JP2014527084A - Ｈｙｒ１由来組成物およびそれを使用する処置方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、Ｈｙｒ１の単離ポリペプチドを特徴とする。本開示は、カンジダ症もしくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染またはこれらの両方を処置または防止するのに有用なワクチンおよび抗体をさらに特徴とする。さらに開示されるのは、ワクチン調製のための、１４〜２０の間のアミノ酸からなる単離ポリペプチドである。Ｈｙｒ１の単離ポリペプチドの特異的アミノ酸配列もまた開示される。例えば、哺乳動物におけるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を処置または防止する方法における使用のための、単離Ｃａｎｄｉｄａ属Ｈｙｒ１タンパク質（配列番号１）またはその免疫原性断片を含むワクチンもまた提供される。

Description

連邦政府により援助された研究についての言及
本発明は、公衆衛生局助成金Ｒ０１ ＡＩ１９９９０、Ｒ０１ ＡＩ０６３３８２、Ｒ０１ ＡＩ０６３５０３、Ｒ０３ ＡＩ０８３２５１およびＲ２１ ＡＩ０８２４１４のもとで政府支援を受けて行われた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は一般に、被験体における感染性疾患を、検出、処置、および防止するための組成物および方法に関する。
発明の背景
医療に関連する血流感染のうちで３番目に一般的な原因であるＣａｎｄｉｄａ属種は、米国で毎年約６０，０００例の血行性播種性カンジダ症を引き起こし、結果として数十億ドルの医療費が費やされている。現行の抗真菌療法にも関わらず、死亡率は依然として容認できない程度に高い。致死性のカンジダ症の発症率が上昇し、処置の失敗率が高いために、より有効な予防的戦略および治療的戦略が必要とされている。
播種性カンジダ症に対する宿主による主要な防疫機構は、食細胞による生物の殺滅である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣａｎｄｉｄａ属を直接殺滅することが可能なのは、食細胞だけである。加えて、マウス、ウサギ、イヌ、またはヒトにおけるＣａｎｄｉｄａ属静脈内接種から３０分間以内に、酵母は、網内系、とりわけ、肝臓に保持される。クッパーマクロファージに富む肝臓は、単回の通過時に、門脈系内の酵母のうちの９９．９％を除去することが可能であることから、真菌に対する食細胞による防疫機構の有効性が強調される。よって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの食細胞による殺滅に対する抵抗性は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの重要な毒性機能である。
細胞表面におけるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質は、病原体と宿主との間の極めて重要な界面に存在することから、このタンパク質は宿主−病原体間相互作用に関与する可能性が高いとされている。
毒性に寄与する生物の調節経路におけるエフェクターを同定することにより、既存の抗真菌剤より優れた方法または組成物による治療的介入の機会がもたらされる。毒性に関与する調節経路に影響を及ぼす細胞表面タンパク質または菌糸タンパク質の同定は、タンパク質の特徴づけにより、Ｃａｎｄｉｄａ属感染と闘う場合に、既存の抗真菌剤より優れているか、またはこれらと相乗作用的である可能性が高い免疫療法を可能とするため、特に有望である。
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの毒性は、複数の推定毒性因子であって、宿主の構成物質へのその接着および酵母から菌糸に形質転換する能力が病原性の決定においてとりわけ最も重要な因子により調節される。Ｃａｎｄｉｄａ属に対して殺菌性である強力な抗真菌剤が存在するが、アムホテリシンＢなどの強力な抗真菌剤による処置がなされても、カンジダ性敗血症に帰しうる死亡率は約３８％である。また、アムホテリシンＢなど、既存の薬剤も、所望されない毒性を呈示する傾向がある。アムホテリシンＢより毒性の小さいさらなる抗真菌剤が開発される可能性はあるが、より強力な薬剤が開発される可能性は低い。したがって、播種性カンジダ症を処置または防止する受動免疫療法または能動免疫療法は、標準的な抗真菌療法に対する有望な代替法である。
Ｃａｎｄｉｄａ属から生じる感染など、抗生物質抵抗性の病原性細菌による致死性の感染は、頻度を増しつつある。さらに、これらの致死性の感染に罹患する危険性は、毎年の集中治療室（ＩＣＵ）における、危険性がある多くの患者にとってのほか、戦闘地帯の前線に配備される兵士にとっても極めて高い。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属種、特に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ種は、入院患者および兵士における感染の高頻度の供給源である。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属とは、ガンマプロテオバクテリアに属するグラム陰性菌属である。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属種は、土壌中の芳香族化合物の鉱物化に寄与する。残念ながら、現在のところ、標準的な手洗いおよび院内環境で実施される他の感染コントロールを除くと、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を防止する技法は存在しない。
抗生物質抵抗性の病原性細菌に対する個体の能動免疫および受動免疫は、これらの感染に対抗しようと試みる、簡便で、かつ、潜在的に費用効果の高い方法を提示する。しかし、細菌種が無数であるために、細菌に対する受動免疫および能動免疫を実現するために有効な抗原性標的の同定および開発は一般に、困難な問題を提示する。特定の細菌ファミリーまたは菌属の毒性に影響を及ぼす化合物の同定は、新規の治療的介入を開発する機会をもたらす。特に、遍在性の細胞表面タンパク質であって、個別の免疫系により同定されうる細菌ファミリーまたは菌属に存在するタンパク質の認識は、免疫療法を可能とするであろう。これらの技法はまた、細菌感染を防止または処置するのに抗生物質より優れ、抗生物質と相乗作用的に作用する可能性も高い。
したがって、Ｃａｎｄｉｄｉａ属と関連する感染性疾患および細菌感染の危険性を低減し、有効な治療をもたらす化合物および方法が必要とされている。本発明は、この必要を満たし、関連する利点も提供する。
発明の概要
Ｃａｎｄｉｄａ属細胞の表面タンパク質であるＨｙｒ１の断片は、Ｃａｎｄｉｄａ属感染に対して被験体を免疫するのに有用であることが発見されている。また、Ｈｙｒ１タンパク質が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染に対抗することも同様に見出されている。
したがって、第１の態様では、本発明は、配列番号３〜１０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号３〜１０のうちのいずれか１つの前記アミノ酸配列に対して最大で３カ所の置換、欠失、または付加を有するそのバリアント配列を含む単離ポリペプチドであって、配列番号２の２０を超える連続アミノ酸を含まない単離ポリペプチドを特徴とする。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３〜１０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドが、１４〜２０の間のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基またはＣ末端のアミノ酸残基が、システインである。他の実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
第２の態様では、本発明は、担体にコンジュゲートされた第１の態様のポリペプチドを含む単離コンジュゲートを特徴とする。例えば、担体は、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、または破傷風トキソイドの場合もあり、ファージ、酵母、ウイルス、ウィロソーム、または組換えウイルス様粒子の場合もある。一部の実施形態では、コンジュゲートが、組換え融合タンパク質である。
第３の態様では、本発明は、免疫原性量の、第１の態様のポリペプチドまたは第２の態様のコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチンを特徴とする。一部の実施形態では、ワクチンは、第１の態様の異なるポリペプチドの混合物または第２の態様のコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、ワクチンは、アジュバント、例えば、Ａｌハイドロゲルをさらに含む。一部の実施形態では、第１の態様のポリペプチドまたは第２の態様のコンジュゲートを、合成または組換えにより作製する。一部の実施形態では、ワクチンが、カンジダ症に対する、哺乳動物、例えば、ヒトへのワクチン接種における使用のためのワクチン、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対して哺乳動物にワクチン接種するためのワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンを、筋内投与、皮下投与、または皮内投与により投与する。一部の実施形態では、ワクチン接種が、追加投与を行うステップをさらに含む。一部の実施形態では、カンジダ症が、播種性カンジダ症、例えば、血行性播種性カンジダ症であるか、またはカンジダ症が、粘膜性カンジダ症であるか、またはカンジダ症が膣カンジダ症であるか、またはカンジダ症が、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなどのＣａｎｄｉｄａ属により引き起こされる。
第４の態様では、本発明は、カンジダ症に対して哺乳動物、例えば、ヒトにワクチン接種する方法であって、哺乳動物に、第３の態様のワクチンを投与し、これにより、哺乳動物に、カンジダ症に対してワクチン接種するか、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対して哺乳動物にワクチン接種するステップを含む方法を特徴とする。一部の実施形態では、ワクチンを、筋内投与、皮下投与、または皮内投与により投与する。一部の実施形態では、投与するステップが、追加投与を行うステップをさらに含む。一部の実施形態では、カンジダ症が、播種性カンジダ症、例えば、血行性播種性カンジダ症であるか、またはカンジダ症が、粘膜性カンジダ症、または膣カンジダ症であるか、またはカンジダ症が、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなどのＣａｎｄｉｄａ属により引き起こされる。
第５の態様では、本発明は、キメラワクチンを作製する方法であって、（ａ）ファージ、酵母、またはウイルスを用意するステップと、（ｂ）ファージ、酵母、またはウイルスに、第１の態様のポリペプチドをコードする核酸分子を挿入するステップと、（ｃ）ポリペプチドを、ファージ、酵母、またはウイルスにおいて発現させるステップと、（ｄ）発現させたポリペプチドを含む、ステップ（ｃ）のファージ、酵母、またはウイルスを単離するステップと、（ｅ）薬学的に許容される賦形剤を、単離された、ステップ（ｄ）のファージ、酵母、またはウイルスに添加するステップとを含む方法を特徴とする。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）に続いて、ポリペプチドが、ファージ、酵母、またはウイルスの表面において提示される。
第６の態様では、本発明は、第１の態様のポリペプチドまたは第２の態様のコンジュゲートに結合する単離モノクローナル抗体を特徴とする。一部の実施形態では、抗体が、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体を、組換えにより作製するか、または化学合成する。
第７の態様では、本発明は、第６の態様の抗体を含む診断用組成物を特徴とする。
第８の態様では、本発明は、第６の態様の抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を特徴とする。一部の実施形態では、医薬組成物は、複数の異なる特異性を伴う第６の態様の抗体の混合物を含む。
第９の態様では、本発明は、第１の態様のポリペプチドもしくは第２の態様のコンジュゲートに結合するポリクローナル抗体、または第１の態様の異なるポリペプチドの混合物もしくは第２の態様のコンジュゲートに結合するポリクローナル抗体を含む医薬組成物を特徴とする。
第８または第９の態様の一部の実施形態では、医薬組成物が、カンジダ症に対する、哺乳動物、例えば、ヒトの受動免疫、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対するヒトの受動免疫における使用のための医薬組成物である。例えば、医薬組成物は、筋内投与、皮下投与、または皮内投与により投与することができる。一部の実施形態では、カンジダ症が、播種性カンジダ症、例えば、血行性播種性カンジダ症であるか、またはカンジダ症が、膣カンジダ症などの粘膜性カンジダ症であるか、またはカンジダ症が、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなどのＣａｎｄｉｄａ属により引き起こされる。
第１０の態様では、本発明は、カンジダ症に対して哺乳動物、例えば、ヒトを受動免疫する方法であって、哺乳動物に、有効量の、第８または第９の態様の医薬組成物を投与し、これにより、カンジダ症に対して、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対して哺乳動物を受動免疫するステップを含む方法を特徴とする。一部の実施形態では、医薬組成物を、筋内投与、皮下投与、または皮内投与、なおまたは鼻腔内投与により投与する。一部の実施形態では、カンジダ症が、播種性カンジダ症、例えば、血行性播種性カンジダ症であるか、またはカンジダ症が、膣カンジダ症などの粘膜性カンジダ症であるか、またはカンジダ症が、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなどのＣａｎｄｉｄａ属により引き起こされる。
さらに他の態様では、本発明は、本明細書で開示される組成物および方法であって、Ｃａｎｄｉｄａ属のＨＹＲ１ポリペプチドを標的とし、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染からの防御を付与する、抗体および他の機構などの免疫応答の同定に少なくとも部分的に基づく組成物および方法も特徴とする。本明細書で開示されるＨＹＲ１ポリペプチドまたは特異的なＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのタンパク質を用いる能動免疫法または受動免疫法は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉが含まれるがこれらに限定されないグラム陰性桿菌により引き起こされる感染に対する防御に有用である。本明細書で開示される組成物および方法の一部の使用には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉへの感染の獲得を防止するための、急性の危険性がある患者に対する抗ＨＹＲ１抗体の投与による受動ワクチン接種が含まれる。加えて、活性のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ感染を伴う患者は、抗体単独または他の抗菌剤と組み合わせた抗体で処置することができる。代替的に、例えば、軍務従事者など、このような感染を発症する危険性がある患者に、本明細書で開示されるＨＹＲ１ポリペプチドまたは特異的なＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉポリペプチドで能動的にワクチン接種して、このような感染を防止することもできる。
他の態様では、この文脈における本発明は、本明細書で開示される受動ワクチン接種または能動ワクチン接種であって、薬物抵抗性で致死性のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉへの感染の獲得を顕著に軽減する能力を有する接種を特徴とする。現在Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対して活性である抗生物質は存在しないため、このような感染の防止は、最優先の懸案事項である。加えて、本発明により提供される受動戦略および能動戦略は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに由来する異種抗原であって、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉに由来する異種抗原を含めたグラム陰性桿菌抗原との無視できない構造的相同性を有する異種抗原に対しても適用されるため、本明細書で開示されるワクチンおよび医薬組成物は、グラム陰性桿菌により引き起こされる他の感染に対して作用する可能性を有する。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染に対する防御のための、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属以外の抗原の使用は、感染に対抗するための大きな利点をもたらす。
したがって、本発明は、本明細書で開示されるＨＹＲ１ポリペプチドもしくはその断片またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのタンパク質を用いて、入院患者における感染を防止するのに有用な能動ワクチン接種を提供する。本発明はまた、軍務従事者におけるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を防止する能動ワクチン接種のための方法および組成物も提供するが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属は、戦闘創傷感染の最も一般的な原因のうちの１つであるので、これらの方法および組成物は強く所望される。本発明はさらにまた、本明細書で開示されるＨＹＲ１ポリペプチドまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのタンパク質に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いる、能動感染のための補助療法としての受動免疫のための方法および組成物も提供する。さらにまた、本発明は、感染した体液中または組織内のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を決定するための、抗体またはＰＣＲ検出による診断用バイオマーカーも提供する。本発明はまた、上記適用が、医療において重要な他のグラム陰性菌に拡張しうることも前提とする。
他の態様では、本発明は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを含めたグラム陰性菌に対する免疫反応を発生させるための抗原として作用しうる、特定のＨＹＲ１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸に関する。
例えば、本発明の一部の態様では、本発明の核酸が、配列番号３〜１０のうちの１もしくは複数またはＣＧＰＳＡＰＥＳＥＳＤＬＮＴＰ（配列番号１１）、ＣＧＮＲＤＨＦＲＦＥＹＹＰＤＴ（配列番号１２）、ＣＧＹＤＳＫＬＦＲＩＶＮＳＲＧ（配列番号１３）、ＣＫＩＫＧＴＧＣＶＴＡＤＥＤＴ（配列番号１４）、ＣＬＫＮＡＶＴＹＤＧＰＶＰＮＮ（配列番号１５）、ＮＳＫＳＳＴＳＦＳＮＦＤＩＧＣ（配列番号１６）、ＣＥＰＴＨＮＦＹＬＫＤＳＫＳＳ（配列番号１７）、およびＴＳＲＩＤＲＧＧＩＱＧＦＨＧＣ（配列番号１８）のうちの１もしくは複数から選択されるアミノ酸配列を含むＨＹＲ１ポリペプチドをコードする。さらに、本発明の一部の態様では、ＨＹＲ１ポリペプチドが、９３７未満、９３６未満、９３５未満、９３４未満、９３３未満、９３２未満、９３１未満、９３０未満、９２０未満、９１０未満、９００未満、８９０未満、８８０未満、８７０未満、８６０未満、８５０未満、８４０未満、８３０未満、８２０未満、８１０未満、８００未満、７９０未満、７８０未満、７７０未満、７６０未満、７５０未満、７４０未満、７３０未満、７２０未満、７１０未満、７００未満、６９０未満、６８０未満、６７０未満、６６０未満、６５０未満、６４０未満、６３０未満、６２０未満、６１０未満、６００未満、５９０未満、５８０未満、５７０未満、５６０未満、５５０未満、５４０未満、５３０未満、５２０未満、５１０未満、５００未満、４９０未満、４８０未満、４７０未満、４６０未満、４５０未満、４４０未満、４３０未満、４２０未満、４１０未満、４００未満、３９０未満、３８０未満、３７０未満、３６０未満、３５０未満、３４０未満、３２０未満、３１０未満、３００未満、２９０未満、２８０未満、２７０未満、２６０未満、２５０未満、２４０未満、２３０未満、２２０未満、２１０未満、２００未満、１９０未満、１８０未満、１７０未満、１６０未満、１５０未満、１４０未満、１３０未満、１２０未満、１１０未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満または２０未満の長さのアミノ酸残基を含み、免疫原性でありうる。本発明の一部の態様では、本発明の核酸が、配列番号１または２のＨＹＲ１ポリペプチドをコードしない。さらに他の態様では、核酸が、単独または組合せの配列番号３〜１０または１１〜１８のうちのいずれか１つをコードする。
本発明はまた、核酸配列が、単独または組合せの配列番号３〜１０または配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つに示される複数のアミノ酸配列をコードする実施形態も提供する。例えば、本発明の核酸配列は、配列番号１２と組み合わせた配列番号１５、または代替的に、配列番号１７と組み合わせた配列番号１１、または代替的に、配列番号１８と組み合わせた配列番号１３など、２つのアミノ酸配列をコードしうる。本発明の核酸は、配列番号１１〜１８から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全てのアミノ酸配列をコードしうることが理解される。また、コードされるアミノ酸配列は、連続的である必要がなく、介在するスペーサー配列であって、例えば、発現させたポリペプチドが、免疫反応を発生させるために所望されるアミノ酸配列またはエピトープを提示することを可能としうる配列により連結しうることも理解される。
本発明の一部の態様では、本発明の核酸によりコードされるアミノ酸配列が、配列番号３〜１０または配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つに示される、実質的に同じアミノ酸配列を含む。例えば、アミノ酸配列は、配列番号３〜１０または１１〜１８のうちのいずれか１つに対する、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ここで、このポリペプチドには、本明細書で開示される抗ＨＹＲ１抗体が結合しうる。他の態様では、本発明の核酸により発現させるＨＹＲ１ポリペプチドは、免疫原性であることが可能であり、被験体における抗ＨＹＲ１抗体の産生または免疫原性応答を誘発することが可能である。
当業者に公知の多様なタンパク質発現系に組み込まれると、本明細書で記載される核酸分子は、本発明のポリペプチド（複数可）を作製するのに有用である。加えて、このような核酸分子またはその断片は、容易に検出可能な置換基で標識し、所与の試料中の、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉなどのグラム陰性菌の存在および／または量についてアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブとしても用いることができる。本明細書で記載される核酸分子およびその断片はまた、本明細書で記載される本発明のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を増幅するためのＰＣＲ反応におけるプライマーおよび／または鋳型としても有用である。
本発明はまた、本発明の核酸を含有するベクターも提供する。当技術分野では、適切な発現ベクターが周知であり、核酸の発現を調節することが可能なプロモーター領域またはエンハンサー領域などの調節配列または調節エレメントに作動的に連結された核酸を発現させることが可能なベクターが含まれる。適切な発現ベクターには、真核細胞内および／または原核細胞内で複製可能なベクターならびにエピソーム性を維持するかまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。
他の態様では、本発明は、単離抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体もさらに提供する。「抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体」は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉにおいて自然発生する少なくとも１つのタンパク質またはその断片を認識する。本明細書で開示されるＨＹＲ１ポリペプチドに対する特異的反応性を有する本発明の抗ＨＹＲ１抗体は、抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体の一例である。本明細書で開示される、ＨＹＲ１ポリペプチドに対する抗体に結合する特異的なＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのタンパク質であって、配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質が同定されている。これらのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのタンパク質には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺが含まれる。本発明の抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もある。本発明はさらに、本明細書で開示されるＨＹＲ１ポリペプチド断片である、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する細胞系も提供する。
他の態様では、本発明はさらに、被験体におけるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を診断する方法も提供する。これらの方法は、（ａ）被験体に由来する被験試料を用意するステップと、（ｂ）適切な条件下で、試料を、本明細書で開示されるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質をコードする単離核酸または本明細書で開示されるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質に結合しうる薬剤と接触させるステップと、（ｃ）被験試料中の特異的結合の量を、対照試料中の特異的結合の量と比較するステップとを含み、被験試料中の特異的結合の、対照試料と比較した増加量または減少量により、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を診断する。本発明の方法において用いられる条件は、薬剤の核酸またはタンパク質に対する特異的結合を可能とすることが理解される。
本明細書で記載される通り、本方法の単離核酸によりコードされるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺが含まれる。
本発明の方法において用いられうる薬剤には、本明細書で開示される抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、もしくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺをコードする１５〜３００の間の連続ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
本発明は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺの一部分をコードする１５〜３００の間の連続ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドもさらに提供する。本明細書で用いられる、「オリゴヌクレオチド」という用語は、基準のヌクレオチド配列に由来する少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む核酸分子を指し、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、または少なくとも２５の連続ヌクレオチドを含むことができ、基準のヌクレオチド配列に由来する少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、最大で３５０の連続ヌクレオチドを含むことが多い。基準のヌクレオチド配列は、センス鎖の場合もあり、アンチセンス鎖の場合もある。
本発明の単離核酸分子は、多様な診断的適用および治療的適用において用いることができる。例えば、本発明の単離核酸分子は、プローブおよびプライマーとして用いることができる。したがって、本発明は、試料中の核酸を検出するための方法を提供する。試料中の核酸を検出する方法は、所望に応じて、定性的な場合もあり、定量的な場合もある。例えば、核酸の存在、夥少、完全性、または構造は、ハイブリダイゼーションに用いられるアッセイフォーマットおよびプローブ、または適用に選択されるプライマー対に応じて、所望の通りに決定することができる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の核酸分子を検出する方法であって、試料を、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺの一部分をコードする１５〜３００の間の連続ヌクレオチドを含む２つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、核酸分子を増幅するステップと、前記増幅を検出するステップとを含む方法を提供する。本発明の一部の態様では、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅を実施する。したがって、一部の態様では、本発明は、試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を検出するためのキットであって、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺの一部分をコードする１５〜３００の間の連続ヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。
本発明の一部の実施形態ではまた、試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を検出するためのキットであって、本明細書で開示される単離抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体を含むキットも提供される。
したがって、本発明の実施形態によれば、キット形態の診断システムであって、本発明の少なくとも１つの核酸または抗体を適切な包装材料内に含むシステムが提供される。核酸を含有する診断用キットは、本明細書で記載されるコード核酸に由来する。一実施形態では、例えば、診断用核酸が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、もしくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺのコード核酸配列の任意の部分、または本発明のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つに由来する。本発明の診断システムは、ゲノムＤＮＡ内またはｍＲＮＡ内の核酸の存在または非存在についてアッセイするのに有用である。
適切な診断システムは、本発明の少なくとも１つの核酸または抗体と、少なくとも１つのアッセイに十分な量の、別個に包装された化学試薬（複数可）とを含む。本発明の核酸を含有する診断用キットでは、キットが一般に、２つ以上の核酸を含有する。診断用キットをＰＣＲにおいて用いる場合、キットは、ＰＣＲ用のプライマーとして用いられうる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含有することになろう。当業者は、本発明の核酸プローブおよび／または核酸プライマーまたは本発明の抗体を、本明細書で記載される本発明の方法を実施するのに適する緩衝液および溶液と組み合わせたキット形態に容易に組み込むことができる。抗体を含有するキットは、試料中のポリペプチドの発現レベルを決定するためのアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを実施するのに適正な条件をもたらす反応カクテルを含有することが可能であり、公知量のポリペプチドを含有する対照試料も含有し、所望の場合は、抗体に対して特異的な二次抗体も含有しうる。
本発明のキットの内容物、例えば、核酸または抗体は、無菌の夾雑物を含まない環境をもたらすことが好ましい包装材料内に含有される。加えて、包装材料は、キット内の材料をどのように使用して、特定の配列またはタンパク質の存在または非存在を検出し、かつ、細菌感染と関連する状態の存在、またはこれに対する素因を診断しうるかについて指示する指示書も含有する。使用のための指示書は、試薬の濃度、または混合される試薬および試料の相対量、試薬／試料の混合物の保持時間、温度、緩衝液条件など、少なくとも１つのアッセイ法のパラメータについて記載する理解可能な表現を含むことが典型的である。
「アジュバント」とは、免疫系に対する刺激を引き起こす１または複数の物質を意味する。この文脈では、アジュバントを用いて、１または複数のワクチン抗原または抗体に対する免疫反応を増強する。アジュバントは、ワクチンまたは抗体を投与する前に、ワクチンまたは抗体の投与と組み合わせて、またはワクチンまたは抗体を投与した後で被験体に投与することができる。アジュバントとして用いられる化合物の例には、アルミニウム化合物（例えば、アラム、Ａｌハイドロゲル）、油、ブロックポリマー、免疫刺激複合体、ビタミンおよび鉱物（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレニウム、およびビタミンＢ１２）、Ｑｕｉｌ Ａ（サポニン）、細菌および真菌の細胞壁成分（例えば、リポ多糖、リポタンパク質、および糖タンパク質）、ホルモン、サイトカイン、および共刺激因子が含まれるがこれらに限定されない。他の例示的なアジュバントには、例えば、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、アルミニウムアジュバント、ＭＦ５９、ＱＳ２１、毒素、サイトカイン、およびマイコバクテリア属の派生物などの免疫調節アジュバント；油性調合、ポリマー、ミセル形成アジュバント、サポニン、免疫刺激性複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）、粒子、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ＤＮＡアジュバント、ならびに封入用アジュバントが含まれる。リポソーム処方物もまた、アジュバント効果を付与することが公知であり、したがって、本発明に従えば、リポソームアジュバントも含まれる。アジュバントは、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるワクチン分子の取込みを容易とし、これらの細胞を活性化することが可能である。アジュバントの免疫反応を増大させる能力は、免疫介在性防御の増大により顕在化される。体液性免疫の増強は、例えば、抗原に対する抗体力価の増大により決定することができる。細胞性免疫の増強は、例えば、陽性皮膚試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−２についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定することができる。
「抗体」とは、全抗体、免疫グロブリン、またはその任意の抗原結合断片もしくは抗原結合単鎖を意味する。本明細書で用いられる抗体は、哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）抗体の場合もあり、ヒト化抗体の場合もあり、キメラ抗体の場合もあり、組換え抗体の場合もあり、合成作製抗体の場合もあり、天然単離抗体の場合もあり、例えば、モノクローナル抗体の場合もありポリクローナル抗体の場合もある。ヒトを含めた大半の哺乳動物では、全抗体が、ジスルフィド結合により接合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を有する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記される）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、ならびにＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記される）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含めた宿主の組織または因子への結合を媒介しうる。
本発明の抗体は、抗体および抗体様特性を伴う他のタンパク質骨格の公知の全ての形態を含む。例えば、抗体は、ヒト抗体の場合もあり、ヒト化抗体の場合もあり、二重特異性抗体の場合もあり、キメラ抗体の場合もあり、フィブロネクチンまたはアンキリン反復配列など、抗体様特性を伴うタンパク質骨格の場合もある。抗体はまた、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、ダイアボディー、ナノボディー、アプタマー、またはドメイン抗体でもありうる。抗体は、以下のアイソタイプ：ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、およびＩｇＡｓｅｃ）、ＩｇＤ、またはＩｇＥのうちのいずれかを有しうる。
本明細書で用いられる「抗体断片」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１または複数の断片を指す。全長抗体の断片には、抗体の抗原結合機能を果たすことが可能であり、これらの断片には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメインとＶＨドメインとからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインとＶＬドメインとを含むｄＡｂ；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Wardら、Nature、３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年））；（ｖｉｉ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ；（ｖｉｉｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｉｘ）場合によって、合成リンカーにより接合されうる２つ以上の単離ＣＤＲの組合せが含まれるがこれらに限定されない。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、Birdら、Science、２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８年）；およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８５巻：５８７９〜５８８３頁（１９８８年）を参照されたい）となることを可能とする合成リンカーにより接合することができる。これらの抗体断片を、当業者に公知の従来の技法を用いて得、断片を、完全抗体と同じ形で、有用性についてスクリーニングする。抗体断片は、組換えＤＮＡ法により作製することもでき、完全免疫グロブリンの酵素的切断または化学的切断により作製することもできる。
「抗原」とは、抗体が選択的に結合しうる分子を意味する。標的抗原は、タンパク質（例えば、抗原性ペプチド）の場合もあり、炭水化物の場合もあり、核酸の場合もあり、脂質の場合もあり、ハプテンの場合もあり、他の天然に存在する化合物または合成の化合物の場合もある。標的抗原は、ポリペプチドまたはペプチドの模倣体でありうる。抗原はまた、動物に投与して、動物における免疫反応を発生させることもできる。
コンジュゲートの文脈における「担体」とは、本明細書で記載されるポリペプチドに連結されるかまたはこれを提示するのに適する部分または粒子、例えば、ＫＬＨ、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ファージ、酵母、ウイルス、ウィロソーム、または組換えウイルス様粒子を意味する。
「キメラ抗体」とは、その可変領域が第１の種に由来し、その定常領域が第２の種に由来する免疫グロブリンまたは抗体を意味する。キメラ抗体は、例えば、遺伝子操作により、異なる種に属する（例えば、マウスおよびヒトに由来する）免疫グロブリンの遺伝子セグメントから構築することができる。
「キメラワクチン」とは、例えば、共有結合的に接合された少なくとも２つの異なる抗原を含むワクチンを意味する。キメラワクチンの例は、例えば、ファージ、ウイルス、酵母、ウィロソーム、または組換えウイルス様粒子などの粒子の表面において提示されたポリペプチドを含む組成物である。
「コンジュゲート」とは、別の部分または粒子、例えば、ＫＬＨ、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ファージ、酵母、ウイルス、ウィロソーム、または組換えウイルス様粒子に連結された本発明のポリペプチドを含む化合物を意味する。
アミノ酸配列における「保存的置換」とは、アミノ酸を、それらの側鎖の化学的性格が類縁であるアミノ酸のファミリー内の別のアミノ酸に置きかえることを意味する。
遺伝子によりコードされるアミノ酸は、４つのファミリー：酸性ファミリー（アスパラギン酸、グルタミン酸）；塩基性ファミリー（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；非極性ファミリー（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；および非帯電極性ファミリー（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）に分けることができる（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、場合によって、芳香族アミノ酸として群分けされる）。同様にまた、アミノ酸は、以下の群：酸性群（アスパラギン酸、グルタミン酸）；塩基性群（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；脂肪族群（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）（セリンおよびトレオニンは、場合によって、脂肪族ヒドロキシルとして別個に群分けされる）；芳香族群（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；アミド群（アスパラギン、グルタミン）；および硫黄含有群（システイン、メチオニン）に分けることもできる。
アミノ酸配列の変化が、機能的バリアントを結果としてもたらすのかどうかは、本明細書で記載される方法などの標準的な方法を用いて、バリアントのポリペプチドが野生型のポリペプチドと同様に機能する能力を評価することにより決定することができる。
「診断用組成物」とは、本発明のポリペプチド、コンジュゲート、ワクチン、または抗体を含有する組成物であって、診断法と連携させた使用のために調合された組成物を意味する。
例えば、抗体を含む医薬組成物を用いる受動免疫の文脈における「有効量」とは、臨床において関与的な形で受動免疫するのに要請される医薬組成物の量を意味する。本明細書で記載される受動免疫法を実施するのに用いられる有効量の医薬組成物は、投与方式、被験体の年齢、体重、および全般的健康に応じて変化する。最終的には、処方者が、適量および投与レジメンを決定する。
「フランキングアミノ酸」とは、ポリペプチド配列内のアミノ酸であって、規定された特定の配列のＮ末端またはＣ末端に直接隣接するアミノ酸を意味する。フランキングアミノ酸は、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列またはその断片のＮ末端および／またはＣ末端に存在することが所望され、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のフランキングアミノ酸が、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列またはその断片のＮ末端および／またはＣ末端に存在することがいっそう所望される。
「融合タンパク質」とは、本発明のポリペプチド、例えば、ＨＹＲ１の断片またはバリアント、および融合パートナーを含むタンパク質を意味する。
「融合パートナー」とは、本発明のポリペプチド、例えば、ＨＹＲ１の断片またはバリアントに融合させうる異種配列を意味する。本明細書では、融合パートナーの例が記載されており、検出マーカー、安定化ドメイン、タンパク質の産生もしくは精製の一助となる配列、またはポリペプチドの抗原性を増大させるドメインが含まれる。
「ＨＹＲ１ポリペプチド」とは、配列番号１のアミノ酸配列と実質的に同一なポリペプチドを意味する。ＨＹＲ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも７０、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、なおまたは１００％の同一性を有することが所望される。
「ＨＹＲ１断片」または「ＨＹＲ１ポリペプチドの断片」とは、９３７、９３６、または９３５より少数のアミノ酸を含有するＨＹＲ１ポリペプチドの一部分を意味する。一部の実施形態では、ＨＹＲ１断片が、３００〜３５０、または２５０〜５００アミノ酸の間の長さである。一部の実施形態では、断片が、９３７、９３６、９３５、９３４、９３３、９３２、９３１、または９３０、９２０、９１０、９００、８９０、８８０、８７０、８６０、８５０、８４０、８３０、８２０、８１０、８００、７９０、７８０、７７０、７６０、７５０、７４０、７３０、７２０、７１０、７００、６９０、６８０、６７０、６６０、６５０、６４０、６３０、６２０、６１０、６００、５９０、５８０、５７０、５６０、５５０、５４０、５３０、５２０、５１０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、または１０アミノ酸より少数であり、場合によって、免疫原性である。
例示的なＨＹＲ１断片は、Ｈｙｒ１ｐ−Ｎ（配列番号２）またはその断片である。場合によって、Ｈｙｒ１ｐ−Ｎ断片が、１４〜２０アミノ酸の間の長さである。一般に、断片は、例えば、３２５、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または１１アミノ酸より少数であることが可能であり、免疫原性であることが所望される。場合によって、Ｈｙｒ１ｐ−Ｎ断片は、１４〜２０アミノ酸の間である。
加えて、ＨＹＲ１断片は、例えば、配列番号２の配列内の１または複数の保存的アミノ酸置換を含有しうる。さらなる所望のＨＹＲ１断片は、配列番号２の配列のＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号２の配列内の１もしくは複数の保存的アミノ酸置換および／または少なくとも１つのフランキングアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のフランキングアミノ酸）を含有する。他の好ましいＨＹＲ１断片は、配列番号２の配列のうちの７つ以上の連続アミノ酸を含有する。
ＨＹＲ１断片の非限定的な例には、配列番号２の配列のうちの１〜４０、１０〜５０、２０〜６０、３０〜７０、４０〜８０、５０〜９０、６０〜１００、７０〜１１０、８０〜１２０、９０〜１３０、１００〜１４０、１１０〜１５０、１２０〜１６０、１３０〜１７０、１４０〜１８０、１５０〜１９０、１６０〜２００、１７０〜２１０、１８０〜２２０、１９０〜２３０、２００〜２４０、２１０〜２５０、２２０〜２６０、２３０〜２７０、２４０〜２８０、２５０〜２９０、および２６０〜３００、２７０〜３１０、２８０〜３２０、および２９０〜３３１アミノ酸；ならびに以下の特徴：配列番号２の配列内の１カ所または複数カ所の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６カ所の保存的アミノ酸置換）；配列番号２の配列のＮ末端および／またはＣ末端から切断された１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のアミノ酸）；ならびに配列番号２の配列のＮ末端および／またはＣ末端における少なくとも１つのフランキングアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のフランキングアミノ酸）のうちの１または複数を有する断片が含まれる。
「免疫原性」とは、被験体における免疫反応を誘導することが可能な任意の物質を意味する。
ワクチンの文脈における「免疫原性量」とは、臨床的に関与的な形で、被験体における免疫反応を誘導するのに要請されるワクチンの量を意味する。本明細書で記載されるワクチン接種法を実施するのに用いられる免疫原性量のワクチンは、投与方式、被験体の年齢、体重、および全般的健康に応じて変化する。最終的には、処方者が、適量および投与レジメンを決定する。
本明細書で用いられる「免疫原性量」という用語は、有効量の本発明の特定のポリペプチドまたはその断片であって、ポリペプチドまたはポリペプチドを発現させる感染作用物質に対する宿主の免疫反応を誘導しうるポリペプチドまたはその断片の有効量を指す。この量は一般に、ワクチンの投与１回当たり２０μｇ〜１０ｍｇの抗原の範囲にあり、処置される被験体、被験体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望される防御の程度に依存する。要請される正確な免疫原性の量は、例えば、抗体滴定など、多様な方法により計算することができる。有効量という用語は、所望の結果をもたらすのに十分な化合物または組成物の量を指す。したがって、ワクチンについて記載するのに用いられる場合の有効量とは、防御的免疫反応をもたらすかまたは誘発するのに十分な化合物または組成物（例えば、抗原）の量を指す。免疫組成物との関連における有効量とは、応答が防御的な場合であれ、防御的でない場合であれ、免疫反応を誘発するのに十分な量である。
「単離」または「精製」とは、他の天然随伴成分から分離されていることを意味する。典型的には、化合物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗体、または低分子）は、その重量で少なくとも６０％が、天然では会合しているタンパク質および／または天然に存在する有機分子を含まない場合に、実質的に単離されている。この定義はまた、例えば、そのフランキング配列から分離されたポリペプチドまたは核酸分子へも拡張される（例えば、アミノ酸配列の場合、単離とは、ポリペプチド内のその配列が天然では会合しているフランキングアミノ酸を含まない配列を指す）。場合によって、化合物は、重量で少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９９％単離されている。単離化合物、例えば、ポリペプチドは、標準的な技法により、例えば、天然の供給源からの抽出（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属に感染した細胞からの精製）により；ＨＹＲ１の断片もしくはバリアントまたはその融合タンパク質をコードする組換え核酸を発現させることにより；またはポリペプチドを化学合成することにより得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ解析により測定することができる。本明細書および特許請求の範囲における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質の修飾語としての、「単離」、および／または「精製」という用語の使用は、そのように称されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質が、このような形態で人工的に作製されており、したがって、それらのｉｎ ｖｉｖｏにおける天然の細胞環境から分離されていることを意味する。
コンジュゲートの文脈における「〜に連結された」または「〜にコンジュゲートされた」とは、ポリペプチドと担体または融合パートナーとの間の共有結合的または非共有結合的な相互作用を意味する。非共有結合的相互作用には、水素結合、帯電基間のイオン性相互作用、静電結合、ファンデルワールス相互作用、非極性基間の疎水性相互作用、疎油性相互作用、およびＬｏｇＰベースの引力が含まれるがこれらに限定されない。
「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団を構成する個別の抗体が、希少量で存在しうる、可能な天然に存在する変異を除き同一であることを意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位を指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含むことが典型的な従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。モノクローナル抗体は、例えば、Kohlerら、Nature、２５６巻：４９５頁（１９７５年）により記載されているハイブリドーマ法、トランスジェニック動物（例えば、Lonbergら、Nature、３６８巻（６４７４号）：８５６〜８５９頁（１９９４年））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）など、当技術分野で認知された任意の技法および本明細書で記載される技法を使用して調製することもでき、例えば、Clacksonら、Nature、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；およびMarksら、J. Mol. Biol.、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）において記載されている技法を用いてファージライブラリー、酵母ライブラリー、または合成の抗体骨格によるライブラリーを使用して調製することもできる。
「核酸分子」とは、２つ以上の共有結合的に結合したヌクレオチド、天然に存在するヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドによる配列を有する分子、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。核酸分子は、例えば、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、修飾ヌクレオチドを含む場合もあり、非修飾ヌクレオチドを含む場合もあり、それらの混合物または組合せを含む場合もある。また、多様な塩形態、混合塩形態、および遊離酸形態も含まれる。
ポリヌクレオチドとも称する「核酸」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーを包摂し、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の場合もあり、ゲノムＤＮＡの場合もあり、センス鎖を表す場合もあり、アンチセンス鎖を表す場合もあり、これらの両方を表す場合もある。核酸の例は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離ゲノムＤＮＡである。このような核酸には、本明細書で記載される配列と実質的に同じヌクレオチド配列を含む核酸が含まれるがこれらに限定されない。
「患者」または「被験体」とは、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコなどの非ヒト哺乳動物が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物を意味する。本明細書では「被験体」、「個体」、または「患者」が互換的に用いられ、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、農場動物、競技動物、ペット、ウマ、および霊長動物、特に、ヒトが含まれるがこれらに限定されない。
「薬学的に許容される担体」、および「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、互換的に用いられ、共に投与される化合物の治療特性を維持しながら、処置する患者に対して生理学的に許容される担体または賦形剤を意味する。薬学的に許容される例示的な１つの担体物質は、生理食塩液である。生理学的に許容される他の担体およびそれらの調合は、当業者に公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、（２０版）、A.Gennaro編、２０００年、Lippincott, Williams & Wilkins、Philadelphia、PAにおいて記載されている。
「医薬組成物」とは、薬学的に許容される賦形剤と共に調合された、本発明のポリペプチド、コンジュゲート、ワクチン、または抗体を含有し、哺乳動物における疾患または事象を処置または防止するための治療レジメンの一部として、政府の規制機関の承認を伴って製造または販売される組成物を意味する。医薬組成物は、例えば、静脈内投与用に調合することもでき（例えば、粒子状塞栓物質を含まない滅菌溶液として調合することができ、静脈内の使用に適する溶媒系中で調合することもできる）、経口投与用に調合することもでき（例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ゲルキャップ、またはシロップ）、本明細書で記載される他の任意の調合、例えば、単位剤形で調合することもできる。本発明はまた、薬学的に許容される担体と、本明細書で開示される抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体または抗ＨＹＲ１抗体であって、本明細書で開示されるＨＹＲ１タンパク質（配列番号１）またはその断片に対する特異的反応性を有する抗体を含む化合物とを含む医薬組成物も提供する。本発明は、それを必要とする被験体における、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを含めたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌など、グラム陰性菌による感染を処置または防止する方法もさらに提供する。本発明の方法は、薬学的に許容される担体と、本明細書で開示される抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体または抗ＨＹＲ１抗体であって、ＨＹＲ１タンパク質（配列番号１）またはその断片に対する特異的反応性を有する抗体を含む化合物とを含有する治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含みうる。本発明は、本明細書で開示される治療有効量のワクチン組成物を投与することにより、それを必要とする被験体における細菌感染を処置または防止する方法もさらに提供する。
本明細書で用いられる、「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸を指すことを意図する。このようなポリペプチドは、連続で非分枝状のペプチドであることが典型的である。ペプチドとは、アミノ酸単量体の短いポリマーである。「タンパク質」は、生物学的に機能的な形で配置された１または複数のポリペプチドを含むことを意図する。本発明のポリペプチドを含むアミノ酸は、ペプチド結合または他の結合、例えば、エステル結合もしくはエーテル結合で連結することができる。本発明のポリペプチドを含むアミノ酸は、遺伝子によりコードされるのではないアミノ酸であって、自然発生するかまたは化学合成されるアミノ酸を含みうる。本発明のポリペプチドはまた、１または複数の保存的置換も包摂しうる。コードされたアミノ酸の保存的置換には、例えば、以下の群：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）；（２）極性の中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）；（３）極性の酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）；および（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓ）内に属するアミノ酸が含まれる。ポリペプチドが本明細書で記載されるその機能の一部または全部を保持する限りにおいて、他の希少な修飾もまた、本発明のポリペプチド内に含まれる。
本発明のポリペプチドにはまた、このようなポリペプチドが、本明細書で開示されるその機能の一部または全部を保持することを条件として、その誘導体、類似体、および機能的模倣体も含まれる。例えば、誘導体には、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨード化、またはポリペプチドを誘導体化する任意の修飾など、ポリペプチドの化学修飾が含まれうる。このような誘導体化された分子には、例えば、遊離アミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチロキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成するように誘導体化された分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化して、塩、メチルエステルおよびエチルエステルもしくは他の種類のエステル、またはヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化して、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化して、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また、２０の標準的なアミノ酸の、１または複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチド、例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、またはカルボキシグルタミン酸も、誘導体または類似体として含まれ、ペプチド結合で連結されていないアミノ酸を含みうるペプチドも、誘導体または類似体として含まれる。本明細書で開示される免疫原性活性が維持される限りにおいて、本発明のポリペプチドにはまた、本明細書でその配列が示されるポリペプチドの配列と比べて、残基の１または複数の付加および／または欠失を有する任意のポリペプチドも含まれる。
本発明のポリペプチドは、当技術分野で周知の多様な方法、例えば、組換え発現系、沈殿、ゲル濾過、イオン交換、逆相クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーなどにより単離することができる。他の周知の方法は、Deutscherら、Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology、１８２巻、（Academic Press、（１９９０年））において記載されている。代替的に、本発明の単離ポリペプチドは、周知の組換え法を用いて得ることができる（例えば、Ausubelら、「Immunology」、Short Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.、１１章、１１．１〜１１．２９頁（１９９９年）；SambrookおよびRussell、「Molecular Cloning： A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory（２００１年）を参照されたい）。当業者は、本発明のポリペプチドを生化学的に精製するための方法および条件を選択することができ、例えば、免疫学的アッセイまたは機能的アッセイにより、精製をモニタリングすることができる。
本発明のポリペプチドを調製するための手段の例は、当技術分野で周知の方法を用いて、本発明のポリペプチドをコードする核酸を、細菌細胞、酵母細胞、卵母細胞などの両生動物細胞、または哺乳動物細胞など、適切な宿主細胞内で発現させ、発現させたポリペプチドを、ここでもまた本明細書で記載される周知の精製法を用いて回収することである。本発明のポリペプチドは、本明細書で記載される発現ベクターで形質転換された細胞から直接単離することができる。本発明のポリペプチドはまた、化学合成によっても作製することができる。当技術分野では、ポリペプチドを化学合成するための方法が周知であり、市販されている。
組換えにより発現させる本発明のポリペプチドはまた、適切な融合パートナーを伴う融合タンパク質としても発現させることができる。適切な融合パートナーは、特定の機能を果たすかまたは本発明のポリペプチドにさらなる特徴をもたらす異種配列など、通常はアミノ酸配列に接合されないアミノ酸配列でありうる。適切な異種配列の非限定的な例には、検出可能なマーカー、安定化ドメイン、抗体を生成させるための担体タンパク質、リンカー配列、およびポリペプチドの精製の一助となる配列が含まれる。本発明のポリペプチドの精製の一助となりうる配列には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはポリＨｉｓなどのアフィニティータグが含まれる。したがって、一部の態様では、本発明は、本明細書で開示されるポリペプチドであって、異種配列、担体タンパク質、アフィニティータグ、またはリンカー配列に融合させたポリペプチドを有する融合タンパク質を提供する。
本発明はまた、許容される担体と、本明細書で開示される単離ポリペプチドのうちのいずれかとを、単独で、または互いと組み合わせて含有する組成物も提供する。これらのポリペプチドは、組換えにより誘導することもでき、化学合成することもでき、天然の供給源から精製することもできる。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩液、水、ならびに油エマルジョンおよび水エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに多様な種類の保湿剤など、当技術分野で公知の標準的な医薬担体のうちのいずれかを包摂する。
本発明はまた、ポリペプチドをコードする核酸を含有する細胞を、ポリペプチドの発現に適する条件下で培養することにより、本明細書で開示されるポリペプチドを発現させるための方法も提供する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸配列を、適切な宿主細胞内で発現させることを介して、組換えにより本発明のポリペプチドを産生するための方法が提供される。本明細書では、ポリペプチドの産生に適する、組換えによるＤＮＡ発現系について記載されるが、当技術分野でも周知である（Ausubelら、前出、１９９９年を参照されたい）。例えば、上記で記載したヌクレオチド配列は、さらなる操作のためにベクターに組み込むことができる。ベクターは、その発現または複製のために異種ＤＮＡを細胞に導入するのに用いられる異なるエレメントを含有する組換えＤＮＡもしくはＲＮＡプラスミドまたはウイルスも含むことができる。
「〜に特異的に結合する」とは、結合部分（例えば、本明細書で記載される薬剤の抗体部分、抗体断片部分、受容体部分、リガンド部分、または低分子部分）の、標的分子（例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドを含むコンジュゲート）または標的分子を保有する細胞もしくは組織（例えば、受容体またはリガンドなどの細胞表面抗原）への優先的な会合を意味するものであり、標的分子を欠く非標的分子、細胞、または組織への優先的な会合を意味するものではない。結合部分と非標的分子（単独で、または細胞もしくは組織との組合せで存在する）との間では、ある程度の非特異的相互作用が生じうることが認識されている。にもかかわらず、特異的結合は、標的分子の特異的認識を介して識別することができる。特異的結合は、結合部分（例えば、抗体）と標的分子（例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドを含むコンジュゲート）との間で、結合部分と、例えば、非標的分子または標的分子を欠く他の組成物との間より強い会合を結果としてもたらす。特異的結合は、例えば、標的分子またはマーカーを保有する細胞または組織に結合した結合部分の量（単位時間当たり）の、標的分子またはマーカーを欠く細胞または組織に結合した結合部分の量と比較した、２倍を超える増大、好ましくは５倍を超える増大、より好ましくは１０倍を超える増大、最も好ましくは１００倍を超える増大を結果としてもたらすことが典型的である。結合部分は、例えば、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、もしくは１０−１２Ｍ未満、なおまたは１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、もしくは１０−１５Ｍ未満の解離定数で標的分子またはマーカーに結合する。このような条件下におけるタンパク質への特異的結合は、その特定のタンパク質に対する結合の特異性について選択される結合部分を要請する。多様なアッセイフォーマットが、特定の標的分子に特異的に結合することが可能な結合部分（例えば、抗体）を選択するのに適する。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するのに日常的に用いられる。特異的な免疫反応性を決定するのに用いられうるイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、HarlowおよびLane、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Publications、New York（１９８８年）を参照されたい。
「実質的に同一の」とは、基準配列に対する少なくとも５０％の同一性を呈示するアミノ酸配列または核酸配列を意味する。このような配列は一般に、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、基準配列に対して、少なくとも、例えば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一般に、ポリペプチドでは、比較配列の長さが、少なくとも５アミノ酸、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００以上のアミノ酸、最大でポリペプチドの全長でありうる。核酸では、比較配列の長さが一般に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００以上のヌクレオチド、最大で核酸分子の全長でありうる。配列同一性を決定する目的で、ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列と比較する場合は、チミンヌクレオチドが、ウラシルヌクレオチドと等価であることが理解される。
本明細書で用いられる通り、ポリペプチド配列または核酸配列を、基準配列に対して「少なくともＸ％の配列同一性」を有すると称する場合、これは、配列を最適に配列決定するときのポリペプチドまたは核酸中、少なくともＸパーセントのアミノ酸またはヌクレオチドが、基準配列のアミノ酸またはヌクレオチドと同一であることを意味する。配列の最適なアライメントは、当技術分野の技術の範囲内にある多様な方途、例えば、スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Smithら、J. Mol. Biol.、１４７巻：１９５〜７頁、１９８１年）およびＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Altschulら、J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年）により決定することができる。これらのアライメントアルゴリズムおよび他のアライメントアルゴリズムは、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）（SchwarzおよびDayhof、Atlas of Protein Sequence and Structure、Dayhoff, M.O.編、３５３〜３５８頁、１９７９年）、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれる、「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」（SmithおよびWaterman、Advances in Applied Mathematics、４８２〜４８９頁、１９８１年）などの公開されたコンピュータソフトウェアを用いて利用可能である。加えて、当業者は、比較される配列の長さにわたり最適なアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するのに適するパラメータも決定することができる。
「標的分子」または「標的細胞」とは、結合部分（例えば、抗体）が特異的に結合しうる分子（例えば、ポリペプチド、エピトープ、抗原、受容体、またはリガンド）または細胞を意味する。場合によって、標的分子は、標的細胞の外部（例えば、細胞表面または分泌タンパク質）上に露出されるが、標的分子は、代替的に、または加えて、標的細胞の内部にも存在しうる。
「治療有効量」は、それらの全てが主治医の技術の範囲内にある、用いられるタンパク質組成物、ポリペプチド組成物、または抗体組成物、疾患およびその重症度、ならびに処置される患者の年齢、体重などに応じて変化するであろう。治療有効量の、本明細書で記載されるタンパク質、ポリペプチド、または抗体組成物のうちの１または複数は、グラム陰性菌の病原性を変化させることが想定される。治療有効量は、生物学的効果を及ぼす量から識別される。本発明のタンパク質、ポリペプチド、または抗体組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、なおまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、グラム陰性菌が発現させるタンパク質またはポリペプチドの機能の減殺など、１または複数の生物学的効果を及ぼしうる。しかし、生物学的効果は、本明細書で記載される任意の臨床的に測定可能な治療的効果であって、主治医の技術の範囲内にある方法により決定される効果を結果としてもたらさない場合もある。
「〜を処置すること」または「処置」とは、医薬組成物を投与することにより、疾患、病理学的状態、障害、または事象を治癒させるか、改善するか、安定化させるか、その可能性を低減するか、または防止する意図を伴う患者に対する医学的管理を意味する。この用語は、疾患、病理学的状態、障害、または事象の改善をとりわけ指向するか、または疾患、病理学的状態、障害、または事象の治癒と関連する処置である能動処置を含み、また、関連する疾患、病理学的状態、障害、または事象の原因の除去を指向する処置である原因処置も含む。加えて、この用語は、疾患、病理学的状態、障害、または事象の治癒ではなく、症状の軽減のためにデザインされる処置である緩和処置；関連する疾患、病理学的状態、障害、または事象の構成的症状を指向する処置である対症処置；例えば、まだ罹病していないが、特定の疾患、病理学的状態、障害、または事象に対して感受性であるか、または他の形でその危険性がある患者における、関連する疾患、病理学的状態、障害、または事象の発症の最小化または部分的もしくは完全な阻害を指向する処置である防止処置；ならびに関連する疾患、病理学的状態、障害、または事象の改善を指向する別の特定の治療を補完するために使用される処置である支持処置も含む。
本明細書で用いられる「ワクチン」とは、それが投与される被験体における免疫反応を誘発する組成物を意味する。
本明細書で用いられる「ワクチン接種する」とは、ワクチンを投与することにより、患者を処置して、例えば、疾患、病理学的状態、障害、または事象を防止または改善することを意味する。
本明細書で記載されるポリペプチドもしくはその部分、またはポリペプチドもしくはその部分をコードする核酸分子の文脈における「バリアント」とは、アミノ酸配列または核酸配列における置換または変更であって、例えば、実質的に同一の配列を結果としてもたらす置換または変更を含むことを意味する。バリアント配列を有するポリペプチドは、元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性、例えば、免疫原性活性を維持しうる。「バリアント」という用語は、例えば、アミノおよび／またはカルボキシル末端における融合体のほか、単一または複数のアミノ酸の配列内挿入体など、アミノ酸の挿入による誘導体を含む。挿入によるアミノ酸バリアントとは、タンパク質中の１または複数のアミノ酸残基が所定の部位に導入されたバリアントである。ランダムな挿入もまた、結果として得られる産物の適切なスクリーニングにより可能である。欠失バリアントは、１または複数のアミノ酸の、配列からの除去を特徴とする。置換によるアミノ酸バリアントとは、少なくとも１つの残基がその代わりに挿入されるバリアントである。タンパク質をアミノ酸置換により誘導体化する場合、アミノ酸は一般に、保存的置換、例えば、疎水性、親水性、電気陰性度、大型の側鎖など、類似の物理化学的特性を有する他のアミノ酸で置きかえられる。
本発明の目的ではまた、バリアントは、炭水化物、脂質、および／または他のタンパク質性部分など、ポリペプチドが由来しうる天然に存在するタンパク質の部分と天然でまたは人為的に会合する任意の成分（複数可）に対する、単一カ所または複数カ所の置換、欠失、および／または付加も含む。「バリアント」という用語により、このような分子の全てが包摂される。
「バリアント配列」とは、本明細書で定義されるバリアントのアミノ酸配列または核酸配列を意味する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなろう。
図１Ａ〜１Ｂ：ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンにより、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを感染させたマウスにおける生存が改善し、真菌負荷が減少した。（Ａ）臨床分離株であるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ １５５６３株（投与１回当たり９×１０５個）を静脈内感染させたワクチン接種されたマウスまたは対照マウス（１群当たりのｎ＝１５）の生存を示す図である（＊ログランク検定により、アラム単独と比較してＰ＜０．００１）。（Ｂ）３０μｇのｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ＋アラムまたはアラム単独をワクチン接種され、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ １５６６３（投与１回当たり７×１０５個）による感染の３日後に摘出されたマウス（アーム１つ当たりのｎ＝１０）の腎臓の真菌負荷を示す図である。データは、中央値±四分値間範囲として提示する。＊マン−ホイットニーのＵ検定により、アラム単独をワクチン接種されたマウスから摘出された腎臓から得られる結果と比較してＰ＜０．００１。 図２Ａ〜２Ｃ：腎臓に由来する代表的な組織病理学的切片を示す。（Ａ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを感染させた対照マウスは、大半が腎臓全体にわたり何らかの菌糸および偽菌糸を伴う酵母形態を示す複数の膿瘍を有したことを示す図である。（Ｂ）ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ（３０μｇ）をワクチン接種されたマウスであって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを感染させたマウスは、膿瘍が少なく、可視的な真菌もはるかに少なかったことを示す図である。（Ｃ）感染の重症度についての半定量的評価により、ワクチン接種されたマウスでは、対照マウスと比較して、膿瘍およびＣａｎｄｉｄａ属細胞の有意な低減が指示されることを示す図である。切片は、ＰＡＳで染色した。盲検評価者（ＧＬ）が３０のランダムな視野を検討して、視野１つ当たりの病変の数を評価した。ワクチン接種されない対照マウスの１２０カ所の病変において、病変１カ所当たりの生物数を評価した。病変１カ所当たりの平均生物数は、真菌細胞の総数を、カウントされた病変の数で除することにより決定した。 図３Ａ〜３Ｃ：ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンにより、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを感染させた好中球減少性マウスにおける生存が延長され、真菌負荷が減少した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（アーム１つ当たりのｎ＝２０）に、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎと混合したアラムまたはアラム単独をワクチン接種し、シクロホスファミドで処置し、次いで、出芽胞子１×１０５個のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ １５５６３を感染させた。シクロホスファミド処置の２日前、マウスのうちの半数から採血し、ＥＬＩＳＡ（Ａ）および生存（Ｂ）を用いて、抗体力価について個別に記録した。他の半数のマウスには、真菌負荷（Ｃ）を用いた。＊ログランク検定により、対照と対比したワクチン接種について、ｐ＜０．０５。 図４Ａ〜４Ｄ：抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧによる投与依存的な受動免疫が、マウスを、血行性播種性カンジダ症に対して防御した。マウスには、尾静脈を介して、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ １５５６３の出芽胞子６．２×１０５個で感染させる２時間前に、０．３ｍｇ（Ａ）、１ｍｇ（Ｂ）、および３ｍｇ（Ｃ）の抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧを、腹腔内を介して施した。マウスの生存（１群当たりのｎ＝１０）を、毎日２回ずつモニタリングした。＊ログランク検定により、アイソタイプの対応する対照ＩｇＧを施されたマウスと対比して、Ｐ＝０．００１。（Ｄ）ワクチン接種用のＦ（ａｂ’）２または対照のＦ（ａｂ’）２の、ＨＬ−６０に由来する好中球によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの殺滅の遮断に対する効果を示す図である。アッセイでは、Ｈｙｒ１ｐを過剰発現させるかまたは抑制するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを用いて、Ｆ（ａｂ’）２断片のＨｙｒ１ｐに対する特異性を裏付けた。対照は、Ｆ（ａｂ’）２の非存在下またはアイソタイプの対応するＩｇＧに由来するＦ（ａｂ’）２の存在下で実施されるアッセイを示す。データは、中央値±四分値範囲として提示する。＊マン−ホイットニーの検定により、Ｐ＝０．００１。 図５Ａ〜５Ｂ：プールされた精製ＩｇＧを用いる血行性播種性カンジダ症に対する防御が、Ｈｙｒ１ｐに対して特異的である。Ａ）ウサギ抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧによる間接的免疫蛍光法により、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸におけるＨｙｒ１ｐの表面発現、および抗Ｈｙｒ１ｐ抗体の取込みの成功が裏付けられたことを示す図であり、Ｂ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ １５５６３の出芽胞子８．７×１０５個を、尾静脈を介して感染させる２時間前に、１ｍｇの１）プールされた抗Ｈｙｒ１ ＩｇＧ（ｎ＝２０）、２）プールされた抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧであって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸に取り込ませた抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧ（ｎ＝１０）、または３）対照のウサギＩｇＧ（ｎ＝２０）で処置されたマウスの生存について示す図である。感染の３日後に抗体の投与を繰り返した。ログランク検定により、＊取り込まれたＩｇＧと対比して、ｐ＝０．００２であり、対照ＩｇＧと対比して、ｐ＝０．０３であり、＊＊取り込まれたＩｇＧと対比して、ｐ＝０．２８。 図６：ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ以外のＣａｎｄｉｄａ属種を感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける組織の真菌負荷を軽減する。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりのｎ＝１０）に、アラムまたはｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ（３０μｇ）に加えたアラムをワクチン接種し、３週間後に追加接種した。追加接種の２週間後、尾静脈を介して、マウスを、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ（３．２×１０７個）、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ（３．４×１０７個）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（９．６×１０６個）、またはＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（３．２×１０６個）で感作した。感染の３日後に、腎臓の真菌負荷を決定した。ｙ軸は、アッセイの検出下限を反映する。＊マン−ホイットニーのＵ検定により、アジュバント対照と対比して、Ｐ＜０．００１。 図７は、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ（配列番号２）による能動免疫が、糖尿病性マウスを、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉによる菌血症から防御することを示す。０日目に、マウスを、水酸化アルミニウム単独（ｎ＝１０）または水酸化アルミニウムと混合されたｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ（３０ｍｇ）（ｎ＝９）で免疫し、２１日目に追加接種し、３５日目にＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを感染させた。＊対照と対比して、Ｐ＜０．００５。 図８は、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ（配列番号２）による能動ワクチン接種の、腎臓組織、肺組織、および脾臓組織における細菌負荷に対する効果を示す。０日目に、対照マウスを、水酸化アルミニウム単独で免疫する一方で、ワクチン接種されたマウスを、水酸化アルミニウムと混合されたｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ（３０ｍｇ）で免疫し、２１日目に追加接種し、３５日目に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを感染させた。 図９は、受動免疫が、糖尿病性マウスを、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉによる菌血症から防御することを示す。マウスを、対照としての１ｍｇのウサギ対照ＩｇＧ（ｎ＝１８）で処置した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを感染させる２時間前に、被験マウスを、プールされたポリクローナル抗ｒＨｙｒ１ｐ ＩｇＧ（ｎ＝２０）で処置した。プールを含むポリクローナル抗ｒＨｙｒ１ｐ抗体の各々は、配列番号１１〜１８のうちの１つを含む合成の抗原性ポリペプチドのうちの１つに対してもたらされた。＊対照ＩｇＧと対比して、Ｐ＜０．００５。 図１０は、受動免疫が、糖尿病性マウスを、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉによる菌血症から防御することを示す。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを感染させる２時間前に、マウスを、１ｍｇのウサギ対照ＩｇＧ（ｎ＝１８）または８つの異なる合成ＨＹＲ１ペプチドのうちの１つに対して個別にもたらされたポリクローナル抗ＨＹＲ１ｐ ＩｇＧで処置した。番号１は、ＣＧＰＳＡＰＥＳＥＳＤＬＮＴＰ（配列番号１１）に対してもたらされた。番号２は、ＣＧＮＲＤＨＦＲＦＥＹＹＰＤＴ（配列番号１２）に対してもたらされた。番号３は、ＣＧＹＤＳＫＬＦＲＩＶＮＳＲＧ（配列番号１３）に対してもたらされた。番号４は、ＣＫＩＫＧＴＧＣＶＴＡＤＥＤＴ（配列番号１４）に対してもたらされた。番号５は、ＣＬＫＮＡＶＴＹＤＧＰＶＰＮＮ（配列番号１５）に対してもたらされた。番号６は、ＮＳＫＳＳＴＳＦＳＮＦＤＩＧＣ（配列番号１６）に対してもたらされた。番号７は、ＣＥＰＴＨＮＦＹＬＫＤＳＫＳＳ（配列番号１７）に対してもたらされた。番号８は、ＴＳＲＩＤＲＧＧＩＱＧＦＨＧＣ（配列番号１８）に対してもたらされた。組合せ１（Ｃｏｍｂ１）は、抗体番号２、３、５、および８を含む。組合せ２（Ｃｏｍｂ２）は、抗体番号２、５、および８を含む。 図１１は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細胞表面の抽出物についての例示的な２Ｄ−ゲルおよびウェスタンブロットによる解析を示す。ＣＬＫＮＡＶＴＹＤＧＰＶＰＮＮ（配列番号１５）に対してもたらされたウサギＩｇＧを、上ブロットをプローブするのに用いる一方で、免疫前血清は、下ブロットをプローブするための対照として用いた。
発明の詳細な説明
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓは、ヒトにおける一般的な病原体である。例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、通常は無害な片利共生生物であるが、膣カンジダ症および／または口腔咽頭カンジダ症などの表在性皮膚粘膜感染から、播種性カンジダ症における深部の器官病変までの範囲の多様な状態を引き起こしうる。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓは、疾患を引き起こす前に、消化管にコロニー形成し、場合によって、皮膚および粘膜にコロニー形成する。宿主の粘膜表面への接着が、この初期段階の鍵となる要件である。コロニー形成の後、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、感染した血管内デバイスを介して、または化学療法またはストレス性潰瘍により損なわれた消化管粘膜を介する移入により血流に侵入する。次いで、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓは、血流を介して播種される。血管内皮に結合し、これを透過して、血管系から放出され、肝臓、脾臓、および腎臓など、深部器官に浸潤する。
本明細書で記載されるＨＹＲ１断片および他の組成物の同定は、例えば、カンジダ症だけでなく、また、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染の有効な処置およびこれらに対するワクチン接種を可能とする。
本発明は、例えば、ＨＹＲ１またはＨｙｒ１ｐ−Ｎに由来するポリペプチド、コンジュゲート、ワクチン、抗体、組成物、これらを用いるワクチン接種の方法、およびこれらを作製する方法であって、下記でさらに詳細に記載される方法を提供する。
ポリペプチド
本発明は、ＨＹＲ１、例えば、配列番号３〜１０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号３〜１０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して０、１、２、または３カ所の置換、欠失、または付加を有するそのバリアント配列を含む、例えば、Ｈｙｒ１ｐ（配列番号１）またはＨｙｒ１ｐ−Ｎ（配列番号２）に由来するポリペプチド、例えば、単離ポリペプチドであって、配列番号２の２０を超える連続アミノ酸を含まないポリペプチドを特徴とする。
配列番号１とは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ Ｈｙｒ１ｐのアミノ酸配列（配列番号１）である。
配列番号２とは、Ｈｙｒ１ｐの組換えＮ末端ドメインのアミノ酸配列（ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ、配列番号２）である。
配列番号３〜１０とは、表１に示される、Ｈｙｒ１ｐ−Ｎ（配列番号２）のアミノ酸配列の１４マーの断片である。
本明細書で記載される表１のポリペプチドまたは他のポリペプチドは、バリアントまたは他の形で修飾されたアミノ酸配列を有しうる。例えば、表１のポリペプチドのバリアントでは、存在する場合、各々の置換、欠失、または付加を、例えば、ポリペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４位、またはＮ末端もしくはＣ末端に施すことができる。
ある場合、ポリペプチドは、１４〜２０アミノ酸の間であり、例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。他の場合、ポリペプチドは、１４アミノ酸より短く、例えば、１１、１２、または１３アミノ酸である。ポリペプチドは、配列番号２の２０を超える連続アミノ酸を含まないという条件で、２０アミノ酸より長い場合もある。
場合によって、本明細書で記載されるポリペプチドに対する修飾は、ポリペプチドの生物学的活性、例えば、免疫原性活性を実質的に減殺しない。修飾ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性、バイオアベイラビリティー、毒性、免疫学的活性、免疫学的同一性、またはコンジュゲーション特性などのポリペプチドの特徴を有しうるかまたは最適化しうる。
修飾には、翻訳後プロセシングなどの天然の過程による修飾、または当技術分野で公知の化学修飾法による修飾が含まれる。修飾は、ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含めた、ポリペプチド内の任意の位置において生じうる。同じ種類の修飾が、所与のポリペプチド内の複数の部位において、同じ程度で存在する場合もあり、程度を変化させて存在する場合もある。ポリペプチドは、複数の種類の修飾を含有しうる。
バリアントまたは他の形で修飾されたポリペプチドはまた、ポリペプチド配列内に１カ所または複数カ所の、保存的または非保存的（例えば、Ｄ−アミノ酸、デスアミノ酸）なアミノ酸の挿入、欠失、または置換も含みうる。例えば、本発明のポリペプチドのうちのいずれかのアミノ末端またはカルボキシ末端への１または複数のシステイン残基の付加は、これらのポリペプチドのコンジュゲーションを容易としうる。Ｎ末端またはＣ末端のシステインを有する例示的なポリペプチドには、例えば、表２に示され、実施例１でさらに記載される、例えば、配列番号１１〜１８のポリペプチドが含まれる。
アミノ酸置換は、保存的（すなわち、残基が、一般型または群が同じ別の残基で置きかえられる）な場合もあり、非保存的（すなわち、残基が、別の型のアミノ酸で置きかえられる）な場合もある。加えて、天然に存在するアミノ酸を、天然に存在しないアミノ酸で置換することもできる（すなわち、天然に存在しない保存的アミノ酸置換または天然に存在しない非保存的アミノ酸置換）。
例えば、当技術分野で公知の方法を用いて合成により作製されるポリペプチドは、天然ではＤＮＡによりコードされないアミノ酸（例えば、天然に存在しないアミノ酸または非天然のアミノ酸）による置換を含むことができる。天然に存在しないアミノ酸の例には、Ｄ−アミノ酸、システインの硫黄原子に接合されたアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、式ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ［式中、ｎは、２〜６である］のオメガアミノ酸、中性の非極性アミノ酸、例えば、サルコシン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、およびノルロイシンが含まれる。Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅは、フェニルグリシンで置換することができ；シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは、中性の非極性であり、システイン酸は、酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンは、ヒドロキシプロリンで置換し、特性を付与するコンフォメーションを保持することができる。
バリアントは、置換による変異誘発を介して生成させ、元のポリペプチドの生物学的活性、例えば、免疫原性活性を保持するか、なおまたはこれを増大させることができる。
本明細書で記載されるポリペプチドは、市販の自動式ペプチド合成器を用いて、例えば、化学合成により得ることができる。合成されるタンパク質またはポリペプチドは、沈殿させ、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、さらに精製することができる。代替的に、タンパク質およびポリペプチドは、組換え法、例えば、当技術分野で周知の組換え法により得ることができる。
コンジュゲート
本発明のポリペプチドは、別の部分または粒子にコンジュゲートすることができる。
タンパク質部分
場合によって、例えば、当技術分野で公知の二官能性薬剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、またはコハク酸無水物を用いて、ポリペプチドを、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ダイズトリプシン阻害剤、またはポリカチオン（ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｌ−アルギニン）にコンジュゲートするのが有用でありうる。
場合によって、コンジュゲートは、例えば、ポリペプチドの発現および精製を容易とするための組換え融合タンパク質でありうる。
ポリペプチドのコンジュゲーションまたは提示のための粒子
場合によって、ポリペプチドは、粒子、例えば、ファージ、酵母、ウイルス、ウィロソーム、または組換えウイルス様粒子にコンジュゲートするか、またはこれらの粒子上に提示する。
例えば、１または複数のポリペプチドを、ファージ、酵母、またはウイルス粒子に、例えば、粒子の表面にコンジュゲートすることができる。一実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸分子を、ファージ、酵母、またはウイルス粒子に挿入し、ファージ、酵母、またはウイルス、例えば、粒子の表面におけるポリペプチドの発現を結果としてもたらす。次いで、薬学的に許容される賦形剤を添加することにより、ポリペプチドを含有するファージ、酵母、またはウイルスの集団を、例えば、ワクチンとして単離および調製することができる。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチドを、ウィロソームまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）にコンジュゲートする。ウィロソームおよびＶＬＰは一般に、ウイルスに由来する１または複数のタンパク質であって、場合によってリン脂質と組み合わせるかまたはこれと共に調合されたタンパク質を含有する。これらのタンパク質は一般に、非病原性、かつ、非複製性であり、一般に、天然のウイルスゲノムのいずれも含有しない。ウイルスタンパク質は、全ウイルスから組換えにより作製または単離することができる。ウィロソームまたはＶＬＰにおける使用に適するウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質またはカプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、手足口病ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑ．β．−ファージ（コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が含まれる。ウィロソームについては、例えば、参照によりその全体において組み込まれる、Gluckら（２００２年）、Vaccine、２０巻：Ｂ１０〜Ｂ１６頁においてさらに論じられている。
ＶＬＰについては、例えば、それらの各々が参照によりその全体において組み込まれる、Niikuraら（２００２年）、Virology、２９３巻：２７３〜２８０頁；Lenzら（２００１年）、J Immunol、１６６巻：５３４６〜５３５５頁；Pintoら（２００３年）、J Infect Dis、１８８巻：３２７〜３３８頁；Gerberら（２００１年）、Viral、７５巻：４７５２〜４７６０頁；ＷＯ０３／０２４４８０；およびＷＯ０３／０２４４８１においてさらに論じられている。
抗体
本発明は、本明細書で記載されるポリペプチドまたはコンジュゲートに結合するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を特徴とする。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、例えば、Kohlerら、Nature、２５６巻：４９５頁、１９７５年により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することもでき、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により作製することもできる。ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターもしくはマカクザルなど、他の適切な宿主動物を、例えば、本明細書で記載されるポリペプチドまたはコンジュゲートを用いて免疫して、免疫に用いられるポリペプチドまたはコンジュゲートに特異的に結合する抗体を産生するかまたは抗体を産生することが可能なリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて免疫することもできる。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、５９〜１０３頁、Academic Press、１９８６年）。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合しなかった親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１または複数の物質を含有しうる適切な培養培地に播種して成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合は、ハイブリドーマ用の培養培地はヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）ことが典型的であり、これらの物質により、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長が防止される。
例示的な骨髄腫細胞は、選択された抗体産生細胞に効率的に融合し、これらによる抗体の安定的で高レベルの産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性の骨髄腫細胞である。これらのうちで、使用が考慮されうる特定の骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するマウス骨髄腫細胞系などのマウス骨髄腫細胞系である。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系についてもまた、記載されている（Kozbor、J. Immunol.、１３３巻：３００１頁、１９８４年；Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、５１〜６３頁、Marcel Dekker, Inc.、New York、１９８７年）。
ハイブリドーマ細胞を成長させる培養培地を、抗原を指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により決定することもでき、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合アッセイにより決定することもできる。
所望される特異性、アフィニティー、および／または活性を有する抗体をもたらすハイブリドーマ細胞を同定した後で、限界希釈手順によりクローンをサブクローニングし、標準的な方法（Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、５９〜１０３頁、Academic Press、１９８６年）により成長させることができる。この目的に適する培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、動物における腹水腫瘍として成長させることもできる。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリンの精製手順により、培養培地、腹水、または血清から適切に分離する。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として用いられる。単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに移入させ、次いで、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の細胞では免疫グロブリンタンパク質がもたらされない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。組換え抗体の産生については、下記でより詳細に記載される。
さらなる実施形態では、抗体または抗体断片を、例えば、McCaffertyら、Nature、３４８巻：５５２〜５５４頁、１９９０年において記載されている技法を用いて生成させる抗体ファージライブラリーから単離することができる。
Clacksonら、Nature、３５２巻：６２４〜６２８頁、１９９１年；およびMarksら、J. Mol. Biol.、２２２巻：５８１〜５９７頁、１９９１年は、それぞれのファージライブラリーを用いるマウス抗体およびヒト抗体の単離について記載している。後続の刊行物は、鎖シャフリングによる高アフィニティー（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製（Marksら、Bio/Technology、１０巻：７７９〜７８３頁、１９９２年）のほか、コンビナトリアル感染、および極めて大型のファージライブラリーを構築するための戦略としてのｉｎ ｖｉｖｏにおける組換え（Waterhouseら、Nucl. Acids Res.、２１巻：２２６５〜２２６６頁、１９９３年）について記載している。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な代替法である。
ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより修飾することもでき（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、８１巻：６８５１頁、１９８４年）、免疫グロブリン以外のポリペプチドのコード配列の全部または一部を、免疫グロブリンのコード配列に共有結合的に接合することにより修飾することもできる。
抗体の定常ドメインをこのような免疫グロブリン以外のポリペプチドで置換するか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインをこのような免疫グロブリン以外のポリペプチドで置換して、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を創出することが典型的である。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関与的な抗原およびアジュバントの複数回の注射、例えば、皮下注射または腹腔内注射により、動物においてもたらされることが典型的である。場合によって、例えば、当技術分野で公知の二官能性薬剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、またはコハク酸無水物を用いて、ポリペプチドを、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ダイズトリプシン阻害剤、またはポリカチオン（ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｌ−アルギニン）にコンジュゲートするのが有用でありうる。
加えて、本発明において有用な抗体は、天然に存在する抗体のほか、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体、またはヒト化抗体のほか、その抗原結合断片を含めた天然に存在しない抗体でもありうる。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することもでき、組換えにより作製することもでき、例えば、Ｐｏｎｓｅｌら（Molecules、１６巻（５号）：３６７５〜３７００頁（２０１１年））により記載されるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得ることもできる。当業者には、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、単鎖抗体、および二官能性抗体を作製するこれらの方法および他の方法が周知であり、市販もされている。
抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体は、配列番号３〜１０もしくは配列番号１１〜１８のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、または本明細書で開示される特異的なＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのタンパク質またはその断片のうちのいずれかなどの免疫原性ポリペプチドであって、天然の供給源から調製することもでき、組換えにより作製することもでき、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのタンパク質のペプチド部分から作製することもできる、免疫原性ポリペプチドを用いて作製することができる。本明細書で開示されるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのタンパク質のこのようなペプチド部分は、抗原性ペプチドの機能的な抗原性断片であり、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質特異的抗体を生成させるのに用いることができる。非免疫原性のポリペプチドもしくは免疫原性の弱いポリペプチドまたはその部分は、ポリペプチドを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体分子にカップリングすることにより免疫原性とすることができる。当技術分野では、多様な他の担体分子、およびポリペプチドを担体分子にカップリングするための方法が周知である（例えば、HarlowおよびLane、前出、１９８８年を参照されたい）。免疫原性ポリペプチド断片はまた、ペプチド部分を、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリＨｉｓなどへの融合タンパク質として発現させることにより生成させることもできる。当業者には、ペプチド融合体を発現させるための方法が周知である（Ausubelら、前出）。
本発明はさらに、試料を、特異的抗体と接触させることにより、試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌など、グラム陰性菌の存在を検出し、抗体の試料への特異的結合の存在を検出し、これにより、試料中のグラム陰性菌の存在を検出するための方法も提供する。例えば、抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質特異的抗体は、本明細書で開示される診断法であって、試料中に存在するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属のレベルを検出するための診断法において用いることができる。
本明細書で用いられる、「試料」という用語は、核酸またはポリペプチドを含むかまたは潜在的に含む任意の生物学的流体、細胞、組織、器官またはその一部分を意味することを意図する。この用語は、個体において存在する試料のほか、個体から得られるかまたは個体に由来する試料を含む。例えば、試料は、生検により得られる検体の組織学的切片の場合もあり、組織培養物中に入れられるかまたはこれに適応させた細胞の場合もある。試料はさらに、細胞内画分または細胞抽出物の場合もあり、核酸またはタンパク質の粗調製物または実質的に純粋な調製物の場合もある。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける試料中の標的であるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質の検出に有用な免疫学的手順には、検出可能な抗体を使用するイムノアッセイが含まれる。このようなイムノアッセイには、例えば、当技術分野で周知の免疫組織化学、免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＦＡＣＳ解析、免疫沈降、免疫ブロット解析、Ｐａｎｄｅｘ顕微蛍光測定アッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、および血清診断アッセイが含まれる（HarlowおよびLane、前出、１９８８年；HarlowおよびLane、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press（１９９９年））。
抗体は、当技術分野で周知の多様な手段により検出可能とすることができる。例えば、検出可能なマーカーは、抗体に直接的に接合することもでき、例えば、抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体を認識する二次薬剤を用いて間接的に接合することもできる。有用なマーカーには、例えば、放射性ヌクレオチド、酵素、結合タンパク質、例えば、ビオチン、蛍光発生物質、色原体、および化学発光標識が含まれる。
本発明に有用な標識には、検出可能なシグナルの発生に直接的または間接的に関与する単一の原子および分子が含まれる。本発明の核酸、ポリペプチド、または抗体には、任意の標識手段または指示手段を連結することができる。これらの原子または分子は、単独で用いることもでき、さらなる試薬と共に用いることもできる。このような標識はそれら自体、臨床診断化学において周知である。
一実施形態では、標識が、変性せずに抗体に化学的に結合して、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（色素）を形成する蛍光標識剤でありうる。当技術分野では、蛍光標識剤を作製してこれを用いるための方法は周知であり、市販もされている。
一実施形態では、標識基が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなどの酵素でありうる。別の実施形態では、放射性元素を、標識剤として使用する。当技術分野では、標識の基質への連結、すなわち、核酸、抗体、およびポリペプチドの標識化が周知である。例えば、本発明の抗体は、培養培地中に用意した放射性標識されたアミノ酸の代謝的組込みにより標識することができる。例えば、Galfreら、Meth. Enzymol.、７３巻：３〜４６頁（１９８１年）を参照されたい。加えて、本発明の抗体は、二官能性キレート化剤と共にコンジュゲートされた本発明の抗体を、放射性アイソトープ溶液中でインキュベートすることにより標識することもできる。例えば、米国特許第７，２２９，６２０号を参照されたい。活性化された官能基によるタンパク質のコンジュゲーションまたはカップリングの従来の手段は、市販されている。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を検出するための方法を提供する。これらの方法は、試料を本明細書で記載される抗体と接触させるステップと、抗体の試料への特異的結合の存在を検出し、これにより、試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を検出するステップとを含みうる。一部の態様では、抗体の結合が、本明細書で同定される特異的なＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質への結合である。例えば、方法は、試料中に存在するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺへの結合を含みうる。
記載された、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属を検出および解析するための組成物および方法は、Ｃａｎｄｉｄａ属を検出するためにも同様に適用可能である。
ワクチンおよび抗体を含有する医薬組成物
本明細書で記載されるワクチン調合および抗体を含有する医薬組成物（まとめて「組成物」）は、標準的な医薬調合化学および医薬調合法であって、当業者に容易に利用可能な医薬調合化学および医薬調合法を用いて調製することができる。例えば、本明細書で記載されるポリペプチド、コンジュゲート、または抗体は、１または複数の薬学的に許容される賦形剤または媒体と組み合わせることができる。賦形剤または媒体中には、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質を存在させることができる。これらの賦形剤、媒体、および補助物質は一般に、組成物を施された個体において免疫反応を誘導しない医薬剤であり、過度な毒性を伴わずに投与することができる。薬学的に許容される賦形剤には、水、生理食塩液、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれるがこれらに限定されない。薬学的に許容される賦形剤はまた、薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩も含むことができる。薬学的に許容される賦形剤、媒体、および補助物質についての完全な考察については、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co.、N.J.、１９９１年）において入手可能である。
このような組成物は、ボーラス投与または連続投与に適する形態で調製、包装、または販売することができる。注射用組成物は、防腐剤を含有するアンプルまたは複数回投与用の容器などの単位剤形で調製、包装、または販売することができる。組成物には、懸濁液、溶液、油性媒体中または水性媒体中のエマルジョン、ペースト、および植込み用徐放処方物または植込み用生物分解性処方物が含まれうるがこれらに限定されない。このような組成物は、懸濁化剤、安定化剤、または分散剤が含まれるがこれらに限定されない、１または複数のさらなる成分をさらに含みうる。非経口投与用組成物の一実施形態では、有効成分は、適切な媒体（例えば、滅菌の発熱物質非含有水）と共に再構成してから、再構成された組成物を非経口投与するための乾燥（例えば、粉末または顆粒）形態で提供される。組成物は、滅菌注射用の水性または油性の懸濁液または溶液の形態で調製、包装、または販売することができる。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従い調合することができ、有効成分に加えて、本明細書で記載される分散剤、保湿剤、または懸濁化剤などのさらなる成分を含みうる。このような滅菌注射用処方物は、例えば、水または１，３−ブタンジオールなど、非経口投与において許容される非毒性の希釈剤または溶媒を用いて調製することができる。他の許容される希釈剤および溶媒には、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成のモノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油が含まれるがこれらに限定されない。
有用な他の非経口投与用の組成物には、有効成分を、微晶質形態中、リポソーム調製物中、または生物分解性ポリマー系の成分として含む組成物が含まれる。徐放用または植込み用の組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩など、薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料を含みうる。
代替的に、本明細書で記載されるポリペプチド、コンジュゲート、および抗体は、粒子状担体内に封入することもでき、これに吸着させることもでき、これと会合させることもできる。適切な粒子状担体には、ポリメチルメタクリレートポリマーのほか、ポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に由来するＰＬＧマイクロ粒子に由来する粒子状担体が含まれる。例えば、Jefferyら（１９９３年）、Pharm. Res.、１０巻：３６２〜３６８頁を参照されたい。また、他の粒子状系および粒子状ポリマー、例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンのほか、これらの分子のコンジュゲートなどのポリマーも用いることができる。
調合された組成物は、本明細書で記載される１または複数のポリペプチドまたはコンジュゲートであって、免疫学的応答を誘起するのに十分な量のポリペプチドまたはコンジュゲートを含むことになる。当業者は、免疫原性量を容易に決定することができる。このような量は、日常的な試験を介して決定しうる比較的広い範囲内に収まるであろう。組成物は、ポリペプチド、コンジュゲート、または抗体のうちの約０．１％〜約９９．９％を含有することが可能であり、被験体に直接投与することもでき、代替的に、当業者に公知の方法を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、被験体に由来する細胞に送達することもできる。
組成物は、本明細書で記載される異なるポリペプチド、コンジュゲート、または抗体の混合物を含むことができる。例えば、ワクチンは、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上の、本明細書で記載される異なるポリペプチドまたはコンジュゲートであって、例えば、配列番号３〜１０もしくは１１〜１８のアミノ酸配列、または配列番号３〜１０または１１〜１８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して最大で３カ所の置換、欠失、もしくは付加を有するそのバリアント配列を含有するかまたはこれからなるポリペプチドまたはコンジュゲートを含むことができる。一実施形態では、ワクチンは、８つの異なるポリペプチドであって、アミノ酸配列が、配列番号１１〜１８の配列からなる８つのポリペプチドを含む。別の実施形態では、抗体を含有する医薬組成物は、例えば、本明細書で記載されるポリペプチドまたはコンジュゲートに対して異なる特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の混合物を含むことができる。
組成物、例えば、ワクチンは、免疫反応を刺激する物質、例えば、アジュバントを含むことができる。アジュバントとして用いられる化合物の例には、アルミニウム化合物（例えば、アラム、Ａｌハイドロゲル）、油、ブロックポリマー、免疫刺激複合体、ビタミンおよび鉱物（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレニウム、およびビタミンＢ１２）、Ｑｕｉｌ Ａ（サポニン）、細菌および真菌の細胞壁成分（例えば、リポ多糖、リポタンパク質、および糖タンパク質）、ホルモン、サイトカイン、および共刺激因子が含まれるがこれらに限定されない。
さらに別の態様では、本発明は、免疫原性量の、本明細書で記載されるＨＹＲ１ポリペプチド、本明細書で記載される融合タンパク質、ＨＹＲ１タンパク質（配列番号１）またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１もしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２もしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質もしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質もしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇもしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体もしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通もしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）もしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質もしくはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質もしくはその断片、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺもしくはその断片を有するワクチン組成物を提供する。ワクチン組成物は、アジュバントを含むことができる。本発明のワクチン組成物の処方物は、ポリペプチド抗原に対する特異的体液性（中和抗体）免疫反応およびエフェクター細胞介在性免疫反応の両方を刺激することにより、被験体における防御的免疫を誘導するのに有効である。本発明のワクチン組成物はまた、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを含めた、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌により引き起こされる感染など、グラム陰性菌感染の処置または予防においても用いられる。
本発明のワクチンは、免疫防御量のポリペプチド抗原を含有し、当技術分野で周知の方法により調製される。ワクチンの調製については一般に、例えば、M. F. PowellおよびM. J. Newman編、「Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)」、Plenum Press（１９９５年）；A. Robinson、M. Cranage、およびM. Hudson編、「Vaccine Protocols (Methods in Molecular Medicine)」、Humana Press（２００３年）；およびD. Ohagan編、「Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Methods in Molecular Medicine)」、Humana Press（２０００年）において記載されている。
本発明のポリペプチドおよびそのペプチド断片は、当技術分野で周知の実験法を用いて同定されうる免疫原性エピトープを含むことができる。加えて、コンピュータによるモデル化も用いて、免疫原性エピトープを同定することもできる。例えば、Tongら（Brief Bioinform.、８巻（２号）：９６〜１０８頁（２００６年））；およびPonomarenkoら（２００８年）、「B-cell epitope prediction」、Structural Bioinformatics、Bourne PEおよびGu J（編）、Wiley-Liss、２版、８４９〜８７９頁を参照されたい。完全タンパク質に対する抗体との反応性を保有するエピトープを同定したら、ペプチドを、あらゆる位置ならびに／またはＣ末端および／もしくはＮ末端両方の伸長部分におけるアミノ酸置換による特異性について調べることができる。ポリペプチドを保有するこのようなエピトープは、少なくとも６〜１４アミノ酸残基を含有することが典型的であり、例えば、当技術分野で周知の方法を用いるポリペプチド合成により作製することもでき、既存のポリペプチドを断片化することにより作製することもできる。本発明に準拠する免疫原として用いられる分子との関連において、当業者は、免疫原性ワクチンとして不可欠な品質を失わせずに、ポリペプチドを、切断または断片化しうることを認識するであろう。例えば、ポリペプチドは、Ｃ末端から切断することにより、免疫原性物質としての分子の機能的特性を温存したＮ末端断片をもたらすように切断することができる。同様に、Ｎ末端から切断することにより、免疫原性物質としての分子の機能的特性を温存させたＣ末端の断片を生成させることもできる。本明細書で提示される教示および指針に従う他の修飾を、本発明に準拠して施し、他のポリペプチドの機能的断片、免疫原性断片、それらのバリアント、類似体、または誘導体を創出して、本明細書で記載される治療的に有用な特性であって、天然のタンパク質およびポリペプチドによる特性を達成することもできる。
本発明のワクチン組成物は、従来の医薬担体もさらに含有する。当業者には、適切な担体が周知である。これらのワクチン組成物は、液体の単位剤形に調製することができる。当業者は、他の任意選択の成分、例えば、医薬グレードの安定化剤、緩衝液、防腐剤、賦形剤なども容易に選択することができる。しかし、組成物は、凍結乾燥させ、使用前に再構成することができる。代替的に、ワクチン組成物は、例えば、鼻腔内投与、経口投与などの選択した投与方式に適する任意の様式で調製することもできる。ｐＨ、等張性、安定性などに正当に留意した、薬学的に許容されるワクチンの調製は、当技術分野の技術の範囲内にある。
ワクチンがアジュバント物質をさらに含む場合、本発明のワクチン組成物の免疫原性はさらに増強されうる。ワクチンのためのアジュバント効果を達成する多様な方法が公知である。一般的な原理および方法は、「Vaccine Design: Innovative Approaches and Novel Strategies」、２０１１年、Rappuoli R.およびBagnoli F.（編）、Caister Academic Pressにおいて詳述されており；また、「Vaccine Adjuvants and Delivery Systems」、２００７年、Singh, M.（編）、John Wiley & Sons, Inc.においても詳述されている。
本発明に従うワクチンとは、個体に投与して、感染性疾患に対して個体を防御しうる組成物を指す。ワクチンは、動物において、感染性疾患に対する免疫反応を誘導するかまたは増大させることにより、疾患に対して防御する。本発明のワクチンによる処置に適する例示的な感染性疾患には、重度の肺炎、尿路の感染、血流の感染、および体内の他の部分の感染が含まれる。ワクチンを媒介する防御は、被験体を、例えば、本明細書で記載されるポリペプチドまたはタンパク質の免疫原性部分で感作するとき、宿主において誘導される体液性免疫および／または細胞介在性免疫でありうる。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属もしくはＣａｎｄｉｄａ属による感染またはこれらの両方に対して感受性の被験体へのワクチン接種に加えて、本発明のワクチン組成物はまた、多様なグラム陰性菌感染を患う被験体を免疫療法により処置するのにも用いることができる。したがって、本明細書で記載されるポリペプチドおよび／または抗体組成物のうちの１または複数を含有するワクチンであって、アジュバントと組み合わせたワクチンは、グラム陰性菌による感染に対する予防的処置または治療的処置の目的で作用させることができる。一実施形態では、本発明のワクチンにより、身体自身の免疫系が誘導され、グラム陰性菌もしくはＣａｎｄｉｄａ属またはこれらの両方が探索および阻害されるであろう。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される治療有効量の医薬組成物または本明細書で開示されるワクチン組成物を投与することにより、それを必要とする被験体におけるグラム陰性菌による感染を処置または防止する方法を提供する。例えば、本発明は、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａ．ｉｗｏｆｆｉｉ、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ、およびＡ．ｊｕｎｉｉなど、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌；Ｈ．ａｅｇｙｐｔｉｕｓ、Ｈ．ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈ．ａｖｉｕｍ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈ．ｆｅｌｉｓ、Ｈ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｐａｒａｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、Ｈ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ、およびＨ．ｓｏｍｎｕｓなど、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属の細菌；Ｂ．ａｎｓｏｒｐｉｉ、Ｂ．ａｖｉｕｍ、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂ．ｈｉｎｚｉｉ、Ｂ．ｈｏｌｍｅｓｉｉ、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｐｅｔｒｉｉ、およびＢ．ｔｒｅｍａｔｕｍなど、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属の細菌；Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｓａｌａｍａｅ、Ｓ．ａｒｉｚｏｎａｅ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｄｉａｒｉｚｏｎａｅ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｕｔｅｎａｅ、およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａなど、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属の細菌；Ｙｅｒｓｉｎａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒ、Ｙ．ａｌｄｏｖａｅ、Ｙ．ａｌｅｋｓｉｃｉａｅ、Ｙ．ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙ．ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ、Ｙ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｙ．ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ、Ｙ．ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙ．ｒｏｈｄｅｉ、およびＹ．ｒｕｃｋｅｒｉなど、Ｙｅｒｓｉｎａ属の細菌；Ｅ．ａｌｂｅｒｔｉｉ、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ、およびＥ．ｖｕｌｎｅｒｉｓなど、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌；Ｐ．ｈｅｐａｒｉｎｕｓ、Ｐ．ｒｏｓｅｕｓ ｓｐ．ｎｏｖ．、およびＰ．ａｑｕａｔｉｌｉｓ ｓｐ．ｎｏｖ．など、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属の細菌；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ、Ｐ．ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐ．ｌｕｔｅｏｌａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ、Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｐ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｍａｌｌｅｉ、およびＰ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉなど、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の細菌；またはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、およびＫ．ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓなど、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌を含めた、１または複数のグラム陰性菌により引き起こされる感染を処置または防止する方法を提供する。他の実施形態では、本明細書で開示されるＣａｎｄｉｄａ属種を、処置または阻止することができる。
さらに、本発明はまた、単独で投与されることに加えて、本発明のワクチンおよび医薬組成物が、１または複数の抗生物質と共に共投与されうることも前提とする。当業者は、共投与に有用でありうる抗生物質を容易に決定することができる。共投与されうる抗生物質の非限定的な例には、イミペネムなどのカルバペネム系抗生物質、またはポリミキシン、チゲサイクリン、もしくはアミノグリコシドなど、第２選択の抗生物質が含まれる。Ｂａｓｓｅｔｔｉら（Future Microbiol.、３巻（６号）：６４９〜６０頁（２００８年１２月））を参照されたい。
処置
本発明は、哺乳動物に、カンジダ症に対してワクチン接種する方法を特徴とし、動物に本明細書で記載されるワクチンを投与し、これにより、哺乳動物に、カンジダ症に対してワクチン接種するステップを含む。加えて、本発明は、哺乳動物を、カンジダ症に対して受動免疫する方法も特徴とし、哺乳動物に、有効量の、本明細書で記載される医薬組成物を投与し、これにより、哺乳動物を、カンジダ症に対して受動免疫するステップを含む。カンジダ症には、例えば、播種性カンジダ症、例えば、血行性播種性カンジダ症、または粘膜性カンジダ症が含まれうる。場合によって、カンジダ症は、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓにより引き起こされる。他のＣａｎｄｉｄａ属種には、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａが含まれる。
本明細書で記載されるワクチンおよび抗体を含有する医薬組成物（まとめて「組成物」）は、それら自身で、あるいは、病原体（例えば、ウイルス性病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、または寄生性病原体）、腫瘍もしくはがん、アレルゲン、自己免疫障害、または移植片拒絶に対する防御的応答を誘導する他の当技術分野で公知の組成物と組み合わせて、予防的または治療的に投与することができる。例えば、組成物は、例えば、インフルエンザ、マラリア、結核、天然痘、麻疹、風疹、ムンプスのワクチン、または当技術分野で公知の他の任意のワクチンなど、例えば、別の免疫ワクチンと共に、同時に投与することもでき、個別に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
本明細書で記載される組成物は、多様な公知の経路および技法を用いて、哺乳動物被験体（例えば、ヒトまたは本明細書で記載される他の哺乳動物）に送達することができる。例えば、組成物は、注射用溶液、懸濁液、またはエマルジョンとして用意し、従来の注射針およびシリンジを用いる筋内注射、皮下注射、皮内注射、腔内注射、非経口注射、表皮注射、動脈内注射、腹腔内注射、または静脈内注射を介して投与することもでき、液体ジェット注射システムを用いるこれらの注射を介して投与することもできる。組成物はまた、鼻腔内、気管内、腸内、直腸内または膣内など、皮膚組織または粘膜組織に局所投与することもでき、呼吸器内投与または肺内投与に適切な微粉化スプレーとしてもたらすこともできる。他の投与方式には、経口投与、坐剤、および能動経皮送達法または受動経皮送達法が含まれる。
本明細書で記載される組成物は、剤形と適合可能であり、予防的および／または治療的に有効な量で、哺乳動物被験体（例えば、ヒトまたは本明細書で記載される他の哺乳動物）に投与することができる。適切な有効量は、比較的広い範囲内に収まるが、当業者は、日常的な試験により、容易に決定することができる。「Physicians Desk Reference」、および「Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics」は、必要とされる量を決定する目的で有用である。
予防または治療は、単一の時点における単一の直接的投与により達成することもでき、場合によって、複数の時点における複数の投与により達成することもできる。投与はまた、単一の部位に送達することもでき、複数の部位に送達することもできる。当業者は、投与および濃度を、特定の送達経路に適するように調整することができる。一実施形態では、単一の投与を、単一の機会に行う。代替的な実施形態では、同じ機会であるが、例えば、異なる部位に、複数の投与を被験体に行う。さらなる実施形態では、複数の機会に複数の投与を行う。このような複数の投与は、バッチで、すなわち、同じ機会の異なる部位における複数の投与により行うこともでき、複数の機会の各々における１つずつの投与（場合によって、複数の部位における）により個別に行うこともできる。このような投与レジメの任意の組合せを用いることができる。
一実施形態では、本発明の異なる組成物を、同じ処置レジメの一部として、異なる部位または異なる機会に投与することができる。
異なる投与は、同じ機会に実施することもでき、同じ日に実施することもでき、１、２、３、４、５、または６日間隔てて実施することもでき、１、２、３、４週間以上隔てて実施することもできる。場合によって、投与は、１〜５週間隔てて、例えば、２週間、３週間、または４週間隔ててなど、２〜４週間隔てて実施する。当業者は、日常的な試験により、このような複数の投与のスケジュールおよびタイミングを、特定のワクチンまたは医薬組成物のために最適化することができる。
本明細書で用いられる場合の「〜を処置すること」または「処置」という用語は、細菌感染を示す臨床症状の改善を意味すると意図する。臨床症状の改善には、例えば、処置される個体における細菌感染の、処置前のレベルと比較するかまたは細菌感染を伴う個体と比較した、少なくとも１つの症状の減殺または軽減が含まれる。処置することはまた、細菌感染と関連する病理学的状態、慢性合併症、または日和見感染の重症度の軽減を含むことも意図する。病理学的状態、慢性合併症、および日和見感染はまた、例えば、Merck Manual、１６版、１９９２年；およびAcinetobacter: Molecular Biology、Ulrike Gerischer（編）、Caister Academic Press、１版（２００８年）において記載されていることも見出すことができる。
本明細書で用いられる場合の「〜を防止すること」または「防止」という用語は、細菌感染を示す臨床症状を未然に防ぐことを意味すると意図する。このような、未然に防ぐことには、例えば、状態の顕在的な症状の発症前または状態の診断前の、細菌による感染の危険性がある個体における、正常な生理学的指標の維持が含まれる。したがって、防止することには、個体を細菌感染の発生から守るための個体の予防的処置が含まれうる。個体における細菌感染を防止することはまた、感染の発症を阻害すること、または停止させることも含むと意図する。状態の発症を阻害することまたは停止させることには、例えば、発赤、発熱、腫脹、および局在化された疼痛、ならびに／または他の周知の症状などの異常な生理学的指標または臨床症状の発生を阻害すること、または停止させることが含まれる。したがって、細菌感染の有効な防止には、正常な体温、体重の維持、または細菌感染の素因がある個体における他の病理学的徴候を防止することが含まれるであろう。細菌感染の素因がある個体には、例えば、ＡＩＤＳ、高窒素血症、糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、好中球減少症、気管支拡張症、肺気腫、結核（ＴＢ）、リンパ腫、白血病、もしくは火傷を伴う個体、または化学療法、骨髄移植、幹細胞移植、および／もしくは固形臓器移植を受けつつある個体、または細菌感染に対する感受性の履歴を伴う個体であるがこれらに限定されない免疫不全の個体が含まれる。状態の発症を阻害することまたは停止させることにはまた、例えば、細菌と関連する１もしくは複数の病理学的状態の進行、慢性合併症、または日和見感染に対する感受性を阻害することまたは停止させることも含まれる。
投与
本明細書で記載されるワクチンまたは抗体を含有する医薬組成物の適切な用量は、調製法、投与法、患者の年齢、体重、および性別、症状の重症度、投与回数、投与経路、排出速度、および応答性などの因子に応じて変化しうる。医療技術分野の当業者は、処置に有効な投与用量を容易に決定および診断するであろう。
当業者は、当技術分野で公知の方法に従い、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて、組成物を、単位用量調製物または複数回投与用調製物に調製することができる。
ベクター
本発明はまた、本発明の核酸を含有するベクターも提供する。当技術分野では、適切な発現ベクターが周知であり、核酸の発現を調節することが可能なプロモーター領域またはエンハンサー領域などの調節配列または調節エレメントに作動的に連結された核酸を発現させることが可能なベクターが含まれる。適切な発現ベクターには、真核細胞内および／または原核細胞内で複製可能なベクター、ならびにエピソーム性を維持するかまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。
「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」という用語は、核酸を宿主細胞に導入しうる媒体を意味する。ベクターは、核酸の増殖もしくは保有、またはコードされる配列のポリペプチドへの発現に用いることができる。当技術分野では、多種多様なベクターが公知であり、例えば、プラスミド、ファージ、およびウイルスが含まれる。例示的なベクターは、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning： A Laboratory Manual」、３版、Cold Spring Harbor Laboratories、Cold Spring Harbor、N.Y.、２００１年；およびAusubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、Baltimore、MD （１９９９年））において記載されていることを見出すことができる。
プロモーターまたはエンハンサーは、調節の性格に応じて、構成的な場合もあり、調節的な場合もある。調節配列または調節エレメントは、核酸と調節配列との物理的および機能的関係が核酸の転写を可能とするように、本発明の核酸に作動的に連結される。
真核細胞における発現に有用なベクターには、例えば、ＳＶ４０早期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどを含めた調節エレメントが含まれうる。本発明のベクターは、核酸分子をサブクローニングおよび増幅し、本明細書で開示されるポリペプチドを組換えにより発現させるのに有用である。本発明のベクターには、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルスベクター；コスミドまたはプラスミドが含まれる可能性があり、特に、大型の核酸分子をクローニングするためには、細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）および酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）が含まれうる。このようなベクターは、市販されており、当技術分野では、それらの使用が周知である。当業者は、特定の宿主細胞における発現に適するプロモーターについて承知し、これを容易に決定することができるであろう。
本発明は、本発明の核酸を含有する組換え細胞もさらに提供する。組換え細胞は、核酸分子を含有するベクターを宿主細胞に導入することにより発生させる。組換え細胞は、形質導入されるか、トランスフェクトされるか、または他の形で遺伝子改変される。組換え分子を発現させるのに用いうる例示的な宿主細胞には、哺乳動物初代細胞；ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＰＣ１２細胞などの確立された哺乳動物細胞系；Ｘｅｎｏｐｕｓ属の胚および卵母細胞などの両生動物細胞；ならびに他の脊椎動物細胞が含まれる。例示的な宿主細胞にはまた、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属などの昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母細胞、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの原核細胞も含まれる。
本発明の実施形態はまた、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを含めたグラム陰性菌に対する免疫反応を発生させるための抗原として作用しうる特異的なＨＹＲ１ポリペプチドも提供する。本発明の一部の態様では、本発明のＨＹＲ１ポリペプチドは、配列番号３〜１０のほか、ＣＧＰＳＡＰＥＳＥＳＤＬＮＴＰ（配列番号１１）、ＣＧＮＲＤＨＦＲＦＥＹＹＰＤＴ（配列番号１２）、ＣＧＹＤＳＫＬＦＲＩＶＮＳＲＧ（配列番号１３）、ＣＫＩＫＧＴＧＣＶＴＡＤＥＤＴ（配列番号１４）、ＣＬＫＮＡＶＴＹＤＧＰＶＰＮＮ（配列番号１５）、ＮＳＫＳＳＴＳＦＳＮＦＤＩＧＣ（配列番号１６）、ＣＥＰＴＨＮＦＹＬＫＤＳＫＳＳ（配列番号１７）、およびＴＳＲＩＤＲＧＧＩＱＧＦＨＧＣ（配列番号１８）から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに、本発明の一部の態様では、ＨＹＲ１ポリペプチドが、９３７未満、９３６未満、９３５未満、９３４未満、９３３未満、９３２未満、９３１未満、９３０未満、９２０未満、９１０未満、９００未満、８９０未満、８８０未満、８７０未満、８６０未満、８５０未満、８４０未満、８３０未満、８２０未満、８１０未満、８００未満、７９０未満、７８０未満、７７０未満、７６０未満、７５０未満、７４０未満、７３０未満、７２０未満、７１０未満、７００未満、６９０未満、６８０未満、６７０未満、６６０未満、６５０未満、６４０未満、６３０未満、６２０未満、６１０未満、６００未満、５９０未満、５８０未満、５７０未満、５６０未満、５５０未満、５４０未満、５３０未満、５２０未満、５１０未満、５００未満、４９０未満、４８０未満、４７０未満、４６０未満、４５０未満、４４０未満、４３０未満、４２０未満、４１０未満、４００未満、３９０未満、３８０未満、３７０未満、３６０未満、３５０未満、３４０未満、３２０未満、３１０未満、３００未満、２９０未満、２８０未満、２７０未満、２６０未満、２５０未満、２４０未満、２３０未満、２２０未満、２１０未満、２００未満、１９０未満、１８０未満、１７０未満、１６０未満、１５０未満、１４０未満、１３０未満、１２０未満、１１０未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満または２０未満の長さのアミノ酸残基を含み、免疫原性であることが可能である。本発明の一部の態様では、本発明のＨＹＲ１ポリペプチドが、配列番号１のＨＹＲ１ポリペプチドではない。
さらに他の態様では、本発明はまた、ポリペプチドが、配列番号３〜１０または配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つに示される複数のアミノ酸配列を含む実施形態も提供する。例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号１２と組み合わせた配列番号１５、または代替的に、配列番号１７と組み合わせた配列番号１１、または代替的に、配列番号１８と組み合わせた配列番号１３など、２つのアミノ酸配列を含むことができる。本発明のポリペプチドは、配列番号３〜１０または配列番号１１〜１８から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのアミノ酸配列全てを含みうることが理解される。また、アミノ酸配列は、連続的である必要がなく、介在するスペーサー配列であって、例えば、ポリペプチドが、免疫反応を発生させるために所望されるアミノ酸配列またはエピトープを提示することを可能としうる配列により連結しうることも理解される。
本発明の一部の態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号３〜１０または配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つに示される、実質的に同じアミノ酸配列を含む。例えば、アミノ酸配列は、配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つに対する、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ここで、このポリペプチド断片には、本明細書で開示される抗ＨＹＲ１抗体が結合しうる。他の態様では、本発明のＨＹＲ１ポリペプチドは、免疫原性であることが可能であり、被験体における抗ＨＹＲ１抗体の産生または免疫原性応答を誘発することが可能である。
本明細書で記載される通り、本発明のポリペプチドは、基準のアミノ酸配列との関連において少なくとも約６５％の同一性を有し、基準のアミノ酸配列に特徴的である、同等な機能的および生物学的活性を保持する、実質的に類似のアミノ酸配列を包摂しうる。一態様では、実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するであろう。しかし、記載されるレベル未満の配列同一性を含有するポリペプチドまたはコード核酸であって、スプライスバリアントとして現れるか、または保存的アミノ酸置換もしくは縮重コドンの置換によりにより修飾されたポリペプチドまたはコード核酸もまた本発明の範囲内に包摂されることが認知される。
以下の例は、本発明を例示するものである。それは、いかなる形であれ、本発明を限定することを意図するものではない。
（実施例Ｉ）
ｒＨｙｒ１−Ｎによる能動免疫および受動免疫は、血行性播種性カンジダ症に対して防御する
ＨＹＲ１は、１２のメンバーを含む、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＩＦＦ遺伝子ファミリーに属する。ＨＹＲ１は、菌糸形成時に発現する細胞表面グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質をコードする。Ｈｙｒ１ｐは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける食細胞による殺滅に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの抵抗性を媒介し、食細胞に富む器官（例えば、肝臓および脾臓）における真菌負荷の上昇に寄与することが既に示されている。天然のＨＹＲ１は、転写因子であるＢｃｒ１ｐにより正に調節される。ＨＹＲ１の自律的発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのｂｃｒ１ヌル変異体の食細胞介在性殺滅に対する感受性過剰を逆転させることが見出された。さらに、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａにおけるＨＹＲ１の異種発現は、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａの好中球による殺滅に対する抵抗性を高めた。かつての研究はまた、Ｈｙｒ１ｐの組換えＮ末端（ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ）に基づくワクチンが、アジュバントとしてのフロイントのアジュバントまたはアラムと混合されると、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓで静脈内感作された免疫正常マウスの生存を顕著に改善することも示した。
本研究は、とりわけ、免疫正常マウスおよび免疫不全マウスの両方におけるｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンの有効性をさらに規定するために、ＦＤＡで承認されたアラムをアジュバントとして用いて実施した。さらに、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎにより誘導される防御の幅を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ以外のＣａｎｄｉｄａ属種に対するその有効性により評価した。最後に、我々は、抗Ｈｙｒ１抗体を用いて、受動免疫療法の、播種性カンジダ症における潜在的使用について研究しようと試みた。
材料および方法
Ｃａｎｄｉｄａ属株および成長条件
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ １５６６３、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ ３１０２８、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ ２２０１９、およびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ４２４３は、Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒから回収された臨床血流単離株である。Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ ９１−１１５９は、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｎａｌｄｉ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸにより恵与された。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株であるＣＡＡＨ−３１およびＴＨＥ３１は、我々のかつての研究で記載される通りに操作し、ドキシサイクリンを用いて、ＨＹＲ１の発現を調節した［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］。全ての被験株は、ＹＰＤ（２％のＢａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、１％の酵母抽出物、２％のデキストロース）中で日常的に成長させた。細胞密度は、血球計でカウントすることにより決定した。
ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎの作製
既に記載した［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］通りに、６×ＨｉｓでタグづけされたｒＨｙｒ１ｐ−ＮをＥ．ｃｏｌｉ内で作製し、Ｎｉ−アガロースアフィニティーカラムにより精製した。ＰｒｏｔｅｏＳｐｉｎ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎから内毒素を除去し、製造元の指示書に従い、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ ｅｎｄｏｃｈｒｏｍｅ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）により内毒素レベルを決定した。この手順を用いて、内毒素を、ワクチンの投与１回当たり＜０．１ＥＵに軽減した。
合成ペプチドおよびウサギ抗Ｈｙｒ１ｐポリクローナル抗体
市販用に合成されているｒＨｙｒ１ｐ−Ｎに由来する８つのペプチド（表１）を、抗Ｈｙｒ１ｐ抗体を発生させるのに用いた。ＨＰＬＣおよび質量分析（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により決定されたペプチドは、＞８５％純粋であった。ウサギ抗血清をもたらす前に、標準的な免疫プロトコール（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を個別に用いて、これらのペプチドを、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートした。受動免疫研究における投与するステップの前に、プールされた血清に由来する全ＩｇＧを、製造元の指示書に従い、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｐｌｕｓ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてアフィニティー精製した。
Ｈｙｒ１ｐの細胞内局在化の免疫蛍光法による検出
既に記載した通りに、プールされたｒ−Ｈｙｒ１ｐ−Ｎの８つのペプチドに対してもたらされたウサギ抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧを用いて、間接的免疫蛍光法を実施した［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］。略述すると、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの出芽胞子（１×１０７個）を、ＲＰＭＩ １６４０中、３７℃で９０分間にわたりあらかじめ発芽させ、４ウェルのチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に移した。４℃で３０分間にわたるインキュベーション後、１．５％のマウス血清３００μｌで細胞をブロッキングし、次いで、１）プールされた抗Ｈｙｒ１ ＩｇＧ、２）プールされた抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧであって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸に取り込ませた抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧ（プールされたＩｇＧを、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸１×１０７本と共に、各回氷上で３０分間ずつ４回にわたり繰り返しインキュベートすることにより）、または３）対照のウサギＩｇＧの１：５００希釈液で染色した。細胞は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ蛍光顕微鏡で造影する前に、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧにより、１：１００の希釈率で対染色した。
免疫プロトコールおよび動物研究
全ての能動ワクチン接種は、既に記載した通り［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］に行った。略述すると、０日目に、若齢（１０〜１２週齢）のＢａｌｂ／Ｃマウスに、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中で、アジュバントとしてのアラム（２％のＡｌハイドロゲル；Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と混合した３０μｇのｒＨｙｒ１ｐ−Ｎを、皮下ワクチン接種し、２１日目に同じ投与を追加接種した、次いで、３５日目に、尾静脈を介して感染させた［Ibrahimら、Infect. Immun.、７３巻：９９９〜１００５頁（２００５年）］。対照マウスには、アラム単独をワクチン接種した。
免疫不全マウスにおけるワクチンの有効性を調べるために、２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドの腹腔内注射により好中球減少症を誘導する前の−２日目において、上記の通り、マウスにワクチン接種した後、感染の＋７日目に、１００ｍｇ／ｋｇのさらなる投与を行った。既に記載された通り［Spellbergら、Infect. Immun.、７３巻：６１９１〜６１９３頁（２００５年）；Fuら、Eukaryot. Cell.、７巻：４８３〜４９２頁（２００８年）；Sheppardら、Antimicrob. Agents Chemother.、４８巻：１９０８頁〜１９１１頁（２００４年）］、このレジメンは、好中球カウント、リンパ球カウント、および単球カウントの低減を伴う、約１０日間にわたる白血球減少症を結果としてもたらした。免疫正常マウスおよび好中球減少性マウスのいずれについても、ワクチン接種されたマウスと、アジュバントでワクチン接種されたマウスとの生存の差違を、ログランク検定で比較した。
受動免疫のために、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを静脈内感染させる２時間前に、免疫ＩｇＧを、ナイーブマウスに腹腔内投与した。対照マウスには、アイソタイプの対応するＩｇＧ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を施した。ＩｇＧ投与は、感染後３日間にわたり繰り返し、マウスの生存を毎日２回ずつモニタリングした。
ワクチン接種されたマウスまたは対照マウスであって、Ｃａｎｄｉｄａ属の異なる種を感染させたマウスに由来する腎臓の定量的培養を、既に記載した通り［Ibrahimら、Infect. Immun.、７４巻：３０３９〜３０４１頁（２００６年）］に実施した。略述すると、マウスに、尾静脈を介して感染させた。感染の３日後に腎臓を摘出し、ホモジナイズし、０．８５％の生理食塩液中で系列希釈し、５０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＹＰＤ上で定量的に培養した。３７℃で２４〜４８時間にわたりプレートをインキュベーションした後、コロニーをカウントした。結果を、感染させた内臓１グラム当たりのｌｏｇ ＣＦＵとして表現した。
真菌負荷実験と共時的に、組織病理学的検討のために、１群当たり２匹ずつのマウスから腎臓を無菌的に除去した。検討を行うまでの間、腎臓を、亜鉛ホルマリン固定剤中に浸漬した。固定された内臓を、勾配をつけたアルコール溶液中で脱水処理し、パラフィン中に包埋し、６μｍ厚の切片に切り刻んだ。スライド処理された切片を、ＧＭＳ（Ｇｏｍｏｒｉ ｍｅｔｈｅｎａｍｉｎｅ ｓｉｌｖｅｒ）染色し、光学顕微鏡で検討した［Davisら、Infect. Immun.、６８巻：５９５３〜５９５９頁（２０００年）］。
酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンが、免疫反応を誘導したかどうかを調べるために、既に記載した通りに、ワクチン接種されたマウスおよび対照マウスから回収された血清試料の抗体力価を、９６ウェルプレートによるＥＬＩＳＡにより決定した［Ibrahimら、Infect. Immun.、７３巻：９９９〜１００５頁（２００５年）］。ウェルを、ウェル１つ当たり、ＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌのｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ １００μｌずつでコーティングした。マウス血清を、トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ；３％のウシ血清アルブミンを含有する０．０１ＭのトリスＨＣｌ［ｐＨ７．４］、０．１５ＭのＮａＣｌ）によるブロッキングステップの後、室温で１時間にわたりインキュベートした。ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＴＢＳで３回にわたり洗浄した後、ＴＢＳでさらに３回にわたり洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）と共にコンジュゲートされたヤギ抗マウス二次抗体を、１：５０００の最終希釈率で添加し、プレートを、室温で１時間にわたりさらにインキュベートした。ウェルをＴＢＳで洗浄し、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）、および３０％のＨ２Ｏ２ １０μｌを含有する基質と共にインキュベートした。３０分間にわたり発色させ、その後、１０％のＨ２ＳＯ４を添加することにより、反応を終了させ、４９０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を、マイクロ滴定プレートリーダーにより決定した。陰性対照のウェルには、希釈剤だけを施し、被験ウェルからバックグラウンドの吸収を減じて、最終のＯＤリーディングを得た。ＥＬＩＳＡ力価は、陽性ＯＤリーディング（すなわち、陰性対照試料の平均ＯＤに標準偏差の２倍を加えた値を超える）をもたらした最後の血清希釈率の逆数として測定した。
Ｆ（ａｂ’）２遮断アッセイ
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの食細胞介在性殺滅における、抗Ｈｙｒ１ｐ抗体を媒介する防御機構について研究するために、好中球様表現型に分化させたＨＬ−６０細胞を用いた［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］。以前に記載した通りに、抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧまたはＦ（ａｂ’）２断片の存在下で殺滅アッセイを行った［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］。略述すると、ＨＬ−６０細胞を、５％のＣＯ２を伴う３７℃で３日間にわたり、２．５μＭのレチノイン酸および１．３％のＤＭＳＯにより誘導した。免疫抗Ｈｙｒ１ペプチド（表１）血清をプールし、プロテインＡアガロース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて全ＩｇＧを単離した。ペプチドによる免疫前に同じウサギから回収された血清が対照血清として用いられた。免疫ＩｇＧまたは対照ＩｇＧに由来するＦ（ａｂ’）２断片を、製造元の指示書に従い、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、Ｆｃ断片のうちの＞９５％が、このキットにより消化されることを示した（データは示さない）。次に、Ｈｙｒ１ｐを過剰発現させるかまたは抑制するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］を、５０μｇ／ｍｌのワクチン接種用のＦ（ａｂ’）２断片、または対照のＦ（ａｂ’）２断片と共に、氷上で４５分間にわたりインキュベートした。ＹＰＤプレート上における超音波処理および定量的培養の前に、Ｆ（ａｂ’）２断片と共に共培養されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを、ＨＬ−６０に由来する好中球と共に、５％のＣＯ２を伴う３７℃で１時間にわたりインキュベートした。殺滅％は、ＨＬ−６０に由来する好中球を伴う共培養後におけるＣＦＵの数を、好中球様細胞を伴わずに培地と共にインキュベートされたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＣＦＵの数で除することにより計算した。
統計学的解析
ノンパラメトリックのログランク検定を用いて、マウスの生存期間の差違を決定した。好中球殺滅アッセイ、抗体の力価、および組織の真菌負荷を、対応のない比較について、マン−ホイットニーのＵ検定で比較した。スピアマンのランクサム検定で相関を計算した。＜０．０５のＰ値を有意と考えた。
マウスを伴う全ての手順は、動物の飼育およびケアについての米国保健研究所のガイドラインに従う、プロジェクト１１６７２−０５のための、とりわけ、本ワクチン研究のための、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物の使用およびケアに関する委員会により承認された。同研究所は、米国公衆衛生局により承認された動物福祉保証第Ａ３３３０−０１号を有する。
結果
ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンにより、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓで静脈内感作された免疫正常マウスにおける生存が改善し、真菌負荷が減少した
ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ免疫原の最も有効な投与を決定するために、３倍の投与範囲（マウス１匹当たり１〜３０μｇずつ）を評価した。雌の若齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを、アラム（２％のＡｌハイドロゲル；Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）を加えたｒＨｙｒ１ｐ−Ｎまたはアラム単独で免疫した。その後、これらのマウスに、致死量のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの接種材料（７×１０５個の出芽胞子）を感染させた。ワクチン接種されたマウスは、アジュバントによる対照マウスと比較して、生存の有意な改善を示した（図１Ａ）。１μｇを除く全ての被験投与が、アジュバント単独を施されたマウスと比較して生存を延長または改善し、１０および３０μｇに対する用量反応が、最大の有効性を示すことが見出された（図１Ａ）。実験は２８日目に終了させ、全てのマウスは見かけの健康を維持した。
ワクチン接種の真菌負荷に対する影響を決定するために、上記の通りに、若齢マウスにワクチン接種し、感染させた。感染の３日後（かつての実験に基づき、対照マウスが死亡すると予測された１日前）、マウスを安楽死させ、主要な標的器官である腎臓を摘出して、組織の真菌負荷を決定した。ワクチン接種は、対照マウスと比較して、組織の真菌負荷を約１６倍軽減した（ｐ＜０．０１）（図１Ｂ）。
ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎをワクチン接種されたマウスから摘出された腎臓の組織病理学的検討により、出芽胞子形成時に主に存在する最小限の真菌残留物を伴う極めて少数の膿瘍が裏付けられたことは、生存データおよび真菌負荷データと符合する（図２Ｂ）。これに対し、アラム単独をワクチン接種されたマウスから採取された腎臓では、大半が何らかの菌糸および偽菌糸を伴う酵母形態を示す真菌細胞で満たされた多数の膿瘍が検出された（図２Ａ）。感染の重症度の半定量的評価は、視野１つ当たりの膿瘍の有意な低減を示したほか、ワクチン接種されたマウスにおける膿瘍１つ当たりのＣａｎｄｉｄａ属細胞も、対照における膿瘍１つ当たりのＣａｎｄｉｄａ属細胞と比較して低減された（図２Ｃ、ウィルコクソンのランクサム検定によりＰ＜０．０００１）。
ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎは、免疫不全マウスを、カンジダ症に対して有効に防御した
免疫不全患者のうちのかなりの割合が、多様なワクチンに応答することが公知である［Dockrellら、Vaccine、１７巻：２７７９〜２７８５頁（１９９９年）；Chokephaibulkitら、Vaccine、２２：２０１８〜２０２２頁（２００４年）；dos Santosら、ＡＩＤＳ Res．Hum. Retroviruses、２０巻：４９３〜４９６頁（２００４年）；Kingら、Pediatrc. Infect. Dis.、１５巻：１９２〜１９６頁（１９９６年）］。我々は、好中球減少性マウスを、播種性カンジダ症から防御するための、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンの潜在的な使用法を規定しようと試みた。１２日間にわたる３０ｍｇのｒＨｙｒ１ｐ−Ｎによる追加接種の後、免疫されたマウスから採血した。ワクチン接種は、抗ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ抗体力価の増大の検出により決定されるマウスの免疫反応を著明に増大させた（図３Ａ）。採血の１日後、マウスを、好中球減少性とした。ワクチン接種は、有意な生存の改善を結果としてもたらした（対照と対比されるログランク検定によるＰ＝０．００７）（図３Ｂ）。
我々はまた、感染後１０日目における腎臓の真菌負荷も評価した。３０μｇのｒＨｙｒ１ｐ−Ｎをワクチン接種されたマウスにおける真菌負荷の減殺が、対照マウスから摘出された腎臓における真菌負荷の減殺と比較して１．５０ ｌｏｇ倍であることが見出された（図３Ｃ、ウィルコクソンのランクサム検定により、Ｐ＝０．００２１）ことは、我々の生存についての結果と符合する。
抗Ｈｙｒ１ ＩｇＧによる受動免疫は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを感染させたマウスの生存を延長した
患者によっては、能動ワクチン戦略に応答しない可能性があるので、我々は、Ｈｙｒ１ｐを標的とする受動免疫療法を用いる可能性を評価した。我々は、ウサギに、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ領域内に位置する、８つの親水性で抗原性が高い１４マーのペプチドをワクチン接種することにより、ポリクローナル抗体を発生させた（表１）。これらの８つの親水性のペプチドを標的とする精製ＩｇＧをプールし、致死量のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを感染させたナイーブマウスを処置するのに用いた。１または３ｍｇの抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧを施されたマウスは、販売元による非特異的な対照ＩｇＧを施されたマウスと比較したところ、感染から実質的に防御された（しかし、０．３ｍｇで投与したときは防御されなかった）（図４Ａ、Ｂ、およびＣ）。
発生させた抗Ｈｙｒ１ｐ抗体が、食細胞機能を、オプソニン化貪食作用を増大させることにより増強したのか、Ｈｙｒ１ｐの毒性機能を中和することにより増強したのかを決定するために、我々は、Ｆ（ａｂ’）２断片を、プールされたＩｇＧであって、Ｈｙｒ１ｐの８つのペプチドに対してもたらされたＩｇＧから単離および調製するか、またはアイソタイプの対応する対照ＩｇＧから単離および調製した。これらの断片を、野生型のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓではなく、Ｈｙｒ１ｐを条件的に過剰発現させるかまたは抑制するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対するＨＬ−６０に由来する好中球による殺滅アッセイにおいて用いて、これらの断片の、ＩＦＦファミリーの他のメンバーに対する特異性ではなく、Ｈｙｒ１ｐに対する特異性を裏付けた［d'Enferら、Nucleic Acids Res.、３３巻：Ｄ３５３〜３５７頁（２００５年）］。ＨＬ−６０に由来する好中球による、ＨＹＲ１の条件的発現株に対する殺滅を、ＨＬ−６０に由来する好中球による抑制株に対する殺滅のレベルと同等のレベルまで回復することが可能なのは、対照抗体から調製されたＦ（ａｂ’）２断片ではなく、抗Ｈｙｒ１ｐ抗体から調製されたＦ（ａｂ’）２断片であると見出されたことは、我々のかつてのマウスＩｇＧデータ［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］と符合する（図４Ｄ）。
抗体により誘発された防御が、抗Ｈｙｒ１ｐ抗体に実際に起因し、非類縁の免疫原（例えば、ＫＬＨに対する抗体）と反応する抗体により引き起こされる非特異的防御には起因しなかったことを検証するために、８つの親水性のｒＨｙｒ１ｐ−Ｎペプチドを標的とする精製ＩｇＧを、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸に取り込ませてから、血行性播種性カンジダ症に対するそれらの防御的活性について調べた。取り込まれたＩｇＧが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸を染色しなかった（図５Ａ）ことから、抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧが除去されたことが示される。さらに、対照ＩｇＧ（すなわち、販売元による非特異的ＩｇＧ）と同様に、取り込まれたＩｇＧも、マウスを、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来する感染から防御しなかったのに対し、取り込まれなかった精製ＩｇＧは、マウスを、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来する感染から防御した（図５Ｂ、Ｐ＝０．００２）。これらの結果により、血行性播種性カンジダ症に対する防御における抗ｒＨｙｒ１ｐ抗体の特異性が確認される。
ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ以外の複数のＣａｎｄｉｄａ属種で感作したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける組織の真菌負荷を実質的に軽減した
大多数のＣａｎｄｉｄａ属感染は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ以外の種により引き起こされるため、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ以外の他の種に対する防御を誘発するワクチンが強く所望される。例えば、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａは、カンジダ症の２番目に一般的な原因を表し、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉは、アゾール療法に対して抵抗性である。ＢＬＡＳＴ検索を用いて、我々は、特定の領域内の４７〜７２％の間の範囲のアミノ酸類似性を伴う複数のＣａｎｄｉｄａ属種において、Ｈｙｒ１ｐ−Ｎのオーソログを検出することができた。したがって、我々は、上記の通りに、マウスに、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎに加えたアラムでワクチン接種し、次いで、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、またはＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓで感作した。感染の３日後、マウスを屠殺し、腎臓を摘出し、コロニーカウントを介して組織の真菌負荷を決定した。ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎをワクチン接種されたマウスにおける腎臓の真菌負荷は、アラム単独をワクチン接種されたマウスと比較して、０．６５〜１．６９ｌｏｇ減少した（図６）。
我々は、Ｈｙｒ１ｐの組換えＮ末端（ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ）の特性であって、能動免疫療法および受動免疫療法両方の標的として有用な特性を同定した［Luoら、J. Infect. Dis.、２０１巻：１７１８〜１７２８頁（２０１０年）］。ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎの領域に由来する、８つの異なる１４マーのペプチドに対してもたらされたウサギポリクローナルＩｇＧは、マウスを、実験の播種性カンジダ症から実質的に防御する。さらに、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎは、好中球減少性マウスモデルにおいてもその有効性を維持した。
ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎまたはアラム単独をワクチン接種されたマウスから摘出された組織の真菌負荷および腎臓の組織病理学的検討により、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンの有効性がさらに確認された。しかし、対照マウス（図２Ａ）とｒＨｙｒ１ｐ−Ｎをワクチン接種されたマウス（図２Ｂ）との間の組織病理学の差違は、同じ器官の組織の真菌負荷の差違よりはるかに顕著であった。この点で、コロニーカウントは、おそらく組織のホモジナイゼーションが真菌の菌糸を死滅させるために、菌糸および偽菌糸の存在下における組織の真菌負荷を過小評価しうることが既に報告されている［Spellbergら、J. Leukoc. Biol.、７８巻：３３８〜３４４頁（２００５年）；Spellbergら、J. Infect. Dis.、１９４巻：２５６〜２６０頁（２００６年）］。我々は、腎臓では、対照マウスが、ワクチン接種されたマウスであって、主に酵母形態の真菌エレメントからなる膿瘍が少ないマウスより、著明に多くの糸状真菌を有することを見出した。したがって、組織のホモジナイゼーションにより、対照マウスから摘出された腎臓のコロニーカウントは人為的に低減されるが、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎをワクチン接種されたマウスから摘出された腎臓のコロニーカウントは人為的に低減されないことから、差違がそれほど顕著とならない可能性が高い。
我々の結果はまた、マウスの播種性カンジダ症からの防御における抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧの用量反応も示す。我々はまた、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸により取り込まれたＩｇＧが、マウスを、血行性播種性カンジダ症に対して防御するその能力を喪失したので、抗Ｈｙｒ１ｐ ＩｇＧにより誘発される防御が、Ｈｙｒ１ｐに対して特異的であることも確認した（図５Ｂ）。これらの結果は、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎによりもたらされる防御機構が、少なくとも部分的に、防御的抗体応答に帰せられると考えられることを示唆する。
本研究において、我々は、プールされたＩｇＧであって、８つのＨｙｒ１ペプチドに対してもたらされたＩｇＧが、オプソニン化貪食作用を増強するのではなく、食細胞による殺滅への抵抗におけるＨｙｒ１ｐの機能を直接中和することを示す。これは、Ｆ（ａｂ’）２断片（抗ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎ抗体から調製された）が、食細胞による、Ｈｙｒ１ｐを過剰発現させるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの殺滅を、食細胞による抑制株の殺滅と同等のレベルまで回復する能力により明らかである（図４Ｄ）。しかし、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンは、その有効性を、好中球減少性マウスにおいても維持した。これは、シクロホスファミドが、組織の食細胞に対する影響を最小限としてマウスにおける白血球減少症を誘導するという事実により説明することができる。
まとめると、アジュバントとしてのアラムと混合した場合、ｒＨｙｒ１ｐ−Ｎワクチンは、免疫正常マウスおよび免疫不全マウスの両方において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの複数の臨床単離株に対して有効であり、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ以外の複数のＣａｎｄｉｄａ属種に対しても有効である。
（実施例ＩＩ）
ＨＹＲ１タンパク質断片は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉによる感染を防止する
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓとは、酵母細胞および糸状細胞のいずれとしても成長する二倍体の真菌である。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、米国内で１年間に約６０，０００例の播種性カンジダ症を引き起こす。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＨＹＲ１タンパク質は、真菌の感染時において、真菌細胞に食細胞に対する抵抗性を付与する細胞表面タンパク質である。組換えＨＹＲ１タンパク質によるワクチン接種は、マウスを、Ｃａｎｄｉｄｉａ属感染に対して防御することが示されている。さらに、抗ＨＹＲ１タンパク質抗体による受動免疫も、血行性播種性カンジダ症に対して防御する。
予測構造による相同性モデル化を介して、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＨＹＲ１タンパク質は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを含めたグラム陰性菌に由来する複数のタンパク質との無視できない相同性を有することが発見された。結果として、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉに対する防御において、ＨＹＲ１タンパク質を標的とする能動免疫および受動免疫を用いることの実現可能性を検討した。
構造的相同性モデル化の収束法を用いて、三次元構造における相同性の研究を行った。これらには、複数の配列アライメント、配列の同一性および類似性に基づく構造的相同体に対するスレディング、および三次元構造のモデル化が含まれる。この解析は、全長のＣａｎｄｉｄａ（Candidal）属ＨＹＲ１ポリペプチドが、Ｈａｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Haernophilus）属種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｙｅｒｓｉｎａ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属種を含めた複数のグラム陰性菌（表３）に由来するタンパク質に対する著明な相同性を有することを明らかにした。
構造的解析研究に基づき、ｒＨＹＲ１−Ｎ（配列番号２）をＥ．ｃｏｌｉにより作製し、マウスに能動的にワクチン接種するのに用いた。０日目に、マウスを、水酸化アルミニウム単独（ｎ＝１０）または水酸化アルミニウムと混合されたｒＨＹＲ１ｐ−Ｎ（３０ｍｇ）（ｎ＝９）で免疫し、２１日目に追加接種した。その後、３５日目に、ワクチン接種されたマウスに、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを感染させた。ワクチン接種されたマウスは、対照アームにおける１０％の生存と比較して６７％の生存を示した（ログランク検定によりｐ＜０．０５）（図７）。加えて、ワクチン接種されて感染したマウスの組織における細菌負荷も同様に検討した。組織１グラム当たりのコロニー形成単位の数により測定される細菌負荷は、腎臓、肺、および脾臓に由来する組織単離物の細菌負荷が、対照の組織試料と比較して低減されることを示した（図８）。
次に、ウサギにおいて、ＨＹＲ１タンパク質から選択される８つの特異的ポリペプチド領域に対するポリクローナル抗体をもたらした。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓが発現させる場合の親水性の領域が露呈されるように、これらの領域を構造マッピングし、抗原性が高いと予測した。８つの特異的ポリペプチド領域は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端におけるさらなるシステイン残基を加えた１４アミノ酸残基からなった（表２）。末端のシステイン残基は、ポリクローナル抗体の産生に用いられる、担体タンパク質、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）への接合をもたらした。
糖尿病性マウスにおいて、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ感染に対する全体的受動免疫についてアッセイした。上記で生成させた、８つの異なるポリクローナル抗体に由来する精製ＩｇＧをプールし、感染の２時間前に糖尿病性マウス（ｎ＝２０）に施した。市販されている非類縁のウサギＩｇＧを、糖尿病性対照マウス（ｎ＝１８）に施した。次いで、マウスに、尾静脈注射を介して、致死用量のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを感染させた。抗Ｈｙｒｌｐ ＩｇＧの単回投与を施されたマウスは、対照ＩｇＧを施されたマウスより著明に長期間にわたり生存した（すなわち、抗Ｈｙｒｌｐ ＩｇＧアームでは、対照アームにおける０％と対比して、８０％の生存であり、ログランク検定により、ｐ＜０．０００１である）（図９）。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉに感染した糖尿病性マウスではまた、個別のアミノ酸配列に対するポリクローナル抗体による受動免疫についてもアッセイした。感染の２時間前に、糖尿病性マウスを、８つの異なる合成ＨＹＲ１ペプチドのうちの１つに対して個別にもたらされた、１ｍｇのウサギ対照ＩｇＧ（ｎ＝１８）またはポリクローナル抗ＨＹＲ１ポリペプチドＩｇＧで処置した（表２）。加えて、抗体の２つの個別の組合せプールについてもアッセイした。組合せ１は、抗体番号２、３、５、および８を含み、組合せ２は、抗体番号２、５、および８を含むものであった。ペプチド＃５（配列番号１５）に対してもたらされた抗体は、マウスを、プール抗体と同様な程度に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ感染から防御した（すなわち、プールされたＩｇＧによる８０％の生存と対比して、抗ペプチド５Ａｂによる８６％の生存）。これらの実験の結果を、図１０に示す。
（実施例ＩＩＩ）
抗ＨＹＲ１抗体は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉが発現させる特異的タンパク質に結合する
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉに由来する細胞壁抽出物を、二次元ゲル上で泳動させ、ＣＬＫＮＡＶＴＹＤＧＰＶＰＮＮ（配列番号１５）に対してもたらされたウサギＩｇＧを用いるウェスタンブロットによりアッセイした。ブロットを、対照としての免疫前血清と比較した。抗ＨＹＲ１ ＩｇＧは、細胞壁抽出物に由来する固有のバンドを認識した（図１１）。選択されたスポットを抽出し、配列決定した。配列決定解析は、抗ＨＹＲ１抗体が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１（ＧＩ番号｜１２６６４２０１４｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８４９９８．１｜）（配列番号１９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２（ＧＩ番号｜１２６６４０２９６｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８３２８０．１｜）（配列番号２０）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質（ＧＩ番号｜１２６６４１７００｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８４６８４．１｜（配列番号２１）；ＧＩ番号｜１２６６４０５４７｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８３５３１．１｜（配列番号２２）；ＧＩ番号｜１２６６４３３３１｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８６３１５．１｜を含む）（配列番号２３）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質（ＧＩ番号｜１２６６４２９８１｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８５９６５．１｜）（配列番号２４）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ（ＧＩ番号｜１２６６４０９１８｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８３９０２．１｜）（配列番号２５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体（ＧＩ番号｜１２６６４１５９１｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８４５７５．１｜）（配列番号２６）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通（ＧＩ番号｜１２６６４０６８９｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８３６７３．１｜）（配列番号２７）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）（ＧＩ番号｜１２６６４２８７３｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８５８５７．１｜）（配列番号２８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質（ＧＩ番号｜１２６６４１７９７｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８４７８１．１｜）（配列番号２９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質（ＧＩ番号｜１２６６４３３３９｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８６３２３．１｜）（配列番号３０）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺ（ＧＩ番号｜１２６６４３３３８｜ＧｅｎＢａｎｋ参照番号｜ＹＰ＿００１０８６３２２．１｜）（配列番号３１）を含めた複数のタンパク質と交差反応することを示した。
他の実施形態
上記の明細書で言及されたＧｅｎＢａｎｋ番号およびＧＩ番号の公開、特許、および特許出願を含めた全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者には、本発明の範囲および精神を逸脱しない限りにおける、本発明の記載される方法の多様な改変および変更が明らかであろう。本発明を、特定の実施形態との関連において記載してきたが、特許請求される本発明を、このような特定の実施形態に不必要に限定すべきではないことを理解されたい。実際に、当業者に明らかな本発明を実行するための記載された方式に対する多様な改変が、本発明の範囲内にあることを意図する。
他の実施形態は、請求項において認められる。

Claims (63)

  1. 哺乳動物におけるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を処置または防止する方法における使用のための、単離Ｃａｎｄｉｄａ属Ｈｙｒ１タンパク質（配列番号１）またはその免疫原性断片を含むワクチン。
  2. 前記Ｃａｎｄｉｄａ属Ｈｙｒ１タンパク質またはその断片が、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、またはＣａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに由来する、請求項１に記載の使用のためのワクチン。
  3. 前記感染が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉから生じる、請求項１または２に記載の使用のためのワクチン。
  4. 前記免疫原性断片が、前記Ｃａｎｄｉｄａ属Ｈｙｒ１タンパク質のＮ末端領域断片である、前記請求項のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
  5. 前記免疫原性断片が、配列番号２に示されるアミノ酸配列または表１もしくは２に示されるＨｙｒ１ｐ断片を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
  6. 前記免疫原性断片が、表１もしくは２に示されるＨｙｒ１ｐ断片またはそれらの免疫原性断片のうちの１または複数である、前記請求項のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
  7. 皮下投与されるか、追加投与として投与されるか、または免疫刺激性アジュバント（アラムなど）を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
  8. 前記Ｈｙｒ１ｐ、またはその免疫原性断片が、組換えにより作製される（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどにおいて）か、または化学合成される、前記請求項のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
  9. 配列番号３〜１０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号３〜１０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して最大で３カ所の置換、欠失、または付加を有するそのバリアント配列を含む単離ポリペプチドであって、配列番号２の２０を超える連続アミノ酸を含まない単離ポリペプチド。
  10. 配列番号３〜１０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. 前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、１４〜２０の間のアミノ酸からなる、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
  12. 前記ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基またはＣ末端のアミノ酸残基がシステインであり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 担体にコンジュゲートされた、請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む単離コンジュゲート。
  14. 前記担体が、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、または破傷風トキソイドである、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  15. 前記担体が、ファージ、酵母、ウイルス、ウィロソーム、または組換えウイルス様粒子であるか、または前記コンジュゲートが、組換え融合タンパク質である、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  16. 免疫原性量の、請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１３から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチン。
  17. 請求項９から１２のいずれか一項に記載の異なるポリペプチドの混合物または請求項１３から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、請求項１６に記載のワクチン。
  18. 前記ポリペプチドもしくはコンジュゲートが、合成により作製されるか、または前記ポリペプチドもしくはコンジュゲートが、組換えにより作製される、請求項１６から１７のいずれか一項に記載のワクチン。
  19. カンジダ症に対する哺乳動物（例えば、ヒト）のワクチン接種における使用のためであるか、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対する哺乳動物（例えば、ヒト）へのワクチン接種における使用のための、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のワクチン。
  20. 筋内投与、皮下投与、または皮内投与により投与されるものである、請求項１９に記載のワクチン。
  21. カンジダ症に対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、該哺乳動物に、請求項１６から２０のいずれか一項に記載のワクチンを投与し、これにより、カンジダ症に対して該哺乳動物（例えば、ヒト）をワクチン接種するステップを含む方法。
  22. Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対して哺乳動物をワクチン接種する方法であって、該哺乳動物に、請求項１６から２０のいずれか一項に記載のワクチンを投与し、これにより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染に対して該哺乳動物（例えば、ヒト）にワクチン接種するステップを含む方法。
  23. キメラワクチンを作製する方法であって、
    （ａ）ファージ、酵母、またはウイルスを用意するステップと、
    （ｂ）該ファージ、酵母、またはウイルスに、請求項９から１２または１３から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を挿入するステップと、
    （ｃ）該ポリペプチドを、該ファージ、酵母、またはウイルスにおいて発現させるステップと、
    （ｄ）該発現させたポリペプチドを含む、ステップ（ｃ）の該ファージ、酵母、またはウイルスを単離するステップと、
    （ｅ）薬学的に許容される賦形剤を、ステップ（ｄ）の該単離されたファージ、酵母、またはウイルスに添加するステップと
    を含む方法。
  24. ステップ（ｃ）に続いて、前記ポリペプチドが、前記ファージ、酵母、またはウイルスの表面において提示される、請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１３から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートに結合する、単離モノクローナル抗体。
  26. 請求項２５に記載の抗体を含む診断用組成物。
  27. 請求項２５に記載の抗体を含む医薬組成物。
  28. 請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドもしくは請求項１３から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートに結合するポリクローナル抗体、または請求項９から１２のいずれか一項に記載の異なるポリペプチドもしくは請求項１３から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートの混合物に結合するポリクローナル抗体を含む医薬組成物。
  29. カンジダ症に対する哺乳動物の受動免疫における使用のための、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
  30. Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対する哺乳動物の受動免疫における使用のための、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
  31. カンジダ症に対して哺乳動物を受動免疫する方法であって、該哺乳動物に、有効量の、請求項２７または２８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、これにより、該カンジダ症に対して該哺乳動物を受動免疫するステップを含む方法。
  32. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記医薬組成物が、筋内投与、皮下投与、または皮内投与により投与される、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対して哺乳動物を受動免疫する方法であって、該哺乳動物に、有効量の、請求項２７または２８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、これにより、該Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に対して該哺乳動物を受動免疫するステップを含む方法。
  35. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記医薬組成物が、筋内投与、皮下投与、または皮内投与により投与される、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. ＣＧＰＳＡＰＥＳＥＳＤＬＮＴＰ（配列番号１１）、ＣＧＮＲＤＨＦＲＦＥＹＹＰＤＴ（配列番号１２）、ＣＧＹＤＳＫＬＦＲＩＶＮＳＲＧ（配列番号１３）、ＣＫＩＫＧＴＧＣＶＴＡＤＥＤＴ（配列番号１４）、ＣＬＫＮＡＶＴＹＤＧＰＶＰＮＮ（配列番号１５）、ＮＳＫＳＳＴＳＦＳＮＦＤＩＧＣ（配列番号１６）、ＣＥＰＴＨＮＦＹＬＫＤＳＫＳＳ（配列番号１７）、およびＴＳＲＩＤＲＧＧＩＱＧＦＨＧＣ（配列番号１８）から選択されるアミノ酸配列を含むＨＹＲ１ポリペプチドをコードする単離核酸であって、前記ポリペプチドが、９３０未満の長さのアミノ酸残基を含む単離核酸。
  38. 前記アミノ酸配列が、配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項３７に記載の単離核酸。
  39. 前記ポリペプチドが、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、または２０未満の長さのアミノ酸残基を含む、請求項３７に記載の単離核酸。
  40. 請求項３７に記載の核酸を含有するベクター。
  41. 請求項３７に記載の核酸を含有する組換え細胞。
  42. 試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を検出するためのキットであって、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺをコードする１５〜３００の間の連続ヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むキット。
  43. ＣＧＰＳＡＰＥＳＥＳＤＬＮＴＰ（配列番号１１）、ＣＧＮＲＤＨＦＲＦＥＹＹＰＤＴ（配列番号１２）、ＣＧＹＤＳＫＬＦＲＩＶＮＳＲＧ（配列番号１３）、ＣＫＩＫＧＴＧＣＶＴＡＤＥＤＴ（配列番号１４）、ＣＬＫＮＡＶＴＹＤＧＰＶＰＮＮ（配列番号１５）、ＮＳＫＳＳＴＳＦＳＮＦＤＩＧＣ（配列番号１６）、ＣＥＰＴＨＮＦＹＬＫＤＳＫＳＳ（配列番号１７）、およびＴＳＲＩＤＲＧＧＩＱＧＦＨＧＣ（配列番号１８）から選択されるアミノ酸配列を含む単離ＨＹＲ１ポリペプチドであって、９３０未満の長さのアミノ酸残基を含む単離ＨＹＲ１ポリペプチド。
  44. 前記ポリペプチド断片が、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、または２０未満の長さのアミノ酸残基を含む、請求項４３に記載の単離ＨＹＲ１ポリペプチド。
  45. 抗ＨＹＲ１抗体によって結合されうる、請求項４３に記載の単離ＨＹＲ１ポリペプチド。
  46. 免疫原性である、請求項４３に記載の単離ＨＹＲ１ポリペプチド。
  47. 前記免疫原性ポリペプチドが、被験体における抗ＨＹＲ１抗体の産生を誘発することができる、請求項４６に記載の単離ＨＹＲ１ポリペプチド。
  48. 担体タンパク質、アフィニティータグ、またはリンカー配列に融合させたポリペプチドを含む融合タンパク質であって、該ポリペプチドが、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のＨＹＲ１ポリペプチドを含む融合タンパク質。
  49. 請求項４３から４７のいずれか一項に記載のＨＹＲ１ポリペプチド、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺに対する特異的反応性を有する、単離抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体。
  50. モノクローナル抗体である、請求項４９に記載の抗体。
  51. ポリクローナル抗体である、請求項４９に記載の抗体。
  52. 請求項５０に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞系。
  53. 試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を検出するためのキットであって、請求項４３から４７に記載の単離抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体を含むキット。
  54. 試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の核酸分子を検出する方法であって、該試料を、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺの一部分をコードする１５〜３００の間の連続ヌクレオチドを含む２つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、核酸分子を増幅するステップと、該増幅を検出するステップとを含む方法。
  55. 前記増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施する、請求項５４に記載の方法。
  56. 試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を検出するための方法であって、試料を、請求項４９に記載の抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体と接触させるステップと、該抗体の該試料への特異的結合の存在を検出し、これにより、該試料中のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の存在を検出するステップとを含む方法。
  57. 薬学的に許容される担体と、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体またはＨＹＲ１タンパク質（配列番号９）もしくはその断片に対する特異的反応性を有する抗ＨＹＲ１タンパク質抗体とを含む医薬組成物。
  58. Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染に対して被験体を免疫するためのワクチン組成物であって、薬学的に許容される担体と、免疫原性量の、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のＨＹＲ１ポリペプチド、請求項４８に記載の融合タンパク質、ＨＹＲ１タンパク質（配列番号９）またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇまたはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質またはその断片、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質またはその断片、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺまたはその断片とを含むワクチン組成物。
  59. アジュバントをさらに含む、請求項５８に記載のワクチン組成物。
  60. Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を処置または防止を必要とする被験体におけるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を処置または防止する方法であって、治療有効量の、請求項２８に記載の医薬組成物または請求項５７に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む方法。
  61. 抗生物質の共投与をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 被験体におけるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染を診断する方法であって、
    （ａ）該被験体に由来する被験試料を用意するステップと、
    （ｂ）該試料を、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺをコードする単離核酸、または請求項４１に記載の前記ＨＹＲ１ポリペプチドに結合しうる薬剤と、適切な条件下で接触させるステップであって、前記条件により、前記薬剤の前記核酸またはポリペプチドへの特異的結合が可能となるステップと、
    （ｃ）前記被験試料中の前記特異的結合の量を、対照試料中の特異的結合の量と比較するステップであり、前記被験試料中の前記特異的結合の、前記対照試料と比較した増加量または減少量により、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属感染が診断されるステップとを含む方法。
  63. 前記薬剤が、請求項４８に記載の抗Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属タンパク質抗体、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの外膜タンパク質２、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの鉄シデロホア受容体タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＤｎａｋ熱ショックタンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの伸長因子Ｇ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの有機溶媒耐性タンパク質前駆体、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定リポタンパク質前駆体（ＶａｃＪ）膜貫通、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの推定グルコース感受性ポリン（ＯｐｒＢ様）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉのＡｄｅＡ膜融合タンパク質、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質、もしくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺの一部分をコードする１５〜３００の間の連続ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の方法。
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