CN117979992A - 钩端螺旋体毒力调节蛋白及其用途 - Google Patents

钩端螺旋体毒力调节蛋白及其用途 Download PDF

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CN117979992A CN202280062844.1A CN202280062844A CN117979992A CN 117979992 A CN117979992 A CN 117979992A CN 202280062844 A CN202280062844 A CN 202280062844A CN 117979992 A CN117979992 A CN 117979992A
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Abstract

提供了钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白、或其包含DNA酶结构域的片段，以及它们作为疫苗和治疗剂的用途。还提供了包含多种VM蛋白的泛疫苗。

Description

钩端螺旋体毒力调节蛋白及其用途
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AI115658、AI108276和AI064466的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月6日提交的美国临时申请号63/230,244的优先权，在此通过引用将其全部并入本文。
背景技术
PF07598基因家族被鉴定为仅属于致病性钩端螺旋体(Fouts et al,2016,PLoSNegl Trop Dis.10(2):e0004403；Lehmann et al,2013,PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468.)。先前已知该基因家族的成员会因渗透压而上调，但目前尚不清楚该基因功能(Matsunaga et al,2007；Infect Immun,75(6):2864-2874)。已报道了在仓鼠模型中PF07598基因家族成员的体内上调(Lehmann et al,2013；PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468)，并且已报道在体内针对该基因家族的一个成员的人抗体反应(Lessa-Aquino,2017,PLoS Negl Trop Dis,11(1):e0005349)。此外，已经报道了问号钩端螺旋体血清型Manilae的随机转座子诱变(Marcsisin et al,2013,J Med Microbiol,62(Pt10):1601-1608)，但其功能仍然未知。
人钩端螺旋体病在发展中国家很常见，并且在工业化国家发病率有所增加。在实施有效的公共卫生应对措施方面只取得了有限的进展，并且没有注册用于人的疫苗。
本领域仍然需要具有针对致病性钩端螺旋体的疫苗潜力的新组合物。本发明满足了这一未满足的需求。
发明内容
在一个实施方式中，本发明涉及一种组合物，包含至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白或其包含DNA酶(DNase)结构域的片段。在一个实施方式中，至少一种VM蛋白是LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050或LMANV2_170091。
在一个实施方式中，本发明涉及一种融合蛋白，其包含钩端螺旋体VM蛋白或钩端螺旋体VM蛋白DNA酶结构域以及特异于结合靶分子的靶向结构域。在一个实施方式中，至少一种VM蛋白是LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050或LMANV2_170091。在一个实施方式中，靶分子是细菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、癌抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
在一个实施方式中，组合物包含两种或更多种钩端螺旋体VM蛋白的组合。在一个实施方式中，组合物包含LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091中两种或更多种的组合。在一个实施方式中，组合物包含LIC_12340和LIC_12985的组合。在一个实施方式中，组合物包含LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的组合。
在一个实施方式中，组合物包含至少一种钩端螺旋体VM蛋白，该蛋白包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一个实施方式中，组合物包含VM蛋白的组合，VM蛋白包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12中所示的序列。在一个实施方式中，组合物包含VM蛋白的组合，VM蛋白包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12所示的序列。
在一个实施方式中，组合物包含至少一种脂质纳米颗粒(LNP)，脂质纳米颗粒包含至少一种VM蛋白或含DNA酶结构域的VM蛋白片段。在一个实施方式中，组合物包含至少两种LNP的组合，LNP包含至少两种VM蛋白或含DNA酶结构域的VM蛋白片段。
在一个实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含至少一种核酸分子，该核酸分子编码至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白或其包含VM蛋白的DNA酶结构域的片段。在一个实施方式中，VM蛋白是LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050或LMANV2_170091。
在一个实施方式中，核酸分子编码融合蛋白，该融合蛋白包含与特异于结合靶分子的靶向结构域融合的钩端螺旋体VM蛋白或含VM蛋白的DNA酶结构域的片段。在一个实施方式中，靶分子是细菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、癌抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
在一个实施方式中，核酸分子编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中的至少一种氨基酸序列。在一个实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18中的至少一种核苷酸序列。
在一个实施方式中，组合物包含编码LIC_12340和LIC_12985的组合的一种或多种核酸分子。在一个实施方式中，组合物包含编码SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的组合的一种或多种核酸分子。在一个实施方式中，组合物包含含有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的组合的一种或多种核酸分子。
在一个实施方式中，组合物包含编码LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的组合的一种或多种核酸分子。在一个实施方式中，组合物包含编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的组合的一种或多种核酸分子。在一个实施方式中，组合物包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的组合的一种或多种核酸分子。
在一个实施方式中，组合物包含至少一种脂质纳米颗粒(LNP)，脂质纳米颗粒包含编码至少一种VM蛋白或其包含DNA酶结构域的片段的至少一种核酸分子。在一个实施方式中，核酸分子包含mRNA分子，该mRNA分子编码至少一种VM蛋白或其包含DNA酶结构域的片段。
在一个实施方式中，组合物包含疫苗。
在一个实施方式中，组合物包含佐剂。在一个实施方式中，佐剂是以稳定的水包油纳米乳液(SE)配制的吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
在一个实施方式中，本发明涉及一种在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括给予受试者包含至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白或其含DNA酶结构域的片段的组合物或包含编码至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白或其含VM蛋白的DNA酶结构域的片段的至少一种核酸分子的组合物。在一个实施方式中，受试者当前感染有钩端螺旋体属，并且组合物诱导针对钩端螺旋体属的免疫应答。
在一个实施方式中，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，其包括给予受试者包含至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白或其含DNA酶结构域的片段的组合物或包含编码至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白或其含VM蛋白的DNA酶结构域的片段的至少一种核酸分子的组合物。在一个实施方式中，疾病或病症是癌症、细菌感染、病毒感染或寄生虫感染。
在一个实施方式中，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，其包括给予受试者包含至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)抗体的组合物或包含编码至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)抗体的至少一种核酸分子的组合物。在一个实施方式中，疾病或病症是钩端螺旋体病。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的实施方式。然而，应该理解的是，本发明不限于附图中所示实施方式的精确布置和手段。
图1描绘了泛疫苗挑战研究设计。
图2描绘了泛疫苗挑战研究的实验时间表。
图3描绘了示例性实验数据，其展示了免疫的C3H/HeJ小鼠在致死挑战(低传代问号钩端螺旋体血清型Canicola)后受到泛疫苗的保护免于死亡/体重减轻。5种抗原的混合物：LA3490、LA0620和LA1402的全长mCherry融合体，以及全长LIC12340和LIC12985。2种抗原的混合物：全长LIC12340和LIC12985。比较基因组分析表明，这些蛋白质在所有致病性钩端螺旋体(包括(不仅限于)问号钩端螺旋体)中高度保守，使得这些蛋白质同源物可能具有相似的功能，并且对包括针对这些和同源蛋白质开发的疫苗、药物和生物制品在内的预防和治疗干预措施具有相似的敏感性。
图4描绘了致死挑战后用泛钩端螺旋体病疫苗免疫的小鼠的死亡/体重减轻的统计分析。
图5描绘了示例性实验数据，展示了与PBS阴性对照相比，VM蛋白疫苗减少了肾脏中的细菌负荷。通过Kruskal-Wallis检验和邓恩氏多重比较事后检验对数据进行统计分析，将所有条件与PBS治疗的小鼠进行比较，以比较多个组(**，p<0.01；***，p<0.001)。不同疫苗组之间肾脏中的细菌负荷存在差异(Kruskal-Wallis检验，P＝0.0003***)。
图6描绘了用VM蛋白疫苗免疫后肾脏中细菌负荷的统计分析。
图7描绘了示例性实验数据，展示了与PBS阴性对照相比，VM蛋白疫苗减少了肺中的细菌负荷。
图8描绘了用VM蛋白疫苗免疫后肺中细菌负荷的统计分析。
图9描绘了展示在挑战前交叉反应性VM蛋白抗体的检测的示例性实验数据。t检验，非参数、未配对、双尾、Mann Whitney检验，p<0.05，p<0.0001。
图10A和图10B描绘了对AlphaFold衍生的VM蛋白三维结构的评估和计算验证。图10A描绘了使用Zlab(zlab.umassmed.edu/bu/rama/)在线服务器评估基于人工智能衍生的VM蛋白三维结构的拉氏图分析。这提供了允许和不允许的扭转角值区域的概述，其作为蛋白质结构品质和三维确认稳定性的重要指标。残基98.211(LA3490)、96.59(LA0620)、98.59(LA1400)、95.11(LA1402)和96.32(LA0591)的百分比在有利区域(核心β)，1.78(LA3490)、2.50(LA0620)、1.20(LA1400)、4.70(LA1402)和2.57(LA0591)处于允许范围(核心-α)，并且0.00(LA3490)、0.896(LA0620)、0.20(LA1400)、0.18(LA1402)和1.13(LA0591)处于异常值(核心左手α)。图10B描绘了使用在线PROVE分析服务器计算的Z分数平均值、Z分数标准差和Z分数RMS。
图11A和图11B描绘了展示问号钩端螺旋体血清型Lai中的VM蛋白中QxW基序的结构和序列表示的实验结果。图11A描绘了LA3490 VM蛋白的AlphaFold生成的高分辨率3D结构，其显示了编码表面芳香斑块的氨基酸(红色：酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)。蓝色代表在N末端RBL1结构域的QxW基序。图11B描绘了显示三个保守的QxW基序(蓝色：40QKP42、134QRW136和78QCW80)的RBL1结构域，其中134QRW136基序在蓖麻毒素B链中也是保守的。芳香族基序158YGY160在VM蛋白和蓖麻毒素B链中高度保守。
图12A和图12B描绘了展示VM蛋白的RBL2与CARD毒素(D3结构域)的结构和功能相似性的实验结果。图12A描绘了LA3490 VM蛋白的RBL2结构域(绿色：196aa-335aa)在结构上与具有RMSD 的CARD毒素(PDB：4TLV_A链，粉色)的C末端叠加。图12B描绘了CARD毒素的C末端(D3结构域)编码8个色氨酸，而LA3490 VM蛋白编码9个色氨酸。其中六个色氨酸在结构上在CARD毒素的C末端和RBL2结构域中叠加。
图13A至图13E描绘了展示LA3490 VM蛋白和蓖麻毒素中二硫键的代表性和相似性的实验结果。图13A描绘了AlphaFold算法生成的LA3490的3D带状结构，通过配对10个半胱氨酸残基显示了5个二硫键。图13B描绘了蓖麻毒素(PDB:2AAI)，其通过配对10个半胱氨酸残基显示出5个二硫键。图13C描绘了与LA3490的CBR(RBL1)叠加的蓖麻毒素B链以及二硫键结合，然而，蓖麻毒素A链不与LA3490的C末端结构域叠加。图13D描绘了LA3490(洋红色：Cys62 aa-Cys79 aa、Cys105 aa-Cys127aa、Cys244 aa-Cys262 aa、Cys353 aa-Cys608 aa和Cys630 aa-Cys635 aa)和蓖麻毒素(紫色：Cys4 aa-Cys259 aa、Cys151 aa-Cys164 aa、Cys20 aa-Cys39 aa、Cys62 aa-Cys79 aa、Cys63 aa-Cys80 aa、Cys105 aa-Cys127aa、Cys244 aa-Cys262 aa之间的二硫键类拟模式的叠加。图13E描绘了LA0591中在位置Cys303-Cys308处显示的单二硫键的存在。
图14A至图14D描绘了LA3490 VM蛋白的CTD(羧基末端结构域)中的热点和配体结合残基的评估。图14A描绘的数据展示，基于FTMap机器学习的算法显示了基于高结合能亲和力的热点残基及其与簇相互作用的数量。图14A描绘的数据展示，热点残基(Arg615、His533、Cys403、Gln486、Thr549和Gln523)以三维视图显示了与配体结合。图14C描绘的数据展示，LA3490的CTD表面视图显示了配体与深袋中的热点残基的结合。图14D描绘的数据展示，LA3490的CTD和牛DNA酶(3DNI)的结构叠加显示了His533(LA3490)与牛DNA酶的催化残基His134重叠。
图15A至图15C描绘了VM蛋白的全长和C末端结构域中基于FTMap的热点残基的比较演示。图15A描绘的数据展示，AlphaFold生成的全长VM蛋白(LA3490、LA0620、LA1402和LA1400)结构显示了具有高结合能并且与簇具有大量相互作用的氨基酸。图15B描绘了直方图，显示了具有显示出与簇大量相互作用的高结合能氨基酸的VM蛋白(LA0620、LA1400、LA1402和LA0591)的羧基末端结构域(CTD)。图15C描绘了VM蛋白的CTD的三维视图，显示了配体结合位点。
图16A至图16D描绘了对LA3490 VM蛋白的配体结合位点的基于PrankWeb和Deepsite的评估。图16A描绘了提交给ParnkWeb的基于AlphaFold算法的全长LA3490 PDB文件。基于机器学习的工具识别出14个深配体结合口袋，且最高得分(18.39)的口袋1以蓝色显示具有溶剂可及表面(SAS)，并且下图显示了进化保守的口袋的位置。图16B描绘了LA0591，显示了最高得分为15.64的五个口袋，口袋1以蓝色显示具有溶剂可及表面(SAS)，并且下图显示了进化保守的口袋的位置。基于Deepsite机器学习的算法显示深袋中的His533残基作为LA3490(图16C)和LA0591(图16D)的表面上代表的交互式氨基酸。
图17描绘了LA3490和牛DNA酶中热点残基和配体结合位点的比较评估。
图18A至图18F展示了二价阳离子对VM蛋白的DNA酶活性的影响。将HeLa DNA(150ng)与30nM纯化的可溶性重组VM蛋白(t3490、LA3490、LA0620、LA1402、LA1400和LA0591)在含有3mM MgCl2(图18A)、不存在(二价阳离子)MgCl2(图18B)存在2mM ZnCl2(图18C)、存在3mM CaCl2(图18D)、存在CaCl2+3mM MgCl2(图18E)的TM缓冲液(10mM Tris pH-7.4)中温育30分钟，并且使样品经受1％琼脂糖凝胶电泳。通过DNA的拖尾和消失指示了VM蛋白的DNA酶活性；t3490、t0620无此效果。(图18F)使用MGLTools 1.5.7的对接研究显示，磷酸根离子和镁离子与Gln412(结合能-0.95kCal/mol)和Arg615(结合能-2.58kCal/mol)相互作用。
图19A至图19C展示了DeepMind AlphaFold算法衍生的结构、重组His标记VM蛋白的克隆、纯化和抗原性策略。图19A描绘了使用AlphaFold算法的(LA3490、LA0620、LA1402、LA1400和LA0591)的基于人工智能的高分辨率结构建模。图19B描绘了描绘当前研究中使用的重组mCherry(mC)融合VM蛋白的组织的示意图；t3490，氨基酸位置40aa-147aa(减去信号序列)；LA3490(19aa-639aa)、LA0620(32aa-637aa)、LA1402(28aa-641aa)、LA1400(1aa-573aa)和LA0591(23aa-313aa)。克隆的设计没有信号序列。LA1400自然缺乏信号序列。重组融合体包括甘氨酸-丝氨酸(Gly4S)3接头(用于柔性)、N-末端和C-末端His6标签(纯化)以及N-末端硫氧还蛋白。图19C描绘了通过4±12％SDS-PAGE随后是考马斯染色来分析AKTA纯化的可溶性His-标记的VM蛋白(LA3490、t3490、LA0620、LA1402、LA0591和LA1400)。运行复制凝胶进行免疫印迹分析。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用小鼠抗-His单克隆-ALP缀合物(1:2,000稀释；Santa Cruz Biotechnology，USA)探测印迹。M代表分子量标志物。
图20描绘了小鼠免疫时间表和样品收集。C3H/HeJ小鼠分别在第0、21和42天通过肌内途径用25μg总抗原和佐剂(5μg GLA-角鲨烯-水包油乳液)进行免疫。在每次免疫之前且在挑战感染之前对它们进行预抽血，并且在尸检当天获取血液。对照小鼠用PBS缓冲液加佐剂进行免疫。在第52天免疫后，小鼠通过腹膜内途径用活问号钩端螺旋体血清型Canicola(～1x105个钩端螺旋体，LD50<100)感染。在后续感染后收集血液和器官。
图21A至图21C描绘了展示用问号钩端螺旋体血清型Canicola挑战的小鼠的体重变化、细菌负荷和促炎细胞因子应答的数据。图21A描绘了从感染后0天到13天记录的小鼠体重(变化％)；还观察了临床状态(梳理、食物、饮用、能量水平)的同时评估。在第6天和第5天处死G-I和G-II小鼠(和/>)。使用双尾未配对Mann-Whitney T-检验进行统计分析以确定PBS对照组和疫苗接种组之间体重的统计显著性。p值：VM混合物比PBS，549p-0.0152*：VM未标记的比PBS，p-0.0005*：VM未标记的比VM混合物，p<0.0001****：t3490比PBS，p-0.3869，ns。误差线表示标准误差。从肾脏(图21B)和肝脏(图21C)中提取总基因组DNA，并通过使用lipL32引物和SYBER Green探针一式两份进行的qPCR进行分析，以量化钩端螺旋体组织负荷。使用Kruskal-Wallis检验和邓恩氏多重比较检验进行统计分析。p<0.0001被认为是显著的。图21D描绘了来自各组的混合血清样品中的促炎细胞因子应答：通过V-PLEX促炎1组小鼠试剂盒(Meso Scale Discovery，MD，USA)(一种基于电化学发光的免疫测定法)，使用G-I(PBS对照)、G-II(t3490)、G-III(5种VM蛋白的混合物)和G-IV小鼠(2种VM蛋白的混合物)挑战前和挑战后来测量IL-1β、IL-6、IL-5、IL-10、IFN-y、TNF-a、KC/GRO的水平。PIB表示免疫前采血。
图22A和图22B描绘了展示对重组VM蛋白免疫的IgG应答的数据。图22A描绘的数据表明，使用ELISA一式三份地在每个研究组中在挑战前和挑战后针对个体VM蛋白测量了抗体滴度。每条数据线代表每只动物的平均IgG应答(n-10)。箱线图和须状图分别代表针对t3490、LA3490、LA0620、LA1402、LA1400和LA0591的抗体滴度。四个研究组包括G-I:PBS、G-II:t3490、G-III:VM混合物和G-IV:VM未标记的。箱边界表示中位数和四分位数范围，并且须线表示最大值和最小值。通过t检验和非参数、非配对、双尾Mann Whitney检验进行统计分析。p<0.0001值被认为是显著的。图22B描绘的数据表明，来自免疫重组纯化的VM蛋白的等分试样在4±12％SDS-PAGE中运行，然后转移至硝酸纤维素膜以进行蛋白质印迹分析。用挑战后收集的1:500混合血清探测膜。PIB表示免疫前采血，用作对照。通过来自G-II、G-III和G-IV的血清识别VM蛋白。泳道1显示了VM混合蛋白(LA3490、LA0620、LA1402、LA1400和LA0591)，并且泳道2显示了VM未标记的蛋白(LA1400和LA0591)。箭头显示了VM蛋白的预期大小。M代表分子量标志物。
图23A和图23C描绘了展示通过来自免疫的小鼠组的血清对钩端螺旋体无细胞裂解物中VM蛋白的体外和体内识别的数据。致病性问号钩端螺旋体血清型Canicola、Lai、Copenhagni和非致病性双曲钩端螺旋体血清型Patoc在条件EMJH培养基中生长，在对数期用120mM NaCl诱导4小时，并收获非条件EMJH培养基和细胞。通过4-12％SDS-PAGE分析无细胞裂解物，然后将其转移到硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹分析。图23A描绘了展示用多克隆LA3490抗体(1:2,000稀释)和用作上样对照的LipL32单克隆抗体(1:10,000)探测膜的数据。图23B描绘了展示用在免疫前(预采血)和在挑战组I(PBS+佐剂)、组II(t3490)、组III(VM混合物)和组IV(VM未标记的)之后收集的混合血清(1:100稀释)探测另一组膜的数据。图23A和23B展示，钩端螺旋体在未添加NaCl的EMJH培养基中生长，由减号(-)表示，并且钩端螺旋体在EMJH培养基中生长至对数期，此时添加120nM NaCl，由加号(+)表示。箭头指示了70.29kDa原生VM蛋白的表达。图23C描绘了展示在C3H/HeJ可疑小鼠的实验性感染后，针对血清型Canicola产生的抗钩端螺旋体免疫球蛋白的数据。使用预采血和挑战后免疫小鼠的血清进行全细胞IgG ELISA。血清型Patoc作为阴性对照。
图24描绘了I组致病性钩端螺旋体中PF07598基因家族成员的直系同源物和氨基酸相似性百分比的表格。
图25描绘了展示单克隆上清液(YUSM001B)与重组VM蛋白的反应性的数据。
图26描绘了显示用来自YUMS1B的五个克隆针对500nM浓度的靶抗原LA0591进行的侦察结果的表格。
图27描绘了来自YUMS1B的五个克隆的反应性的总结。
图28描绘了展示单克隆上清液(YUSM001A，LA1400)与重组VM蛋白的反应性的数据。
图29描述了验证性筛选数据的表格。
图30描绘了YUSM001A和YUSM001B小鼠IgG定量数据的表格。
图31A至图31C描绘的数据表明，钩端螺旋体PF07598基因家族成员(此处由LA3490代表)被以高置信度预测为具有两个串联重复的N-末端蓖麻毒素B-样(RBL)凝集素结构域。图31A描绘了全长LA3490的AlphaFold 3D-生成的模型的可视化(Callaway，2020；Jumperet al.,2020；Senior et al.,2020)，显示了四个球状结构域N-末端到C-末端(蓝色到红色)残基在PyMOL 2.4.0pymol.org/2/中被可视化。Phyre2(蛋白质折叠预测服务器；sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id＝index)首先以高(>94％)置信度预测，LA3490以及由PF07598基因家族编码的所有其它毒力修饰(VM)蛋白含有N末端b-三叶形折叠，被鉴定为蓖麻毒素B结构域。图31B描绘了蓖麻毒素B结构域(PBD；2AAI-B，7aa至129aa)。图31C描绘了使用PyMOL(TM)2.4.0进行2AAI-B与LA3490的N末端区域(即氨基酸位置40-150)的叠加，显示了RBL1和蓖麻毒素B链的结构保守性
图32A至图32D描绘了展示描绘(直系同源)VM蛋白簇的三维度量多维标度(3DMMDS/Galaxy)图的数据。使用bios2mds(Pele et al.,2012)鉴定了所分析的940个PF07598家族VM蛋白中的簇，并使用R中的主成分分析进行可视化。除了典型的PF07598旁系同源物之外，还包括缺乏蓖麻毒素B-样凝集素、RBL、子结构域的42种天然缺乏突变体(即仅含有氨基末端信号序列和毒素结构域)。图32A描绘了糖类结合区域(CBR)，其含有两个不同的串联RBL子结构域。图32B描绘了包含离散运输和DNA酶子结构域的羧基末端毒素结构域(CTD)。两者都对初始渲染进行了编辑(仅进行了外观更改)，以通过增强3D效果来辅助可视化。坐标没有改变。突出显示了在问号钩端螺旋体中发现的含有VM蛋白变体的簇(大球体)，并使用参考问号钩端螺旋体血清型Copenhageni菌株(PMID 15028702)、L1-130(UniProtKB)蛋白ID命名。基于同一性百分比(PID)，将直系同源簇分组为三个包含VM蛋白旁系同源物的超簇(A，n＝2；B，n＝7；和C，n＝4)。颜色键使用以下约定：对于物种，问号钩端螺旋体(ins)、kirschneri钩端螺旋体(kri)、野口氏钩端螺旋体(nii)等；对于血清型，例如Canicola(CLA)、Lai(LAI)、Hardjo(HJO)等；以及对于源自斯里兰卡的菌株，例如问号钩端螺旋体血清型未知菌株KW1(KW1)等。图32C描绘了显示VM蛋白家族的理论进化历史的示意图，涉及横向转移(LGT)、基因复制(紫色箭头，II)和侵蚀(实心黑色箭头)以及重组(蓝色箭头＝通过横向基因转移获得的供体，I；虚线箭头指示来自密切相关的旁系同源的基因组内供体)。圆圈代表理论上随时间演变的VM蛋白；方块代表当前时间的最终进化形态。图32D描绘了由属于密切相关的CBR簇的旁系同源物的CBR和CTD结构域融合产生的嵌合钩端螺旋体VM蛋白的结构域组织和连接，例如与Q72NW3(例如WP.017856587.1)和Q72TZ4(例如QHH71994.1)相关的那些(～99.1％PID)。这些天然VM蛋白变体在问号钩端螺旋体及其姐妹物种kirschneri钩端螺旋体和野口氏钩端螺旋体中很少出现(～2％)。无论所代表的旁系同源物，嵌合VM蛋白通常共享共同的连接。
图33A至图33D描述了展示VM蛋白LA3490是真正的R型凝集素的数据。图33A描绘了描绘当前研究中使用的重组mCherry(mC)融合蛋白的组织的示意图；t3490，氨基酸位置40-147aa(减去SS，信号序列)；和rLA3490，19-639aa，也缺乏SS。重组融合物还包括甘氨酸-丝氨酸接头和C末端His6标签(纯化)以及N末端硫氧还蛋白。RBL和CTD分别命名蓖麻毒素B-样凝集素和羧基末端结构域。图33B描绘了脱唾液酸胎球蛋白结合测定，展示了截短的(t3490)和全长(rLA3490)VM蛋白以类似于市售蓖麻毒素B链的剂量依赖性方式结合脱唾液酸胎球蛋白。图33C描述了竞争测定，显示截短的(t3490)、另一种VM蛋白LA0620的蓖麻毒素B结构域(t0620)和全长(rLA3490)竞争与重组蓖麻毒素B链相同的结合位点(25nM和50nM)。使用ELISA形式在微量滴定板中进行测定。小鼠多克隆抗-LA3490和抗-LA0620抗体(1:1,000稀释)用作一抗，并且抗小鼠IgG用作二抗(单独用作特异性对照，标记为2Ab对照)。图33D描绘了在120mM NaCl存在下，由问号钩端螺旋体血清型Lai分泌到EMJH培养上清液中的原生LA3490(70.29kDa)与脱唾液酸胎球蛋白偶联的琼脂糖珠(AFS)结合。用0.5M乳糖洗脱蛋白。将未缀合的琼脂糖珠与问号钩端螺旋体血清型Lai-条件培养基一起温育，并将AFS珠与PBS一起作为对照。测定进行一式三份，并且实验重复两次。在GraphPad Prism 8中可视化平均吸光度(±SEM)，并且其在p<0.05时被认为具有统计显著性。
图34A至图34C描绘了展示确认重组蛋白制品的身份和纯度的蛋白质免疫印迹和鲎变形细胞裂解物测定的数据。图34A和图34B描绘了重组蛋白制品的蛋白质印迹，确认了预期大小的单个条带(A，t3490，B.rLA3490)的存在。用抗-His6(泳道2)和多克隆抗-LA3490抗体(泳道3)探测膜。M-分子量标志物。图34C使用大肠杆菌LPS作为阳性对照的鲎变形细胞裂解物测定，表明没有明显的内毒素污染。在GraphPad Prism v8中将数据可视化。
图35A至图35F描绘了展示rLA3490的细胞病变效应的数据。图35A描绘了通过台盼蓝染料排斥评估的由r3490诱导的剂量依赖性HeLa细胞死亡。阴性对照、t3490、BSA以及未处理没有此类效果。用分级摩尔比剂量(0至904nM)的LA3490、t3490和BSA将单层细胞处理4小时。数据代表在每种条件下一式三份进行的两次独立实验的平均值±SD，(配对t检验，*p<0.005)。图35B描绘了显示在暴露于45nM的rLA3490和对照之后HeLa细胞的细胞病变效应的延时相差显微镜图像(40帧，5秒间隔)。仅在使用rLA3490时，从1小时起，细胞起泡才明显[在缩放视图中可见(左上和右上图，黑色箭头)]。使用Leica DMi8倒置显微镜使用×40物镜捕获延时成像。比例尺，10mm。图35C描绘了rLA3490处理后早期发生的肌动蛋白解聚。将HeLa细胞单层与45nM的rLA3490、t3490和BSA温育长达1小时。将单层用4％多聚甲醛固定，然后在PBS透化中进行0.1％Triton X-100固定。将单层与鬼笔环肽-Alexafluor-488nm缀合物一起温育，洗涤，然后用带有DAPI的ProLongTM Gold Antifade Mountant封片。使用Leica DMi8共焦显微镜[Alexa_488nm(绿色)，DAPI(蓝色)]在×40放大倍数下拍摄图像。未经处理的HeLa细胞作为对照。比例尺，20mm。图35D描绘了通过荧光活/死染色评估的由rLA3490诱导的HeLa细胞死亡。阴性对照(t3490、BSA和未处理)没有这种效果。在暴露于45nM rLA3490(左上图)和t3490(左下图)4小时后，对HeLa细胞单层进行活/死染色。在用rLA3490(而非t3490或BSA)处理后，观察到贴壁细胞急剧减少，并伴随死亡细胞的积累。使用Leica DMi8倒置显微镜以×10放大倍数拍摄图像。比例尺，100mm。图35E描绘了与阴性对照暴露(t3490、BSA和未处理)相比，暴露4小时后，LA3490-诱导的HeLa细胞从单层脱离的定量。rLA3490暴露1小时后，细胞明显从单层分离。图35F描绘了与阴性对照相比，用rLA3490处理后由乳酸脱氢酶释放引起的时间依赖性HeLa细胞死亡的量化。在GraphPad Prism 8中使用单向t检验对各组进行比较，并认为p<0.05具有统计学显著性；ns，不显著。**表示具有统计显著性，p＝0.0054。
图36A至图36C描绘了展示rLA3490处理HeLa细胞后半胱天冬酶活化的数据。超分辨率共聚焦荧光显微镜显示，将rLA3490-mCherry融合蛋白添加到HeLa细胞中会导致与重组蛋白的内化相关的半胱天冬酶-3活化，这通过产生绿色荧光的半胱天冬酶-3识别序列/底物(DEVD)的切割来证实。与阴性对照t3490或未经处理的HeLa细胞不同，这种共定位还显示出细胞核的显著形态变化(图36A-图36B)。简而言之，用45nM重组融合蛋白处理细胞单层4小时。细胞用含有10μM488底物的PBS洗涤和染色，然后用ProLongTMGoldAntifade Mount加DAPI封片。使用适当的滤光片(蓝色，DAPI；绿色，半胱天冬酶-3活性细胞；和红色，mCherry融合物)使用63x油浸物镜拍摄图像。图36B描绘了放大视图，表明与t3490不同，rLA3490在细胞核中的共定位和半胱天冬酶-3活化导致细胞凋亡。图36C描绘了展示半胱天冬酶-3抑制剂的影响的数据，并且在分光光度计酶标仪上在488/520nm(激发/发射)处读取活性半胱天冬酶-3荧光。先前使用半胱天冬酶-3抑制剂治疗HeLa细胞可减弱rLA3490对凋亡细胞的影响。在GraphPad Prism 8中通过t检验评估了各种处理，并且当p<0.05时认为显著，ns＝不显著。
图37A至图37C描绘了展示HeLa细胞中rLA3490的表面结合和核定位的数据。荧光共聚焦显微镜展示了mCherry-rLA3490和mCherry-t3490融合蛋白与HeLa细胞结合的动力学。图37A描绘了二维视图，在60分钟时，t3490仅在细胞表面上可见(红色)；rLA3490在60分钟内被内化(红色/粉色)。图37B描绘了通过高分辨率荧光共聚焦显微镜获得的三维Z-堆栈和正交图像，显示mCherry-rLA3490融合物从30分钟开始内化，在60分钟内核易位和染色体降解(通过斑片状DAPI染色显示，右下)明显。在30和60分钟时，t3490保留在细胞表面上。使用CellMaskTM绿色质膜染色剂染色后，使用ProLongTM Gold Antifade Mountant+DAPI核染色剂封片，对处理的细胞进行可视化。使用适当的滤光片(蓝色，DAPI；绿色，质膜；红色，mCherry融合物)使用油浸×100物镜拍摄图像。图37C描绘了mCherry-标记的rLA3490和t3490蛋白与HeLa细胞的时间依赖性相互作用(表面结合加内化)。使用荧光共聚焦显微镜(使用ImageJ1.53版软件)来量化HeLa细胞单层的重组融合蛋白。将单层暴露于45nM重组融合蛋白或对照长达60分钟。从0至60分钟以10分钟间隔测量mCherry-t3490和mCherry-LA3490融合蛋白的荧光强度。在GraphPrism 8中将数据可视化。
图38A至图38F描述了展示钩端螺旋体VM蛋白的DNA酶活性的数据。图38A描绘了将来自HeLa细胞的150ng DNA在含有3mM Mg2+的TM缓冲液中温育指定剂量和时间后观察到的rLA3490的DNA酶活性(反应中不存在Mg+2不产生DNA降解)。对样品进行1％琼脂糖凝胶电泳。DNA酶活性rLA3490通过DNA的拖尾和消失来指示；t3490没有这样的效应。图38B描绘了展示其它重组VM蛋白(LA0620、LA1400、LA1402和LA0591)均具有相似的DNA酶活性的数据。图38C描绘了400ng未消化的质粒pET28上rLA3490的DNA酶活性，显示出随着展开、线性化和部分降解而部分降解，并且不受t3490的影响，如白色箭头所示。图38D描绘了线性化质粒上rLA3490的DNA酶活性，显示线性和松弛质粒的完全消失，具有剂量和时间依赖性拖尾。L，DNA梯子。图38E描绘了使用实时PCR和FAM荧光探针对rLA3490 DNA酶活性的定量。将牛DNA酶，0.02U/ml用作阳性对照。数据代表三个独立实验的平均值±SD。图38F分别描绘了AlphaFold生成的LA3490和LA0591的CTD的叠加。尽管如图1A所示，LA3490代表了绝大多数具有两个RBL、CTD和干预功能序列的VM蛋白，而LA0591缺少RBL1和RBL2但含有其余的功能序列。由LA0591代表的该旁系同源物仅完全存在于问号钩端螺旋体物种中，但不存在于其它致病性I组钩端螺旋体中。尽管氨基酸序列存在差异，但LA3490和LA0591的CTD预计在结构水平上高度保守，如的RMSD值所示。
图39A和图39B描绘了LA3490的CTD拥有与牛DNA酶I相同的保守活性位点残基。图39A描绘了使用phylogeny.fr生成的基于来自LA3490的CTD、牛DNA酶I(uniport ID:P00639)、小鼠DNA酶1(P49183)、大鼠DNA酶1P21704、人DNA酶I(P24855)、大肠杆菌_CdtB(Q46669)和人核酸内切酶(P27695)的氨基酸序列比对的系统发育树。比例尺，每个氨基酸位点一个取代。数字表示通过100个替代树的自展分析确定的分支顺序的统计可靠性。图39B描绘了LA3490的CTD(368-639aa)和牛DNA酶(PDB:3DNI)的叠加，预测了牛DNA酶I的活性位点中的结构相似性，RMSD为
具体实施方式
本发明涉及钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白及其变体和片段，以及包含它们的疫苗组合物。本文证明，钩端螺旋体VM蛋白是免疫原性的，并因此可以用作疫苗或免疫原性组合物以治疗或预防有需要的受试者的钩端螺旋体病。
在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含至少一种毒力修饰(VM)蛋白或其片段或变体。在一个实施方式中，至少一种VM蛋白来自问号钩端螺旋体血清型(L.interrogans serovar)Lai、问号钩端螺旋体血清型Copenhageni、问号钩端螺旋体血清型Manilae或其组合。在一个实施方式中，至少一种VM蛋白是LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091、或其片段或变体。
在一个实施方式中，本发明涉及一种包含至少两种、三种、四种、五种或多于五种VM蛋白的组合的疫苗。在一个实施方式中，疫苗包含LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091、或其片段或变体中的至少两种、三种、四种、五种或多于五种的组合。在一个实施方式中，疫苗包含LIC_12340和LIC_12985的组合。在一个实施方式中，疫苗包含LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的组合。
在另一个实施方式中，本发明的组合物包含编码至少一种VM蛋白、其片段或其突变体的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的组合物包含编码至少一种VM蛋白的核酸序列，至少一种VM蛋白是LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091、或其片段或变体。在一个实施方式中，本发明的组合物包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091、或其片段或变体中的至少两种、三种、四种、五种或多于五种的组合。在一个实施方式中，该核苷酸序列编码LIC_12340和LIC_12985的组合。在一个实施方式中，该核苷酸序列编码LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的组合。
在一个实施方式中，本发明提供了用于诱导或增强免疫应答的组合物和方法。例如，在某些实施方式中，本发明涉及诱导或增强针对所需抗原的细胞介导的和/或体液免疫。
在一个实施方式中，本发明的组合物充当抗原以诱导针对钩端螺旋体属细菌的免疫。在某些实施方式中，该组合物和方法用于预防、治疗和诊断钩端螺旋体感染。在某些实施方式中，组合物和方法用于预防或治疗与钩端螺旋体感染相关的疾病或病症，疾病或病症包括但不限于钩端螺旋体病、肾损伤、脑膜炎、肝功能衰竭、呼吸窘迫和甚至死亡。在一个实施方式中，本发明的组合物是一种疫苗，该疫苗诱导针对至少一种钩端螺旋体属蛋白的细胞介导的和/或体液免疫。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是描述了优选的方法和材料。
如本文所用，每个以下术语具有与其在本节中相关的含义。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且不旨在进行限制。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代冠词的一个或多个(即至少一个)语法对象。举例来说，“一个要素”是指一个要素或多于一个要素。
在提及可测量值(例如量、持续时间等)时本文所用的“约”意在涵盖指定值±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％并且还更优选±0.1％的变化，因为这样的变化适合于进行所公开的方法。
如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。本发明中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science242:423-426)。
本文使用的术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生，或特定免疫感受态细胞的活化，或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有蛋白质或肽，都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码本文所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫应答。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品。
如本文所用，术语“自体的”意指源自个体的任何材料，随后将其重新引入该同一个体中。
本文使用的术语“佐剂”定义为增强抗原特异性适应性免疫应答的任何分子。
术语“试剂”包括任何物质、代谢物、分子、组分、化合物或其组合。其包括但不限于例如蛋白质、寡肽、有机小分子、聚糖、多糖、多核苷酸等。它可以是天然产物、合成化合物、化学化合物、或两种或更多种物质的组合。除非另有说明，否则术语“试剂”、“物质”和“化合物”可以互换使用。此外，“测试试剂”或“候选试剂”通常是用于本发明的测定中的对象试剂。
术语“结合”是指至少两个分子之间由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键相互作用而直接缔合。
“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4thEd.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，本文所用的“CDR”是指所有三个重链CDR，或所有三个轻链CDR(或者如果合适的话，所有重链和所有轻链CDR)。抗体的结构和蛋白折叠可能意味着其它残基被认为是抗原结合区的一部分并且技术人员将如此理解。参见例如Chothia et al.,(1989)Conformations of immunoglobulinhypervariable regions；Nature 342，p877-883。
“嵌合抗体”是指一类工程化抗体，其含有源自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)以及源自受体抗体的轻链和重链恒定区。
“接触”是指两个或更多个分子或者相同分子或不同分子的两个或更多个组分物理接近使得它们能够发生相互作用的过程。可以通过组合两种或更多种含有不同组分的分子来接触分子或其组分，例如通过混合两种或更多种溶液组分，制备包含两种或更多种分子(例如靶分子、候选分子或竞争性结合参考分子)的溶液，和/或组合两种或更多种流动组分。
如本文所用，“组合疗法”是指第一试剂与另一种试剂联合给药。“联合”是指除了一种治疗方式之外还施用另一种治疗方式。因此，“联合”是指在向个体递送一种治疗方式之前、期间或之后施用另一种治疗方式。此类组合被认为是单一治疗方案或制度的一部分。
如本文所用，术语“同时给药”是指组合疗法中第一疗法和第二疗法的给药在时间上彼此重叠。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康状况继续恶化。相反，动物的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但动物的健康状态不如没有病症时的健康状态。如果未经治疗，病症不一定会导致动物的健康状况进一步下降。
术语“供体抗体”是指将其可变区、CDR或其其它功能片段或类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体的抗体(单克隆和/或重组体)，以提供改变的免疫球蛋白编码区和由此产生的表达改变的抗体，该表达改变的抗体具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特征。
术语“受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体(单克隆和/或重组体)，其将编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列的全部(或任何部分，但在某些实施方式中全部)贡献给第一免疫球蛋白配偶体。在某些实施方式中，人抗体是受体抗体。
本文所用的“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
本文使用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或提供在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“重链抗体”或“重链抗体”包含衍生自骆驼科物种的免疫球蛋白分子，要么通过用肽进行免疫并随后分离血清，要么通过克隆和表达编码此类抗体的核酸序列。术语“重链抗体”或“重链抗体”进一步涵盖从患有重链疾病的动物分离的免疫球蛋白分子，或通过克隆和表达来自动物的VH(可变重链免疫球蛋白)基因而制备的免疫球蛋白分子。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子中的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，则这些分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性百分比是由两个序列共享的匹配或同源位置的数量除以比较位置的数量乘以100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个匹配或同源，则这两个序列有60％的同源性。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常，当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。
“人源化抗体”指一类工程化抗体，其CDR衍生自非人供体免疫球蛋白，该分子的其余免疫球蛋白衍生部分衍生自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，可以改变框架支持残基以保留结合亲和力(参见例如1989,Queen et al.,Proc.Natl.Acad Sci USA,86:10029-10032；1991,Hodgson et al.,Bio/Technology,9:421)。合适的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列同源性从常规数据库(例如KABAT数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库)中选择的一种。通过与供体抗体的框架区(基于氨基酸)的同源性表征的人抗体可能适合于提供重链恒定区和/或用于插入供体CDR的重链可变框架区。可以以类似的方式选择能够捐献轻链恒定区或可变框架区的合适受体抗体。应当注意的是，受体抗体重链和轻链不需要源自相同的受体抗体。现有技术描述了产生此类人源化抗体的多种方法(参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951)。
本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为一类具有抗体功能的蛋白。B细胞表达的抗体有时称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。此类蛋白包括的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物(例如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物)中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者中初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定和其它抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且对于防御细菌和病毒很重要。IgD是免疫球蛋白，其没有已知的抗体功能，但可以充当抗原受体。IgE是免疫球蛋白，其在暴露于过敏原时通过引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体来介导速发型超敏反应。
如本文所用，术语“免疫应答”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子产生和细胞的细胞毒性，以及B细胞应答，例如抗体产生。此外，术语免疫应答包括间接受T细胞活化影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答细胞(例如巨噬细胞)的活化。参与免疫应答的免疫细胞包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Th1和Th2细胞)；抗原呈递细胞(例如专业抗原呈递细胞，例如树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、朗格汉斯细胞，和非专业(non-professional，非专职性)抗原呈递细胞，例如角质形成细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
如本文所用，“抑制有效量”是导致可检测(例如可测量)量的活性抑制的量。在某些情况下，活性是其与另一组分结合的能力。
“分离的”是指从自然状态改变或脱离。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非原生环境(诸如例如宿主细胞)中。
本文所用的“突变”是指核酸或多肽序列相对于参考序列(其优选是天然存在的正常或“野生型”序列)的变化，并且包括易位、缺失、插入、和取代/点突变。如本文所用，“突变体”是指包含突变的核酸或蛋白。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或皮内(i.d.)注射或输注技术。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且指的是适于本文中描述的方法的任何动物或其细胞(无论是体外还是原位)。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。
如本文关于抗体所使用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的该抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在另一个示例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指代抗体、蛋白或肽与第二化学物种的相互作用，意指该相互作用取决于化学物种上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白结构，而不是一般的蛋白。如果抗体对表位“X”具有特异性，则在含有标记的“X”和抗体的反应中，含有表位X(或游离未标记的A)的分子的存在将减少与该抗体结合的标记的X的量。
本文所用的术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如由本文描述的噬菌体表达的抗体。该术语还应当解释为意指通过合成编码该抗体的DNA分子(并且该DNA分子表达抗体蛋白)或限定该抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域可用且众所周知的合成DNA或氨基酸序列技术获得的。
本文使用的术语“治疗”是指治疗和/或预防。通过抑制、减轻、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指引起研究人员、兽医、医生或其它临床医生正在寻求的组织、系统或受试者的生物学或临床应答的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当给药时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或者在某种程度上减轻一种或多种体征或症状的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物、疾病及其严重性以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
本文使用的术语“治疗”疾病是指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。
本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染的、转化的或转导的细胞。该细胞包括原代受试细胞及其后代。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被理解为对本发明范围的僵化限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应当被认为具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围有多宽，这都适用。
描述
本发明涉及由PF07598钩端螺旋体基因家族编码的钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白及其变体和片段。
在一些实施方式中，本发明提供了一种包含钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的组合物。在一些实施方式中，组合物包含钩端螺旋体VM蛋白的片段。例如，在一个实施方式中，组合物包含钩端螺旋体VM蛋白的片段，其中片段包含含有钩端螺旋体VM蛋白的核酸酶活性的C末端结构域(本文中称为DNA酶结构域)。
在一个实施方式中，组合物包含融合蛋白，融合蛋白包含第一结构域，第一结构域包含钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段。在一个实施方式中，融合蛋白包含第二结构域。在一个实施方式中，第二结构域是靶向结构域，其中靶向结构域将融合蛋白引导至特定的目的细胞或组织。例如，在一个实施方式中，靶向结构域包含特异性结合抗原(例如肿瘤抗原)从而将融合蛋白引导至表达抗原的细胞或组织的抗体、抗体片段或肽。在一个实施方式中，第二结构域包含允许融合蛋白可视化的可检测蛋白或肽(例如荧光蛋白)。
在一个实施方式中，本发明提供了一种编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的分离的核酸分子。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的DNA、cDNA、RNA或mRNA。在一个实施方式中，分离的核酸分子编码包含钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的融合蛋白。
在一个实施方式中，组合物包含免疫组合物，该免疫组合物包含(a)钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。如本文所证明的，在某些实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段诱导保护性免疫应答，保护性免疫应答可以在有需要的受试者中治疗或预防钩端螺旋体感染或钩端螺旋体病。在一个实施方式中，免疫组合物包含疫苗。在一个实施方式中，免疫组合物包含经修饰以表达钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的细菌(例如来自钩端螺旋体属的细菌)。在一个实施方式中，细菌是减毒的，因为其致病性降低，但能够诱导保护性免疫应答。组合物不仅可用作用于免疫保护的预防性治疗剂，而且还可用作用于治疗正在进行的感染、疾病或病症的治疗剂。
在一个实施方式中，本发明涉及诱导细胞死亡或损伤的方法，其包括给予细胞组合物，该组合物包含：(a)钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。例如，如本文所证明的，钩端螺旋体VM蛋白是细胞病变蛋白。在一个实施方式中，该方法包括给予肿瘤该组合物，从而诱导肿瘤细胞死亡或损伤。
本发明还提供了在有需要的受试者中预防、抑制和治疗由钩端螺旋体属的细菌引起的感染的方法。在一个实施方式中，本发明的方法通过在受试者中产生针对钩端螺旋体VM蛋白的免疫应答来诱导针对受试者中钩端螺旋体属的免疫。在某些实施方式中，该方法诱导跨钩端螺旋体属的广泛免疫。在一个实施方式中，本发明的方法在受试者中诱导VM蛋白特异性抗体的产生。在一个实施方式中，本发明的方法在有需要的受试者中预防钩端螺旋体相关病状，例如钩端螺旋体病(也称为威尔氏病)。在一个实施方式中，本发明的方法包括给予受试者组合物，该组合物包含：a)钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。
组合物
本发明提供了包含或编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的组合物。
在一个实施方式中，组合物包含来自问号钩端螺旋体血清型Lai、问号钩端螺旋体血清型Copenhageni、问号钩端螺旋体血清型Manilae或其组合的钩端螺旋体VM蛋白。在一个实施方式中，至少一种VM蛋白是LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091、或其片段或变体。
在一个实施方式中，本发明涉及一种包含至少两种、三种、四种、五种或多于五种VM蛋白的组合的疫苗。在一个实施方式中，疫苗包含LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091、或其片段或变体中的至少两种、三种、四种、五种或多于五种的组合。在一个实施方式中，疫苗包含LIC_12340和LIC_12985的组合。在一个实施方式中，疫苗包含LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的组合。
在一个实施方式中，本发明涉及一种类毒素疫苗，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种或多于五种VM蛋白。在一个实施方式中，类毒素疫苗包含LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091、或其片段或变体中的至少一种、两种、三种、四种、五种或多于五种。在一个实施方式中，类毒素疫苗包含LIC_12340和LIC_12985的组合。在一个实施方式中，类毒素疫苗包含LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的组合。
在一个实施方式中，本发明的组合物或疫苗包含VM蛋白、或其片段或变体，VM蛋白包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的组合物或疫苗包含VM蛋白的组合，VM蛋白包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的组合物或疫苗包含VM蛋白的组合，VM蛋白包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在某些实施方式中，组合物包含钩端螺旋体VM蛋白的片段。例如，在一个实施方式中，组合物包含钩端螺旋体VM蛋白的DNA酶结构域。
在各种实施方式中，本发明提供了如本文别处描述的蛋白、或蛋白的片段、同系物、突变体、变体、衍生物或盐，其中钩端螺旋体VM蛋白的各个结构域的活性(例如免疫原性活性或细胞病变活性或与钩端螺旋体VM蛋白作用机制相关的活性)被保留。
可以使用众所周知的技术来制备本发明的蛋白或肽。例如，可以使用重组DNA技术或化学合成来合成制备蛋白。本发明的蛋白可以单独合成或合成为由两个或更多个蛋白组成的更长蛋白。本发明的蛋白可以是分离的，即基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白及其片段。
本发明的蛋白可以含有修饰，例如糖基化、去糖基化(aglycosylation，低糖基化)、侧链氧化或磷酸化；只要该修饰不破坏蛋白的免疫活性。其它修饰包括掺入D-氨基酸或可用于例如增加蛋白的血清半衰期的其它氨基酸模拟物。
本发明的蛋白可以被修饰，由此氨基酸被替换为不同的氨基酸，其中氨基酸侧链的性质是保守的(称为保守氨基酸取代的过程)。氨基酸侧链的性质的示例为疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，以及具有以下共同官能团或特性的侧链：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含羟基的侧链(S、T、Y)；含硫原子的侧链(C、M)；含有羧酸和酰胺的侧链(D、N、E、Q)；含有碱基的侧链(R、K、H)；和含有芳香基(aromatic)的侧链(H、F、Y、W)。请注意，括号内的字母表示氨基酸的单字母代码。如本文所用，X代表任何氨基酸。
本发明还应被解释为涵盖本发明蛋白(或编码它的DNA)的“突变体”、“衍生物”和“变体”，突变体、衍生物和变体是在一个或多个氨基酸中发生改变的多肽(或者当指编码它的核苷酸序列时，在一个或多个碱基对中发生改变)，使得所得蛋白(或DNA)与本文引用的序列不相同，但具有与本文公开的蛋白相同的生物学特性。
本发明还应当被解释为包括与本文公开的氨基酸序列具有基本同源性的任何形式的蛋白变体。在一个实施方式中，蛋白变体与本文公开的氨基酸序列是至少约50％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源的。
本发明还应被解释为包括具有本文公开的氨基酸序列的基本长度的任何形式的片段。在一个实施方式中，片段为本文公开的氨基酸序列的长度的至少约50％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
本发明还应当被解释为包括蛋白变体的任何形式的片段，其与本文公开的氨基酸序列具有基本同源性和具有其基本长度。在一个实施方式中，蛋白变体的片段与本文公开的氨基酸序列是至少约50％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源的，并且为本文公开的氨基酸序列长度的至少约50％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
或者，蛋白可以通过重组方式或通过从较长的蛋白切割来制备。可以通过氨基酸分析或测序来确认蛋白。
根据本发明的蛋白的变体可以是：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(例如保守氨基酸残基)取代并且此类取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基的变体，(ii)其中存在一个或多个经修饰的氨基酸残基(例如通过附接取代基基团进行修饰的残基)的变体，(iii)其中蛋白包含本文描述的蛋白或结构域的替代剪接变体的变体，(iv)本文描述的蛋白或结构域的片段和/或(v)其中蛋白与另一种蛋白或肽(例如前导序列或分泌序列或用于纯化(例如His-标签)或用于检测(例如Sv5表位标签)的序列)融合的变体。片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)产生的蛋白或肽。变体可以进行翻译后修饰或化学修饰。根据本文的教导，此类变体被认为在本领域技术人员的范围内。
如本领域已知的，通过将一种肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二种肽的序列进行比较来确定两种肽之间的“相似性”。变体被定义为包括与原始序列不同的肽序列，例如每个目的节段与原始序列的残基差异小于40％、每个目的节段与原始序列的残基差异小于25％、每个目的节段的残基差异小于10％、或者每个目的节段与原始蛋白序列的差异仅在于几个残基并同时与原始序列足够同源以保留原始序列的功能性。本发明包括与原始氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％或95％相似性或同一性的氨基酸序列。可以使用计算机算法和本领域技术人员广泛已知的方法来确定两种肽之间的同一性程度。可以通过使用BLASTP算法(BLAST Manual,Altschul,S.,etal.,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))来确定两种氨基酸序列之间的同一性。
本发明的蛋白可以或可以不被翻译后修饰。例如，落入本发明范围内的翻译后修饰包括信号肽切割、糖基化、乙酰化、异戊二烯化、蛋白水解、肉豆蔻酰化、蛋白折叠和蛋白水解加工等。一些修饰或处理事件需要引入额外的生物机器。例如，通过将犬微粒体膜或非洲爪蟾卵提取物(美国专利号6,103,489)添加到标准翻译反应中来检查处理事件，例如信号肽切割和核心糖基化。可以使用常规方法(例如Reedijk et al.(The EMBO Journal11(4):1365,1992)中描述的方法)将本发明的多肽或蛋白磷酸化。
本发明的蛋白可以包括通过翻译后修饰或通过在翻译期间引入非天然氨基酸而形成的非天然氨基酸。有多种方法可用于在多肽翻译过程中引入非天然氨基酸。
本发明的蛋白可以与其它分子例如聚乙二醇(PEG)缀合。这可以通过插入半胱氨酸突变或可用化学反应性PEG衍生物修饰的非天然氨基酸来实现。在一个实施方式中，该蛋白与其它蛋白缀合，以制备融合蛋白。这可以例如通过N-末端或C-末端融合蛋白的合成来实现，条件是所得融合蛋白保留了本文描述的蛋白的功能性。
本发明的蛋白的环状衍生物也是本发明的一部分。环化可以使蛋白呈现出更有利的构象以与其它分子缔合。环化可以使用本领域已知的技术来实现。例如，可以在两个适当间隔的具有游离巯基的组分之间形成二硫键，或者可以在一个组分的氨基和另一组分的羧基之间形成酰胺键。也可以使用Ulysse,L.,et al.,J.Am.Chem.Soc.1995,117,8466-8467描述的含有偶氮苯的氨基酸来实现环化。形成键的组分可以是氨基酸侧链、非氨基酸组分或两者的组合。在本发明的一个实施方式中，环状肽可以在右侧位置包含β-转角(beta-turn)。可以通过在右侧位置添加氨基酸Pro-Gly来将β-转角引入本发明的肽中。
可能期望产生比如上描述的含有肽键连接的环状蛋白更柔性的环状蛋白。可以通过在多肽的右侧和左侧位置引入半胱氨酸并在两个半胱氨酸之间形成二硫键来制备更柔性的蛋白。两个半胱氨酸经排列以便不使β-折叠(beta-sheet)和转角变形。由于二硫键的长度和β-折叠部分中数量较少的氢键，该蛋白更柔性。可以通过分子动力学模拟来确定环状蛋白的相对柔性。
本发明还涉及一种融合蛋白。例如，在一个实施方式中，融合蛋白包含第一结构域，该第一结构域包含钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段。在一个实施方式中，融合蛋白包含第二结构域。在一个实施方式中，第二结构域是靶向结构域，其中靶向结构域将融合蛋白引导至特定的目的细胞或组织。例如，在一个实施方式中，靶向结构域包含特异性结合抗原(例如肿瘤抗原)的抗体、抗体片段或肽，从而将融合蛋白引导至表达该抗原的细胞或组织。在一个实施方式中，第二结构域包含允许融合蛋白可视化的可检测蛋白或肽(例如荧光蛋白)。
在一个实施方式中，融合蛋白包含能够将所得蛋白引导至所需细胞组分或细胞类型或组织的靶向结构域。嵌合蛋白或融合蛋白还可以含有额外的氨基酸序列或结构域。嵌合蛋白或融合蛋白是重组的，因为各种组分来自不同来源，并且因此在自然界中不在一起被发现(即是异源的)。
在一个实施方式中，靶向结构域可以是跨膜结构域、膜结合结构域或引导蛋白例如与囊泡或与细胞表面缔合的序列。在一个实施方式中，靶向结构域可以将蛋白靶向特定细胞类型或组织。例如，靶向结构域可以是细胞表面配体或针对靶组织的细胞表面抗原的抗体。靶向结构域可以将本发明的蛋白靶向细胞组分。
在一个实施方式中，靶向结构域可以包含抗体或其抗体片段。抗体可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。在一个实施方式中，本发明的组合物的靶向结构域包含抗体片段。在一个实施方式中，靶向结构域包含含有scFv的抗体片段。
本发明的含有VM-结构域的融合分子可被生成为与任何所需的目的抗原或其片段具有反应性，包括但不限于肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原或自身抗原。在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性病症抗原”或“与过度增殖性病症相关的抗原”是指特定过度增殖性病症(例如癌症)所共有的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性病症抗原源自癌症，癌症包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、间皮瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
本文讨论的抗原仅作为示例被包括在内。该清单并不旨在是排他性的并且进一步的示例对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
可以通过常规技术合成本发明的蛋白。例如，可以使用固相肽合成通过化学合成来合成蛋白。这些方法采用固相或溶液相合成方法(参见例如，对于固相合成技术，J.M.Stewart,and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Ed.,PierceChemical Co.,Rockford Ill.(1984)和G.Barany and R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis Synthesis,Biology editors E.Gross and J.Meienhofer Vol.2AcademicPress,New York,1980,pp.3-254；以及对于经典溶液合成，M Bodansky,Principles ofPeptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin 1984,和E.Gross and J.Meienhofer,Eds.,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,suprs,Vol 1)。举例来说，可以使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相化学直接掺入磷酸苏氨酸作为N-芴基甲氧基-羰基-O-苄基-L-磷酸苏氨酸衍生物合成本发明的多肽。
可以通过重组技术将本发明的肽或蛋白的N-末端端部或C-末端端部与具有所需生物学功能的选定蛋白或选择标志物的序列融合制备包含与至少一种其它分子缀合的肽或蛋白的N-末端或C-末端融合蛋白。所得融合蛋白含有本文描述的与选定蛋白或标记蛋白融合的钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段。可用于制备融合蛋白的蛋白的示例包括免疫球蛋白及其区域、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血凝素(HA)和截短的myc。
可以使用生物表达系统来开发本发明的蛋白。使用这些系统允许产生大型随机序列文库，并筛选这些文库中与特定蛋白结合的序列。可以通过将编码随机肽序列的合成DNA克隆到适当的表达载体中来产生文库(参见Christian et al 1992,J.Mol.Biol.227:711；Devlin et al,1990Science249:404；Cwirla et al 1990,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,87:6378)。还可以通过重叠肽的同时合成来构建文库(参见美国专利号4,708,871)。
本发明的蛋白可以通过与无机酸(例如盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸等)或有机酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、水杨酸、苯磺酸和甲苯磺酸)反应而转化为药用盐。。
本发明进一步涵盖融合蛋白，其中本发明的蛋白或其片段重组地融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至异源蛋白(即不相关的蛋白或其部分，例如多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300或至少500个氨基酸)以产生融合蛋白。融合不一定需要是直接的，而是可以通过接头序列发生。
在一个示例中，一种融合蛋白，其中本发明的蛋白或其片段可以与衍生自各种类型的免疫球蛋白的序列融合。例如，本发明的多肽可以融合至人IgG或IgM分子的恒定区(例如铰链、CH2和CH3结构域)，例如如本文所述，以便制备在体内更易溶解且更稳定的融合蛋白或其片段。在另一个实施方式中，此类融合蛋白可以给予受试者以抑制体内配体与其受体之间的相互作用。这种相互作用的抑制将阻断或抑制触发某些细胞反应的信号转导。
一方面，融合蛋白包含在其N-末端与异源信号序列融合的本发明的多肽。例如，本发明的蛋白中天然存在的信号序列可以被来自异源来源的信号序列替代。各种信号序列是可商购的。例如，蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶(Stratagene；La Jolla,Calif.)的分泌序列可用作真核异源信号序列。作为原核异源信号序列的示例，可以列出phoA分泌信号(Sambrook,et al.,同上；和Current Protocols in Molecular Biology,1992,Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway,N.J.)。另一个示例是杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列(Current Protocols inMolecular Biology,1992,Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons)。
在另一个实施方式中，本发明的蛋白可以融合至标签序列，例如六组氨酸肽，例如pQE载体中提供的标签(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)等，其中许多是可商购的。如Gentz,et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824所描述的，例如，六组氨酸提供了融合蛋白的便捷纯化。肽标签的其它示例是血凝素“HA”标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson,et al.,1984,Cell 37:767)和“标记”标签(Knappik,et al.,1994,Biotechniques 17(4):754-761)。这些标签对于本发明的纯化重组产生的蛋白特别有用。
在一个实施方式中，本发明的蛋白可以与可检测标记例如荧光标签融合。荧光标签的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、橙色荧光蛋白(OFP)、eGFP、mCherry、hrGFP、hrGFPII、Alexa 488、Alexa594等。荧光标签还可以是可光转换的，诸如例如点燃红色荧光蛋白(KFP-红)、PS-CFP2、Dendra2、CoralHue Kaede和CoralHue Kikume。然而，本发明不应限于特定标记。相反，任何可检测的标记都可用于给表达的蛋白加标签。
在一些实施方式中，本发明提供了包含缀合至或封装至少一种本发明的VM蛋白或肽的脂质纳米颗粒(LNP)或脂质体的组合物。在一个实施方式中，组合物包含封装两种或更多种VM蛋白的组合的两种或更多种LNP的组合。在某些情况下，LNP增强VM蛋白的细胞摄取。
在一些实施方式中，组合物包含支架，例如组织工程支架，支架包含编码生长因子的核酸分子。例如，在一个实施方式中，支架包含封装编码生长因子的核酸分子的LNP。在一个实施方式中，支架包含含有编码生长因子的核酸分子的细胞或细胞群。在一些实施方式中，支架包括水凝胶、电纺支架等，其包含生物聚合物、合成聚合物或它们的组合。
本发明还提供了编码本文描述的蛋白的分离的核酸分子。因此，在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的分离的核酸分子。
在一个实施方式中，分离的核酸分子编码具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的蛋白或类毒素、或其片段或变体。在一个实施方式中，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的DNA酶结构域的片段。在一个实施方式中，分离的核酸分子编码至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或多于五种VM蛋白。在一个实施方式中，分离的核酸分子编码LIC_12340和LIC_12985。在一个实施方式中，分离的核酸分子编码SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12。在一个实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。在一个实施方式中，分离的核酸分子编码LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402。在一个实施方式中，分离的核酸分子编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12。在一个实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。
在一个实施方式中，本发明涉及至少两种分离的核酸分子的组合，核酸分子编码至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或多于五种VM蛋白或类毒素的组合。在一个实施方式中，至少两种分离的核酸分子编码LIC_12340和LIC_12985。在一个实施方式中，组合物包含至少两种编码SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的组合的分离的核酸分子的组合。在一个实施方式中，组合物包含至少两种包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的分离的核酸分子的组合。在一个实施方式中，至少两种分离的核酸分子编码LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402。在一个实施方式中，组合物包含至少两种分离的核酸分子的组合，分离的核酸分子编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的组合。在一个实施方式中，组合物包含至少两种分离的核酸分子的组合，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。
一种或多种分离的核酸分子可包含任何类型的核酸，包括但不限于DNA、cDNA和RNA。例如，在一个实施方式中，组合物包含编码蛋白或其功能片段的分离的DNA分子，包括例如分离的cDNA分子。在一个实施方式中，组合物包含编码蛋白或其功能片段的分离的RNA分子。
核酸序列包括转录成RNA的DNA序列和翻译成蛋白的RNA序列。根据其它实施方式，本发明的核酸序列是从本发明的蛋白的氨基酸序列推断的。如本领域已知的，由于冗余密码子，多种替代的核酸序列是可能的，同时保留翻译的蛋白的生物活性。
此外，本发明涵盖一种分离的核酸分子，其编码与本文公开的VM蛋白具有基本同源性的蛋白。在一些实施方式中，本发明涵盖一种编码蛋白的分离的核酸分子，该蛋白包含与本文公开的蛋白的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方式中，编码本发明蛋白的核酸序列与本文描述的核酸序列是“基本上同源的”，即约50％同源、约70％同源、约80％同源、约90％同源、约91％同源、约92％同源、约93％同源、约94％同源、约95％同源、约96％同源、约97％同源、约98％同源或约99％同源。
应当明确地理解的是，本发明的范围涵盖同源物、类似物、变体、片段、衍生物和盐，包括更短和更长的蛋白和核酸分子，以及具有一个或多个氨基酸或核酸取代的蛋白和核酸分子类似物，以及本领域已知的氨基酸或核酸衍生物、非天然氨基酸或核酸和合成氨基酸或核酸，前提条件是这些修饰必须保留原始分子的活性。具体地，根据本发明的原理，本文包括并公开了活性蛋白和核酸分子的任何活性片段以及延伸物、缀合物和混合物。
本发明应当被解释为包括与本文描述和引用的核酸序列同源的任何和所有分离的核酸序列，只要这些同源核酸序列编码具有本文公开的蛋白的生物活性的蛋白。
本领域技术人员将理解，本发明的核酸序列涵盖编码本发明蛋白的RNA或DNA序列及其任何修饰形式，包括DNA或RNA的化学修饰，其使得序列在无细胞时或与细胞相关联时更稳定。核苷酸的化学修饰也可用于增强核酸序列被细胞吸收的效率或其在细胞中表达的效率。本发明考虑了核酸序列修饰的任何和所有组合。
此外，可以使用本领域熟知的重组DNA方法，诸如例如Sambrook etal.(2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和Ausubel et al.(1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York)中描述的方法，使用许多程序来产生本发明蛋白的突变体、衍生物或变体形式。通过改变编码多肽的DNA序列在多肽或多肽中引入氨基酸变化的程序是本领域众熟知的，并且也在这些和其它论文中进行了描述。
可以修饰本发明的核酸分子以改善在血清或在生长培养基的细胞培养物中的稳定性。可添加修饰以增强稳定性、功能性和/或特异性并最小化本发明核酸分子的免疫刺激特性。例如，为了增强稳定性，可以稳定3’-残基以防止降解，例如可以选择它们使得它们由嘌呤核苷酸(特别是腺苷或鸟苷核苷酸)组成。或者，用修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如用2’-脱氧胸苷取代尿苷是容许的并且不会影响分子的功能。
在本发明的一个实施方式中，核酸分子可以含有至少一种修饰的核苷酸类似物。例如，可以通过掺入修饰的核苷酸类似物来稳定端部。
核苷酸类似物的非限制性示例包括糖修饰的和/或主链修饰的核糖核苷酸(即包括对磷酸-糖主链的修饰)。例如，天然RNA的磷酸二酯键可被修饰以包括氮或硫杂原子中的至少一种。在示例性主链修饰的核糖核苷酸中，连接至相邻核糖核苷酸的磷酸酯基团被经修饰的基团(例如硫代磷酸酯基团)替代。在示例性糖修饰的核糖核苷酸中，2’OH基团被选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON中的基团替代，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基并且卤素是F、Cl、Br或I。
修饰的其它示例是核碱基修饰的核糖核苷酸，即含有至少一个非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸。可以修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。示例性的经修饰的核碱基包括但不限于在5-位修饰的尿苷和/或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位修饰的腺苷和/或鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷是合适的。上述修饰可以组合。
在一些情况下，核酸分子包含以下化学修饰中的至少一种：一种或多种核苷酸的2’-H、2’-O-甲基或2’-OH修饰。在一些实施方式中，本发明的核酸分子可以具有增强的核酸酶抗性。为了增加核酸酶抗性，核酸分子可以包括例如2’-修饰的核糖单元和/或硫代磷酸酯键。例如，2’羟基(OH)可以被修饰或被许多不同的“氧基”或“脱氧”取代基替代。为了增加核酸酶抗性，本发明的核酸分子可以包括2’-O-甲基、2’-氟、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-氨基丙基、2’-氨基和/或硫代磷酸酯键。包括锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)(例如2’-4’-乙烯桥核酸)以及某些核碱基修饰(例如2-氨基-A、2-硫代(例如2-硫代-U)、G-夹修饰)也可以增加与靶的结合亲和力。
在一个实施方式中，核酸分子包括2’-修饰的核苷酸，例如2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。在一个实施方式中，核酸分子包括至少一种2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且在一些实施方式中，核酸分子的所有核苷酸都包含2’-O-甲基修饰。
本文讨论的核酸试剂包括未修饰的RNA和DNA以及修饰的RNA和DNA(例如以改善功效)和核苷替代物的聚合物。未修饰的RNA是指这样的分子，其中核酸的组分，即糖、碱基和磷酸部分与自然界中存在的(例如人体内天然存在的)相同或基本上相同。本领域已将稀有或不常见但天然存在的RNA称为修饰的RNA，参见例如Limbach et al.(Nucleic AcidsRes.,1994,22:2183-2196)。此类稀有或不常见的RNA(通常称为修饰的RNA)通常是转录后修饰的结果，并且在本文所用术语“未修饰的RNA”内。如本文所用，修饰的RNA是指这样的分子，其中核酸的一种或多种组分，即糖、碱基和磷酸部分与自然界中存在的不同，例如与人体中存在的不同。虽然它们被称为“修饰的RNA”，但由于修饰，它们当然会包括严格来说不是RNA的分子。核苷替代物是其中核糖磷酸主链被非核糖磷酸构建体替代的分子，非核糖磷酸构建体允许碱基以正确的空间关系呈现，使得杂交与核糖磷酸主链所见的杂交基本相似，例如不带电荷的核糖磷酸主链的模拟物。
本发明的核酸的修饰可以存在于磷酸基团、糖基团、主链、N-末端、C-末端或核碱基中的一个或多个处。
本发明还包括其中插入本发明的分离的核酸的载体。本领域存在很多可用于本发明的合适载体。
简要总结，通常通过将编码蛋白或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并将构建体掺入表达载体中来实现编码蛋白的天然或合成核酸的表达。所使用的载体适合于在真核细胞中复制和任选地整合。典型的载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所需核酸序列的表达的启动子。
本发明的载体使用标准基因递送协议还可用于核酸免疫和基因疗法。基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，其全部内容通过引用并入本文。在另一个实施方式中，本发明提供了一种基因疗法载体。
本发明的分离的核酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，核酸可以克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别令人感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的并且描述于例如Sambrook et al.(2012,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点以及一种或多种选择标志物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因传递系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后，可以分离重组病毒并在体内或离体将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一种实施方式中，使用慢病毒载体。
例如，源自逆转录病毒(例如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体比衍生自肿瘤逆转录病毒(例如鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞(例如肝细胞)。它们还具有低免疫原性的额外优势。在一个实施方式中，组合物包括源自腺相关病毒(AAV)的载体。腺相关病毒(AAV)载体已成为治疗各种病症的强大基因递送工具。AAV载体具有许多使其非常适合基因疗法的特征，包括没有致病性、最小的免疫原性以及以稳定且有效的方式转导有丝分裂后细胞的能力。通过选择AAV血清型、启动子和递送方法的适当组合，AAV载体中包含的特定基因的表达可以特异性地靶向一种或多种类型的细胞。
在一些实施方式中，载体还包括常规控制元件，其以允许转基因在用质粒载体转染的或用本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至转基因。如本文所用，“可操作地连接的”序列包括与目的基因相连(contiguous)的表达控制序列和以反式或相距一定距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物分泌的序列。本领域已知并且可以使用大量的表达控制序列，包括原生的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp区域内，尽管最近显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件倒置或相对另一个移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。取决于启动子，各个元件似乎可以协同或独立地发挥作用来激活转录。
合适的启动子的一个示例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强的组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个示例是伸长生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了能够开启其可操作地连接的多核苷酸序列的表达(当需要此类表达时)或关闭该表达(当不需要表达时)的分子开关。诱导型启动子的示例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
载体上发现的增强子序列也调节其中所含基因的表达。通常，增强子与蛋白因子结合以增强基因的转录。增强子可能位于其调节的基因的上游或下游。增强子也可以是组织特异性的，以增强特定细胞或组织类型中的转录。在一个实施方式中，本发明的载体包含一种或多种增强子以增强载体内存在的基因的转录。
为了评估蛋白的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择标志物可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序中。选择标志物和报告基因的侧翼都可以有适当的调控序列以能够在宿主细胞中表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报告基因用于识别潜在转染的细胞并用于评估调控序列的功能性。一般而言，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不是由受体生物体或组织表达的基因，并且其编码多肽，多肽的表达通过一些易于检测的特性(例如酶活性)来体现。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei etal.,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的并且可以使用已知技术制备或商业获得。一般来说，具有显示最高水平报告基因表达的最小5’侧翼区域的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可以与报告基因连接并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因引入细胞并表达该基因的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法容易地将载体引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物方式将表达载体转移至宿主细胞中。
用于将肽或蛋白引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如Sambrook et al.(2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。
将目的肽或蛋白引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，且特别是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物(例如人细胞)中最广泛使用的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将肽或蛋白引入宿主细胞的化学方式包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质配制品将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以封装在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子附接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、被包含作为在脂质中的悬浮液、被包含在胶束中或与胶束复合、或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构如胶束存在或具有“塌陷”结构。它们也可以只是散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类别，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。在氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可以储存在约-20℃下。氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个通用术语，涵盖通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有带有磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自我重排并将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghosh et al.,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
无论使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生化”测定，例如检测特定多肽的存在或不存在，例如通过免疫学方式(ELISA和蛋白印迹)或通过本文描述的测定来鉴定落入本发明范围内的试剂。
在一个实施方式中，本发明提供了一种包含蛋白或编码蛋白的核酸分子的递送载体。示例性的递送载体包括但不限于微球、微粒、纳米颗粒、聚合物体、脂质体和胶束。例如，在一些实施方式中，递送载体负载有蛋白或编码蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，递送载体提供其装载的货物的受控释放、延迟释放或连续释放。在一些实施方式中，递送载体包含将递送载体靶向治疗部位的靶向部分。
在一个实施方式中，本发明提供了一种可植入支架或装置，其包含蛋白或编码该蛋白的核酸分子。例如，在一些实施方式中，本发明提供了一种组织工程支架，包括但不限于水凝胶、电纺支架、聚合物基质等，其在支架中或上包含蛋白或编码该蛋白的核酸分子。
在一些实施方式中，本发明提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)或脂质体的组合物，脂质纳米颗粒(LNP)或脂质体缀合至或封装编码本发明的至少一种VM蛋白或肽的至少一种核酸分子。在一个实施方式中，组合物包含两种或更多种LNP的组合，其封装编码至少两种或更多种本发明的VM蛋白或肽的两种或更多种核酸分子的组合。在一个实施方式中，核酸分子包含编码至少一种本发明的VM蛋白或肽的mRNA分子。因此，在一些实施方式中，本发明提供了至少一种LNP或脂质体，其缀合至或封装编码至少一种VM蛋白的至少一种mRNA分子。在一个实施方式中，本发明提供了一种缀合至或封装编码LIC_12340和LIC_12985的mRNA分子的LNP或脂质体的组合。在一个实施方式中，本发明提供了一种缀合至或封装编码LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的mRNA分子的LNP或脂质体的组合。
在某些方面，本发明涵盖组合物，其包括多肽、核苷酸、载体、细菌和疫苗，当将其给予受试者时，其引发或增强免疫应答。在某些情况下，组合物引发针对钩端螺旋体属细菌的免疫应答，包括针对钩端螺旋体VM蛋白的免疫应答。此外，当将组合物给予受试者时，它们引发免疫应答，该免疫应答用于保护接种的受试者免受与钩端螺旋体感染相关的病症。
在一个实施方式中，本发明提供了可用作免疫调节剂(例如用于刺激免疫应答和预防钩端螺旋体相关病状)的组合物。在各种实施方式中，免疫调节剂包含(a)钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。在一个实施方式中，免疫应答对宿主无害，并且因此本发明的组合物可用作疫苗。在一个实施方式中，免疫调节剂与佐剂组合给予。在一个实施方式中，佐剂是以稳定的水包油纳米乳液(SE)配制的吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)，称为GLA-SE佐剂。在另一个实施方式中，免疫调节剂在不存在佐剂的情况下给予。
在一些实施方式中，组合物用作免疫刺激剂以诱导或增强特异性抗体的产生。在某些方面，免疫刺激剂预防钩端螺旋体诱发的病状。
在一个实施方式中，组合物包含细菌，细菌包含(a)钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。例如，在一个实施方式中，组合物包含钩端螺旋体属细菌，钩端螺旋体属细菌包含(a)钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。在一个实施方式中，组合物包含不是钩端螺旋体属细菌的细菌，其中该细菌包含(a)钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。
包含编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核苷酸序列的细菌可以使用本领域已知的任何方法产生，方法包括但不限于等位基因交换和定点诱变。
根据本发明可以选择和使用具有编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的至少一种核苷酸序列的任何细菌或细菌菌株。在一个实施方式中，可以选择天然存在的突变体或变体、或自发突变体。在另一个实施方式中，可以通过将细菌暴露于诱变剂(例如紫外线照射或化学诱变剂)，或通过多次传代和/或在非许可性宿主中传代来产生突变细菌。差异生长系统中的筛选可用于选择在钩端螺旋体VM蛋白中具有突变的那些突变体。
在另一个实施方式中，可以使用“反向遗传学”方法将突变工程化到细菌(例如钩端螺旋体细菌)中。以这种方式，可以将赋予失活或减毒表型的天然突变或其它突变工程化到菌株中。例如，可以对负责钩端螺旋体VM蛋白的基因的编码区的缺失、插入或替代进行工程化。还考虑了在负责钩端螺旋体VM蛋白的基因的非编码区中的缺失、替代或插入。为此，可以使负责基因(负责钩端螺旋体VM蛋白)的转录、复制、多聚腺苷酸化和/或包装的信号中的突变工程化。
在一个实施方式中，细菌被工程化为有缺陷的，其中不存在钩端螺旋体VM蛋白。例如，在某些实施方式中，缺乏毒素的突变细菌或病毒(其中不存在一种或多种钩端螺旋体VM蛋白)不能引起疾病，但能够诱导针对钩端螺旋体属的适应性免疫应答。
通过本文描述的方法产生的细菌可以用于本文描述的疫苗和药物配制品中。反向遗传学技术还可以用于对对疫苗生产重要的其它基因的额外突变进行工程化-即可以将有用的疫苗株变体的表位工程化到细菌中。或者，可以将完全外源的表位(包括源自其它病原体的抗原)工程化到灭活或减毒菌株中。
本发明的灭活或减毒细菌本身可用作疫苗或药物配制品中的活性成分。在某些实施方式中，细菌可以用作重组生产的疫苗的载体或“骨架”。为此，“反向遗传学”技术可用于工程化突变或将外源表位引入细菌中，其可以用作“亲本”菌株。以这种方式，可以将疫苗设计用于针对菌株变体的免疫接种，或者替代地，针对完全不同的传染原或疾病抗原的免疫接种。
例如，在一个实施方式中，本发明的免疫组合物包含经工程化以表达给定病原体的一种或多种表位或抗原的细菌。例如，可以对细菌进行工程化以表达其它预选菌株的中和表位。或者，可以将其它病原体的表位构建到突变细菌中。
在一个实施方式中，细菌能够在宿主中诱导强键的免疫应答—这一特征有助于在用作疫苗时产生强烈的免疫应答，并且具有其它生物学后果，该后果使得该细菌可用作用于预防和/或治疗与抗原相关的感染、疾病或病症的药物试剂。例如，在某些实施方式中，细菌诱导抗钩端螺旋体免疫应答。
对于要用作疫苗的抗原组合物，该抗原组合物必须在细胞、组织或受试者(例如人)中诱导针对抗原的免疫应答。在某些方面，疫苗在受试者中诱导保护性免疫应答。如本文所用，“免疫组合物”可以例如包含抗原(例如蛋白)、编码抗原的核酸分子(例如抗原表达载体)、或表达或呈递抗原的细胞。在特定实施方式中，该抗原组合物包含或编码本文描述的任何蛋白抗原的全部或部分或其免疫功能等同物。在其它实施方式中，该抗原组合物是以包含额外免疫刺激剂或编码此类试剂的核酸的混合物的形式。免疫刺激剂包括但不限于额外的抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。在其它实施方式中，一种或多种额外试剂以任何组合共价结合至抗原或免疫刺激剂。在某些实施方式中，该抗原组合物缀合至或包含HLA锚基序氨基酸。
在本发明的上下文中，术语“疫苗”(也称为免疫原性组合物)是指在接种到动物体内时诱导免疫力的物质。在一个实施方式中，该疫苗诱导抗钩端螺旋体免疫力。在各种实施方式中，本发明的疫苗包含。
在一个实施方式中，疫苗与佐剂组合给予。在另一个实施方式中，疫苗在不存在佐剂的情况下给予。
本发明的疫苗在其核酸和/或细胞组分的组成方面可以不同。在非限制性示例中，编码抗原的核酸也可以与佐剂一起配制。当然，应当理解的是，本文描述的各种组合物可以进一步包含额外组分。例如，一种或多种疫苗组分可以包含在脂质或脂质体中。在另一个非限制性示例中，疫苗可以包含一种或多种佐剂。根据本公开，本发明的疫苗及其各种组分可以通过本文公开的任何方法或本领域普通技术人员将已知的方法来制备和/或给予。
在一个实施方式中，本发明的蛋白疫苗包括但不限于至少一种钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段，其任选地与佐剂物质混合。在一些实施方式中，蛋白与抗原呈递细胞(APC)一起引入。用于后一类疫苗的最常用的细胞是骨髓和外周血来源的树突状细胞，因为这些细胞表达有助于激活T细胞的共刺激分子。WO00/06723公开了一种细胞疫苗组合物，其包括呈递肿瘤相关抗原多肽的APC。可以通过用编码蛋白的多核苷酸(例如DNA、RNA)装载APC或用蛋白本身装载APC来实现呈递蛋白。
例如，用于检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是众所周知的。进入生物体内的异物通过APC的作用被呈递给T细胞和B细胞。由于抗原的刺激，以抗原特异性方式对APC呈递的抗原作出响应的T细胞分化为细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞或CTL)。这些抗原刺激的细胞然后增殖。该过程在本文中被称为T细胞的“活化”。因此，可以通过APC将多肽呈递给T细胞并检测CTL的诱导来评估本发明的某种多肽或多肽组合对CTL的诱导。此外，APC具有活化CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。
使用树突状细胞(DC)作为APC评估CTL的诱导作用的方法是本领域众所周知的。DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在此方法中，首先使多肽或多肽组合与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。与DC接触后检测到对目的细胞具有细胞毒性作用的T细胞表明多肽或多肽组合具有诱导细胞毒性T细胞的活性。此外，还可以通过在携带固定化多肽或多肽组合的抗原呈递细胞存在下，通过使用抗-IFN-γ抗体(例如ELISPOT测定)可视化，通过测量由CTL产生和释放的IFN-γ来检查所诱导的免疫应答。
除了DC之外，外周血单核细胞(PBMC)也可以用作APC。据报道，通过在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC增强CTL的诱导。同样，已证明CTL是通过在匙孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC来诱导的。
通过这些方法证实，具有CTL诱导活性的多肽或多肽组合是具有DC活化作用和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对钩端螺旋体VM蛋白的CTL的多肽或多肽组合可用作针对钩端螺旋体相关病状的疫苗。此外，由于APC呈递多肽或多肽组合而获得细胞毒性的CTL也可以用作针对钩端螺旋体感染的疫苗。
通常，当使用多肽进行细胞免疫治疗时，可以通过组合具有不同结构的多种多肽并使它们与DC接触来增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋白片段刺激DC时，有利的是使用多种类型片段的混合物。
可以通过观察针对特定抗原的抗体产生的诱导来进一步证实由多肽或多肽组合对免疫力的诱导。例如，当在用多肽或多肽组合免疫的实验动物中诱导针对多肽或多肽组合的抗体时，并且当钩端螺旋体相关病状被这些抗体抑制时，确定多肽或多肽组合诱导了抗钩端螺旋体免疫力。
方法
在各种实施方式中，本发明的组合物可用于生物测定，包括检测蛋白(例如脱唾液酸胎球蛋白)的方法。示例性的生物测定包括但不限于免疫层析测定、免疫点测定、Luminex测定、ELISA测定、ELISPOT测定、蛋白微阵列测定、蛋白印迹测定、质谱测定、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散测定、液相色谱-串联质谱测定、ouchterlony免疫扩散测定、反相蛋白微阵列、火箭免疫电泳测定、免疫组织染色测定、免疫沉淀测定、补体固定测定、FACS、酶-底物结合测定、酶测定、采用可检测分子(例如发色团、荧光团或放射性底物)的酶测定、使用这样的底物的底物结合测定、使用这样的底物的底物置换测定和蛋白芯片测定(还参见，2007,Van Emon,Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques,CRC Press；2005,Wild,Immunoassay Handbook,Gulf Professional Publishing；1996,Diamandis andChristopoulos,Immunoassay,Academic Press；2005,Joos,Microarrays in ClinicalDiagnosis,Humana Press；2005,Hamdan and Righetti,Proteomics Today,John Wileyand Sons；2007)。在一些实施方式中，使用用至少一种钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段、或本发明的编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子的测定测量生物样品中脱唾液酸胎球蛋白的水平，如本文别处描述的。
在各种实施方式中，本发明提供了包括给予有需要的受试者本文描述的组合物的方法。例如，在一个实施方式中，该方法包括给予受试者组合物，该组合物包含：a)钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。在各种实施方式中，本发明的组合物可用作诱导钩端螺旋体免疫力的试剂或用作治疗疾病或病症的细胞毒性剂。
本发明的组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式给予。给予的量和频率将根据诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重性等因素来确定，虽然可以通过临床试验确定合适的剂量。当指明“有效量”或“治疗量”时，可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、疾病进展和病情的个体差异来确定待给予的本发明组合物的精确量。通过监测受试者的疾病体征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。
主题组合物的给予可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。本文描述的组合物可以皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内给予受试者。
可用于本文描述的方法的给予形式包括但不限于直接递送至所需器官、口服、吸入、鼻内、气管内、静脉内、肌内、瘤内、皮下、皮内和其它胃肠外给予途径。另外，如果需要，可以组合给予途径。在一个实施方式中，给予途径是皮内注射或瘤内注射。在一个实施方式中，在外科手术期间，例如在手术切除全部或部分肿瘤期间，将一种或多种组合物给予治疗部位。
用作疫苗的方法
因此，本发明还涵盖一种使用本文描述的一种或多种组合物诱导抗钩端螺旋体免疫力的方法。可以通过给予本发明的组合物来诱导抗钩端螺旋体免疫力，并且抗钩端螺旋体免疫力的诱导使得能够治疗和预防与钩端螺旋体感染相关的病状。因此，本发明提供了一种用于治疗或预防钩端螺旋体属感染的方法。
当某种组合物在接种到动物内后诱导钩端螺旋体免疫应答时，确定该组合物具有免疫诱导作用。可以通过体内或体外观察宿主中免疫系统针对组合物的应答来检测该组合物对免疫力的诱导。
在另一个实施方式中，本发明的方法包括给予受试者包含编码核酸分子的核酸序列的细菌或病毒，该核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段。在另一个实施方式中，本发明的方法包括给予受试者细菌或病毒，其中不存在钩端螺旋体VM蛋白。例如，在某些实施方式中，给予缺乏毒素的突变体细菌或病毒(其中不存在钩端螺旋体VM蛋白)不能引起疾病，但能够诱导适应性免疫应答。
本发明的治疗化合物或组合物可以预防性或治疗性地给予患有或有风险发展为或易发展为与抗原相关的感染、疾病或病症的受试者。可以使用标准临床方法来鉴定此类受试者。在本发明的上下文中，预防性给予发生在疾病的明显临床症状表现之前，使得疾病或病症被预防或替代地延迟其进展。在医学领域的背景下，术语“预防”涵盖减少疾病造成的死亡率或发病率负担的任何活动。预防可以在一级、二级和三级预防水平进行。一级预防避免疾病的发展，而二级和三级预防水平则涵盖旨在预防疾病进展和症状出现以及通过恢复功能和减少疾病相关并发症来减少已发生疾病的负面影响的活动。
本发明的具有免疫活性的多肽或多肽组合或者编码此类多肽或多肽组合的多核苷酸或载体可以任选地与佐剂组合。佐剂是指当与具有免疫活性的多肽一起(或相继)给予时增强针对多肽或多肽组合的免疫应答的化合物。合适佐剂的示例包括合成的TLR4-激动剂佐剂、GLA-SE、霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等，但不限于此。此外，本发明的疫苗可以与药学上可接受的载体适当组合。此类载体的示例是无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。此外，疫苗可以根据需要含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等。疫苗可全身或局部给予。疫苗给予可以通过单次给予进行或通过多次给予加强。
在一个实施方式中，本发明的方法包括给予受试者组合物，该组合物包含：a)至少一种钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段；或(b)编码至少一种钩端螺旋体VM蛋白、其变体或其片段的核酸分子。在一些实施方式中，VM蛋白的片段包含VM蛋白的DNA酶结构域。组合物的给予可包括例如肌内、静脉内、腹膜、皮下、皮内以及局部给予。
可以根据组合物是否与其它药物组合物组合给予，或者根据药代动力学、药物分布和代谢的个体间差异来改变实际剂量和时间表。类似地，在体外应用中，量可以根据所使用的特定细胞系(例如基于细胞表面上存在的载体受体的数量，或用于基因转移的特定载体在细胞系中复制的能力)而改变。此外，每个细胞添加的载体的量可能会随着插入载体中的治疗基因的长度和稳定性以及该序列的性质而改变，并且特别是需要凭经验确定的参数，并且可以由于本发明方法非固有的因素(例如与合成相关的成本)而改变。本领域技术人员可以根据特定情况的紧急程度容易地做出任何必要的调整。
本文描述的这些方法绝不是都包括的，并且适合特定应用的进一步方法对于普通技术人员来说将是显而易见的。此外，可以通过与已知发挥所需效果的化合物的类比来进一步估计组合物的有效量。
抗体
在一些实施方式中，本发明提供了结合本发明抗原的VM蛋白的组合物，VM蛋白包括但不限于LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091、或其片段或变体。在一些实施方式中，与本发明的VM蛋白结合的组合物是抗体。
本发明涉及抗VM蛋白抗体的设计和开发及其用于钩端螺旋体感染或钩端螺旋体病的免疫疗法的用途。抗VM蛋白抗体可充当用于钩端螺旋体感染或钩端螺旋体病的免疫预防策略。
抗VM抗体可以结合受试者中存在的靶抗原(即VM蛋白)。这种结合可以中和抗原，阻断另一分子(例如蛋白或核酸)对抗原的识别，并且引发或诱导针对该抗原的免疫应答。
在一个实施方式中，组合物包含编码合成抗体或其片段的至少一种核酸分子。在一个实施方式中，核酸分子包含编码抗VM蛋白抗体的可变重链区的核苷酸序列和编码抗VM蛋白抗体的可变轻链区的核苷酸序列。在一个实施方式中，本发明提供了一种包含第一核酸分子和第二核酸分子的组合物，第一核酸分子包含编码抗VM蛋白抗体的可变重链区的核苷酸序列，第二核酸分子包含编码抗VM蛋白抗体的可变轻链区的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明的抗体(包括抗VM蛋白抗体片段)包括由任何合适的多核苷酸编码的本文公开的抗体氨基酸序列、或任何分离的或配制的抗体。此外，本公开的抗体包含具有本文描述的抗VM蛋白抗体的结构和/或功能特征的抗体。在一个实施方式中，抗VM蛋白抗体结合钩端螺旋体VM蛋白，并从而部分或实质上改变钩端螺旋体VM蛋白的至少一种生物活性。
在一个实施方式中，本发明的抗VM蛋白抗体免疫特异性结合对VM蛋白特异的至少一种表位，并且不特异性地结合其它多肽。该至少一种表位可以包含至少一个抗体结合区，该抗体结合区包含全长VM蛋白的至少一部分。本文使用的术语“表位”是指能够结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与构象表位的结合会丢失，而与非构象表位的结合不会丢失。
在一些实施方式中，本发明包括包含特异性结合VM蛋白的抗体(例如抗体的结合部分)的组合物。在一个实施方式中，抗VM蛋白抗体是多克隆抗体。在另一个实施方式中，抗VM蛋白抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗VM蛋白抗体是嵌合抗体。在进一步的实施方式中，抗VM蛋白抗体是人源化抗体。
抗体的结合部分包含抗体的一个或多个片段，该片段保留特异性结合结合配偶体分子(例如钩端螺旋体VM蛋白)的能力。已经表明，抗体的结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。涵盖在术语抗体的“结合部分”内的结合片段的示例包括：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature341:544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接起来，使它们能够制成单条蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird etal.(1988)Science 242:423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并利用与完整抗体相同的方式筛选片段。可以通过重组DNA技术或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生结合部分。
与本发明的钩端螺旋体VM蛋白结合的抗体是在体外、原位和/或体内抑制、阻断或干扰至少一种钩端螺旋体VM蛋白活性的抗体。
在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79中所示的HCDR序列。
在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82中所示的LCDR序列。
在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62和SEQ ID NO:63中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:77、SEQID NO:78和SEQ ID NO:79中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ IDNO:82中所示的LCDR序列。
在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:27中所示的HC序列和SEQ ID NO:28中所示的LC序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ IDNO:27中所示的HC序列和SEQ ID NO:43中所示的LC序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:51中所示的HC序列和SEQ ID NO:52中所示的LC序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:67中所示的HC序列和SEQ ID NO:68中所示的LC序列。在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:83中所示的HC序列和SEQ ID NO:84中所示的LC序列。
表1：抗VM蛋白抗体序列
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在一个实施方式中，本发明涉及一种核苷酸序列，其编码钩端螺旋体VM蛋白抗体或其片段。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核苷酸序列包含编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的RNA序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核苷酸序列包含编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的DNA序列。
在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79中所示的HCDR序列。
在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82中所示的LCDR序列。
在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:23中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:48、SEQID NO:49和SEQ ID NO:50中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQID NO:77、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81和SEQ ID NO:82中所示的LCDR序列。
在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:27中所示的HC序列和SEQ ID NO:28中所示的LC序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:27中所示的HC序列和SEQ ID NO:43中所示的LC序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:51中所示的HC序列和SEQ ID NO:52中所示的LC序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:67中所示的HC序列和SEQ ID NO:68中所示的LC序列。在一个实施方式中，核酸分子编码钩端螺旋体VM蛋白抗体，钩端螺旋体VM蛋白抗体包含SEQ ID NO:83中所示的HC序列和SEQ ID NO:84中所示的LC序列。
在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:53、SEQID NO:54和SEQ ID NO:55中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71中所示的HCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中所示的HCDR序列。
在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:40、SEQID NO:41和SEQ ID NO:42中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含至少一种、两种或三种SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90中所示的LCDR序列。
在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQID NO:34中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74中所示的LCDR序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:86和SEQ ID NO:87中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90中所示的LCDR序列。
在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:35中所示的HC序列和SEQ ID NO:36中所示的LC序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:35中所示的HC序列和SEQ ID NO:44中所示的LC序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:59中所示的HC序列和SEQ ID NO:60中所示的LC序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:75中所示的HC序列和SEQ ID NO:76中所示的LC序列。在一个实施方式中，编码钩端螺旋体VM蛋白抗体的核酸分子包含SEQ ID NO:91中所示的HC序列和SEQ IDNO:92中所示的LC序列。
本发明的组合物可以治疗、预防和/或防御与钩端螺旋体感染相关的疾病、病症或病情。
本发明的组合物可以具有有效组合物所需的特征，例如安全，使得该组合物不会引起疾病或死亡；预防疾病；且给药方便、副作用少、生物稳定性好且每剂成本低。
在一些实施方式中，本发明的钩端螺旋体VM蛋白结合分子(例如抗体等)表现出在盐、化合物和其它多肽的复杂混合物中检测和结合钩端螺旋体VM蛋白的高能力，例如通过本领域已知的多种体外和体内测定中的任何一种来评估。本领域技术人员将理解，本文描述的可用于疾病的诊断和治疗以及预防的方法中的钩端螺旋体VM蛋白结合分子(例如抗体等)也可用于本发明的程序和方法，包括但不限于免疫层析测定、免疫点测定、Luminex测定、ELISA测定、ELISPOT测定、蛋白微阵列测定、蛋白印迹测定、质谱测定、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散测定、液相色谱-串联质谱测定、ouchterlony免疫扩散测定、反相蛋白微阵列、火箭免疫电泳测定、免疫组织染色测定、免疫沉淀测定、补体固定测定、FACS、蛋白芯片测定、分离和纯化方法、以及亲和层析(也参见，2007,Van Emon,Immunoassay andOther Bioanalytical Techniques,CRC Press；2005,Wild,Immunoassay Handbook,GulfProfessional Publishing；1996,Diamandis and Christopoulos,Immunoassay,AcademicPress；2005,Joos,Microarrays in Clinical Diagnosis,Humana Press；2005,Hamdanand Righetti,Proteomics Today,John Wiley and Sons；2007)。
在一些实施方式中，本发明的钩端螺旋体VM蛋白结合分子(例如抗体等)表现出降低或中和钩端螺旋体VM蛋白活性的高能力，如通过本领域已知的多种体外和体内测定中的任一种所评估。
在某些实施方式中，抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可包含轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包含κ轻链恒定区。或者，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。
剂量和配制品
本发明设想通过给予一种或多种本发明的治疗剂(例如本发明的VM-结构域融合构建体；类毒素疫苗、抗VM抗体或编码抗VM抗体的核酸分子)来治疗受试者中的疾病，例如与钩端螺旋体病原体相关的疾病。
根据本发明的组合物的给予可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、给药的目的是治疗性的还是预防性的、以及技术人员已知的其它因素。本发明的试剂的给予可以在预选的时间段内基本上连续或可以是以一系列间隔的剂量。在一个实施方式中，将本发明的细胞因子组合物、抗原受体组合物和整合组合物局部给予同一部位。给予的量将根据多种因素而变化，包括但不限于所选择的组合物、具体疾病、哺乳动物的体重、身体状况和年龄以及是否要实现预防或治疗。临床医生利用本领域熟知的动物模型或其它测试系统可以容易地确定这些因素。
具有本发明的治疗剂的一种或多种合适的单位剂型(如下所讨论的，可以任选地配制用于持续释放(例如使用微囊化，参见WO 94/07529和美国专利号4,962,091，其公开内容通过引用并入本文))可以通过多种途径给予，包括肠胃外途径，包括静脉内和肌内途径，以及通过直接注射到患病组织中。例如，治疗剂可以直接注射到肿瘤中。在适当的情况下，配制品可以方便地以离散的单位剂型存在，并且可以通过药学中熟知的任何方法来制备。此类方法可包括将治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、细分固体载体或其组合混合的步骤，且然后，如果需要，将产物引入或成形到所需的递送系统中。
脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体或脂质复合物是生物活性化合物的有效药物递送系统，生物活性化合物为例如治疗性蛋白、肽或基于核酸的治疗剂，这些化合物是细胞不可渗透的。因此，在一些实施方式中，本发明涉及包含一种或多种脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体或脂质复合物的组合物，脂质纳米颗粒、脂质体或脂质复合物包含至少一种本发明的VM蛋白或编码它的核酸分子。
在某些实施方式中，将治疗剂与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合以形成药物配制品或单位剂型。此类配制品中的总活性成分占配制品重量的0.1％至99.9％。“药学上可接受的”是与配制品的其它成分相容并且对其接受者无害的载体、稀释剂、赋形剂和/或盐。给予的活性成分可以作为粉末或作为颗粒；作为溶液、悬浮液或乳液存在。
可以通过本领域已知的程序使用公知且易于获得的成分来制备含有本发明的治疗剂的药物配制品。本发明的治疗剂还可以配制成适合肠胃外给予(例如通过肌内、皮下或静脉内途径)的溶液。
本发明的治疗剂的药物配制品还可以采用水性或无水溶液或分散体的形式，或者替代地采用乳液或悬浮液的形式。
因此，治疗剂可以配制用于肠胃外给予(例如通过注射，例如推注或连续输注)并且可以以单位剂型存在于安瓿、预填充注射器、小容量输注容器或添加防腐剂的多剂量容器中。活性成分可以采用诸如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液等形式，并且可以含有配方剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是通过无菌分离无菌固体或通过从溶液中冻干获得的粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌、无热原水)重构。
应当理解的是，每种剂型的单个气雾剂剂量中所含的一种或多种活性成分的单位含量本身不需要构成用于治疗特定适应症或疾病的有效量，因为可以通过给予多个剂量单位来达到所需的有效量。此外，可以使用少于剂型中剂量，单独或一系列给予来实现有效量。
本发明的药物配制品可以包括作为任选成分的药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂以及本领域熟知类型的盐。可用于本发明的药物配制品的载体和/或稀释剂的具体非限制性示例包括水和生理学上可接受的缓冲盐溶液，例如pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲盐溶液。
可以配制并给予本发明的表达载体、转导的细胞、多核苷酸和多肽(活性成分)，以通过使活性成分与有机体体内的试剂作用位点产生接触的任何方式来治疗多种疾病状态。它们可以通过可与药物结合使用的任何常规方式给予，作为单独的治疗活性成分或以治疗活性成分的组合。它们可以单独给予，但通常与基于所选择的给予途径和标准制药实践选择的药物载体一起给予。
一般而言，水、合适的油、盐水、水性右旋糖(葡萄糖)和相关的糖溶液和二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是用于肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外给予的溶液含有活性成分、合适的稳定剂以及缓冲物质(如果需要)。单独或组合的抗氧化剂(例如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸)是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸钠(EDTA)。此外，肠胃外溶液可含有防腐剂，例如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。合适的药物载体描述于本领域的标准参考书雷明顿药物科学中。
本发明的活性成分可以配制为悬浮在适合用于哺乳动物且特别是人的药学上可接受的组合物中。此类配制品包括使用佐剂，例如美国专利号4,082,735、4,082,736、4,101,536、4,185,089、4,235,771和4,406,890中描述的胞壁酰二肽衍生物(MDP)或类似物。有用的其它佐剂包括明矾(Pierce Chemical Co.)、脂质A、二麦考酸酯海藻糖和二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、弗氏佐剂和IL-12。其它组分可以包括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物非离子表面活性剂和可代谢油例如角鲨烯(美国专利号4,606,918)。
另外，可以采用标准制药方法来控制作用持续时间。这些是本领域熟知的并且包括控释制剂并且可以包括适当的大分子，例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯基化合物(polyvinyl)、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。可以调节大分子的浓度以及掺入方法以控制释放。另外，该试剂可以掺入聚合物材料的颗粒中，例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。除了掺入之外，这些试剂还可用于将化合物捕获在微胶囊中。
因此，本发明的组合物可以通过各种途径递送并且递送至哺乳动物体内的各个部位以实现特定的效果(参见例如Rosenfeld et al.,1991；Rosenfeld et al.,1991a；Jaffeet al.,同上；Berkner，同上)。本领域技术人员将认识到，尽管可以使用多于一种途径进行给药，但是特定途径可以提供比另一途径更及时且更有效的反应。在一个实施方式中，上述组合物通过瘤内注射给予受试者。可用于本文描述的方法的其它给药形式包括但不限于直接递送至所需器官、肌内、皮下、皮内和其它肠胃外给药途径。
本发明的活性成分可以以单位剂型提供，其中每个剂量单位(例如一茶匙的量、片剂、溶液或栓剂)含有预定量单独的或与其它活性剂适当组合的组合物。本文所用的术语“单位剂型”是指适合作为用于人和哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单元，以足以产生所需效果的量计算，每个单元含有预定量单独的或与其它活性剂组合的本发明的组合物(在适当的情况下与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂组合)。用于本发明的单位剂型的规格取决于要实现的特定效果以及与特定宿主中组合物相关的特定药效学。
本文描述的这些方法绝不是全包括的，并且适合特定应用的进一步方法对于普通技术人员来说将是显而易见的。此外，组合物的有效量可以通过与已知发挥所需效果的化合物的类比来进一步估算。
治疗方法
在一个实施方式中，本发明包括在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括给予钩端螺旋体VM蛋白、类毒素疫苗、抗VM抗体或编码本发明的抗VM抗体的核酸分子。
在一个实施方式中，钩端螺旋体VM蛋白或肽或包含编码钩端螺旋体VM蛋白或肽的核苷酸序列的载体用作类毒素疫苗。本文还提供了一种通过给予有需要的受试者类毒素疫苗来治疗、防御和/或预防受试者疾病的方法。给予受试者该疫苗可以在受试者中诱导或引发免疫应答。诱导的免疫应答可用于治疗、预防和/或防御疾病，例如传染病，包括但不限于与钩端螺旋体感染相关的病状。
在一个实施方式中，包含与抗原肽融合的钩端螺旋体VM蛋白或肽的融合蛋白、或包含编码包含与抗原肽融合的钩端螺旋体VM蛋白或肽的融合蛋白的核苷酸序列的载体用作用于治疗与抗原肽相关的疾病或病症的治疗剂。
在一些实施方式中，抗原肽是肿瘤相关肽。因此，在一些实施方式中，诱导的免疫应答可用于治疗、预防和/或防御癌症。以下是可以通过所公开的方法和组合物治疗的癌症的非限制性示例：急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、阑尾癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌和脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童视觉通路肿瘤、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增殖性病症、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、尤因家族肿瘤、颅外癌、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、肝外癌、眼癌、蕈样瘤、胆囊癌、胃(胃)癌、胃肠道癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道癌间质瘤(gist)、生殖细胞瘤、妊娠期癌症、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、下丘脑肿瘤、眼内(眼)癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾(肾细胞)癌、朗格汉斯细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、霉菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、髓性白血病、骨髓瘤、骨髓增殖性病症、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中间分化的松果体实质肿瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体肿瘤、浆细胞肿瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管癌、涉及15号染色体上坚果基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯肿瘤。
在一个实施方式中，本发明的方法包括给予受试者抗原蛋白、肽，其中抗原蛋白、肽促进针对抗原的免疫应答的产生。在一个实施方式中，本发明的方法包括给予受试者核酸分子，其中核酸分子包含用于表达至少一种抗原蛋白或肽的表达构建体，其中抗原蛋白或肽促进针对编码的抗原蛋白或肽的免疫应答的产生。在一个实施方式中，本发明的方法包括给予受试者抗体，其中该抗体靶向疾病相关抗原。在一个实施方式中，本发明的方法包括给予受试者至少一种编码抗体或其片段的核酸分子，其中编码的抗体靶向疾病相关抗原。
在一些实施方式中，诱导的免疫应答可以包括诱导的体液免疫应答和/或诱导的细胞免疫应答。体液免疫应答可被诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。诱导的体液免疫应答可以包括IgG抗体和/或中和抗体。诱导的细胞免疫应答可包括CD8+T细胞应答，其被诱导约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。
疫苗剂量可以是1μg至10mg活性组分/kg体重/次，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/次。疫苗可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天给予。有效治疗的疫苗剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个实施方式中，本发明的疫苗或抗体可以单独给予。在一个实施方式中，本发明的疫苗或抗体可以与用于疾病或病症的另一种治疗组合给予。
在一个实施方式中，本发明的疫苗或抗体与作为初免或加强疫苗的额外疫苗组合物组合给予。在一个实施方式中，然后给予用疫苗(作为初免疫苗)免疫的受试者本发明的疫苗作为加强疫苗以增强免疫应答。
在一个实施方式中，本发明的载体可以表达至少两种抗原性多肽，其中至少一种抗原性多肽是本发明的钩端螺旋体VM蛋白。
给药
可以根据制药领域技术人员熟知的标准技术配制本发明的组合物。可以考虑诸如特定受试者的年龄、性别、体重和状况以及给药途径等因素，以医学领域技术人员熟知的剂量和技术给予此类组合物。受试者可以是哺乳动物，例如人、马、牛、猪、羊、猫、狗、大鼠或小鼠。
该组合物可以预防性或治疗性给予。在预防性给药中，组合物可以以足以诱导免疫应答的量给予。在治疗性应用中，将组合物以足以引发治疗效果的量给予需要它的受试者。足以实现这个的量被定义为“治疗有效剂量”。对此用途有效的量将取决于例如给予的治疗方案的具体组合物、给药方式、疾病的阶段和严重性、患者的一般健康状况以及处方医生的判断。
该组合物可以通过本领域熟知的方法给予，如Donnelly et al.(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner et al.(美国专利号5,580,859，1996年12月3日授权)；Felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日授权)；和Carson et al.(美国专利号5,679,647，1997年10月21日授权)中所描述的，其全部内容通过引用整体并入本文。本领域技术人员会知道，药学上可接受的载体的选择，包括生理学上可接受的化合物，取决于例如表达载体的给药途径。
该组合物可以通过多种途径递送。典型的递送途径包括肠胃外给药，例如皮内、肌内、瘤内或皮下递送。其它途径包括口服给药、鼻内和阴道内途径。特别是对于组合物的DNA，可以将组合物递送至个体组织的间隙空间(Felgner et al.,美国专利号5,580,859和5,703,055，其全部内容通过引用整体并入本文)。还可以将组合物给予肌肉，或者可以通过皮内或皮下注射、或经皮给予该组合物，例如通过离子电渗疗法。还可以采用组合物的表皮给药。表皮给药可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫应答(Carson et al.,美国专利号5,679,647，其内容通过引用整体并入本文)。
在一个实施方式中，本发明的蛋白、核酸分子或抗体可以给予哺乳动物(包括人)的细胞。
在一些实施方式中，本发明的蛋白、核酸分子或抗体可以作为注射剂(皮下、皮内或肌内注射)给予哺乳动物(包括人)的细胞。可以通过标准方法制备注射剂。例如，如果需要，将含有病毒载体的培养上清液浓缩，并与适当的载体或赋形剂一起悬浮在缓冲溶液(如PBS或盐水)中。然后，可以根据需要通过过滤器等过滤来对悬浮液进行灭菌，随后将其装入无菌容器中以制备注射剂。可以根据需要对注射剂补充稳定剂、防腐剂等。由此获得的表达载体可以作为注射剂给予受试者。
在一些实施方式中，蛋白、核酸分子或抗体可以配制用于通过皮内(ID)疫苗接种的方式给药(例如通过Mantoux技术进行ID注射、使用空心微针、使用基因枪、使用划痕或通过用于其它ID递送的方法)。用于ID疫苗接种的配制品可以通过标准方法制备。例如，如果需要，浓缩含有蛋白、核酸分子或抗体的培养物上清液，并将其与适当的载体或赋形剂一起悬浮在缓冲溶液(如PBS、核酸分子稳定溶液或盐水)中。然后，可以根据需要通过过滤器等过滤来对悬浮液进行灭菌，随后将其装入无菌容器中以制备用于ID疫苗接种的配制品。可以根据需要对用于ID疫苗接种的配制品补充稳定剂、防腐剂等。由此获得的组合物可以皮内给予受试者。
本发明还提供了一种用于在动物中产生免疫应答的方法，包括以有效刺激免疫应答的量给予动物上述蛋白、肽、核酸分子或组合物中的任一种。在一个实施方式中，免疫应答包括以下中的一种或多种：对表达的靶抗原特异性的记忆CD8+T细胞的产生、对表达的靶抗原特异性的记忆CD4+T细胞的产生和对表达的靶抗原特异性的抗体的产生。在一个实施方式中，至少一些抗体是中和抗体。
本发明进一步提供了包含本发明的钩端螺旋体VM蛋白的药物组合物(例如疫苗)。在一个实施方式中，组合物包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂载体。组合物还可以含有水性介质或含水悬浮液，以增加该组合物的活性和/或保质期。介质/悬浮液可包括盐、葡萄糖、pH缓冲剂、稳定剂、乳化剂和防腐剂。
在一些实施方式中，组合物进一步包含佐剂，例如包括但不限于：胞壁酰二肽；氢氧化铝；皂苷；聚阴离子；双亲性物质；卡介苗(BCG)；内毒素脂多糖；匙孔血蓝蛋白(GKLH)；和环磷酰胺。
一方面，本发明提供了一种给予根据本发明的治疗有效的组合物的方法。期望的治疗效果包括以下中的一种或多种：减少或消除细菌负荷、增加CD4+和/或CD8+T细胞或识别编码的抗原的抗体的数量；增加CD4+T细胞的总体水平；增加识别抗原的中和抗体的水平；减少疾病症状的数量或严重性；减少癌症特异性标志物的表达；减少肿瘤的大小或生长速度；预防肿瘤转移；预防病原生物体感染等。可以通过评估生物标志物和/或异常生理反应来监测治疗效果。一般而言，根据本发明的组合物的有效剂量包含可调节针对编码的抗原的免疫应答的滴度，使得产生对编码的抗原具有特异性的记忆T细胞。
可以基于患者的状况(例如年龄、体重、一般健康状况)、发展疾病的风险或疾病进展的状态来确定剂量和给药方式。
在一个实施方式中，重组病毒的有效量范围为约10μl至约25μl盐水溶液，其含有的浓度为约1×1010至1×1011空斑形成单位(pfa)病毒/ml。
在本发明的一个实施方式中，进行初次免疫接种，随后任选地在初次免疫接种后约3-4周进行加强免疫接种。然而，直到初免加强后至少约4个月、约6个月、约8个月、约12个月、约10个月、约16个月、约18个月或约24个月才需要提供后续免疫接种。一方面，组合物是预防性疫苗，给予未检测出疫苗抗原呈阳性的患者，例如给予处于暴露于钩端螺旋体细菌风险的个体。在另一个方面，疫苗治疗性地给予疫苗抗原血清反应阳性的人(尽管不一定表现出症状)(即例如给予钩端螺旋体阳性个体)。
试剂盒
本发明还包括一种包含一种或多种本文描述的组合物的试剂盒。例如，在一个实施方式中，试剂盒包含钩端螺旋体VM蛋白、其变体或片段、编码钩端螺旋体VM蛋白、其变体或片段的核酸分子、或包括钩端螺旋体VM结构域的融合构建体。在一个实施方式中，试剂盒包含抗钩端螺旋体VM抗体或编码它的核酸分子。在一个实施方式中，试剂盒包含描述该组合物的使用的说明材料。例如，在一些实施方式中，说明材料描述了给予受试者组合物作为治疗性治疗或非治疗用途，如本文别处描述的。在一个实施方式中，试剂盒进一步包含一种或多种用于测定(例如本发明的免疫测定)中使用的附加试剂。
实验例
下面结合以下实验例对本发明作进一步详细说明。提供这些实施例仅是为了说明的目的，并且除非另有说明，否则并不旨在进行限制。因此，本发明决不应当被解释为限于以下实施例，而是应当被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变型。
实施例1：钩端螺旋体VM(“毒力修饰”)蛋白
设计了包含一种或多种VM蛋白的钩端螺旋体VM蛋白疫苗并测试了其保护小鼠免受钩端螺旋体挑战的能力。包含多种VM蛋白的泛疫苗显示出完全的免于死亡的保护作用。
以两种方式表达钩端螺旋体VM蛋白。将问号钩端螺旋体血清型Lai蛋白LA3490、tLA3490、LA0620和LA1402产生为mCherry融合物。将第II部分问号钩端螺旋体血清型Copenhageni蛋白LIC12340(LA1400的保守直系同源物)和LIC12985(LA0591的保守直系同源物)不产生为mCherry融合物。
图1和图2显示了泛疫苗挑战研究设计和实验时间表。
在致死挑战(低传代问号钩端螺旋体血清型Canicola)后，通过泛疫苗保护免疫的C3H/HeJ小鼠免受死亡/体重减轻(图3和图4)。
与PBS阴性对照相比，VM蛋白疫苗减少了肾脏(图5和图6)和肺(图7和图8)中的细菌负荷。
在挑战前检测到交叉反应性VM蛋白抗体(图9)。
VM蛋白-mCherry融合蛋白疫苗组分
将全长LA3490(氨基酸40-639)、截短的tLA3490(短，仅是蓖麻毒素B结构域，氨基酸40-174)、全长LA0620(氨基酸41-637)和全长LA1402(氨基酸28-641)表达到pET32b的XhoI/NcoI限制性位点中。将这些蛋白表达为融合物，融合物在氨基末端处具有硫氧还蛋白(TrxA)、S-标签、His6亲和/表位标签和肠激酶切割位点，并且在羧基末端具有额外的肠激酶切割位点以及mCherry融合物和His6亲和/表位标签。接头是作为铰链的(Gly4Ser)5。
挑战研究：细菌负荷结果的保护和减少
挑战细菌接种物：问号钩端螺旋体血清型Canicola
第1组：以稳定的水包油纳米乳液(SE)配制的PBS加吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)，(GLA-SE)佐剂。无保护，每克组织约8.5log10个细菌拷贝。
第2组：t3490(LA3490的蓖麻毒素B结构域)，加上佐剂。与第1组相比，肾脏中的细菌负荷减少了约2.5log10数量级，并且肝脏中的细菌负荷减少了约4log10数量级。
第3组：(五种蛋白)重组全长LA3490、LA0620、LA1402加LIC12340(LA1400)和LIC12985(LA0591加GLA-SE佐剂)。与第1组相比，完全防止死亡，并且肾脏中的细菌负荷减少了约3.5log10数量级，并且肝脏中的细菌负荷减少了约3.9log10数量级。
第4组：(两种蛋白)重组全长LIC12340(LA1400)和LIC12985(LA0591)加GLA-SE佐剂，与第1组相比，完全防止死亡，并且肾脏中的细菌负荷减少了约4.0log10数量级，并且肝脏中的细菌负荷减少了约4.1log10数量级。
pET32b中表达的LA3490-mCherry
克隆到pET32b中的构建体的全长LA3490 DNA序列(大肠杆菌-优选密码子)(SEQID NO:1)
/>
全长LA3490氨基酸序列
名称：LA_3490_mCherry，序列：蛋白，5'序列：，3'序列：，序列长度：877(SEQ IDNO:2)
pET32b中表达的LA0620-mCherry
克隆到pET32b中的构建体的全长DNA序列(大肠杆菌-优选的密码子)(SEQ ID NO:3)
/>
氨基酸序列
名称：Full_LA_0620_mCherry，序列：蛋白，5'序列：，3'序列：，序列长度：862(SEQID NO:4)
t3490(LA3490，氨基酸40-174，mCherry融合物，在prSET中表达)
克隆到pRSET中的构建体的DNA序列(大肠杆菌-优选的密码子)(SEQ ID NO:5)
氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
pET32b中表达的LA1402-mCherry
克隆到pET32b中的构建体的DNA序列(大肠杆菌-优选的密码子)(SEQ ID NO:7)
/>
氨基酸序列
名称：LA_1402_mCherry，序列：蛋白，5'序列：，3'序列：，序列长度：870(SEQ IDNO:8)
/>
不具有mCherry融合物的VM蛋白
以大肠杆菌-优选的密码子合成编码问号钩端螺旋体血清型Copenhageni蛋白的基因，该蛋白编码LIC12340的氨基酸31-627(LA1400的>99％保守的直系同源物)和LIC12985的氨基酸23-314(LA0591的>99％保守的直系同源物)，并将该基因克隆到pET32b的XhoI/NcoI限制位点中。这些蛋白被表达为融合体，该融合体在氨基末端具有硫氧还蛋白(TrxA)、S-标签、His6亲和/表位标签和肠激酶切割位点并且在羧基末端具有His6亲和/表位标签，所有融合配偶体均由pET32b载体编码。
LIC12340(LA1400的保守直系同源物)
克隆到pET32b中的构建体的DNA序列(大肠杆菌-优选的密码子)(SEQ ID NO:9)
氨基酸序列
名称：LIC_12340(LA_1400直系同源物)，序列：蛋白，5'序列：，3'序列：，序列长度：597(SEQ ID NO:10)
LIC12985(LA0591的高度保守的直系同源物)
克隆到pET32b中的构建体的DNA序列(大肠杆菌-优选的密码子)(SEQ ID NO:11)
氨基酸序列
名称：LIC_12985(LA_0591直系同源物)，序列：蛋白，5'序列：，3'序列：，序列长度：291(SEQ ID NO:12)
含有Q8F6A9_LEPIN蓖麻毒素B型凝集素结构域的蛋白OS＝问号钩端螺旋体血清组黄疸出血血清型Lai(菌株56601)OX＝189518GN＝LA_1400PE＝4SV＝2(SEQ ID NO:13)
Q72PX7_LEPIC未表征的蛋白OS＝问号钩端螺旋体血清组黄疸出血血清型copenhageni(菌株Fiocruz L1-130)GN＝LIC_12340PE＝4SV＝1(SEQ ID NO:14)信号序列(粗体)未包括在重组蛋白构建体中。
实施例2：AB毒素的钩端螺旋体新型PF07598VM基因家族的基于计算智能的评估以 推断发病机制
尽管确定了多种钩端螺旋体毒力因子、信息丰富的体外和小动物模型，但钩端螺旋体的发病机制和生物学仍然具有挑战性。血管不稳定性、肝和肾功能障碍和肺出血主要见于严重钩端螺旋体病，推测由致病性钩端螺旋体分泌的循环毒素引起。毒力修饰(VM)蛋白(PF07598)是I组致病性钩端螺旋体的一个区别性特征，并且是经过实验验证的真正含有R型凝集素结构域的外毒素。VM蛋白包含串联的N-末端蓖麻毒素B链样β-三叶形结构域和C-末端DNA酶活性，其迅速导致染色体断裂和细胞死亡。
此处，使用计算工具和人工智能导出的VM蛋白的高分辨率三维结构(使用DeepMind AlphaFold算法)，在序列、原子和结构水平上探索了新型钩端螺旋体毒素的作用机制。目前的发现表明，PF07598蛋白家族与均仅由一个基因和一种蛋白编码的植物来源的蓖麻毒素B-链[N-末端独特(QxW)3基序]、细菌CARD毒素[D3结构域，芳香斑块]和哺乳动物DNA酶[C-末端催化残基]具有显著程度的特征性保守序列基序和结构相似性。独特VM蛋白的进化差异起源为致病性和宿主向性提供了重要见解。通过诱变方法对VM蛋白进行的结构-功能验证为了解钩端螺旋体病的发病机制和开发新的治疗性和预防性措施提供了独特的机会。
钩端螺旋体新型R-型凝集素：特征性糖类结合芳香斑块和存在的序列基序(QXW)3 增强VM蛋白是真正的R-型凝集素
R-型凝集素是蛋白超家族的成员，并且它们都含有糖类识别结构域(CRD)以及对糖缀合物(例如蓖麻毒素B链(Cummings et al.,2017,Cold Spring Harbor LaboratoryPress))的复合糖类(糖蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖和糖脂)的结合功能。蓖麻毒素是一种来自蓖麻子(蓖麻)的有毒蛋白，是在植物中发现的第一个凝集素(Olsnes et al.,1974,Nature,249(458):627-31)。R-型凝集素结构域与AB毒素的结合结构域(B-链)相关(Varkiet al.,2015,Cold Spring Harbor)。B-链的组成和结构的更大异质性很可能进化为识别广泛的靶细胞(DiRienzo et al.,2014,New Journal of Science,26.)。
AlphaFold算法导出的VM蛋白的高分辨率三维(3D)结构框架使我们能够了解多球蛋白结构-功能关系的重要性(待出版)(Callaway et al.,2020,Nature,588(7837):203-4；Jumper et al.,2020,predictioncenterorg/casp14/doc/CASP14_Abstracts；Senioret al.,2020,Nature,577(7792):706-10)。致病性钩端螺旋体编码～640aa分子量、12+旁系同源VM蛋白，并且它们编码从单个基因位点转录的单个多肽，与大多数其它细菌AB毒素不同。通过Ramachandran图接着Verify3D(doe-mbi.ucla.edu/verify3d/)[LA3490：89.20％，LA0620：92.15％，LA1402：90.02％，LA1400：98.60％，和LA0591：84.98％的残基的平均3D-1D得分>＝0.2且分数及格](Pontius et al.,1996,J Mol Biol,264(1):121-36)验证了VM蛋白的3D结构。通过程序PROVE(蛋白体积评价)(saves.mbi.ucla.edu/Jobs/1016444/prove/PROVE_PLOT.ps)和计算的Z-得分平均值、Z-得分标准偏差和Z-得分RMS进一步验证了该结构(图10)。
VM蛋白的旁系同源物包含高度保守的串联N-末端三叶样凝集素(RBL1和RBL2)结构域和可变C-末端结构域(Chaurasia et al.,2022,Front Microbiol,13:859680)。值得注意的是，问号钩端螺旋体包含天然CBR缺失变体(～313aa)，其含有预测的信号序列。计算和体外实验验证确认，只有RBL1结构域(LA3490的N-末端区域，40aa-150aa)在结构上与具有RMSD–1.796的蓖麻毒素B链(PBD；2AAI-B：7aa至129aa)叠加，且仅负责与宿主细胞受体上存在的N-末端半乳糖基糖蛋白部分结合(Chaurasia et al.,2022,Front Microbiol,13:859680)。由于存在表面暴露的芳香族(酪氨酸)和杂环(苯丙氨酸和色氨酸)氨基酸，RBL1和RBL2富含芳香族斑块(图11A)。这些芳香族斑块似乎在宿主受体/糖类识别中发挥重要作用。除了芳香族斑块之外，RBL1结构域还在类似于蓖麻毒素B链的β-三叶结构域中包含三种序列保守的QxW基序(40QKP42、78QCW80和134QRW136)(图11B)。有趣的是，RBL1与蓖麻毒素B链的多序列比对表明，仅134QRW136基序在RBL1和蓖麻毒素B链中是保守的，并且值得注意的是，RBL1结构域中第一个QxW基序(40QKP42)中的色氨酸被脯氨酸替代。QxW序列保守基序在受体识别中发挥重要作用，并且通过糖类结合基序内的氢键有助于结构稳定(Hatakeyama etal.,2007,J Biol Chem,282(52):37826-35；Hazes et al.,1995,Nat Struct Biol,2(5):358-9；Hazes et al.,1996,Protein Sci,5(8):1490-501)。在RBL1结构域中，序列基序158YGY160在蓖麻毒素B链中高度保守，并且呈现出具有与蓖麻毒素B链类似的功能性糖类结合能力。LA1402和LA1400是I组致病性钩端螺旋体中的祖先VM蛋白，并且它们属于同一簇A。计算分析预测表明，这两种蛋白(LA1402和LA1400)缺乏78QCW80基序，这可能解释了VM蛋白通过连续基因复制的进化获得了78QCW80基序结合宿主细胞表面/宿主向性的必要性(Chaurasia et al.,2022,Front Microbiol,13:859680；Fouts etal.,2016,PLoS NeglTrop Dis,10(2):e0004403)。VM蛋白与宿主受体结合的必要性是理解宿主-病原体相互作用机制的关键步骤。充分研究的蓖麻毒素B链(RTB)是半乳糖特异性凝集素，其包含两个相同的糖结合位点，优选寡糖(Frankel et al.,1996,Biochemistry,35(47):14749-56)。一个末端半乳糖被RTB的结合位点1(W37)结合，而另一末端半乳糖可结合RTB的另一分子的结合位点2(Y248)而没有任何空间位阻，并且产生强疏水相互作用，这使蛋白-糖复合物稳定(Sphyris et al.,1995,J Biol Chem,270(35):20292-7)。因此，参考蓖麻毒素B链，不受理论的束缚，假设VM蛋白的(QxW)3或158YGY160基序中芳香族斑块的缺失或酪氨酸和色氨酸的替换可能会使得β-三叶形折叠的基础结构不稳定。这导致提出了一个假设，即抑制VM蛋白与宿主细胞表面的结合，并且最有可能抑制毒素组装并阻断主要的毒力因子。这些基序或糖类结合结构域的基础研究可以通过诱变和聚糖微阵列来实现，诱变和聚糖微阵列是检查聚糖-蛋白(宿主-病原体)相互作用或鉴定宿主受体/先天免疫受体的极好工具(Geissneret al.,2019,Proc Natl Acad Sci U S A,116(6):1958-67)。
VM蛋白的RBL2结构域与CARDS毒素的序列和结构相似性，其使结合和内化的功能 相似性合理化
未揭示VM蛋白的RBL2的结构和功能，使VM蛋白的氨基酸序列经受高通量Predictprotein在线服务器(predictprotein.org)(Bernhofer et al.,2021,NucleicAcids Res,49(W1):W535-W40)。该软件使用具有进化信息的机器学习算法并且预测蛋白的结构和功能。Predictprotein比对了32种蛋白，其中31个匹配属于PF07598蛋白家族，而其它匹配是CARD毒素(PDB：4TLV_A链)，其显示出相当大的匹配，同一性为0.55，预期值：2e-94且匹配长度(310aa)。通过PyMOL 2.4.0(pymol.org/2/)将VM蛋白和CARD毒素(PDB:4TLV)的全长在结构上叠加并可视化。仅VM蛋白的RBL2(196aa-335aa)叠加在CARD毒素的C-末端(PDB：4TLV，D3结构域：447aa-591aa)，RMSD-(图12A、B)。使用MAFFT(使用快速傅里叶变换的多重比对)利用L-INS-i(精确导向的)算法对PF07598蛋白家族的RBL2(196aa-335aa)和CARD毒素(PDB：4TLV，447aa-591aa)的氨基酸序列进行比对，并在Jalviewv2.11.5(jalview.org)中可视化。CARD毒素的D3结构域包含8个色氨酸，并且RBL2包含9个色氨酸，有趣的是RBL2和CARD毒素中有6个色氨酸在序列和结构水平上都是保守的。CARD毒素(D2+D3三叶形)没有半乳糖结合位点，这表明VM蛋白的RBL1似乎是唯一的糖类结合配偶体。CARD毒素的残基571aa–591aa(对于D3的正确折叠及其芳香族斑块的形成至关重要)的诱变缺乏HeLa细胞的内化，因此表明CARD毒素进入通过D3结构域介导的宿主细胞(Beckeret al.,2015,Proc Natl Acad Sci U S A,112(16):5165-70；Ramasamy et al.,2018,mBio,9(1))。VM蛋白的RBL2和CARD(D3结构域)的叠加/>和它们的芳香族斑块中的六个保守色氨酸增强了RBL2作为VM蛋白中易位结构域的功能，这使VM蛋白内化到宿主细胞中。根据该信息，不受理论的束缚，假设这些保守色氨酸/芳香族斑块中的突变消除了蛋白到宿主细胞的内化。总的来说，诱变、聚糖微阵列和表面等离子体共振(SPR)将打开一个窗口来表征RBL结构域的功能，并识别它们的糖类结合配偶体和宿主细胞内VM蛋白的易位。
与蓖麻毒素相似的分子内二硫键架构证实了VM蛋白是真正的AB-毒素
文献研究显示了多种外毒素，例如白喉毒素[白喉棒杆菌：AB(Murphy et al.,2011,Toxins(Basel),3(3):294-308)]、百日咳毒素[百日咳博代氏杆菌：A(S1)-B(S2-S5)(Stein et al.,1994,Structure,2(1):45-57)]、志贺毒素[志贺氏痢疾杆菌：AB5(Johannes,2017,Toxins(Basel),9(11)]、外毒素A[铜绿假单胞菌AB(Ogata et al.,1990,J Biol Chem,265(33):20678-85)]和植物来源蓖麻毒素[蓖麻：AB(Lord et al.,2011,Toxins(Basel),3(7):787-801)]，属于AB-型毒素类别(Cherubin et al.,2018,Sci Rep,8(1):2494)。这些被称为AB毒素，因为它们含有识别细胞表面上特定受体的至少一种亚基或多肽(B-链)以及可进入细胞以进入靶位点的一种亚基或多肽(A-链)。这些AB毒素通过ADP-核糖基化、糖基化、脱酰胺、脱腺苷化、蛋白水解和乙酰化等特异性地修饰宿主靶。这些修饰通常导致靶失活，这改变了细胞生理学或可能导致坏死或凋亡细胞死亡(Odumosu et al.,2010,Toxins(Basel),2(7):1612-45；Biernbaum et al.,2022,Toxins(Basel),14(1))。AB毒素中二硫键的形成调节其功能作用激活的折叠和稳定性需求，因此它们影响AB毒素的结构和功能特性(Hogg,2003,Trends Biochem Sci,28(4):210-4)。蓖麻毒素A-链和B-链中二硫键的减少降低了其在小鼠中的毒性，并且也降低了抑制HeLa细胞蛋白合成的能力(Lappiet al.,1978,Proc Natl Acad Sci U S A,75(3):1096-100)。
AlphaFold算法导出的VM蛋白的结构架构显示，它们包含十二个半胱氨酸残基，十个半胱氨酸参与形成类似于蓖麻毒素的五个二硫键(5-二硫键)(Chaurasia et al.,2022,Front Microbiol,13:859680；Lappi et al.,1978,Proc Natl Acad Sci U S A,75(3):1096-100)(图13A、B、C)。有趣的是，VM蛋白的RBL1包含两个二硫键(62aa-79aa、105aa-127aa)，RBL2结构域包含一个二硫键(244aa-262aa)且C-末端球状结构域编码两个二硫键(353aa-608aa和630aa-635aa)(图13A-D)。VM基因编码与蓖麻毒素不同的单多肽链，因此二硫键的蛋白水解切割在将RBL1、RBL2和C-末端加工成其功能结构域的过程中起着关键作用。蓖麻毒素A链(RTA)含有两个半胱氨酸残基(Cys171和Cys259)，Cys259与蓖麻毒素B链(RTB)的Cys4形成蓖麻毒素全毒素的链间二硫键。有趣的是，通过定点诱变(蓖麻毒素中在259aa处的半胱氨酸替换为丙氨酸)破坏A链中的该二硫键降低了细胞毒性(Mohanraj etal.,1995,Biochim Biophys Acta,1243(3):399-406)，或向蓖麻毒素A链中引入新的二硫键降低了蓖麻毒素的细胞毒性(Argent et al.,1994,J Biol Chem,269(43):26705-10)。基于蓖麻毒素与VM蛋白的结构叠加，在位置353aa-608aa(蓖麻毒素中的4aa-259aa)处的二硫键被认为对于核内体中的C-末端蛋白水解或水解至关重要，在核内体中具有生物活性的C-末端结构域随后释放到细胞质中并转位到细胞核。有趣的是，LA0591(313aa)天然缺乏RBL(RBL1和RBL2)，这表明这种天然突变体不需要结合并内化到宿主细胞中，因此推测了它们在发病机制中的细胞间作用。LA0591中的两个半胱氨酸在C-末端形成二硫键(303aa-308aa)，诱变研究将为VM蛋白及其直系同源物中二硫键的功能作用提供信息(图13E)。
CARD毒素编码氨基酸位置230、247、324、406、425和548处的6个半胱氨酸残基，并且在残基C230和C247之间形成对于其细胞毒性至关重要的二硫键信息。诱变研究表明，二硫键保护CARDS毒素的ADPRT(D1)结构域免受蛋白酶的影响，并且破坏的二硫键不会影响细胞结合、内化和细胞内运输(Balasubramanian et al.,2019,Cell Microbiol,21(8):e13032)。在志贺毒素的A链中，在核内体或反式高尔基体网络中的蛋白酶切割后，二硫键稳定毒素亚基(Garred et al.,1995,J Biol Chem,270(18):10817-21；Tam et al.,2007,Microbiology(Reading),153(Pt8):2700-10)，然而志贺毒素缺乏二硫键的突变体更容易被蛋白酶降解并且对细胞的细胞毒性较小(Garred et al.,1997,J Biol Chem,272(17):11414-9)。同样，在百日咳毒素中，二硫键的还原改变了其构象，这种构象是毒素表现出NAD糖水解酶和ADPRT活性所必需的(Moss et al.,1983,J Biol Chem,258(19):11879-82；Burns et al.,1989,J Biol Chem,264(1):564-8)。在白喉毒素和霍乱毒素中，二硫键的还原导致活性片段从核内体释放到胞质溶胶中(Falnes et al.,1994,J Biol Chem,269(11):8402-7；Collier,2001,Toxicon,39(11):1793-803；Tsai et al.,2001,Cell,104(6):937-48；Sandvig et al.,2002,FEBS Lett,529(1):49-53)。
细菌毒素中二硫键的重要性及其在发病机制中的作用加强了PF07598蛋白家族的RBL和二硫键架构的计算信息(图13)。半胱氨酸残基定点诱变或在VM蛋白中工程化新的二硫键的方法可用于降低细胞毒性，因此可用作疫苗候选。综上，这些数据得出这样的假设：二硫键在VM毒素的激活和随后的细胞病理学事件中发挥着关键作用。
比较计算分析破译PF07598蛋白家族C-末端的热点残基和活性位点
本研究旨在鉴定积极参与底物或配体结合的VM蛋白氨基酸的功能重要区域。使AlphaFold算法生成的VM蛋白3D结构(全长和C-末端结构域)经受基于在线机器学习的服务器，例如FTMap服务器(ftmap.bu.edu)(Kozakov et al.,2015,Nat Protoc,10(5):733-55)、PrankWeb(prankweb.cz)(Jendele et al.,2019,Nucleic Acids Res,47(W1):W345-W9)和Deepsite(playmolecule.com/deepsite/)(Jimenez et al.,2017,Bioinformatics,33(19):3036-42)，以进行基于结构的配体结合位点预测和确定积极参与配体结合的比较保守的热点残基。配体结合位点的分析通常用于功能识别和基于3D结构的药物发现。FTMap服务器使用16种小分子作为探针(乙醇、异丙醇、异丁醇、丙酮、乙醛、二甲醚、环己烷、乙烷、乙腈、脲、甲胺、苯酚、苯甲醛、苯、乙酰胺和N,N-二甲基甲酰胺)并识别热点区域，该热点区域是结合自由能的主要贡献者，因此它们是任何配体结合的关键区域(Kozakov et al.,2015,Nat Protoc,10(5):733-55；Ngan et al.,2012,Nucleic Acids Res,40:W271-5)。FTMap分析表明，氨基酸Cys403、His533和Ser482是全长LA3490蛋白中的热点残基，并显示与簇的相互作用数量为2111、1457和1128，然而LA3490的C-末端结构域(368aa-369aa)显示更高数量的热点残基以及与簇的相互作用(Arg615-3109、His533-2510、Cys403-2400、Gln486-1890、Thr549-1622和Gln523-1357)(图14和图15)。有趣的是，对于LA3490，His533显示出高结合能，并且与在其它VM蛋白(LA0620：His530，LA1400：His469，LA1402：His537，LA0591：His205)中一致，是最佳热点残基(图15B)。目前的研究表明，His533(LA3490)是关键氨基酸，并且诱变方法可以揭示其在催化中的功能作用。
PrankWeb和Deepsite是另一种基于免费模板在线机器学习的算法，用于基于结构的配体结合位点预测(Jendele et al.,2019,Nucleic Acids Res,47(W1):W345-W9；Jimenez et al.,2017,Bioinformatics,33(19):3036-42；Krivak et al.,2018,JCheminform,10(1):39)。PrankWeb在全长LA3490中识别出14个口袋，并根据概率和溶剂可及表面将它们排名为1至14(SAS点)。口袋1的得分为18.30，相对于其余口袋，其具有0.817的最高概率和106的溶剂可及表面(SAS点)(图16A、16C)。值得注意的是，得分最高的口袋1位于C-末端凹槽，且重要地包含氨基酸Cys403、Gln523、His533和Thr549，这也经过FTMap服务器筛选(图17)。Deepsite基于机器学习的算法识别出两个深口袋，His533、Thr549和Gln523位于口袋1的C-末端且His451、Tyr621位于口袋2。FTMap和PrankWeb也识别了口袋1的氨基酸。值得注意的是，氨基酸Cys406、His525、Thr531、Pro548、Asn550、Trp554和Asn580氨基酸被PrankWeb和Deepsite识别和共享，但不被FTMap服务器识别和共享(图17)。这项比较研究表明，His533、Thr549和Gln523具有高度保守性、高置信度并积极参与配体结合，因此这些氨基酸可用于通过定点诱变进行功能研究。缺乏RBL的天然突变变体LA0591显示，由所有三个在线服务器(FTMap、PrankWeb和Deepsite)识别的His205参与配体结合(图16B、16D和图17)。
由于DNA酶活性，使用牛DNA酶(PDB：3DNI)的3D结构验证了识别VM蛋白中配体结合位点的比较研究，并且其活性位点与VM蛋白叠加(图17)。值得注意的是，在牛DNA酶中，Asn7、Glu39、Tyr76、Arg111、Asp251、His134、Asp168、Asn170和His252被FPMap识别为热点残基，并且这些氨基酸由PrankWeb和Deepsite共享(图17)。牛DNA酶(PDB：3DNI)和人DNA酶(4AWN)的晶体结构表明，Arg9、Arg41、Tyr76、Glu78、His134、Asp168、Asp212和His252是存在于活性位点的氨基酸(Suck et al.,1984,EMBO J,3(10):2423-30；Parsiegla et al.,2012,Biochemistry,51(51):10250-8)。三个独立服务器FTMap、PrankWeb和Deepsite列出的VM蛋白中的共享氨基酸列表以及牛和人DNA酶与活性位点重叠的配体结合位点的识别表明，这些基于机器学习的算法可以可靠地筛选蛋白中的热点残基/配体结合位点/活性位点。在牛和人中，His134和His252及其氢键对Glu 78和Asp 212对于功能性DNA酶I活性至关重要(Pan et al.,1998,Protein Sci,7(3):628-36)并且在四个催化氨基酸(His134、His252、Glu 78和Asp 212)中任一个处的突变显著降低了DNA酶I的水解活性(Pan et al.,1998,Protein Sci,7(3):628-36)。牛DNA酶的杂环His134与PF07598基因家族的His533(LA3490)的叠加增强了VM蛋白中的催化位点，该催化位点由在VM蛋白C-末端处高度保守的His533介导(LA0620：His530，LA1400：His469，LA1402：His537，LA0591：His205)(图14D，图15)。定点诱变方法将有助于揭示VM蛋白C-末端处的功能催化残基。此外，Predictprotein(predictprotein.org)在线服务器进一步提供了有关结构功能的信息知识，并通过显示VM蛋白C-末端处的DNA结合域来加强计算分析(图15)。
VM蛋白的DNA酶活性取决于Mg+2离子，然而Zn+2、Ca+2的存在或Mg+2离子的缺失会消除VM蛋白的催化活性(图18)。使用MGLTools 1.5.7.用磷酸根离子和镁离子对LA3490的C-末端进行对接研究。镁离子与热点残基Gln412相互作用并且显示结合能-0.95kCal/mol，然而磷酸根离子与热点残基Arg615相互作用并且显示结合能-2.58kCal/mol(图18)。热点残基或配体结合残基是定点诱变方法的最佳靶，导致对PF07598蛋白家族中的活性位点进行功能表征。
实施例3：用问号钩端螺旋体PF07598基因家族编码的毒力修饰蛋白进行疫苗接种 保护了小鼠免受严重钩端螺旋体病并减少了肝脏和肾脏中的细菌负荷
自从对钩端螺旋体病的病因学进行最初描述以来，致病性钩端螺旋体引起严重疾病的机制仍然难以捉摸(Noguchi et al.,1917,J Exp Med,25(5):755-63；Inada et al.,1915,The Journal of Experimental Medicine,XXIII:377-402)。尽管历史上钩端螺旋体的命名一直令人困惑，但最近的基因组和分子方法已经澄清了物种和血清型之间的关系。非常重要的是发现PF07598基因家族仅存在于致病性第1组钩端螺旋体中，并且在致病性最强的物种问号钩端螺旋体以及kirschneri钩端螺旋体和野口氏钩端螺旋体中扩展。严重的人类疾病主要归因于属于问号钩端螺旋体的血清型的感染；此类数据有限，因为从严重钩端螺旋体病病例中获得的分离株不足以明确识别此类病例中的感染钩端螺旋体。由于目前针对钩端螺旋体的基因敲除方法仍然有限，尤其是应用于多基因家族时，因此采用免疫学方法来证明钩端螺旋体PF07598基因家族编码的VM蛋白是否可能是导致小鼠模型中严重钩端螺旋体病疾病表现的毒力因子。此处提供的数据支持这样的假设，即VM蛋白作为毒力因子在严重钩端螺旋体病的发病机制中具有核心重要性。
使用少至两种问号钩端螺旋体血清型Lai VM蛋白(G-IV，LA1400和LA0591)但多至五种(G-III，LA1400和LA0591，加上LA3490、LA0620和LA1402)对C3H/HeJ小鼠进行疫苗接种保护了小鼠免受疾病的任何临床表现，并且导致肝脏和肾脏的细菌负荷减少～3-4log10，这两个器官分别是钩端螺旋体病发病机制和钩端螺旋体传播的两个关键器官。先前的数据表明，所有PF07598基因家族成员在急性严重钩端螺旋体病的仓鼠模型中都有不同程度的上调(Lehmann et al.,2013,PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468)。基于描述在体内具有最高和最低表达的VM蛋白抗原的先前数据(Lehmann et al.,2013,PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468)，选择了用于G-III和G-IV组的特定VM蛋白抗原。目前的发现表明，用最少补体的交叉反应性VM蛋白进行VM蛋白疫苗接种可能会产生保护性免疫力，但到目前为止，LA1400和LA0591是否都需要作为免疫原仍不清楚。奇怪的是，来自G-IV的免疫接种后/挑战前血清与LA1402和LA3490以最高滴度发生异源交叉反应，尽管针对它们的同源蛋白的滴度较低。LA1400是属于A簇的第1组致病性钩端螺旋体中的一种祖先VM蛋白(Fouts et al.,2016,PLoS Negl Trop Dis.10(2):e0004403)，具有2个N-末端、串联重复的蓖麻毒素B样凝集素结构域(RBL)和C-末端毒素结构域(CTD)。LA0591具有CTD但缺乏RBL。这些结构域可能先验地预期与同源VM蛋白的交叉反应最强烈，但实验数据表明，异源交叉反应性被发现最强。进一步的实验正在进行中，以进一步确定用这些蛋白中的任何一种单独、串联或分离的各种VM蛋白的子结构域、或者甚至再一种全长VM蛋白(例如LA1402和LA3490)进行免疫接种是否可以赋予泛钩端螺旋体免疫力。一种可能的情况是，对由疫苗接种LA1400和LA0591诱导的VM蛋白的一般交叉反应性介导防御致命挑战感染和组织定植。生物信息学分析暗示了这种可能性，生物信息学分析表明，VM蛋白在问号钩端螺旋体中在氨基酸水平上高度保守，并且得到了实验支持(Chaurasia et al.,2022,Frontiers in Microbiology,13:859680)。
虽然用全长钩端螺旋体VM蛋白对钩端螺旋体病易感C3H/HeJ小鼠(Viriyakosolet al.,2006,Infect Immun.74(2):887-95)进行免疫接种防御了严重疾病，而用分离的RBL、t3490(一种仅含有N-末端蓖麻毒素B结构域的重组蛋白)进行疫苗接种(G-II)导致疾病增强同时减少了肝脏和肾脏中的细菌负荷。对血清的多重细胞因子分析表明，II组小鼠的促炎细胞因子标志物(IL-β、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α和KC/GRO)具有独特的升高(Wolpe et al.,1989,Proc Natl Acad Sci U S A.86(2):612-6)(啮齿动物中与IL-8相关的中性粒细胞化学引诱物)，这表明这些细胞因子风暴可能是导致小鼠死亡的原因。RBD-结构域诱导的免疫增强导致严重疾病的机制尚不清楚。不受理论的束缚，推测t3490免疫导致疾病增强的一种潜在机制可能是诱导针对钩端螺旋体分泌的VM蛋白的N-末端RBL的抗体，该VM蛋白在体内携带全长蛋白至含有Fc受体的细胞中的促炎途径，但这一假设需要实验测试。尽管如此，G-II免疫小鼠中产生的针对RBD的交叉反应性抗体并不能防御严重疾病。这些观察表明，N-末端RBD不应单独用于基于VM蛋白的钩端螺旋体病疫苗研究。需要进一步研究RBD-介导的免疫增强的工作。
在本项研究中，使用重组VM蛋白和渗透压-诱导的体外培养的问号钩端螺旋体血清型Lai进行的疫苗接种后血清的ELISA和蛋白印迹分析表明，疫苗接种导致与保护性免疫力相关的同源和异源VM蛋白识别。这些实验结果证实了问号钩端螺旋体属内VM蛋白多克隆抗血清交叉反应性的生物信息学预测。进一步开展工作以确认其它问号钩端螺旋体血清型在啮齿动物模型中防御挑战感染是必要的。计划了在VM蛋白疫苗接种后针对用密切相关的kirschneri钩端螺旋体和野口氏钩端螺旋体(其它第1组高致病性钩端螺旋体物种)的强毒分离株的挑战进行跨物种保护实验(Lehmann et al,2013,PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468；Fouts et al.,2012,J Hepatol,56(6):1283-92)。在同源或异源VM蛋白疫苗接种后的跨物种保护实验、随后用其它第1组病原体(例如在其基因组中几乎没有PF07598旁系同源物的borgpetersenii钩端螺旋体)的强毒分离株进行的挑战感染将有助于确定哪些VM蛋白可能适合于进一步开发成泛钩端螺旋体病疫苗。
提供防御钩端螺旋体病的血清型非依赖性泛钩端螺旋体病疫苗是钩端螺旋体病领域的一个主要优先事项(Wunder et al.,2021,Elife.,10；Beutler et al.,2000,EurCytokine Netw,11(2):143-52)。各种基于灭活全细菌细胞的疫苗(菌苗)具有血清型特异性，并且仅限于动物使用，这种传统技术仍然不完全有效。在寻找泛钩端螺旋体病疫苗候选的过程中(Haake etal.,1999,Infect Immun,67(12):6572-8223；Conrad et al.,2017,PLoS Negl Trop Dis,11(3):e0005441；Techawiwattanaboon et al.,2019,Vaccines(Basel),7(3)；Govindan et al.,2021,Appl Nanosci,1-15；Phoka et al.,2021,VetMicrobiol,262:109220；de Oliveira et al.,2021,Vaccine,39(39):5626-34；Haake etal.,Front Immunol,11:579907；Teixeira et al.,2020,Front Immunol,11:568694；Coutinho et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis,5(12):e1422)，提出了亚单位疫苗以及最近自发产生的问号钩端螺旋体血清型Copenhageni减毒突变体(Wunder et al.,2021,Elife.,10)。由于副作用和疗效欠佳，包括缺乏持久的保护性和灭菌免疫力，菌素的广泛使用受到限制(Felix et al.,2020,Expert Opin Drug Discov.15(2):179-88；Techawiwattanaboon et al.,2019,Vaccines(Basel),7(3)；Levett,2001,ClinMicrobiol Rev,14(2):296-326；Zaugg et al.,2021,Schweiz Arch Tierheilkd,163(9):545-52)。
本报告证明，通过疫苗接种问号钩端螺旋体VM蛋白子集诱导了针对致命挑战感染的保护性免疫力。诱导抗VM蛋白抗体的免疫策略验证了VM蛋白在介导钩端螺旋体病发病机制中的作用。
现在描述用于实验的材料和方法。
细菌培养物
在30℃下在液体Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris(EMJH，BDBiosciences，USA)中生长问号钩端螺旋体血清型Canicola菌株LOCaS46(Ellinghausen etal.,1965,Am J Vet Res,26:39-44)。在模拟已知在体外诱导毒力基因表达的体内宿主环境的条件下生长钩端螺旋体(Matsunaga et al.,2005,Infect Immun,73(1):70-8)。简言之，通过在18,514g下离心收获未修饰的EMJH培养基中的对数中期培养物。用1X磷酸盐缓冲盐水洗涤丸粒化的细胞两次，将其重悬于补充有120mM NaCl的液体EMJH培养基中，然后在37℃下温育4小时(Sigma Aldrich，USA)。LOCaS46菌株的LD50的中位致死剂量LD50<100(Salinas et al.,2020,Vaccines(Basel),8(4))。
将化学感受态大肠杆菌菌株DH5α(New England Biolabs，Ipswich，MA)用于基因克隆，并且将菌株T7感受态大肠杆菌细胞(New England Biolabs，USA)用于蛋白表达和纯化。在补充有100μg/mL氨苄青霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的Luria-Bertani(LB)培养基(BD Biosciences，Sparks，MD)中生长大肠杆菌。
使问号钩端螺旋体血清型Lai、Canicola、Copenhageni和非致病性血清型双曲钩端螺旋体血清型Patoc生长在液体EMJH培养基中，并通过在18,514g下离心10分钟进行收获。用1X PBS pH 7.4洗涤细胞两次，并且将丸粒重悬于含有“具有EDTA的蛋白酶抑制剂混合物”(Roche,USA)的5mL/g蛋白提取试剂(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中。在室温下在旋转混合器上将细胞裂解物温育15分钟。通过在4℃下以18,514g离心20分钟去除不溶性细胞碎片。将上清液储存在-20℃下直至分析。
计算生物学
PF07598家族的N-末端和C-末端氨基酸序列(LA3490、LA0620、LA1402、LA1400和LA0591)使用MAFFT(使用快速傅立叶变换的多重比对)利用L-INS-i(精确导向的)进行比对，并且在Jalview v2.11.5(jalview.org)中可视化。最初保藏的LA1400序列被发现是不完整的，因为它缺少编码完整编码蛋白的前54个氨基酸的序列。该结论基于使用簇分析来比较问号钩端螺旋体血清型Lai LA1400的氨基酸序列与LIC12340，LIC12340是问号钩端螺旋体血清型Copenhageni菌株FioCruz L1-130中的LA1400直系同源物(补充信息)。在本研究中称为LA1400的重组蛋白由源自LIC12340的氨基酸31至54、然后从位置55至末端的LA1400-衍生氨基酸组成。
动物
三周大、无特定病原体的雌性C3H/HeJ小鼠(The Jackson Laboratory，ME，USA)购自杰克逊实验室(ME，USA)，并饲养在耶鲁动物资源中心的无特定病原体的环境中。将小鼠饲养在单独通风的微型隔离笼中，并每周更换两次无菌、吸水的垫料。在整个实验过程中对动物进行喂食和饮水。在问号钩端螺旋体血清型Canicola挑战后，每天对小鼠称重和监测两次，直至最终终点。观察到它们食欲不振、严重疲倦、呼吸困难、虚脱、皮毛皱起且体重减轻了10％。具有这些表现的小鼠根据AAALAC/AVMA批准的程序通过CO2处以安乐死，并被认为已达到严重/致命钩端螺旋体病的终点。
质粒构建和克隆
由Gene Universal(geneuniversal.com)构建了合成的大肠杆菌密码子优化的基因，由来自血清型Lai的编码NCBI基因座标签LA3490(Uniprot：Q8F0K3)、LA0620(Q8F8D7)和LA1402(Q8F6A7)的完整PF07598基因组成，并且合成了来自血清型Copenhageni的基因座标签LIC12340(Q72PX7)(Lai直系同源物：LA1400)和LIC12985(Q72N53)(Lai直系同源物：LA0591)、编码序列减去预测的信号肽或截短的3490(N-末端结构域)并克隆到pET32b(+)(Gene Universal Inc.,USA)中。将LA3490、LA0620、LA1402和t3490经由甘氨酸-丝氨酸铰链(Gly4Ser)3连接到mCherry(AST15061.1)，并克隆到肠激酶切割位点之间的pET32b(+)(Gene Universal Inc.,USA)中，以便于去除mCherry荧光标签。制备没有mCherry融合的全长LA1400和LA0591构建体(图19A)。使用前，通过限制性消化和测序验证了构建体中基因的序列和取向。
重组可溶性PF07598抗原的表达和纯化
在T7感受态大肠杆菌细胞(New England Biolabs，USA)中表达重组PF07598蛋白构建体。将转化体传代培养到含有100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中。通过添加1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG；Sigma-Aldrich,USA)在OD为0.6时诱导PF07598蛋白的表达，并使其在16℃和250rpm下温育24小时。诱导后，收获细胞，并在37℃下在含有50个单位benzonase核酸酶(Sigma-Aldrich，USA)、0.2μg/mL溶菌酶、非EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche，USA)加100mM PMSF(Sigma-Aldrich，USA)的CelLyticTMB(细胞裂解试剂；Sigma-Aldrich，USA)中将丸粒裂解30分钟。分离上清液和丸粒，然后通过4-12％双-三十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。通过BCA测定(Bio-Rad，Hercules，CA)确定蛋白浓度。
使用用含有100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl、25mM咪唑的缓冲液(pH 8.0)预平衡的5mL预装Ni-琼脂糖AKTA Hi-TRAP柱(GE Healthcare，USA)，纯化重组PF07598融合物和无融合蛋白。然后，在500mM咪唑(pH 8.0)存在下洗脱结合到Hi-TRAP柱的PF07598蛋白。合并洗脱液，通过10kDaUltra离心过滤器浓缩，并在4℃下轻轻搅拌(350rpm)相对于1XPBS(pH 7.4)进一步透析过夜(10kDa截止值，Slide-A-Lyzer，Thermo ScientificTM，USA)。纯化的重组PF07598蛋白在SDS-PAGE中解析，通过使用小鼠抗-His单克隆ALP缀合物(1:2,000稀释；Santa Cruz Biotechnology，USA)的免疫印迹验证。从单个制品制备用于增强剂和SDS-PAGE的等分试样，并将其储存在-80℃下以防止重复冻融。
动物免疫接种、钩端螺旋体挑战和样品采集
通过肌内(IM)途径用重组PF07598蛋白对C3H/HeJ小鼠进行免疫(Viriyakosol etal.,2006,Infect Immun,74(2):887-95)。GLA-角鲨烯-水包油乳液佐剂(0.25mg/mL)购自Infectious Disease Research Institute(IDRI)，Seattle，WA，USA(idri.org)。恰好在注射之前，将佐剂添加到重组蛋白或PBS中至最终体积100μL，并通过短暂涡旋混合(Patra etal.,2015,Infect Immun,83(5):1799-1808)。
将小鼠分为四组；G-I作为阴性对照，并且注射有与佐剂(EM082；5μg GLA-角鲨烯-水包油乳液)混合的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)。类似地，G-II(t3490)、G-III[VM混合物，(LA3490、LA0620、LA1400、LA1402和LA0591]和G-IV[VM未标记的，(LA1400和LA0591])用25μg总抗原以等摩尔比与佐剂(5μg GLA-角鲨烯-水包油乳液)一起注射、然后每隔3周注射两次25μg总抗原进行免疫(图20)。最后一次免疫接种后两周对免疫小鼠进行放血，并且为了消除各组之间的个体差异，汇集血清样本并且测量血清中的抗VM抗体(称为预挑战出血)。所有组均通过腹膜内(IP)注射1x105个问号钩端螺旋体血清型Canicola菌株LOCaS46的有毒、低传代分离株的生物体进行实验感染。感染后存活的小鼠在感染挑战后13天处以安乐死。通过末端心脏穿刺采集血液，并从全血中分离血清。使血清在室温下凝结并在4℃下储存过夜。然后将样品在4℃下以11,292g离心15分钟。采集血清并储存在-80℃下。采集器官并在4℃下保存在RNALater中。使用肾脏和肝脏组织通过定量PCR(qPCR)来定量问号钩端螺旋体。
通过ELISA评估PF07598蛋白诱导的免疫力
通过ELISA定量免疫组中对重组PF07598蛋白的血清抗体响应(61)。简言之，将在100μL碳酸氢盐/碳酸盐涂覆缓冲液中的PF07598抗原(分别为LA3490、LA0620、LA1402、LA1400和LA0598)涂覆(250ng)在96孔微量滴定ELISA板(Corning，USA)中，并在4℃下温育过夜。每组抗原均与免疫前和免疫后血清组(I-IV组，1:1000)一起温育1小时，然后与山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)-碱性磷酸酶缀合物(1:5000；KPL，USA)温育1小时，用TBST洗涤三次，并用磷酸对硝基苯酯(1-StepTMPNPP底物溶液；KPL，USA)显影。用2M NaOH终止反应，并使用M2e微孔板读取器(Molecular Devices，USA)在405nm处读取吸光度。对于全细胞ELISA，用500ng/孔的无细胞裂解物涂覆板。对照包括预出血、免疫前的血清样品以及抗原和抗体空白。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹分析
根据Laemmli(Laemmli，1970，Nature，227(5259):680-5)的方法进行SDS-PAGE。进行免疫印迹分析以确定来自免疫动物的血清是否识别重组或天然钩端螺旋体PF07598蛋白。将纯化的重组PF07598蛋白或钩端螺旋体全细胞裂解物(120mM NaCl诱导的和未诱导的)转移到硝酸纤维素膜上，并用溶解在1X TBST缓冲液(AmericanBio，USA)中的5％脱脂奶粉封闭2小时。将膜与来自免疫组的混合血清一起温育(I-IV组，1:100)，并在摇杆上在4℃下控制预出血和免疫前出血过夜。用山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)–碱性磷酸酶缀合物(1:5000；KPL，USA)对它们探测21/2小时，并且用TBST洗涤三次，并用磷酸对硝基苯酯(1-StepTMPNPP底物溶液；KPL，USA)显影。将单克隆LipL32抗体用作上样对照(1,10,000稀释)。
定量PCR
将40±50mg肾和肝组织切丁并悬浮于500μL 1X PBS中以提取DNA；所有工作均在与钩端螺旋体和PCR产物的其它处理分开的位置在正压下进行，以减少交叉污染的风险。组织匀浆后，按照制造商的说明，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，USA)从当量25mg组织中提取总基因组DNA，并在50μL洗脱缓冲液中洗脱。问号钩端螺旋体血清型Canicola以2x107个钩端螺旋体/mL的密度生长在5mL EMJH培养基中。收获细胞并使用相同的DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，USA)提取DNA用于标准曲线。
使用NanoDrop分光光度计ND-1000(NanoDrop Technologies，DE，USA)确定洗脱DNA的浓度。所有DNA样品均保存在-80℃下直至使用。制备DNA的系列稀释液(1x10°至1x107个基因组当量(GEq)/5μL)，并使用2X iQ5 SYBR Green超混合液(Bio-Rad，CA，USA)以及5pmol正向(5’-TCTGTGATCAACTATTACGGATAC-3’；SEQ ID NO:19)和反向(5’-ATCCAAGTATCAAACCAATGTGG-3’；SEQ ID NO:20)LipL32引物，通过qPCR定量问号钩端螺旋体血清型Canicola基因组。将4微升标准品或样品DNA添加到10μL PCR混合物中，并使用以下程序在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad，USA)中使反应进行扩增：在95℃下3min，在95℃下0.10min，在62℃下0.30min，然后是在72℃下1.00min 44个循环，然后在72℃下最终延伸7min。使用Bio-Rad iQCycler5软件生成标准曲线，并从阈值循环(CT)值推断GEq的数量。如果未发生扩增或如果CT值大于3SD+Ct，则指定为阴性结果。将数据表示为每克组织的问号钩端螺旋体GEq的数量。
统计分析
所有实验进行一式三份并重复两次。使用Kruskal-Wallis检验来确定来自不同免疫组的幸存者的肾脏或肝脏中细菌数量的显著差异。通过非参数Mann-Whitney检验对结果进行分析，以确定各组之间的显著差异，并且当p<0.05、p<0.001时则认为结果具有统计学显著性。所有分析和图表均使用Graph Prism版本8(GraphPad Software，Inc.,La Jolla，CA)生成。
现在提供实验结果
PF07598蛋白家族及其直系同源物在致病性钩端螺旋体中的保守性
PF07598-编码的VM旁系同源蛋白家族在问号钩端螺旋体中具有扩展的库，在血清型Lai、Copenhageni和Canicola中具有至少12个不同的旁系同源物。直系同源物具有>90％的氨基酸氨基酸同一性(图24)。大多数VM蛋白由～640个氨基酸组成，其中AB结构域结构由两个串联排列的β-三叶形、N-末端蓖麻毒素B-样凝集素结构域和具有DNA酶活性的C-末端毒素结构域组成。问号钩端螺旋体血清型还编码一种独特的直系同源物，其缺乏N-末端蓖麻毒素B-样结构域(以LA0591为代表，～313aa)，但其含有信号序列。
用全长VM蛋白免疫接种在小鼠中预防了严重钩端螺旋体病
全长重组VM蛋白LA3490、LA0620、LA1402、LA1400、LA0591(遵循问号钩端螺旋体血清型Lai命名法)在大肠杆菌中分别表达为促进溶解度和亲和纯化的与硫氧还蛋白(TRX)-His6亲和标签的N-末端融合，和促进蛋白的亲和纯化和荧光显微镜可视化的与mCherry-His6的C-末端融合(图19A)。通过SDS-PAGE和蛋白免疫印迹验证了重组VM蛋白的同质性(图19B)。
向小鼠肌内注射与吡喃葡萄糖基脂质A/角鲨烯水包油(GLA-SE)佐剂混合的重组蛋白或PBS对照(图20示意性描绘)。选择这种佐剂用于本实验是因为它适合人使用，因此可用于在动物模型中进行测试，以最终开发用于人的疫苗。GLA组分(在二糖主链上具有六个酰基链以及单个磷酸基团的合成无毒部分(Pantel et al.,2012,Eur J Immunol,42(1):101-9))不会被预期在C3H/HeJ小鼠中具有TLR4激动剂免疫刺激作用，这些小鼠由于在编码功能性Toll-样受体(TLR4)的基因中的突变而在遗传上对脂质A反应低下(Beutler etal.,2000,Eur Cytokine Netw,11(2):143-52)。
这项免疫研究的主要结果是小鼠在致死挑战感染后是否会出现严重的钩端螺旋体病表现(105个用问号钩端螺旋体血清型Canicola菌株LOCaS46菌株低传代(P3)的有机体，其中位致死剂量LD50<100(Salinas et al.,2020，Vaccines(Basel)，8(4))。如果小鼠在挑战感染后出现严重表现(定义为从实验开始时体重减轻>15％)，或者如果它们无法梳毛、进食、饮水或出现严重的疲倦/驼背，则对小鼠实施安乐死并认为已达到严重疾病终点。次要结果是1)通过定量实时PCR测量的肝脏和肾脏中的定量细菌负荷，以及2)通过ELISA和蛋白免疫印迹测量的抗体反应。
免疫协议后没有小鼠出现严重疾病。接受PBS(G-I)加佐剂或蓖麻毒素B-结构域RBL1[t3490，(G-II)]加佐剂的小鼠组在挑战感染后显示出体重略有下降，但因为表现为嗜睡和无法进食/饮水的严重疾病，必须分别在第6天和第5天处以安乐死。使用全长VM蛋白(5种的混合物(G-III)或2种的混合物(G-IV))进行疫苗接种预防了所有可观察到的临床疾病(图21A)。这一观察表明，防御严重钩端螺旋体病需要全长VM蛋白。
用rVM蛋白免疫接种显著地降低了肝脏和肾脏中的细菌负荷
通过qPCR对四个实验组中肝脏和肾脏中的钩端螺旋体的钩端螺旋体负荷进行定量。挑战感染后，与PBS对照组(G-I)相比，用重组蛋白加佐剂(G-II、G-III和G-III)免疫的三个组在肝脏和肾脏中每克组织的基因组当量(Geq)减少了～103-104倍(Kruskal-Wallis检验，ANOVA结果：肝脏p<0.0001，肾脏p＝0.0003)(图21B和图21C)。使用对照组PBS(G-I)、VM混合物(G-III)p＝0.0054和VM未标记的蛋白(G-IV)p<0.0001的Dunn多重比较统计检验证实了这种统计显著差异。
尽管显著降低了肝脏和肾脏中的细菌负荷，但使用t3490进行免疫接种导致了由 促炎细胞因子引起的严重疾病
为了确定使用第一个高度保守的蓖麻毒素B-样结构域(RBL1)进行免疫接种是否会提供针对致死挑战的保护，并作为用于全长VM蛋白LA3490的对照，使用与全长LA3490相同的程序产生和纯化大肠杆菌产生的重组RBL1结构域(截短的3490，t3490)，并用于免疫接种研究。令人惊讶的是，用t3490免疫的小鼠(G-2)在挑战感染后出现了加速的临床疾病，但肝脏和肾脏中的细菌负荷减少(图21B，图21C)。与PBS和全长蛋白接受组相比，G-2中的疾病增强与高水平的TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10以及趋化因子KC/GRO相关(图21D)。
挑战前和挑战后小鼠对PF07598(VM)蛋白应答的抗体谱和交叉反应性
为了确定用VM蛋白免疫的小鼠是否产生IgG抗体应答，采集了免疫前和免疫后小鼠的血清，并使用研究中使用的所有6种抗原通过ELISA检查了抗体谱(图22A)。对照组(G-I)和免疫前血清未显示出可检测的针对任何VM抗原的IgG抗体。在来自t3490免疫小鼠(G-II)的血清中观察到针对t3490抗原的抗体应答，并且用LA3490(p＝0.0010)和LA1402(p＝0.0010)抗原看到了交叉反应性。
来自VM混合物免疫小鼠(G-III)的血清与所有测试的VM抗原[t3490、LA3490、LA0620、LA1402、LA1400和LA0591，(p<0.0001)]发生反应；针对LA3490和LA1402抗原观察到了最高滴度。使用来自VM未标记组(G-IV)的血清观察到了VM混合物抗原组中针对每种抗原的抗体应答[t3490(p＝0.0015)、LA3490(p<0.0001)、LA0620(p＝0.0004)、LA1402(p<0.0001)、LA1400(p＝0.0003)、LA0591(p<0.0001)]，并且用LA1400、LA0591和LA0620抗原检测到了最高滴度。在免疫后、挑战前的小鼠中也观察到针对t3490、LA3490和LA1402抗原的抗体应答。对LA1400、LA0591和LA0620的挑战前抗体滴度低于用活问号钩端螺旋体血清型Canicola挑战后的感染后滴度。有必要对VM蛋白的直接影响及其体内免疫谱进行进一步的实验研究。尽管具有>90％的氨基酸相似性，但每种VM蛋白均显示出与挑战前和挑战后血清的独特反应性，并且很可能具有不同的体内功能。VM蛋白反应性的差异表明免疫原性的差异，并且由于氨基酸高度相似，它们与挑战前和挑战后的血清发生交叉反应。VM蛋白特异性单克隆抗体的产生和保护性表位的识别将有助于区分不同VM蛋白在促成钩端螺旋体病发病机制中的作用和机制。
通过蛋白免疫印迹分析，用来自免疫动物的混合血清探测固定在硝酸纤维素膜上的重组VM蛋白，证实了交叉反应性(图22B)。预取血血清和PBS对照(G-1)组没有显示出与VM混合物和VM未标记重组抗原(分别为5种和2种蛋白)的混合物的反应性。来自t3490免疫小鼠的血清显示出针对t3490抗原的显著抗体滴度(未显示)，并且与全长VM蛋白发生交叉反应，但与LA1400反应微弱，且与LA0591无反应性，LA0591缺乏N-末端蓖麻毒素B结构域，表明t3490仅与在VM蛋白N-末端区域共享的表位发生交叉反应。来自VM混合物组(G-III)的血清与所有五种抗原发生交叉反应，并且反应模式彼此一致。在所有VM蛋白中以及在免疫G-III和G-IV小鼠的VM抗原的同一混合物批次中，LA1400与来自VM未标记组(G-IV)的血清的反应性最高。在VM未标记组血清(G-IV)中诱导了针对LA1400抗原的高滴度抗体(通过ELISA和蛋白印迹确定)这一发现表明，与其它VM蛋白相比，LA1400在小鼠中引发了最强的体液免疫应答，并且可能负责介导保护性免疫力。然而，这些数据确实提供了强有力的信心，即这些VM蛋白中的一种或多种在该动物模型中介导了发病机制。这些数据支持未来基于这些观察来优化哪些VM蛋白应当用于疫苗接种。
在体外和体内的VM蛋白表达以及致病性血清型之间的交叉反应
使用多克隆抗-LA3490抗体，在蛋白印迹上探测了来自使用或未使用120mM NaCl诱导的问号钩端螺旋体血清型Lai、Canicola和Copenhageni以及非致病性菌株双曲钩端螺旋体血清型Patoc的蛋白提取物。看到致病性血清型Lai、Canicola和Copenhageni以预期的～70kDa分子量大小的原生VM蛋白表达，但血清型Patoc则未看到(考虑到该腐生物种中不存在PF07598基因家族成员，为阴性对照)(图23A)。
为了确定用有限组的VM蛋白进行免疫接种是否会导致广泛交叉反应性的抗VM蛋白抗体，使用来自问号钩端螺旋体血清型Canicola和非传染性腐生物双曲钩端螺旋体血清型Patoc的无细胞的蛋白提取物，通过蛋白印迹分析，推断了体内VM蛋白表达和交叉反应血清型免疫谱。来自免疫组的抗体显示针对血清型Canicola的抗体识别了预测大小的VM蛋白(～70kDa)，这表明挑战感染期间体内VM蛋白表达。该抗体反应性还与挑战后的G-III和G-IV血清发生反应。然而，使用阴性对照血清型Patoc无细胞裂解物没有观察到反应性(图23B)。使用来自G-III和G-IV的血清检测到较低分子量的反应蛋白，这表明VM蛋白经历蛋白水解加工的可能性(图23B)。需要进一步研究以确定这些低分子量蛋白是否在钩端螺旋体发病机制中发挥作用。
针对同源和异源VM蛋白对IgG抗体谱进行定量。将来自问号钩端螺旋体血清型Canicola和非致病性菌株双曲钩端螺旋体血清型Patoc的无细胞的蛋白提取物用作吸附至ELISA板的固相抗原。ELISA证实了血清型Canicola与来自VM混合物(G-III)和VM未标记的(G-IV)挑战后小鼠组的血清的反应性。用于免疫G-III和G-IV组的问号钩端螺旋体血清型Lai-编码的VM蛋白与血清型Canicola的裂解物发生交叉反应。值得注意的是，VM蛋白的直系同源物在问号钩端螺旋体血清型中高度保守，与这一观察到的交叉反应性一致。非致病性血清型Patoc不与来自对照和挑战前或挑战后的免疫小鼠组小鼠的血清发生交叉反应(图23C)。
实施例4：小鼠单克隆工作
用来自YUMS1B的五个克隆针对500nM浓度的靶抗原LA0591进行探查。所有五个克隆均被确定为阳性，亲和力在pM至两位数nM的范围内。在上表中，克隆按照亲和力从最高到最低的顺序排列。请注意，在单一分析物浓度下探查得到的KD只是粗略估计，在与在5-6种分析物浓度范围下通过全动力学确定的KD相比，其差异可能是至多10倍高或低。
图25-图27显示了单克隆上清液(YUSM001B)与重组VM蛋白的反应性。
图28显示了单克隆上清液(YUSM001A，LA1400)与重组VM蛋白的反应性。
图29提供了验证性筛选数据。
图30提供了小鼠IgG定量数据表。
实施例5：致病性钩端螺旋体进化出由含有蓖麻毒素B-样凝集素结构域的细胞毒 素组成的独特基因家族
此处证明了以LA3490(Q8F0K3)为代表的钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白是真正的含R-型凝集素结构域的细胞毒素-第一个经过实验验证的钩端螺旋体外毒素。rLA3490通过对末端半乳糖基残基具有特异性的N-末端R-型凝集素结构域与HeLa细胞结合并快速被HeLa细胞内化。结合/内化后，它通过核靶向信号和用于核受体结合的双LxxLL基序易位到HeLa细胞核。显示细胞表面结合和内化很快，在暴露后30分钟内发生。rLA3490对HeLa细胞产生多效性作用，包括肌动蛋白解聚、半胱天冬酶-3激活、核碎片化以及最终的起泡和细胞死亡。细胞死亡的一种机制似乎起源于基因组DNA降解，这种降解发生在VM蛋白的核定位之后。使用纯化的HeLa细胞基因组DNA以及超螺旋和线性化细菌质粒DNA进行的体外实验证实，rLA3490和迄今为止测试的至少四种其它VM蛋白具有内切和外切DNA酶活性。
大多数VM蛋白(CBR缺失变体除外)符合经典的AB毒素范例(Odumosu et al.,2010,Toxins(Basel),2:1612-1645)。整个钩端螺旋体VM蛋白基因含有通常在其它细菌中由两个或三个独立基因编码的结构域。VM蛋白具有至少两个功能不同的区域，N-末端部分地负责宿主细胞靶向(结合和内化)且C-末端部分地介导细胞毒性(细胞内运输/酶活性)。N-末端节段在钩端螺旋体血清型中相当保守(～78％平均成对氨基酸同一性)，并且含有经证实的R-型凝集素结构域(氨基酸位置40-174)，其与蓖麻毒素B链共享对糖蛋白的末端半乳糖基残基的结合特异性。相比之下，C-末端节段不太保守(～63％平均成对氨基酸同一性)，并且似乎介导细胞毒性。这种序列多样性被认为影响VM蛋白细胞靶向特异性(即成功的结合/内化和细胞内运输)，而不是催化活性，因为迄今为止测试的其它VM蛋白在体外表现出DNA酶活性。尽管有证据表明旁系同源家族簇扩大，但PF07598基因家族多样化的原因仍不确定，尽管一个主要假设是旁系同源扩张使不同的钩端螺旋体能够适应不同的宿主。需要进一步的实验和计算机分析来比较VM蛋白的结构和功能，以确定可能指示PF07598家族成员之间毒力差异的任何可能的序列基序。
基因组内距离的比较表明，毒性I组致病性钩端螺旋体中的VM蛋白库的扩展是由一系列基因复制事件以及随后的N-末端和C-末端节段的自主进化引起的，后者发生得更快。基于现有数据，最初的复制事件似乎产生了LA1402//LA1400，它构成了迄今为止在毒性较低的I组致病物种中以密切直系同源物识别出的唯一问号钩端螺旋体VM蛋白(Fouts etal.,2016,PLoS Negl Trop Dis.10(2):e0004403)。这一初始事件之后是可能源自LA1400的连续复制，形成了三个离散的基因簇[A、B和C(Fouts et al.,2016,PLoS Negl TropDis.10(2):e0004403)]，最大的包含七种VM蛋白编码基因，包括LA3490和LA0620。一些血清型似乎丢失了特定的VM蛋白基因，例如来自血清型Lai的LICRS03300和来自Hardjo的LA3271，而其它血清型则含有各种CBR缺失变体。VM蛋白在钩端螺旋体血清型中的这种不均匀分布及其在宿主细胞靶向特异性方面的隐含差异是第一个明确的证据，表明一些本质上比其它的更具毒性，并因此具有更高的临床和公共卫生意义。大多数VM蛋白编码基因仅在问号钩端螺旋体及其姐妹物种中发现。由于一些VM蛋白，例如LA3490(Q8F0K3)已被证明对人细胞具有特别大的毒性，因此它们在血清中的存在可能预示着严重的疾病并发症，提供了预后信息-这是有效临床风险评估的基石。
如同蓖麻毒素(其毒性和病理学明显相关且依赖于途径(吸入和严重呼吸损害最为致命))，某些VM蛋白的位点特异性表达及其在宿主细胞特异性方面的假定差异(即宿主细胞暴露和易感性)可能解释了严重钩端螺旋体病的不同临床表现。事实上，为了解钩端螺旋体病的分子和细胞发病机制的努力仍处于起步阶段，并且用于预防钩端螺旋体病或改善其发病机制的方法都取决于对钩端螺旋体-宿主相互作用的生物学机制的理解。例如，肺出血和难治性休克是钩端螺旋体病尤为重要的临床表现(Sehgal etal.,1995,IndianJ.Med.Res,102:9-12；Marotto et al.,1999,Clin.Infect.Dis,29:1561-1563；Segura etal.,2005,Clin.Infect.Dis,40:343-351；Gouveia etal.,2008,Emerg.Infect.Dis,14:505-508；Truong and Coburn,2011,Front.Cell Infect.Microbiol,1:24；Helmerhorstet al.,2012,Neth.J.Med.70:215-221；Ruwanpura et al.,2012,Med.J.Malaysia,67:595-600)。血液透析/血液滤过改善这些严重表现(Andrade et al.,2007；Cleto et al.,2016)的间接证据表明，钩端螺旋体病中可能存在一种或多种循环可溶性毒素。对严重肺钩端螺旋体病综合征中肺组织的组织病理学分析未发现完整的钩端螺旋体(Nicodemo etal.,1997,Am.J.Trop.Med.Hyg,56:181-187)，而是发现对肺泡上皮的损伤和内皮细胞的激活，以及作为次要事件的免疫球蛋白和补体的沉积(Nally et al.,2004；Croda et al.,2010,Clin.Microbiol.Infect,16:593-599；De Brito et al.,2013,PLoS One,8:e71743)。尽管如此，除了各种鞘磷脂酶/溶血素(Narayanavari et al.,2015,PLoSNegl.Trop.Dis.9:e0003952；Chaurasia and Sritharan,2020,Microbiology(Reading)166,1065-1073)和胶原酶(Kassegne et al.,2014,Leptospira species.J.Infect.Dis,209:1105-1115)之外，已经鉴定出一些潜在的钩端螺旋体毒素，但没有一个能够充分解释钩端螺旋体病不同临床谱的发病特征。尽管如此，血液透析和血液滤过仍然是挽救生命的干预措施，但超出了绝大多数钩端螺旋体病-流行地区的临床资源和/或能力。相比之下，与其它AB毒素一样(Odumosu et al.,2010,Toxins(Basel),2(7):1612-45)，例如CARDS(Somarajan et al.,2014,mBio,5:e01497-e01514；Becker et al.,2015,Proc Natl AcadSci U S A,112(16):5165-70)和蓖麻毒素(Yermakova et al.,2014,mBio,5:e00995；Galet al.,2017,Toxins(Basel),9:311)，使用扰乱VM蛋白细胞表面结合/细胞进入和/或细胞内运输/毒性的单克隆抗体(mAb)基生物制品或小分子抑制剂来减轻VM蛋白毒性(Benz andBarth,2017,Curr.Top.Microbiol.Immunol,406:229-256)将构成更普遍可用的替代方案。
此处提供的数据基于先前发表的观察结果(Matsunaga et al,2007；InfectImmun,75(6):2864-2874；Lehmann et al,2013,PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468；Foutset al.,2016,PLoS Negl Trop Dis.10(2):e0004403)建立，其表明钩端螺旋体VM蛋白是可能参与钩端螺旋体病的分子和细胞发病机制的主要毒力因子。转座子诱变筛选已经表明，多种VM蛋白，特别是Q8F6G8(基因ID，LA0589)，会在仓鼠中导致致命疾病(Murray et al.,2009,Infect.Immun,77:810-816；Truong and Coburn,2011,Front.CellInfect.Microbiol,1:24)。尽管如此，到目前为止，VM蛋白被无信息地归类为PF07598，一个功能未知的蛋白家族。此处，基于Phyre2的预测得到证实，即这些蛋白属于蛋白超家族，R-型凝集素，其具有糖类结合活性，以蓖麻毒素B链命名且结构相似，并且存在于植物、动物和细菌中(Cummings etal.,2017,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。蓖麻毒素及其B链(和其它R-型凝集素)与各种宿主细胞表面糖缀合物的末端半乳糖或其它相关聚糖结合，其促进蓖麻毒素A链易位和内化到靶细胞中，从而经由蛋白合成的抑制导致细胞死亡(Montanaro et al.,1973,Biochem.J,136:677-683；Sperti et al.,1973,Biochem.J,136:813-815；Lord et al.,2003,Toxicol.Rev,22:53-64；Sowa-Rogozinska et al.,2019,Toxins(Basel),11:350)。同样，细菌AB毒素，例如志贺毒素、百日咳毒素和白喉毒素，通过28S rRNA的ADP核糖基化或异源三聚体G蛋白的ai亚基或通过延伸因子2的失活来介导细胞死亡(Brown et al.,1980,FEBS Lett.117,84-88；Cemal,1999,Design AndConstruction Of Membrane-Acting Immunotoxins For Intracellular And SecretedProtein Expression In Pichia Pastoris.Ph.D.Thesis,University of Cambridge,Cambridge；Coutte and Locht,2015,Future Microbiol,10:241-254；Cherubin et al.,2018,Sci Rep,8(1):2494)。基因毒素如钩端螺旋体VM蛋白，例如细胞致死膨胀毒素(CDT)，并未得到充分研究。随着钩端螺旋体VM蛋白的表征，细菌基因毒素的一些一般特征已成为焦点。例如，它们表现出DNA酶活性，通过核定位信号易位到细胞核(McSweeney andDreyfus，2004，Cell Microbiol，6:447-458)，并且对靶细胞具有多效性作用，包括通过半胱天冬酶3-依赖性和-非依赖性机制引起细胞死亡(Ohara et al.,2008,Infect.Immun,76:4783-4791)。
通过将此处提供的数据重新置于经典AB毒素范例内，提议了在细胞表面结合之后-可能通过甘露糖受体，正如为蓖麻毒素B所报道的那样(Simmons et al.,1986,J.Biol.Chem,261:7912-7920；Lord et al.,1992,Biochem.Soc.Trans,20:734-738；Newton et al.,1992,J.Biol.Chem,267:11917-11922)，考虑到重叠的VM蛋白-蓖麻毒素B糖类结合特异性，VM蛋白被内吞-与蓖麻毒素和大多数AB毒素一样，例如志贺毒素(Arfilliet al.,2010,Biochem.J,432:173-180)；被释放至细胞质，然后通过内部核定位信号运送到细胞核，在通过一个或多个含有LxxLL基序的两亲性a-螺旋结合在核孔复合物后获得进入；并且然后，通过该孔主动易位到核质中，通过内在的核酸外切酶活性导致核断裂；当游离在细胞质溶胶中时，在运输过程中可能通过未知的机制诱导半胱天冬酶-3激活和细胞骨架拆解。
虽然证明不同VM蛋白(rLA3490、t3490和t0620)的蓖麻毒素B-样凝集素结构域与固定化脱唾液酸胎球蛋白结合(Wales et al.,1994,Glycoconj J,11:274-281；Frankelet al.,1996,Biochemistry,35:14749-14756；Dawson et al.,1999,J.Appl.Toxicol,19:307-312)，但原生靶配体和细胞靶尚未确定。第二，VM蛋白之间细胞病变潜力的差异、它们的宿主细胞靶向特异性以及它们发挥多效性作用的分子途径仍有待充分探索，尽管这些初步实验表明它们可能是AB-型细胞毒性基因毒素。第三，虽然越来越明显的是，钩端螺旋体VM蛋白源自连续的基因复制事件，但与其它致病性钩端螺旋体物种(Lehmann et al,2013,PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468；Fouts et al.,2016,PLoS Negl Trop Dis.10(2):e0004403)相比，问号钩端螺旋体、kirschneri钩端螺旋体和野口氏钩端螺旋体的扩展库的原因(Lehmann et al,2013,PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468)尚未被理解，VM旁系同源物在钩端螺旋体血清型类别之间分布不均匀的原因也未被理解，尽管未知的生态位专门化是相当合理的，大概是作为对土壤/地表水中真核生物捕食的防御，类似于大肠杆菌中的志贺毒素产生(Lainhart et al.,2009,J.Bacteriol,191:5116-5122)。
现在描述用于实验的材料和方法。
计算分析
为了识别功能子结构域，将Q8F0K3及其最接近的旁系同源物Q8F8D7(分别由问号钩端螺旋体血清型Lai中的LA3490和LA0620编码)的氨基酸序列分别提交给Phyre2远程同源搜索门户1(Kelley et al.,2015)。经由HeliQuest2(Gautier et al.,2008,Bioinformatics,24:2101-2102)和真核线性基序(ELM)资源3(Kumar et al.,2020,Nucleic Acids Res.48,D296-D306)识别了短功能区和基序，包括两亲性潜在膜结合a-螺旋、推定的真核蛋白分选信号、蛋白水解切割和磷酸化位点以及结合/对接基序。代表所有临床相关钩端螺旋体物种-以及alexanderi钩端螺旋体和alstonii钩端螺旋体的约3,000种PF07598|VM蛋白与定制的HMM模型进行比对，该模型基于完整的PF07598参考比对。在目视检查比对的氨基酸残基后，任何含有模糊氨基酸的(VM蛋白)序列都被注释为部分(如果源自基因组草图)；未跨越至少一个假定的功能子域[即RBL1/RBL2/CTD(羧基末端结构域)中的任何一个]的那些被排除。对于簇类分析，将涵盖CBR(糖类结合区域)和CTD(即分别相对于Q8F0K3的aa位置23-343和344-639)的子比对从策划的全局比对中去除，并用作用于使用R软件包bio2mds(Pele et al.,2012,BMC Bioinformatics,13:133)计算离散所有与所有成对距离矩阵的输入，不包括“gappy”列(即含有>50％的缺口)。为具有公共卫生重要性的六种钩端螺旋体血清型(问号钩端螺旋体血清型Copenhageni、Canicola、Hardjo、Lai、Manilae和Pomona以及kirschneri钩端螺旋体Pomona)提供了展示全长比对与CBR-和CTD-子比对的氨基酸密切相关性的成对距离矩阵。在Jalview v2.11.4中，通过目视检查手动改进了比对不良的列。去除了片段化的VM蛋白(即不跨越至少一个功能子结构域的蛋白)。将策划的多序列比对用作经由HHpred4针对PDB、SCOPe70、SMARTv6和UniProt-SissProt-viral70数据库的基于HMM配置文件的远程同源搜索的输入。使用Ali2D5预测了一致的二级结构，并使用AlphaFold预测了3D(蛋白)结构(Callaway et al.,2020,Nature,588(7837):203-4；Jumper et al.,2020,predictioncenterorg/casp14/doc/CASP14_Abstracts；Senior et al.,2020,Nature,577(7792):706-10)。生成了用于氨基末端半部分(涵盖预测的凝集素结构域)和C-末端半部分(含有推定的毒素子结构域)的单独距离矩阵，以推断它们的进化相关性和簇类关系。
体外钩端螺旋体培养和毒力基因表达
将已通过仓鼠传代恢复高毒力的低传代强毒问号钩端螺旋体血清型Lai菌株56,601(LD50<100)(Lehmann et al,2013,PLoS Negl Trop Dis,7(10):e2468)保持在30℃下半固体Ellinghausen、McCullough、Johnson和Harris培养基(EMJH，BD Biosciences，美国)中(Ellinghausen et al.,1965，Am J Vet Res，26:39-44)。因为已发表的数据表明，VM蛋白在急性钩端螺旋体病仓鼠模型中体内转录上调(Lehmann et al,2013,PLoS Negl TropDis,7(10):e2468)，并且为了最大化其体外表达，在模拟已知在体外诱导毒力基因表达的体内宿主环境的条件下使钩端螺旋体生长(Matsunaga etal.,2005，Infect Immun，73(1):70-8)。通过在18,514g下离心收获EMJH培养基中的中对数培养物(2×108w钩端螺旋体/ml)。将丸粒化细胞用1×PBS洗涤两次，重悬于补充有120mM NaCl的液体EMJH培养基中，以及然后在37℃下温育4小时(Sigma Aldrich，美国)。
毒力基因诱导后，通过以18,514×g离心20分钟收集培养物上清液，通过0.22毫米滤膜(Merck Millipore，德国)过滤澄清，然后通过30kDaUltra离心过滤器(Merck Millipore，德国)浓缩。通过用兔抗-LA3490多克隆抗血清探测的蛋白印迹分析了诱导和未诱导(对应于基线体外表达)培养物上清液。通过BCA测定(PierceTM BCA蛋白测定试剂盒，Thermo Fisher Scientific，美国)估计总蛋白。
哺乳动物细胞培养
在37℃下在含有5％CO2的加湿培养箱中，在组织培养板中，在补充有10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌溶液(青霉素，100单位/ml；链霉素，100mg/ml；和两性霉素，25mg/ml；Invitrogen，美国)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Sigma-Aldrich，美国)中，使从美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国)获得的HeLa细胞以单层生长。每次实验前用新鲜的不含抗生素的培养基替换含抗生素的培养基。
质粒构建和克隆
合成了大肠杆菌密码子优化的基因融合物，该基因融合物由完整的LA3490编码序列(NP_713670.1)减去预测的信号肽(即对应于核苷酸位置57–1,917bp)或包括位置40-174bp且涵盖通过甘氨酸-丝氨酸铰链(GGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO:93)连接至mCherry(AST15061.1)的Phyre2-预测的蓖麻毒素B-样凝集素子结构域的N-末端截短物组成，并将该融合物克隆到pET32b(+)中(Gene Universal Inc.，美国)。使用前，通过测序验证了构建体。
重组蛋白表达和纯化
由于PF07598蛋白富含半胱氨酸[LA3490编码12个半胱氨酸]，因此在SHuffleRT7-感受态大肠杆菌细胞(New England Biolabs，美国)中表达重组蛋白，因为SHuffleRT7-感受态大肠杆菌细胞能够促进细胞质中的二硫键，确保适当的蛋白折叠。将转化体传代培养到含有100mg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中。当培养物达到0.6的OD时，通过添加1mM异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG；Sigma-Aldrich，美国)在16℃和250rpm下诱导表达24小时。
诱导后，通过离心使细胞丸粒化，然后在37℃下在含有50Ubenzonase核酸酶(Sigma-Aldrich，美国)、0.2mg/ml溶菌酶、非EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche，美国)加1mMPMSF(Sigma-Aldrich，美国)的CelLyticTM B(细胞裂解试剂；Sigma-Aldrich，美国)中裂解30分钟。将裂解物在4℃和18,514×g下离心10分钟。分离上清液和丸粒，然后通过4-12％双-三十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。
如上，通过BCA测定确定了蛋白浓度。使用用含有100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl和25mM咪唑的缓冲液(pH 8.0)预平衡的5-ml预装Ni-琼脂糖AKTA Hi-TRAP柱(GEHealthcare，美国)分离重组硫氧还蛋白(TRX)-His6-VM蛋白-(GGGGSGGGGSGGGGS；SEQ IDNO:93)-mCherry-His6融合蛋白。然后在500mM咪唑(pH 8.0)存在下从柱中洗脱结合的融合蛋白。合并洗脱液，通过30kDaUltra离心过滤器浓缩，然后使用高容量内毒素去除离心柱(Thermo Fisher Scientific，美国)离心以消除脂多糖污染。在4℃下轻轻搅拌(350rpm)将重组蛋白制品相对于1×PBS(pH 7.4)透析过夜(30-kDa截止值，Slide-A-Lyzer，Thermo ScientificTM，美国)，然后经由40-kDa ZebaTM脱盐离心柱(Thermo FisherScientific，美国)通过尺寸排阻去除咪唑，然后保存在-80℃下直至使用。/>
脱唾液酸胎球蛋白结合和蓖麻毒素B-链竞争性结合测定
为了确认Phyre2预测的蓖麻毒素B-样凝集素结构域的结合特异性，测试了大肠杆菌产生的重组全长和截短的Q8F0K3(即分别为rLA3490和t3490)以及钩端螺旋体分泌的VM蛋白是否如蓖麻毒素B一样与固定化脱唾液酸胎球蛋白结合。使用rLA3490/t3490的结合测定是使用ImmulonR2HB平底微量滴定板(Thermo Fisher Scientific，美国)进行的。板预涂覆有脱唾液酸胎球蛋白(5ng/ml，在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，pH 9.4)，在4℃下温育过夜。使用前，将板用1×TBST中的5％脱脂奶粉在37℃下封闭2小时。封闭后，单独地添加以在1×TBST中摩尔浓度为0.9、4.50和9.05nM的rLA3490、t3490和重组蓖麻毒素B链(VectorLaboratories,Inc.，美国)，一式三份。将板温育2小时，用1×TBST洗涤三次，然后在TBST(Invitrogen，美国)中与抗-LA3490多克隆抗体或抗蓖麻毒素B-链单克隆抗体以1:1,000温育1小时。为了定量结合的rLA3490/t3490，将板与山羊抗-小鼠IgG(1:5,000；KPL，美国)一起温育1小时，用TBST洗涤三次，并且用磷酸对硝基苯酯(1-StepTM PNPP底物溶液；KPL，美国)显影。用2M NaOH终止反应，并使用SpectraMaxR M2e微孔板读取器(MolecularDevices，美国)在405nm下读取吸光度。对于竞争性结合测定，将预涂覆有脱唾液酸胎球蛋白(2.5ng/ml)的板用25或50nM重组蓖麻毒素B链(Vector Laboratories，美国)预温育2小时，然后添加50nM rLA3490/t3490并最后温育2小时。使用抗-LA3490多克隆抗体对结合的重组蛋白进行定量。使用涂覆的SepharoseR珠评估钩端螺旋体分泌的VM蛋白结合脱唾液酸胎球蛋白的能力。将溶解在0.1M NaHCO3中的市售脱唾液酸胎球蛋白(1mg/ml)(Sigma-Aldrich，美国)与PBS-洗涤的NHS-活化的琼脂糖珠(GE Healthcare，美国)偶联。将悬浮液在室温下缓慢搅拌1小时，并用1M乙醇胺(pH 9)封闭未占据的NHS基团1小时。将洗涤后的珠与250mg含有分泌蛋白的澄清钩端螺旋体培养物上清液一起温育1小时，然后用MEPBS(4mMb-巯基乙醇、2mM EDTA和20mM磷酸钠，pH 7.2)缓冲液在200×g下洗涤1分钟，两次。用0.5M乳糖洗脱结合的蛋白，并通过4–10％双-三SDS-PAGE进行分析，然后如上，使用小鼠抗-LA3490多克隆抗体(1:2,000稀释)进行蛋白印迹。
rLA3490介导的HeLa细胞细胞毒性
将HeLa细胞(35,000个细胞/200ml)接种于八孔室载玻片(LabTek，美国)中，并且在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中温育24小时。用预优化浓度的45nM rLA3490处理细胞；t3490-和BSA-处理的和未处理的HeLa细胞作为对照。将载玻片温育长达4小时，并使用Leica DMi8倒置显微镜(Leica Microsystems，德国)在×40物镜下拍摄延时图像。通过a_10物镜拍摄暴露于rLA3490、t3490或BSA之前和之后的贴壁细胞或未处理的HeLa细胞，并使用LAS AF 2D定量图像分析软件(Leica Application Suite X，LAS X；LeicaMicrosystems，德国)对细胞进行计数。应用灰度预滤器来提高图像清晰度。将脱附量化为100×(4小时的#细胞/0小时的#细胞)，并报告为两次或更多次重复实验的平均值。
活/死和LDH测定以及F-肌动蛋白染色
将HeLa细胞暴露于45nM rLA3490或t3490中4小时。然后用1×PBS(pH 7.4)洗涤单层两次；将200ml溶解在PBS中的2mM钙黄绿素AM/4mM乙锭同型二聚体-1(活力试剂盒，Invitrogen，美国)添加到每个孔中，并将板在黑暗中温育30分钟。用PBS(pH 7.4)洗涤单层以减轻非特异性背景荧光。将BSA和未经处理的HeLa细胞用作对照。使用LeicaDMi8显微镜通过具有适当用于绿色(活细胞)和红色(死细胞)荧光的激发和发射滤光片的10×物镜拍摄图像。通过测定培养物上清液中乳酸脱氢酶的浓度来定量细胞裂解物(CyQUANTTM LDH细胞毒性测定，Invitrogen，美国)。对于F-肌动蛋白染色，将细胞单层暴露长达1小时，用PBS(pH 7.4)洗涤两次，以及然后用4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich，美国)在室温下固定30分钟。在吸出固定剂后，用PBS洗涤单层两次，然后将在PBS中的0.1％Triton X-100添加到每个孔中5分钟，然后用PBS重复洗涤。按照制造商的说明，将单层用鬼笔环肽Alexa_488nm缀合物(Invitrogen，美国)在黑暗中在室温下温育30分钟。细胞核用0.1mg/mlProLongTM Gold抗淬灭封片剂(含DAPI)染色10分钟。所有图像均使用Leica DMi8显微镜用适当的滤光片[Alexa_488nm(绿色)，DAPI(蓝色)]在×40物镜下拍摄。
HeLa细胞对rLA3490的内化
将HeLa细胞接种到八孔室载玻片(LabTek，美国)中并如上描述的进行温育。用45nM rLA3490或t3490处理单层长达60分钟，用PBS洗涤两次，然后按照制造商的说明用CellMaskTM绿色质膜染色剂(Invitrogen，美国)染色；细胞核用0.1mg/ml ProLongTM Gold抗淬灭封片剂(含DAPI)染色10分钟。使用Leica SP8门控STED 3×超分辨率共焦显微镜(Leica Microsystems，德国)通过×100油浸物镜拍摄图像。通过LAS X软件从24-42个截面图像(深度，6.87mm；间距，298.5nm)获得三维z投影。
DNA断裂/阶梯测定
使用分离的HeLa细胞基因组DNA(QiAmp DNesay血液和组织试剂盒；Qiagen，Invitrogen，美国)，在最终体积15ml含有10mM Tris和3mM MgCl2的1×Tris氯化镁(TM)样品缓冲液(pH 7.5)中进行DNA酶测定(Nakamura and Wisnieski，1990，J.Biol.Chem，265:5237-5241)；当90％汇合时，对单层进行胰蛋白酶消化，并按照制造商推荐的用于有核哺乳动物细胞的协议分离基因组DNA。在TM中稀释重组蛋白rLA3490或t3490(作为阴性对照)，并在使用前使其平衡至22℃。使用150ng基因组DNA(预平衡至22℃)启动含有3、10、30或100nM重组蛋白的一式三份反应，在不同的时间点添加预混合的上样缓冲液、凝胶上样染料、紫色(6×)(New England Biolabs，美国)终止，然后通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分析；凝胶用溴化乙锭(0.5ml/ml)染色。使用Gel Doc UV照明(Gel Logic212Pro，CarestreamMolecular Imaging，美国)拍摄凝胶图像。使用400ng未消化的(即超螺旋)pET质粒载体或HindIII消化的pET质粒载体作为输入来评估核酸内切酶活性。使用在DNA酶存在下发出强烈荧光(激发/发射495/520nm)的在其50端部用荧光素标记的且在其30端部用黑洞猝灭剂BHQ-1R标记的双标记寡核苷酸探针，使用互补的基于荧光的方法重复这些测定。与之前一样，重组蛋白在TM(3、10或30nM)中稀释，并在使用前使其平衡至22℃ 10分钟。对含有主混合液、寡核苷酸探针、检测缓冲液、ROX参考染料和10ml预平衡重组蛋白(在TM缓冲液中)的二十微升反应进行两步热循环协议，该协议由以下组成：使用CFX96Touch实时PCR检测系统(Bio-Rad，美国)进行36℃、10秒和37℃、50秒，30个循环。以5分钟增量记录荧光。将DNA酶I(0.02单位/ml)用作阳性对照，并且将PCR级水用作阴性对照。
统计分析和图像编辑
所有实验均一式三份进行并重复至少两次以评估再现性。结果表示为平均值和标准差。使用未配对的双尾学生t检验来评估统计显著性。数据通过Graph Prism 8可视化。所有图均使用Adobe Illustrator制作。
现在描述实验结果。
钩端螺旋体毒力修饰蛋白的独特结构
毒力钩端螺旋体属物种编码10至12种～640个氨基酸(aa)的多结构域VM蛋白，每种含有串联N-末端蓖麻毒素B-样凝集素(RBL)子结构域：RBL1和RBL2-统称为糖类结合区(CBR)或凝集素结构域(图31)。这些串联重复的RBL的存在类似于肺炎支原体社区获得性呼吸窘迫综合征(即CARDS)毒素(Becker et al.,2015,Proc Natl Acad Sci U S A,112(16):5165-70)-尽管取向相反(图31)，但钩端螺旋体VM蛋白和CARDS毒素的C-末端区域不相关。钩端螺旋体VM蛋白包含在从单个基因位点转录的单个多肽中，与大多数其它细菌AB毒素不同，其它细菌AB毒素通常由两个或多个基因编码(因此称为A-B)并组装成多聚蛋白复合物(Brown et al.,1980,FEBS Lett.117,84-88；Nakamura and Wisnieski,1990,J.Biol.Chem,265:5237-5241；McSweeney and Dreyfus,2004,Cell Microbiol,6:447-458；Coutte and Locht,2015,Future Microbiol,10:241-254；Cherubin et al.,2018,Sci Rep,8(1):2494)。独特于问号钩端螺旋体，存在含有预测信号序列的天然CBR缺失变体(～313aa)(见下文)。
钩端螺旋体毒力修饰蛋白变体的分布和进化
所有(当时)公认的致病性钩端螺旋体属物种的全基因组比较分析，表明，基因复制和衰变导致VM蛋白变体在毒力I组钩端螺旋体中分布不均匀，仅在问号钩端螺旋体、kirschneri钩端螺旋体和野口氏钩端螺旋体中进一步辐射(Fouts et al,2016,PLoS NeglTrop Dis.10(2):e0004403)。在距离矩阵计算之后，使用定制的R脚本和bio2mds，使用三维(3D)度量多维标度(MMDS)来定义和可视化直系同源簇(图32A、B)。为了一致性，簇使用相关的Copenhageni UniProtKB ID进行命名。使用指定的(直系同源)簇ID来引用VM蛋白旁系同源物(及其衍生物CBR和CTD)，例如Q8F0K3(簇ID，Q72UG2)(图32A、B)。
为了进一步探讨这些观察的进化意义，对源自致病性钩端螺旋体物种的～3,000种钩端螺旋体VM蛋白进行了系统发育基因组学分析。基于全面完整的PF07598参考比对，通过hmmalign将氨基酸序列与定制的HMMER v3(Potter et al.,2018,Nucleic Acids Res,46:W200-W204)配置文件进行比对。在钩端螺旋体属的致病进化枝内，VM蛋白极其多样化，包含至少36种离散的直系同源簇，但具有重要的氨基酸相似性(图32A、B)。限于少数钩端螺旋体物种的簇大小适中，含有5至50种单独的VM蛋白。含有问号钩端螺旋体特异性蛋白、kirschneri钩端螺旋体特异性蛋白和野口氏钩端螺旋体特异性蛋白的簇较大，大小在80至375种成员蛋白的范围内，可能反映了可访问的基因组数据库中对这些物种的偏好。
对成对距离矩阵和MMDS簇成员资格的检查使我们得出重要的结论。第一，在旁系同源物中，与～63成对氨基酸同一性、Lai范围62-72％的CTD相比，涵盖CBR的N-末端节段更加保守，～78％成对氨基酸同一性、Lai基因组内范围为66-99％。相比之下，CTD在具有最小氨基酸同一性>75％的直系同源物中更加保守，甚至在远缘亲缘物种之间也如此，从而允许轻松辨别旁系同源物和直系同源物。第二，在定义的许多直系同源簇中(图32B)，只有一个-Q72PX8-含有源自所有医学上重要物种(以及alexanderi钩端螺旋体和alstonii钩端螺旋体)的蛋白(N＝375)。Q72PX8周围的簇类模式可能表明该蛋白是I组致病性钩端螺旋体中的祖先VM蛋白。相反，大多数物种含有至少一个定义簇，例如问号钩端螺旋体的CBR缺失变体(n＝139)。第三，糖类结合和毒素功能的范围可能因血清型而异，即使在属于同一物种的血清型之间也是如此。例如，分别对应于Q8F0K3[UG2]的CBR和CTD的CBRUG2和CTDUG2存在于-每个基因组有一例-问号钩端螺旋体血清型Copenhageni(由8种菌株和98种蛋白代表)、Canicola(8种和95种)、Hardjo(2种和21种)、Lai(3种和28种)、Manilae(2种和26种)和Pomona(5种和62种)，每种的氨基酸同一性>99％。尽管Lai和Copenhageni直系同源物具有预期的CBRUG2//CTDUG2组合，但Canicola的一些菌株含有保守的嵌合变体CBRUG2//CTDTZ4和CBRUL8//CTDUG2。虽然同源Q8F0K3[UG2]CBR和CTD以交替串联配对出现，但要被视为真正的嵌合体，变体必须出现在多个基因组中，并且CBR和CTD必须在指定的簇中心内各自共享>99％的氨基酸同一性。此类变体在具有相同或几乎相同CBR的旁系同源物的血清型中更常见(例如Copenhageni中的Q72U83和Q72NP1)(图32A、B)。综上，这些观察表明，CBR和CTD结构域的进化及其在某些谱系中的重配(可能通过重组)促进了钩端螺旋体VM蛋白的多样性，并且特别是有助于了解I组病原体对哺乳动物生态位的适应(图32C)。
定位嵌合毒力修饰蛋白的融合连接：
功能性后果
已证明钩端螺旋体VM蛋白通过CBR和CTD的基因复制和谱系依赖性重配在毒力物种内辐射和多样化(图32)，寻求证据来表明VM蛋白结构域的融合连接是否在功能上保守。为了测试CTD的全部或部分是否被替换，首先使用基于互补序列的方法识别了嵌合VM蛋白。嵌合变体出现在医学上重要的钩端螺旋体中，但仅出现在属于同一超簇的最近分化的旁系同源对中(图32D)。无论涉及何种旁系同源物，仅检测到两种类型的嵌合变体，这表明嵌合变体的发展取决于对体内功能至关重要的一些特定结构特征。对嵌合连接的检查揭露，融合连接非常一致(通过多个菌株的比较得到证实)，这表明这些替代在功能上受到限制。因此，嵌合VM蛋白是新型的子结构域单倍型，其中存在于一个旁系同源物的氨基末端CTD节段中的运输基序与位于相关旁系同源物的第二CTD节段中的DNA酶活性配对(图32D)。这些观察表明，这些嵌合蛋白可能改变了细胞靶向能力(相对于其同源供体和接受者)，即可能反映了钩端螺旋体对不同宿主的适应。
钩端螺旋体毒力修饰蛋白的第一个蓖麻毒素B-样凝集素子结构域(RBL1)具有与 蓖麻毒素B链相似的糖类结合特异性
因为远程同源性搜索在钩端螺旋体VM蛋白的氨基末端区域识别了串联蓖麻毒素B-样凝集素子结构域(图31)，因此测试了假设，即如同蓖麻毒素B链，钩端螺旋体VM蛋白结合末端半乳糖和N-乙酰基-半乳糖胺残基，例如脱唾液酸胎球蛋白(一种模型蛋白)(Dawsonet al.,1999,J.Appl.Toxicol,19:307–312；Blome et al.,2010,Anal.Biochem,396:212–216；Falach et al.,2020,Sci.Rep,10:9007)。最初的实验聚焦于重组Q8F0K3(此处称为其基因座标签rLA3490)-因为之前的研究表明LA3490在体内高度转录上调并与毒力有关(Lehmann et al,2013，PLoS Negl Trop Dis，7(10):e2468)。为了保持一致性，所有全长重组VM蛋白[即完整的CDS减去SS(信号序列)]将被类似地提及。仅含有RBL1的重组N-末端截短(例如Q8F0K3的重组N-末端截短)将按以下方式提及：对于截短的LA3490为t3490。对于使用原生VM蛋白的实验，在模拟内部宿主环境的条件下生长钩端螺旋体细胞，以促进体外毒力基因表达(Matsunaga et al.,2005，Infect Immun，73(1):70-8；Lo et al.,2006，Infect.Immun，74:5848–5859；Matsunaga et al,2007；Infect Immun，75(6):2864–2874)。
重组VM蛋白在大肠杆菌中表达为与硫氧还蛋白-His6(TRX)的N-末端融合物，以改善溶解度。将C-末端与mCherry-His6融合以促进亲和纯化和使用荧光显微镜可视化蛋白(图33A)。蛋白免疫印迹(通过鲎变形细胞裂解物测定显示其不含内毒素)排除了污染脂多糖的潜在细胞毒性(图34)。LA3490和t3490均与脱唾液酸胎球蛋白结合(图33B)。VM蛋白与蓖麻毒素B链具有相似的糖类结合特异性，这通过竞争性脱唾液酸胎球蛋白结合测定所确定(Sehnke et al.,1994,J.Biol.Chem.269,22473-22476；Dawson et al.,1999,J.Appl.Toxicol,19:307-312；Blome et al.,2010,Anal.Biochem,396:212-216；图33C)。正如基于预测的分泌信号的存在所预测的那样，Q8F0K3[rLA3490](以及可能的其它VM蛋白)被发现是在钩端螺旋体条件培养基中的可溶性蛋白，这种分泌可通过生理渗透压和温度诱导。使用脱唾液酸胎球蛋白缀合的琼脂糖珠的固相结合测定证实，Q8F0K3与脱唾液酸胎球蛋白结合(图33D)。如同重组蓖麻毒素B，可以使用0.5M乳糖洗脱脱唾液酸胎球蛋白结合的Q8F0K3，这进一步支持了以下结论：钩端螺旋体VM蛋白具有真正的蓖麻毒素B-样凝集素糖类结合活性。
这些观察表明，LA3490的CBD(RBL1)以及以此类推的其它VM蛋白的CBD都是真正的R-型凝集素。
rLA3490对HeLa细胞单层的剂量依赖性细胞毒性
在确认RBL1是R-型凝集素后，不受理论的束缚，假设VM蛋白是细胞毒素，其作用由尚未表征的C-末端区域介导。
将HeLa细胞暴露于rLA3490诱导了剂量依赖性细胞病变效应和HeLa细胞单层破坏(图35)，如台盼蓝排除、相差显微镜检查、荧光活/死染色和乳酸脱氢酶释放所证实的。观察到肌动蛋白解聚(图35C)和半胱天冬酶激活(图36)。使用阴性对照(包括t3490、牛血清白蛋白(BSA)和未处理)未观察到此类变化，这证实细胞死亡是rLA3490处理的直接结果，而不是融合蛋白亲和力/表位标签或培养条件的人为因素所致。
单独的蓖麻毒素B-样凝集素1足以附着在HeLa细胞表面，但不足以内化
使用超分辨率荧光共聚焦显微镜监测rLA3490-和t3490-mCherry融合蛋白的内化和/或细胞内运输(图37)。两种融合蛋白均结合至细胞表面，但仅rLA3490内化并且定位至细胞核(图37A、B)。虽然单独的RBL1足以结合-至固定的脱唾液酸胎球蛋白(如上)和在HeLa细胞表面-但内化取决于RBL结构域之外的蛋白折叠。在处理后30-60分钟发生rLA3490和t3490在细胞表面的结合，从30分钟开始内化、易位和核碎裂明显(图37B，右图)。rLA3490的最大积累取决于全长蛋白依赖性内化；t3490的最大结合和积累发生在10分钟，而rLA3490持续在HeLa细胞中积累(图37C)。t3490结合到HeLa细胞的表面，但没有被内化(图37B，左图)，并且没有细胞毒性。动画正交堆栈和z堆栈显示了HeLa细胞在30分钟和60分钟时的rLA3490和/或t3490的结合和内化。
钩端螺旋体毒力修饰蛋白具有体外内切和外切DNA酶活性
已经证明rLA3490定位至HeLa细胞核，导致染色体断裂，不受理论的束缚，假设Q8F0K3(以及推而广之，所有VM蛋白)具有可能有助于细胞死亡机制的DNA酶活性。无细胞测定表明，rLA3490对纯化的HeLa细胞基因组DNA具有有效的、剂量依赖性的DNA酶活性(图38A)，并且对产生松弛和线性化质粒的超螺旋质粒DNA具有剂量依赖性切口、核酸内切酶和核酸外切酶活性(图38C、D)。线性化质粒被完全消化(图38D)，这证实外切DNA酶活性与重组牛DNA酶I的活性相当(图38E)。其它重组VM蛋白、LA0591[血清型Lai CBR缺失变体(图38F)]、rLA0620、rLA1400和rLA1402也表现出外切DNA酶活性(数据未示出)。阴性对照、t3490(和t0620，未示出)没有可检测到的DNA酶活性(图38)。
LA3490的钩端螺旋体羧基末端结构域与牛DNA酶I的序列、结构相似性
在实验证明重组全长VM蛋白中的DNA酶活性后，进行了新的序列比对，并且系统发育关系分析聚焦于将VM蛋白氨基酸序列的CTD与各种哺乳动物DNA酶和大肠杆菌细胞致死膨胀毒素(CdtB)序列进行比较。这些分析与具有可识别的C-末端DNA酶结构域的钩端螺旋体VM蛋白一致。在尝试将LA3490的CTD与牛DNA酶I叠加时，特别是在活性位点存在结构相似性，但仅获得的RMSD值，因为在预测的活性位点之外整体结构相似性较低(图39)。
钩端螺旋体毒力修饰蛋白结构-功能关系
基于VM蛋白细胞毒性和DNA酶活性的展示，寻求了更好地了解这些蛋白的多样性及其在毒力钩端螺旋体属物种中的辐射。HHpred同源性搜索表明，RBL1和RBL2与CARDS的D2和D3具有高度的序列和结构同源性(Becker et al.,2015,Proc Natl Acad Sci U S A,112(16):5165-70)(E＝2.7e-96)并且在功能上似乎相似。AlphaFold结构模型表明，VM蛋白CTD似乎含有功能不同的子结构域，这些子结构域解释了实验展示的细胞内运输、细胞毒性和DNA酶活性(图35)。
所有VM CTD，包括CBR缺失变体，都含有多个统计上得到充分支持的(即p<1e-4)人短线性基序(SLiM)模拟物(Samano-Sanchez and Gibson,2020,Trends Biochem.Sci,45:526-544)，使用真核线性基序(ELM)资源进行鉴定，其可能促进VM蛋白运输和核易位，包括核定位信号NLS。在13种问号钩端螺旋体旁系同源物中，只有CBR缺失变体与另一种旁系同源物具有共同的NLS，这可能反映了它们的进化起源。属于同一物种的给定直系同源簇的大多数成员都包含不变的NLS。与其侧翼相比，含有NLS的子结构域(14aa)特别可变，这表明了强选择。该子结构域之后是连续的两亲性a-螺旋，包含假定的LxxLL核受体基序[LIG_NRBOX(ELME000045):451HLERLLE457；SEQ ID NO:94，和SH2结合基序LIG_SH2_SRC(ELME000474):Yxxx8(385YEIAT389)；SEQ ID NO:95]。此外，还存在EF2转录因子特征性的LxxLFD基序(Q8F0K3中不存在)和用于结合辅助内吞蛋白(ELME000190)的单个LIG_AP2alpha_2模拟物(440DPF442)。Q72UG2簇成员(包括Q8F0K3)含有多个不同的SLiM模拟物，包括第二个LxxLL基序(413MLAELLE419；SEQ ID NO:96)。
pLxIS基序(536PILRIS541；SEQ ID NO:97)可能通过干扰IRF-3依赖性信号传导和衔接蛋白-结合核内体-溶酶体-基底外侧分选信号(p<8.4e-5)：TRG_DiLeu_BaEn_3[ELME000525]和557EEFRRFL563(SEQ ID NO:98)来介导免疫逃逸。
VM蛋白C-末端似乎无序，并且通常由CAAX基序终止(即MOD_CAAXbox[ELME000059]，p<2.4e-6)，让人想起由细胞内细菌嗜肺军团菌产生的F-box蛋白(Perpichet al.,2017)。这些基序充当异戊二烯化底物，并且通常介导膜附着。Q8F0K3[UG2]和Q8F6G6[CBR缺失变体]缺乏规范的CAAX盒，但由LIG_PDZ_Class_2[ELME000091]基序：634RCALPF639(SEQ ID NO:99)终止(p<7.9e-5)，以用于结合PDZ结构域，它们是在真核调节蛋白中发现的球状蛋白模块。
实施例6：凝集素-DNA酶VM蛋白抗原序列
野生型-Q04T47_12844_0769(SEQ ID NO:15)
突变体-Q04T47_12844_0769(SEQ ID NO:16)
/>
野生型-Q04V07_12339_1402(SEQ ID NO:17)
/>
突变体-Q04V07_12339_1402(SEQ ID NO:18)
/>
本文引用的每一项和每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用完整地并入本文。虽然已经参考特定实施方式公开了本发明，但是显然，本领域的其它技术人员在不背离本发明的真实精神和范围的情况下可以设计出本发明的其它实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有此类实施方式和等同变型。

Claims (40)

1.一种组合物，包含选自由以下组成的组中的至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白或其片段：
a)选自由以下组成的组中的VM蛋白：LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091；和
b)含有选自由以下组成的组中的VM蛋白的DNA酶结构域的VM蛋白片段：LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物是融合蛋白，所述融合蛋白包含与特异于结合靶分子的靶向结构域融合的钩端螺旋体VM蛋白或含有DNA酶结构域的VM蛋白片段。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述靶分子选自由以下组成的组：细菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、癌抗原、肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含两种或更多种钩端螺旋体VM蛋白或含有DNA酶结构域的VM蛋白片段的组合。
5.根据权利要求4所述的组合物，包含LIC_12340和LIC_12985的组合。
6.根据权利要求4所述的组合物，包含LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的组合。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含至少一种钩端螺旋体VM蛋白，所述钩端螺旋体VM蛋白包含选自由以下组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物包含含有SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:12中所示序列的VM蛋白的组合。
9.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述组合物包含含有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12中所示序列的VM蛋白的组合。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含至少一种脂质纳米颗粒(LNP)，所述脂质纳米颗粒包含至少一种VM蛋白或含有DNA酶结构域的VM蛋白片段。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物包含至少两种LNP的组合，所述LNP包含至少两种VM蛋白或含有DNA酶结构域的VM蛋白片段。
12.一种组合物，包含至少一种核酸分子，所述核酸分子编码选自由以下组成的组中的至少一种钩端螺旋体毒力修饰(VM)蛋白或其片段：
a)选自由以下组成的组中的VM蛋白：LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091；和
b)含有选自由以下组成的组中的VM蛋白的DNA酶结构域的的片段：LA_3388、LA_0835、LA_0591、LA_0589(v)、LA_1402、LA_1400、LA_3271、LA_0934、LA_0769、LA_2628、LA_0620、LA_3490、LIC_10778、LIC_12791、LIC_12985、LIC_12986、LIC_12339、LIC_12340、LIC_10870、LIC_12715、LIC_12844、LIC_11358、LIC_10639、LIC_12963、LIC_10695、LMANV2_260038、LMANV2_240079、LMANV2_70075、LMANV2_70078、LMANV2_210058、LMANV2_210056、LMANV2_80114、LMANV2_320010、LMANV2_240142、LMANV2_150103、LMANV2_170032、LMANV2_70050和LMANV2_170091。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与特异于结合靶分子的靶向结构域融合的钩端螺旋体VM蛋白或含有VM蛋白的DNA酶结构域的片段。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述靶分子选自由以下组成的组：细菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、癌抗原、肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中，组合物包含编码LIC_12340和LIC_12985的组合的一种或多种核酸分子。
16.根据权利要求12所述的组合物，其中，组合物包含编码LIC_12340、LIC_12985、LA_3490、LA_0620和LA_1402的组合的一种或多种核酸分子。
17.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述核酸分子编码选自由以下组成的组中的至少一种氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12。
18.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组中的至少一种核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
19.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述组合物包含编码SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:12的组合的一种或多种核酸分子。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述组合物包含含有SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:11的组合的一种或多种核酸分子。
21.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物包含编码SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的组合的一种或多种核酸分子。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述组合物包含含有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的组合的一种或多种核酸分子。
23.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述组合物包含至少一种脂质纳米颗粒(LNP)，所述脂质纳米颗粒包含编码至少一种VM蛋白或其含有DNA酶结构域的片段的至少一种核酸分子。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述核酸分子包含编码所述至少一种VM蛋白或其含有DNA酶结构域的片段的mRNA分子。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含疫苗。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含佐剂。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述佐剂是以稳定的水包油纳米乳液(SE)配制的吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含类毒素疫苗。
29.一种抗钩端螺旋体VM蛋白抗体，包含选自由以下组成的组中的CDR序列：
a)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所示的LCDR序列；
b)SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中所示的LCDR序列；
c)SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50中所示的LCDR序列；
d)SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66中所示的LCDR序列；和
e)SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79中所示的HCDR序列以及SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82中所示的LCDR序列。
30.根据权利要求29所述的抗钩端螺旋体VM蛋白抗体，其中，所述抗体包含选自由以下组成的组中的重链和轻链序列：
a)SEQ ID NO:27中所示的HC序列和SEQ ID NO:28中所示的LC序列；
b)SEQ ID NO:27中所示的HC序列和SEQ ID NO:43中所示的LC序列；
c)SEQ ID NO:51中所示的HC序列和SEQ ID NO:52中所示的LC序列；
d)SEQ ID NO:67中所示的HC序列和SEQ ID NO:68中所示的LC序列；和
e)SEQ ID NO:83中所示的HC序列和SEQ ID NO:84中所示的LC序列。
31.一种核酸分子，编码权利要求29-30中任一项所述的抗体或其片段。
32.根据权利要求31所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组中的核苷酸序列：
a)包含编码HCDR的SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的核苷酸序列；
b)包含编码LCDR的SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的核苷酸序列；
c)包含编码LCDR的SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的核苷酸序列；
d)包含编码HCDR的SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的核苷酸序列；
e)包含编码LCDR的SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的核苷酸序列；
f)包含编码HCDR的SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71的核苷酸序列；
g)包含编码LCDR的SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的核苷酸序列；
h)包含编码HCDR的SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87的核苷酸序列；和
i)包含编码LCDR的SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90的核苷酸序列。
33.根据权利要求32所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组中的核苷酸序列：SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:44、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92。
34.一种组合物，包含至少两种权利要求32所述的核酸分子的组合。
35.根据权利要求34所述的组合物，包含选自由以下组成的组中的核酸分子的组合：
a)包含编码HCDR的SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的第一核酸分子；和包含编码LCDR的SEQ ID NO:32、SEQID NO:33和SEQ ID NO:34的第二核苷酸序列；
b)包含编码HCDR的SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的第一核酸分子；和包含编码LCDR的SEQ ID NO:40、SEQID NO:41和SEQ ID NO:42的第二核苷酸序列；
c)包含编码HCDR的SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的第一核酸分子；和包含编码LCDR的SEQ ID NO:56、SEQID NO:57和SEQ ID NO:58的第二核苷酸序列；
d)包含编码HCDR的SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71的第一核酸分子；和包含编码LCDR的SEQ ID NO:72、SEQID NO:73和SEQ ID NO:74的第二核苷酸序列；
e)包含编码HCDR的SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87的第一核酸分子；和包含编码LCDR的SEQ ID NO:88、SEQID NO:89和SEQ ID NO:90的第二核苷酸序列。
36.根据权利要求34所述的组合物，包含选自由以下组成的组中的核酸分子的组合：
a)包含SEQ ID NO:35的第一核酸分子；和包含SEQ ID NO:36的第二核苷酸序列；
b)包含SEQ ID NO:35的第一核酸分子；和包含SEQ ID NO:44的第二核苷酸序列；
c)包含SEQ ID NO:59的第一核酸分子；和包含SEQ ID NO:60的第二核苷酸序列；
d)包含SEQ ID NO:75的第一核酸分子；和包含SEQ ID NO:76的第二核苷酸序列；和
e)包含SEQ ID NO:91的第一核酸分子；和包含SEQ ID NO:92的第二核苷酸序列。
37.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予所述受试者权利要求1-28中任一项所述的组合物、权利要求29-30中任一项所述的抗体、权利要求31-33中任一项所述的核酸分子、或权利要求34-36中任一项所述的组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述受试者当前感染有钩端螺旋体属物种并且组合物诱导针对钩端螺旋体属物种的免疫应答。
39.一种在受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括给予所述受试者权利要求1-28中任一项所述的组合物、权利要求29-30中任一项所述的抗体、权利要求31-33中任一项所述的核酸分子、或权利要求34-36中任一项所述的组合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述疾病或病症是选自由以下组成的组中的至少一种：癌症、细菌感染、病毒感染和寄生虫感染。
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