EA025831B1

EA025831B1 - Композиции из hyr1-производных и способы лечения ими

Info

Publication number: EA025831B1
Application number: EA201391199A
Authority: EA
Inventors: Ашраф С. Ибрагим; Майкл Р. Йиман; Джон Е. Джр. ЭДВАРДС; Гуаньпиншэн Ло; Юэ ФУ
Original assignee: Лос-Анджелес Биомедикал Ресерч Институт Эт Харбор-Укла Медикал Центер
Priority date: 2011-09-14
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2017-02-28
Also published as: AU2012308281A1; JP2014527084A; UA115305C2; GEP20197052B; EP2755668A4; CN103998049A; CA2848403A1; EA201391199A1; WO2013040478A3; US10160790B2; US20150191514A1; WO2013040478A2; EP2755668A2; BR112014005773A2

Abstract

Изобретение предлагает выделенные полипептиды Hyr1. Изобретение также предлагает вакцины и антитела, подходящие для лечения или профилактики кандидоза или инфекций Acinetobacter или и того и другого.

Description

Изобретение относится в общем к композициям и способам обнаружения, лечения и профилактики инфекционных заболеваний у пациента.

Предпосылки для создания изобретения

Вид СапШйа, третья наиболее распространенная причина инфекций крови, связанных со здравоохранением, приводит приблизительно к 60000 случаев кандидоза, распространяющегося в крови, в год в США, вызывая многомиллиардные расходы на здравоохранение. Несмотря на текущее состояние противогрибковой терапии смертность остается неприемлемо высокой. Из-за растущей частоты угрожающего жизни кандидоза и высокой частоты неудачного лечения необходимы более эффективные стратегии профилактики и терапии.

Основным защитным механизмом организма против распространяющегося кандидоза является иммунологическое фагоцитарное уничтожение. Только фагоцитарные клетки способны непосредственно уничтожать СапШйа ίη νίίτο. Помимо этого, в течение 30 мин после внутривенной инокуляции СапШйа у мышей, кроликов, собак или людей дрожжи сохраняются в ретикулоэндотелиальной системе, особенно в печени. Печень, богатая макрофагами Купфера, способна очистить 99,9% дрожжей в портальной системе за один прогон, подчеркивая эффективность фагоцитарных защитных механизмов против грибка. Следовательно, устойчивость С. а1Ыеап8 к фагоцитарному уничтожению является важной вирулентной функцией организма.

Белки, прикрепленные к гликозилфосфатидилинозитолу (ГФИ) поверхности клеток находятся на критической поверхности контакта между патогенным микроорганизмом и иммунной системой, что делает эти белки вероятными участниками взаимодействия между иммунной системой и патогенным микроорганизмом.

Идентификация эффекторов в регуляторных путях организма, которые способствуют вирулентности, дает возможность для терапевтического вмешательства с помощью способов или композиций, которые лучше по качеству, чем современные противогрибковые вещества. Идентификация белков клеточных поверхностей или гифальных белков, которые отрицательно влияют на регуляторный путь, вовлеченный в вирулентность, является особенно перспективной, поскольку определение характеристик белка позволяет применить иммунотерапевтические способы, которые, вероятно, лучше по качеству или действуют совместно с существующими противогрибковыми средствами в борьбе с кандидозной инфекцией.

Вирулентность С. а1Ыеап8 регулируется несколькими предполагаемыми факторами вирулентности, из которых адгезия к составляющим организма-носителя и способность трансформироваться из дрожжей в гифы являются одними из наиболее критических при определении патогенности. Хотя существуют сильные противогрибковые средства, которые являются бактерицидными для СапШйа. смертность, относимая на счет кандидемии, составляет приблизительно 38%, даже при лечении сильными противогрибковыми средствами, такими как амфотерицин В. Кроме того, существующие средства, такие как амфотерицин В, стремятся к проявлению нежелательной токсичности. Хотя могут быть разработаны дополнительные противогрибковые средства, которые менее токсичные, чем амфотерицин В, маловероятно, что будут разработаны средства, которые более сильные. Поэтому пассивная или активная иммунотерапия для лечения или профилактики распространяющегося кандидоза является перспективной альтернативой стандартной противогрибковой терапии.

Летальные инфекции стойких к антибиотикам патогенных бактерий, как и инфекции, вызываемые СапШйа, становятся все более частыми. Более того, риск заражения этими летальными инфекциями чрезмерно высокий для многих пациентов, подверженных ему, которые ежегодно находятся в отделениях интенсивной терапии, а также для солдат, находящихся на передней линии зон боевых действий. Виды ЛстсЮЬасЮг часто являются источником инфекции для госпитализированных пациентов и солдат, в частности вид Ααηθίοϋπ№Γ Баишаппл. Ααηθίοϋπ№Γ является родом грамотрицательных бактерий, принадлежащих к гаммапротеобактериям. Виды Αс^ηеίοБасίе^ способствуют минерализации ароматических соединений в почве. К сожалению, в настоящее время не существует технологии, которая препятствует инфекциям, вызываемым Αс^ηеίοБасίе^, помимо стандартного мытья рук и других способов избежать инфекции в больничной обстановке.

Активная и пассивная иммунизация пациентов против стойких к антибиотикам патогенных бактерий представляется удобным и потенциально экономичным способом попытки борьбы с этими инфекциями. Однако выявление и разработка эффективных антигенных мишеней для осуществления пассивной и активной иммунизации против бактерий в общем представляет серьезную трудность из-за огромного массива видов бактерий. Выявление соединений, которые влияют на вирулентность конкретных семейств или родов бактерий, дает возможность разрабатывать новые терапевтические вмешательства. В частности, распознавание повсеместных белков клеточных поверхностей, которые присутствуют на се- 1 025831 мействах или родах бактерий, которые могут быть идентифицированы иммунной системой человека, позволят разработать способы иммунотерапии. Эти способы вероятно будут лучше, чем антибиотики и будут действовать совместно с последними для профилактики или лечения бактериальных инфекций.

Соответственно, существует потребность в соединениях и способах, которые снижают риск инфекционных заболеваний, связанных с СаийМа, и бактериальных инфекций и обеспечивают эффективную терапию. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность и предлагает связанные с этим преимущества.

Раскрытие изобретения

Было установлено, что фрагменты белка Нуг1 поверхностей клеток Сапй1йа помогают иммунизировать пациента от инфекций СапФйа. Также было установлено, что белок Нуг1 также борется с инфекциями ЛстсЮЬасГсг.

Соответственно, в первом аспекте изобретение предлагает выделенный полипептид, включающий любую аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 3-10, или вариант последовательности, имеющий до трех замен, делеций или добавлений к любой аминокислотной последовательности из 8ЕЦ ГО N0: 3-10, причем полипептид не включает более чем 20 смежных аминокислот из 8ЕЦ ГО N0: 2. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает любую одну аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 3-10. В некоторых вариантах осуществления полипептид состоит из 14-20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления №концевым аминокислотным остатком или Сконцевым аминокислотным остатком полипептида является цистеин. В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида включает или состоит из любой аминокислотной последовательности из 8ЕЦ ГО N0: 11-18.

Во втором аспекте изобретение предлагает выделенный конъюгат, включающий полипептид первого аспекта, конъюгированный с носителем. Например, носителем может быть гемоцианин фиссуреллы (КЬН), СКМ197, или токсоид столбняка, или фаг, дрожжи, вирус, виросома, или рекомбинантная вирусоподобная частица. В некоторых вариантах осуществления конъюгатом является рекомбинантный составной белок.

В третьем аспекте изобретение предлагает вакцину, включающую иммуногенное количество полипептида первого аспекта или конъюгата второго аспекта и фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах осуществления вакцина включает смесь разных полипептидов первого аспекта или конъюгатов второго аспекта. В некоторых вариантах осуществления вакцина, кроме того, включает адъювант, например Альгидрогель. В некоторых вариантах осуществления полипептид первого аспекта или конъюгат второго аспекта получают синтетически или рекомбинантно. В некоторых вариантах осуществления вакцина предназначена для вакцинации млекопитающего, например человека, против кандидоза или вакцинации млекопитающего против Ас1пе1оЪас1ег. В некоторых вариантах осуществления вакцина должна вводиться внутримышечно, подкожно или внутрикожно. В некоторых вариантах осуществления вакцинация, кроме того, включает введение бустер-дозы. В некоторых вариантах осуществления кандидозом является рассеянный кандидоз, например рассеянный в крови кандидоз, или кандидозом является кандидоз слизистой, или кандидозом является вагинальный кандидоз, или кандидоз вызван СаийМа, таким как Сапй1йа а1Ысаи8, Сапй1йа д1аЪга!а, СапФйа кгидег СапФйа рагар8Йо818 или СапФйа Форка®.

В четвертом аспекте изобретение предлагает способ вакцинации млекопитающего, например человека, против кандидоза, включающий введение млекопитающему вакцины третьего аспекта, этим вакцинируя млекопитающего против кандидоза или вакцинируя млекопитающего против АсФе1оЪас1ег. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно. В некоторых вариантах осуществления введение кроме того включает введение бустер-дозы. В некоторых вариантах осуществления кандидозом является рассеянный кандидоз, например рассеянный в крови кандидоз, или кандидозом является кандидоз слизистой или вагинальный кандидоз, или кандидоз вызван СаиФйа, таким как СапФйа а1Ъюап8, СапФйа §1аЪга1а. СапФйа кгидег СапФйа рагар8Йо818 или СапФйа Цорюа®.

В пятом аспекте изобретение предлагает способ получения химерной вакцины, включающий следующие этапы: (а) получения фага, дрожжей или вируса; (Ъ) введение в фаг, дрожжи или вирус молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид первого аспекта; (с) экспрессию полипептида в фаге, дрожжах или вирусе; (й) выделение фага, дрожжей или вируса с этапа (с), включая экспрессированный полипептид; и (е) добавление фармацевтически приемлемого наполнителя к выделенному фагу, дрожжам или вирусу с этапа (й). В некоторых вариантах осуществления полипептид проявляют на поверхности фага, дрожжей или вируса после этапа (с).

В шестом аспекте изобретение предлагает выделенное моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом первого аспекта или конъюгатом второго аспекта. В некоторых вариантах осуществления антитело является человеческим или гуманизированным или является химерным. В некоторых вариантах осуществления антитело получают рекомбинантно или синтезируют химически.

В седьмом аспекте изобретение предлагает диагностическую композицию, включающую антитело шестого аспекта.

В восьмом аспекте изобретение предлагает фармацевтическую композицию, включающую антите- 2 025831 ло шестого аспекта и фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает смесь антител шестого аспекта с несколькими отдельными специфическими характеристиками.

В девятом аспекте изобретение предлагает фармацевтическую композицию, включающую поликлональные антитела, которые связываются с полипептидом первого аспекта или конъюгатом второго аспекта, или которые связываются со смесью разных полипептидов первого аспекта или конъюгатов второго аспекта.

В некоторых вариантах осуществления восьмого или девятого аспекта фармацевтическая композиция предназначена для использования при пассивной иммунизации млекопитающего, например человека, против кандидоза или против Асше1оЬас1ег. Например, фармацевтическая композиция может быть введена внутримышечно, подкожно или внутрикожно. В некоторых вариантах осуществления кандидозом является рассеянный кандидоз, например рассеянный в крови кандидоз, или кандидозом является кандидоз слизистой, такой как вагинальный кандидоз, или кандидоз вызван СаибЫа, таким как СаибМа а1Ысап8, СаиФба д1аЬга!а, СаибМа кгикец СаибМа рагар811о818, или СаиФба йорюаПк.

В десятом аспекте изобретение предлагает способ пассивной иммунизации млекопитающего, например человека, против кандидоза, включающий введение млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции восьмого или девятого аспекта, в результате чего млекопитающее иммунизируется против кандидоза или против Асше1оЬас1ег. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно или даже интраназально. В некоторых вариантах осуществления кандидозом является рассеянный кандидоз, например рассеянный в крови кандидоз, или кандидозом является кандидоз слизистой, такой как вагинальный кандидоз, или кандидоз вызван СаибМа, таким как СаиФба а1Ысап5. СаиФба д1аЬга!а, СаибМа кгикец СаибМа рагар811о818 или СаиФба йорюайк.

В других аспектах изобретение предлагает раскрытые в настоящем документе композиции и способы, которые основаны, по меньшей мере, отчасти на выявлении того, что иммунная реакция, такая как антитела и другие механизмы, которые нацелены на полипептид СаибМа ΗΥΚ1 и обеспечивают защиту от инфекции Асше1оЬас1ег, такой как Асше1оЬас1ег Ьаиташю. Подходы активной или пассивной иммунизации, использующие полипептид ΗΥΚ1 или специфические белки Асше1оЬас1ег Ь-штатиЕ раскрытые в настоящем документе, подходят для защиты от инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, включая, но без ограничения, ЛстеЮЬасЮг Ьаитаиил. Некоторые виды использования композиций и способов, раскрытых в настоящем документе, включают пассивную вакцинацию пациентов с острыми рисками такой дозой антитела к ΗΥΚ.1, чтобы предотвратить приобретение инфекции Лсте1оЬас1ег Ьаитаиии. Помимо этого, пациенты с активной инфекцией ЛсшеЮЬас1ег Ьаитатш могут получать лечение только этим антителом или в сочетании с другими противобактериальными средствами. Альтернативно, пациенты с риском развития таких инфекций, например военнослужащие, могут быть активно вакцинированы полипептидами ΗΥΚ.1 или специфическими полипептидами Асше1оЬас1ег Ьаитаηη^^. раскрытыми в настоящем документе, чтобы предотвратить такие инфекции.

В других аспектах изобретение в этом контексте предлагает пассивную или активную вакцинацию, как она раскрыта в настоящем документе, которая способна заметно уменьшить приобретение стойкой к лекарствам, летальной инфекции ЛстеЮЬасЮг Ьаитаиил. Поскольку в настоящее время нет антибиотиков с активностью против рода Асше1оЬас1ег, предотвращение таких инфекций имеет очень важное значение, помимо этого, вакцина и фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем документе, имеют потенциал действия против других инфекций, вызываемых грамотрицательными палочками, поскольку пассивные и активные стратегии, предлагаемые изобретением, действуют против ксеноантитела СаибМа ЦЫсаш, которое имеет значительную структурную гомологию с антигенами к грамотрицательным палочкам, включая таковые из вида Асше1оЬас1ег Ьаиташю. Использование антигена не к АстеЮЬас1ег для защиты против инфекции Асте1оЬас1ег дает крупное преимущество в борьбе с инфекцией.

Изобретение поэтому предлагает активную вакцинацию, подходящую для предотвращения инфекций у госпитализированных пациентов, с использованием полипептида ΗΥΚ1 или его фрагмента или белков Асше1оЬас1ег Ьаиташик раскрытых в настоящем документе. Изобретение также предлагает способы и композиции для активной вакцинации, чтобы предотвратить инфекцию Асше1оЬас1ег у военнослужащих, что крайне желательно, поскольку Асше1оЬас1ег является одной из наиболее распространенных причин инфицирования ран в боевых условиях. Изобретение, кроме того, предлагает способы и композиции для пассивной иммунизации в качестве дополнительной терапии при активной инфекции с использованием антитела как поликлонального, так и моноклонального, действующего против полипептида ΗΥΚ1 или белков АстеЮЬасЮг Ьаитаиий, раскрытых в настоящем документе. Кроме того, изобретение предлагает диагностический биомаркер, путем обнаружения антитела или ПЦР, чтобы определять присутствие Асше1оЬас1ег в инфицированных жидкостях или тканях. Изобретение также предлагает, что вышеуказанные применения могут быть распространены на другие медицински важные грамотрицательные бактерии.

В других аспектах изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют специфические полипептиды ΗΥΚ1 или их фрагменты, которые могут действовать как антигены для создания им- 3 025831 мунной реакции на грамотрицательные бактерии, включая бактерии рода Ас1ие1оЬас1ет, например Асше1оЬас1ет Ьаитаппи.

Например, в некоторых аспектах изобретения нуклеиновые кислоты изобретения кодируют полипептид ΗΥΚ1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из одной или нескольких из δΕΟ ГО N0: 3-10 или из одной или нескольких из ΟΟΡδΑΡΕδΕδΌΕΝΤΡ (δΕΟ ΙΌ N0: 11), ΟΟΝΚΌΗΡΚΕΕΥΥΡΌΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 12), ('ΟΥΙ)δΚΙ ,Ι^;ΗΙν\δΗΟ (δΕΟ ΙΌ N0: 13), ΟΚΙΚΟΤΟΟνΤΑΌΕΌΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 14), 0Ι.Κ\Ά\ΊΎυ0Ρ\Ρ\\ (δΕΟ ΙΌ N0: 15), NδΚδδΤδΡδNΡ^IСС (δΕΟ ΙΌ N0: 16), ΟΕΡ^^ΥΌ^δ^ (δΕΟ ΙΌ N0: 17) и ΤδΗΙΙ)ΗΟΟΙΟΟΙΊ 1ОС (δΕΟ ΙΌ N0: 18). Более того, в некоторых аспектах изобретения полипептид ΗΥΚ1 может включать меньше чем 937, 936, 935, 934, 933, 932,

931, 930, 920, 910, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730,

720, 710, 700, 690, 680, 670, 660, 650, 640, 630, 620, 610, 600, 590, 580, 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510,

500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 320, 310, 300, 290, 280,

270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков в длину и может быть иммуногенным. В некоторых аспектах изобретения нуклеиновые кислоты изобретения не кодируют полипептид ΗΥΚ1 δΕΟ ΙΌ N0: 1 или 2. В других аспектах нуклеиновые кислоты кодируют любую одну из δΕΟ ΙΌ N0: 3-10 или 11-18 отдельно или в сочетании.

Изобретение также предлагает варианты осуществления, в которых нуклеинокислотная последовательность кодирует больше чем одну аминокислотную последовательность в любой одной из δΕΟ ΙΌ N0: 3-10 или δΕΟ ΙΌ N0: 11-18 отдельно или в сочетании. Например, нуклеинокислотная последовательность изобретения может кодировать две аминокислотные последовательности, например δΕΟ ΙΌ N0: 15 в сочетании с δΕΟ ΙΌ N0: 12 или, альтернативно, δΕΟ ΙΌ N0: 11 в сочетании с δΕΟ ΙΌ N0: 17, или, альтернативно, δΕΟ ΙΌ N0: 13 в сочетании с δΕΟ ΙΌ N0: 18. При этом понимается, что нуклеиновые кислоты изобретения могут кодировать две, три, четыре, пять, шесть, семь или все восемь аминокислотных последовательностей, выбираемых из δΕΟ ΙΌ N0: 11-18. При этом также понимается, что кодируемая аминокислотная последовательность необязательно будет непрерывной и может быть связана промежуточными спейсерными последовательностями, которые могут, например, позволять экспрессированному полипептиду представлять желательную аминокислотную последовательность или эпитоп для создания иммунной реакции.

В некоторых аспектах изобретения аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеиновыми кислотами изобретения, включает, по существу, такую же аминокислотную последовательность, которая содержится в любой одной из δΕΟ ΙΌ N0: 3-10 или δΕΟ ΙΌ N0: 11-18. Например, аминокислотная последовательность может иметь по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности с любой одной из δΕΟ ΙΌ N0: 3-10 или 11-18, причем полипептид может быть связан антителом к ΗΥΚ1, раскрытым в настоящем документе. В других аспектах полипептид ΗΥΚ1, экспрессированный нуклеиновыми кислотами изобретения, может быть иммуногенным и способным активировать создание антитела к ΗΥΚ1 или иммуногенную реакцию у пациента.

После введения в разные системы экспрессии белков, известные специалистам в данной области, молекулы нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, подходят для получения полипептида (полипептидов) изобретения. Помимо этого, такие молекулы нуклеиновых кислот или их фрагменты могут быть помечены легко обнаруживаемым заместителем и использованы как гибридизационные пробники для анализа на наличие и/или количество грамотрицательных бактерий, таких как, например, Ас1ие1оЬас1ет Ьаитаппп в пробе. Описанные здесь молекулы нуклеиновых кислот и их фрагменты также подходят для использования в качестве праймеров и/или шаблонов в реакции ПЦР для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды изобретения или описанные здесь белки.

Изобретение также предлагает векторы, содержащие нуклеиновые кислоты изобретения. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны в данной области и включают векторы, способные экспрессировать нуклеиновую кислоту, оперативно связываемую с регуляторной последовательностью или элементом, таким как участок промотера или участок энхансера, который способен регулировать экспрессию нуклеиновой кислоты. Подходящие экспрессирующие векторы включают векторы, которые могут воспроизводиться в эукаритических клетках и/или прокариотических клетках, и векторы, которые остаются эписомными или интегрируются в геном клетки-хозяина.

В других аспектах изобретение дополнительно предлагает выделенное белковое антитело к Асше1оЬас1ет. Белковое антитело к Асше1оЬас1ет распознает по меньшей мере один белок или его фрагмент, который встречается в естественных условиях в Асше1оЬас1ет Ьаитаптт Антитело изобретения к ΗΥΚ1, которое имеет специфическую реактивность с полипептидом ΗΥΚ1, раскрытым в настоящем документе, является одним примером белкового антитела к Асше1оЬас1ет. Как раскрыто в настоящем документе, были выявлены специфические белки Асше1оЬас1ет Ьаитаппп, которые связываются с антителами, выведенными против полипептида ΗΥΚ1, имеющего аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 15. Эти белки Асше1оЬас1ет Ьаитаппи включают белок 1 наружной мембраны Асше1оЬас1ет Ьаитаппп, белок 2 наружной мембраны Асше1оЬас1ет Ьаитаппп, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу Асше1оЬас1ет Ьаитаппи, белок теплового шока Опак Асше1оЬас1ет Ьаитаппи, фактор элонгации О Асше- 4 025831

ЮЬасЮг Ьаитаппй, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю АстеЮЬасЮг Ьаитапηίί, трансмембрана предполагаемого прекурсора липопротеина (Уас1) АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный ОргВ) АстеЮЬасЮг Ьаитаппп, составной белок мембраны ЛйеЛ АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй или белок ΡΐδΖ деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй. Белковое антитело изобретения к АстеЮЬасЮг может быть моноклональным или поликлональным. Изобретение кроме того предлагает клеточные линии, вырабатывающие моноклональные антитела, имеющие специфическую реактивность с фрагментом ΗΥΚ.1, раскрытым в настоящем документе, белком 1 наружной мембраны АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белком 2 наружной мембраны АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белком рецептора с сидерофорной активностью к железу АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белком теплового шока Ипак АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, фактором элонгации С АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, прекурсором белка толерантности к органическому растворителю АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, трансмембраной предполагаемого прекурсора липопротеина (Уас1) АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, предполагаемым чувствительным к глюкозе порином (подобным ОргВ) АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, составным белком мембраны ЛйеЛ АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белком деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй или белком ΡΐδΖ деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй.

В других аспектах изобретение кроме того предлагает способ диагностики инфекции АстеЮЬасЮг у пациента. Эти способы могут включать следующие этапы: (а) получение пробы для проверки от пациента; (Ь) контакт пробы со средством, которое может связывать выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует раскрытый здесь белок АстеЮЬасЮг или раскрытый здесь белок АстеЮЬасЮг в подходящих условиях; и (с) сравнение величины специфического связывания в пробе для проверки с величиной специфического связывания в контрольной пробе, причем повышенная или пониженная величина специфического связывания в пробе для проверки по сравнению с контрольной пробой диагностирует инфекцию АстеЮЬасЮг. Условия, используемые в способах изобретения, понимаются как позволяющие специфическое связывание средства с нуклеиновой кислотой или белком.

Как сказано в настоящем описании, белки АстеЮЬасЮг кодируемые выделенными нуклеиновыми кислотами способа, включают белок 1 наружной мембраны АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок 2 наружной мембраны АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок теплового шока Ипак АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, фактор элонгации С АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, трансмембрана предполагаемого прекурсора липопротеина (Уас1) АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный ОргВ) АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, составной белок мембраны ЛйеЛ АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, или белок ΡΐδΖ деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй.

Средства, которые могут быть использованы в способах изобретения, включают белковое антитело к ЛстеЮЬасЮг которое раскрыто в настоящем документе, или олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют белок 1 наружной мембраны ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок 2 наружной мембраны ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок теплового шока Ипак ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, фактор элонгации С АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, трансмембрану предполагаемого прекурсора липопротеина (Уас1) ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный ОргВ) АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, составной белок мембраны АйеЛ ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок деления клеток ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй или белок ΡΐδΖ деления клеток ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй.

Дополнительно изобретение предлагает олигонуклеотиды, включающие от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белка 2 наружной мембраны ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белка рецептора с сидерофорной активностью к железу АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белка теплового шока Ипак ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, фактора элонгации С ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, прекурсора белка толерантности к органическому растворителю АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, трансмембраны предполагаемого прекурсора липопротеина (Уас1) ЛстеЮЬасЮг Ьаитаппй, предполагаемого чувствительного к глюкозе порина (подобного ОргВ) АсшеЮЬасЮт Ьаитаппй, составного белка мембраны АйеА АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белка деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй или белка ΡΐδΖ деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй. Используемый в настоящем описании термин олигонуклеотид относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая включает по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из контрольной нуклеотидной последовательности и может включать по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20 или по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов и часто включает по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, до 350 смежных нуклеотидов из контрольной нуклеотидной последовательности. Контрольной нуклеотидной последовательностью может быть смысловая цепь или антисмысловая цепь.

Выделенные молекулы нуклеиновых кислот изобретения могут быть использованы для разных диагностических и терапевтических применений. Например, выделенные молекулы нуклеиновых кислот изобретения могут быть использованы в качестве зондов и праймеров. Изобретение таким образом предлагает способы обнаружения нуклеиновой кислоты в пробе. Способы обнаружения нуклеиновой кисло- 5 025831 ты в пробе могут быть или качественными или количественными, по выбору. Например, присутствие, изобилие, целостность или структура нуклеиновой кислоты могут быть определены, по выбору, в зависимости от формата анализа и зонда, используемого для гибридизации или пары праймеров, выбранных для применения.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способ обнаружения молекулы нуклеиновых кислот Лсше1оЪас1ег в пробе, включающий контакт пробы с двумя или больше олигонуклеотидами, включающими от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белка 2 наружной мембраны Лсше1оЪас1ег Ъаитапηττ, белка рецептора с сидерофорной активностью к железу Лсше1оЪас1ег Ъаитапии, белка теплового шока Опак Лсте1оЪас1ег Ъаитапии, фактора элонгации С Лсше1оЪас1ег Ъаитапии, прекурсора белка толерантности к органическому растворителю Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, трансмембраны предполагаемого прекурсора липопротеина (УасТ) Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, предполагаемого чувствительного к глюкозе порина (подобного ОргВ) Лсте1оЪас1ег Ъаитаппи, составного белка мембраны ЛйеЛ Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белка деления клеток Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи или белка ΡΐδΖ деления клеток Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты и обнаружение упомянутой амплификации. В некоторых аспектах изобретения амплификацию выполняют, используя полимеразную цепную реакцию. Так, в некоторых аспектах изобретение предлагает набор для обнаружения присутствия Лсше1оЪас1ег в пробе, включающий по меньшей мере один олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белка 2 наружной мембраны Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белка рецептора с сидерофорной активностью к железу Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белка теплового шока Опак Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, фактора элонгации С Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, прекурсора белка толерантности к органическому растворителю Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, трансмембраны предполагаемого прекурсора липопротеина (УасТ) Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, предполагаемого чувствительного к глюкозе порина (подобного ОргВ) Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, составного белка мембраны Айе А Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белка деления клеток Лсте1оЪас1ег Ъаитаппи или белка ΡΐδΖ деления клеток Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи.

В некоторых вариантах осуществления изобретения также предложен набор для обнаружения присутствия Лсше1оЪас1ег в пробе, включающий выделенное белковое антитело к Лсше1оЪас1ег, которое раскрыто в настоящем документе.

Таким образом, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения предложены диагностические системы в форме набора, которые включают по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или антитело изобретения в подходящей упаковке. Диагностические наборы, содержащие нуклеиновые кислоты, получены из описанных здесь кодирующих нуклеиновых кислот. В одном варианте осуществления, например, диагностические нуклеиновые кислоты получены из любой части нуклеинокислотной последовательности, кодирующей белок 1 наружной мембраны Лсше1оЪас1ег Ъаитаппй, белок 2 наружной мембраны Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белок теплового шока Опак Лсте1оЪас1ег Ъаитаппи, фактор элонгации С Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, трансмембрану предполагаемого прекурсора липопротеина (УасТ) Лсте1оЪас1ег Ъаитаппи, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный ОргВ) Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, составной белок мембраны ЛйеЛ Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, белок деления клеток Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи или белок ΡΐδΖ деления клеток Лсше1оЪас1ег Ъаитаппи, или любой один из олигонуклеотидов изобретения. Диагностические системы изобретения подходят для анализа на присутствие или отсутствие нуклеиновой кислоты в геномной ДНК или мРНК.

Подходящая диагностическая система включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или антитело изобретения и отдельно упакованный химический реагент (реагенты) в количестве, достаточном по меньшей мере для одного анализа. Что касается диагностического набора, содержащего нуклеиновые кислоты изобретения, то он обычно будет включать две или больше нуклеиновые кислоты. Если диагностический набор должен использоваться для ПЦР, то он будет содержать по меньшей мере два олигонуклеотида, которые могут служить как праймеры для ПЦР. Специалисты в данной области могут легко объединить нуклеиновые зонды изобретения и/или праймеры или антитела изобретения в форму набора в сочетании с подходящими буферами и растворами для осуществления на практике описанных здесь способов изобретения. Набор, содержащий антитело, может содержать реакционный коктейль, который обеспечивает надлежащие условия для выполнения анализа, например твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8Л) или другого иммунологического анализа, для определения уровня экспрессии полипептида в пробе, и может содержать контрольные пробы, которые включают известные количества полипептида и, по желанию, второго антитела, специфического для антитела изобретения.

Содержимое набора изобретения, например нуклеиновые кислоты или антитела, помещены в упаковочный материал, предпочтительно создающий стерильную среду без загрязнений. Кроме того, упаковочный материал содержит инструкции о том, как материалы в наборе могут быть использованы для обнаружения присутствия или отсутствия конкретной последовательности или белка или для диагностики присутствия бактериальной инфекции или предрасположенности к состоянию, связанному с бактериаль- 6 025831 ной инфекцией. Инструкции по использованию обычно включают четкое указание, описывающее концентрацию реагента или по меньшей мере один параметр способа выполнения анализа, такой как относительные количества реагента и пробы, которые необходимо смешать, время, в течение которого можно использовать смеси реагента/пробы, температуру, буферные условия и т.д.

Под адъювантом понимается одно или несколько веществ, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В этом контексте адъювант используется для усиления иммунной реакции на один или несколько антигенов или антител вакцины. Адъювант может быть введен пациенту до, вместе или после введения вакцины или антитела. Примеры химических соединений, используемых в качестве адъювантов, включают, но без ограничения, соединения алюминия (например, квасцы, Альгидрогель), масла, блок-полимеры, иммуностимулирующие комплексы, витамины и минералы (например, витамин Е, витамин А, селен и витамин В12), Квил А (сапонины), компоненты клеточных стенок бактерий и грибков (например, липополисахариды, липопротеины и гликопротеины), гормоны, цитокины и совместно стимулирующие факторы. Другие примеры адъювантов включают, например, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, адъюванты с алюминием, МР59, 0321 иммуномодулирующий адъювант, такой как токсин, цитокин и микобактериальный дериват; масляную композицию, полимер, мицеллообразующий адъювант, сапонин, матрицу иммуностимулирующего комплекса (матрица 13СОМ®), частицу, ΌΌΆ (диметилдиоктадециламмоний) бромид, адъюванты ДНК и инкапсулирующий адъювант. Липосомные композиции также, как известно, дают эффекты адъювантов, и поэтому липосомные адъюванты также включены согласно изобретению. Адъюванты могут способствовать поглощению молекул вакцины клетками, представляющими антигены, такими как дендритные клетки, и активировать эти клетки. Способность адъюванта повышать иммунную реакцию проявляется в повышении иммунноопосредованной защиты. Повышение гуморального иммунитета можно определить, например, по увеличению титра антитела, выведенного для антигена. Повышение клеточного иммунитета можно измерить, например, положительным тестом кожи, цитотоксическим анализом Т-клеток, иммуноферментным спотанализом ЕЫ3РОТ на гамма-интерферон или 1Ь-2.

Под антителом понимаются целые антитела, иммуноглобулины или любой их антигенсвязывающий фрагмент или одиночные цепи. Антитела, которые используются в настоящем описании, могут быть антителами млекопитающего (например, человека или мыши), гуманизированными, химерными, рекомбинантными, полученными путем синтеза или выделенными в естественных условиях, и могут быть, например, моноклональными или поликлональными. У большинства млекопитающих, включая человека, целые антитела имеют по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из переменного участка тяжелой цепи (здесь в сокращении ν_Η) и постоянного участка тяжелой цепи. Постоянный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, С_н1, С_н2 и С_н3 и шарнирного участка между С_Н1 и С_н2. Каждая легкая цепь состоит из переменного участка легкой цепи (здесь в сокращении У_ь) и постоянного участка легкой цепи. Постоянный участок легкой цепи состоит из одного домена, Сц. Участки ν_Η и Ун могут быть далее подразделены на участки гипервариабельности, называемые участками определения комплементарности (СИР.), с вкраплениями участков, которые более консервативные и называются каркасными участками (РР). Каждый ν_Η и состоит из трех СЭР и четырех РР, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: РР1, СИР1, РР2, СЭР2. РР3, СИР3, РР4. Переменные участки тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Постоянные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма-хозяина, включая разные клетки иммунной системы (например, клетки эффектора) и первый компонент (С1ц) классической комплементарной системы.

Антитела настоящего изобретения включают все известные формы антител и других белковых каркасов со свойствами, подобными антителам. Например, антитело может быть антителом человека, гуманизированным антителом, биспецифическим антителом, химерным антителом или белковым каркасом со свойствами, подобными антителу, таким как повторы фибронектина или анкирина. Антителом также может быть РаЬ, РаЬ'2, 8еРу, 3М1Р, димерные мини-антитела, нанотела, аптамеры, или доменное антитело. Антитело может иметь любой из следующих изотипов: 1§С (например, 1дС1, 1дС2, 1§03 и 1§04), 1дМ, 1дА (например, 1дА1, 1дА2 и 1дЛ8ее), 1§ϋ или 1дЕ.

Используемый здесь термин фрагмент антитела относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Функция антитела связываться с антигеном может быть выполнена фрагментами антитела полной длины, которые включают, но без ограничения: (ί) фрагмент РаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов У_ь, ν_Η, С_ъ и С_н1; (ίί) фрагмент Р(аЬ')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента РаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) фрагмент Рй, состоящий из доменов ν_Η и С_н1; (ίν) фрагмент Ρν, состоящий из доменов Ун и ν_Η одной ветви антитела, (ν) фрагмент йАЬ, включающий домены ν_Η и У[,; (νί) фрагмент йАЬ (Уард и др. (\Уагй е1 а1.), ИаШге 341:544-546 (1989)), который состоит из домена ν_Η; (νίί) фрагмент йАЬ, который состоит из домена ν_Η или У₂; (νίίί) выделенный участок, определяющий комплементарность (СЭР); и (ίχ) сочетание двух или больше выделенных СЭР, которые могут быть связаны, по выбору, синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена фрагмента Ρν, У_ъ и У_н,

- 7 025831 кодируются разными генами, они могут быть объединены рекомбинантными способами с использованием синтетического линкера, который позволяет сделать их одной белковой цепью, в которой участки У_ъи.У_н спарены, чтобы сформировать одновалентные молекулы (известна как одна цепь Ρν (δοΡν); см., например, Берд и др. (Вий е! а1.), Зс1еисе 242:423-426 (1988) и Хастон и др. (ΗιΐδΙοη е! а1.), Ргос. ЫаЙ. Леай. 3с1 ИЗА 85:5879-5883 (1988)). Эти фрагменты антитела получают, используя способы, известные специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу на пригодность таким же образом, как и интактные антитела. Фрагменты антитела могут быть получены способами рекомбинантной ДНК или ферментным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов.

Под антигеном понимается молекула, с которой антитело может селективно связываться. Антигеном-мишенью может быть белок (например, антигенный пептид), углеводород, нуклеиновая кислота, липид, гаптен или другое природное или синтетическое соединение. Антигеном-мишенью может быть полипептид или пептидный мимик. Антиген также может быть введен животному, чтобы создать иммунную реакцию у животного.

Под носителем в контексте конъюгата понимается доля или частица, например, КЬН, СКМ197, токсоид столбняка, фаг, дрожжи, вирус, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица, которая подходит для соединения с ней или для отображения полипептида, как сказано выше.

Под химерным антителом понимается иммуноглобулин или антитело, переменные участки которого являются производными первого вида и постоянные участки которого являются производными второго вида. Химерные антитела могут быть получены, например, способами генной инженерии из сегментов гена иммуноглобулина, принадлежащих разным видам (например, мыши и человека).

Под химерной вакциной понимается вакцина, которая включает по меньшей мере два разных антигена, соединенных, например, ковалентно. Одним примером химерной вакцины является композиция, которая включает полипептид, отображенный, например, на поверхности частицы, такой как фаг, вирус, дрожжи, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица.

Под конъюгатом понимается соединение, которое включает полипептид изобретения, связанный с другой долей или частицей, например, КЬН, СКМ197, токсоид столбняка, фаг, дрожжи, вирус, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица.

Под консервативной заменой в аминокислотной последовательности понимается замена одной аминокислоты другой в семействе аминокислот, которые родственны по химической природе их боковых цепей.

Генетически кодируемые аминокислоты могут быть разделены на четыре семейства: кислые (аспартат, глутамат); основные (лизин, аргинин, гистидин); неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин). Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда объединяют в группу ароматических аминокислот. Подобным же образом аминокислоты также могут быть разделены на следующие группы: кислые (аспартат, глутамат), основные (лизин, аргинин, гистидин); алифатические (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), притом что серин и треонин, по выбору, могут быть отдельно объединены в группу алифатически-гидроксильных; ароматические (фенилаланин, тирозин, триптофан); амидные (аспарагин, глутамин) и серосодержащие (цистеин, метионин).

Приводит ли изменение в аминокислотной последовательности к функциональному варианту, можно определить путем оценки способности вариантного полипептида функционировать подобно полипептиду дикого типа, используя стандартные способы, такие как описанные в настоящем документе.

Под диагностической композицией понимается композиция, содержащая полипептид, конъюгат, вакцину или антитело изобретения, подготовленная для использования вместе со способом диагностики.

Под эффективным количеством в контексте пассивной иммунизации с использованием фармацевтической композиции, например, включающей антитело, понимается количество фармацевтической композиции, требующееся для пассивной иммунизации клиническим способом. Эффективное количество фармацевтической композиции, используемое для осуществления на практике способов пассивной иммунизации, описанных в настоящем документе, изменяется в зависимости от способа введения, возраста, массы тела и общего здоровья пациента. В конечном счете вопросы подходящего количества и режима дозировки решают врачи, которые выписывают назначения.

Под фланкирующей аминокислотой понимается аминокислота в полипептидной последовательности, которая непосредственно примыкает к Ν- или С-концу конкретной последовательности. Желательно, чтобы фланкирующая аминокислота присутствовала на Ν- и/или С-конце аминокислотной последовательности ЗЕО ГО N0: 1 или 2 или ее фрагмента и, более желательно, чтобы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующих аминокислот присутствовали на Ν- и/или С-конце аминокислотной последовательности ЗЕО ГО N0: 1 или 2 или ее фрагмента.

Под составным белком понимается белок, который включает полипептид изобретения, например фрагмент или вариант НУК1 и сливающийся объект.

Под сливающимся объектом понимается гетерологичная последовательность, которая может быть соединена с полипептидом изобретения, например, фрагментом или вариантом НУК1. Примеры сливающихся объектов описаны в настоящем документе и включают маркеры обнаружения, стабилизирую- 8 025831 щие домены, последовательности, которые способствуют получению или очистке белка, или домены, которые повышают антигенность полипептида.

Под полипептидом ΗΥΚ1 понимается полипептид, который, по существу, идентичен аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 1. Желательно, чтобы полипептид ΗΥΚ1 имел по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или даже 100% идентичности с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 1.

Под фрагментом ΗΥΚ1 или фрагментом полипептида ΗΥΚ1 понимается часть полипептида ΗΥΚ1, содержащая меньше чем 937, 936 или 935 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления фрагменты ΗΥΚ1 по длине имеют 300-350 или 250-500 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления фрагмент имеет меньше чем 937, 936, 935, 934, 933, 932, 931, или 930, 920, 910, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 690, 680, 670, 660, 650,

640, 630, 620, 610, 600, 590, 580, 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430,

420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210,

200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15 или 10 аминокислот и в некоторых случаях является иммуногенным.

Примером фрагмента ΗΥΚ1 является Η\τ1ρ-Ν (8ЕО ГО N0: 2) или его фрагмент. В некоторых случаях фрагменты ΗνιΊρ-Ν имеют в длину от 14 до 20 аминокислот. В общем, фрагменты могут иметь меньше чем, например, 325, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 или 11 аминокислот и, желательно, быть иммуногенными. В некоторых случаях фрагмент ΗνιΊρ-Ν имеет от 14 до 20 аминокислот.

Помимо этого, фрагменты ΗΥΚ1 могут содержать, например, одну или больше консервативных замен аминокислот в последовательности 8ЕО ГО N0: 2. Также желательно, чтобы фрагменты ΗΥΚ1 содержали одну или больше консервативных замен аминокислот в последовательности 8ЕО ГО N0: 2 и/или по меньшей мере одну фланкирующую аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующих аминокислот) на N и/или С-конце последовательности 8ЕО ГО N0: 2. Другие предпочтительные фрагменты ΗΥΚ1 содержат семь или больше непрерывных аминокислотных последовательностей 8ЕО ГО N0: 2.

Неограничивающие примеры фрагмента ΗΥΚ1 включают аминокислоты 1-40, 10-50, 20-60, 30-70, 40-80, 50-90, 60-100, 70-110, 80-120, 90-130, 100-140, 110-150, 120-160, 130-170, 140-180, 150-190, 160200, 170-210, 180-220, 190-230, 200-240, 210-250, 220-260, 230-270, 240-280, 250-290, и 260-300, 270-310, 280-320 и 290-331 аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 2; и эти фрагменты имеют один или больше из следующих признаков: одна или несколько консервативных замен аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 консервативных замен аминокислот) в последовательности 8ЕО ГО N0: 2; одна или несколько аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот), отсеченных от N и/или С-конце последовательности 8ЕО ГО N0: 2, и по меньшей мере одну фланкирующую аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующих аминокислот) на N и/или С-конце последовательности 8ЕО ГО N0: 2.

Под иммуногенным понимается любое вещество, которое способно индуцировать иммунную реакцию у пациента.

Под иммуногенным количеством в контексте вакцины понимается количество вакцины, требующееся для того, чтобы индуцировать иммунную реакцию у пациента клиническим образом. Иммуногенное количество вакцины, используемое при осуществлении на практике описанных в настоящем документе способов вакцинации, изменяется в зависимости от способа введения, возраста, массы тела и общего здоровья пациента. В конечном счете вопросы подходящего количества и режима дозировки решают врачи, которые выписывают назначения.

Используемый здесь термин иммуногенное количество относится к эффективному количеству конкретного полипептида изобретения или его фрагмента, которое может индуцировать иммунную реакцию у пациента против полипептида или инфекционного агента, экспрессирующего полипептид. Это количество обычно составляет от 20 мкг до 10 мг антигена на дозу вакцины и зависит от пациента, способности иммунной системы пациента синтезировать антитела и желательной степени защиты. Точное требуемое количество иммуногена можно вычислить разными способами, такими как, например, титрование антитела. Термин эффективное количество относится к количеству соединения или композиций, которого достаточно для получения желательного результата. Таким образом, при использовании для описания вакцины эффективное количество относится к количеству соединения или композиции (например, антигена), которого достаточно для получения защитной иммунной реакции. Эффективное количество по отношению к иммунологической композиции является количеством, которого достаточно для того, чтобы вызвать иммунную реакцию независимо от того, является ли она защитной.

Выделенное или очищенное понимается как отделенное от других естественно сопровождающих компонентов. Обычно соединение (например, нуклеиновая кислота, полипептид, антитело или небольшая молекула), по существу, выделено, если оно по меньшей мере на 60 мас.% свободно от белков и/или встречающихся в природе органических молекул, с которыми оно естественно связано. Это опре- 9 025831 деление также распространяется, например, на полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, выделенную из ее фланкирующих последовательностей (например, для аминокислотной последовательности выделенная относится к последовательности, которая свободна ото фланкирующих аминокислот, с которыми эта последовательность естественно связана в полипептиде). В некоторых случаях соединение выделено по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99 мас.%. Выделенное соединение, например полипептид, может быть получено стандартными способами, например, экстракцией из натурального источника (например, очищение из клетки, инфицированной Сапб1ба); экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент или вариант ΗΥΚ1 или его составной белок, или химическим синтезом полипептида. Чистота может быть измерена подходящим способом, например колоночной хроматографией, электрофорезом на полиакриламидном геле или анализом ЖХВР. Использование терминов выделенный и/или очищенный в настоящем описании и формуле изобретения как модификаторов ДНК, РНК, полипептидов или белков означает, что соответствующие ДНК, РНК, полипептиды или белки были получены в такой форме человеком и, таким образом, отделены ото их природной клеточной среды ίη νίνο.

Под связанным с или конъюгированным с в контексте конъюгата понимается ковалентное или нековалентное взаимодействие между полипептидом и носителем или сливающимся объектом. Нековалентные взаимодействия включают, но без ограничения, водородную связь, ионные взаимодействия между заряженными группами, электростатическое связывание, ванн-дер-ваальсовы взаимодействия, гидрофобные взаимодействия между неполярными группами, липофобные взаимодействия и притяжения, основанные на ЬодР.

Под моноклональным антителом понимается антитело, полученное из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в малых количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфическими и направленными на один антигенный сайт. Кроме того, в противоположность традиционным препаратам из (поликлональных) антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием любого способа, признанного в данной области и способов, описанных в настоящем документе, таких как, например, гибридомный способ, описанный Колером и др. (КоЫет е! а1.), ЫаШге 256:495 (1975), трансгенного животного (например, Лонберг и др. (ЬопЬетд е! а1.), ИаШте 368(6474):856-859 (1994)), способов рекомбинантной ДНК (например, патент США № 4816567) или с использованием библиотек антител фагов, дрожжей или синтетических каркасов способами, описанными, например, Клаксоном и др. (С1аек§оп е! а1.), ИаШте 352:624-628 (1991) и Марксом и др. (Маткк е! а1.), 1. Мо1. ΒίοΙ. 222:581-597 (1991).

Под молекулой нуклеиновой кислоты понимается молекула, например РНК или ДНК, имеющая последовательность из двух или больше ковалентно связанных, встречающихся в природе или модифицированных нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одно- или двухнитевой и может включать модифицированные или немодифицированные нуклеотиды или их смеси или комбинации. Сюда также включены разные соли, смешанные соли и свободные формы кислоты.

Термин нуклеиновая кислота, также упоминаемый как полинуклеотиды, охватывает рибонуклеиновую кислоту (РНК) или деоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), зонды, олигонуклеотиды и праймеры и может быть одно- или двухнитевой. ДНК может быть комплементарной ДНК (кДНК) или геномной ДНК и может представлять смысловую цепь, антисмысловую цепь или обе. Примерами нуклеиновых кислот являются РНК, кДНК или выделенная геномная ДНК. Такие нуклеиновые кислоты включают, но без ограничения, нуклеиновые кислоты, содержащие, по существу, такие же нуклеотидные последовательности, которые описаны в настоящем документе.

Под пациентом понимается млекопитающее, включая, но без ограничения, человека или другое млекопитающее, такое как корова, лошадь, собака, овца или кошка. Пациент или индивидуум используются здесь взаимозаменяемо и относятся к позвоночному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку. Млекопитающие включают, но без ограничения, мышей, крыс, кроликов, обезьян, коров, овец, свиней, собак, кошек, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних питомцев, лошадей и приматов, в частности людей.

Термины фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически приемлемый наполнитель используются взаимозаменяемо и означают носитель или наполнитель, который физиологически приемлем для пациента при сохранении терапевтических свойств соединения, с которым его вводят. Одним примером вещества фармацевтически приемлемого носителя является физиологический раствор. Другие физиологически приемлемые носители и их составы известны специалистам в данной области и описаны, например, в Фармацевтике Ремингтона (20-е издание), под ред. Э. Геннаро, 2000, Ырршеой, Аййашк & Айкшк, Рййабе1рй1а, РА.

Под фармацевтической композицией понимается композиция, содержащая полипептид, конъюгат, вакцину или антитело изобретения, вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем, которая производится и продается с одобрения государственного регулирующего органа как часть терапевтиче- 10 025831 ского режима для лечения или профилактики заболевания или события у млекопитающего. Фармацевтические композиции могут иметь форму, например, для внутривенного введения (например, стерильный раствор, свободный от закупоривающих частиц и в системе растворителя, подходящей для внутривенного применения), для перорального введения (например, таблетка, капсула, овальная таблетка, желатиновая капсула или сироп) или любую другую форму, описанную в настоящем документе, например форму разовых доз. Изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически приемлемый носитель и соединение, содержащее белковое антитело к Асте1оЪас1ег, которое раскрыто в настоящем документе, или антитело к ΗΥΚ1, имеющее специфическую реактивность с белком ΗΥΚ1 (БЕЦ ГО N0: 1) или его фрагментом, который раскрыт в настоящем документе. Изобретение дополнительно предлагает способ лечения или профилактики инфекций от грамотрицательных бактерий, таких как бактерии рода Асше1оЪас1ег включая, например, ЛетеЮЪаеЮг Ъаитаиий, для нуждающегося в этом пациента. Способы изобретения могут включать введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и соединение, включающее белковое антитело к ЛетеЮЪаеЮг. которое раскрыто в настоящем документе, или антитело к ΗΥΚ.1, имеющее специфическую реактивность с белком ΗΥΚ.1 (БЕЦ ГО N0: 1) или его фрагментом. Изобретение дополнительно предлагает способ лечения или профилактики бактериальной инфекции у нуждающегося в этом пациента путем введения терапевтически эффективного количества композиции вакцины, раскрытой в настоящем документе.

Используемый здесь термин полипептид относится к двум или больше аминокислотам. Такие полипептиды обычно являются непрерывным и неразветвленным пептидом. Пептидом является короткий полимер из мономеров аминокислот. Белки включают один или несколько полипептидов, расположенных биологически функциональным образом. Аминокислоты, включающие полипептиды изобретения, могут быть соединены пептидными или другими связями, например, сложными или простыми эфирами. Аминокислоты, содержащие полипептиды изобретения, могут включать не генетически кодируемые аминокислоты, которые или встречаются в природе, или синтезированы химическим путем. Полипептид изобретения также может включать одну или несколько консервативных замен. Консервативные замены кодируемых аминокислот включают, например, аминокислоты, которые принадлежат к следующим группам: (1) неполярные аминокислоты (С1у, А1а, Уа1, Ьеи и 11е); (2) полярные нейтральные аминокислоты (Сук, МеЕ Бег, ТЬг, Аки и С1и); (3) полярные кислые аминокислоты (Акр и С1и); (4) полярные основные аминокислоты (Бук, Агд и Ηίκ) и (5) ароматические аминокислоты (РЬе, Тгр, Туг и Ηίκ). Другие малые модификации также включены в полипептиды изобретения, если полипептид сохраняет некоторые или все из его функций, которые описаны в настоящем документе.

Полипептиды изобретения могут также включать их производные, аналоги и миметики при условии, что такой полипептид сохраняет некоторые или все его функции, раскрытые в настоящем документе,. Например, производные могут включать химические модификации полипептида, такие как алкилирование, ацилирование, карбамилирование, иодирование или любую модификацию, которая дает производное полипептида. Такие производные молекулы включают, например, те молекулы, у которых свободные аминогруппы были дериватированы, чтобы образовать амингидрохлориды, ртолуолсульфонильные группы, карбобензоксигруппы, ΐ-бутилоксикарбонилгруппы, хлороацетилгруппы или формилгруппы. Свободные карбоксильные группы могут быть дериватированы для образования солей, метиловых и этиловых сложных эфиров или других типов сложных эфиров или гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватированы для образования О-ацильных или Оалкильных производных. Имидазольный азот гистидина может быть дериватирован для образования Νим-бензилгистидина. Также включены в качестве производных или аналогов те пептиды, которые содержат одно или несколько встречающихся в природе производных аминокислот из двадцати стандартных аминокислот, например 4-гидроксипролин, 5-гидроксилизин, 3-метилгистидин, гомосерин, орнитин или карбоксиглутамат, и могут включать аминокислоты, которые не соединены пептидными связями. Полипептиды настоящего изобретения также включают любой полипептид, имеющий одно или несколько добавлений и/или делеций остатков относительно последовательности полипептида, которая показана в настоящем документе, если сохраняется иммуногенная активность, раскрытая в настоящем документе.

Полипептиды изобретения могут быть выделены разными способами, хорошо известными в данной области, такими как рекомбинантные экспрессирующие системы, осаждение, гель-фильтрация, ионный обмен, хроматография с обращенной фазой и аффинная хроматография и т.д. Другие хорошо известные способы описаны у Дойчера и др. ГОеШксЬег е1 а1.), Ошйе ΐο Рго1ет Ршэйсайоп: Мейюйк ίη Еп/уто1оду (Руководство по очищению белков: способы в ферментологии) Уо1. 182, (Асайетю Ргекк, (1990)). Альтернативно, выделенные полипептиды настоящего изобретения могут быть получены путем использования хорошо известных рекомбинантных способов (см., например, Осубель и др. (АикиЪе1 е1 а1.), Иммунология, БЬой Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (Короткие протоколы в молекулярной биологии), ίοΐιη \УПеу & Бопк, 1пс. СЬар1ег 11. Раде 11.1-11.29 (1999); Сэмбрук и Расселл (БатЪгоок апй Кикке11), Мо1еси1аг С1отпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1 (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство), Со1й Брйпд ИагЬог ЬаЪогаФгу (2001)). Способы и условия для биохимической очистки полипептида изобретения могут быть выбраны специалистами в данной области, и очистку можно контролировать, например,

- 11 025831 иммунологическим анализом или функциональным анализом.

Примером средства для приготовления полипептида изобретения является экспрессия нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид изобретения в подходящей клетке-хозяине, такой как бактериальная клетка, клетка дрожжей, клетка амфибии, такая как ооцит, или клетка млекопитающего, с использованием способов, хорошо известных в данной области, и извлечение экспрессированного полипептида снова с использованием хорошо известных способов очистки, описанных в настоящем документе. Полипептиды изобретения могут быть выделены непосредственно из клеток, которые были трансформированы экспрессирующими векторами, как сказано в настоящем документе. Полипептиды изобретения также могут быть получены путем химического синтеза. Способы химического синтеза полипептидов хорошо известны в данной области и коммерчески доступны.

Рекомбинантно экспрессированные полипептиды изобретения также могут быть экспрессированы как составные белки с подходящими сливающимися объектами. Подходящим сливающимся объектом может быть аминокислотная последовательность, которая обычно не соединена с аминокислотной последовательностью, такой как гетерологичная последовательность, которая выполняет конкретную функцию или придает дополнительную характеристику полипептидам изобретения. Неограничивающие примеры подходящих гетерологичных последовательностей включают обнаруживаемый маркер, стабилизирующий домен, белок-носитель для создания антитела, линкерную последовательность и последовательность, которая способствует очистке полипептида. Последовательности, которые могут способствовать очистке полипептидов изобретения включают аффинные метки, такие как глутатион-§-трансфераза (С8Т) или поли-Ηίδ. Таким образом, в некоторых аспектах изобретение предлагает составной белок, имеющий полипептид, который раскрыт в настоящем документе, объединенный с гетерологичной последовательностью, белком-носителем, аффинной меткой или линкерной последовательностью.

Настоящее изобретение также предлагает композиции, содержащие приемлемый носитель и любой из выделенных полипептидов, раскрытых в настоящем документе, отдельно или в сочетании друг с другом. Эти полипептиды могут быть получены рекомбинантными способами, синтезированы химически или очищены от природных источников. Используемый здесь термин фармацевтически приемлемый носитель охватывает любые из стандартных фармацевтических носителей, известных в данной области, такие как фосфатный буферный раствор, вода и эмульсии, такие как масляная и водная эмульсия, и разные типы смачивающих агентов.

Изобретение также предлагает способ экспрессии полипептида, раскрытого в настоящем документе, путем культивирования клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид в условиях, подходящих для экспрессии полипептида. Таким образом, предложен способ рекомбинантного получения полипептида изобретения путем экспрессии нуклеинокислотных последовательностей, кодирующих полипептид в подходящих клетках-хозяевах. Системы экспрессии рекомбинантной ДНК, которые подходят для получения полипептидов, описаны в настоящем документе и хорошо известны в данной области (см. Осубель и др., выше, 1999). Например, вышеописанные нуклеотидные последовательности могут быть введены в векторы для дальнейшего манипулирования. Векторы могут включать плазмид или вирус рекомбинантной ДНК или РНК, содержащий дискретные элементы, которые используются для введения гетерологичной ДНК в клетки для экспрессии или репликации.

Под выражением специфически связывается понимается предпочтительная связь связывающей доли (например, антитело, фрагмент антитела, рецептор, лиганд или небольшая доля молекулы агента, описанного в настоящем документе) с молекулой-мишенью (например, полипептид или конъюгат, включающий его) или с клеткой или тканью, имеющей эту молекулу-мишень (например, антиген клеточной поверхности, такой как рецептор или лиганд), а не с молекулами, клетками или тканями, не имеющими этой молекулы-мишени. Признано, что определенная степень неспецифического взаимодействия может происходить между связывающей долей и молекулой, не являющейся мишенью (присутствует отдельно или в сочетании с клеткой или тканью). Тем не менее специфическое связывание можно отличить как опосредованное через специфическое распознавание молекулы-мишени. Специфическое связывание приводит к более короткой связи между связывающейся долей (например, антитело) и молекулоймишенью (например, полипептид или включающий его конъюгат) чем между связывающейся долей и, например, молекулами, не являющимися мишенями, или другими композициями без молекулы-мишени. Специфическое связывание обычно приводит более чем к двукратному, предпочтительно более чем пятикратному, более предпочтительно более чем десятикратному и наиболее предпочтительно более чем стократному увеличению количества связанной связывающейся доли (в единицу времени) например, клетки или ткани, имеющей молекулу-мишень или маркер, по сравнению с клеткой или тканью без такой молекулы-мишени или маркера. Связывающиеся доли связываются с молекулой-мишенью или маркером с константой диссоциации, например, меньше чем 10^-6М меньше чем 10^-7М, 10^-8М, 10^-9М, 10^-10М, 10^-11М или 10^-12М, или даже меньше чем 10^-13М, 10^-14М или 10^-15М. Специфическое связывание с белком в таких условиях требует связывающейся доли, которую выбирают по ее специфичности для этого конкретного белка. Разные форматы анализа подходят для выбора связывающихся долей (например, антител), способных специфически связываться с конкретной клеткой-мишенью. Например, твердофазный иммунологический анализ ЕЫ§Л обычно используют для выбора моноклональных антител, специфически имму- 12 025831 нореактивных с белком. Смотрите: Хэрлоу и Лейн (Нат1оте & Ьаие), Антитела, Лабораторное руководство, Со1б 8ρτίη§ НатЬот РиЬйеайоик, Ые\у Уогк (1988), в части описания форматов иммунологических анализов и условий, которые могут быть использованы для определения специфической иммунореактивности.

Под по существу, идентичной понимается аминокислотная последовательность или нуклеинокислотная последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность с контрольной последовательностью. Такая последовательность обычно идентична по меньшей мере, например, на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% на уровне аминокислоты или уровне нуклеиновой кислоты с контрольной последовательностью. В общем, для полипептидов длина последовательностей сравнения может составлять по меньшей мере пять аминокислот, например, 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 или больше аминокислот, до полной длины полипептида. Для нуклеиновых кислот длина последовательностей сравнения обычно может составлять по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или больше нуклеотидов, до полной длины молекулы нуклеиновой кислоты. При этом понимается, что для целей определения идентичности последовательности при сравнении последовательности ДНК с последовательностью РНК нуклеотид тимин эквивалентен нуклеотиду урацилу.

Как используется в настоящем документе, когда полипептид или нуклеинокислотная последовательность упоминается как имеющая по меньшей мере Х% идентичности последовательности с контрольной последовательностью, это означает, что по меньшей мере X процентов аминокислот или нуклеотидов в полипептиде или нуклеиновой кислоте идентичны таковым в контрольной последовательности, когда последовательности оптимально выровнены. Оптимальное выравнивание последовательностей можно определить разными путями, которые известны специалисту в данной области, например, с использованием алгоритма выравнивания Смита-Уотермана (Смит и др. (8ιηίΐΗ е! а1.), 1. Мо1. Вю1. 147:195-7, 1981) и алгоритма ВБА8Т (программа нахождения участков локального сходства между последовательностями; Альтшуль и др. (А11зс1ш1 е! а1.), 1. Мо1. Вю1. 215: 403-10, 1990). Эти и другие алгоритмы выравнивания доступны через общедоступное программное обеспечение для компьютера, такое как Вез! Ρίΐ (Смит и Уотерман (8тйк апб \Уа1егтаи). Абуаисез ίη АррБеб МаГОетабсз (Достижения прикладной математики), 482-489, 1981), которое включено в программу ОеиеМа!скет Р1изТМ (Шварц и Дейхоф (8ск\уаг/ апб Иауко1), А!1аз о! Рто!еш 8ецпепсе апб 8!гис!иге (Атлас белковых последовательностей и структур), ИаукоГГ, М.О., Еб рр 353-358, 1979), ВЬА8Т, ВЬА8Т-2, ВЬА8Т-Р, ВЬА8Т-Ы, ВЬА8Т-Х, ^и-ВЬА8Т-2, АиСЫ, ΛΕΙΟΝ-Σ, СЕИ8ТАЕ или МедаПдп (ИЫА8ТАК). Помимо этого, специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения оптимального выравнивания по длине сравниваемых последовательностей.

Молекула-мишень или клетка-мишень означает молекулу (например, полипептида, эпитопа, антигена, рецептора или лиганда) или клетку, с которой может специфически связываться связывающаяся доля (например, антитело). В некоторых случаях молекулы-мишени открыты снаружи клетки-мишени (например, на клеточной поверхности или секретированном белке), но молекулы-мишени могут альтернативно или также присутствовать внутри клетки-мишени.

Терапевтически эффективное количество будет изменяться в зависимости от используемых композиций белков, полипептидов или антител, заболевания и его тяжести, возраста, веса и т.д. пациента, причем все это входит в знания лечащего врача. Предусматривается, что терапевтически эффективное количество одной или нескольких описанных здесь композиций белков, полипептидов или антител будет изменять патогенность грамотрицательных бактерий. Терапевтически эффективное количество отличается от количества, имеющего биологический эффект. Композиции белков, полипептидов или антител настоящего изобретения могут иметь один или больше биологических эффектов ίη νίΙΐΌ или даже ίη У1уо, например снижение функции белка или полипептида, экспрессированного грамотрицательными бактериями. Биологический эффект, однако, может не приводить к какому-либо клинически измеримому терапевтическому эффекту, который описан в настоящем документе и который может быть определен способами, известными лечащему врачу.

Под лечением понимается медицинский уход за пациентом с намерением излечить, уменьшить, стабилизировать снизить вероятность или предотвратить заболевание, патологическое состояние, нарушение или событие путем введения фармацевтической композиции. Этот термин включает активное лечение, то есть лечение, специфически направленное на улучшение, или связанное с излечением заболевания, патологического состояния, нарушения или события, а также включает этиотропную терапию, то есть лечение, направленное на устранение причины соответствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или события. Кроме того, этот термин включает паллиативное лечение, то есть лечение, предназначенное для снижения симптомов, а не на излечение заболевания, патологического состояния, нарушения или события; симптоматическое лечение, то есть лечение, направленное на системные симптомы соответствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или события; профилактическое лечение, то есть лечение, направленное на минимизацию или частичное или полное ингибирование развития соответствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или

- 13 025831 события, например, у пациента, который еще не болен, но который восприимчив или имеет иной риск к конкретному заболеванию, патологическому состоянию, нарушению или событию; и поддерживающую терапию, то есть лечение, применяемое для дополнения другой специфической терапии, направленной на улучшение соответствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или события.

Под вакциной, как она здесь используется, понимается композиция, которая вызывает иммунную реакцию у пациента, которому она введена.

Под термином вакцинировать, как он здесь используется, понимается лечение пациента путем введения вакцины, например для предотвращения или уменьшения симптомов заболевания, патологического состояния, нарушения или события.

Под вариантом в контексте полипептида или его части, как здесь описано, или молекулы нуклеиновой кислоты, их кодирующей, понимается включение замен или изменений в аминокислотную последовательность или нуклеинокислотную последовательность, что приводит, например, к, по существу, идентичной последовательности. Полипептид, имеющий вариантную последовательность, может сохранять по меньшей мере одну биологическую активность оригинального полипептида, например, иммуногенную активность. Термин вариант включает, например, инсерционные производные аминокислот, такие как амино- и/или карбоксиконцевые гибриды, а также вставки одной или нескольких аминокислот в последовательности. Инсерционные аминокислотные варианты - это те, в которых один или несколько аминокислотных остатков введены в определенный сайт в белке. Случайная вставка также возможна при подходящем скрининге полученного продукта. Делеционные варианты характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности. Варианты аминокислот с заменами - это те, в которых по меньшей мере один остаток вставлен на его место. Если необходимо получить производное белка путем замены аминокислоты, аминокислоты обычно заменяют консервативными заменами, например, другими аминокислотами, имеющими сходные физико-химические свойства, такие как гидрофобность, гидрофильность, электроотрицательность, объемные боковые цепи и т.д.

Для целей настоящего изобретения варианты также включают одиночные или множественные замены, делеции и/или добавления любого компонента (или компонентов), естественно или искусственно связанного с частью встречающегося в природе белка, из которого может быть получен полипептид, такого как углеводород, липид и/или другие белковые доли. Все такие молекулы охватываются термином вариант.

Под вариантной последовательностью понимается аминокислотная или нуклеинокислотная последовательность варианта, согласно приведенному определению.

Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из последующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А-1В - улучшенное выживание и сниженная грибковая нагрузка после введения вакцины гНуг1р-Ы мышам с инфекцией СапЛБа а1Ысап8. (А) Выживание вакцинированных или контрольных мышей (п = 15 в одной группе), инфицированных внутривенно СапЛБа а1Ысап8 штамм 15563, клинический изолят (9х10⁵ на дозу), *, Р < 0,001 по сравнению только с квасцами по критерию Мантела-Кокса. (В) Грибковая нагрузка на почки мышей (п=10 в подгруппе), вакцинированных 30 мкг гНуг1р-Ы + квасцы или только квасцами, измеренная через 3 суток после инфицирования С. а1Ысап8 15663 (7х10⁵ на дозу). Данные представлены как средний ± межквартильный размах. *, Р < 0,001 по сравнению с результатами, полученными из почек, взятых у мышей, вакцинированных только квасцами по И-критерию МаннаУитни;

фиг. 2А-2С - показаны репрезентативные гистопатологические срезы с почек. (А) Контрольные мыши, инфицированные С. а1Ысап8, имели множественные абсцессы по большей части с дрожжевой форме с гифами и псевдогифами в почках. (В) гНуг1р-Ы-вакцинированные мыши (30 мкг), инфицированные С. а1Ысап8, имели меньше абсцессов с намного меньшими видимыми количествами грибков. (С) Полуколичественная оценка тяжести инфекции показала значительный абсцесс и уменьшение числа клеток СапБМа у вакцинированных мышей по сравнению с контрольными мышами. Срезы были окрашены ΡΑδ. Тридцать произвольных полей были изучены слепым оценщиком (ОЬ), чтобы оценить число поражений на одно поле. Число организмов в одном поражении оценили в 120 поражениях у контрольных, невакцинированных мышей. Среднее число организмов в одном поражении определяли путем деления общего числа грибковых клеток на число подсчитанных поражений;

фиг. 3А-3С - вакцина гНуг1р-Ы продлила выживание и уменьшила грибковую нагрузку у нейтропенических мышей, инфицированных С. а1Ысапх Мыши Ва1Б/с (п=20 на группу) были вакцинированы гНуг1р-Ы, смешанной с квасцами, или только квасцами, обработаны циклофосфамидом, затем инфицированы С. а1Бюап§ 15563 в количестве 1 х 10⁵ бластоспор. За двое суток до обработки циклофосфамидом, половину мышей обескровили и индивидуально пометили для титрования антител, используя ИФА (А) и выживание (В). Другую половину мышей использовали для грибковой нагрузки (С). *р<0,05 для вакцинированных против контрольных по критерию Мантела-Кокса;

фиг. 4Α-4Ό - зависящая от дозы пассивная иммунизация !§О к Нуг1р для защиты от мышиного,

- 14 025831 распространяющегося в крови кандидоза. Мышам ввели внутрибрюшинно 0,3 мг (А), 1 мг (В) и 3 мг (С) 1дС к Нуг1р за 2 ч до инфицирования 6,2х10⁵ бластоспорами СапШба а1Ысап5 15563 через хвостовую вену. Выживание мышей (п= 10 в одной группе) контролировали два раза в сутки. *Р = 0,001 по критерию Мантела-Кокса против мышей, получивших контрольный 1дС. соответствующий изотипу. (Ό) Влияние вакцинированного или контрольного Е(аЬ')₂ на блокирование НЬ-60-производного нейтрофила, убивающего С. а1Ьюап8. В этом анализе использовали сверхэкспрессию С. а1Ысап§ или подавление Нуг1р, чтобы продемонстрировать специфичность фрагментов Е(аЬ')₂ для Нуг1р. Контрольный обозначает анализ, выполненный в отсутствие Е(аЬ')₂ или в присутствии Е(аЬ')₂ из 1§О, совпадающего с изотипом. Данные показаны как средний ± интерквартильный размах. * Р = 0,001 по критерию Манна-Уитни;

фиг. 5А-5В - защита от распространяющегося в крови кандидоза с использованием очищенного смешанного 1§О, специфического для Нуг1р. А) Косвенная иммунофлуоресценция с 1§О кролика, специфического для Нуг1р, продемонстрировала поверхностную экспрессию Нуг1р на гифе С. а1Ьюап8 и успешную абсорбцию антитела к Нуг1р. В) Выживание мышей, обработанных 1 мг: 1) смешанных 1§С к Нуг1 (п=20); 2) смешанного 1§О к Нуг1р, абсорбированного гифой С. а1Ысап§ (п=10); или 3) контрольный 1дС кролика (п=20) за два часа до инфицирования 8,7х10⁵ бластоспорами С. а1Ысап§ 15563 через хвостовую вену. Дозу антитела повторили через 3 суток после инфицирования. *р=0,002 против абсорбированного 1§О и 0,03 против контрольного 1§О, **р=0,28 против абсорбированного 1§О по критерию МантелаКокса;

фиг. 6 - вакцина гНуг1р-Ы снижает грибковую нагрузку в тканях у мышей ВАЬВ/с, инфицированных СапШба, не относящейся к виду а1Ысап§. Мышей ВАЬВ/с (п = 10 в группе) вакцинировали квасцами или квасцами плюс гНуг1р-Ы (30 мкг) и через три недели ввели бустер-дозу. Через две недели после бустер-дозы мышам через хвостовую вену ввели С. д1аЬга!а (3,2х10⁷), С. кги8е1 (3,4х10⁷), С. рагар8Йо818 (9,6х 10⁶) или С. 1горюаЙ8 (3,2х10⁶). Грибковую нагрузку на почки определяли на третьи сутки после инфицирования. Ось у показывает нижний предел обнаружения при анализе. *Р < 0,001 против контрольного адъюванта по И-критерию Манна-Уитни;

на фиг. 7 показана активная иммунизация с использованием гНУК1р-Ы (8ЕЦ ГО N0: 2) для защиты диабетических мышей от бактериемии Асте1оЬас1ег Ьаитаппй. Мышей иммунизировали только гидроксидом алюминия (п=10) или гНУЫр-Ν (30 мг) в смеси с гидроксидом алюминия (п=9) в день 0, ввели бустер-дозу в день 21 и инфицировали Асше1оЬас1ег Ьаитаппй в день 35. *Р<0,005 против контрольных;

на фиг. 8 показано влияние активной вакцинации гНУЫр-Ν (8ЕЦ ГО N0: 2) на бактериальную нагрузку в почечной, легочной и селезеночной ткани. Контрольные мыши были иммунизированы только гидроксидом алюминия, тогда как вакцинированные мыши были иммунизированы гНУЫр-Ν (30 мг), смешанным с гидроксидом алюминия в день 0, бустер-дозой в день 21 и инфицированы АсшеЮЬасЮг Ьаитаппи в день 35;

на фиг. 9 - пассивная иммунизация для защиты диабетических мышей от бактериемии Асше1оЬас1ег Ьаитаппй. Мышей обработали 1 мг контрольного 1§О кролика (п=18) в качестве контрольных. Экспериментальных мышей обработали смешанным поликлональным 1§О к гНУК1р (п=20) за два часа до инфицирования А. Ьаитаппй. Каждое из поликлональных антител к гНУК1р, составивших пул, было предназначено против одного из синтетических антигенных полипептидов, включая полипептид из 8ЕЦ ГО N0: 11-18. *Р<0,005 против контрольного 1§О;

на фиг. 10 - пассивная иммунизация для защиты диабетических мышей от бактериемии Асше1оЬас1ег Ьаитаппй. Мышей обработали 1 мг контрольного 1§О кролика (п=18) или поликлональным 1§О к НУК1р, полученным индивидуально против одного из восьми разных синтетических пептидов НУК1, за 2 ч до инфицирования А. Ьаитаппй. № 1 был выведен против ^ΡδΑΡΕδΕδΌΕΝΤΡ (8ЕЦ ΙΌ N0: 11). № 2 был выведен против ССУРЭНЕРЕЕУУРЭТ (8ЕЦ ГО N0: 12). № 3 был выведен против СОУО8КЕЕК1У№Ке (8ЕЦ ΙΌ N0: 13). № 4 был выведен против СК1КОТОСУТАПЕЭТ (5ЕО ГО N0: 14). № 5 был выведен против СЕКУАУТУЭСРУРУУ (8ЕЦ ГО N0: 15). № 6 был выведен против У8К88Т8Е8УЕЭ1СС (5ЕО ГО N0: 16). № 7 был выведен против СЕРТ1 Ι\ΕΥΕΙΗ)δΚδδ (РЕО ΙΌ N0: 17). № 8 был выведен против ТЗРГОРССЮСЕНСС (8ЕЦ ГО N0: 18). Сочетание 1 (СотЬ1) включает антитела № 2, 3, 5 и 8. Сочетание 2 (СотЬ2) включает антитела № 2, 5 и 8;

на фиг. 11 - пример двухмерного анализа на геле и вестерн-блоттинга экстрактов клеточной поверхности Асше1оЬас1ег. Ι§0 кролика, выведенный против СЕКУАУТУЭСРУРУУ (8ЕЦ ГО N0: 15), использовали для зондирования верхнего блота, тогда как неиммунную сыворотку использовали в качестве контроля для зондирования нижнего блота.

Подробное описание изобретения

СапШба а1Ьюап8 является широко распространенным патогеном для человека. Например, С. а1Ь1сап8, хотя обычно и безвредный симбионт, может вызывать разные состояния от поверхностной слизисто-кожной инфекции, такой как вагинальный и/или орофарингеальный кандидоз, до глубокого проникновения в орган рассеянного кандидоза. Перед тем как вызвать заболевание, грибок колонизирует желудочно-кишечный тракт и, в некоторых случаях, кожу и слизистые оболочки. Адгезия к слизистым поверхностям организма-хозяина является одним из главных условий на этом начальном этапе. После

- 15 025831 колонизации С. а1Ысап8 проходит в поток крови через инфицированные внутрисосудистые устройства или путем трансмиграции через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, состояние которой ухудшено химиотерапией или язвами, вызванными стрессом. Затем организмы распространяются через поток крови, связываются с сосудистым эндотелием и проникают в него, чтобы выйти из дерева сосудов и поразить глубокие органы, такие как печень, селезенка и почки.

Идентификация фрагментов ΗΥΚ1 и других описанных здесь композиций позволяет, например, эффективно лечить и вакцинировать против не только кандидоза, но и инфекцию Асше1оЪас1ег.

Изобретение предлагает полипептиды, например производные ΗΥΚ1 или Ηνιΐρ-Ν. конъюгаты, вакцины, антитела, композиции, способы вакцинации с их использованием и способы их получения, о чем более подробно сказано ниже.

Полипептиды.

Изобретение предлагает полипептиды, например, выделенные полипептиды, производные от ΗΥΚ1, например, Нуг1р (ЗЕО ГО N0: 1) или Ηγιΐρ-Ν (ЗЕО ГО N0: 2), например, включающие аминокислотную последовательность любой одной из ЗЕО ГО N0: 3-10, или ее вариантную последовательность, имеющую нуль, одну, две или три замены, делеции или добавления к аминокислотной последовательности любой одной из ЗЕО ГО N0: 3-10, при этом полипептид не включает больше 20 заменимых аминокислот ЗЕО ГО N0: 2.

ЗЕО ГО N0:1 является аминокислотной последовательностью С. а1Ысап8 Нуг1р (ЗЕО ГО N0: 1). МКУУЗН ΡI РГ IЪЪТЬЫЬЗААЬЕνντ 3ΕΙГЖСС ЮСРНСОТКУН ЗОАТИАХЬСТТЬС3 ГРС СЬЕУЕКеАЗЬГ1КЗОКСРУЪАЬЫ7АЬЗТЬУКРУ1МНСУ13ЦЦЗКЗЗТЗГБЫГП1ССЗЗГТ ИМСЕ1УЬАЗЗСШКЗТАУЬУАЕЕ№ТНЫСЫУАУ2К<ЗКААСМ1АГСТАУ0Т1Т1®ТС(Э1СЬК НООГУРАТКХКСТССУТАОЕОТЙИКЪСЫТГЬЗУЕРТНЫЕУЬКОЗКЗЗЫУНАУЗЗНОТГТ УНСГеЫбККЬОЪТЬРЬТбЫКОНГНРЕУУРОТСГЬЗЬКАААЬРОУРКГСКеУРЗКЬГИУЫ ЗКСЪКМАУТУОСРУРККЕГРАУСЫРСТМСРЗАРЕЗЕЗОЬЫТРТТЗЗГЕТЗЗУЗЗААТЕЗ ЗУУ5Е558АУО51/ГЗЗЗЬ53КЗЕ38ОУУ83ТТМ1Е338ТА1ЕТТМИЗЕ53Т0А6333130 3Ε383ΤΑΙΤ383ΕΤ335Ε5Μ5Α33ΤΤΑ3ΝΤ3ΙΕΤΟ3(3ΐν303Ε333ΝΑΣ35ΤΕ03ΙΤ33Ρ С05Т1У™ЗТУТ?5Т1Т5СПЕМКСТЕОУУТ1РГТУРС5ТОСУРТТС01РМ5ТЗУТ0КТУТ5 ΤΙΤΝΟΟΕν3Ο3ΟθννΤΥΤΤΝνΡΗΤΤνθΑΤΤΤΤΤΤ3Τσ0ΟΝ3Τ6ΟΝΕ563ΝΗΟΡ6Ν63ΤΕ<3 ЗСЫСЗСАСЗМЕСЗОЗСРЫЫСЗСЗСЗЕССЗШСЗСЗОЗСЗКИСЗСЗСЗШСЗСЗСЗТЕеЗЕ 665σ3ΝΕΟ303Ο3Ο3<2Ρ0ΡΝΕΟ5ΕΰΟ8<55ΝΕ63ΝΗΟ5ΝΕ636363Ο5Ο3ΝΝ6363Ο3<35Ο ЗОЗеЗОЗСЗЕЗеЗЦЗбЗМЕСЗМРСАСЫСЗЫЕСЗеОСЗСМОЗЕАбЗСОеЗСРЫЫСЗСЗСНЫ ΕΚ55Ο3Ε3Νι2Ο3ΝΡΟΑΟ5σ3Ο3Ε3Ο3ΝΑΟ3Η363ΝΕΟΑΚΤ03ΙΕΟΓΗΤΕ5ΚΡΟΕΝΓ&ΑΗΤΟ ΑΤνΤ6Ν3νΑΝΡνΤΤ3ΤΕ3ΟΤΤΙ5ντν3ΙΤ3ΥΜΤ0ΈΌ0ΚΡΚΡΓΤΤν0νΐΡνΡΗ3ΜΡ3ΝΤΤ0 ЗЗЗЗУРТЮТЫЕЫС331УТССК31ЬРСЫ¥ЗМУУЬГМ (ЗЕО Ю N0:1)

ЗЕО ГО N0:2 является аминокислотной последовательностью рекомбинантного ^концевого домена Нуг1р (гНуг1р-Н ЗЕО ГО N0: 2).

1	Τ5Η.ΙΌΕ&3Ι0 СГНСОУКУНЗ
21	САТИА1ЕСТТ ЬСЗГГСеЬЕУ
41	ЕКСАЗЬПКЗ ЬМСРУЬАЬКУ
61	АЬЗТЬУРРУ1 ΝΝ0νΐ3ΣΝ5Κ
81	38Τ3Γ3ΝΡϋΙ ССЗЗРТЫЫСЕ
101	1УЬА53СЬУК ЗТАУЬУАР.ЕИ
121	ΤΝΝΰΣίνΑΥΟ ΝΟΚΑΑΰΝΙΑΕ
141	ΟΤΑΥΟΤΙΤΝΝ СОЮЬКНООГ
161	νΡΑΤΚΙΚΟΤΟ ΟνΤΑΌΕΌΤΪίΙ
181	кьсыньзуе ртниеуькоз
201	КЗЗЫУНАУЗ ЗВДТГТУЕСГ
221	СМСНКЬСЬТЬ РЬТСЫКОНГР.
241	ΓΕΥΥΡΌΤσίΙ, ОЬКАААЬРОУ
261	екюксуьзк ьгк1Уызкбъ
281	ΚΝΑνΤΥϋΟΡν РЫЫЕ1РАУСЬ
301	ΙΡ0ΤΝ0Ρ3ΑΡ ЕЗЕЗОЬЫТРТ
321	Τ33ΙΕΤ (ЗЕО 10 N0:2)

ЗЕО ГО N0: 3-10 являются 14-мер фрагменты аминокислотной последовательности Нуг1р^ (ЗЕО ГО N0: 2), как показано в табл. 1.

Таблица 1. Примеры фрагментов Нуг1р^

5Е0ГО Νο.	Последовательность
3	ΟΡδΑΡΕδΕδϋΕΝΤΡ

- 16 025831

4	ΟΝΚΌΗΡΚΡΕΥΥΡϋΤ
5	ΟΥΟδΚΕΡΚΓνΝδΚΟ
6	ΚΙΚΟΤΟΓνΤΑΟΕϋΤ
7	ίΚΝΑνΤϊΌΟΡνΡΝΝ
8	ΝδΚδδΤδΡδΝΡϋΙΟ
9	ΕΡΤΗΝΡΥΣΚϋδΚδδ
10	τδκωκοοκκίΡΗΟ

Полипептиды из табл. 1 или другие полипептиды, описанные в настоящем документе, могут иметь вариантную или иначе модифицированную аминокислотную последовательность. Например, в вариантных полипептидах из табл. 1, каждая замена, делеция или добавление, если таковые имеются, могут быть сделаны, например, в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, или на Ν- или С-конце полипептида.

В некоторых случаях полипептид включает 14 и 20 аминокислот, например 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот. В других случаях полипептид короче чем 14 аминокислот, например 11, 12 или 13 аминокислот. Полипептид может быть длиннее чем 20 аминокислот при условии, что он не включает больше 20 заменимых аминокислот из 8ЕО ГО N0: 2.

В некоторых случаях модификация полипептида, который описан в настоящем документе, незначительно снижает биологическую активность, например иммуногенную активность, полипептида. Модифицированный полипептид может иметь или оптимизировать характеристику полипептида, такую как стабильность ίη νίνο, биодоступность, токсичность, иммунологическую активность, иммунологическую идентичность или свойства конъюнкции.

Модификации включают модификации естественными процессами, такие как посттрансляционная обработка, или химическими способами модификации, известными в данной области. Модификации могут происходить в любом месте полипептида, включая полипептидный остов, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксиконец. Тот же тип модификации может присутствовать в такой же или изменяющейся степени в нескольких местах данного полипептида, и полипептид может содержать модификации больше чем одного типа.

Вариантный или иначе модифицированный полипептид может также включать одну или больше вставок, делеций или замен аминокислот как консервативных, так и неконсервативных (например, Όаминокислоты, дезаминокислоты) в полипептидной последовательности. Например, добавление одного или нескольких цистеиновых остатков к амино- или карбоксиконцу любого полипептида изобретения может способствовать конъюнкции этих полипептидов. Примеры полипептидов, имеющих Ν- или Сконцевой цистеин, включают, например, полипептиды 8Е0 ГО N0: 11-18, например которые приведены в табл. 2 и описаны в примере 1.

Таблица 2. Пептиды к Нуг1

№ пептида	5Ε<2ΙΟ №	Последовательность	ΜΜ (кДа)	ρΐ	Чистота (%>
ί	11	€ΟΡ5ΑΡΕ£Ε5ΡΕΝΤΡ	1,5	3,44	86,1
2	12	ΕΟΝΚΟΗΕΚΕΕΥΥΡΟΤ	1,9	5,69	99,4
3	13	εοΥϋδΚΗΚινΝδκο	1,7	9,16	95,7
4	14	СИКОТССУТАОЕОТ	1,5	4,70	86,4
5	15	ΕίΚΝΑνΤΥϋΟΡνΡΝΝ	1,6	6,25	94,1
6	16	ΝδκδδτδΡδΝΡοιοε	1,6	6,25	91,4
7	17	ΓΕΡΤΗΝΡΎΙ.ΚΟδΚδδ	1,8	7,19	85,8
8	18	Т5КЮЕСС10СРНСС	1,6	8,27	91,8

Замены аминокислот могут быть консервативными (т.е. когда остаток заменяют другим того же общего типа или группы) или неконсервативным (т.е. когда остаток заменяют аминокислотой другого типа). Помимо этого, не встречающаяся в природе аминокислота может быть заменена на встречающуюся в природе аминокислоту (т.е. консервативная замена не встречающейся в природе аминокислоты или неконсервативная замена не встречающейся в природе аминокислоты).

Полипептиды, полученные путем синтеза, например с использованием способов, известных в данной области, могут включать замены аминокислот, не кодируемых ДНК в естественных условиях (например, не встречающейся в природе или ненатуральной аминокислоты). Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают Ό-аминокислоты, аминокислоту, имеющую ацетиламинометиловую группу, прикрепленную к атому серы в цистеине, пегилированную аминокислоту, омега-аминокислоты формулы ΝΗ₂(ΟΗ₂)_ηΟ00Η, где η = 2-6, нейтральные неполярные аминокислоты, такие как саркозин, ΐбутилаланин, ΐ-бутилглицин, Ν-метилизолейцин и норлейцин. Фелинглицином можно заменить Тгр, Туг или РЬе; цитруллин и метионинсульфоксид являются нейтральными неполярными, цистеиновая кислота является кислой, и орнитрин является основным. Пролин можно заменить гидроксипролином и сохра- 17 025831 нить свойства, придающие конформацию.

Варианты могут быть созданы мутагенезом с заменой и сохранять или даже повышать биологическую активность, например иммуногенную активность, исходного полипептида.

Полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть получены, например, химическим синтезом с использованием имеющегося в продаже автоматизированного синтезатора пептидов. Синтезированный белок или полипептид могут быть осаждены и далее очищены, например, жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР). Альтернативно, белки и полипептиды могут быть получены рекомбинантными способами, например теми, которые хорошо известны в данной области.

Конъюгаты.

Полипептиды изобретения могут быть конъюгированы с другой долей или частицей.

Доли белка.

В некоторых случаях может быть полезно конъюгировать полипептид с белком, который является иммуногенным в иммунизируемых видах, например гемоцианином фиссуреллы (КЬН), СРМ197, токсоидом столбняка, токсоидом дифтерии, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином, ингибитором соевого трипсина или поликатионом (поли-Ь-лизином или поли-Ь-аргинином), например с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, который известен в данной области, например малеимидобензоилсульфосукцинимидный эфир (конъюнкция через остатки цистеина), N гидроксисукцинимид (через остатки лизина), глутаральдегид или янтарный ангидрид.

В некоторых случаях конъюгат может быть рекомбинантным составным белком, например для облегчения экспрессии и очищения полипептида.

Частицы для конъюнкции или отображения полипептидов.

В некоторых случаях полипептиды конъюгированы с частицей или отображены на частице, например фаге, дрожжах, вирусе, виросоме или рекомбинантной вирусоподобной частице.

Например, один или несколько полипептидов могут быть конъюгированы с фагом, дрожжами или вирусной частицей, например с поверхности частицы. В одном варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, вводят в фаг, дрожжи или вирусную частицу, что приводит к экспрессии полипептида в фаге, дрожжах или вирусе, например на поверхности частицы. Популяция фага, дрожжей или вируса, содержащая полипептид, затем может быть выделена и приготовлена, например, как вакцина путем добавления фармацевтически приемлемого наполнителя.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды, которые описаны в настоящем документе, конъюгированы с виросомой или вирусоподобной частицей (ВПЧ). Виросомы и ВПЧ обычно содержат один или несколько белков из вируса, по выбору объединенного или смешанного с фосфолипидом. Они обычно не патогенные, не воспроизводящиеся и обычно не содержат нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть рекомбинантно получены или выделены из целых вирусов. Вирусные белки, подходящие для использования в виросомах или ВПЧ, включают белки, производные от вируса гриппа (такие как НА или NА), вируса гепатита В (такие как капсидные белки), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящера, ретровируса, вируса Норволк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, Кью-бета-фага (такого как белки оболочки), ОА-фага, ίτ-фага, АР205 фага и Ту (такого как белок р 1 Ту ретротранспозона). Виросомы более подробно описаны, например, в публикации Глюка и др. (О1иск е! а1.) (2002), Уассше 20:В10-В16, которая включена в полном объеме путем ссылки. ВПЧ описаны более подробно, например, в публикациях Ниикуры и др. (№1кига е! а1.) (2002), Уио1оду 293:273-280; Ленца и др. (Ъеп/ е! а1.) (2001), I. 1ттипо1. 166:5346-5355; Пинто и др. (Рт!о е! а1.) (2003), I. 1пГсс1. ϋΐδ. 188:327-338; Гербера и др. (ОегЪег е! а1.) (2001), Уиа1. 75:4752-4760; \\'0 03/024480 и \\'0 03/024481, каждая из которых включена в полном объеме путем ссылки.

Антитела.

Изобретение предлагает моноклональное и поликлональное антитела, которые связываются с полипептидами или конъюгатами, описанными в настоящем документе.

Моноклоналъные антитела.

Моноклональные антитела могут быть получены, например, с использованием гибридомного способа, впервые описанного Колером и др. (КоЫег е! а1.), №Циге 256:495, 1975, или способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). Согласно гибридомному способу мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомяк или макака, иммунизируют, например, используя полипептид или конъюгат, описанный в настоящем документе, чтобы активировать лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с полипептидом или конъюгатом, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы ш νίύΌ. Затем лимфоциты соединяют с клетками миеломы, используя подходящий соединяющий агент, такой как полиэтиленгликоль, чтобы получить гибридомную клетку (Годинг (Оойшд), Мопос1опа1 АпОЬоФек Рппар1е5 и Ргасйсе (Моноклоналъные антитела: принципы и практика), стр. 59103, Асайетю Рге88, 1986).

Полученные таким образом гидридомные клетки засевают и выращивают в подходящей питательной среде, которая может содержать одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание несоединившихся, родительских миеломных клеток. Например, если родительские миеломные

- 18 025831 клетки не имеют фермента гипоксантин-гуанин - фосфорибозилтрансфераза (ΗΟΡΚΤ или ΗΡΚΤ), питательная среда для гибридом обычно будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ΗΑΤ), которые предотвращают рост клеток с дефицитом ΗΟΡΚΤ.

Примерами миеломных клеток являются клетки, которые эффективно соединяются, поддерживают стабильное продуцирование антител на высоком уровне клетками, продуцирующими выбранное антитело, и чувствительны к среде, такой как среда ΗΑΤ. Из них конкретными миеломными клеточными линиями, которые могут рассматриваться для использования, являются линии мышиных миелом, такие как полученные из опухолей МОРС-21 и МРС-11 мышей, доступных из Института Салка Центра распространения клеток, Сан-Диего, Калифорния, США, и клетки 8Ρ-2 или Х63-Ад8-653, доступные из Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния, США. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека также описаны как подходящие для продуцирования моноклональных антител человека (Козбор (Ко/Ьог). ί. 1ттипо1. 133:3001, 1984; Бродер и др. (Вгобеиг с1 а1.), Мопос1опа1 АпйЪобу Ρ^обисΐ^оη ΤесЬп^^ие8 апб АррПсабопе (Способы продуцирования и применения моноклональных антител), стр. 51-63, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Уогк, 1987).

Питательная среда, в которой выращивают гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, произведенных гибридомными клетками, можно определить путем иммуноосаждения или анализа связывания ш νίΙΐΌ, такого как радиоиммуноанализ (РИА) или ферментный иммуносорбентный тест (ЕЬ18А).

После идентификации гидридомных клеток, которые продуцируют антитела желательной специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть субклонированы путем ограничения процедур разбавления и роста стандартными способами (Годинг (Ообшд), Мопос1опа1 АпбЪоб1е8: ΡπικίρΚ8 и Ρι^ού^ (Моноклинальные антитела: принципы и практика), стр. 59-103, Асабетю ΡΐΌ88, 1986). Культуральные среды, подходящие для этой цели, включают, например, среду Ό-МЕМ или ΚΡΜΙ-1640. Помимо этого, гибридомные клетки могут быть выращены ш νί\Ό как асцитные опухоли у животного.

Моноклональные антитела, секретированные субклонами, подходящим образом отделяют от питательной среды, асцитической жидкости или сыворотки традиционными способами очистки иммуноглобулинами, такими как, например, белковая А-сефароза, гидроксилапатитная хроматография, электрофорез на геле, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделить и определить ее последовательность, используя известные способы (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи моноклональных антител). Гидридомные клетки служат в качестве источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которые затем переносят в клетки-хозяева, такие как клетки Е.соП, обезьяньи клетки С08, клетки яичника китайского хомяка (СНО) или миеломные клетки, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулин, чтобы синтезировать моноклональные антитела в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантное продуцирование антител будет более подробно описано ниже.

В еще одном варианте осуществления антитела или фрагменты антитела могут быть выделены из библиотек фагов антител с использованием способов, описанных, например, Маккафферти и др. (МсСаТ£ебу е! а1.), №11иге 348:552-554, 1990.

Клаксон и др. (С1аскеоп е! а1.), МШие 352:624-628, 1991 и Маркс и др. (Матке е! а1.), I. Мо1. Вю1. 222:581-597, 1991, описывают выделение антител мышей и человека, соответственно, с использованием библиотек фагов. Последующие публикации описывают продуцирование высоко аффинных (в диапазоне нМ) антител человека путем перестановки цепей (Маркс и др. (Матке е! а1.), В^о/ΤесЬио1о§у 10:779-783,

1992) , а также комбинаторное инфицирование и рекомбинацию ш νί\Ό как стратегию для построения очень больших библиотек фагов (Уотерхаус и др. (^а1егЬои8е е! а1.), N^1. Ашбе. Кее. 21:2265-2266,

1993) . Таким образом, эти способы являются действующими альтернативами традиционным гибридомным способам получения моноклональных антител для выделения моноклональных антител.

ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены кодирующей последовательности для постоянных доменов тяжелых и легких цепей человека вместо гомологичных последовательностей мышей (патент США № 4816567; Моррисон и др. (Мотеоп е! а1.), Бгос. №ιΐ1. Асаб. 8ск И.8.А. 81:6851, 1984), или путем ковалентного связывания с кодирующей иммуноглобулин последовательностью всей или части кодирующей последовательности для полипептида, не содержащего иммуноглобулин.

Обычно такие полипептиды без иммуноглобулина используют для замены постоянных доменов антител или вариабельных доменов одного объединяющего с антигеном сайта антитела, чтобы создать химерное бивалентное антитело, включающее один сайт объединения с антигеном, имеющий специфичность к антигену, и еще один сайт объединения с антигеном, имеющий специфичность к другому антигену.

Поликлоналъные антитела.

Поликлональные антитела обычно выращивают у животных путем множественных инъекций, например подкожных или интраперитонеальных, соответствующего антигена и адъюванта. В некоторых

- 19 025831 случаях может быть полезным конъюгировать полипептид с белком, который иммуногенный для иммунизируемых видов, например с гемоцианином фиссуреллы (КЬН), СКМ197, токсоидом столбняка, токсоидом дифтерии, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином, ингибитором соевого трипсина или поликатионом (поли-Ь-лизином или поли-Ь-аргинином), например с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, который известен в данной области, например малеимидобензоилсульфосукцинимидным эфиром (конъюнкция через остатки цистеина), Ν-гидроксисукцинимидом (через остатки лизина), глутаральдегидом или янтарным ангидридом.

Помимо этого, антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть встречающимся в природе антителом, а также не встречающимся в природе антителом, включая, например, однонитевым антителом, химерным, бифункциональным или гуманизированным антителом, а также его фрагментами, связывающимися с антигеном. Такие не встречающиеся в природе антитела могут быть сконструированы путем твердофазного пептидного синтеза, могут быть продуцированы рекомбинантно или могут быть получены, например, путем скрининга комбинаторных библиотек, как описывают Понсел и др. (Ропке1 е! а1.) (Мо1еси1ек, 16(5):3675-3700 (2011)). Эти и другие способы получения, например, химерных, гуманизированных, СОК-привитых, однонитевых и бифункциональных антител хорошо известны специалистам в данной области и имеются в продаже.

Белковые антитела к Асте1оЬас1ег могут быть выращены с использованием иммуногенного полипептида, такого как выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность δΕΟ ГО N0:3-10 или δΕΟ ГО N0: 11-18, или любого из белков, специфических к Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, раскрытых в настоящем документе, или его фрагмента, который может быть получен из природных источников или продуцирован рекомбинантно, или пептидной части белка Асте1оЬас1ег Ьаитаппл. Такие пептидные части белков Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, раскрытых в настоящем документе, являются функциональными антигенными фрагментами антигенных пептидов, которые можно использовать для создания антитела, специфического к белку Асте1оЬас1ег. Неиммуногенный или слабоиммуногенный полипептид или его часть может быть сделан иммуногенным, путем соединения полипептида с молекулой носителя, такого как бычий сывороточный альбумин (В§А) или гемоцианин фиссуреллы (КЬН). В данной области хорошо известны другие молекулы носителя и способы соединения полипептида с молекулой носителя (см., например, Харлоу и Лейн (Наг1о\у апб Ьапе), выше, 1988). Иммуногенный фрагмент полипептида также может быть создан путем экспрессии пептидной части как составного белка, например, с глутатион-δтрансферазой (ΟδΤ), ро1уН1к и т.д. Способы экспрессии слияний пептидов хорошо известны специалистам в данной области (Осубель и др., выше).

Изобретение, кроме того, предлагает способ обнаружения присутствия грамотрицательных бактерий, таких как бактерии рода Асте1оЬас1ег, в пробе путем введения пробы в контакт со специфическим антителом и обнаружения присутствия специфического связывания антитела с пробой, этим обнаруживая присутствие грамотрицательных бактерий в пробе. Например, специфические антитела к белку Ас1пе1оЬас1ег можно использовать в способах диагностики, раскрытых в настоящем документе, чтобы обнаруживать уровень присутствия Асте1оЬас1ег в пробе.

Используемый здесь термин проба предназначен для обозначения любой биологической жидкости, клетки, ткани, органа или их части, которые включают или потенциально включают нуклеиновые кислоты или полипептиды. Термин включает пробы, присутствующие в пациенте, а также пробы, полученные или производные от пациента. Например, пробой может быть гистологический срез образца, полученного биопсией, или клетки, которые помещены в культуру ткани или адаптированы к ней. Пробой, кроме того, может быть субклеточная фракция, или экстракт, или сырая или, по существу, чистая нуклеиновая кислота, или белковый препарат.

Иммунологические процедуры, подходящие для обнаружения ш νίΙΐΌ целевых белков Асте1оЬас1ег в пробе, включают иммунологические анализы, в которых используется обнаруживаемое антитело. Такие иммунологические анализы включают, например, иммуногистохимию, иммунофлуоресценцию, анализы ИФА, радиоиммуноанализ, анализ ЕАС8, иммуноосаждение, иммуноблот-анализ, микрофлуориметрический анализ Рапбех, агглютинационные анализы, проточную цитометрию и диагностические анализы сыворотки, которые хорошо известны в данной области (Харлоу и Лейн, выше, 1988; Харлоу и Лейн, Икшд АпБЬоб1ек: А БаЬогаГОгу Мапиа1 (Использование антител: лабораторное руководство), Со1б Бртшд НагЬог Ртекк (1999)).

Антитело может быть сделано обнаруживаемым разными средствами, хорошо известными в данной области. Например, обнаруживаемый маркер может быть прикреплен прямо или косвенно к антителу или с использованием, например, вторичного агента, который распознает антитело к белку АстеФЬаОет. Подходящие маркеры включают, например, радионуклеотиды, ферменты, связывающиеся белки, такие как биотин, фторогены, хромогены и хемилюминисцентные метки.

Метки, которые подходят для изобретения, включают одиночные атомы и молекулы, которые прямо или косвенно вовлечены в продуцирование обнаруживаемого сигнала. Любая метка или индикатор может быть связана с нуклеиновыми кислотами, полипептидами или антителами изобретения. Эти атомы или молекулы могут быть использованы отдельно или вместе с дополнительными реагентами. Сами такие метки хорошо известны в клинической диагностической химии.

- 20 025831

В одном варианте осуществления меткой может быть флуоресцентная метка, которая химическим путем связывается с антителами без денатурации, чтобы образовать фторохром (краситель), который является полезным иммунофлуоресцентным индикатором. Способы получения и использования флуоресцентного агента-метки хорошо известны в данной области и имеются в продаже.

В одном варианте осуществления метящей группой может быть фермент, такой как пероксидаза хрена (ΗΚΡ), оксидаза глюкозы и т.д. В еще одном варианте изобретения в качестве метящих агентов применяются радиоактивные элементы. Связывание метки с субстратом, т.е. мечение нуклеиновых кислот, антител и полипептидов, хорошо известно в данной области. Например, антитело изобретения может быть помечено путем метаболического включения меченой радиоактивным изотопом аминокислоты, полученной в питательной среде. См., например, Галфре и др. (Оа1£ге е1 а1.), Мебт Εηζуто1, 73:3-46 (1981). Помимо этого, антитело изобретения может быть помечено путем инкубации антитела изобретения, конъюгированного с бифункциональным хелатором в растворе радиоактивных изотопов. См., например, патент США № 7229620. Известные средства конъюнкции или соединения белков активированными функциональными группами имеются в продаже.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способ обнаружения присутствия АстеЮЬасЮг в пробе. Эти способы могут включать контакт пробы с антителом, как сказано в настоящем документе, и обнаруживать присутствие специфического связывания антитела с пробой, посредством чего обнаруживается присутствие Асте1оЬас1ег в пробе. В некоторых аспектах связывание антитела происходит со специфическим белком Асте1оЬас1ег. определенным в настоящем документе. Например, способ может включать связывание с белком 1 наружной мембраны Асте1оЬас1ег конъюгир, белком 2 наружной мембраны Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, белком рецептора с сидерофорной активностью к железу Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, белком теплового шока Опак Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, фактором элонгации О Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, прекурсором белка толерантности к органическому растворителю Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, трансмембраной предполагаемого прекурсора липопротеина ^асТ) Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, предполагаемым чувствительным к глюкозе порином (подобным 0ргВ) Аси1е1оЬас1ег Ьаитаппп, составным белком мембраны АбеА Асте1оЬас1ег Ьаитаппп, белком деления клеток Асп1е1оЬас1ег Ьаитаппп, или белком ΡΐδΖ деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппп, который присутствует в пробе.

Композиции и способы, описанные для обнаружения и анализа Лсте(оЬас(ег, в равной степени применимы к обнаружению Саиб1ба.

Вакцины и содержащие антитело фармацевтические композиции.

Составы вакцин и содержащих антитело фармацевтических композиций (совместно композиции), которые описаны в настоящем документе, могут быть приготовлены с использованием стандартных химических способов и методологий приготовления фармацевтических составов, которые легко доступны среднему специалисту. Например, полипептиды, конъюгаты или антитела, описанные в настоящем документе, могут быть объединены с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями или средами. Вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные вещества для регулировки рН и т.д., могут присутствовать в наполнителе или среде. Эти наполнители, среды и вспомогательные вещества обычно являются фармацевтическими агентами, которые не вызывают иммунную реакцию у пациента, принимающего композицию, и которые могут быть введены без ненужной токсичности. Фармацевтически приемлемые наполнители включают, но без ограничения, жидкости, такие как вода, физраствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновую кислоту, глицерин и этанол. Также могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.д., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.д.. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей, сред и вспомогательных веществ можно найти в Фармакологии Ремингтона (Маск ГиЬ. Со., N.1. 1991).

Такие композиции могут быть приготовлены, упакованы или предлагаться в продаже в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Композиции для инъекций могут быть приготовлены, упакованы или предлагаться в продаже в форме единичной дозы, такой как ампулы, или в контейнерах на несколько доз, содержащих консервант. Композиции могут включать, но без ограничения, суспензии, растворы, эмульсии в масляной или водной среде, пасты и имплантируемые формы с продолженным высвобождением или биоразлагаемые. Такие композиции могут кроме того включать один или несколько дополнительных ингредиентов, включая, но без ограничения, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие вещества. В одном варианте осуществления композиции для парентерального введения активный ингредиент представлен в сухой (например, порошок или гранулы) форме для восстановления подходящей средой (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением восстановленной композиции. Композиции могут быть приготовлены, упакованы или предлагаться в продаже в форме стерильной водной или масляной суспензии или раствора для инъекций. Эта суспензия или раствор могут быть приготовлены согласно известному уровню техники и могут включать, в дополнение к активному ингредиенту, дополнительные ингредиенты, такие как диспергаторы, смачивающие агенты или суспендирующие агенты, описанные в настоящем документе. Такие

- 21 025831 стерильные композиции для инъекций могут быть приготовлены с использованием нетоксичного, приемлемого для парентерального введения разбавителя или растворителя, такого как, например, вода или 1,3-бутандиол. Другие приемлемые разбавители и растворители включают, но без ограничения, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и фиксированные масла, такие как синтетические моноили диглицериды.

Другие подходящие композиции для парентерального введения включают те, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме, в липосомном препарате или как компонент биоразлагаемых полимерных систем. Композиции для продленного высвобождения или имплантации могут включать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы, такие как эмульсия, ионообменная смола, труднорастворимый полимер или труднорастворимую соль.

Альтернативно, полипептиды, конъюгаты и антитела, описанные в настоящем документе, могут быть инкапсулированы, адсорбированы на корпускулярные носители или связаны с ними. Подходящие корпускулярные носители включают производные полимеров полиметилметакрилата, а также микрочастицы РЬО, полученные из полилактидов и полилактидкогликолидов. См., например, Джеффери и др. (.Тейегу е1 а1.) (1993) РЬагт. Кек. 10:362-368. Могут быть использованы и другие корпускулярные системы и полимеры, например такие полимеры, как полилизин, полиаргинин, полиорнитрин, спермин, спермидин, а также конъюгаты этих молекул.

Приготовленные композиции будут включать некоторое количество одного или нескольких полипептидов или конъюгатов, описанных в настоящем документе, которого достаточно для создания иммунной реакции. Иммуногенное количество может легко определить специалист в данной области. Такое количество попадает в относительно широкий диапазон, который можно определить посредством обычных экспериментов. Композиции могут содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 99,9% полипептидов, конъюгатов или антител и могут быть введены непосредственно пациенту или, альтернативно, доставлены ех νίνο, к клеткам, взятым у пациента, с использованием способов, известных специалистам в данной области.

Композиции могут включать смесь разных полипептидов, конъюгатов или антител, описанных в настоящем документе. Например, вакцины могут включать, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше разных полипептидов или конъюгатов, описанных в настоящем документе, например, содержащих или состоящих из аминокислотных последовательностей 3ЕО ГО N0: 3-10 или 11-18, или их вариантной последовательности, имеющей до трех замен, делеций или добавлений в аминокислотной последовательности любой одной из 3Е0 ГО N0: 3-10 или 11-18. В одном варианте осуществления вакцина включает восемь разных полипептидов, причем аминокислотная последовательность восьми полипептидов состоит из последовательности из 3Е0 ГО N0: 11-18. В еще одном варианте изобретения содержащие антитело фармацевтические композиции могут включать смесь моноклональных или поликлональных антител, имеющих, например, разную специфичность к полипептидам или конъюгатам, описанным в настоящем документе.

Вещества, которые стимулируют иммунную реакцию, например адъюванты, могут быть включены в композиции, например в вакцины. Примеры химических соединений, используемых в качестве адъювантов, включают, но без ограничения, соединения алюминия (например, квасцы, Альгидрогель), масла, блок-полимеры, иммуностимулирующие комплексы, витамины и минералы (например, витамин Е, витамин А, селен и витамин В12), Οιιίΐ А (сапонины), компоненты клеточных стенок бактерий и грибков (например, липополисахариды, липопротеины и гликопротеины), гормоны, цитокины и костимулирующие факторы.

В еще одном аспекте изобретение предлагает композицию вакцины, включающей: иммуногенное количество полипептида ΗΥΡ1, описанного в настоящем документе, составной белок, описанный в настоящем документе, белок ΗΥΡ1 (3Е0 ГО N0: 1) или его фрагмент, белок 1 наружной мембраны Асше1оЬас1ег Ьаитаиий или его фрагмент, белок 2 наружной мембраны АсшеТоЬасТег Ьаитаиии или его фрагмент, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу АсшеТоЬасТег Ьаитаиии или его фрагмент, белок теплового шока Опак Ас1пе1оЬас1ег Ьаитаиии или его фрагмент, фактор элонгации О Ас1пе1оЬас1ег Ьаитаппй или его фрагмент, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю АстеТоЬасТег Ьаитаппй или его фрагмент, трансмембрану предполагаемого прекурсора липопротеина (Уисй) Асте1оЬас1ег Ьаитаппй или ее фрагмент, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный ОргВ) АсшеТоЬасТег Ьаитаппй или его фрагмент, составной белок мембраны АйеА АсшеТоЬасТег Ьаитаппй или его фрагмент, белок деления клеток АсшеТоЬасТег Ьаитаппй или его фрагмент или белок ΕίκΖ деления клеток АсшеТоЬасТег Ьаитаппй или его фрагмент. Композиция вакцины может включать адъювант. Состав композиции вакцины изобретения эффективно индуцирует защитный иммунитет у пациента, стимулируя специфические гуморальные (нейтрализующие) антитела и иммунные реакции, опосредованные клетками эффектора, полипептиду антигену. Композиция вакцины изобретения также используется при лечении или профилактике инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, такими как, например, бактериями рода АсшеТоЬасТег, включающими, например, АсшеТоЬасТег Ьаитаппй.

Вакцина настоящего изобретения будет содержать иммунозащитное количество полипептид антигенов и может быть приготовлена способами, хорошо известными в данной области. Приготовление вак- 22 025831 цин в общем описано, например, М.Ф. Пауэллом и М.Дж. Ньюменом (М.Р. Ро\\е11 апй М.1. №\утап), ейк., Уассте Пе81дп (1Не 8иЪит1 апй ай)иуап1 арргоасЬ), Р1епит Рге88 (1995); Э. Робинсоном, М. Кренеджем и М. Хадсоном (Л. КоЪт8оп, М. Сгападе, апй М. Ний8оп), ей8., Уассте Рго1осо18 (МеШой8 ш Мо1еси1аг Мейкше), Нитапа Рге88 (2003); и Д. Охаганом (Ό. ОЬадап), ей., Уассте Лфцуайь: Ргерагайоп Ме11юй8 апй Ре8еагс1 РгоЮсо18 (МеЛой8 т Мо1еси1аг Мейкте),Нитапа Рге88 (2000).

Полипептиды изобретения и их пептидные фрагменты могут включать иммуногенные эпитопы, которые могут быть идентифицированы экспериментальными способами, хорошо известными в данной области. Помимо этого, для идентификации иммуногенных эпитопов также может быть использовано вычислительное моделирование. См., например, Тонг и др. (Топд е1 а1.) (ВпеГ ВюшГогт. 8(2):96-108 (2006)) и Пономаренко и др. (Ропотагепко е1 а1.) (2008) В-се11 еркоре ргейкйоп, в §1гис1ига1 ВюшГогтайс8. Войте Р.Е. апй Си 1. (ей8) ^11еу-Ь188; 2 изд, стр. 849-879. После идентификации эпитопа, имеющего реактивность с антителом, выведенным против интактного белка, пептид может быть испытан на специфичность путем замены аминокислоты в каждом положении и/или расширения на С- и/или Νконце. Такой эпитоп, имеющий полипептиды, обычно содержит по меньшей мере 6-14 аминокислотных остатков и может быть продуцирован, например, синтезом полипептида с использованием способов, хорошо известных в данной области, или путем фрагментации существующего полипептида. По отношению к молекуле, используемой в качестве иммуногена согласно настоящему изобретению, специалисты в данной области поймут, что полипептид может быть усечен или фрагментирован без потери существенных качеств иммуногенной вакцины. Например, полипептид может быть усечен, чтобы получить Νконцевой фрагмент путем отсечения от С-конца с сохранением функциональных свойств молекулы как иммуногенной. Подобно этому С-концевые фрагменты могут быть получены путем отсечения от Νконца с сохранением функциональных свойств молекулы как иммуногенной. Другие модификации в соответствии с настоящим документом могут быть выполнены согласно настоящему изобретению, чтобы создать другие функциональные фрагменты, иммуногенные фрагменты, варианты, аналоги полипептида или его производных, чтобы получить терапевтически полезные свойства, описанные в настоящем документе, у нативных белков и полипептидов.

Композиции вакцин изобретения, кроме того, включают обычные фармацевтические носители. Подходящие носители хорошо известны хорошо известны специалистам в данной области. Эти композиции вакцин могут быть приготовлены в жидких формах единичных доз. Другие компоненты, добавляемые по выбору, например стабилизаторы фармацевтического класса, буферы, консерванты, наполнители и т.д., могут быть легко выбраны специалистом в данной области. Однако композиции могут быть лиофилизированы и восстановлены перед использованием. Альтернативно, композиции вакцин могут быть приготовлены любым способом, подходящим для выбранного режима введения, например интраназального, перорального и т.д. Приготовление фармацевтически приемлемой вакцины с должным учетом рН, изотоничности, стабильности и т.д., известно специалистам в данной области.

Иммуногенность композиций вакцин изобретения может быть далее усилена, если вакцина будет также содержать вещество-адьювант. Известны разные способы достижения эффектов адъюванта для вакцины. Общие принципы и способы детализированы в публикации Уассте Пе81дп: ПтоуаПуе Лрргоасйе8 апй Шуе1 §1га1ед1е8, 2011, РарриоП К. апй ВадпоН Р. (ей8.), Са181ег Лсайетк Рге88, и также в публикации Уассте Лфцуайь апй ИеНуегу 8у81ет8, 2007, 8шдП М. (ей.), 1о1т \УПеу & §оп8, 1пс.

Вакцины согласно изобретению относятся к композиции, которая может быть введена пациенту для защиты его от инфекционного заболевания. Вакцины защищают от заболеваний, индуцируя или увеличивая иммунную реакцию в животном против инфекционного заболевания. Примеры инфекционных заболеваний, поддающихся лечению вакцинами изобретения, включают тяжелую пневмонию, инфекции мочевых путей, инфекции кровеносной системы и инфекции других частей тела. Опосредованная вакциной защита может быть гуморальным и/или опосредованным клетками иммунитетом, индуцированном в организме-хозяине, когда на пациента воздействуют иммуногенной частью полипептида или белка, описанного в настоящем документе.

В дополнение к вакцинации пациентов, восприимчивых к инфекциям Лсше1оЪас1ег или СапФйа или и тем и другим, композиции вакцин настоящего изобретения также могут быть использованы для лечения, иммунотерапевтически, пациентов, страдающих от разных инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями. Соответственно, вакцины, которые содержат один или несколько композиций полипептидов и/или антител, описанных в настоящем документе, в сочетании с адъювантами, могут применяться для целей профилактического или терапевтического лечения инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями. В одном варианте осуществления вакцины настоящего изобретения будут индуцировать собственную иммунную систему организма, чтобы найти и ингибировать грамотрицательные бактерии или бактерии СапФйа или и те и другие.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способ лечения или профилактики инфекции от грамотрицательных бактерий нуждающегося в этом пациента путем введения терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, раскрытой в настоящем документе, или композиции вакцины, раскрытой в настоящем документе. Например, изобретение предлагает способы лечения или предотвращения инфекций, вызываемых одной или несколькими грамотри- 23 025831 цательными бактериями, включая бактерии рода АстеЮЬасЮг такие как А. Ьаитаппп, А. тойй, А. йаето1уйси8, А. са1соасейси8, А. |о1т8ошк А. гаФоге818Юп8 и А. |ип11, бактерии рода Наеторййи8, такие как Н. аедурйи8, Н. арйгорййи8, Н. аушт, Н. йисгеу1, Н. ГеЙ8, Н. Ьаето1уйси8, Н. шЯиепга, Н. рагашДиещае, Н. рагасишси1и8, Н. рагайаето1уйси8, Н. рйкташае и Н. 8отпи8, бактерии рода ВогйеЮйа, такие как В. апкогрй, В аушт, В. Ьгопсй8ерйса, В. йт/п, В. Ьо1те8Й, В. рагарейи8818, В. рейи8818, В. рейй и В. £гета£ит, бактерии рода 8а1топе11а, такие как 8. 1урЫтийит, 8. Ьопдогк 8. епЮпса 8иЬ8р. епЮйса, δ. епЮпса киЬкр. 8а1атае, 8. ап/опае, 8. епЮпса 8иЬ8р. Фап/опае, 8. епЮпса 8иЬ8р. ЬоиЮпае и 8. епЮпса 8иЬ8р. шФса, бактерии рода Уегкта, такие как Уеюта р8еийоЮЬег, Υ. а1йоуае, Υ. аЮккШае, Υ. Ьегсо\аегк Υ. епЮгосоййса, Υ. Ггейепк8епй, Υ. шЮгтеФа, Υ. кп8Юп8ешк Υ. тойагеФ, Υ. ре8Й8, Υ. р8еийоЮЬегси1о818, Υ. гоМе1 и Υ. гискей, бактерии рода Е8сйейсЫа, такие как Е. а1ЬеФк Е. Ь1айае, Е. сой, Е. Гегди8опй, Е. йегтаппй и Е. уи1пеЙ8, бактерии рода РейоЬасЮг, такие как Р. Ьерагшщ, Р. го8еи8 8р. поу. и Р. адиаййк 8р. по\х бактерии рода Р8еийотопа8, такие как Р. аегидшо8а, Р. а1сайдепе8, Р. тепйосша, Р. Яиоге8сеп8, Р. топЮйй, Р. огу/ФаЬйап8, Р. 1иЮо1а, Р. риййа, Р. серааа, Р. 81Ш/егк Р. такорЫйа, Р. ри£геГааеп8, Р. та11е1 и Р. р8еийота11ек или бактерии рода К1еЬ81е11а, такие как К. рпеитотае, К. р1апйсо1а К. охуЮса и К. гЫпо8с1еготаЙ8. В других вариантах осуществления лечение или профилактика может относиться к видам СапФйа, раскрытым в настоящем документе.

Более того, изобретение также предлагает, что в дополнение к отдельному введению вакцины и фармацевтические композиции изобретения могут быть введены совместно с одним или несколькими антибиотиками. Антибиотики, которые подходят для совместного введения, могут быть легко определены специалистом в данной области. Неограничивающие примеры антибиотиков, которые подходят для совместного введения, включают антибиотик карбапенем, такой как имипенем, или антибиотик второй линии, такой как полимиксины, тигециклин или аминогликозиды. См., например, Бассетти и др. (Ва88е£й е£ а1.) (РиЮге МюгоЬЮк, 3(6): 649-60 (декабрь 2008)).

Лечение.

Изобретение предлагает способы вакцинации млекопитающего против кандидоза, включая введение животному вакцины, описанной в настоящем документе, этим вакцинируя млекопитающего против кандидоза. Помимо этого, изобретение предлагает способы пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза, включая введение млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, этим пассивно иммунизируя млекопитающего против кандидоза. Кандидоз может включать, например, рассеянный кандидоз, например кандидоз, рассеянный в крови, или кандидоз слизистой. В некоторых случаях кандидоз вызван, например, СапФйа а1Ысап8, СапЙ1Йа д1аЬга!а, СапЙ1Йа кги8е£, СапФйа рагар8Йо818 или СапЙ1Йа кгор1саЙ8. Другие виды СапФйа включают СапФйа 1и8Йатае и СапФйа 8Ю11аЮ1Йеа.

Вакцины и содержащие антитело фармацевтические композиции (совместно композиции), которые описаны в настоящем документе, могут быть введены с профилактическими или терапевтическими целями отдельно или в сочетании с другими, известными в данной области композициями, которые индуцируют защитные реакции против патогенов (например, вирусных, бактериальных, грибковых или паразитарных патогенов), опухолей или раков, аллергенов, аутоиммунных расстройств или отторжения трансплантата. Например, композиции могут быть введены одновременно, отдельно или последовательно, например, с другой иммунизирующей вакциной, такой как вакцина против, например, гриппа, малярии, туберкулеза, оспы, кори, краснухи, свинки, или с любыми другими вакцинами, известными в данной области.

Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть доставлены млекопитающему пациенту (например, человеку или другому млекопитающему, указанному в настоящем документе) путем использования разных известных путей и способов. Например, композиция может иметь форму раствора, суспензии или эмульсии для инъекций и вводиться как внутримышечная, подкожная, внутрикожная, внутриполостная, парентеральная, эпидермальная, внутриартериальная, интраперитонеальная или внутривенная инъекция с использованием обычной иглы и шприца или с использованием струйной системы для жидких инъекций. Композиции также могут быть введены топикально на кожу или слизистую ткань, например, назально, внутритрахеально, интестинально, ректально или вагинально, или же иметь форму мелкого аэрозоля, подходящего для респираторного или пульмонального введения. Другие режимы введения включают пероральное введение, свечи и способы активной или пассивной трансдермальной доставки.

Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть введены млекопитающему пациенту (например, человеку или другому млекопитающему, указанному в настоящем документе) в количестве, которое совместимо с дозировкой и будет иметь профилактический и/или терапевтический эффект. Подходящее эффективное количество подпадает под относительно широкий диапазон, но может быть легко определено специалистом в данной области путем обычных испытаний. Для цели определения необходимого количества можно использовать публикации Настольная книга врача (Рйу81с1ап8 Эе8к КеГегепсе) и Фармакологические основы клинической медицины Гудмена и Гилмена (Соойтап апй Сйтап'8 Тйе РЬагтасо1одюа1 Ва818 оГ Тйегареийс8).

Профилактика или терапия могут быть осуществлены путем одиночного прямого введения за один

- 24 025831 раз или путем множественных введений, по выбору в разные моменты времени. Введение также может быть направлено на доставку к одному или нескольким местам. Специалисты в данной области могут регулировать дозировку и концентрацию для конкретного пути доставки. В одном варианте осуществления одну дозу вводят в единичном случае. В альтернативном варианте осуществления несколько доз вводят пациенту в одном случае, но, например, в разных местах. В еще одном варианте осуществления несколько доз вводят в нескольких случаях. Такие множественные дозы могут быть введены сериями, т.е. путем множественных введений в разных местах за один раз, или могут быть введены по отдельности, с одним введением в каждом из нескольких случаев (по выбору, в разных местах). Можно использовать любое сочетание таких режимов введения.

В одном варианте осуществления разные композиции изобретения могут быть введены в разных местах или в разные случаи как часть одного режима лечения.

Разные введения могут быть выполнены в одном случае, в тот же день, через один, два, три, четыре, пять или шесть дней или через одну, две, три, четыре или больше недель. В некоторых случаях введения разделяют 1-5 недель, например 2-4 недели, т.е. 2, 3 или 4 недели. График и хронометраж таких множественных введений могут быть оптимизированы для конкретной вакцины или фармацевтической композиции специалистом в данной области путем обычных испытаний.

Используемый здесь термин лечение предназначен для обозначения уменьшения клинического симптома, указывающего на бактериальную инфекцию. Уменьшение клинического симптома включает, например, уменьшение по меньшей мере одного симптома бактериальной инфекции у пациента, получающего лечение, по сравнению с уровнями до лечения или по сравнению с пациентом с бактериальной инфекцией. Лечение также включает уменьшение тяжести патологического состояния, хронического осложнения или оппортунистической инфекции, которая связана с бактериальной инфекцией. Патологические состояния, хронические осложнения и оппортунистические инфекции также описаны, например, в руководстве Мегск Мапиа1, δίχΙοοπίΗ ΕάιΙίοπ, 1992, и в публикации Мо1еси1аг Βίοίοβν, и1пкс Оепкскег (Εάίίοτ), С.шк1ег Αсаάет^с Ргекк; 1κί е^^п (2008).

Используемые здесь термины профилактика или предотвращение предназначены для обозначения предотвращения клинического симптома, указывающего на бактериальную инфекцию. Такое предотвращение включает, например, поддержание нормальных физиологических индикаторов пациента с риском инфицирования бактериями перед развитием явных симптомов такого состояния или перед диагнозом такого состояния. Поэтому профилактика может включать профилактическое лечение пациентов, чтобы защитить их от случая бактериальной инфекции. Предотвращение бактериальной инфекции у пациента также должно включать ингибирование или остановку развития инфекции. Ингибирование или остановка развития состояния включает, например, ингибирование или остановку проявления ненормальных физиологических индикаторов или клинических симптомов, таких как покраснение, жар, разбухание и локализованная боль и/или других хорошо известных симптомов. Поэтому эффективное предотвращение бактериальной инфекции включает поддержание нормальной температуры и массы тела или предотвращение других патологических проявлений у пациента, предрасположенного к бактериальной инфекции. Пациенты, предрасположенные к бактериальной инфекции включают пациента с ухудшенным иммунным состоянием, например, но без ограничения, пациента со СПИДом, азотемией, сахарным диабетом, диабетическим кетоацидозом, нейропенией, бронхоэктазией, эмфиземой, туберкулезом, лимфомой, лейкемией или ожогами или пациента, получающего химиотерапию, с трансплантацией костного мозга, стволовых клеток и/или твердого органа или пациента с историей восприимчивости к бактериальной инфекции. Ингибирование или остановка развития состояния также включает, например, ингибирование или остановку прогресса одного или нескольких патологических состояний, хронических осложнений или восприимчивости к оппортунистической инфекции, связанной с бактериями.

Дозировки.

Подходящая доза вакцин или содержащих антитело фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, может изменяться в зависимости от таких факторов как способ приготовления, способ введения, возраст, масса тела и пол пациента, тяжесть симптомов, время введения, путь введения, частота экскреции и чувствительность. Средний врач в этой области легко определит и диагностирует дозу, эффективную для лечения.

Композиции могут быть приготовлены как единичные дозы или множественные дозы специалистами в этой области с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя согласно способу, известному в данной области.

Векторы.

Изобретение также предлагает векторы, содержащие нуклеиновые кислоты изобретения. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны в данной области и включают векторы, способные экспрессировать нуклеиновую кислоту, оперативно связанную с регуляторной последовательностью или элементом, таким как участок промотора или участок энхансера, который способен регулировать экспрессию нуклеиновой кислоты. Подходящие экспрессирующие векторы включают векторы, которые могут реплицироваться в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, и векторы, которые остаются эписомальными или интегрируются в геном клетки-хозяина.

- 25 025831

Термины вектор, клонирующий вектор и экспрессирующий вектор означают средство, которым нуклеиновая кислота может быть введена в клетку хозяина. Вектор можно использовать для репродукции или размещения нуклеиновой кислоты или для экспрессии полипептида кодированной последовательности. В данной области известен широкий круг векторов, которые включают, например, плазмиды, фаги и вирусы. Примеры векторов описаны, например, в публикациях Сэмбрука и др. (8атЬгоок е! а1.), Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 3^гб Е6Шои. Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!опез, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 2001; и Осубеля и др. (АизиЬе1 е! а1.), Сиггеп! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, ШИп \УПеу и 8оиз, ВаШтоге, МИ (1999)).

Промоторы и энхансеры, в зависимости от характера регулирования, могут быть конститутивными или регулируемыми. Регуляторные последовательности или регуляторные элементы оперативно связаны с нуклеиновой кислотой изобретения, так что физическое и функциональное отношение между нуклеиновой кислотой и регуляторной последовательностью позволяет осуществлять транскрипцию нуклеиновой кислоты.

Векторы, подходящие для экспрессии в эукариотических клетках, могут включать, например, регуляторные элементы, включая ранний промотор 8У40, промотор цитомегаловируса (СМУ), индуцируемый стероидом промотор вируса опухоли молочных желез мыши (ММТУ), промотор вируса Молони, вызывающего лейкемию у мышей (ММЬУ) и т.д. Векторы изобретения подходят для субклонирования и амплификации молекулы нуклеиновой кислоты и для рекомбинантной экспрессии полипептида, раскрытого в настоящем документе. Вектор изобретения может включать, например, вирусные векторы, такие как бактериофаг, бакуловирус или ретровирус; космиды или плазмиды; и, в частности для клонирования больших молекул нуклеиновых кислот, векторы бактериальных искусственных хромосом (ВАС) и векторы дрожжевых искусственных хромосом ^АС). Такие векторы имеются в продаже, и их использование хорошо известно в данной области. Специалист в данной области узнает или сможет легко определить подходящий промотор для экспрессии в конкретной клетке-хозяине.

Изобретение помимо этого предлагает рекомбинантные клетки, содержащие нуклеиновые кислоты изобретения. Рекомбинантные клетки получают, вводя в клетку-хозяин вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты. Такие рекомбинантные клетки трансдуцированы, трансформированы или иначе генетически модифицированы. Примеры клеток-хозяев, которые могут быть использованы для экспрессии рекомбинантных молекул, включают первичные клетки млекопитающего; установившиеся клеточные линии млекопитающего, такие как клетки СО8, СНО, НеЬа, Ы1Н3Т3, НЕК 293 и РС12; клетки земноводных, такие как эмбрионы и ооциты Хеиориз; и клетки других позвоночных. Примеры клеток-хозяев также включают клетки насекомых, таких как ИгозорЫ1а, клетки дрожжей, таких как 8ассйаготусез сегеУ131ае, 8ассйаготусез ротЬе или РюЫа раз!опз, и прокариотические клетки, такие как ЕзсНегюЫа сой.

Варианты осуществления настоящего изобретения также предлагают специфические полипептиды НΥΚ1, которые могут действовать как антигены для создания иммунной реакции на грамотрицательные бактерии, включая бактерии рода Асше!оЬас!ег, например Асше!оЬас!ег ЬаитапЫг В некоторых аспектах изобретения полипептиды НΥΚ1 изобретения включают аминокислотную последовательность, выбираемую из 8ЕС ГО N0: 3-10, а также из ССР8ΛРЕ8Е8^^NТР (81 СС) ГО N0: 11), ССNΚ^НЕΚЕЕΥΥР^Т (8ЕС ГО N0: 12), ССΥ^8К^ЕΚIУN8ΚС (81 СС) ГО N0: 13), СК1К0Т0СУТАИЕИТ (81 СО ГО N0: 14), С^КNАУТΥ^ΟРУРNN (8ЕС ГО N0: 15), №К88Т8Е8№ИЮС (8ЕС ГО N0: 16), СЕРТНNЕΥ^К^8К88 (8Е0 ГО N0: 17) и Т8Р1ИРСС10СЕНСС (8Е0 ГО N0: 18). Более того, в некоторых аспектах изобретения полипептид НΥΚ1 может включать меньше чем 937, 936, 935, 934, 933, 932, 931, 930, 920, 910, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 690, 680, 670,

660, 650, 640, 630, 620, 610, 600, 590, 580, 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 460, 450,

440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220,

210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков в длину и может быть иммуногенным. В некоторых аспектах изобретения полипептиды НΥΚ1 изобретения не являются полипептидом НΥΚ1 8Е0 ГО N0: 1.

В других аспектах изобретение также предлагает варианты осуществления, в которых полипептиды включают больше чем одну аминокислотную последовательность, соответствующую любой одной из 8Е0 ГО N0: 3-10 или 8Е0 ГО N0: 11-18. Например, полипептиды изобретения могут включать две аминокислотных последовательности, такие как 8Е0 ГО N0: 15 в сочетании с 8Е0 ГО N0: 12, или, альтернативно, 8Е0 ГО N0: 11 в сочетании с 8Е0 ГО N0: 17, или, альтернативно, 8Е0 ГО N0: 13 в сочетании с 8Е0 ГО N0: 18. При этом понимается, что полипептиды изобретения могут включать две, три, четыре, пять, шесть, семь или все восемь аминокислотных последовательностей, выбираемых из 8Е0 ГО N0: 310 или 8Е0 ГО N0: 11-18. Также при этом понимается, что аминокислотная последовательность необязательно должна быть сцепленной и может быть связана промежуточными спейсерными последовательностями, которые могут, например, позволять полипептиду представлять желательную аминокислотную последовательность или эпитоп для создания иммунной реакции.

В некоторых аспектах изобретения полипептиды изобретения включают, по существу, ту же аминокислотную последовательность любой одной из 8Е0 ГО N0: 3-10 или 8Е0 ГО N0: 11-18. Например, аминокислотная последовательность может иметь по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%

- 26 025831 идентичности последовательности с любой одной из БЕЦ ГО N0: 11-18, в которой фрагмент полипептида может быть связан антителом к ΗΥΚ.1, раскрытым в настоящем документе. В других аспектах полипептид ΗΥΚ1 изобретения может быть иммуногенным и способным активировать продуцирование антитела к ΗΥΚ1 или иммуногенную реакцию у пациента.

Как сказано в настоящем документе, полипептиды изобретения могут охватывать, по существу, одинаковые аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере приблизительно 65% идентичности по отношению к контрольной аминокислотной последовательности и сохраняющие сравнимую функциональную и биологическую активность, характерную для контрольной аминокислотной последовательности. В одном аспекте полипептиды, имеющие, по существу, такую же аминокислотную последовательность, будут иметь по меньшей мере 65% идентичности, по меньшей мере 70% идентичности, по меньшей мере 75% идентичности, по меньшей мере 80% идентичности, по меньшей мере 85% идентичности, по меньшей мере 90% идентичности, по меньшей мере 95% идентичности, по меньшей мере 98% идентичности или по меньшей мере 99% идентичности. При этом понимается, однако, что полипептиды или кодирующие нуклеиновые кислоты, содержащие меньше чем указанные уровни идентичности последовательности, являющиеся сплайсовыми вариантами или модифицированные консервативными заменами аминокислот или заменой дегенеративных кодонов также входят в объем настоящего изобретения.

Примеры

Следующий пример предназначен для иллюстрации изобретения. Он не предназначен для ограничения изобретения каким-либо образом.

Пример I. Активная и пассивная иммунизация с помощью γΗυγ1-Ν защищает от кандидоза, рассеянного в крови.

ΗΥΚ1 относится к семейству генов ΙΡΡ С. а1Ысапк, которое включает 12 членов. Он кодирует белок, сцепленный с гликозилфосфатдиинозитолом (ГФИ) клеточной поверхности, который экспрессируется во время образования гифов. Ранее было доказано, что Ηγτΐρ опосредует стойкость С. а1Ысапк к умерщвлению фагоцитов ш У11го и способствует повышенной грибковой нагрузке на органы, богатые фагоцитами (например, печень и селезенка). Нативный ΗΥΚ1 положительно регулируется фактором транскрипции Всг1р. Было установлено, что автономная экспрессия ΗΥΚ1 обращает гипервосприимчивость к опосредованному фагоцитами умерщвлению нулевого мутанта Ъсг1 С. а1Ысапк ш тйго. Кроме того, гетерологичная экспрессия ΗΥΚ1 в С. д1аЪга!а делает организм более стойким к умерщвлению нейтрофилами. Предыдущие исследования также показали, что вакцина на основе рекомбинантного Ν-конца Ηγτΐρ (τΗγτΐρ-Ν) заметно улучшает выживание иммунокомпетентных мышей, инфицированных внутривенно С. а1Ьюапк в смеси с адъювантом Фрейнда или квасцами в качестве адъюванта.

Настоящие исследования были выполнены, помимо прочего, для дальнейшего уточнения эффективности вакцины на основе ιΉγιΊρ-Ν у иммунокомпетентных и иммунодефицитных мышей с использованием одобренных Управлением США по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами (ΡΌΛ) квасцов в качестве адъюванта. Кроме того, объем защиты, индуцируемой ΓΗγτΐρ-Ν, оценивали по эффективности против видов, отличных от а1Ысапк Сапй1йа. В заключение, мы хотели изучить потенциальное использование пассивной иммунной терапии при рассеянном кандидозе с применением антитела к Ηυγ1.

Материалы и способы.

Штаммы СапФйа и условия роста.

С. а1Ысапк 15663, С. д1аЪга!а 31028, С. рагаркйоык 22019 и С. ЦорюаЬк 4243 являются клиническими изолятами из потока крови, полученными от Медицинского центра иСЬА в Харборе. С. кгике1 91-1159 был любезно предоставлен Майклом Риналди из Сан-Антонио, штат Техас. Штаммы С. а1Ысапк СААН31 и ТНЕ31 были получены генно-инженерным путем, как сказано в нашем предыдущем исследовании, и доксициклин использовали для регулирования экспрессии ΗΥΚ1, как сказано у Луо и др. [Ьио е1 а1., ί. 1п1сс1. Όίκ. 201: 1718-1728 (2010)]. Все испытанные штаммы были обычным образом выращены в среде ΥΡΌ (2% бактопептона, 1% экстракта дрожжей, 2% декстрозы). Плотности клеток определяли путем подсчета в гемацитометре.

Продуцирование ΓΗγτΐρ-Ν.

ΓΗγΓΐρ-Ν, помеченный 6ΧΗικ, продуцировали в Е. сой и очищали аффинной колонкой с Νΐагарозой, как было описано ранее [Ьио е1 а1., I. 1п£еск Όίκ. 201: 1718-1728 (2010)]. Эндотоксин удалили из ΓΗγΓΐρ-Ν, используя набор Рго1еоБрш для удаления эндотоксина (компания Шгдеп Вю1еск Согрогайоп, Онтарио, Канада), и уровень эндотоксина определяли с помощью эндохрома лизата амебоцитов мечехвоста (Сйаг1ек Кщег ЬаЪогаШпек, Уилмингтон, Массачусетс) согласно инструкции изготовителя. При использовании этой процедуры эндотоксин был уменьшен до уровня <0,1 ЕИ на дозу вакцины.

Поликлональные антитела синтезированных пептидов и кролика к Ηγτΐρ.

Восемь пептидов, производных от ΓΗγΓΐρ-Ν (табл. 1) были коммерчески синтезированы и использовались для создания антител к Ηγτΐρ. Пептиды имели чистоту >85%, которая была определена ЖХВР и масс-спектрометрией (компания СепБспрЕ Пискатауэй, Нью-Джерси). Они были конъюгированы с гемоцианином фиссуреллы (ΚΌΗ) перед отдельным выращиванием антисыворотки кролика с использованием стандартного протокола иммунизации (компания СепБспрЕ Пискатуэй, Нью-Джерси). Весь 1дС из

- 27 025831 смешанной сыворотки был аффинно очищен с использованием протеина А Иегсе плюс агароза (компания ТЬегто Зшеиййс, Рокфорд, Иллинойс) согласно инструкции изготовителя перед введением в ходе исследований пассивной иммунизации.

Иммунофлуоресцентное обнаружение клеточной локализации Иуг1р.

Косвенную иммунофлуоресценцию выполнили, используя смешанный кроличий 1§С к Иуг1р, выращенный против 8 пептидов η^Γ^-Η, как было описано раньше [Ьио е1 а1., ί. 1иГес1. Όίδ. 201: 17181728 (2010)]. Вкратце, бластоспоры С. а1Ысаг18 (1х10⁷) предварительно проращивали в ΚΡΜΙ 1640 в течение 90 мин при 37°С и перенесли на предметное стекло с 4 лунками (компания Иа1де Ииис Iиΐе^иайоηа1). После инкубации при 4°С в течение 30 мин клетки блокировали с помощью 300 мкл 1,5% сыворотки мыши, затем окрашивали раствором 1:500 или 1) смешанного 1§О к Иуг1, 2) смешанного 1§О к Иуг1р, абсорбированного гифами С. аЫсаик (путем четырехкратной инкубации смешанного 1§О с гифами (1х10⁷) С. а1Ысаг15 в течение 30 мин, каждый раз на льду), или 3) контрольного 1§О кролика. Клетки контрастно окрашивали помеченным флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) 1§С козы, являющимся антителом к кролику, с разбавлением 1:100 перед получением изображений с помощью флуоресцентного микроскопа Ахю8кор от компании 2е188.

Протокол иммунизации и исследования на животных.

Все активные вакцинации проводили, как было описано раньше [Ьио е1 а1., ί. йГесб Όίδ. 201: 17181728 (2010)] Вкратце, молодых (10-12 недель) мышей Ва1Ь/С вакцинировали подкожно 30 мкг гИуг1р-Н в смеси с квасцами (2% Альгидрогель; компания ВгеиЩад Вю8есЮг, Фредериксзунд, Дания) в качестве адъюванта в фосфатном буферном физрастворе (ΡΒδ) в день 0, вводили такую же бустер-дозу в день 21, затем инфицировали через хвостовую вену в день 35 [1ЬгаЫт е1 а1., ПтГесб 1ттии. 73:999-1005 (2005)]. Контрольных мышей вакцинировали только квасцами.

Для проверки эффективности вакцины у иммунодефицитных мышей их вакцинировали перед индукцией нейтропении путем интраперитонеальной инъекции циклофосфамида в количестве 200 мг/кг в день -2, после чего вводили еще одну дозу 100 мг/кг в день +7 относительно инфицирования. Этот режим приводит приблизительно к 10 суткам лейкопении с уменьшением числа нейтрофилов, лейкоцитов и моноцитов, как было описано раньше [Зре11Ьег§ е1 а1., 1иГес1. 1ттии. 73:6191-6193 (2005); Ри е1 а1., ЕикагуоР Се11. 7:483-492 (2008); ЗЬеррагб е1 а1., АийтюгоЬ. А§еи!8 СЬетоШег. 48:1908-1911 (2004)]. Для иммунокомпетентных и нейтропенических мышей различия в выживании между вакцинированными и вакцинированными адъювантом мышами сравнивали, используя критерий Мантела-Кокса.

пассивной иммунизации иммунный 1§С вводили интраперитонеально ранее не использовавшимся в опытах мышам за 2 ч перед внутривенной инъекцией С. а1Ысаг18. Контрольным мышам давали 1§С, совпадающий с изотипом (компания йитоуаОуе Ке8еагсЬ, ИЗА). Дозы 1§С повторили через 3 суток после инфицирования и выживание мышей контролировали ежедневно.

Количественное культивирование почек от вакцинированных или контрольных мышей инфицировали разными видами СаиФба в порядке, описанном раньше [1ЬгаЫт е1 а1., ШёсР 1ттии. 74:3039-3041 (2006)]. Вкратце, мышей инфицировали через хвостовые вены. Почки забрали через 3 суток после инфицирования, гомогенизировали, последовательно разбавили 0,85%-ным физраствором и количественно культивировали на среде ΥΡΌ, которая содержала 50 мкг/мл хлорамфеникола. Колонии подсчитали после инкубации предметных стекол при 37 °С в течение 24 -48 ч и результаты выразили как логарифм КОЕ на 1 г инфицированного органа.

Одновременно с экспериментом по грибковой нагрузке почки удалили асептически у двух мышей из каждой группы для гистопатологического исследования. Почки погрузили в фиксирующий раствор, содержащий цинк и формалин, до исследования. Фиксированные органы дегидрировали в спиртовых растворах, погрузили в парафин и сделали срезы толщиной 6 мкм. Срезы окрасили серебряным гексаметилентетрамином Гомори и исследовали под оптическим микроскопом |Эа\38 е1 а1., ЫесР 1ттии. 68:5953-5959 (2000)].

Ферментный иммуносорбентный анализ (ЕЬ1ЗА).

Для проверки того, индуцировали ли вакцина ЖуИр-И иммунную реакцию, титры антитела из проб сыворотки, взятых у вакцинированных и контрольных мышей, определяли анализом ЕЬ1ЗА в планшетах с 96 лунками, как были описано раньше [1ЬгаЫт е1 а1., 1иГес1. 1ттии. 73:999-1005 (2005)]. Каждую из лунок покрыли 100 мкл гИуг1р-Н в концентрации 5 мкг/мл в фосфатном буфере. Сыворотку мышей инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре после этапа блокирования с помощью Тп8-буферного физраствора (ТВЗ; 0,01 М Тп8 Η0 [рН 7,4], 0,15 М ИаС1), содержащего 3% бычьего сывороточного альбумина. Лунки промыли три раза раствором ТВЗ, содержащим 0,05% Тгееи 20, после чего еще три раза промыли ТВЗ. Вторичное козье антитело к мыши, конъюгированное с пероксидазой хрена (компания Зщта), добавили при конечном разбавлении 1:5000 и планшет затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки промыли ТВЗ и инкубировали с субстратом, содержащим 0,1М цитратного буфера (рН 5,0), 50 мг о-фенилендиамина (компания З1дта) и 10 мкл 30% Н₂О₂. Цвету дали развиваться в течение 30 мин, после чего реакцию прекратили путем добавления 10% Η^Ο₄и оптическую плотность (ОП) на 490 нм определили в устройстве для считывания микротитровального

- 28 025831 планшета. Отрицательные контрольные мыши получили только разбавитель и фоновую спектральную поглощательную способность вычли для проверяемых лунок, чтобы получить конечные показания ОП. Титр ЕЬ1§Л взяли как обратную величину от последнего разбавления сыворотки, которое дало положительное показание ОП (т.е. больше, чем среднее показание ОП отрицательных контрольных проб плюс 2 стандартных отклонения).

Блокирующий анализ Р(аЬ')₂.

Для изучения механизма защиты, опосредованного антителами к Нуг1р в опосредованном фагоцитами умерщвлении С. а1Ысап8, использовали клетки НЬ-60, которые были дифференцированы по нейтрофилподобному фенотипу с [Ьио с1 а1., 1. СтГесЬ Όΐ8. 201: 1718-1728 (2010)]. Анализ умерщвления выполнили в присутствии фрагментов 1§С или Р(аЬ)₂ к Нуг1р, как было описано раньше [Ьио с1 а1., 1. [пГесЬ Όίδ. 201: 1718-1728 (2010)]. Вкратце, клетки НЬ-60 индуцировали с помощью 2,5 мкМ ретиноловой кислоты и 1,3% ДМСО в течение трех суток при 37 °С с 5% СО₂. Смешали иммунные сыворотки с пептидами к Нуг1 (табл. 1) и выделили весь 1§С, используя агарозу белка А (компания ТНегто §шепййс). Сыворотка, взятая у тех же кроликов перед иммунизацией пептидами, служила в качестве контрольной сыворотки. Фрагменты Р(аЬ)₂ из иммунного или контрольного 1§С очистили, используя набор компании Йетсе для подготовки Р(аЬ)₂ согласно инструкции изготовителя. Анализ δΌδ-РАСЕ показал, что >95% фрагмента Рс было переварено этим набором (данные не приведены). Далее, клетки С. а1Ысап8, сверхэкспрессирующие или подавляющие Нуг1р [Ьио е1 а1., 1. 1пГес1. Όίδ. 201: 1718-1728 (2010)], инкубировали с 50 мкг/мл фрагментов Р(аЬ)₂ из вакцинированной или контрольной группы на льду в течение 45 мин. С. а1Ысап8, культивированную совместно с фрагментами Р(аЬ)₂, инкубировали с НЬ-60-производными нейтрофилами в течение 1 ч при 37°С с 5% СО₂ перед обработкой ультразвуком и количественным культивированием на планшетах с ΎΡΌ. Процент умерщвления вычислили путем деления числа КОЕ после совместного культивирования с НЬ-60-производными нейтрофилами на число КОЕ от С. а1Ысап8, инкубированной со средами без нейтрофилоподобных клеток.

Статистический анализ.

Непараметрический критерий Мантела-Кокса был использован для определения различий во времени выживания мышей. Анализ нейтрофильного умерщвления, титры антитела и грибковую нагрузку на ткань сравнили по И-критерию Манна-Уитни для непарных сравнений. Корреляции вычислили по коэффициенту корреляции Спирмена. Значения Р <0,05 были сочтены значащими.

Все процедуры с мышами были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Института биомедицинских исследований Лос-Анджелеса для проекта 11672-05 специфически для этого исследования вакцины согласно Рекомендациям Национальных институтов здравоохранения по размещению животных и уходу за ними, институт имеет утвержденный Министерством здравоохранения и социальных служб США номер обеспечения благополучия животных А3330-01.

Результаты.

Вакцина гНуг1р-Ы значительно улучшила выживание и снизила грибковую нагрузку у иммунокомпетентных мышей, внутривенно инфицированных С. а1Ысап8.

Для определения наиболее эффективной дозы иммуногена гНуг1р-Ы оценили диапазон трехкратной дозы (1-30 мкг на 1 мышь). Молодых самок мышей ВАЬВ/с иммунизировали, используя гНуг1р-Ы плюс квасцы (2% Альгидрогеля; компания Втепи1ад Вю8ес1ог) или только квасцы. Этих мышей затем инфицировали летальным инокулятом С. а1Ысап8 (7х10⁵ бластоспор). Вакцинированные мыши имели значительные улучшения в выживании по сравнению с адъювант-ными контрольными мышами (фиг. 1А). Все испытанные дозы, за исключением 1 мкг, продлевали или улучшали выживание по сравнению с мышами, получившими только адъювант, и было установлено, что реакция на дозы 10 и 30 мкг имела наибольшую эффективность (фиг. 1А). Эксперимент прекратили в день 28, причем все оставшиеся мыши выглядели здоровыми.

Для того чтобы определить воздействие вакцинации на грибковую нагрузку, молодых мышей вакцинировали и инфицировали так, как сказано выше. В день 3 после инфицирования (за один день до того, как контрольные мыши по прогнозу должны были умереть в предыдущем эксперименте), мышей подвергли эвтаназии и забрали почки, являющиеся первичным целевым органом, чтобы определить грибковую нагрузку на ткань. Вакцинация уменьшила грибковую нагрузку на ткань приблизительно в 16 раз по сравнению с контрольными мышами (р < 0,01) (фиг. 1В).

Равным образом с данными по выживанию и грибковой нагрузке гистопатологическое исследование почек, взятых у мышей, вакцинированных гНуг1р-Ы, продемонстрировало очень мало абсцессов с минимальными грибковыми остатками, в основном присутствующими в бластоспорной формации (фиг. 2В). Наоборот, многочисленные абсцессы, полные грибковых клеток, имеющих по большей части формы дрожжей с некоторыми гифами и псевдогифами, были обнаружены в почках мышей, вакцинированных только квасцами (фиг. 2А). Полуколичественная оценка тяжести инфекции показала значительное уменьшение абсцессов на 1 поле, а также уменьшенное число клеток СаиФйа на 1 абсцесс у вакцинированных мышей по сравнению с контрольными (фиг. 2С, Р < 0,0001 по ранговому критерию Уилкинсона).

гНуг1р-Ы эффективно защищает иммунодефицитных мышей от кандидоза.

Известно, что значительная доля иммунодефицитных пациентов не реагирует на разные вакцины

- 29 025831 [Оосктей е! а1., вакцина 17:2779-2785 (1999); СйокерйшЪШкй е! а1., вакцина 22:2018-2022 (2004); йок 8ап!ок е! а1., АГО§ Ке8. Нит. Кей^иикек 20:493-496 (2004); Ктд е! а1., РеФайс. 1пГес!. Όίκ. 15:192-196 (1996)]. Мы хотели определить потенциальное использование вакцины гНуг1р-Ы для защиты нейтропенических мышей от рассеянного кандидоза. У иммунизированных мышей взяли кровь через 12 суток после бустер-дозы 30 мг гНуг1р-Ы. Вакцинация значительно повысила иммунную реакцию мышей, что было определено путем обнаружения увеличенных титров антитела к гНуг1р-Ы (фиг. 3А). Через сутки после взятия крови мыши стали нейтропеническими. Вакцинация привела к значительным улучшениям в выживании (Р = 0,007 по критерию Мантела-Кокса против контрольных мышей) (фиг. 3В).

Мы также оценили грибковую нагрузку на почки в день 10 после инфицирования. Согласно нашему результату по выживанию мы обнаружили, что мыши, вакцинированные 30 мкг гНуг1р-Ы, имели снижение грибковой нагрузки в 1,50 раза по сравнению с почками, взятыми у контрольных мышей (фиг. 3С, Р=0,0021 по ранговому критерию Уилкинсона).

Пассивная иммунизация иммуноглобулином 1дО к Нуг1 продлила выживание мышей, инфицированных С. А1Ысапк.

Поскольку некоторые пациенты могут не реагировать на активную стратегию вакцинации, мы оценили возможность использования пассивной иммунотерапии, нацеленной на Нуг1р. Мы подготовили поликлональные антитела путем вакцинации кроликов восемью гидрофильными, высоко антигенными 14-мер пептидами, расположенными в области гНуг1р-Н (табл. 1). Очищенные 1дО, нацеленные на эти 8 гидрофильных пептидов, были смешаны с использовались для лечения ранее не участвовавших в экспериментах мышей, инфицированных летальной дозой С. а1Ысапк. Мыши, получившие 1дО к Нуг1р в дозе 1 или 3 мг (но не при введении 0,3 мг) получили существенную защиту от инфекции по сравнению с мышами, получившими неспецифический контрольный 1дО от коммерческого источника (фиг. 4А, В и С).

Для того чтобы определить, усилили ли созданные антитела к Нуг1р функцию фагоцитов путем повышения опсонофагоцитоза или нейтрализации вирулентной функции Нуг1р, мы выделили и подготовили фрагменты Р(аЪ)₂ из смешанного 1дО, выращенного против 8 пептидов Нуг1р, или из совпадающего с изотипом контрольного 1дО. Эти фрагменты использовали в анализе нейтрофильного умерщвления НЬ60-производных клеток против С. а1Ысапк, условно сверхэкспрессирующих или подавляющих Нуг1р, а не С. а1Ысапк дикого типа, чтобы продемонстрировать специфичность этих фрагментов к Нуг1р, а не к другим членам семейства Ιίί [й'ЕпГег е! а1., №с1еаг АФйк Кек. 33:0353-357 (2005)]. Согласно с нашими предыдущими данными по 1дО для мышей [Ьио е! а1., I. ПтГесС Όίκ. 201: 1718-1728 (2010)], мы обнаружили, что фрагменты Р(аЪ)₂, приготовленные из антитела к Нуг1р, но не фрагменты, приготовленные из контрольных антител, смогли восстановить умерщвление НЬ-60-производными нейтрофилами условного экспресси-рующего штамма НУК1 до уровней, эквивалентных уровню подавляющего штамма (фиг. 4Ό).

Для проверки того, что защита, активированная антителами, действительно была вызвана антителами к Нуг1р, а не была неспецифической защитой, вызванной антителами, реагирующими на несвязанный иммуноген (например, антителами к КЬН), очищенный 1дО, нацеленный на 8 гидрофильных пептидов гНуг1р-Ы, абсорбировали гифами С. а1Ысапк перед проверкой на их защитную активность против кандидоза, рассеянного в крови. Абсорбированный 1дО не окрашивал гифы С. а1Ысапк (фиг. 5А), указывая на то, что 1дО к Нуг1р был устранен. Кроме того, подобно контрольному 1дО (т.е. неспецифическому 1дО от коммерческого источника), абсорбированный 1дО не защитил мышей от инфекции С. а1Ъ1сапк, тогда как неабсорбированный очищенный 1дО защитил (фиг. 5В, р=0,002). Эти результаты подтверждают специфичность антител к гНуг1р при защите от кандидоза, рассеянного в крови.

Вакцина гНуг1р-Ы существенно снизила грибковую нагрузку на ткань у мышей ВАЬВ/с, инфицированных несколькими видами не относящимися к СапФйа а1Ысапк.

Вакцина, которая активирует защиту от С. а1Ысапк и других видов не а1Ъюапк, крайне желательна, поскольку значительное число инфекций СапФйа вызываются видами, не относящимися к а1Ысапк. Например, С. д1аЪга!а представляет вторую наиболее распространенную причину кандидоза и С. ктике1 стойкая к азольной терапии. Используя поиски возбудителей, мы смогли обнаружить ортологи Нуг1р-Ы в нескольких видах СапФйа со сходством аминокислот в диапазоне 47-72% в определенной области. Так, мы вакцинировали мышей гНуг1р-Ы плюс квасцы, как сказано выше, затем инфицировали их С. а1Ысапк, С. д1аЪга!а, С. кгикек С. рагаркйоык или С. !горюайк. Через трое суток после инфицирования мышей умертвили и взяли у них почки для определения грибковой нагрузки на ткань посредством подсчета колоний. Мыши, вакцинированные гНуг1р-Ы, имели 0,65-1,69 логарифмическое снижение в грибковой нагрузке на почки по сравнению с мышами, вакцинированными только квасцами (фиг. 6).

Мы идентифицировали свойства рекомбинантного №конца Нуг1р (гНуНр-’И) [Ьио е! а1., I. 1пГес!. Όίκ. 201: 1718-1728 (2010)], которые делают его подходящим для целей активной и пассивной иммунотерапии. Поликлональный 1дО кролика, выведенный против 8 разных 14-мерных пептидов из участков гНуг1р-Ы, существенно защищает мышей от экспериментального рассеянного кандидоза. Кроме того, гНуг1р-Ы сохранил свою эффективность в модели нейтропенических мышей.

Грибковая нагрузка на ткань и гистопатологическое исследование почек, взятых у мышей, вакци- 30 025831 нированных гНуг1р-Ы или только квасцами, подтвердили эффективность вакцины гНуг1р-Ы. Однако при гистопатологии разница между контрольными (фиг. 2А) и вакцинированными гНуг1р-Ы мышами (фиг. 2В) была намного более выраженной чем разница в грибковой нагрузке на ткань в тех же органах. В этом отношении ранее сообщалось, что метод подсчета колоний может недооценивать грибковую нагрузку на ткань в присутствии гиф и псевдогиф [§ре11Бег§ еί а1., ί. ΕαΛοα ΒίοΙ. 78:338-344 (2005), §ре11Бег§ еί а1., ί. ШесЕ Όίκ. 194256-260 (2006)], вероятно потому, что гомогенизация ткани убивает грибковые нити. Мы обнаружили, что у контрольных мышей было значительно больше нитевидных грибков в почках чем у вакцинированных мышей, которые имели меньше абсцессов, в основном состоящих из грибковых элементов дрожжевой формы. Поэтому вероятно, что гомогенизация ткани искусственно снижает число колоний в почках, взятых у контрольных мышей, но не у мышей, вакцинированных гНуг1р-Ы, делая разницу менее выраженной.

Наши результаты также показывают реакцию на дозу ΙβΟ к Нуг1р при защите мышей от рассеянного кандидоза. Мы также подтвердили, что защита, активируемая Ι§Ο к Нуг1р, является специфической к Нуг1р, поскольку абсорбированный Ι§Ο при гифах С. а1Бюапк теряет свою способность защищать мышей от кандидоза, рассеянного в крови (фиг. 5В). Эти результаты предполагают, что механизм защиты, придаваемый гНуг1р-Ы, кажется относится, по меньшей мере, отчасти, к защитной реакции антитела.

В этом исследовании мы показали, что смешанный Ι§Ο, выведенный против 8 пептидов Нуг1, непосредственно нейтрализует функцию Нуг1р стойкости к фагоцитарному умерщвлению, а не усиливает опсонофагоцитоз. Это очевидно по способности фрагментов Р(аБ)₂ (приготовленных из антитела к гНуг1р-Ы) восстанавливать фагоцитарное умерщвление С. а1Ысапк, сверхэкспрессируя Нуг1р до уровней, эквивалентных подавляющему штамму (фиг. 4Ό). Однако вакцина гНуг1р-Ы сохранила свою эффективность у нейтропенических мышей. Это можно объяснить тем фактом, что циклофосфамид индуцирует лейкопению у мышей с минимальным воздействием на фагоциты ткани.

В заключение, вакцина гНуг1р-Ы эффективна как для иммунокомпетентных, так и для иммунодефицитных мышей, если она смешана с квасцами в качестве адъюванта, против многих клинически выделенных штаммов С. а1Ысапк и против нескольких видов, не относящихся к СапШйа а1Ысапк.

Пример ΙΙ. Фрагменты белка НУК1 предотвращают инфекцию Αс^ηеίοБасίе^ Ьашпаппн.

СапШйа а1Ысапк является диплоидным грибком, который растет и как дрожжи, и как нитевидные клетки. С. а1Бюапк вызывает приблизительно 60000 случаев рассеянного кандидоза в год в США. Белок НУК1 С. а1Ысапк является белком клеточной поверхности, который придает грибковым клеткам стойкость к фагоцитам белыми кровяными тельцами во время грибковых инфекций. Было доказано, что вакцинация рекомбинантным белком НУК1 защищает мышей от инфекции СапШйа. Более того, пассивная иммунизация антителом к белку НУК1 защищает от кандидоза, рассеянного в крови.

Посредством моделирования прогнозной гомологии структуры было выявлено, что белок НУК1 С. а1Бюапк имеет значительную гомологию к нескольким белкам грамотрицательных бактерий, включающих Αс^ηеίοБасίе^ Баитаппи. Следовательно, была изучена возможность использования активной и пассивной иммунизации, нацеленной на белок НУК1, для защиты от Αс^ηеίοБасίе^ Баитаппи.

Были выполнены трехмерные исследования гомологии структуры с использованием конвергентных способов моделирования структурной гомологии. Они включают выравнивание множественных последовательностей, соединение со структурными гомологами на основании идентичности и сходства последовательностей и трехмерное структурное моделирование. Этот анализ показал, что полноразмерный полипептид НУК1 СапШйа имеет значительную гомологию с белками нескольких грамотрицательных бактерий, включая виды Наеп-юркИнк, Βο^άеίе11а, δа1тοηе11а, Βο^άеίе11а, Уегкта, ЕксЬепсЫа и Αс^ηеίοБас1ег (табл. 3).

- 31 025831

Таблица 3

Моделирование гомологии первичной и втовнчвой структуры вакцины Нуг1

ΡΡΒ -код	(ссылка Ичсипииость		Точность	СупеЖСМеАСТВФ	Соеиймчесипй гомолог	Орнгвв. негодный нагого*
2о(И	12%	0.0016	95%	Лдтнииет Л	Фаяор вндеяекпюсгн НКГАН Наетер(п/иыл/1г1еигае(С·)
ЫаВ	11%	0,06	95%	Пбхгин-лнйЗД	Пертйюия рб9 вирулентности	ЗогЗекЦа ремизное-)
1луЮ	2%	ο,υ	90%	Жгупаовдетедо	Жгутиковой крючок (П$Е)
1пуК	9%	0,26	90%	Пектин-ша»	Домен секреции РН (ЙЬаВ)	Βοη&ίβΙΙα регй«зи(0-)
	8%	0,37	85%	Имваиш	Белок, связывающий кпегрнн Уегашл/ззадкЛо&бег
1Д)О	8%	0,86	75%	Хоидрошииа»	Хондроитина» В	ЕгсДепсЛмо соЛ(С-)
1<нЦ	14%	0,93	75%	Белокютн	Стержень нити аденовируса	,4 (/еп тпиз (вирусный)
1ш£	11%	1	75%	6и<к»п^но1пропел1ерСемс<>р*£Цй домен мнаэд	Мусекос) (нЬенси1о;и{0+)
1оЯ-	9%	1,2	70%	Пекши лиаза	Хридрош-нкато В	Ре<1о(>ас1ег 1)ерагти1(С-)
2ζ2Ω	7%	1,4	65%	Лига	Лига внрщкиамниина В	5)ар1п1ос/>сси! оигеиХОк)

На основе структурного анализа γΗΥΚΓ-Ν (8Е0 ГО N0: 2) был продуцирован в Е. сой и использовался для активной вакцинации мышей. Мышей иммунизировали только гидроксидом алюминия (η=10) или ΓΗΥΚ1ρ-Ν (30 мг) в смеси с гидроксидом алюминия (η=9) в день 0 и вводили им бустер-дозу в день 21. Вакцинированных мышей затем инфицировали А. Ъаитагтй в день 35. Вакцинированные мыши имели 67% выживания по сравнению с 10% выживания в контрольной группе (р <0,05 по критерию Мантела-Кокса) (фиг. 7). Помимо этого, исследовали бактериальную нагрузку в ткани вакцинированных и инфицированных мышей. Бактериальная нагрузка, которую определили по числу колониеобразующих единиц на 1 г ткани, показала, что изоляты ткани из почек, легких и селезенки имели более низкую бактериальную нагрузку по сравнению с пробами контрольной ткани (фиг. 8).

Затем были взяты поликлональные антитела у кроликов против восьми специфических полипептидных участков, выбранных из белка ΗΥΚ1. Эти участки были структурно картированы, чтобы быть открытыми гидрофильными участками экспрессии С. (йЫсащ и по прогнозам должны быть высоко антигенными. Эти восемь специфических полипептидных участков состояли из 14 аминокислотных остатков плюс дополнительный цистеиновый участок на Ν-конце или С-конце полипептида (табл. 2). Концевые цистеиновые участки предназначались для прикрепления к белку-носителю, гемоцианину фиссуреллы (ΚΣΗ), который использовали для продуцирования поликлональных антител.

Общая пассивная иммунизация против инфекции АсЙ1е(оЪас(ег Ьаитагти была проанализирована на диабетических мышах. Очищенные 1§С из восьми разных поликлональных антител, созданных как сказано выше, смешали и дали диабетическим мышам (η=20) за 2 ч до инфицирования. Имеющийся в продаже несвязанный 1§С кролика дали диабетическим контрольным мышам (η=18). Затем мышей инфицировали летальной дозой Лсше1оЪас1ег Ъаитагтй путем инъекции в хвостовую вену. Мыши, получившие одну дозу 1§С к Цуг1р. выживали значительно дольше чем мыши, получившие контрольный 1дС (т.е. 80% выживания в группе 1§С к Цуг1р против 0% в контрольной группе, р<0,0001 по критерию Мантела-Кокса) (фиг. 9).

Пассивная иммунизация поликлональными антителами против индивидуальных аминокислотных последовательностей также была проанализирована у диабетических мышей, инфицированных Асше1оЪас(ег Ъаиташш. За 2 ч перед инфицированием диабетическим мышам дали 1 мг контрольного 1§С кролика (η= 18) или поликлональный 1§С к полипептиду ΗΥΚ1, выведенный индивидуально против одного из восьми разных синтетических пептидов ΗΥΚ1 (табл. 2). Помимо этого, были проанализированы две отдельных сочетания смеси антител. Сочетание 1 включало антитела № 2, 3, 5 и 8, и сочетание 2 включало антитела № 2, 5 и 8. Антитела, выведенные против пептида № 5 (8Е0 ГО Ν0: 15) защитили мышей от инфекции Лсте1оЪас1ег Ъаитаηη^^ в степени, подобной смеси антител (т.е. 86% выживания с антипептидом 5 АЪ против 80% выживания со смесью 1§С). Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 10.

Пример III. Антитело к ΗΥΚ1 связывает специфические белки, экспрессируемые Асте1оЪас1ег Ъаиташйк

Экстракты клеточных стенок АсЙ1е(оЪас(ег Ъаитаηη^^ были пропущены на двухмерном геле и проанализированы вестерн-блоттингом с использованием 1§С кролика, выведенным против СЬКЫАУ- 32 025831

ΤΥΩΟΓΥΕΝΝ (δΕΟ ΙΌ N0: 15). Блоты сравнили с предиммунной сывороткой в качестве контрольной. 1дО к ΗΥΚ1 распознавал уникальные полосы в экстрактах клеточных стенок (фиг. 11). Выбранные споты экстрагировали и секвенировали. Анализ секвенирования показал, что антитело к ΗΥΚ1 перекрестно реагировало с несколькими белками, включая белок 1 наружной мембраны оГ Асше1оЬас(ег Ьаитаппи (ΟΙ № |126642014| ОепВапк ^еГ|ΥР_001084998.1|) (δΕΟ ΙΌ N0: 19), белок 2 наружной мембраны АстеГОЬасЮг Ьаитаппи (ΟΙ № |126640296| ОепВапк ^еГ|ΥР_001083280.1|) (δΕΟ ΙΌ N0: 20), белок рецептора с сидерофорной активностью к железу Асте1оЬас1ег Ьаитаппи (включающий ΟΙ № |126641700| ОепВапк геГ[УР_001084684.1| (δΕΟ ΙΌ N0: 21); ΟΙ № |126640547| ОепВапк кеГ^Р_001083531.1| (δΕΟ ΙΌ N0: 22); ΟΙ № |126643331| ОепВапк ^еГ|ΥР_001086315.1|) (δΕΟ ΙΌ N0: 23), белок теплового шока Опак Асше(оЬас!ег Ьаитаппи (6Ι № |126642981| ОепВапк ^еГ|ΥР_001085965.1|) (δΕΟ ГО N0: 24), фактор элонгации О Асте(оЬас1ег Ьаитаппи (6Ι № |126640918| ОепВапк ^еГ|ΥР_001083902.1|) (δΕΟ ГО N0: 25), прекурсор белка толерантности к органическому растворителю Асше1оЬас(ег Ьаитаппи (6Ι № |126641591| ОепВапк геГ[УР_001084575.1|) (δΕΟ ГО N0: 26), трансмембрану предполагаемого прекурсора липопротеина (УасТ) Асте(оЬас1ег Ьаитаппи (6Ι № |126640689| ОепВапк ^еГ|ΥР_001083673.1|) (δΕΟ ГО N0: 27), предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный 0ргВ) Асте1оЬас1ег Ьаитаппи (6Ι № |126642873| ОепВапк ге^Р_001085857.11) (δΕΟ ГО N0: 28), составной белок мембраны АбеА Асте1оЬас1ег Ьаитаппи (6Ι № |126641797| ОепВапк ^еГ|ΥР_001084781.1|) (δΕΟ ГО N0: 29), белок деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппи (6Ι № |126643339| ОепВапк ге^Р_001086323.1|) (δΕΟ ГО N0: 30) и белок ΕΐκΖ деления клеток Асте(оЬас1ег Ьаитаппи (ОТ № |126643338| ОепВапк геГ^Р_001086322.1|) (δΕΟ ГО N0: 31).

Другие варианты осуществления.

Все публикации, включая публикации номеров ОепВапк и 6Ι, патенты и патентные заявки, упомянутые в вышеприведенном описании изобретения, включены в настоящий документ путем ссылки. Разные модификации и вариации описанных способов изобретения будут очевидны специалистам в данной области без нарушения объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано в связи со специфическими вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно быть ограничено такими специфическими вариантами осуществления. В действительности, предполагается, что разные модификации описанных режимов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в данной области, входят в объем изобретения.

Другие варианты осуществления изложены в формуле изобретения.

- 33 025831

Перечень последовательностей <110> НОВАДИГМ ТЕРАПЬЮТИКС, инк.

<120> КОМПОЗИЦИИ ИЗ ΗΥΚ.Ι-ПРОИЗВОДНЫХ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ими <130> 50665-013\УО2 <140> РСТ/Ы812/55604 <141> 2012-09-14 <150> 61/564,201 <151> 2011-11-28 <150> 61/534,734 <151> 2011-09-14 <160> 31 <170> Ра1епИп уегзюп 3,5 <210> 1 <211> 937 <212> РКТ <213> Сат1к1а а№кап$ <400> 1

Ме1 Ьуз Уа1 Уа1 Зег Αδη РЬе Не РЬе ТЬг Пе Ьеи Ьеи ТЬг Ьеи Азп

10 15

Ьеи Зег А1а А1а Ьеи О1и Уа1 Уа1 ТЬг Зег Ага Пе Авр Аг§ <Э1у О1у 20 25 30

Пе О1п О1у РЬе ΗΪ5 О1у Азр Уа1 Ьуз Уа1 ΗΪ8 Зег О1у А1а ТЬг Тгр 35 40 45

А 1а Пе Ьеи 01у ТЬг ТЬг Ьеи Суз Зег РЬе РЬе О1у О1у Ьеи 01и Уа1 50 55 ЙО <31и Ьуз О1у А1а Зег Ьеи РЬе Пе Ьуз Зег Азр Азп С1у Рго Уа1 Ьеи 65 70 75 80

А1а Ьеи Азп Уа1 А1а Ьеи Зег ТЬг Ьеи Уа1 Аг§ Рго Уа1 Пе Азп Азп 85 90 95

О1у Уа1 Ие Зег Ьеи Азп Зег Ьуз Зег Зег ТЬг Зег РЬе Зег Азп РЬе 100 105 110

Азр Ие О1у <31у Зег Зег РЬе ТЬг Азп Азп О1у О1и Ие Туг Ьеи А1а 115 120 125

- 34 025831

8ег Зег <31у Ьеи Уа1 Ьуз Зег ТЬг А1а Туг Ьеи Туг А1а Аг® 01и Тгр 130 135 140

ТЬг Азп Азп С1у Ьеи Не Уа1 А1а Туг О1п Азп <31п Ьуз А1а А1а 01у 145 150 155 160

Азп Пе А1а РЬе О1у ТЬг А1а Туг О1п ТЬг Пе ТЬг Азп Азп С1у О1п 165 170 175

Не Суз Ьеи Аг® Шз С1п Азр РЬе Уа1 Рго А1а ТЬг Ьуз Пе Ьуз О1у 180 185 190

ТЬг О1у Суз Уа1 ТЬг А1а Азр О1и Азр ТЬг Тгр Пе Ьуз Ьеи О1у Азп 195 200 205

ТЬг Не Ьеи Зег Уа101и Рго ТЬг Шз Азп РЬе Туг Ьеи Ьуз Азр Зег 210 215 220

Ьуз Зег Зег Ьеи Не Уа1 Шз А1а Уа1 Зег Зег Азп О1п ТЬг РЬе ТЬг 225 230 235 240

Уа1 Шз О1у РЬе О1у Азп О1у Азп Ьуз Ьеи О1у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Ьеи 245 250 255

ТЬг О1у Азп Аг® Азр Шз РЬе Аг® РЬе О1и Туг Туг Рго Азр ТЬг О1у 260 265 270

Не Ьеи О1п Ьеи Аг® А1а А1а А1а Ьеи Рго О1п Туг РЬе Ьуз Не С1у 275 280 285

Ьуз О1у Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЬе Аг® Пе Уа1 Азп Зег Аг® 01у Ьеи 290 295 300

Ьуз Азп А1а Уа1 ТЬг Туг Азр О1у Рго Уа! Рго Азп Азп О1и Пе Рго 305 310 315 320

А1а Уа1 Суз Ьеи Пе Рго Суз ТЬг Азп О1у Рго Зег А1а Рго О1и Зег 325 330 335

С1и Зег Азр Ьеи Азп ТЬг Рго ТЬг ТЬг Зег Зег Пе О1и ТЬг Зег Зег 340 345 350

Туг Зег Зег А1а А1а ТЬг О1и Зег Зег Уа1 Уа1 Зег О1и Зег Зег Зег 355 360 365

- 35 025831

А1а Уа1 Акр 8ег Ьеи ТЬг Зег Зег Зег Ьеи Зег Зег Ьуз Зег 01и Зег 370 375 380

Зег Азр Уа1 Уа1 Зег Зег ТЬг ТЬг Азп Не О1и Зег Зег Зег ТЬг А1а 385 390 395 400

Не О1и ТЬг ТНг Ме( Азп Зег О1и Зег Зег ТЬг Азр А1а О1у Зег Зег 405 410 415

Зег Пе Зег О1п Зег О1и Зег Зег Зег ТЬг А1а Пе ТЬг Зег Зег Зег 420 425 430

О1и ТЬг Зег Зег Зег <31и Зег Ме( Зег А1а Зег Зег ТКг ТЬг А1а Зег 435 440 445

Азп ТЬг Зег Пе <31и ТЬг Азр Зег О1у Пе Уа] Зег О1п Зег О1и Зег 450 455 460

Зег Зег Азп А1а Ьеи Зег Зег ТЬг О1и О1п Зег Пе ТЬг Зег Зег Рго 465 470 475 480

О1у О1п Зег ТЬг Пе Туг Уа1 Азп Зег ТЬг Уа1 ТЬг Зег ТЬг Пе ТЬг 485 490 495

Зег Суз Азр <31и Азп Ьуз Суз ТЬг О1и Азр Уа1 Уа1 ТЬг Пе РЬе ТЬг 500 505 510

ТЬг Уа1 Рго Суз Зег ТЬг Азр Суз Уа1 Рго ТЬг ТЬг О1у Азр Пе Рго 515 520 525

Ме( Зег ТЬг Зег Туг ТЬг О1п Аг§ ТЬг Уа1 ТЬг Зег ТКг Пе ТЬг Азп 530 535 540

Суз Азр О1и Уа1 Зег Су5 Зег О1п Азр Уа1 Уа1 ТЬг Туг ТЬг ТЬг Азп 545 550 555 560

Уа1 Рго Н1з ТЬг ТЬг Уа1 Азр А1а ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг Зег ТЬг 565 570 575

С1у О1у Азр Азп Зег ТЬг О1у О1у Азп О1и Зег 01у Зег Азп Н1з О1у 580 585 590

Рго О1у Азп 01у Зег ТЬг О1и О1у Зег СПу Азп СПу Зег СПу А1а СПу 595 600 605

- 36 025831

Зег Азп С1и С1у Зег С1п Зег С1у Рго Азп Азп С1у Зег О1у Зег С1у 610 615 620

Зег О1и О1у О1у Зег Азп Азп О1у Зег О1у Зег Азр Зег О1у Зег Азп 625 630 635 640

Азп О1у Зег <31у Зег О1у Зег Азп Азп О1у Зег О1у Зег О1у Зег ТНг 645 650 655

О1и С1у Зег С1и О1у С1у Зег О1у Зег Азп С1и О1у Зег С1п Зег О1у 660 665 670

Зег О1у Зег Οίη Рго О1у Рго Азп С1и О1у Зег С1и С1у О1у Зег О!у 675 680 685

Зег Азп О1и О1у Зег Азп Шз О1у Зег Азп О1и 01у Зег О1у Зег О1у 690 695 700

Зег О1у Зег О1у Зег Азп Азп О1у Зег О1у Зег О1у Зег О1п Зег О1у 705 710 715 720

Зег С1у Зег С1у Зег О1п Зег С1у Зег О1и Зег С1у Зег Азп Зег С1у 725 730 735

Зег Азп О1и О1у Зег Азп Рго О1у А1а О1у Азп О1у Зег Азп О1и С1у 740 745 750

Зег С1у О1п С1у Зег <31у Азп С1у Зег О1и А1а О1у Зег 01у С1п О1у 755 760 765

Зег С1у Рго Азп Азп 01у Зег О1у Зег О1у Шз Азп Азр О1у Зег О1у 770 775 780

Зег О1у Зег Азп О1п О1у Зег Азп Рго О1у А1а 01у Зег О1у Зег О1у 785 790 795 800

Зег О1и Зег О1у Зег Азп А1а О1у Зег Шз Зег О1у Зег Азп С1и С1у 805 810 815

А1а Ьуз ТНг Азр Зег Ие О1и О1у РНе Шз ТНг О1и Зег Ьуз Рго С1у 820 825 830

РНе Азп ТНг О1у А1а Шз ТНг Азр А1а ТНг Уа1 ТНг О1у Азп Зег Уа1 835 840 845

- 37 025831

А1а Азп Рго Уа1 ТЬг ТЬг Зег ТЬг СНи Зег Азр ТЬг ТЬг Пе Зег Уа1 850 855 860

ТЬг Уа1 Зег Пе ТЬг Зег Туг Ме1 ТЬг СНу РЬе Аар С1у Ьуз Рго Ьуз 865 870 875 880

Рго РЬе ТЬг ТЬг Уа1 Аар Уа1 Пе Рго Уа1 Рго Ηι$ Зег Ме1 Рго Зег 885 890 895

Азп ТЬг ТЬг Азр Зег Зег Зег Зег \'а1 Рго ТЬг Пе Азр ТЬг Азп С1и 900 905 910

Азп О1у Зег Зег Пе Уа1 ТЬг СНу СНу Ьуз Зег Пе Ьеи РЬе СНу Ьеи 915 920 925

Пе Уа1 Зег Ме( Уа1 Уа1 Ьеи РЬе Ме( 930 935 <210> 2 <211> 326 <212> РКТ <213> СапНИа а1Ысапз <400> 2

ТЬг Зег Аг§ Не Азр Аг§ О1у С1у Пе СПп СНу РЬе Ηίϊ СНу Азр Уа1 15 10 15

Ьуз Уа1 Н1з Зег СНу А1а ТЬг Тгр А1а Пе Ьеи СНу ТЬг ТЬг Ьеи Суз 20 25 30

Зег РЬе РЬе СНу СНу Ьеи СНи Уа101и Ьуз О1у А1а Зег Ьеи РЬе Пе 35 40 45

Ьуз Зег Азр Азп СНу Рго Уа1 Ьеи А1а Ьеи Азп Уа1 А1а Ьеи Зег ТЬг 50 55 60

Ьеи Уа1 Аг§ Рго Уа1 Пе Азп Азп СНу Уа1 Пе Зег Ьеи Азп Зег Ьуз 65 70 75 80

Зег Зег ТЬг Зег РЬе Зег Азп РЬе Азр Не СНу СНу Зег Зег РЬе ТЬг 85 90 95

Азп Азп СНу СНи Пе Туг Ьеи А1а Зег Зег СНу Ьеи Уа1 Ьуз Зег ТЬг 100 105 НО

А1а Туг Ьеи Туг А1а Лг§ СНи Тгр ТЬг Азп Азп О1у Ьеи Пе Уа1 А1а

- 38 025831

ИЗ 120 125

Туг Οίη Азп О1п Ьуз А1а А1а О1у Азп Не А1а РЬе О1у ТНг А1а Туг 130 135 140

О1п ТЬг Пе ТЬг Азп Азп О1у О1п Не Суз Ьеи Агд Шз О1п Азр РЬе 145 150 155 160

Уа1 Рго А1а ТЬг Ьуз Пе Ьуз О1у ТЬг О1у Суз Уа1 ТЬг А1а Азр О1и 165 170 175

Азр ТЬг Тгр Пе Ьуз Ьеи О1у Азп ТЬг Пе Ьеи Зег Уа1 О1и Рго ТЬг 180 185 100

Шз Азп РЬе Туг Ьеи Ьуз Азр Зег Ьуз Зег Зег Ьеи Пе Уа1 Шз А1а 195 200 205

Уа1 Зег Зег Азп О1п ТЬг РЬе ТНг Уа1 Шз О1у РЬе О1у Азп С1у Азп 210 215 220

Ьуз Ьеи О1у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Ьеи ТЬг О1у Азп Агд Азр Шз РЬе Агд 225 230 235 240

РЬе О1и Туг Туг Рго Азр ТЬг О1у Пе Ьеи О1п Ьеи Агд А1а А1а А1а 245 250 255

Ьеи Рго О1п Туг РЬе Ьуз Пе О1у Ьуз 01у Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЬе 260 265 270

Агд Пе Уа1 Азп Зег Агд О1у Ьеи Ьуз Азп А1а Уа1 ТЬг Туг Азр О1у 275 280 285

Рго Уа1 Рго Азп Азп О1и Пе Рго А1а Уа1 Суз Ьеи Пе Рго Суз ТЬг 290 295 300

Азп О1у Рго Зег А1а Рго О1и Зег О1и Зег Азр Ьеи Азп ТЬг Рго ТНг 305 310 315 320

ТЬг Зег Зег Пе О1и ТЬг 325 <210> 3 <211> 14 <212> РКТ <213> СапОМа аПясапз

- 39 025831 <400> 3

01у Рго Зег А1а Рго О1и Зег О1и Зег Азр Ьеи Азп ТЬг Рго 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> РКТ <213> СашЬйа аНясапз <400> 4

О1у Азп Аг® Азр №з РЬе Аг® РЬе О1и Туг Туг Рго Азр ТЬг 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> РКТ <213> СапсПЬа а1Ысапз <400> 5

О1у Азп Аг® Азр №з РЬе Аг® РЬе О1и Туг Туг Рго Азр ТЬг 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> РКТ <213> СапйМа аНнсапз <400> 6

Ьуз Не Ьуз О1у ТЬг О1у Суз Уа1 ТЬг А1а Азр О1и Азр ТЬг 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> РКТ <213> СапбЫа аНнсапз <400> 7

Ьеи Ьуз Азп А1а Уа1 ТЬг Тут Азр О1у Рго Уа1 Рго Азп Азп 1 5 10 <210» 8 <211> 14 <212> РКТ <213> СапЬЫа а1Ысапз <400> 8

Азп Зег Ьуз Зег Зег ТЬг Зег РЬе Зег Азп РЬе Азр Пе О1у 1 5 10

- 40 025831 <210> 9 <211> 14 <212> РКТ <213> СапЛМа аНнсапз <400> 9

01и Рго ТЬг ΗΪ5 Азп РЬе Туг Ьеи Ьуз Азр Зег Ьуз Зег Зег 1 5 10 <2Ю> 10 <211> 14 <212> РКТ <213> СапЛЮа аПмсапз <400> 10

ТЬг 8ег Аг£ Пе Азр Аг§ С1у С1у Не С1п С1у РЬе Н1з С1у 1 5 10 <210> 11 <211> 15 <212> РКТ <213> СажПЛа аНнсапз <400> 11

Суз С1у Рго 8ег А1а Рго С1и Зег О1и 5ег Азр Ьеи Азп ТЬг Рго 15 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> РКТ <213> СапЛШа а1Ь1сапз <400> 12

Суз О1у Азп Аг§ Азр ΗΪ5 РЬе Аг£ РЬе О1и Туг Туг Рго Азр ТЬг 15 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> РКТ <213> СапЛМа а1Ысапз <400> 13

Суз О1у Туг Азр Зег Ьуз Ьеи РЬе Лг£ Пе Уа1 Азп Зег Аг§ О1у 15 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> РКТ <213> СапЛИа аНнсапз

- 41 025831 <400> 14

Суз Ьуз Пе Ьуз 01у ТНг СПу Суз Уа1 ТЬг А1а Азр 01и Азр ТЬг 15 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> РКТ <213> СапсППа аПмеапз <400> 15

Суз Ьеи Ьуз Азп А1а Уа1 ТЬг Туг Азр СПу Рго Уа1 Рго Азп Азп 15 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> РКТ <213> СапНМа аННеапз <400> 16

Азп Зег Ьуз Зег 8ег ТЬг Зег РЬе Зег Азп РЬе Азр Пе СПу Суз 15 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> РКТ <213> СапПЫа аПжапз <400> 17

Суз С1и Рго ТЬг Ηΐβ Азп РЬе Туг Ьеи Ьуз Азр Зег Ьуз Зег Зег 15 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> РКТ <213> СапПИа аИмсапз <400> 18

ТЬг Зег Аг§ Не Азр Аг& СПу 01у Пе О1п О1у РЬе Н1з О1у Суз 15 10 15 <210> 19 <211> 829 <212> РКТ <213> Ас1пе1оЬас1ег Ьаигоаппи <400> 19

Ме( Рго Ьеи А1а Ьеи Уа1 Зег А1а Ме( А1а А1а Уа1 О1п О1п А1а Туг 15 10 15

- 42 025831

А1а А1а Авр Авр РНе Уа1 Уа1 Агд Авр Не Агд Уа1 Авп 01у Ьеи Уа1 20 25 30

Агд Ьеи ТНг Рго А1а Авп Уа1 Туг ТНг Ме1 Ьеи Рго Пе Авп Зег О1у 35 40 45

Авр Агд Уа1 Авп С1и Рго Ме( Не А1а С1и А1а Пе Агд ТНг Ьеи Туг 50 55 60

А1а ТЬг О1у Ьеи РЬе Авр Авр Пе Ьув А1а Зег Ьув О1и Авп Авр ТЬг 65 70 75 80

Ьеи Уа1 РЬе Азп Уа1 Пе О1и Агд Рго Пе Пе Зег Ьуз Ьеи О1и РЬе 85 90 95

Ьуз О1у Азп Ьуз Ьеи Пе Рго Ьув О1и А1а Ьеи О1и О1п О1у Ьеи Ьув 100 105 ПО

Ьув Ме( О1у Пе А1а С1и О1у С1и Уа! РЬе Ьув Ьуз Зег А1а Ьеи О1п 115 120 125

ТНг Пе О1и ТЬг О1и Ьеи С1и О1п О1п Туг ТНг С1п С1п О1у Агд Туг 130 135 140

Авр А1а Авр Уа1 ТЬг Уа1 Авр ТЬг Уа1 А1а Агд Рго Авп Азп Агд Уа1 145 150 155 160

О1и Ьеи Ьув Пе Авп РЬе Азп О1и О1у ТНг Рго А1а Ьув Уа1 РНе Азр 165 170 175

Пе Авп Уа1 Не О1у Авп ТНг Уа! РЬе Ьув Авр Зег О1и Не Ьув С1п 180 185 190

А1а РЬе А1а Уа1 Ьуз О1и Зег О1у Тгр А1а Зег Уа1 Уа1 ТЬг Агд Авп 195 200 205

Азр Агд Туг А1а Агд О1и Ьуз Мег А1а А1а Зег Ьеи О1и А1а Ьеи Агд 210 215 220

А1а Ме1 Туг Ьеи Авп Ьув О1у Туг Пе Авп РНе Авп Пе Авп Азп Зег 225 230 235 240

О1п Ьеи Авп Пе Зег О1и Азр Ьув Ьуз Шз Пе РНе Пе О1и Уа1 А1а 245 250 255

- 43 025831

Уа1 Авр 01и О!у 8ег О1п РЬе Ьув РЬе 01у О1п ТЬг Ьув РЬе Ьеи 01у 260 265 270

Авр А1а Ьеи Туг Ьув Рго 01и О1и Ьеи О1п А1а Ьеи Ьув Пе Туг Ьув 275 280 285

Авр 01у Авр ТЬг Туг Зег О1п О1и Ьув Уа] Авп А1а Уа] Ьув О1п Ьеи 290 295 300

Ьеи Ьеи Аге Ьуз Туг О1у Авп А1а О1у Туг Туг РЬе А1а Азр Уа! Авп 305 310 315 320

Не Уа1 Рго О!п Пе Авп Авп О1и ТЬг О1у Уа! Уа! Авр Ьеи Авп Туг 325 330 335

Туг Уа1 Авп Рго О1у О1п С1п Уа! ТЬг Уа1 Аге Аге Пе Авп РНе ТЬг 340 345 350

О1у Авп Зег Ьув ТЬг Зег Авр О1и Уа! Ьеи Аг§ Аг§ О1и Ме! Ага. С1п 355 360 365

Ме! О1и О1у А!а Ьеи А1а Зег Авп О1и Ьув Пе Авр Ьеи Зег Ьув Уа! 370 375 380

Аг§ Ьеи <31и Аг§ ТЬг О1у РЬе РЬе Ьуз ТЬг Уа1 Авр Не Ьув Рго А1а 385 390 395 400

Аге Не Рго Авп Зег Рго Авр О1п Уа1 Авр Ьеи Азп Уа! Авп Уа! О1и 405 410 415

О1ц О1п Ηιβ Зег О1у ТЬг ТЬг ТЬг Ьеи А1а Уа! О1у Туг Зег С!п Зег 420 425 430

01у О1у Пе ТЬг РЬе О1п А1а С1у Ьеи Зег О1п ТЬг Азп РЬе Ме! О1у 435 440 445

ТЬг О1у Авп Аг§ ^а1 А1а Не Авр Ьеи Зег Аге ®^ег Й1и ТЬг О1п Азр 450 455 460

Туг Туг Азп Ьеи Зег Уа! ТЬг Авр Рго Туг РЬе ТЬг Не Авр С1у Уа1 465 470 475 480

Зег Аге θ!γ Туг Авп Уа1 Туг Туг Аге Ьув ТЬг Ьуз Ьеи Авп Азр Авр 485 490 495

- 44 025831

Туг Азп Уа1 Азп Азп Туг Уа1 ТЬг Азр 5ег РЬе 01у С1у Вег Ьеи Вег 500 505 510

РЬе О1у Туг Рго Пе Акр С1и Азп С1п Вег Ьеи Вег А1а Вег Уа101у 515 520 525

Уа1 Азр Азп ТЬг Ьуз Уа1 ТЬг ТЬг О1у А1а РЬе Уа1 Зег ТЬг Туг Уа1 530 535 540

Аг§ Азр Туг Ьеи Ьеи А1а Азп С1у С1у Ьуз ТЬг ТЬг Вег ТЬг Азп ТЬг 545 550 555 560

Туг Суз Ьеи Уа1 Азр Ьеи Уа1 О1п Азр Рго О1п ТЬг 01у Ьеи Туг Ьуз 565 570 575

Суз Рго О1и О1у О1п ТЬг Зег О1п Рго Туг 01у Азп А1а РЬе О1и 01у 580 585 590

О1и РЬе РЬе ТЬг Туг Азп Ьеи Азп Ьеи С1у Тгр Вег Туг Азп ТЬг Ьеи 595 600 605

Азп Аг§ Рго Пе РЬе Рго ТЬг Вег С1у Ме! Вег Ηϊ$ Аг£ Уа101у Ьеи 610 615 620

С1и Ие О1у Ьеи Рго С1у Вег Азр Уа] Азр Туг С1п Ьуз Уа] ТЬг Туг 625 630 635 640

Азр ТЬг <31п А1а РЬе РЬе Рго Пе <31у Вег ТЬг О1у РЬе Уа! Ьеи Аг£ 645 650 655

01у Туг С1у Ьуз Ьеи О1у Туг О1у Азп Азр Ьеи Рго РЬе Туг Ьуз Азп 660 665 670

РЬе Туг А1а 01у О1у Туг О1у Вег Уа1 Аг£ О1у Туг Азр Азп Зег ТЬг 675 680 685

Ьеи О1у Рго Ьуз Туг А1а Вег Уа1 Азп Ьеи С1п СПи С1и Ьуз Ьуз Азп 690 695 700

Азр Вег Вег Рго О1и (Ли Уа101у О1у Азп А1а Ьеи Уа1 О1п РЬе 01у 705 710 715 720

ТЬг О1и Ьеи Уа1 Ьеи Рго Ме! Рго РЬе Ьуз О1у Азр Тгр ТЬг Аг§ О1п 725 730 735

- 45 025831

Уа1 Аг§ Рго Уа1 Ьеи РЬе А1а О1и О1у О1у О1п Уа1 РЬе Азр ТЬг Ьуз 740 745 750

Суз Азр Уа1 Аг§ Зег Туг Зег Ме( Пе Мег Азп О1у О1п С1п Пе Зег 755 760 765

Азр А1а Ьуз Ьуз Туг Суз О1и Азр Азп Туг <31у РЬе Азр Ьеи О1у Азп 770 775 780

Ьеи Аг§ Туг Зег Уа1 О1у Уа1 О1у Уа1 ТЬг Тгр Пе ТЬг Ме1 Не О1у 785 790 795 800

Рго Ьеи Зег Ьеи Зег Туг А1а РЬе Рго Ьеи Азп Азр Ьуз Рго О1у Азр 805 810 815

О1и ТЬг Ьуз О1и Пе О1п РЬе О1и Пе О1у Аг§ ТЬг РЬе 820 825 <210> 20 <211> 424 <212> РКТ <213> АстеюЬаиег Ъаитаппп <400> 20

Ме1 Ьеи Ьуз А1а О1п Ьуз Ьеи ТЬг Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Зег А1а А1а 15 10 15

Пе Пе Зег Зег А1а О1п А1а Зег С1и О1п Зег О1и А1а Ьуз С1у РНе 20 25 30

Уа1 С1и Азр А1а Азп С1у Зег Не Ьеи РНе Аг§ ТЬг С1у Туг Пе Зег 35 40 45

Аг§ Азр Ьуз Ьуз Азр О1у Аг§ А1а Азр Азп Зег Зег РЬе А1а О1п ТЬг 50 55 60

А1а Пе Уа1 Азп Ие Азр Зег О1у РЬе ТЬг Рго О1у Пе Уа101у РНе 65 70 75 80

О1у Уа1 С1у Уа1 Уа1 О1у Азр О1у Зег РНе Ьуз Пе О1у О1и Азп Ьуз 85 90 95

Азп А1а О1у Азп Азп Ме1 Пе Рго Οίη ΗΪ3 Азп Азр С1у Зег А1а Туг 100 105 НО

- 46 025831

Азр Ηίί Тгр А1а Агр <31у С1у А1а Азп Уа1 Ьуз А)а Агд РЬе Зег Азп 115 120 125

ТЬг ТЬг Уа1 Агд Туг 01у ТЬг О1п Уа1 Ьеи Азр Ьеи Рго Уа1 Ьеи А1а 130 135 140

Зег Азп ТЬг А1а Аг» Ьеи Уа1 Рго <31и Туг РЬе ТЬг О1у ТЬг Ьеи Ьеи 145 150 155 160

ТЬг Зег ΗΪ5 О1и Не Ьуз Азр Ьеи О1и Уа1 Уа1 А1а О1у Ьуз РЬе ТЬг 165 170 175

Ьуз Азп О1п Туг Зег Азр Οίη Не А1а ТЬг Азр С1п Азп С1у Ьеи Азр 180 185 190

Агд А1а Уа! Уа1 Тгр С1у А1а Ьуз Туг Ьуз РЬе Азр Азр С1п Не Зег 195 200 205

О1у Зег Туг Туг С1у Уа1 Азр Уа1 Ьуз Азр Ьуз Ьеи Азр Агд IΙΪ5 Туг 210 215 220

Уа1 Азп Уа! Азп Туг Ьуз О1п Рго Ьеи А1а Азп Азр Зег Зег Ьеи ТЬг 225 230 235 240

Туг Азр РЬе Зег О1у Туг Шз ТЬг Ьуз РЬе Азр Ьуз О1у А1а Азп Ьеи 245 250 255

Зег Туг А1а ТЬг О1у Рго А1а Азр <31и Азр Ьуз ТЬг Азп Азп Пе Тгр 260 265 270

А1а Пе Зег 01у ТЬг Туг А1а ТЬг <31у Рго Шз Зег Уа1 Ме1 Ьеи А1а 275 280 285

Туг О1п О1п Азп Зег 01у Азп 11е О1у Туг Азп Туг О1у Уа1 Азп О1п 290 295 300

Азр О1у О1у С1п Зег Уа1 Туг Ьеи Рго Азп Зег Туг Ьеи Зег Азр РЬе 305 310 315 320

Пе О1у Азп Азр О1и Ьуз Зег А1а О1п Не О1п Туг Зег Ьеи Азр РЬе 325 330 335

О1у Ьуз Ьеи 01у Уа1 Ьеи Рго О1у Ьеи Азп Тгр ТЬг ТЬг А1а Туг Уа1 340 345 350

- 47 025831

Туг С1у Тгр Азр Пе Ьуз ТНг Зег Азп СНу А1а Азр Азр Зег Азп СНи 355 360 365

Зег С1и РЬе РЬе Азп О1п Уа1 Ьуз Туг ТЬг Уа101п Зег СНу РЬе А1а 370 375 380

Ьуз СНу Зег Зег Ьеи Агд Ьеи Агд Азп Зег Пе Туг Агд А1а Азр Азп 385 390 395 400

А1а Туг ТЬг ТЬг Азр Туг Мег Рго Азр ТЬг Азп СНи Тгр Агд Пе РНе 405 410 415

Ьеи Азр Пе Рго Уа1 ТЬг Ьеи РЬе 420 <210> 21 <211> 746 <212> РКТ <213 > Ае те(оЬас(ег Ъашпапт ί <400> 21

Ме( ТЬг Рго Суз Суз Ьеи А1а Не Зег А1а Не РЬе А1а С1п СЬ А1а 15 10 15

Туг А1а О1и ТЬг Уа1 ТЬг О1п ТЬг А 1а О1и Уа1 Зег О1и Азп А1а ТЬг 20 25 30

О1п Ьуз Рго Уа1 А1а СПп Ьеи О1п Ьуз Пе Уа1 Уа1 ТЬг А1а ТЬг Агд 35 40 45

ТЬг Рго Ьуз Азп Пе А1а О1и Не А1а СНу ТЬг Уа1 С1п Зег Пе Азр 50 55 60

СПп Ьуз СНп Пе Не СПп О1п А1а ТЬг А1а О1у Агд Ьуз Уа1 А1а Азр 65 70 75 80

Пе Ьеи А1а С1п Ьеи Уа1 Рго Зег Ьеи А1а Зег Зег Зег СНу ТЬг ТНг 85 90 95

Зег Азп Туг СНу СПп ТЬг Ме1 Агд СНу Агд Азп Уа1 Ьеи Уа1 Ме1 Не 100 105 ПО

Азр О1у Уа1 Зег О1п ТНг СНу Зег Агд Азр Уа1 Зег Агд СПп Ьеи Азп 115 120 125

- 48 025831

Зег Пе Зег Рго О1у Ме( Пе С1и Аге Пе О1и Уа1 Пе Зег О1у А1а 130 135 140

ТЬг Зег Ие Туг О1у Зег О1у А1а ТЬг С1у О1у Не Пе Аеп Пе Пе 145 150 155 160

ТЬг Ьуз Аге А1а Аяр ТЬг Зег Ьуз Рго Ьеи Зег РЬе С1и ТЬг Ьуз Уа1 165 170 175

О1у Пе ТЬг Зег Зег Азр ТЬг РНе Аге Зег Азр О1у Ьеи А1а Туг С1и 180 185 190

Уа101у С1п Зег Уа1 Зег РЬе Азп Ьуз О1у Азп Пе Азр О1у РЬе Ьеи 195 200 205

С1у А1а Азп РЬе ТЬг Зег Аг§ О1у Зег С1п РЬе Азр О1у Азп О1у Азр 210 215 220

Аге Пе Зег Ьеи Зег Рго Тгр О1п О1у Зег ТЬг Ме( Азр ТЬг Азр ТЬг 225 230 235 240

Ие Азр Уа1 Азп О1у Аг§ Ьеи Азп РЬе Азп Ьеи Азп Азр ТЬг О1л ТЬг 245 250 255

Ьеи Зег РЬе О1у А1а О1п Туг Туг Ьуз Азр Ьуз О1п Азр ТЬг Азр Туг 260 265 270

О1у Рго Азр Туг Зег Туг Ьеи Рго ТЬг ТЬг Зег Ьуз Зег Азп Азр А1а 275 280 285

ТЬг ТЬг Рго ТЬг Туг Ьуз А1а Пе Ьуз О1у Ьеи Ьуз Ьеи Зег Азп Рго 290 295 300

Ьеи РНе ТЬг <31и Агц Туг А1а Уа1 Азп Зег О1п Туг О1п Азп О1п Азр 305 310 315 320

РЬе Ьеи О1у О1п Пе Ьеи Азп Уа1 О1и А1а Туг Туг Аг§ Азп О1и Ьуз 325 330 335

Зег Аге РЬе РЬе Рго Туг С1у Ьеи Зег Азп Ьуз Зег Уа1 ТЬг Зег Уа] 340 345 350

Азп О1п Зег О1п Зег О1и Пе О1и Уа1 А1а О1у Ьеи Аге Зег ТЬг Ме1 355 360 365

- 49 025831

Οίη ТЬг Азр Ьеи Азп Пе А1а Азп Агд Азр Ме( Ьуз Пе ТЬг Туг О1у 370 375 380

Ьеи Азр Тут Азр Тгр О1и Ьуз Азр Ьуз О1п РЬе Уа1 Азр Пе Ьеи А1а 385 390 395 400

ТЬг Οίη Туг Рго Тут Ьеи Уа1 Туг ТЬг Рго ТЬг С1у О1п Агд Ьуз О1у 405 410 415

Туг О1у Рго Азп ТЬг О1и Не О1п Азп Пе О1у А1а РЬе Уа1 О1п Зег 420 425 430

Азр Туг А1а Уа1 ТЬг Азр Ьуз Ьеи Азп Ьеи О1п А1а О1у Пе Агд Туг 435 440 445

О1п Туг Пе О1п А1а Азр ТЬг Азр А1а Туг Не Рго Зег Агд О1и ТКг 450 455 460

ТЬг Ме1 Уа1 Рго А1а О1у Зег ТЬг Ηίδ Азр Азр Ьуз Рго Ьеи РЬе Азп 465 470 475 480

Ьеи С1у А1а Уа1 Туг Ьуз Ьеи ТЬг Азр А1а Οίη О1п Уа1 Туг А1а Азп 485 490 495

РЬе Зег С1п О1у РЬе Зег РЬе Рго Азр Уа1 О1п Агд Ме1 Ьеи Агд Азр 500 505 510

Уа1 Зег ТЬг Туг ТЬг Уа1 Зег ТЬг А1а Азп Ьеи О1п Рго Пе ТЬг Уа1 515 520 525

Азп Зег Туг О1и Ьеи О1у Тгр Агд Ьеи Азп О1п Азр Азр О1у Ьеи Азп 530 535 540

Ьеи С1у Ьеи ТЬг С1у РЬе Туг Азп ТЬг Зег Азр Ьуз ТЬг Уа1 О1п РЬе 545 550 555 560

Азп Азп Агд А1а А1а Ьуз Уа1 Уа1 Азр ТЬг Азр О1п Агд Уа1 Туг О1у 565 570 575

А1а О1и А1а ТЬг Не Зег Туг Рго РЬе Ме101и Азп Туг Ьуз Уа1 О1у 580 585 590

О1у ТЬг Ьеи О1у Туг ТЬг Агд О!у О1п Туг Ьуз Азр Уа1 А1а Азп Ьуз 595 600 605

- 50 025831

Тгр Шз 01и Ьеи Азп Зег РЬе ТЬг Уа1 А1а Рго Уа1 Ьуз О1у ТЬг Ьеи 610 615 620

РЬе А1а О1и Тгр Азр Азп Азп О1ц О1у Туг О1у Уа1 Аг§ Уа101п Ме1 625 630 635 640

01п А1а Ие Ьуз О1у ТЬг Азп Ьуз А1а Тут Ьуз Азр Азр Аг§ 01и Ьеи 645 650 655

А1а А1а РЬе А1а ТЬг ТЬг О1п Азр О1и А1а РЬе 01п Азп А1а Уа1 Ьуз 660 665 670

Азп Азр А1а Азп 8ег А1а А1а О1п Пе Ьуз О1у Тут ТЬг ТЬг Ме! Азр 675 680 685

Уа! Ьеи А1а Шз РЬе Рго А1а Τιρ Ьуз С1у Аг§ Уа! Азр РЬе О1у Уа1 690 695 700

Туг Азп Уа1 Тгр Азп Аг§ О1п Туг Аг§ ТЬг Уа1 РНе А!а О1п О1п А1а 705 710 715 720

А1а Уа1 Зег Азп А1а Азп Рго Ьеи Ьеи А1а 11е Рго А1а О1и О1у Аг§ 725 730 735

ТЬг Туг О1у Ьеи Зег Туг ТЬг РЬе Азп Туг 740 745 <210> 22 <211> 736 <212> РКТ <213> Ас1пе1оЬас1ег Ьаитаппи <400> 22

Ме( А1а О1п О1и А1а Уа1 Зег О1п Ьеи Рго ТНг Ие Шз ТЬг Ьуз А1а 15 10 15

ТНг О1п О1и О1и Зег Ьеи Ьуз Уа1 Азр О1п Зег А1а Азп Зег Ьуз РЬе 20 25 30

Уа1 А1а Рго Ьеи Ьуз Азр ТЬг Рго Ьуз Зег Уа1 Зег Пе Ьеи Зег О1п 35 40 45

Ьуз Ьеи Пе Ьуз Азр ТЬг Азп Зег Азп ТЬг Ьеи Ьеи О1и А1а Ьеи Ага 50 55 60

Туг О1и Рго О1у Не ТЬг Ьеи О1у А1а О1у О1и О1у О1у ТЬг Рго РЬе

- 51 025831

70 75 80

ТНг Азр Ме! Рго Туг Пе Аг® О1у Туг Зег О1у О1п Зег Зег Пе Туг 85 90 95

Уа! Азр О1у Уа1 Аг® Азп ТЬг ТЬг Зег О!п Азп Аг® Азр Ме! РЬе А1а 100 105 НО

Пе О1и О1п Уа1О1и Уа1 Пе Ьуз О1у Зег Зег Зег А1а Ьеи О1у О1у 115 120 125 <31у 01у Зег Уа101у <31у Зег Не Азп Ьеи Не Рго Ьуз Уа1 А1а Шз 130 135 140 <31и С1у Азр Уа1 Туг С1п О1у Зег Уа101п Зег О1у ТЬг Азр Азп Туг 145 150 155 160

Аг® Шз Не О1п Ьеи Азр А1а Азп Ьуз Азр РНе <31у Азп О1у Пе А1а 165 170 175

О1у Аг® Уа1 Уа1 Не Ме! <31у Шз О1и Азп О1и Ьуз А1а С1у О1п Зег 180 185 190

Азп С1у А1а С1и Туг Ьуз Аг® Уа1 С1у Пе А1а Рго Зег Пе ТЬг РЬе 195 200 205

О1у Ьеи Азр ТЬг А1а ТЬг Аг® О1у ТЬг Ьеи Зег Туг Туг Туг Ьеи Аг® 210 215 220

Зег Азп Азр О1и Рго Азр А1а О1у Пе Рго РЬе Азп Азп А1а Азп Рго 225 230 235 240

А1а Ьуз Рго Рго Уа1 О1у Уа1 ТЬг Уа1 ТЬг Рго 01у Азр 01у Ьуз Рго 245 250 255

Уа1 Азр Уа1 Ьуз А1а О1у ТЬг Туг Туг О1у Тгр Ьуз А1а Аг® Азр РЬе 260 265 270

Азр Ьуз Аг® О1и Азп Н1з Пе 01у ТЬг РЬе Ьуз Ьеи <31и Шз Азр РЬе 275 280 285

Азп О1и Азп Ьеи ТЬг Ьеи Зег Азп Пе А1а ТЬг Туг Азп Ьуз Зег Ьуз 290 295 300

Зег Азр Туг Уа1 Туг ТЬг Азп А1а Азр Азр 8ег Ьуз О1у Азп Не Туг

- 52 025831

305 310 315 320

Агд О1у ТЬг Уа) А1а Агд Агд А1а Ьеи Зег Агд Пе Ьеи Азр ТЬг Азр 325 330 335

А1а Туг 5ег Азр О1п Ьеи 8ег Ьеи Агд О1у Ьуз РЬе Азп ТЬг С1у Зег 340 345 350

Ьеи Ьуз Шз Зег РНе Азп Уа1 О1у ТЬг О1и Тгр Зег РЬе О1п О1и ТЬг 355 360 365

Азр О1п С1у Уа1 Шз ТЬг РЬе ТЬг Азп А1а А1а О1у С1и ТЬг ТЬг Зег 370 375 380

ТЬг 11е Ьеи Азр Зег Азп Пе С1п Азп Суз ТЬг Зет А1а А1а А1а Уа1 385 390 395 400

А1а Азп О1у Тгр Суз ТЬг Зег Ьеи Азп Азп Рго О1у Азп С1у А1а РЬе 405 410 415

ТЬг Азр Ьуз Агд О1у Зег Пе ТЬг А1а О1п Зег ТЬг ТЬг Агд Зег Шз 420 425 430

Азп Уа1 С1у Пе Туг А1а Ьеи Азр Зег Не О1и РЬе Азп Рго Οίη Тгр 435 440 445

Ьеи Ьеи Азп Ьеи О1у Уа1 Агд Тгр Авр Ьуз РЬе О1и ТЬг О1и Ьуз Ьуз 450 455 460

Туг Азп Ьуз Азр Уа1 Азр О1у Агд ТЬг Рго Шз Ьуз А1а О1у Азр Ьуз 465 470 475 480

Ьеи О1и Зег Азр ТЬг Азр Туг РЬе Зег Туг О1п А1а О1у Ьеи Уа1 РЬе 485 490 495

Ьуз Рго ТЬг О1и Азр О1у Зег Пе Туг Ьеи Зег Туг А1а ТЬг Зег А1а 500 505 510

Азп Рго Уа1(Пу Уа1 Ьеи А1а СПи О1у Азр ТЬг (Пу Зег Азр Зег Пе 515 520 525

Зег Азр Зег О1у ТЬг А1а Зег А1а Зег А1а Азп А1а Ьеи Ьуз Рго О1и 530 535 540

О1и А1а Агд ТЬг РЬе О1и Ьеи О1у ТЬг Ьуз Тгр Азр Ьеи РЬе Азп Азп

- 53 025831

545 550 555 560

Агд. А1а Αδη Ьеи ТЬг А1а А1а Уа1 РЬе Аг® ТЬг О1и Ьуз О1п Азп ТЬг 565 570 575

Аг§ Пе О1п Пе Азр Рго ТЬг ТЬг ТЬг А1а Азп А1а О1у Ьуз Зег Ьуз 580 585 590

Уа1 Азр 01у РЬе С1и Пе Зег Ьеи Азп О1у Ьуз Не ТЬг Азр Ьуз Тгр 595 600 605

Азр Уа1 Зег ТЬг О1у Туг Зег Туг Ьеи Азр Зег О1и Пе ТЬг О1и А1а 610 615 620

А1а Туг Азп А1а Уа1 А1а О1п О1и О1у Ьуз Рго Ьеи Рго РЬе Уа1 А1а 625 630 635 640

Ьуз Азп Зег А1а ТЬг Ьеи Тгр Зег ТЬг Туг Аг§ Уа1 Ме( Рго О1п Ьеи 645 650 655

ТЬг Ьеи 01у А1а О1у Уа1 С1и Туг Аг§ Азр О1п Уа1 РЬе Уа! Азп ТЬг 660 665 670

ТЬг А1а Рго Ьуз Туг Ьеи Рго ТЬг Туг ТЬг Пе Туг Азп А1а Ме( А1а 675 680 685

Ьуз Туг Азр Уа1 Азп Ьуз Азп Уа1 Азп Ьеи О1п Ьеи Азп Пе Азп Азп 690 695 700

Не Зет Азр Ьуз Агд Туг РЬе ТЬг Зег А1а ΗΪ3 А1а А1а ΗΪ5 Туг А1а 705 710 715 720

РЬе О1и О1у Азп О1у Агд Азп А1а Уа1 Ьеи А1а Пе Азп РЬе Ьуз Туг 725 730 735 <210> 23 <211> 543 <212> РКТ <213> Ас1пе1оЬас(ег Ьашпаппп <400> 23

Ме1 ТЬг ТЬг Зег ΗΪ5 А1а О1и 01и ТЬг А1а О1и О1п О1п Азп Зег ТЬг 15 10 15

Азп Уа1 Ьеи Рго ТЬг Ие Зег Пе С1п А1а О1п Ьуз О1и Азп Рго ТЬг 20 25 30

- 54 025831

Зег Туг Уа1 А1а ТЬг Ьу® А1а Азп Зег А1а Ьеи Ьуз Зег Азр А1а Рго 35 40 45

Ьеи РЬе Ьуз ТЬг А1а О1п Зег Уа1 Зег Уа1 Уа1 ТЬг Аг® <31и О1п Ьеи 50 55 60

Азр О1п Ьуз С1п А1а Аг® ТЬг Ьеи ТЬг Азр А1а Ьеи О1и С1у Уа! А1а 65 70 75 80

О1у Уа! С1и А1а С1у Ьуз Ьеи О1у Ате Аг® С1у Тгр Азр Азр РЬе Пе 85 90 95

Пе Аг® С 1у С1п ТЬг Зег Зег Азр Зег Уа1 Туг Уа! Азр С1у Ьеи Аг® 100 105 ПО

Уа! О1у О1п Азп ТЬг Туг Уа1 А1а ТЬг О1и Ьеи Зег С1у Ме! Азр О1п 115 120 125

Уа1 О1п Пе Ьеи Ьуз О1у Рго А1а Зег Пе Азп РНе О1у Ьеи Уа1 А1а 130 135 140

Рго С1у О1у Ме! Уа1 Азп Ьеи Уа1 ТЬг Ьуз Аг® Рго О1и А1а О1и Зег 145 150 155 160

РЬе А1а Аг® А1а Зег Ме! ТЬг Туг О1у Зег Туг Зег Ьеи Ьуз О1и С1у 165 170 175

ТЬг РЬе Азр Ьеи Азп Туг Зег Рго Азп Азп Зег <31и Ьуз О1у А1а РЬе 180 185 190

Аг® Ьеи Азп О1у Аг® Пе Зег Азр О1п Азр Азр Рго ТЬг Азр Туг Уа1 195 200 205

Туг РЬе Ьуз Азп РЬе Туг Пе Зег Рго Зег Туг Азп РКе Азр Ьеи 01у 210 215 220

Азр Азп ТЬг Азр Ьеи Зег Уа1 Зег А1а Зег Туг О1п Н1з Аг® О1и Туг 225 230 235 240

Ие Аг® С1п О1п О1у Ьеи Рго Уа1 Ие С1у ТЬг Ьеи Ьуз Азп Азп Рго 245 250 255

Азп О1у Рго Ие Азр Аг® Зег Ьеи Туг Не 01у Азр Рго Азп РЬе О1у 260 265 270

- 55 025831

Ьув Туг 01и А1а Авр Уа! Туг Аг§ ТЬг 01у Туг ТЬг РЬе Ьув ΗΪΒ ТЬг 275 280 285

РЬе Авр Авп С1у Тгр Авп РЬе Авп О1п Авп РЬе А1а Уа! О1п Ьув ТЬг 290 295 300

О1и Ме! Авр СНу Ьув А1а Уа1 РЬе А1а Аге ТЬг О1у Зег Авп РЬе Тгр 305 310 315 320

А1а Ьув Авр Ьув СНп СНу С1и Не Азр Туг ТЬг ТЬг Пе Зег Аг§ Аг§ 325 330 335

Авп Авп Зег Аге Ηϊβ О1п Уа) Пе Авр Азп Ьеи Зег РНе А1а Не Азр 340 345 350

Азп Ага, Ьеи Авп Ьув Оп РЬе Азр Ьеи Туг О1у Ме! СНп РНв Авр Не 355 360 365

Авп Пе Оу Уа) Азр А1а РЬе Оп Ои Ьув Зег Авр Туг ТЬг Авп Азр 370 375 380

Ьуз Туг Авр Пе Оу Авр Ьеи Авп Не Туг Авп Рго Уа1 Туг Оу Оп 385 390 395 400

Авп Уа1 ТЬг Ьеи Ьув Оп Азп Уа1 Ατβ Авр Не Авп Аг§ Ьеи Ьуз Туг 405 410 415

Ьеи Оу Ьеи Туг Ьеи Аг§ Авр Агц Пе Оп Ьеи Азп Азр О1п Ьеи Ьеи 420 425 430

Ьеи Зег Ьеи Зег О1у Аг§ Оп Авр Тгр А1а Оп ТЬг О1п ТЬг ТЬг Зег 435 440 445

Ьеи Уа1 ТЬг СНу Азп А1а Зег Ьув Оп Зег Авр Авп А1а РЬе ТЬг СНу 450 455 460

Зег А1а Зег Уа1 Ме! Туг ТНг Ьеи Авп Авр Пе Уа! А1а Рго Туг Уа! 465 470 475 480

Зег Туг А1а ТЬг Зег РЬе ТНг Рго Авп Зег 01у ТЬг Азр Уа! Авп Зег 485 490 495

Азп Рго РЬе Ьув Рго О1и Ьув О1у Ьув О1п Уа! О1и Уа! Оу Ме! Ьув 500 505 510

- 56 025831

Ьеи 01η Зег Рго О1у Οίη Αη» Пе О1п О1у А1а Пе А1а Тгр Туг Азр 515 520 525

Ьеи Ьуз Αη» С1п Азп Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг Азр ТЬг А1а Азп Зег СПу 530 535 540 <210> 24 <211> 598 <212> РКТ <213> АстеГоЬасГег Ьаитаппй <400> 24

Ме1 СПу О1п Зег А1а Ьуз Аг§ О1п А1а Уа1 ТЬг Азп Рго Ьуз Азп ТЬг 15 10 15

Ьеи РЬе А1а Пе Ьуз Аг§ Ьеи Пе СПу Αη» Аг® Туг С1и Азр СПп А1а 20 25 30

Уа1 Οίη Ьуз Азр Не О1у Ьеи Уа1 Рго Туг Ьуз Пе Пе Ьуз А1а Азр 35 40 45

Азп О1у Азр А1а Тгр Уа1 О1и Уа1 Азп Азр Ьуз Ьуз Ьеи А1а Рго О1п 50 55 60

СПп Пе Зег А1а СПи Пе Ьеи Ьуз Ьуз Ме( Ьуз Ьуз ТЬг А1а О1и Азр 65 70 75 80

Туг Ьеи О1у О1и ТЬг Уа1 ТЬг О1и А1а Уа1 Пе ТЬг Уа1 Рго А1а Туг 85 90 95

РЬе Азп Азр А1а Οίη Αη» О1п А1а ТЬг Ьуз Азр А1а О1у Ьуз Пе А1а 100 105 110

О1у Ьеи Азр Уа1 Ьуз Аг£ Пе Пе Азп СПи Рго ТЬг А1а А1а А1а Ьеи 115 120 125

А1а РЬе О1у Ме1 Азр Ьуз Ьуз СПи СПу Азр Αη> Ьуз Уа1 А1а Уа1 Туг 130 135 140

Азр Ьеи О1у СПу О1у ТЬг РЬе Азр Уа1 Зег Не Пе О1и Пе А1а Азр 145 150 155 160

Ьеи Азр О1у Азр О1п О1п Ие СПи Уа1 Ьеи Зег ТЬг Азп О1у Азр ТЬг 165 170 175

- 57 025831

РЬе Ьеи С1у С1у С1и Азр РЬе Азр Азп А1а Ьеи Пе О1и Туг Ьеи Уа1 180 185 190

О1и О1и РЬе Ьуз Ьуз <31и О1п Азп Уа1 Азп Ьеи Ьуз Азп Азр Рго Ьеи 195 200 205

А1а Ьеи О1п Аг§ Ьеи Ьуз О1и А1а А1а О1и Ьу5 А1а Ьуз Пе О1и Ьеи 210 215 220

8ег 8ег Зег Азп А1а ТЬг О1и Пе Азп Ьеи Рго Туг Пе ТЬг А1а Азр 225 230 235 240

А1а ТЬг 01у Рго Ьуз Шз Ьеи Уа1 Пе Азп Уа1 ТЬг Аг§ А1а Ьуз Ьеи 245 250 255

О1и О1у Ьеи Уа1 А1а Азр Ьеи Уа1 А1а Лг§ ТЬг Пе О1и Рго Суз Ьуз 260 265 270

Пе А1а Ьеи Ьуз Азр А1а О1у Ьеи Зег ТЬг Зег Азр Пе Зег Азр Уа1 275 280 285

Пе Ьеи Уа1 О1у С1у О1п Зег Ап; Мег Рго Ьеи Уа1 О1п О1п Ьуз Уа1 290 295 300

О1п О1и РЬе РЬе С1у Аг§ С1и Рго Аг§ Ьуз Азр Уа1 Азп Рго Азр С1и 305 310 315 320

А1а Уа1 А1а Пе С1у А1а А1а Пе С1п О1у А1а Уа1 Ьеи 8егО1у Азр 325 330 335

Ьуз Азп Азр Уа! Ьеи Ьеи Ьеи Азр Уа1 ТЬг Рго Ьеи ТЬг Ьеи С1у Не 340 345 350

01и ТЬг Мег О1у О1у Уа1 Ьеи ТНг Рго Пе Пе О1и Ьуз Азп ТЬг ТЬг 355 360 365

Не Рго А1а Ьуз Ьуз Зег О1п Уа1 РЬе Зег ТЬг А1а А1а Азр Азп О1п 370 375 380

Рго А1а Уа1 Азр Пе Зег Уа1 Туг О1п О1у О1и Аг§ Ьуз МеГ А1а О1п 385 390 395 400

С1п Азп Ьуз Ьеи Ьеи О1у Азп РЬе О1п Ьеи О1у Азр Не Рго Рго А1а 405 410 415

- 58 025831

Рго Агд О1у Уа1 Рго О1п Пе О1и Уа1 Зег РЬе Азр Не Азп А1а Азр 420 425 430

О1у Пе Ьеи Ьуз Уа1 Зег А1а Ьуз Азр Ьуз Зег ТЬг О1у Ьуз О1и О1п 435 440 445

Зег Пе О1п Пе Ьуз А1а Азп Зег О1у Ьеи Зег Азр А1а О1и Пе О1и 450 455 460

А1а Ме! Пе Ьуз Азр А1а О1и А1а Азп А1а О1и <31и Азр Агд Ьуз РЬе 465 470 475 480

О1и О1и Ьеи А1а Ьуз А1а Агд Азп О1и А1а Азр А1а Ьеи Не Зег Зег 485 490 495

Зег Азп Ьуз А1а Уа1 Ьуз Азр Ьеи О1у Азр Ьуз Уа1 ТЬг О1и Азр О1и 500 505 510

Ьуз ТЬг А1а Уа1 Азп ТЬг А1а Уа1 Зег О1и Ьеи О1и А1а А1а ТЬг Ьуз 515 520 525

О1и Азп Азр Уа1 О1и А1а Пе Ьуз А1а Ьуз ТЬг О1и А1а Ьеи О1п Азп 530 535 540

Пе Ьеи Ме1 Рго Не ТЬг О1п Агд А1а Туг О1и О1п А1а О1п О1п А1а 545 550 555 560

О1у О1у А1а О1и О1у РЬе Азр Рго Азп А1а РЬе О1п О1у О1у Азр А1а 565 570 575

О1у Οίη О1п Ьуз А1а Азр Азр О1у Уа1 Уа1 Азр А1а О1и РЬе ТЬг С1и 580 585 590

Уа1 Ьуз Азр Азр Ьуз Ьуз 595 <210> 25 <211> 663 <212> РКТ <213> Асте1оЬа«ег Ьаитаппи <400> 25

Ме( Азр Тгр Ме101и О1п О1и О1п О1и Агд О1у Пе ТНг Пе ТЬг 5ег 15 10 15

- 59 025831

А1а А1а ТЬг ТЬг Суа РЬе Тгр Зег С1у Мег СПу Азп 01п РЬе Рго С1п 20 25 30

Н1з Аг§ Пе Азп Уа1 Не Азр ТЬг Рго О1у НЬ Уа! Азр РЬе ТЬг Пе 35 40 45

О1и Уа1 С1и Аг§ Зег Мег Аг§ Уа1 Ьеи Азр <31у А1а Суз МеГ Уа1 Туг 50 55 60

Суз А1а Уа! О!у С1у Уа! О1п Рго О!п Зег О1и ТЬг Уа1 Тгр Ага С1п 65 70 75 80

А1а Азп Ьуз Туг Ьуз Уа1 Рго Аг§ Ьеи А1а РЬе Уа! Азп Ьуз МеГ Азр 85 90 95

Аг§ ТЬг С1у А1а Азп РЬе РЬе Аг§ Уа1 Уа1 О1и О1п МеГ Ьуз ТЬг Ащ 100 105 ПО

Ьеи 01у А1а Азп Рго Уа1 Рго Пе Уа1 Уа1 Рго Пе О1у А1а О1и Азр 115 120 125

ТЬг РЬе ТЬг Оу Уа1 Уа! Азр Ьеи Ие С1и Мег Ьуз А1а Не Пе Тгр 130 135 140

Азр О1и А1а Зег О1п О1у Мег Ьуз РЬе О1и Туг С1у О1и Пе Рго А1а 145 150 155 160

Азр Ьеи Уа1 Азр ТЬг А1а С1п С1и Тгр Ате ТЬг Азп МеГ Уа101и А1а 165 170 175

А!а А!а О1и А1а Зег О1и О1и Ьеи МеГ Азр Ьуз Туг Ьеи С1и О1и О1у 180 185 190

Азр Ьеи Зег Ьуз <31и Азр Ие Пе А1а С1у Ьеи Лг£ А1а Аге ТЬг Ьеи 195 200 205

А1а Зег О1и Пе О1п Уа1 МеГ Ьеи Суз О1у Зег А1а РЬе Ьуз Азп Ьуз 210 215 220

О1у Уа101п Аг£ МеГ Ьеи Азр А1а Уа1 Не О1и РЬе Ьеи Рго Зег Рго 225 230 235 240

ТЬг О|ц Уа1 Ьуз А1а Пе О1и О1у Пе Ьеи Азр Азр Ьуз Авр <31и ТЬг 245 250 255

- 60 025831

Ьуз А1а Зег Агд 01и А1а Зег Азр 01ч А1а Рго РЬе Зег А1а Ьеи А1а 260 265 270

РЬе Ьуз Пе Ме1 Азп Азр Ьуз РЬе Уа1 01у Азп Ьеи ТНг РЬе Уа1 Агд 275 280 285

Уа1 Туг Зег О1у Уа1 Ьеи Ьуз О1п О1у Азр А1а Уа1 Туг Азп Рго Уа1 290 295 300

Ьуз Зег Ьуз Агд О1и Агд Пе О1у Агд 11е Уа1 О1п Ме( ΗΪ3 А1а Азп 305 310 315 320

О1и Агд О1п Азр Пе Азр О1и Не Агд А1а О1у Азр Пе А1а А1а Суз 325 330 335

Уа101у Ьеи Ьуз Азр Уа1 ТЬг ТЬг С1у Азр ТЬг Ьеи Суз Азр С1и Ьуз 340 345 350

Азп Не Пе ТЬг Ьеи С1и Агд Ме! О1и РЬе Рго Азр Рго Уа1 Пе О1п 355 360 365

Ьеи А1а Уа1 С1и Рго Ьуз ТЬг Ьуз А1а Азр С1п О1и Ьу5 Ме18ег Пе 370 375 380

А1а Ьеи С 1у Агд Ьеи А1а Ьуз С1и Азр Рго 5ег РЬе Агд Уа1 ΗΪ3 ТЬг 385 390 395 400

Азр О1и С1и 5ег С1у С1п ТЬг Пе Пе А1а С1у Ме101у С1и Ьеи Шз 405 410 415

Ьеи Азр Пе Пе Уа1 Азр Агд Ме! Ьуз Агд О1и РЬе С1у Уа1 С1и А1а 420 425 430

Азп Пе О1у Ьуз Рго Ме1 Уа! А1а Туг Агд О1и ТЬг Пе Ьуз Ьуз ТЬг 435 440 445

Уа101и О1п О1и О1у Ьуз РЬе Уа1 Агд О1п ТЬг О1у 01у Ьуз 01у Ьуз 450 455 460

РЬе О1у ΗΪ3 Уа1 Туг Уа1 Агд Ьеи О1и Рго Ьеи Азр Уа101и А1а А1а 465 470 475 480

О1у Ьуз О1и Туг С1и РЬе А1а С!и С1и Уа1 Уа1 С1у О1у Уа1 Уа1 Рго 485 490 495

- 61 025831

Ьуз 01и РЬе РЬе О1у А1а Уа! Азр Ьуз О1у Не О1п О1и Аге Ме1 Ьуз 500 505 510

Азп 01у Уа1 Ьеи А1а СПу Туг Рго Уа1 Уа1 С1у Уа1 Ьуз А1а Уа1 Ьеи 515 520 525

РЬе Азр О1у 5ег Туг Н1з Азр Уа] Азр Зег Азр О1и Ьеи Зег РЬе Ьуз 530 535 540

Ме· А1а О1у Зег Туг А1а РЬе Аге Азр О1у РЬе Ме! Ьуз А1а Азр Рго 545 550 555 560

Уа1 Ьеи Ьеи О1и Рго Не Ме! Ьуз Уа1 О1и Уа1 О1и ТЬг Рго О1и Азр 565 570 575

Туг Ме! 01у Азр Пе Ме! О1у Азр Ьеи Азп Аг§ Аге Аге О1у Ме· Уа1 580 585 590

О1п СНу Ме! Азр Азр Ьеи Рго СНу СНу ТЬг Ьуз А1а Пе Ьуз А1а О1и 595 600 605

Уа1 Рго Ьеи А1а <31и Ме! РЬе 01у Туг А1а ТЬг <31п Ме! Аге 610 615 620

Зег О1п СНу Аге А1а ТЬг Туг Зег Ме! О1и РЬе А1а Ьуз Туг А 1а О1и 625 630 635 640

ТЬг Рго Аге Азп Уа1 А1а СНи О1у Пе Пе А1а Ьуз РЬе О1п А1а О1у 645 650 655

СПу Ьуз Ьуз СНу Азр Азр О1и 660 <210> 26 <211> 581 <212> РКТ <213> Асте!оЬас!ег Ьаитаппп <400> 26

Ме· Азп О1п О1и ТЬг СНу Аге О1у Ув1 ТЬг Аг§ О1у ТЬг Ьуз Ьеи Туг 15 10 15

Уа1 Ьуз Азр Уа1 Рго Уа1 Ьеи А1а Уа1 Рго Туг РЬе Азп РЬе Рго Пе 20 25 30

Азр Азр Аге Аге ТЬг ТЬг СНу Пе Ьеи Азп Рго СНп РЬе С1у РЬе Зег

- 62 025831

40 45

Азп Азр О1у 01у Пе О1и Ьеи Зег Уа1 Рго Уа1 Туг Ьеи Азп Ьеи А1а 50 55 60

Рго Азп Туг Азр А1а ТЬг Пе ТЬг Рго Агд Туг Ьеи А1а Азр Агд СНу 65 70 75 80

А1а Ме1 Ьеи С1п С1у О1и РЬе Агд Туг Ьеи ТЬг Азр О1у РЬе О1у А1а 85 90 95

О1у С1п Не Тгр С1у СНу Пе Ьеи Рго Зег Азр Ьуз СНи Туг Азр Акр 100 105 110

Ьук Азр Агд Ьуз Азр РЬе Ηίκ РЬе Ьеи Ηϊκ Азп Тгр Азр Пе Азп Азр 115 120 125

О1п Тгр Зег ТЬг Азп Ьеи СНи Туг Азп Туг А1а Зег Азр Ьуз Азр Туг 130 135 140

РЬе Зег Азр Ьеи Азр Зег Зег Рго Пе Зег Ьуз ТЬг Азр Ьеи Азп Ьеи 145 150 155 160

Агд Агд А1а Тгр СПи Ьеи Азп Туг ΟΙη ΗΪ3 СНу Пе Рго СНу Ьеи Ьуз 165 170 175

А1а СНп Ьеи Ьуз Уа1 СПи Азр РЬе СНп ТЬг Ьеи Азр Рго СНп Уа1 Ьуз 180 185 190

Азр А1а Азр Ьуз Рго Туг А1а Агд Ьеи Рго СНп РЬе Ьеи Ьеи Азп Туг 195 200 205

Уа1 ТЬг СНу Азп Рго Ьеи СНу Ьеи С1п Туг С1и РЬе Азп Азп Азр ТЬг 210 215 220

А1а Туг РЬе Ьуз Ьуз Зег Пе Азп Азр Азп Зег А1а О1п СНи Зег Зег 225 230 235 240

01у ТЬг Агд Пе Туг Азп СНп РЬе А1а ТЬг Агд Туг Азп Туг Агд ТЬг 245 250 255

Рго А1а А1а РЬе Уа1 Пе Рго О1и Уа1 Зег Уа1 Агд Зег Пе СНп ТЬг 260 265 270

РЬе Туг Азр Ьуз Азр ТЬг СПп Ьеи Азп Азп Рго СНу СНу Зег СНи Азп

- 63 025831

275 280 285

Ьуз Зег Уа! Уа1 Уа! Рго О1п РНе ТЬг Ьеи Азр ТНг О1у Ьеи Азп РЬе 290 295 300

О1и Лгд О1и О1у Ьуз Туг Ьеи С1п ТЬг Ьеи ТЬг Рго Агд А1а РЬе Туг 305 310 315 320

А1а Туг А1а Рго Туг Ьуз Азп Οίη Азр С1у Тут Рго Азп РЬе Азр Зег 325 330 335

ТНг ТЬг А1а Зег Пе Зег Тут Азр О1п Ьеи РЬе Азп Рго Туг Агд РЬе 340 345 350

Туг О1у ΗΪ5 Азр Агд Ьеи О1и Азр Азп Азп РЬе Ьеи Зег Ьеи О1у Уа1 355 360 365

Зег Туг Зег Ьеи РЬе Азр ТЬг Уа1 О1у Ьеи О1и Агд Ьеи Агд А1а Зег 370 375 380

Уа1 О1у О1п Зег Туг Туг РЬе О1и Азр Агд Агд Уа) ТЬг Ьеи Ьуз О1п 385 390 395 400

О1у О1п Азр О1и РЬе Азр ТЬг О1и Агд Ьуз ТЬг С1у Рго Уа1 Пе Зег 405 410 415

Ьеи Зег Зег С1п Ьеи Азп О1п Азп РЬе ТЬг Пе А1а А1а Азп Зег А1а 420 425 430

Тгр Ме! Зег Азп О1у Азр Азп А1а О1п Агд Азр РЬе О1п Уа! Туг Туг 435 440 445

ТЬг О1у Азр Ьуз О1у Азп Ьеи Туг Азп Ьеи С1у Туг РЬе Туг Агд Ьуз 450 455 460

Азр Пе Рго О1у Агд Οίη Азр ТЬг Туг Азр О!п Уа1 Уа! А1а Зег РЬе 465 470 475 480

Пе С1п Рго Пе Ьуз Азр Азп Тгр Агд Не Ме! О1у ΗΪ3 Уа1 О1п Туг 485 490 495

Азр Ме! Азр Азп Азр Уа1 А1а Агд О1и Ьеи Ьеи Ьеи О1у Уа! Азп Туг 500 505 510

О1и Зег Суз Суз Тгр О1у Пе Зег Уа! Туг О1у Агд Зег Туг Туг Азп

- 64 025831

515 520 525

Азр Ьеи Азр Азр Рго Ьуз ТЬг Зег Азр Уа1 Зег О1и Ьуз Ат£ А1а Пе 530 535 540

Ме! А1а О1и Пе ТКг Ьеи Ьуз 01у Ьеи О1у О1у Ьеи Азп Азп Ьуз Ьеи 545 550 555 560

А1а Зег Ьеи Ьеи О1и Азп Аг§ РЬе Ьеи О1у РЬе Азп Ьуз Ие Азп О1п 565 570 575

Зег Тгр ТЬг О1п Аг§ 580 <210> 27 <211> 208 <212> РКТ <213> Асте1оЬас1ег Ьаитаппи <400> 27

Ме( Ьеи Азр Аг§ Шз Уа1 Ьеи Аг§ Рго Уа1 А1а Уа101и Туг Аг§ О1и 15 10 15

Ьуз ТЬг Рго О1и Азр Уа1 Аг§ О1у Зег Туг Аг§ О1п РЬе Аг§ Ьуз Азп 20 25 30

Ьеи О1у О1и Рго Тгр Азп А1а Уа1 Азп О1п Ьеи Пе Οίη О1у Аг§ Рго 35 40 45

О1у Аг§ А1а А1а Ьуз ТЬг Ьеи О1у Аг§ РЬе ТЬг Пе Азп ТЬг Ьеи ТЬг 50 55 60

ТЬг Ьеи 01у Ьеи А1а Азр Рго А1а Зег Лг£ Ьеи О1у Ьеи Рго Рго О1и 65 70 75 80

О1и О1и Зег РЬе О1у Уа1 ТКг Ьеи О1у Туг Туг О1у Уа1 Рго Зег О1у 85 90 95

Рго РКе Ьеи Ме1 Ьеи Рго РЬе РЬе О1у Рго Зег ТЬг Ьеи Аг§ Азр О1у 100 105 ПО

Уа101у Ьеи А1а Уа1 Азр А1а О1п А1а Аг§ Рго О1п Ьуз Туг Пе Ме( 115 120 125

Азр Азр О1п Азр С1у Ьеи Туг Тгр Зег ТЬг Азп Ьеи Ьеи О1п А1а Уа1 130 135 140

- 65 025831

Азр ТЬг Агд А1а 01п Туг Ьеи Азр Ьеи Азр 01п ТЬг Пе 01п 01у Азр 145 150 155 160

О1п Туг А1а МеС Не Агд Азр Ьеи Туг Ьеи О1п Агд Ьуз А1а РЬе О1п 165 170 175

Не А1а О1и Ьуз Ьуз О1у Азр Зег А1а Азр Уа1 Зег РЬе Пе Азр Азр 180 185 190

Азр О1и Зег О1и Азр Уа1 Рго О1и Азр Азп ТЬг Азр Ьуз ТЬг О1и Ьуз 195 200 205 <210> 28 <211> 381 <212> РКТ <213> АстеюЬасгег Ъаитаппи <400> 28

Ме1 Ьеи 01у Азр Тгр Азп <31у О1п Агд ТЬг А1а Ьеи О1п А1а Οίη О1у 15 10 15

Туг Азр РЬе Зег РЬе О1у Туг ТЬг О1у О1и Туг А1а 01у Пе Ьеи Азр 20 25 30

Зег Ьуз О1п ТЬг Зег ТЬг Нгз О1у Зег А1а Туг ТЬг О1у С1п Ьеи А1а 35 40 45

Ьеи 01у Зег Шз Ьеи Азр Ьеи О1у Ьуз Не Ьеи О1у Тгр О1п Азр ТЬг 50 55 60

О1и А1а О1п Пе ТЬг Ьеи ТЬг Туг Агд Азр О1у О1п Зег Ьеи Зег О1и 65 70 75 80

Шз Зег Рго А1а Ьеи А1а О1у Шз Οίη Зег Зег Уа1 С1п О1и Уа1 Тгр 85 90 95

О1у Агд О1и О1п ТЬг Тгр Агд Ьеи ТЬг Азр Ьеи Тгр Не Ьуз Ьуз Ьуз 100 105 110

РЬе Ьеи Азр О1п Ьуз Ьеи Азр Уа1 Ьуз Уа) О1у Агд РЬе О1у О1и О1у 115 120 125

О1и Азр РЬе Азп Зег РЬе Азр Суз Азр РЬе О1п Азп Ьеи А1а Ьеи Суз 130 135 140

- 66 025831 <31у Зег Οίη Уа1 С1у Азп Тгр Уа! С1у Азр О1п Тгр Туг Азп Тгр Рго 145 150 155 160

Уа1 Зег О1п Тгр А1а Ме1 Аг® Уа1 Ьуз Туг Азп Ьеи С1п Рго Азр Ьеи 165 170 175

Туг ТЬг <31п Уа1 С1у Уа1 Туг С1и Туг Азп Рго О1и Азп Ьеи О1и Аг® 180 185 190

О1у Ьуз С1у РЬе Азп Ьеи Зег ТЬг Азр СЛу Зег ΗΪ5 С1у А1а Пе Пе 195 200 205

Рго А1а О1и Уа) Уа1 Тгр Зег Рго Ьуз Ьеи СЛу Уа1О1п Зег Ме! Рго 210 215 220

СЛу О1и Тут Аг® Ьеи О1у Туг Туг Туг Зег ТЬг А1а Азр А1а Ьуз О1и 225 230 235 240

Пе А1а Азр Зег ТЬг Ьуз ТЬг Зег Н1з Ьуз О1п СЛу Уа1 Тгр Уа1 ТЬг 245 250 255

А1а Ьуз СЛп Ьуз Ьеи РЬе С1п Рго А1а Азр О1п ТЬг Азр Аг® 01у Ьеи 260 265 270

ТЬг О1у РЬе Уа1 Азп Ьеи ТЬг РЬе Н1з Азр Зег Азр ТЬг Азп Ьуз Уа1 275 280 285

Азр Азп Ме! О1п Азп Пе О1у Ьеи Уа1 Туг Ьуз О1у Ьеи Ьеи Азп О1п 290 295 300

Аг® Рго О1п Азр О1и Ьеи А1а Ьеи О1у Уа1 А1а Аг® Не Шз Пе Азп 305 310 315 320

Азр Азр Тгр Зег Азр Уа1 О1п А1а Ьуз О1и Туг Азр ТЬг СПи Туг Азп 325 330 335

ТЬг О1и Ьеи Туг Туг О1у Пе Нгз А1а ТЬг Азп Тгр Ьеи ТЬг Пе Аг® 340 345 350

Рго Азп Уа1 О1п Туг Уа1 Аг® Нгз Уа1 СЛу А1а Ьеи Ьуз Азп С1у Азр 355 360 365

Азп ТЬг Тгр Уа1 СЛу СЛу Ие Ьуз РЬе Зег ТЬг А1а РЬе 370 375 380

- 67 025831 <210> 29 <211> 167 <212> РКТ <213> Ас1пе!оЪас1ег Ъашпаппп <400> 29

Ме( Авр Зег Ме101п Ьув Ηιβ Ьеи Ьеи Ьеи Рго Ьеи РЬе Ьеи Зег Не 15 10 15

О1у Ьеи Пе Ьеи СНп С1у Сув Авр Зег Ьув Ьув Уа1 А1а СНп А1а О1и 20 25 30

Рго Рго Рго А1а Ьув Уа1 Зег Уа1 Ьеи Зег Пе СНп Рго О1п Зег Уа1 35 40 45

Авп РЬе Зег О1и Авп Ьеи Рго А1а Аг§ Уа1 Ηιβ А1а РЬе Аг£ ТЬг А1а 50 55 60

О1и Не Аг§ Рго СНп Уа1 СНу О1у Пе Пе О1и Ьув Уа1 Ьеи РЬе Ьув 65 70 75 80

О1п СНу Зег О1и Уа1 Аг§ А1а О1у СНп А1а Ьеи Тут Ьув Пе Авп Зег 85 90 95

О1и ТЬг РЬе О1и А1а Азр Уа1 Азп Зег Авп Аг§ А1а Зег Ьеи Азп Ьуз 100 105 110

А1а О1и А1а О1и Уа1 А1а Аг£ Ьеи Ьув Уа1 СНп Ьеи О1и Аг£ Туг СНи 115 120 125

СНп Ьеи Ьеи Рго Зег Авп А1а Пе Зег Ьув С1п О1и Уа1 Зег Азп А1а 130 135 140

СНп А1а СНп Туг Аг§ О1п А1а Ьеи А1а Авр Уа1 А1а СНп Ме1 Ьув А1а 145 150 155 160

Ьеи Ьеи А1а Аг§ О1п Авп Ьеи 165 <210> 30 <211> 385 <212> РКТ <213> Ас1пе1оЬас1ег Ьаитаппп <400> 30

Ме! А1а ТНг А1а Аг§ Азп Аг§ СНу Ме! Авп Ьуз СНу Ьув Пе Уа1 Зег

- 68 025831

10 15

Ьеи Азр Ьуз Уа1 Пе А1а А1а Пе Ьуз Азп А1а Уа1 А1а О1и А1а О1и 20 25 30

Азп Ме! А1а О1и Суз Аг® Не Шз Зег А1а Тгр Уа1 Зег Пе Рго Зег 35 40 45

ТЬг О1и Ьеи С1п Зег РЬе Туг А1а Зег О1у Аг® ТЬг Рго Уа1 А1а Азп 50 55 60

Рго А1а Шз Уа1 Пе ТЬг ТЬг Азп О1и 5/а1 Уа1 Аг® А1а Ьеи О1и Ьеи 65 70 75 80

А1а Ьуз А1а Зег Шз Уа1 ТЬг Зег Азр Туг Туг Ьеи А1а Зег А1а Уа1 85 90 95

Рго Ьеи О1у РЬе О1и Ьеи О1у Азр Зег Зег О1и Тгр Уа1 О1п Азп Рго 100 105 НО

Не Азп Ме! ТЬг А1а Шз Зег Ме! ТЬг О1у Шз Туг О1п Ьеи Ме! Ме! 115 120 125

Ме! Рго Пе А1а ТЬг Ме! С1п Азп Ьеи Азр Аг® А1а Ме! Ьуз С1у А1а 130 135 140

Азп Не О1у Уа1 О1и Ьуз Ме! Уа1 Уа1 Зег Суз Ьеи А1а ТЬг А1а О1и 145 150 155 160

А1а Зег Ьеи Ьеи Ьуз Азр С1и Ьуз <31и Туг О1у Уа1 Суз Ьеи Уа1 Азр 165 170 175

Пе О1у А1а О1у Пе ТЬг Азп Ьеи А1а Уа1 Туг Ьеи Азр С1у Аг® Ьеи 180 185 190

А1а Ьеи А1а Аг® ТЬг Ьеи О1п Аг® О1у С1у О1и Шз Уа1 ТЬг Аг® Азр 195 200 205

Пе А1а А1а Уа1 Ьеи О1п ТЬг ТЬг ТЬг О1и С1и А1а О1и Аг® Пе Ьуз 210 215 220

Не Ьеи Шз О1у Суз Уа1 Азр Ьеи Зег А1а Уа1 Ьуз Рго Азр Шз Ме! 225 230 235 240

Пе О1п Уа101п О1у Не Азр О1у Рго О1п ТЬг Пе Зег Аг® Пе С1и

- 69 025831

245 250 255

Ьеи А1а С1и Пе Пе Ие А1а Агд Туг О1и С1и Не РЬе Зег С1п Пе 260 265 270

Агд О1и О1и Ьеи О1и О1п Зег О1у А1а Пе ТПз О1у Ьеи Туг Н,з СПу 275 280 285

Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг С1у Азр А1а Суз О1п Пе О1и С1у Ме1 Уа1 Зег Ьеи 290 295 300

А1а Агд Агд Ме1 Ьеи О1у Уа1 Зег А1а Ηί$ Ьеи О1у Азп Рго Рго Ьеи 305 310 315 320

С1п Уа1 Туг А1а Азр Азр Οίη НЬ С1п А1а А1а Ьеи Агд Агд Зег Ме1 325 330 335

Туг А1а ТЬг А1а А1а О1у Ьеи Ьеи Ме1 РЬе Зег О1п Зег О1и Ьеи О1п 340 345 350

О1и А1а Уа101и О1и Рго О1и С1и 01у Азп Азр Агд Зег Уа1 Тгр О1и 355 360 365

Агд Ме( Уа] Азп <31у Тгр Азп А1а РЬе Азп Зег Ьуз Ьеи Ьуз А1а Ие 370 375 380

РЬе

385 <210> 31 <211> 356 <212> РЯТ <213> Ас1псюЬас:ег Ъашпаппп <400> 31

Ме( Уа1 О1п Зег Азр Пе С1п СПу Уа1 Ьуз РЬе Уа1 Суз А1а Азп ТЬг 15 10 15

Азр Ьуз С1п А1а Ьеи Азр Суз Ме1 Азп А1а Рго РЬе Ьуз Пе С1п Ьеи 20 25 30

С1у О1и С1п Зег ТЬг Агд СПу Ьеи С1у А1а О1у А1а Азп Рго С1и Уа1 35 40 45

О1у О1п Уа1 А1а А1а О1и С1и Зег Агд С1и Пе Пе Агд Οίη ΗΪ3 Ьеи 50 55 60

- 70 025831

О1и 01у ТКг Азр Мес Уа1 РКе Уа1 ТНг А1а С1у Мес 01у С1у О1у ТЬг 65 70 75 80

О1у ТЬг О1у А1а А1а Рго Уа1 Уа1 А1а О1и Уа1 А1а Ьуз О1и МеС О]у 85 90 95

Пе Ьеи ТЬг Уа1О1у Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг Рго РЬе Азп РЬе <31и 01у Агд 100 105 ПО

Агд Агд О1п Ьуз Зег А1а О1и Агд О1у Пе О1и А1а Ьеи О1и А1а Ηικ 115 120 125

Уа1 Азр Зег Ьеи Пе Пе Пе Рго Азп Οίη Агд Ьеи Ьеи Зег Уа1 Туг 130 135 140

О1у Азр Пе Зег Ме1 Ьуз Азр А1а Туг Ьуз Ьуз А1а Азр Азр Уа1 Ьеи 145 150 155 160

Ьеи Азп А1а Уа1 Агд Зег Пе РЬе Азр Ьеи Уа1 Уа1 Азп Агд 01у Нсз 165 170 175

Пе Азп Ьеи Азр РЬе А1а Азр Ьеи Ьуз ТЬг А1а МеС Зег ТЬг Агд О1у 180 185 190

Туг А1а Мес Мес О1у А1а О1у Ьеи С1у Агд О1у О1и Азр Агд А1а Агд 195 200 205

С1п А1а А1а С1и О1п А1а Пе Агд Зег Рго Ьеи Ьеи Азр Азп Уа1 Азп 210 215 220

Ие Пе Азп А1а Ьуз О1у Уа1 Ьеи Не Азп Пе ТЬг О1у О1у Азр Азр 225 230 235 240

Ие ТЬг Ьеи Агд О1и ТЬг О1и Пе Пе ТЬг Азр Уа1 Уа1 Азп О1п Пе 245 250 255

Уа1 Азр Ьеи Азр О1и О1у О1и Пе РЬе Туг О1у ТЬг Уа1 РКе Азр Рго 260 265 270

Азр А1а Агд Азр О1и Ьеи Агд Уа1 ТЬг Уа1 Пе А1а ТЬг О1у Ьеи ТЬг 275 280 285

Агд Азп А1а А1а Азр А1а О1и Рго Агд Ьуз Агд Азп ТЬг Уа1 Зег Нсз 290 295 300

ТЬг Зег ТЬг О1п Зег А1а О1п Зег Уа1 Азр О1и Азр Азр Уа1 Рго А1а 305 310 315 320

Пе Азп Ьуз Агд С1п Азп А1а О1и Азп Азр Уа! Азп Азп А1а Рго Зег 325 330 335

Зег ТЬг Рго Агд Зег Зег Рго МеС Зег Пе О1п Азр Туг Ьеи Ьуз Азп 340 345 350

Οίη О1п Агд Ьуз 355

Claims

1. Вакцина, включающая выделенный белок Нуг1 Саиб1ба (8Е0 ГО N0: 1) или его иммуногенный фрагмент, для использования в способе лечения или профилактики инфекции Асше!оЬас!ег у млекопитающего.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что упомянутый белок Нуг1 Саиб1ба или его фрагмент получен из Саиб1ба а1Ысапз, Саиб1ба кгизец Саиб1ба йорюаНз, Саиб1ба д1аЬга!а или Сапб1ба рагарзПоз1з.

3. Вакцина по п.1 или 2, отличающаяся тем, что упомянутая инфекция является результатом Асше!оЬас!ег Ьаиттат.

4. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенным фрагментом является фрагмент ^концевой области упомянутого белка Нуг1 Саиб1ба.

5. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенный фрагмент включает аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 2, или фрагмент Нуг1р, показанный в табл. 1 или 2.

6. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенным фрагментом является один или больше из фрагментов Нуг1р, показанных в табл. 1 или 2, или его иммуногенный фрагмент.

7. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что упомянутую вакцину вводят подкожно, как бустер-дозу, или она включает иммуностимулирующий адъювант (такой как квасцы).

8. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что упомянутый Нуг1р или его иммуногенный фрагмент получают рекомбинантно (так как в 8ассНаготусез сегеу1з1ае) или синтезируют химически.

9. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность любой одной из 8Е0 ГО N0: 3-10 или ее вариантную последовательность, имеющую до трех замен, делеций или добавлений к упомянутой аминокислотной последовательности любой одной из 8Е0 ГО N0: 3-10, причем упомянутый полипептид не включает больше 20 смежных аминокислот из 8Е0 ГО N0: 2.

10. Полипептид по п.9, включающий аминокислотную последовательность любой одной из 8Е0 ГО N0: 3-10.

11. Полипептид по п.9 или 10, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанного полипептида состоит из 14-20 аминокислот.

12. Полипептид по любому одному из пп.9-11, отличающийся тем, что ^концевым аминокислотным остатком или С-концевым аминокислотным остатком упомянутого полипептида является цистеин; причем аминокислотная последовательность указанного полипептида включает аминокислотную последовательность любой одной из 8Е0 ГО N0: 11-18; или аминокислотная последовательность упомянутого полипептида состоит из аминокислотной последовательности любой одной из 8Е0 ГО N0: 11-18.

13. Выделенный конъюгат, включающий полипептид по любому одному из пп.9-12 и носитель.

14. Конъюгат по п.13, отличающийся тем, что носителем является гемоцианин фиссуреллы (КЬН), СКМ197 или токсоид столбняка.

15. Конъюгат по п.13, отличающийся тем, что носителем является фаг, дрожжи, вирус, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица или отличающийся тем, что упомянутым конъюгатом является рекомбинантный составной белок.

16. Вакцина, включающая иммуногенное количество полипептида по любому одному из пп.9-12 или конъюгата по любому одному из пп.13-15 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

17. Вакцина по п.16, включающая смесь разных полипептидов по любому одному из пп.9-12 или конъюгатов по любому одному из пп.13-15.

18. Вакцина по любому одному из пп.16, 17, отличающаяся тем, что полипептид или конъюгат получен путем синтеза или отличающаяся тем, что упомянутый полипептид или конъюгат получен рекомбинантным путем.

19. Вакцина по любому одному из пп.16-18 для использования при вакцинации млекопитающего (например, человека) против кандидоза или против Асше!оЬас!ег.

20. Вакцина по п.19, отличающаяся тем, что она вводится внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

21. Способ вакцинации млекопитающего против кандидоза, включающий введение эффективного количества вакцины по любому одному из пп.16-20.

22. Способ вакцинации млекопитающего против Асше!оЬас!ег, включающий введение эффективного количества вакцины по любому одному из пп.16-20.

23. Способ получения химерной вакцины, включающий следующие этапы:

(a) получение фага, дрожжей или вируса;

(b) введение в упомянутый фаг, дрожжи или вирус молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по любому одному из пп.9-12 или 13-15;

(c) экспрессия упомянутого полипептида в упомянутом фаге, дрожжах или вирусе;

- 72 025831 (й) выделение упомянутого фага, дрожжей или вируса этапа (с), включающего указанный экспрессированный полипептид; и (е) добавление фармацевтически приемлемого наполнителя к указанному выделенному фагу, дрожжам или вирусу этапа (й).

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что полипептид содержится на поверхности упомянутого фага, дрожжей или вируса после этапа (с).

25. Выделенное моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом по любому одному из пп.9-12 или конъюгатом по любому одному из пп.13-15.

26. Диагностическая композиция для диагностики кандидоза или инфекции ЛстеРоЪасРег, включающая антитело по п.25.

27. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики кандидоза или инфекции ЛсшеРоЪасРег, включающая антитело по п.25.

28. Фармацевтическая композиция, включающая поликлональные антитела, которые связываются с полипептидом по любому одному из пп.9-12 или конъюгатом по любому одному из пп.13-15 или которые связываются со смесью разных полипептидов по любому одному из пп.9-12 или конъюгатов по любому одному из пп.13-15.

29. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28 для использования при пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза.

30. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28 для использования при пассивной иммунизации млекопитающего против ЛстеРоЪасРег.

31. Способ пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза, включающий введение ему эффективного количества фармацевтической композиции по любому одному из пп.27 или 28.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.

33. Способ по п.31 или 32, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

34. Способ пассивной иммунизации млекопитающего против ЛсшеРоЪасРег, включающий введение ему эффективного количества фармацевтической композиции по любому одному из пп.27 или 28.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.

36. Способ по п.34 или 35, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

37. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ΗΥΚ1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из ССР8АРЕ8Е8^^NТР (8ЕЦ ГО NО: 11), ССNК^ΗΡКΡЕΥΥР^Т (8ЕС) ГО Ш:12), ССΥ^8К^ΡКIУN8КС (8РТ) ГО 13), СК1КСТССУТЛПЕПТ (8ЕО ГО 14), СЬКХЛУР¥1)С,РУР№ (8ЕЦ ГО Ш: 15), №К88Т8Р8МГО1С.С (8ЕО ГО Ш: 16), СЕРТΗNΡΥ^К^8К88 (8ЕЦ ГО NО: 17) и Т8КГОКСС1ОСРНСС (8ЕЦ ГО NО: 18), отличающаяся тем, что полипептид включает в длину менее чем 930 аминокислотных остатков.

38. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, выбранный из 8ЕЦ ГО NО: 11-18.

39. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что упомянутый полипептид включает в длину меньше чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков.

40. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.37.

41. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.37.

42. Набор для обнаружения присутствия ЛсшеРоЪасРег в пробе, включающий по меньшей мере один олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют белок 1 наружной мембраны ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи, белок 2 наружной мембраны ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи, белок с сидерофорной активностью к железу ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи, белок теплового шока Опак ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи, фактор элонгации С ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппй, предшественник белка толерантности к органическому растворителю ЛстеРоЪасРег Ъаитаппи, предшественник липопротеина (УасТ) ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи, чувствительный к глюкозе порин (подобный ОргВ) ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи, составной мембранный белок ЛйеЛ ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи, белок деления клеток ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи или белок деления клеток Ρ18Ζ ЛсшеРоЪасРег Ъаитаппи.

43. Выделенный полипептид ΗΥΚ1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из ССН^.ЛРР^РМИЛРР (8ЕТ) ГО Ш: 11), ССNК^ΗΡКΡЕΥΥР^Т (8ЕТ) ГО Ш: 12), ССΥ^8К^ΡКIУN8КС (8ЕТ) ГО Ш: 13), СК1КСТССУТЛПЕПТ (8ЕТ) ГО Ш: 14), СЕКХЛУТ¥1)С,Р¥Р№ (8Р¥) ГО Ш: 15), №К88Т8Р8МГО1С.С (8Р¥) ГО Ш: 16), СЕРТΗNΡΥ^К^8К88 (8ЕТ) ГО NО: 17) и Т8КГОКСС1ОСРНСС (8ЕЦ ГО NО: 18), отличающийся тем, что полипептид имеет длину меньше чем 930 аминокислотных остатков.

44. Выделенный полипептид ΗΥΚ1 по п.43 отличающийся тем, что упомянутый фрагмент полипептида имеет длину меньше чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков.

45. Выделенный полипептид ΗΥΚ1 по п.43, отличающийся тем, что полипептид может быть связан

- 73 025831 антителом к ΗΥΚ1.

46. Выделенный полипептид ΗΥΚ1 по п.43, отличающийся тем, что он является иммуногенным.

47. Выделенный полипептид ΗΥΚ1 по п.46, отличающийся тем, что он способен вызывать выработку антитела к ΗΥΚ1 у пациента.

48. Составной белок, включающий полипептид, соединенный с носителем белка, меткой системы антиген-антитело или линкерной последовательностью, отличающийся тем, что указанный полипептид включает полипептид ΗΥΚ1 по любому одному из пп.43-47.

49. Выделенное белковое антитело к Асте1оЪас1ег, имеющее специфическую реактивность с полипептидом ΗΥΚ1 по любому одному из пп.43-47, белком 1 наружной мембраны Ас1пе1оЪас1ег Ьаитаппп, белком 2 наружной мембраны Ас1пе1оЪас1ег Ьаитаппи, белком с сидерофорной активностью к железу Ас1пе1оЪас1ег Ьаитаппи, белком теплового шока Опак Ас1пе1оЪас1ег Ьаитаппи, фактором элонгации С Асше1оЪас1ег Ьаитаппи, предшественником белка толерантности к органическому растворителю Асше1оЬас1ег Ьаитаппи, предшественником липопротеина (УасР) Ас1пе1оЪас1ег Ьаитаппи, чувствительным к глюкозе порином (подобным 0ргВ) Ас1пе1оЬас1ег Ьаитаппп, составным мембранным белком АйеА Ас1пе1оЬас1ег Ьаитаппп, белком деления клеток Ас1пе1оЬас1ег Ьаитаппп или белком деления клеток ΡίκΖ АстеЮЬасЮг Ьаитаппи.

50. Антитело по п.49, отличающееся тем, что оно является моноклональным.

51. Антитело по п.49, отличающееся тем, что оно является поликлональным.

52. Линия клеток, вырабатывающая моноклональное антитело по п.50.

53. Набор для обнаружения присутствия Асте^а^е!' в пробе, включающий выделенное белковое антитело к АстеЮЬасЮг по пп.43-47.

54. Способ обнаружения молекулы нуклеиновой кислоты Асте^а^е!^- в пробе, включающий контакт упомянутой пробы с двумя или больше олигонуклеотидами, включающими от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны АстеЮЬасЮг Ьаитаппи, белка 2 наружной мембраны Асте^а^е!· Ьаитаппи, белка с сидерофорной активностью к железу Асте^а^е!Ьаитаппи, белка теплового шока Опак АстеЮЬасЮг Ьаитаппп, фактора элонгации С АстеЮЬасЮг Ьаитаппи, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Асте^а^е!^- Ьаитаппи, предшественника липопротеина (Уас1) Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппи, чувствительного к глюкозе порина (подобного 0ргВ) Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппи, составного мембранного белка АйеА Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппи, белка деления клеток Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппи или белка деления клеток ΡίκΖ АсгпегоЬасгег Ьаитаппи, амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты и обнаружение указанной амплификации.

55. Способ по п.54, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют при помощи полимеразной цепной реакции.

56. Способ обнаружения присутствия Ас^ηеίοЪасίе^ в пробе, включающий контакт пробы с белковым антителом к Ас^ηеίοЪасίе^ по п.49 и обнаружение присутствия специфического связывания антитела с пробой, этим обнаруживая присутствие Ас^ηеίοЪасίе^ в указанной пробе.

57. Фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемый носитель и белковое антитело к Ас^ηеίοЪасίе^ по любому одному из пп.49-51 или белковое антитело к ΗΥΚ1, имеющее специфическую реактивность с белком ΗΥΚ1 (8ЕЦ ΙΌ Ν0: 9) или его фрагментом.

58. Композиция вакцины для иммунизации пациента против инфекции Ас^ηеίοЪасίе^, включающая фармацевтически приемлемый носитель и иммуногенное количество полипептида ΗΥΚ1 по любому одному из пп.43-47, составного белка по п.48, белка ΗΥΚ1 (8ЕЦ ГО Ν0: 9) или его фрагмента, белка 1 наружной мембраны АстеЮЬасЮг Ьаитаппи или его фрагмента, белка 2 наружной мембраны АсгпегоЬасгег Ьаитаппи или его фрагмента, белка с сидерофорной активностью к железу АсгпегоЬасгег Ьаитаппи или его фрагмента, белка теплового шока Опак АстеЮЬасЮг Ьаитаппп или его фрагмента, фактора элонгации С Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппп или его фрагмента, предшественника белка толерантности к органическому растворителю АстеЮЬасЮг Ьаитаппп или его фрагмента, предшественника липопротеина (УасР) АсгпегоЬасгег Ьаитаппи или ее фрагмента, чувствительного к глюкозе порина (подобного 0ргВ) АсшеШЬас1ег Ьаитаппп или его фрагмента, составного мембранного белка АйеА АстеЮЬасЮг Ьаитаппи или его фрагмента, белка деления клеток Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппи или его фрагмента или белка деления клеток ΡίκΖ Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппи или его фрагмента.

59. Композиция вакцины по п.58, кроме того, включающая адъювант.

60. Способ лечения или профилактики инфекции Ас^ηеίοЪасίе^ у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.28 или композиции вакцины по п.57.

61. Способ по п.60, кроме того, включающий совместное введение антибиотика.

62. Способ диагностики инфекции Ас^ηеίοЪасίе^ у пациента, включающий следующие этапы:

(a) получение пробы для проверки от пациента;

(b) контакт упомянутой пробы со средством, которое может связывать выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 1 наружной мембраны Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппп, белок 2 наружной мембраны Асте^а^е!· Ьаитаппи, белок с сидерофорной активностью к железу Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппп, белок теплового шока Опак АстеЮЬасЮг Ьаитаппп, фактор элонгации С Ас^ηеίοЪасίе^ Ьаитаппи, предшест- 74 025831 венник белка толерантности к органическому растворителю АстеЮЬасЮг Ьаитаппп, предшественник липопротеина (УасЦ АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, чувствительный к глюкозе порин (подобный ОргВ) АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, составной мембранный белок АйеА АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белок деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй или белок деления клеток Ρΐ8Ζ АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, или полипептид НУК1 по п.41 в подходящих условиях, обеспечивающих специфическое связывание указанного средства с нуклеиновой кислотой или полипептидом; и (с) сравнение степени специфического связывания в пробе со степенью специфического связывания в контрольной пробе, причем повышенное или пониженное связывание в упомянутой пробе указывает на инфекцию АстеЮЬасЮг.

63. Способ по п.62, отличающийся тем, что упомянутым средством является белковое антитело к АстеЮЬасЮг по п.48 или олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белка 2 наружной мембраны АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белка с сидерофорной активностью к железу АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белка теплового шока Опак АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, фактора элонгации С АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, предшественника белка толерантности к органическому растворителю АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, предшественника липопротеина (УасЦ АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, чувствительного к глюкозе порина (подобного ОргВ) АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, составного мембранного белка АйеА АстеЮЬасЮг Ьаитаппй, белка деления клеток АстеЮЬасЮг Ьаитаппй или белка деления клеток Ρΐ8Ζ АстеЮЬасЮг Ьаитаппй.