCer).

Det siste fremskritt i immunterapi mot kreft dreier seg om anvendelse av svulstantigener og autologe antigen-presenterende celler som kreftvaksiner (Melman et al., 1998). I kliniske utprøvinger har in vitro 'pulsing' av autologe dendrittiske celler med antigener som uttrykkes av svulstceller oppnådd opp til 30% delvis respons og 8% komplett respons hos pasienter med visse svulster (Tjoa B. et al., 1998). Videre utvikling av strategier for å forbedre disse lovende resultater er for tiden hemmet av en manglende kunnskap vedrørende effektive fremgangsmåter eller midler som in vitro kan indusere dendrittiske celler til å ta opp antigenet og videre behandle de antigene determinanter slik at de blir presentert på celleoverflaten, slik det forekommer in vivo.

Vi har imidlertid oppdaget at lamellære legemer blir fagocytert av dendritiske celler in vivo. Lamellære legemer blir produsert av de fleste, om ikke alle pattedyrceller, og blir hovedsakelig frisatt på celleoverflatene ved eksocytotisk sekresjon (3). De fungerer som smøremidler på celleoverflater, intercellulært og internt i den ekstracellulære matriks, som overflateaktive komponenter, og som vannavstøtende midler. Et høyere produksjonsnivå karakteriserer visse spesialiserte vev som er innblandet i å frembringe overflater som ikke er klebrige (bukhinne, hjertesekkhinne, lungesekkhinne) (Dobbie et al., 1988, Dobbie and Lloyd 1989, Dobbie et al., 1994, Dobbie et al 1995), smøring ved bevegelse (leddhinner) (Dobbie et al 1994, 1995), som overflateaktivt middel (i lunge), eller som vannavstøtende middel (på hud). Lamellære legemer passerer ikke bare fra ulike kroppshuler rett inn i lymfesystemet, i vev med høy sekretorisk aktivitet passerer de i tillegg også baklengs (retrograd) gjennom grunnsubstansen i matriks og mellom celler ut i de drenerende lymfeårer (6).

Lamellære legemer ligner liposomer. Det er imidlertid viktige forskjeller. Lamellære legemer er krystaller av fosfolipidvæsker, og er svært fleksible siden de inneholder lite eller intet kolesterol, i kontrast til liposomer. I vev blir de derfor konstant dannet og nydannet, og mens dette skjer inkorporerer de frie, 'planktonlignende' proteiner og peptider fra fragmentært proteinavfall som er tilstede i den ekstracellulære væske. Dette avfall er tilstede i både normalt og patologisk vev, slik som i betent vev som er en respons på invasjon av mikroorganismer. Lamellære legemer som inkorporerer både endogent (selv) og eksogent (ikke-selv) materiale, som enten er eksponert på overflaten eller er inneholdt inne i eller mellom de doble fosfolipidlagene, vil således passere inn lymfedrenasjen, og derved automatisk bli ledet til det lokale regionale lymforetikulære vev. Der vil de lamellære legemer (som har overflate-lag som ligner mer på typiske prokaryote cellemembraner, dvs. fra bakterie og virus) bli filtrert gjennom lymfatiske hulrom, noe som medfører at de automatisk blir studert av det lymfoide vev siden de har størrelse, form og membransammensetning som likner en enkel, naken bakterie. I denne sammenheng er den beste analogi som beskriver den primære funksjon til lamellære legemer det universelle fluepapir, der vevsproteiner (både selv og ikke-selv) og peptider automatisk blir tatt opp og ledet til det lymfoide vev. Dette er basisnivået til det acellulære, innebyggete immunsystem, som avhenger av den fysikalsk-kjemiske interaksjon mellom naturlig dannete og resirkulerende multilamellære kuler og planktonlignende molekyler i den ekstracellulære væske. Derved fungerer lamellære legemer som automatiske centripetale transportører i det lymforetikulære system. Betydningen av dette grunnleggende biologiske system har foreløpig vært uklart, i og med at den utbredte tilstedeværelse av lamellære legemer i vanlig vev, samt deres fordeling, tetthet og innehold i patologiske prosesser så vidt vi vet ikke tidligere har blitt rapportert. Deres nærvær i vev utenfor lunger kan ikke visualiseres med elektronmikroskopet dersom ikke vevene blir fiksert på en spesiell måte og behandlet på en måte som spesifikt bevarer deres delikate ultrastruktur, noe som førte til deres oppdagelse i lunge (se referanser).

Den foreliggende oppfinnelse dreier seg om menneskeskapte konstruksjoner som ligner på lamellære legemer, som er fosfolipidblærer oppbygget for å etterligne naturlige lamellære legemer som tillater innføring av utvalgte antigener. Oppfinnelsen dreier seg også om fremgangsmåten hvormed de kan innføres i dendrittiske celler, og om de dendrittiske celler som derved blir formet. Disse dendrittiske celler, som inneholder utvalgte antigener, kan så i en ellers kjent fremgangsmåte bli anvendt i farmasøytiske preparater for å behandle en lang rekke tilstander.

Den foreliggende oppfinnelses fosfolipider er konstruksjoner som består av fosfolipider som forekommer naturlig hos virveldyr, dannet som et multilamellært liposom som nært gjenspeiler den kjemiske sammensetning og den ultrastrukturelle fordeling av lamellære legemer. Disse forekommer i varierende tetthet i de fleste vev i hele kroppen hos pattedyr, for eksempel i lunge, i leddhinne, bukhinne, lungesekkhinne, og hjertesekkhinne (Dobbie 1988, Dobbie and Lloyd 1989, Dobbie et al 1988,1994, 1995). De har også blitt funnet i amfibier, teleoster og elasmobranker (Dobbie and Lewis 1999, og ikke-publiserte data). Lamellære legemer karakteriseres av fosfolipid dobbeltlag, vanligvis med regelmessig periodisitet (Dobbie 1989, Dobbie et al., 1994). I motsetning til sammensetningen av fosfolipid dobbeltlag i normale pattedyrcellers membraner, som inneholder betydelige mengder kolesterol, har lamellære legemer lav konsentrasjon av kolesterol eller er uten kolesterol i deres lameller. I denne henseende er lamellære legemer nærmere beslektet med de karakteristiske sammensetninger og ultrastrukturelle fordelinger av cellemembranen til nakne mikroorganismer, slik som bakterier og virus.

Det er beskrevet konstruksjon av multilamellære liposomer med kjemisk sammensetning som er lik eller nær opptil den som finnes i lamellære legemer som inkluderer antigent materiale, protein, peptider eller andre molekyler som stikker ut fra overfaten eller er tilstede inne i eller mellom de to fosfolipid dobbeltlagene.

Figur 1 viser et skjematisk diagram av hvorledes denne fremgangsmåte blir gjennomført. Antigen 1 blir først innført i en lamellært legeme-lignende fosfolipidblære 2, som danner en antigen-inneholdende fosfolipidblære 3. Fosfolipidblæren som blir konstruert på denne måte blir anvendt som bærer av et utvalgt antigen for å presenteres for en profesjonell (dendrittisk celle eller makrofag) eller ikke-profesjonell antigen-presenterende celle (antigen presenterende celle). Disse celler internaliserer fosfolipidblæren sammen med det antigene materiale som er fordelt gjennom blærens ulike deler. Det antigene materiale blir så behandlet intracellulært av den antigen-presenterende celle, og den antigene determinant blir deretter presentert på celleoverflaten sammen med de korrekte, medfølgende, identifiserende og stimulerende overflateproteiner, for eksempel MHC 1 og 2 molekyler.

I dette eksempel blir en pasients egne dendrittiske celler 4 dyrket in vitro og slått sammen med fosfolipidblærer for å fremskaffe modifiserte dendrittiske celler 5. Selv om denne beskrivelse spesifikt dreier seg om dendrittiske celler vil det være klart for en som er øvet i faget at det samme prinsipp kan anvendes for å modifisere andre antigen-presenterende celler.

Figur 2 viser videre skjematisk en rekke modifiserte dendrittiske celler 5. I terapien går autologe dendrittiske celler, som har blitt isolert fra perifert blod, dyrket in vitro og primet ved tilførsel av et antigen levert via en fosfolipidblære, når de blir tilbakeført til pasienten via alle mulige veier (for eksempel via injeksjon inn i det lymfatiske system), videre til det lymforetikulære system, der de stimulerer produksjon av antigen-spesifikke T lymfocytter 6. Disse utgjør effektorcellene, i og med at de fullfører den cellulære immunrespons mot kroppsceller som bærer på det utvalgte antigen.

Lamellære legemer

Naturlige liposomer, lamellære legemer, blir produsert av de fleste, om ikke alle pattedyrceller, og blir i hovedsak frigjort til celleoverflaten ved eksocytotisk sekresjon (Dobbie, 1989). De fungerer som celleoverflate, smøremidler mellom celler og mellom komponenter av den ekstracellulære matriks, som overflateaktive midler og som vannavstøtende komponenter. Et høyere produksjonsnivå er typisk i visse spesialiserte vev som er innblandet i å frembringe overflater som ikke kleber (bukhinne, hjertesekkhinne, lungesekkhinne) (Dobbie et al., 1988,1994, 1995, Dobbie and Lloyd 1989), som smøring under bevegelse (leddhinner)

(Dobbie et al 1994, 1995), som overflateaktivt middel (lunge) eller som et vannavstøtende middel (hud). Lamellære legemer passerer ikke bare fra de ulike kroppshuler direkte inn i det lymfatiske system, i tillegg passerer de i aktivt sesernerende vev i en retrograd retning gjennom grunnsubstans i den ekstracellulære matriks, og mellom celler inn i de drenerende lymfeårer (Dobbie and Anderson, 1996).

Strukturen til fosfolipidblærer.

I denne oppfinnelse blir fosfolipidblærer konstruert ved at spesifikke fosfolipider blir anvendt i proporsjoner som tilsvarer de som finnes i lamellære legemer i vanlige vev. Nøkkelegenskapen som skiller fosfolipidblærene som beskrives i denne søknad fra liposomer er deres lave innehold eller mangel på kolesterol. I biomedisinske anvendelser blir syntetisk konstruerte liposomer først og fremst oppbygget for å kunne ta opp og beskytte farmasøytiske forbindelser og andre midler. De blir derfor fremstilt med et høyt nivå av kolesterol, noe som gir membranstabilitet og lite porøse membraner, slik som det finnes i membraner i pattedyrsceller. Det følger derfor at dobbeltlagets konsentrasjon av kolesterol er den viktigste determinant som bestemmer halveringstiden i sirkulasjonen for liposomer som er konstruert for å være bærere av medikamenter. Den inhibitoriske virkning som kolesterol har på opptak av liposomer inn i det lymforetikulære system, målt i lever og milt, er velkjent (Patell HM et al., 1983). I klar motsetning til dette blir fosfolipidblærer, modellert etter egenskapene til lamellære legemer, lett tatt opp av fagocytære celler, og blir, som tilfellet er med liposomer med lavt nivå av kolesterol, raskt fjernet fra sirkulasjonen v.h.a. lymforetikulært vev.

De viktigste fosfolipidkonstituenter i lamellære legemer er fosfatidylkolin (PC), sfingomyelin (SPH), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS), fosfatidylinositol (Pl) og lysolecitin (LPC). Fosfolipidsammensetningen til lamellære legemer viser lett variasjon basert på cellen der syntesen foregår.

PC er det viktigste fosfolipid i lamellære legemer, uavhengig av syntesested. Prosentdelen av PC konsentrasjon varierer fra omtrent 70% i utvask fra lunge til 45% i leddvæske (referanser). Det neste fosfolipid i konsentrasjonsrekkefølgen er SPH (5-15%). Deretter er PE, PS, Pl, PG og LPC tilstede i varierende, ensifrete prosentdels konsentrasjoner i lamellære legemer, basert på syntesested.

Den foretrukne sammensetning for fosfolipidblærer av fosfolipider og kolesterol består av: PC 54%: SPH 19%: PE 8%: PS 4%: Pl 3%: kolesterol 10%. Disse verdier representerer medianer, og de følgende områder med sammensetninger har blitt funnet i naturlige lamellære legemer (egen forskning): PC 44-60%, SPH 15-23%, PE 6-10%, PS 2-6%, Pl 2-4%, kolesterol 4-12%. Disse tall representer prosentdel pr. vekt.

LPC kan også inkorporeres i blærene i en mengde på 2% pr vekt, som tilsvarer det område som finnes i naturlig forekommende lamellære legemer på 0-3%.

Fosfolipidblærer i form av liposomer er selvfølgelig godt kjent. Imidlertid blir liposomer laget av de som er øvet i faget med høye konsentrasjoner av kolesterol for å øke deres rigiditet. Liposomer som inneholder kolesterol på nivåer på 20% eller under dette ville bli vurdert som å ha for lite kolesterol (Love WG et al., 1990). Liposomer som inkorporer en høy ratio (50%) av kolesterol, der dette er ekvimolært med fosfolipidene, har en meget stabil struktur (Kirby et al., 1980, Senior et al., 1982), og det ville derfor, før denne oppfinnelse, ifølge vår kunnskap ikke ha vært selvfølgelig å forsøke å teste ut blærer med lavt nivå av kolesterol. Kolesterolinneholdet i lamellære legemer hentet fra lungealveoler har blitt funnet å ligge på ca. 10% kolesterol (SchmitzG., Muller J., 1991, J. Lipid Res. 32:1539).

Nærvær av sfingomyelin i naturlig forekommende lamellære legemer og i de fosfolipidblærene som det kreves patent for i den foreliggende oppfinnelse er viktig. Sfingomyelin er ifølge vår kunnskap ikke vanlig å anvende i liposomer, og gir de lamellære legemer fleksibilitet og bløthet. Erfaring fra vanlig liposomteknologi har vist at rigiditet er bedre for å levere kjemiske forbindelser, vi har imidlertid funnet at fleksible, sfingomyelinholdige fosfolipidblærer med lavt innhold av kolesterol er ideelle for å levere antigen til antigen-presenterende celler.

Fremstilling av fosfolipidblærer

Fosfolipidblærer blir fremstilt med en fremgangsmåte som likner den som anvendes for å fremstille håndristete, multilamellære blærer (New RRC, 1990). Fosfolipidblandingen, sammen med kolesterol i de prosentvise mengder gitt som vekt, blir løst opp i kloroform/metanol løsemiddel (2:1 vol/vol). Lipidløsningen blir innført i en rundbunnet flaske og tilkoplet en roterende evaporator. Flasken blir evakuert og rotert ved 60 omdreininger pr. minutt i et termostatkontrollert vannbad ved en temperatur på 30°C inntil en tørr lipidfilm blir avleiret. Nitrogen innføres i flasken og det gjenværende løsemiddel blir fjernet før flasken blir koplet til en frysetørrer der den blir utsatt for høyt vakuum ved romtemperatur i en time. Etter frikopling fra vakuum og etter tilførsel av nitrogen blir saltvann som inneholder de løste komponenter (det utvalgte antigen) som skal innesluttes tilsatt. Lipidet blir hydrert inne i flasken, gjennomblåst med nitrogen, koplet til evaporatoren, og rotert

(60 r.p.m.) ved romtemperatur i 30 minutter. Suspensjonen får stå i to timer ved romtemperatur for å gjøre oppsvulmingsprosessen komplett.

Antigen- oppfvlte fosfolipidblærer

Antigenet som skal presenteres (protein, peptid eller andre antigene komponenter) for den profesjonelle antigen-presenterende celle, for eksempel dendrittiske celle, blir fremstilt som en komponent oppløst i det normale isotone saltvann (0,9%) som anvendes i hydrering og fremstilling av fosfolipidblærene. Liksom liposomer kan denne oppfinnelses fosfolipidblærer ikke bli sterilisert ved eksponering ved høye temperaturer, og blærene er også følsomme overfor ulike typer stråling og kjemiske steriliserende midler. For anvendelse hos mennesker må hvert trinn i deres fremstilling bli utført under aseptiske betingelser, der den opprinnelige organiske løsning av lipider blir sendt gjennom membranfiltre av regenerert cellulose (pore størrelse 0,45um) og glassfiber før den blir tørket, for å fjerne mikroorganismer, sporer og pyrogent materiale (Ref. RRC New, p. 103). Siden de fosfolipidblærer som beskrives her likner de multilamellære blæretype-liposomer er de mekanisk stabile under lagring i lange perioder. Deres størrelse kan reguleres med ekstrusjon.

Den foreliggende oppfinnelses fosfolipidblærer har en konstruksjon som likner på de multilamellære blæretype liposomer som, i motsetning til andre typer liposomer, gir en mer gradvis og vedvarende frisetning av materiale (RRC New, p28). Denne egenskap er viktig for frisetningen av antigen, både intra- og ekstracellulært.

Fremstilt på denne måten kan fosfolipidblærene bli anvendt til å presentere antigen til profesjonelle og non-profesjonelle antigen-presenterende celler.

Det er på det nåværende tidspunkt kjent at ved å føre nukleinsyre inn i antigen-presenterende celler blir slike nukleinsyrer deretter inkorporert i cellene, som derved uttrykker proteiner som blir presentert på overflaten av cellene. En alternativ utføring fremstiller fosfolipidblærer med DNA og RNA innvendig, og når disse fosfolipidblærer blir tatt opp blir nukleinsyrene levert inn i de antigen-presenterende cellene, som derved fungerer som et passende genterapimiddel.

Separasjon, isolering og dyrking av humane dendrittiske celler

PMBCer, fremskaffet fra enten 50 ml ferskttappet venøst blod eller ved leukoforese, blir isolert med anvendelse av Hypaque tetthetsgradient sentrifugering under sterile betingelser. PMBS blir resuspendert i komplett medium (OPTIMEM medium) i 5% varme-inaktivert autologt plasma, og platet ut i en 75cm<2>vevsdyrkings flaske med 2-3x 10<?>celler pr. flaske. Cellesuspensjonene blir inkubert i en fuktinkubator (37°C, 5% CO2) i 60 minutter. De ikke-adherente celler blir fjernet og de adherente cellene blir forsiktig vasket med varmt (37°C) komplett medium. Dendrittisk celledyrkingsmedium ('dendritic cellPM': komplett medium, 500 enheter/ml granulocytt makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og 500 enheter/ml Interleukin 4 (IL-4)) blir tilsatt de adherente celler (10 ml/flaske) og dyrket i 4-6 dager.

Modifikasjon av dvrkete autologe dendrittiske celler med antigen- lastete fosfolipidblærer

Antigen-lastete fosfolipidblærer blir suspendert i et minimalt volum av isotont saltvann (0,9%) og blir tilsatt dyrkingsflaskene, derved eksponeres de for de dyrkete dendrittiske celler i 1 time ved 37°C. Deretter blir cellene vasket forsiktig i PBS og enten resuspendert i normalt saltvann eller tilført intravenøst eller intralymfatisk intradermalt til pasienten.

I en utførelse der

Adiuvanseffekt

Vi har funnet at "skummet" avfall og inneholdet i skumcellene, både mononukleære og multinukleære, som er en typisk egenskap ved alle granulomer, blir fremvist som lamellære legemer når vevene blir fiksert med tanninsyre glutaraldehyd fiksativ, og vi kan nå gi en tilfredsstillende forklaring på hva som foregår under vaksinasjon med Freunds komplette adjuvans.

Injeksjon av Freunds komplette adjuvans med antigen skaper et kunstig lager av antigen via stimulering av et selvdannende og selv-vedlikeholdende depot gjennom dannelse av granulom som inneholder lamellære legemer. Dette kommer av inhibisjon av fagosom/lysosom fusjonen, fremkalt av trehalose dimykolat (fra mykobakteriers cellevegger) som fører til intracellulær akkumulering av lamellære legemer. Makrofagers kapasitet til å degradere lamellære legemer er videre redusert av fagocyterte dråper av mineral olje, og en fremmedlegemereaksjon blir indusert. Celler som er overfylt med lamellære legemer som de, gjennom blokkade av fagosom/lysosom fusjon, ikke klarer å fordøye, gjennomgår nekrose. Det blir derved frigjort en økende mengde av lamellære legemer inne i granulomet, Når disse lamellære legemer blir refagocytert av gjenværende levedyktige celler blir de i sin tur blokkert av den lokale virkning av Freunds adjuvans.

Freunds komplette adjuvans fører derfor til dannelse av et granulom som etterligner effekten av et naturlig fremskaffet mykobakterielt granulom, der levende intracellulære basiller frigjør trehalose dimykolat, som blokkerer alle fagosom/lysosom fusjoner.

I en vaksine som inneholder Freunds komplette adjuvans blir det utvalgte antigen automatisk tatt opp i lamellære legemer fra den ekstracellulære væske ved injeksjonsstedet. Antigenet blir således konsentrert lokalt som det selv-genererende og selv-vedlikeholdende depot, der antigenmolekyler sekvensielt blir fordelt gjennom et økende antall av nydannete og gjentatt dannete lamellære legemer. Siden disse har både dimensjoner og en lipidsammensetning (lavt kolesterol) som ligner på en bakteries cellemembran, blir lamellære legemer effektivt fagocytert av de konsentriske ringer med leukocytter som omgir granulomet.

Dette er en tidligere ukjent, innebygget forsvarsmekanisme hos virveldyr, der de fagocyterte organismer, i sitt eget forsvar, ved å blokkere intracellulær fagosom/lysosom fusjon, ubønnhørlig gir lokal akkumulering av et stort antall lamellære legemer som bærer et utvalg av antigene deler av de døde invaderende mikroorganismer. Dette fører automatisk til en eskalerende forsterking med først lokal, så fjernere eksponering av antigene molekyler som bæres av de lamellære legemer. Dette fører tilslutt til en kraftig terapeutisk respons rettet mot selv de mest virulente organismer.

Mesosom- lamellært legeme interaksjoner under presentasjon av bakterielle antigener i granulomer

Mesosomer er små kuler (0,05 pm), påvist ved hjelp av de samme elektronmikroskopiske fremgangsmåter som påviser lamellære legemer i dyrevev, som består av oligolamellære fosfolipid dobbeltlag og som er tilstede i de fleste bakterier. I levende bakterier kan de finnes i en rekke para-cellemembran og para-septale lokalisasjoner. Selv om de har blitt tilskrevet en rekke funksjoner, slik som intercellulær overføring av DNA, har deres egenskaper og betydning tiltrukket seg liten interesse. Det er imidlertid klart at skadete, døende eller døde mikroorganismer frigjør mange mesosomer som spres ut i de ødelagte cellulære strukturer i en lokal betennelse.

Mesosomer har derfor struktur som er identisk med liposomer og lamellære legemer, utelukkende oppbygget av fosfolipider (frie for kolesterol) og med en meget liten radius. Det er kjent at slike liposomer, på grunn av høy intramembran spenning, umiddelbart fusjonerer med større liposomer i alle blandinger av liposomer med varierende størrelse (RRC New 1991, p28). Det følger av dette mesosomer som frigjøres fra døende bakterier umiddelbart vil bli inkorporert i lamellære legemer som samles i nærheten av akutte betennelser. Fosfolipid dobbeltlag fra bakterier, enten fra mesosomer eller fra disintegrerende bakterielle cellemembraner, som bærer potensielt antigent materiale med proteiner eller peptider vil i dette området automatisk bli inkorporert i fosfolipid dobbeltlaget til de større "liposomer", dvs. de lamellære legemer som er tilstede i blandingen.

Den viktigste bestanddelen av Freunds komplette adjuvans, emulsifiserte cellevegger fra mykobakterier, anvender seg uten å vite om det av dette til nå ukjente fenomen, som forekommer i områder der en betennelsesreaksjon mot invaderende mikroorganismer oppstår. Basert på størrelse, sammensetning (lavt kolesterol) og oppfylling med antigen etterligner den foreliggende oppfinnelses fosfolipidblærer dette fenomen.

Varmesjokk ( stress) proteiner

Produksjon av varmesjokk proteiner (HSPer) er den universelle respons hos både prokaryote og eukaryote celler på den skadelige effekt av varme (Ritossa F, 1962, Kaufmann SHE, 1990). Det ble først antatt at HSP hadde blitt utviklet for å forhindre denaturering og utfolding av proteiner ved høy temperatur, men det ble senere vist at i tillegg til varme ga mange andre skader også en øket syntese av HSP, slik at begrepet "stress proteiner" ble innført. Det er nå klart at HSP er innblandet i en rekke viktige fysiologiske funksjoner, og at mange både er tilstede og er aktive i normale celler (Ellis J 1987, Pelham H 1988). Begrepet "molekylær chaperone" ble introdusert for å beskrive deres mer generelle funksjon som husholdningsproteiner i cellen (Ellis 1987, Pelham 1988). Siden de er blant de mest konserverte proteiner som er kjent i fylogenesen er det ikke overraskende at HSP også er viktige i immunreaksjoner (Kaufman 1990).

Det faktum at patogener og vertsorganismer anvender liknende mekanismer for å beskytte seg mot hverandre, og at dette oppnåes med liknende molekyler, passer godt inn i det generelle området for HSP funksjoner. At et enkelt molekyl omfatter epitoper som har potensiell relevanse for beskyttelse like ved siden av epitoper som har potensiell relevanse for patogenese, antaes å være en signifikant faktor i immunogenisiteten til disse proteiner (Kaufman 1990).

Kopling av overflateaktivt protein A ( SP- A) og 65 kDa mvkobakterielt HSP

Det er evidens for at mykobakterielle HSPer er en sterkt immunogen molekyltype i vertsforsvaret mot mykobakterielle infeksjoner (tuberkulose, lepra (spedalskhet)) hos menneske, og betydelig, men indirekte evidens antyder at de spiller en avgjørende rolle i autoimmunitet hos genetisk sensitive individer (inflammatorisk leddsykdom) (Dobbie et al., 1994).

Inntil nylig ble det antatt at "overflateaktivt protein", SP-A, som er et konstitutivt sekretorisk protein fra type II pneumocytter, bare var tilstede under produksjon, fordeling og metabolisme av SP-A i luftveiene. Det har nå uventet blitt funnet at store mengder av SP-A er tilstede i mange vev i kroppen. Først beskrevet som et apoprotein som var tett bundet til alveolære lamellære legemer, er det nå kjent at det alltid finnes i høye konsentrasjoner både i lungevev og i andre vev som spesialiserer seg på sekresjon av lamellære legemer (Dobbie et al.). SP-A har således blitt påvist i leddhinner (synovium), bukhinne, hjertesekkhinne, lungesekkhinne, hud, terminale tynntarm, kjertelutførselsganger (galle-, tåre-, spytt-), galleblære og prostata (Dobbie 1994). Det er av interesse at SP-A viser betydelig homologi med C1q komponenten i komplement kaskaden.

Mycobacteria er obligat avhengig av fosfolipid-næring. Det er derfor ikke tilfeldig at vev som utskiller de største mengder fosfolipid, som lamellære legemer (Dobbie and Pavlina) er de vev (lunge, ledd, serøse hulrom, terminale tynntarm, osv.) som er utsatt for primærinfeksjon av patogene mykobakterier. Mykobakterielle infeksjoner hos mennesker forekommer derfor i områder som viser høy produksjon av SP-A.

En slående forbindelse mellom SP-A og mykobakterielle HSPer har nylig blitt påvist med immunfarging, som viser samlokalisasjon av antistoff mot SP-A (PE 10, 5B8, 8H10) og mot mykobakterielle HSP (ML30) i celler som skiller ut lamellære legemer (Dobbie et al., 1994). Denne kopling har videre blitt vist i 'dot-blot' analyse av ML30 som reagerte med et renset SP-A-preparat, somm var blitt isolert på en Sepharose immun-affinitetssøyle koplet til de monoklonale antistoff 5B8 og 8H10. Dette indikerer at SP-A og mykobakterielle HSPer deler epitoper, dvs. homologe aminosyresekvenser. Dette ville være en fornuftig strategi fra de patogene mykobakterienes side, siden deres HSP derved oppnådde en relativ kamuflasje med sekvenser som deles med SP-A, siden de er nødt til å leve i fosfolipid-rike områder i vertsorganismen.

Det er etablert at alveolære celler er hovedcellene som er ansvarlige for fagocytose og resyklering av alveolært fosfolipid. Det er videre klart at SP-A er nødvendig for denne prosess, og tilsetting av SP-A til liposomer øker opptakshastigheten av liposomer inn i kulturer av type II pneumocytter. Vi har vist at makrofager i andre områder utenfor lungen med høy produksjon av lamellære legemer (ledd og kroppshulrom) også er de viktigste cellene som er innblandet i opptak av lamellære legemer og resyklering av fosfolipider. For eksempel har SP-A således med immuncytokjemi blitt påvist i betydelige konsentrasjoner i makrofager i disse områder. SP-A har blitt vist å forbedre opptak av lamellære legemer i minst en av de profesjonelle antigen-presenterende celler.

Vi konkluderer derfor at denne kopling mellom SP-A og mykobakterielle HSPer representerer en kraftig immunostimulant, og at denne involverer eukaryote og prokaryote proteiner som er i nære resiproke relasjoner mellom enkle fosfolipider, lamellære legemer som automatisk blir nydannet og dannet på nytt, og bakterielle mesosomer. Det blir videre antydet at denne mekanisme hos genetisk sensitive, immunologisk dysfunksjonelle individer er ansvarlig for å fremkalle visse former for autoimmunitet som er assosiert med dannelse av granulomer, der HSPer nylig har blitt presentert som mulige autoantigene mål i inflammatoriske leddsykdommer.

Aminosyresekvens- sammenligning mellom lamellært legeme- assosiert humant SP- A og mykobakterielle HSPer

Sammenligning mellom sekvenser fra SP-A fra lamellært legeme fra human lunge med M. leprae 65 kDa HSP ble gjort med anvendelse av 'multiple span' sammenligninger og Dayhoffs skår for å vektlegge passende aminosyrer. Den minimale lengde for å selektere autologe peptider var 10 aminosyrer, med to muligheter, - ingen delesjon, eller delesjon av samme eller mindre enn 3 aminosyrer innen tilpassete homologe peptider. SP-A har 150 aminosyrer, HSP 65 kDa har 540 aminosyrer. Som et neste trinn ble tilpasninger som viste mulige antigene subsekvenser utvalgt. To kriterier ble anvendt for å gjøre seleksjonen: Nærvær innen peptidet av en amfipatisk struktur som kunne representere en alfa-heliks, og nærvær av et av de to mønstre som blir observert i godt studerte antigene peptider. Disse to mønstre tilsvarer foretrukne sekvenser av aminosyrer basert på deres hydrofile, hydrofobe eller nøytrale karakter.

Sekvenser fra det 65 kDa antigen og SP-A, uten delesjoner, som viser homologi vises under:

M. leprae (164) R G I E K A V E K V T E (175)

SP-A (121) + + K + QC + + MY + D (132)

+=identitet, Y= Aminosyre med identiske fysikalsk-kjemiske karakteristika.

Denne sekvens i 65 kDa antigenet har blitt gjenkjent som en epitop av anti-M. leprae monoklonale antistoff (H9) (Shinnick et al. 1987). Syntetiske peptider med denne sekvens har blitt identifisert som en epitop involvert i humane T cellers gjenkjennelse av M. tuberculosis (Lamb et al., 1989).

En annen sekvens som viser homologi vises under:

M. leprae (175) VEESNTFGLQ LELTEG (191)

SP-A (80) + K KY + + Y AY * VG + + + + (94) ;+=identitet, Y= Aminosyre med identiske fysikalsk-kjemiske karakteristika, * delesjon.

Pasienter med kronisk leddgikt viser spesifikk T-lymfocytt-reaktivitet mot denne mykobakterielle epitop (van Eden 1988).

Rolle til HSP i å fange antigener og som chaperoner i dendrittiske celler.

Data som viser at vertscelle HSP har en viktig rolle i å initiere og forsterke immunrespons via deres effekt på profesjonelle antigen-presenterende celler, spesielt dendrittiske celler, har etter hvert blitt presentert (Colaco, 1998). Det er økende interesse for den immunstimulerende effekten av endogene HSPer, fremprovosert av tidlig frisetning av cytokiner for å gjøre det lettere for dendrittiske celler å fange antigener. Videre er det i økende grad akseptert at endogene HSPer fungerer som chaperoner som kanaliserer antigener til passende intracellulære cisterner og organeller for effektiv behandling av den antigene determinant.

Vår analyse av publiserte data om funksjonen til Freunds komplette adjuvans indikerer at mykobakterielle HSPer hos mennesker fremkaller en innebygget, rask og kraftig immunstimulering via de mekanismene som er beskrevet i detalj over. Mykobakterielle HSPer eller avledete peptider, bundet til eller inkorporert i lamellære legemer, fungerer altså ved å lette både deres binding og fagocytose.

Det blir videre fastholdt at peptidmotiver, deriblant de aminosyresekvenser som deles av 65 kDa, mykobakterielle HSPer og humant SP-A, frembringer de essensielle peptider som driver denne effektive kapringen og behandlingen av antigener i dendrittiske celler. Det blir derfor foreslått at lamellært legeme-lignende fosfolipidblærer, fylt opp med de nevnte motiver og et utvalgt antigen, vil benytte denne mykobakterielle HSP-immunostimulerende eller adjuvante egenskap for å stimulere autologe dendrittiske celler under vaksinasjon eller i immunterapi.

Den viktigste egenskap ved denne oppfinnelse er således tilførsel av peptider som utnytter en innebygget, tidlig og kraftig respons fra de antigen-presenterende celler, der et eller flere motiver fra et artskjent farlig patogen, dvs. mykobakterielle HSP peptider, garanterer umiddelbar oppmerksomhet og fanging av antigen når det presenteres sammen med disse motiver. Analysen antyder at den samme høye effektivitet som man ser ved Freunds komplette adjuvans vil kunne fremskaffes ved inkorporering av disse motiver i fosfolipidblærer sammen med det innlastete antigen, uten at det følger med mykobakterielt avfall og oljedråper.

Sammensetning av fosfolipidblærer som er primet med mykobakterielle HSP/ SP- A motiver

Fosfolipidblærer består av fosfolipider og kolesterol i de ratioer som er beskrevet over. Aminosyremotivene er tilstede som oppløste komponenter (opplistete konsentrasjoner) i normalt (0,9%) saltvann, som anvendes i hydreringsprosessen under fremstilling av fosfolipidblærene.

Immunstimulerte fosfolipidblærer som inkorporerer trehalose dimykolat til anvendelse ved kontrollert mikrogranulom vaksinering

Den foreliggende oppfinnelse frembringer også immunstimulerende fosfolipidblærer som inkorporerer trehalose dimykolat til kontrollert mikrogranulom vaksinering, fosfolipidblærer som inkorporerer SP-A peptid sekvens 77-110 for å presentere antigener til autologe profesjonelle og ikke-profesjonelle antigen-presenterende celler in vitro for å frembringe en immunterapeutisk respons hos en vert, og fosfolipidblærer som inkorporerer trehalose dimykolat og SP-A peptid sekvens 77-110.

Dokumenter som det henvises til:

Dobbie JW (1988) Ultrastructural similarities between mesothelium and Type II penumocytes and their relevance to phospholipid surfactant production by the peritoneum. In: Advances in Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis (Eds.: Khanna R, Nolph KD, Prowant B), University of Toronto Press, Toronto pp. 47-53.

Dobbie JW, Pavlina T, Lloyd J, Johnson RC (1988) Phosphatidylcholine synthesis by peritoneal mesothelium: its implications for peritoneal dialysis. Am. J. Kid. Dis. 12,31-36.

Dobbie JW, Lloyd JK (1989) Mesothelium secretes lamellar bodies in a similar manner to Type II pneumocyte secretion of surfactant. Perit. Dial. Int. 9: 215-219

Dobbie JW, Tasiaux N, Meijers P et al. (1994) Lamellar bodies in synoviocytes, mesothelium, and specific epithelia as possible sites for auto-antigen in rheumatoid disease. B J Rheum 33:508-519.

Dobbie JW, Hind C, Meijers P, Bodart C, Tasiaux N, Perret J, Anderson JD (1995) Lamellar body secretion: ultrastructural analysis of an unexplored function of synoviocytes. Br. J Rheum. 34:13-23.

Dobbie JW, Anderson JD (1996) Infrastructure, distribution and density of lamellar bodies in human peritoneum. Perit. Dial. Int. 16:482-487.

New RRC ed. (1990) Liposomes: A Practical Approach. Oxford University Press, New York, pp. 36-39.

Male D, Champion B, Cooke A, Owen M. (1991) In: Advanced Immunology. Second Edition. Gower Medical Publishing,London, New York. pp. 8.13-8.14.

Melman I, Turley SJ, Steinman RM. (1998) Antigen processing for amateurs andProfessionals. Trends Cell Biol. 8:231-235.

Tjoa B, Simmons S, Bowes V et al. (1998) Evaluation of Phase I/Il clinical trials in prostate cancer with dendritic cells and PSMA peptides. Prostate 36:39-44.

Banchereau J, Steinman RM (1998) Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392:245.

Colaco CALS (1998) Towards a unified theory of immunity: dendritic cells, stress proteins and antigen capture. Cell Mol. Biol. 44:883-890.

Markovicz S, Engelman EG (1990) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor promotes differentiation and survival of human peripheral blood dendritic cells in vitro. J Clin Invest 85:955-961.

Ritossa F (1962) Experientia 18:571-573.

Kaufmann SHE (1990) Heat shock proteins and the immune response. Immunology Today 1 1:129-136.

Ellis J (1987) Nature 328:378-379.

Pelham H (1988) Nature 332:776-777.

SEKVENSLISTER:

<110> Lamellar Therapeutics Ltd

<120> Immunotherapeutic methods and compositions <130> Adjuvant peptides

Claims (18)

1. Fosfolipidblære for å fremskaffe en immunrespons, idet fosfolipidblæren har en multilamellær, lamellær-legemelignende struktur og fosfolipidsammensetningen av fosfolipidblæren omfatter: fosfatidylcholin 44% til 60%, sfingomyelin 15% til 25%, fosfatidyletanolamin 6% til 10%, fosfatidylserin 2% til 6%, fosfatidylinositol 2% til 4% og kolesterol 4% til 12% der tallene er prosentdel per vektenhet, idet fosfolipidblæren har et eksogent antigen eller en polynukleinsyre kodende for et antigen deri, idet fosfolipidblæren er tilpasset og blir fagocytert av antigen-presenterende celler.

2. Fosfolipidblære ifølge krav 1, idet fosfolipidsammensetningen omfatter fosfatidylcholin 54%, sfingomyelin 19%, fosfatidyletanolamin 8%, fosfatidylserin 4%, fosfatidylinolsitol 3% og kolesterol 10% der tallene er prosentdel per vektenhet.

3. Fosfolipidblære ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, idet fosfolipidsammensetningen inkluderer lysolecitin.

4. Fosfolipidblære ifølge krav 3, idet fosfolipidsammensetningen inkluderer 0% til 3% per vektenhet lysolecitin.

5. Fosfolipidblære ifølge krav 3 eller krav 4, idet fosfolipidsammensetningen av blæren inkluderer 2% lysolecitin.

6. Fosfolipidblære ifølge krav 3 eller krav 4, idet blæren er et lamellær legeme isolert fra pattedyrskroppen.

7. Fosfolipidblære ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, for anvendelse som et vaksinemiddel.

8. Fosfolipidblære ifølge kravene 1 til 7, som har deri et protein som har en peptidsekvens som er homolog eller identisk med den angitt i sekvens ID NO 1 eller NO 2, og som videre har en ytterligere peptidsekvens som er homolog eller identisk med de som er angitt i sekvens ID NO 3 eller NO 4, idet det resulterende peptidet har evne til å virke som en adjuvans for å fremkalle en immunrespons.

9. Fosfolipidblære ifølge krav 8, idet peptidsekvensen som er homolog viser mellom 99% og 75% homologi med henholdsvis SEKV ID NO 1, SEKV ID NO 2, SEKV ID NO 3 eller SEKV ID NO 4.

10. Fosfolipidbærer ifølge krav 8, idet peptidsekvensen som er homolog viser 99% homologi med henholdsvis SEKV ID NO 1, SEKV ID NO 2, SEKV ID NO 3 eller SEKV ID NO 4.

11. Fosfolipidblære ifølge krav 8, som har deri et protein som har en peptidsekvens som angitt i sekvens ID NO 1 eller ID NO 2, og som videre har en peptidsekvens som angitt i sekvens ID NO 3 eller ID NO 4.

12. Fosfolipidblære ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, som har deri trehalose dimykolat.

13. Fosfolipidblære ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, som inkorporerer SP-A peptidsekvens 77 til 110 for presentering av antigen til autologe profesjonelle og ikke-profesjonelle antigen-presenterende celler in vitro for å påvirke en immunterapeutisk respons i en vert.

14. Fosfolipidblære ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, som inkorporerer trehalose dimykolat SP-A peptidsekvens 77 til 110.

15. Modifisert antigenpresenterende celler for indusering av en cellulær immunrespons som omfatter antigenpresenterende celler isolert fra et pattedyrlegeme, modifisert ved opptak av fosfolipidblærer ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12.

16. Modifisert antigenpresenterende celler ifølge krav 15, idet de antigenpresenterende cellene er dendrittiske celler.

17. Fremgangsmåte for inkorporering av antigener inn i dendrittiske celler, omfattende trinnet av å blande fosfolipidblærer ifølge kravene 1 til 7 med dendrittiske celler.

18. Farmasøytisk sammensetning for indusering av en immunrespons som omfatter en fosfolipidblære ifølge kravene 1 til 7, eller modifisert antigenpresenterende celler ifølge kravene 15 og 16 og farmasøytisk akseptabel bærer.