TW201929896A - 用於常在病原疾病進展之全面性疫苗設計 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種對抗肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)之疫苗組合物及方法。該組合物包含具有來自一或多種血清型之多醣且具有非共價附接表面且曝露於外部之蛋白質的脂質體。
Description
常在病原微生物體一般伺服與載生物宿主之共生關係。然而,在特定情況下,轉變成毒性可能提示疾病來自正常良性之常在病原。此引起以下問題:療法是否應預防初始拓殖,因此,消除未來疾病之任何潛在性但亦移除由常在病原建立提供之任何益處(直接或間接),或療法是否應保留拓殖(及任何相關聯益處)同時靶向毒性轉變(virulence transition)之過程。此困境係由用以解決肺炎球菌疾病之進行中疫苗接種努力良好地表示。
肺炎球菌疾病為影響全世界數百萬人、尤其年輕人、老年人且資源受限之主要全球傳染病威脅。疾病結果包括肺炎、菌血症、腦膜炎及中耳炎(中耳感染)。如上文一般所介紹,由於感染範疇及疾病進展步驟,所以治療此疾病具有挑戰性。
更特定言之,對肺炎球菌疾病負責之伴以肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumoniae )
細菌之人類拓殖為幾乎普遍的(Bogaert等人,Lancet Infect Dis 4
, 144-154 (2004)。舉例而言,拓殖在生命之前幾年內發生在超過95%兒童中(Gray, 等人,J Infect Dis 142
, 923-933 (1980); Huebner等人,The Pediatric Infectious Disease Journal 19
, 1017-1020 (2000))。拓殖組成係藉由肺炎鏈球菌之>90不同血清型複雜化,藉由多醣內容物塗佈細菌細胞分化(Daniels等人,J Pediatr Pharmacol Ther
21, 27-35 (2016))。現行疫苗收穫、純化且組合與侵襲性侵入性感染相關聯之肺炎鏈球菌血清型之表面莢膜多醣(CPS)(Feldman等人,The Journal of Infection
, (2014))。該方法在將初始拓殖減至最少、允許畜群免疫且減輕疾病處有效(Loo等人,The Pediatric Infectious Disease Journal
33 Suppl 2, S140-151 (2014))。
然而,肺炎球菌疾病之進展遠不止需要拓殖。在採集時,肺炎鏈球菌建立鼻咽中之滯留作為無症狀生物膜(Bakaletz,Paediatr Respir Rev 13
, 154-159 (2012); Munoz-Elias等人,Infection and Immunity 76
, 5049-5061 (2008))。換言之,肺炎鏈球菌表示上呼吸道常在病原。疾病發生在生物膜傳播(biofilm dissemination)時,通常由促使子組細菌變得具有毒性之破壞性事件(諸如病毒感染)引起(圖5) (Marks等人,mBio 4
, (2013))。在轉變時,此等細菌衝破生物膜;蔓延至肺、血液、中耳及其他位置;且造成前述疾病類型(Marks等人,Infect Immun 80
, 2744-2760 (2012))。當自此透視圖觀察時,經由現行疫苗選項預防拓殖充當消除後續疾病進展之上行途徑。
然而,限制拓殖僅對於現行疫苗所覆蓋之13-23血清型為有可能的,該等疫苗不足以達至>90迄今為止所識別之血清型(Tin Tin Htar等人,BMC Infect Dis 15
, 419 (2015))。因此,消除拓殖預防疾病但亦展示提供鼻咽中之生態棲位以用於剩餘血清型來建立滯留且進展至毒性之非預期結果(Richter等人,Emerg Infect Dis 19
, 1074-1083 (2013); Weinberger等人.,Lancet 378
, 1962-1973 (2011))。根據現行策略,能夠提供普遍覆蓋度之唯一假想疫苗應合併來自肺炎鏈球菌之每一已知血清型之多醣表面抗原。自製造觀點來看此類目標為過分地昂貴且仍不消除迄今未偵測之肺炎鏈球菌血清型或完全不同之上呼吸道常在病原及病原體之生態棲位置換的危險(Weinberger等人,Lancet 378
, 1962-1973 (2011); Hausdorff等人,Expert Review of Vaccines 14
, 413-428 (2015); Madhi等人,Journal of Infectious Diseases 196
, 1662-1666 (2007); Keller等人, Emergence and Pathogenesis.mBio 7
, e01792 (2016); Spijkerman等人,PloS One 7
, e39730 (2012))。如此,疫苗策略為尚不可用的,尚不可解決新型血清型之問題或提供抗拓殖以及毒性轉變之組合方法。
在本發明中,提供包含針對拓殖之抗原及針對毒性轉變之抗原之組合物及方法。舉例而言,一者預防最侵襲性肺炎鏈球菌血清型之拓殖且另一者限制毒性轉變之兩類互補抗原之非共價共定位提供動物受試者中之完全的疫苗有效性及至今為止已報導之疾病的最全面性覆蓋度。因此,本發明疫苗調配物在有效地管理困擾全球數千萬至數億人之疾病之前景的情況下提供普遍的肺炎球菌疾病預防。該方法更一般化地提出反應於複雜之常在病原-宿主動力學之平衡的預防性治療策略。
在本發明中,雙功能脂質體調配物允許互補抗原類型之共定位,各者與常在病原疾病進展中之獨立狀態相關聯。自製造觀點來看,脂質體設計允許與現行疫苗選項之生產形成鮮明對比之有成本效益且可擴展之調配。自效能觀點來看,脂質體調配物能力及封閉抗原之寬且反作用性質致能如針對Prevnar及Pneumovax對照物所量測之至今為止已報導之最堅固且全面性免疫反應,該等對照物為用於肺炎球菌疾病之商用疫苗選項中之現行標準物。
本發明之組合物及方法係關於細菌多醣之脂質體囊封(在本文中稱為LEPS)。在一態樣中,本發明提供包含脂質體之疫苗組合物。組合物中之脂質體可囊封單種類型之細菌多醣或多種類型之細菌多醣,諸如莢膜多醣。脂質體中之至少一些具有非共價附接表面之蛋白質,該非共價附接從而使得蛋白質中之至少一部分曝露於脂質體之外部。舉例而言,脂質體可囊封來自肺炎鏈球菌血清型之一或多種莢膜多醣且具有經由非共價附接而附接表面之一或多種蛋白質,該非共價附接從而使得蛋白質中之至少某一部分展現於脂質體之外部之表面上。
疫苗組合物可具有多種類型之脂質體,各類型囊封不同類型之單個血清型或血清型組合(亦即莢膜多醣)。舉例而言,複數種脂質體可囊封第一血清型,複數種脂質體可囊封第二血清型,複數種脂質體可囊封第三血清型等等,從而使得組合物可共同地具有囊封1至約100種已知血清型之脂質體。當識別額外的血清型時,可修飾組合物以添加至其囊封新識別之血清型之脂質體。類似地,又另外,複數種脂質體可囊封第一組合之血清型,複數種脂質體可囊封第二組合之血清型等等。脂質體中之一些全部可具有非共價附接之蛋白質,該非共價附接從而使得蛋白質中之至少一部分展現於脂質體之外部之表面上。在一實施例中,提供20價(20種血清型)疫苗組合物,其中脂質體具有囊封於脂質體中之單種或多種血清型,且脂質體進一步具有CRM197、PncO或GlpO或其非共價附接之組合。在一實施例中,20種血清型為1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、17F、18C、19A、19F、20、22F及23F。在一實施例中,疫苗為24價(24種血清型)疫苗組合物,其中脂質體具有囊封於脂質體中之單種或多種血清型,且其中24種血清型為1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。
在一實例中,疫苗組合物包含脂質體,其中脂質體具有單種血清型,且其中組合物中之所有脂質體之血清型含量可為相同的或不同的。因此,舉例而言,該組合物可具有複數組脂質體,其中各組脂質體包含複數種脂質體,各者囊封單種血清型。血清型可選自圖16中所列之血清型。可製備包含其他單種血清型之額外組之脂質體且添加至此組合物中。
組合物可具有以下中之一或多者:囊封血清型1之複數種脂質體,囊封血清型2之複數種脂質體、囊封血清型3之複數種脂質體、囊封血清型4之複數種脂質體、囊封血清型5之複數種脂質體、囊封血清型6A之複數種脂質體、囊封血清型6B之複數種脂質體、囊封血清型7F之複數種脂質體、囊封血清型8之複數種脂質體、囊封血清型9N之複數種脂質體、囊封血清型9V之複數種脂質體、囊封血清型10A之複數種脂質體、囊封血清型11A之複數種脂質體、囊封血清型12F之複數種脂質體、囊封血清型14之複數種脂質體、囊封血清型15B之複數種脂質體、囊封血清型17F之複數種脂質體、囊封血清型18C之複數種脂質體、囊封血清型19A之複數種脂質體、囊封血清型19F之複數種脂質體、囊封血清型20之複數種脂質體、囊封血清型22F之複數種脂質體、囊封血清型23F之複數種脂質體、囊封血清型33F之複數種脂質體。
可非共價附接脂質體之蛋白質之實例包括白喉類毒素突變體CRM197或表面曝露之蛋白質或來自細菌之蛋白質之部分,諸如PncO及GlpO。可用於生產多醣免疫原之免疫原性載體之其他實例包括白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、鑰孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Haemocyanin,KLH)及結核菌素之純化蛋白質衍生物(PPD)。
在一態樣中,本發明提供用於使抵抗諸如肺炎鏈球菌感染之細菌感染之個體免疫之方法,其包含向受保護之個體投與包含脂質體之組合物,該等脂質體具有囊封於其中之一或多種血清型且具有非共價附接表面且曝露於外部之一或多種蛋白質。
相關申請之交叉引用
本申請主張2017年10月13日申請之美國臨時專利申請第62/572,081號及2018年5月11日申請之美國臨時專利申請第62/670,419號之優先權,該等申請之揭示內容以引用之方式併入本文中。
關於聯邦政府贊助研究之表述
關於聯邦政府贊助研究之表述
本發明係根據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)所授與之授權號AI088485及AI117309在政府支持之情況下作出。政府對本發明擁有某些權利。
如本文所使用之術語「免疫反應」係指包括以下中之一或多者之免疫系統之細胞的協同作用:淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞及對侵入病原體、細胞或感染病原體之組織之動物主體造成選擇性損壞、毀壞或消除之其他細胞。
如本文所使用之術語「免疫原」係指能夠刺激或誘導哺乳動物中之體液抗體及/或細胞介導之免疫反應的物質。此術語可在本文中與「抗原」互換使用。
就多肽而言之如本文所使用之術語「隔離」意謂與通常與呈其天然狀態之多肽相關聯之其他巨分子實質上分離的多肽。隔離多肽可完全不含通常與呈其天然狀態之多肽相關聯之其他巨分子。舉例而言,多肽可為至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%純。舉例而言,隔離多肽可由通常表達多肽之細胞純化、可合成或可使用重組DNA方法生成。
多醣通常來自特異性血清型。包括表S1及S2 (相應地圖15及16)中之彼等血清型之多種血清型受到表徵且在此項技術中已知。多醣為來自特定細菌之莢膜多醣。用於製備調配物之多醣可為隔離莢膜多醣。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用以意謂包含藉由肽鍵或經修飾肽鍵接合至彼此之兩種或更多種胺基酸之聚合物。短鏈一般稱為肽(約30種胺基酸或更少),中鏈稱為多肽(30至1,000種胺基酸),且更長鏈稱為蛋白質。多肽可含有除20種基因編碼之胺基酸以外之胺基酸。多肽包括藉由諸如轉譯後處理之天然方法或藉由此項技術中眾所周知之化學修飾技術修飾之胺基酸序列。
與共價多醣-蛋白質偶合對比,本發明利用脂質體技術以囊封所需細菌血清型(多醣)內容物且隨後非共價附接且表面展示所需蛋白質。因此,本發明提供用脂質體進行之一或多種類型之細菌多醣(LEPS)之脂質體囊封,該等脂質體進一步包含非共價附接及表面展示之一或多種類型之蛋白質,諸如細菌蛋白質,諸如曝露於細菌表面上之彼等蛋白質。細菌多醣之實例為肺炎球菌多醣,諸如來自肺炎鏈球菌之多醣。與Prevnar調配物對比,本發明之LEPS調配物經由多醣及蛋白質(例如CRM197)之非共價共定位達成糖結合物疫苗有效性。與Prevnar及Pneumovax調配物對比,本發明之LEPS調配物包含多醣及蛋白質且提供抗拓殖以及毒性轉變策略。在LEPS調配物中,靶抗原(例如表面展示之肺炎鏈球菌蛋白質)為獨立的且除包括於Prevnar調配物中之多醣靶標以外。另外,蛋白質抗原表示不同態樣之常在病原疾病轉變且因此添加新型維度至效力及所得免疫反應之廣度。選定本發明調配物中之蛋白質抗原,此係因為其表面位於細菌(諸如肺炎鏈球菌)上以使得其可進入免疫反應。
在一個態樣中,本發明提供包含囊封一或多種類型之細菌多醣之脂質體且進一步包含非共價附接且展現於脂質體表面上之一或多種類型之細菌蛋白質的組合物。
關於蛋白質或多醣之術語「類型」意謂任何特定蛋白質或多醣分子。因此,當存在僅一種「類型」之蛋白質或多醣時,這意謂可存在特定蛋白質或多醣之一或多種分子。當據稱存在超過一種類型之蛋白質或多醣時,這意謂存在複數種蛋白質或多醣。
本發明之脂質體可囊封僅一種類型之多醣(血清型)或超過一種類型之多醣。舉例而言,脂質體可具有囊封於其中之唯一類型之細菌莢膜多醣或複數種類型之細菌莢膜多醣,諸如來自肺炎鏈球菌之莢膜多醣。
血清型及細節可獲自各種眾所周知之源。舉例而言,關於肺炎鏈球菌之各種血清型之資訊可包括自CDC處之全球肺炎球菌菌株組及世界衛生組織(WHO)獲得。(who.int/biologicals/publications/ meetings/areas/vaccines/pneumococcal/Pneumo%20Meeting%20Report%20FINAL%20IK%2024_Dec_08.pdf?ua=1)。肺炎球菌莢膜多醣之實例包括本發明之表S1 (圖15)及S2 (圖16)中所提供之血清型。在一實施例中,血清型包括:以下以下中之一或多者:4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A。在一個實施例中,血清型為4、6B、9V、14、18C、19F、23F。在一實施例中,血清型為4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F及19A。在一實施例中,血清型為4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F。在一實施例中,血清型為1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。在一實施例中,血清型為1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。在一實施例中,血清型為1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F。
多醣可為表面多醣,諸如抗傷寒沙門氏菌之Vi多醣抗原、腦膜炎球菌多醣(包括類型A、C、W135及Y,及群組B腦膜炎雙球菌之多醣及經修飾多醣)、來自金黃色葡萄球菌之多醣、來自無乳鏈球菌之多醣、來自肺炎鏈球菌之多醣、來自例如結核分支桿菌之分支桿菌之多醣(諸如甘露磷脂醯肌醇(mannophosphoinositides)、海藻糖、黴菌酸、帶甘露糖帽之阿拉伯甘露聚糖、來自其之莢膜及阿拉伯半乳聚糖)、來自新型隱球菌之多醣、非分型流行性感冒桿菌之脂多醣、來自流行性感冒桿菌b之莢膜多醣、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)之脂多醣、宋內氏桿菌之脂多醣、克氏錐蟲之脂肽磷酸聚糖(LPPG)、癌症相關神經節苷脂GD3、GD2、腫瘤相關黏蛋白(尤其T-F抗原及唾液酸基T-F抗原)及與T-F抗原結構上相關之HIV相關多醣、奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseria meningitidis)多醣-詳言之來自血清型A、B、CW-135及Y、流行性感冒桿菌b之莢膜多醣(PRP)及其類似者。
在一個態樣中,本發明提供包含囊封諸如細菌莢膜多醣之一或多種類型之細菌多醣之脂質體的組合物。在一實施例中,本發明提供包含囊封一或多種類型之來自肺炎鏈球菌之細菌莢膜多醣之脂質體的組合物。本發明組合物可包含複數種脂質體,且脂質體中之至少一些中之各者囊封單種類型之細菌(諸如肺炎鏈球菌)莢膜多醣。其他脂質體可囊封複數種類型之細菌莢膜多醣。一些脂質體可不囊封多醣。在一實施例中,該組合物包含:i)包含單種類型之多醣之脂質體,在不同脂質體中多醣可為相同的或不同的;及/或ii)包含複數種類型之多醣之脂質體,在不同脂質體中複數種類型可為不同的。另外,視情況,一些脂質體可不囊封多醣(在本文中稱為空的)。在一實施例中,該組合物包含脂質體,該等脂質體包含超過一種類型之多醣。在一個實施例中,一種組合物包含脂質體,其中一些脂質體囊封單種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣,在不同脂質體中單種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣可為不同的;及/或一些脂質體囊封超過一種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣,在不同脂質體中超過一種類型之莢膜多醣可為不同的,且視情況,一些脂質體可為空的。
該組合物中之至少一些脂質體具有非共價附接在表面之蛋白質分子,該非共價附接從而使得蛋白質展現於外部表面上。表面展示之蛋白質分子不必存在於其中多醣滯留之脂質體之水性隔室中。在一實施例中,表面展示之蛋白質分子不存在於水性隔室中,亦即脂質體不囊封蛋白質分子。相反地,蛋白質分子僅非共價附接表面且展示至脂質體之外部。蛋白質分子可為細菌蛋白質諸如表面曝露之細菌蛋白質。表面曝露之細菌蛋白質及多醣可來自相同類型之細菌或不同類型之細菌或可為非細菌蛋白質。在一實例中,其來自肺炎鏈球菌。
在一實施例中,該組合物包含: a) 囊封單種類型之細菌多醣之脂質體,及/或 b) 囊封多種類型之細菌多醣之脂質體; 且其中脂質體中之一或多種具有非共價附接其表面上、展示至脂質體之外部的蛋白質分子。
在一實施例中,該組合物包含: a) 囊封單種類型之細菌多醣之脂質體,及/或 b) 囊封多種類型之細菌多醣之脂質體; 且其中來自a)及/或b)之脂質體中之一或多種具有非共價附接其表面上、展示至脂質體之外部的蛋白質分子。
在一實施例中,該組合物包含: a) 囊封單種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣之脂質體,及/或 b) 囊封多種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣之脂質體; 且其中脂質體中之至少一些具有非共價附接其表面上之蛋白質分子,該非共價附接從而使得蛋白質分子中之至少一部分展示至脂質體之外部。在一實施例中,蛋白質分子為表面曝露之肺炎鏈球菌蛋白質。
在一實施例中,該組合物包含: a) 囊封單種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣之脂質體,其中莢膜多醣選自由來自表S1及S2 (相應地圖15及16)之血清型組成之群的血清型,及/或 b) 囊封多種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣之脂質體,該等莢膜多醣選自由來自表S1及S2 (相應地圖15及16)之血清型組成之群;
且其中脂質體中之至少一些具有非共價附接其表面上之蛋白質分子,該非共價附接從而使得蛋白質分子中之至少一部分展示至脂質體之外部。在一實施例中,蛋白質分子為表面曝露之肺炎鏈球菌蛋白質。
在一實施例中,該組合物包含:複數種脂質體組,其中各組脂質體囊封單種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣,該莢膜多醣不同於囊封於組合物中之其他脂質體組中之單種類型之莢膜多醣,且其中一些脂質體可不囊封任何莢膜多醣,且其中脂質體中之至少一些具有非共價附接其表面上之蛋白質分子,該非共價附接從而使得蛋白質分子中之至少一部分展示至脂質體之外部。在一實施例中,蛋白質分子為表面曝露之肺炎鏈球菌蛋白質。單種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣可選自表S1及S2 (相應地圖15及16)。
在一實施例中,該組合物包含: a) 囊封單種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣之脂質體,其中莢膜多醣選自由1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F組成之群之血清型,及/或 b) 囊封多種類型之肺炎鏈球菌莢膜多醣之脂質體,該等莢膜多醣選自由1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F組成之群; 且其中脂質體中之至少一些具有非共價附接其表面上之蛋白質分子,該非共價附接從而使得蛋白質分子中之至少一部分展示至脂質體之外部。在一實施例中,蛋白質分子為表面曝露之肺炎鏈球菌蛋白質。
在一實施例中,該組合物包含: a) 囊封單種類型之肺炎鏈球菌多醣之脂質體,其中多醣選自由1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F組成之群之血清型,及/或 b) 囊封多種類型之肺炎鏈球菌多醣之脂質體,該等多醣選自由1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F組成之群之血清型; 且其中脂質體具有非共價附接其表面上之包含以下或選自由以下組成之群之蛋白質分子:CRM197、白喉類毒素(DT或CRM197突變體)、破傷風類毒素(TT)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、結核菌素之純化蛋白質衍生物(PPD)、來自諸如PncO、GlpO及其組合之細菌之表面曝露之蛋白質或蛋白質部分,從而使得蛋白質分子中之至少一部分展示至脂質體之外部。
在一個實施例中,該組合物可包含脂質體且各脂質體囊封單種血清型多醣。然而,該組合物內之不同脂質體可具有相同或不同之單種血清型多醣。在不同脂質體上非共價附接脂質體之表面之蛋白質分子可為相同的或不同的。脂質體可具有展現於表面上之單種類型之蛋白質分子或展現於表面上之多種類型之蛋白質分子。此外,該組合物中之一些脂質體可不囊封多醣且該組合物中之一些脂質體可不具有附接且展現於表面上之任何蛋白質。一些脂質體可僅囊封多醣且不具有附接表面之蛋白質,且一些脂質體可僅具有附接表面之蛋白質且不具有經囊封之多醣。
當脂質體囊封複數種細菌多醣類型(血清型)時,類型之數目可為2-100。舉例而言,數目可為5至50、5至25、5至20或2-100之任何數目。在一個實施例中,脂質體可囊封超過100種多醣類型。在特定實施例中,血清型可為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30種或更多種(至多100種)。
脂質體雙層可包含此項技術中已知之一或多種類型之磷脂。囊封多醣且藉由非共價附接使蛋白質分子展現於表面上之脂質結構可為單層。在一實例中,組合物可包含雙層、單層或其他脂質結構之混合物。
如本文所使用之「磷脂」為具有有經由甘油主鏈連接至疏水性脂質尾部之磷酸根基團之親水性頭基的脂質。磷脂包含具有6至22個碳包括所有整數數目個碳及其間之範圍之醯基側鏈。醯基鏈可為飽和的或不飽和的。磷脂之實例包括磷脂醯絲胺酸、卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇及其類似者。實例包括1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)及1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。
在一實施例中,舉例而言,磷脂可為飽和或不飽和之任何磷脂。磷脂中之醯基鏈可含有6至22個碳。脂質體可包含膽固醇及/或其他固醇,且磷脂可為PEG化的。
在一實施例中,脂質體雙層可包含卟啉結合物。在一實例中,卟啉結合物中之磷脂為1-軟脂醯基-2-羥基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼。卟啉結合物中之磷脂可包含以下或基本上由以下組成:卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸及/或磷脂醯肌醇。在一實例中,藉由具有1至20個碳包括其間之所有整數數目個碳之碳鏈連接基團使卟啉與磷脂上之甘油基團接合。
在各種實施例中,除了卟啉結合物之外,脂質體之雙層亦包含其他磷脂。此等磷脂之脂肪酸鏈可含有合適的碳原子數目以形成雙層。舉例而言,脂肪酸鏈可含有12、14、16、18、20或22個碳原子。在不同實施例中,雙層包含卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸及/或磷脂醯肌醇。
舉例而言,脂質體雙層可包含卟啉磷脂結合物、不與卟啉接合之磷脂、視情況選用之膽固醇及視情況選用之PEG-磷脂。PEG可具有任何方便的尺寸。舉例而言,PEG部分之平均分子量可在500與5000道爾頓之間及其間之所有整數值及範圍。亦可使用其他PEG尺寸。PEG-脂質可以0至20 mol%包括其間之所有%量至十進制小數點之量存在。PEG脂質之實例包括DSPE-PEG,諸如DSPE-PEG-2000、DSPE-PEG-5000或其他尺寸之DSPE-PEG。
本發明之雙層及單層亦可包含固醇。固醇可為動物固醇或植物固醇。固醇之實例包括植固醇、豆固醇及膽固醇。在實施例中,膽固醇可以0 mol%至50 mol%或0.1至50 mol%存在。在其他實施例中,膽固醇可以1至50 mol%、5至45 mol%或10至30 mol%存在。
蛋白質或肽非共價附接脂質體雙層以使得其展現於表面上。在一實施例中,組胺酸標記(HIS標籤)之蛋白質可非共價附接脂質體以使得蛋白質展現於表面上。舉例而言,脂質體可包含雙層內之一或多種基團/部分(例如卟啉、巨環、胺基酸或金屬-離子螯合脂質)。使用金屬作為一實例,(例如Co2 +
、Ni2 +
、Zn2 +
、Cu2 +
及Fe3 +
)金屬可螯合至雙層中之部分以使得金屬滯留於雙層中或內,且蛋白質可經由蛋白質之一部分(例如結合至金屬之基團或部分,諸如(例如)組胺酸標籤)與金屬之間之相互作用(例如配位)非共價附接金屬以使得蛋白質之至少一部分處於雙層內,且蛋白質之剩餘部分展現於結構之外部上。舉例而言,雙層結構可包含具有螯合於其上之鈷之卟啉,以使得鈷金屬滯留於雙層及卟啉巨環內,且進一步具有非共價附接組胺酸標籤之蛋白質分子,以使得His標籤之至少一部分處於雙層內且與鈷金屬核配位。含有His標籤之分子之剩餘部分展現於脂質體之外部上。在另一實例中,諸如發生在氮基三乙酸(NTA)-鎳與多組胺酸之間之金屬蟄合-配位體相互作用可提供組胺酸標記之蛋白質與脂質體之非共價附接。因此,Ni-NTA可存在於雙層中,且組胺酸標籤可以與其非共價附接,使得蛋白質之His標籤之至少一部分處於雙層內且與Ni配位。蛋白質分子之剩餘部分展現於脂質體之外部上。
在一實施例中,可以改用其他基於親和力之方法,諸如:基於抗生蛋白鏈菌素-生物素之化學反應,替代金屬蟄合化學反應,使蛋白質非共價附接脂質體。脂質體可併入雙層中之抗生蛋白鏈菌素,且生物素標記蛋白質可隨後非共價附接脂質體雙層。舉例而言,抗生蛋白鏈菌素可共價或非共價附接脂質體。在另一實例中,脂質體可納入生物素標記脂質(例如DSPE-PEG-生物素)。可將生物素標記脂質體與抗生蛋白鏈菌素連接之蛋白質一起培育以形成生物素-抗生蛋白鏈菌素鏈結(BS鏈結)。在一個實施例中,含生物素之脂質體可附接抗生蛋白鏈菌素及生物素標記蛋白質以建立生物素-抗生蛋白鏈菌素-生物素鏈結(BSB鏈結)。
可與脂質體非共價接合之蛋白質之實例為CRM197。可用於生產多醣免疫原之免疫原性載體之其他實例包括白喉類毒素(DT或CRM197突變體)、破傷風類毒素(TT)、鑰孔血藍蛋白(KLH)及結核菌素之純化蛋白質衍生物(PPD)。此外,另外地或可替代地,亦可使用來自細菌之表面曝露之蛋白質或蛋白質之部分,諸如(例如) PncO或GlpO。在一個實施例中,可使用PncO及GlpO。在一個實施例中,僅可使用GlpO或僅可使用PncO。
舉例而言,可使用引發對抗鏈球菌(諸如(例如)肺炎鏈球菌)之保護性免疫反應之PncO或其片段。PncO可為藉由鏈球菌物種生產之彼等PncO中之任一種,包括來自肺炎鏈球菌、格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、變種鏈球菌(Streptococcus mutans)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、紅球菌屬(Rhodococcus sp.)之彼等PncO。
PncO不必與來自肺炎鏈球菌之PncO之胺基酸序列具有一致性。可在不更改其免疫原性之情況下對蛋白質序列作出修改,且其上之抗體之保護性能力升高。舉例而言,可在以下胺基酸之基團內進行保守取代:1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G);2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E);3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q);4)精胺酸(R)、離胺酸(K);5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V);6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W);7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T);及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)。舉例而言,抗原可與本文所提供之PncO之序列具有90至99%一致性,其中蛋白質可引出抗諸如(例如)肺炎鏈球菌之鏈球菌之保護性抗體。
PncO之序列可以來自肺炎鏈球菌D39之pncO (blpY)之GenBank寄存編號ABJ54598.1形式獲得。下文提供序列。PncO序列中之表面可接近區域顯示為加粗。
在一實施例中,表面展示之蛋白質之序列可與已知序列具有80至99%一致性。因此,非共價附接脂質體表面之蛋白質可與已知序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性,其中蛋白質能夠產生抗諸如(例如)肺炎鏈球菌之鏈球菌之保護性抗體。在一實施例中,PncO與SEQ ID NO:1之PncO具有至少70%一致性、較佳80或85%諸如至少90%或至少95、98或99%一致性。
GlpO之序列可以來自肺炎鏈球菌D39之GenBank寄存編號EC 1.1.3.21形式獲得。下文提供序列。
GlpO序列中之表面可接近區域在上文加粗。表面蛋白質可與本文所提供之GlpO之序列具有80至99%一致性,其中抗原能夠產生抗諸如(例如)肺炎鏈球菌之鏈球菌之保護性抗體。在一個實施例中,表面蛋白質與本文所提供之GlpO序列具有至少70%一致性、較佳80或85%諸如至少90%一致性或至少95、98或99%一致性。
表面蛋白質可為本文所描述之蛋白質或細菌或其免疫原性變異體之其他表面曝露之蛋白質的組合。舉例而言,蛋白質可為stkP或PspA。
可改變脂質體中之蛋白質及多醣之量例如以引出所需量之反應以提供保護。作為一實例,每劑量調配物之合併於脂質體中之一或多種蛋白質之量可為1微克/劑量至1毫克/劑量(例如30-650微克/劑量),包括其間之所有0.1微克/劑量值及範圍,且/或脂質體中之一或多種多醣之量可為10微克/劑量至2.0毫克/劑量(例如80-1,100微克/劑量),包括其間之所有0.1微克/劑量值及範圍,且/或一或多種脂質體脂質之量為500微克/劑量至15毫克/劑量(例如900微克/劑量-10毫克/劑量),包括其間之所有0.1微克/劑量值及範圍。調配物中可存在可不存在例如呈載體或賦形劑形式之其他蛋白質。
在實施例中,每劑量之結合於脂質體中之一或多種蛋白質之量可為10至800微克/劑量,包括其間之所有值及範圍至其間之十進制小數位及範圍,且/或每劑量之脂質體中之一或多種多醣之量可為10微克/劑量至1.5毫克/劑量或50微克/劑量至1毫克/劑量,包括其間之所有值及範圍至其間之十進制小數位及範圍,且/或每劑量之脂質體中之一或多種脂質體脂質之量可為750微克/劑量至10毫克/劑量,包括其間之所有值及範圍至其間之十進制小數位及範圍。
在一實例中,單獨多醣之量為2-44微克/劑量,蛋白質之量為15-350微克/劑量,且脂質體之量為500-5000微克/劑量。舉例而言,LEPS20V調配物可具有約80至900 μg多醣/劑量(歸一化至表面積之0.15-1.25 mg/kg)、約30至650 μg蛋白質/劑量(0.09-0.9 mg/kg)及950-9500 μg脂質體/劑量(約1.4-13.5 mg/kg),其具有約0.14-27 μg/μg (預期劑量中之1.36)之多醣與蛋白質之比率、1.1-110 μg/μg (例如10.82)之脂質體與多醣之比率及1.5-300 μg/μg (例如14.71)之脂質體與蛋白質之比率。在另一實例中,LEPS24V調配物具有105-1050 μg多醣/劑量(歸一化至表面積之0.15-1.25 mg/kg)、32-650 μg蛋白質/劑量(0.09-0.9 mg/kg)及950-9500 μg脂質體/劑量(1.36-13.55 mg/kg),其具有0.16-32 μg/μg (預期劑量中之1.6)之多醣與蛋白質之比率、0.9-90 μg/μg (例如9)之脂質體與多醣之比率及1.5-300 μg/μg (例如15)之脂質體與蛋白質之比率。
在各種實例中,脂質體中之一或多種多醣與一或多種蛋白質之比率可為0.1至50 w/w (以一或多種多醣及一或多種蛋白質之總重量計),包括其間之所有0.1值及範圍。在各種實例中,脂質體中之一或多種多醣與一或多種蛋白質之比率可為0.1至40 w/w (以一或多種多醣及一或多種蛋白質之總重量計)。在各種實例中,表達為脂質體脂質與多醣比率之脂質體之多醣負載量可為0.5至200 w/w (以一或多種脂質體脂質及一或多種多醣之總重量計)。在一實例中,表達為脂質體脂質與蛋白質比率之脂質體之蛋白質負載量可為1至500 w/w (以一或多種脂質體脂質及一或多種蛋白質之總重量計)。
在一實例中,脂質體(例如組合物(例如劑料)中之脂質體)包含0.6至0.7 (例如0.68)之多醣與蛋白質之比率及/或10至11 (例如約10.8)之脂質體脂質與多醣之比率及/或7-8 (例如約7.35)之脂質體脂質與蛋白質之比率。在另一實例中,組合物(例如劑料)包含0.75至0.85 (例如約0.8)之多醣與蛋白質之比率及/或約8.5至9.5 (例如約9.1)之脂質體脂質與多醣之比率及/或7-8 (例如約7.35)之脂質體脂質與蛋白質之比率。
可擴展地囊封額外的多醣於LEPS調配物內之選項進一步突顯與現行糖結合物疫苗選項之差異,該等現行糖結合物疫苗選項需要在使新型血清型CPS各自共價附接CRM197之情況下之連續努力及製造成本且此限制寬疫苗覆蓋度及全球獲取通路。可擴展地囊封額外的多醣於LEPS調配物內可以添加僅囊封新型一或多種多醣之脂質體或製備囊封現存及新型多醣之脂質體之形式進行。類似地,可藉由將脂質體添加至現存調配物中,其中所添加之脂質體具有表面展示之新型蛋白質,或藉由製備具有現存群之蛋白質及新型蛋白質之脂質體,從而將新型表面展示之蛋白質添加至LEPS調配物中。
調配物可包括載體或賦形劑。調配物可包括佐劑以增強免疫反應之程度或性質。免疫原性抗原及/或佐劑之量之測定可根據醫藥學或獸醫學領域中之標準技術進行。
在一實施例中,本發明組合物不具有佐劑。儘管本發明組合物不需要佐劑,但視需要可使用佐劑。舉例而言,佐劑可用作磷酸鹽緩衝鹽水中之0.001至50 wt%溶液,且抗原以約微克至毫克存在,諸如約0.0001至約5 wt%,諸如約0.0001至約1 wt%,諸如約0.0001至約0.05 wt%。抗原可以約微克至毫克或約0.001至約20 wt%諸如約0.01至約10 wt%或約0.05至約5 wt%之量存在。佐劑可作為免疫原性組合物中之獨立組分投與或可將其併入脂質體中。
可有用地用於製備疫苗之佐劑包括以下:例如佛氏完全及不完全佐劑(Freund's complete and incomplete adjuvant)之油佐劑、礦物鹽、明礬、二氧化矽、高嶺土及碳、聚核苷酸及微生物源之特定天然物質。佐劑之實例為α乳白蛋白與脂肪酸之非共價複合物。可用於製造複合物之脂肪酸包括不飽和順式C14至C20脂肪酸。(參見WO 2014/008465)。
對於本發明之疫苗組合物,可使用載體及/或非載體佐劑。實例包括基於鋁之佐劑(諸如明礬、氫氧化鋁或磷酸鋁)、單磷醯基脂質A (MPL)及3-O-去醯化單磷醯基脂質A (或3去-O-醯化單磷醯基脂質A或3-O-去醯基-4'單磷醯基脂質A) (3D-MPL)。
醫藥製劑可包含添加劑,諸如稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。視所需之投與途徑及製備而定,該等添加劑可為液體,諸如水及油、鹽水、葡萄糖或其類似物及輔助劑、穩定劑、增稠劑或潤滑劑、潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑、膠凝劑或黏度增強添加劑、清潔劑及增溶劑(例如亦稱為聚山梨醇酯20或80之TWEEN® 20、TWEEN® 80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如硫柳汞(Thimersol)、苄醇)、膨化物質(例如乳糖、甘露醇)、調味劑、顏料及其類似物。參見「Remington's Pharmaceutical Science」,第17版,1985。可使用非水性溶劑或媒劑,諸如丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油及玉米油之植物油、明膠及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。可僅在使用之前凍乾及再溶解或再懸浮調配物。可藉由例如經由細菌保留過濾器進行之過濾、藉由將滅菌劑併入組合物中、藉由照射組合物或藉由加熱組合物來使調配物滅菌。
本發明技術之關鍵特點在於其不需要使一或多種多醣與一或多種蛋白質接合。接合步驟並非簡單的,且在接合類型之疫苗調配物中,可包括在內之多醣(血清型)之數目受蛋白質之尺寸限制。相反地,因為本發明技術不需要使多醣與蛋白質接合,所以其不限制調配物中可呈現之血清型之數目。因此,本發明調配物可適於包括所識別之新型血清型。舉例而言,可將囊封新型血清型多醣之脂質體添加至現存調配物中。
本發明組合物可以液體製劑、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、延釋調配物、乳液、氣溶膠、噴霧劑形式或適合於將組合物引入受試者中之任何其他形式來提供以產生對抗肺炎鏈球菌或其他鏈球菌具有保護性之免疫反應。可將該等組合物投與至人類或非人類動物。
一般而言可將該等組合物投與至群體或可將其靶向處於罹患諸如肺炎鏈球菌之鏈球菌感染風險下之個體。舉例而言,可將其投與至與受感染個體緊密接觸之任何個體。
可使用包括但不限於以下之任何合適的投與途徑將該等組合物引入受試者中:非經腸、皮下、腹膜內、肌肉內、靜脈內、經黏膜(例如鼻內)、局部、皮內及經口投與。
免疫接種可藉助於單次給藥進行或其可藉由間隔開之多次給藥(例如1、2、3、4或5次給藥)進行。舉例而言,可使用初始投與及後續追加給藥。該等組合物可單獨投與或可與其他預防性組合物(諸如(例如)其他免疫原性組合物)或治療性組合物(諸如(例如)抗生素)一起共投與或依序投與。
在一態樣中,本發明提供製備諸如抗肺炎鏈球菌之疫苗組合物之疫苗組合物之方法,其包含製備一或多組脂質體,其中一組中之所有脂質體囊封單種且相同類型之莢膜多醣(血清型),且混合該等組以獲得包含囊封所需血清型之脂質體之組合物。因此,囊封例如圖15及16中之血清型中之一或多種之脂質體可用於形成疫苗組合物。在一實例中,血清型選自由以下組成之群:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。因為需要額外的血清型,所以可製備囊封彼等額外的血清型之脂質體且添加至現存組合物中,或可製備包括先前血清型及新型血清型之新型組合物。
在一個態樣中,本發明提供預防個體中之肺炎之方法,其包含向個體投與有效量之本文所描述之組合物。本發明亦提供降低群體中之肺炎之總發病率之方法,其包含向群體中之複數個個體投與有效量之本文所描述之組合物,由此免疫原性組合物之投與預防群體中之個體中之至少一些中的肺炎的發生以使得群體中之肺炎之總發病率降低。
儘管已特定參考針對產生抗鏈球菌之免疫反應之脂質體組合物,但本文所描述之策略、組合物及方法適用於任何細菌。舉例而言,LEPS調配物可用作用於金黃色葡萄球菌、流行性感冒桿菌、卡他莫拉菌、大腸桿菌、難養芽胞梭菌。可調配及使用本發明組合物以抵抗其之其他細菌包括無乳鏈球菌、例如結核分支桿菌之分支桿菌、新型隱球菌、非分型流行性感冒桿菌、流行性感冒桿菌b、宋內氏桿菌、克氏錐蟲、奈瑟氏腦膜炎菌及其類似物。
以下實例係作為說明性實例來提供且無論如何並不意欲為限定性的。 實例1
同類最佳之疫苗接種比較
在現行工作之第一次實驗中,吾等試圖創立Prevnar疫苗族之替代物,這依賴於使來自特異性血清型之肺炎鏈球菌多醣共價附接免疫原性CRM197蛋白質(能夠擴增接合多醣組分之免疫反應性之白喉毒素之不活化突變體),產生所謂的糖結合物疫苗(例如特點在於共價附接CRM197之13種不同血清型多醣之Prevnar 13)。與共價多醣-蛋白質偶合相反,吾等利用脂質體技術以囊封所需多醣內容物且以非共價附接及表面展示CRM197蛋白質(圖6及圖7;稱為多醣之脂質體囊封(LEPS))。藉此吾等達成自IgM至IgG之活體內抗體位移圖案及總抗體效價中之有效性及與Prevnar 13相當之對抗肺炎鏈球菌細菌攻擊之保護性(圖1A-C)。在此等比較中,亦在相對於Prevnar 13及LEPS調配物而言之降低之有效性(抗體類別變換及效價及細菌攻擊保護)的情況下測試Pneumovax 23疫苗(其含有來自23種血清型之純化CPS)。重要地,LEPS經由非共價共定位多醣及CRM197達成糖結合物疫苗有效性。可擴展地囊封額外的多醣於LEPS調配物內之選項進一步突顯與現行糖結合物疫苗選項之差異,該等現行糖結合物疫苗選項需要在使新型血清型CPS各自共價附接CRM197之情況下之連續努力及製造成本,因此限制寬疫苗覆蓋度及全球獲取通路(Gregorio,Nat Rev Immunol 14
, 505-514 (2014))。
額外的檢定提供對由LEPS平台提供之免疫反應之見解。亦即,圖1D呈遞調理吞噬活性(OPA)檢定之資料,其中將來自經免疫小鼠之血清在與HL-60人類吞噬細胞共培養之前添加至19F肺炎鏈球菌血清型(由現行Prevnar及Pneumovax調配物辨識)中。對於所有三種疫苗調配物,均易於觀測到細菌殺死,且在與現行標準相當之層級下再次執行LEPS。表S1 (圖15)呈遞經由跨越三個疫苗系統之OPA檢定評估之血清型的更透徹比較。類似地,圖8突顯在針對除了LEPS調配物中所包括之七種非疫苗血清型之外之由Prevnar 7及13覆蓋之血清型的保護性方面的有效性。鼻洗滌實驗表明,由於在此情況下進行比較之三個疫苗系統中所包括之對應多醣,所以19F肺炎鏈球菌血清型不創立滑鼠鼻咽內之滯留(圖1E)。對免疫反應機制之見解係由抗CD4+T細胞耗乏檢定提供,其中抗體效價顯著地降低,這表明經由胸腺依賴性路徑進行之抗原處理(圖1F)。最後,兔子受試者內之抗體效價及OPA活性證實與對小鼠受試者所觀測之彼等活體內趨勢一致之活體內趨勢(圖9)。
廣闊之蛋白質抗原血清型評估及普遍覆蓋度之前景
允許替代性肺炎球菌疾病疫苗之相同之脂質體技術具有解決基於常在病原之疾病進展之互補態樣的受關注潛在性。亦即,除了選擇性地靶向肺炎球菌毒性轉變之蛋白質抗原(GlpO及PncO;經由抗原發現及驗證模式識別(Li 等人,Proc Natl Acad Sci U S A 113
, 6898-6903 (2016))之脂質體表面定位之外,調配物亦提供充當現行疫苗之基礎之多醣(拓殖免疫靶標)的同時囊封(圖5)。在測試此可能性之前,OPA檢定致能GlpO及PncO蛋白質抗原作為保護性相關物以用於未來免疫接種實驗之更謹慎的評估。然而,在此情況下,OPA檢定評估對對應多醣或蛋白質抗原組分起反應之常在病原疾病進展之拓殖(含有浮游細胞之表面CPS)及分散(展示生物膜釋放之細胞之表面蛋白質抗原靶標)態樣。所得見解與僅評估浮游CPS細胞靶標且因此具有朝向拓殖預防之先天性偏置之傳統的OPA檢定形成對比。如表S2 (圖16)及圖10中所示,Prevnar 13、Pneumovax 23及GlpO/PncO蛋白質抗原證實針對其相應細胞靶標之比活性。值得注意地,GlpO/PncO串列對於>70種肺炎鏈球菌之生物膜釋放之血清型具有活性。此為針對肺炎球菌疾病之後期抗原及連同跨越肺炎鏈球菌血清型之glpO / pncO
基因(Li 等人,Sci Adv 2
, e1600264 (2016))之高序列保守性之最大且最全面的評估,強調對抗任何毒性轉變之肺炎鏈球菌細胞之普遍保護潛在性。亦更徹底地測試蛋白質抗原以用於免疫反應機制(LEPS調配物內或與LEPS調配物分離),這顯示在貢獻小鼠中之Th1及Th17活性之情況下之主要Th2反應(圖2A-E)及兔子中之對應體液反應(圖2F)。支持抗原類型之互補態樣,測試呈與Prevnar 7一起共投與及附加格式之PncO及GlpO蛋白質,藉由解決常在病原拓殖、毒性轉變或兩者證實保護性能力(圖11)。
經由
LEPS
技術之全面性疫苗平台
接下來,將PncO及GlpO蛋白質抗原與多醣之脂質體安全殼偶合產生完成的LEPS媒劑(LEPS20:PncO&GlpO;圖3),因此允許常在病原疾病進展疫苗接種範例之最終評估。自圖1及2內之資料,預期完全LEPS媒劑具有理想的免疫反應特徵(類別轉換、記憶體、寬T細胞活化)。除了全面性且有向之保護以外之針對完成媒劑(圖3A)內之抗原類型中之各者所得的體液反應在活體內A型流感病毒(IAV)進行測試時-引起肺炎球菌疾病轉變之肺炎模式。跨越策略性血清型(19F [圖12]、11A及35C)之攻擊檢定確認Prevnar 13及Pneumovax 23之保護性限制且突顯完全LEPS系統(圖3B)之完整保護性能力。強調抗原互補,甚至在不需要必需CPS以預防藉由11A及35C血清型進行之拓殖之情況下,LEPS20:PncO&GlpO調配物提供完整保護。相關解剖學剖析進一步確認最終LEPS調配物抑制非疫苗血清型之疾病分散之能力。類似結果伴隨肺炎及敗血症疾病模式(圖13)。
儘管LEPS疫苗之有效性為關鍵結果,但更廣之含義為消除肺炎鏈球菌之最侵入性血清型之拓殖同時同步防止不由現行疫苗調配物覆蓋之生態棲位-置換血清型之毒性轉變的雙重潛在性。因為藉由跨越肺炎鏈球菌菌株之序列保守性及跨越多種抗原之抗原漂移之最少化輔助之GlpO及PncO抗原的普遍保護潛在性(表S2 (圖16)),所以此為有可能的。圖4提供侵入性肺炎球菌疾病情況之現行及所預測時刻表,其強調非疫苗血清型之難分解性及解決該等問題之LEPS調配物之潛在性。值得注意地,經由囊封所有已知肺炎鏈球菌血清型多醣(除了表面展示GlpO及PncO蛋白質抗原之外)之前景,即對於伴隨現行糖結合物疫苗產品之多醣-蛋白質偶合化學反應而言經濟上不可行之選項,LEPS平台亦提供技術上可行之視覺以用於普遍性。如此,LEPS平台組合現行疫苗之最佳態樣同時預先考慮常在病原疾病進展之基礎原則。
本發明規定在共定位兩個互補抗原作為下一代疫苗以用於肺炎球菌疾病時。在不損害現行疫苗設計之有效性之情況下,吾等引入致能對疾病起反應之疫苗中之普遍性。因此所得LEPS平台將侵入性血清型拓殖減至最少同時亦防止針對所有拓殖血清型之毒性轉變。因此,完整疾病進展路徑導引為解決肺炎球菌疾病之攻擊態樣提供全面性應答之疫苗的發展。更廣泛地,在此研究中概述之概念力圖用可調節以消除或保留滯留作為宿主之最大益處之功能的方法來平衡益處與缺陷至微生物共生(microbial commensalism)。
材料及方法
實驗性設計。
使用在肺炎球菌疾病疫苗接種情形下之脂質體載體平台來共定位來源於基於常在病原之疾病進展之理解及分析的互補抗原。評估形式包括脂質體載體(liposomal vector)表徵;組織特異性疾病進展;抗體、細胞介素及T細胞耗乏分析;端點及時程之攻擊-保護檢定;全面性調理吞噬活性檢定;且測試係在滑鼠及兔子模式中進行。資料均一地支持能夠在肺炎球菌疾病之情形下具有用於普遍覆蓋度之潛在性之情況下引導免疫反應跨越基於常在病原之疾病之階段的有效疫苗接種策略。
倫理學表述。
此研究係嚴格遵照美國國家衛生研究院之《實驗室動物護理及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)》中之建議進行。協定經布法羅分校(the University at Buffalo)之機構動物護理及使用委員會(the Institutional Animal Care and Use Committee)批准。所有細菌接種及治療均在設計成將動物之任何潛在性痛苦降至最低之條件下進行。
試劑。
細菌及細胞培養基(包括化學成分確定之細菌生長培養基[CDM])及試劑購自Fisher Chemical及Sigma-Aldrich。綿羊血液購自Hemostat Laboratories。脂質DOPG-Na及DSPE-PEG2000獲自NOF;DOGS-NTA-Ni購自Avanti Polar Lipids;DOPC、膽固醇及明礬(作為磷酸鋁)及多醣購自Sigma-Aldrich。LL-37購自InvivoGen。Prevnar 7及13及Pneumovax 23疫苗分別獲自Pfizer及Merck。
抗原製備。
所有蛋白質(CRM197、綠色螢光蛋白質[GFP]、PspA、GlpO及PncO)均用聚組胺酸標籤經由大腸桿菌以重組方式生成。經由合作交換獲得含有用於GFP、CRM197及PspA之基因之質粒(Li 等人,Sci Adv 2
, e1600264 (2016); Stefan 等人,J Biotechnol 156
, 245-252 (2011))。剩餘基因係由肺炎鏈球菌基因體DNA進行PCR擴增且使用藉由PCR引物引入擴增產物中之限制位點SacI / XhoI ( glpO )
及NdeI / XhoI ( pncO )
選殖成獨立pET21c載體(Li 等人,Proc Natl Acad Sci U S A 113
, 6898-6903 (2016))。在由限制性消化及群落PCR確認質粒之後,將最終構建體化學上轉化成大腸桿菌BL21 (DE3)以在藉由SDS-PAGE進行分析之前經由使用異丙基β-D-1-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG;1 mM)誘導在0.4-0.6之OD600nm
值下之3 mL溶菌肉湯培養液(LB)培養物來確認個體表達。所確認之表達引起經按比例調整之1 L培養物以用於經由使用高壓均質機(French Press) 進行之細胞破裂且通過在快速蛋白質液相層析柱(GE Healthcare HisTrap HP,1 × 1 mL)上之細胞溶解物進行之表達及蛋白質純化。使用Pierce™ Micro BCA™蛋白質檢定定量最終蛋白質產物。
LEPS 製備及表徵。
經由脂質體遞送系統共定位蛋白質及多醣組分。LEPS脂質體載體由呈對500 µg總脂質質量而言3:3:1:4:0.1莫耳比之DOPC:DOPG:DOGS-NTA-Ni:膽固醇:DSPE-PEG2000構成。在將脂質溶解於三氯甲烷中之後,使用Branson 450D細胞破碎儀(使用錐形尖端在20%振幅下)音波處理溶液1分鐘且隨後使用旋轉式蒸發器進行蒸發以形成膜。隨後用含有多醣抗原之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)復水脂質以形成脂質體,隨後使其通過孔徑為200 nm之手持型擠壓機(Avanti Polar Lipids) 10-12次。在冰上,使背景脂質體溶液通過50 nm孔徑過濾器兩次且每次經PBS置換。接下來,在經由聚組胺酸標籤-Ni螯合介導表面附接之情況下在4℃下將蛋白質與脂質體一起培育30分鐘。CRM197包括於用於圖1、圖8、圖9、圖14及表S1 (圖15)之LEPS調配物中;CRM197不包括(由GlpO/PncO置換)於用於圖2、圖3、圖10、圖12及圖13之LEPS調配物中。在此階段,經由在4℃下之隔夜透析(100 kDa MWCO)使任何非結合蛋白質及多醣與最終LEPS構建體分離。在整個研究中,在疫苗接種期間所使用之最終調配物由含有單獨多醣之LEPS顆粒之混合物構成。舉例而言,最終20價CPS LEPS調配物由混合20種單獨製備之樣本產生。可替代地,亦測試共調配方法(用有限數目個血清型多醣)且在最終疫苗保護方面無差異之情況下與正上方所描述之混合方法比較(圖14)。製備所有最終LEPS調配物以遞送在免疫之前1:10稀釋於PBS中之Prevnar及Pneumovax調配物內利用之相同量之多醣內容物(及視需要CRM197蛋白質)。
藉由分析多醣囊封及表面蛋白質結合效率開始LEPS顆粒之表徵。在一定範圍之多醣(使用19F)或蛋白質(使用GFP)與脂質比率內完成定量以識別效率之交叉點(圖7)。對於多醣評價,將濃硫酸(150 µL)及30 µL苯酚(5% w/v)添加至50 µL脂質體溶液中,隨後在495 nm下之比色分析之前在80℃下培育30分鐘且在22℃下培育30分鐘。經由在359 nm激發波長及508 nm發射波長下之螢光分析量測蛋白質內容物。兩項分析均使用Synergy 4多模微定量盤式讀取器(BioTek Instruments, Inc.)進行,且將量測值與標準(使用葡萄糖或GFP)比較且成比率成引入LEPS生產過程中之多醣及蛋白質之初始量。Zetasizer nano-ZS90 (Malvern, Inc.)上之動態光散射(DLS)用於評價在25℃下之脂質體之粒徑及ζ電位。所有實驗均使用在與入射雷射束成90°之固定量測角度下之4 mW 633 nm HeNe雷射作為光源來進行。LEPS顆粒之影像係經由在100 kV下之JEOL JSM-CXII穿透式電子顯微鏡術分析用藉由浸塗200目經方華膜及碳塗佈之網格(FCF-200-Cu-TB,Electron Microscopy Sciences)、隨後使用1%醋酸鈾醯溶液進行負染色製備之樣本獲得的。
疫苗免疫接種。
遠親雜交6週齡之雌性CD-1小鼠(Harlan Laboratories)用於免疫接種實驗。藉由皮下注射(200 μL)使小鼠免疫;用於調配物之背景溶液為PBS (「假」陰性對照物為在無抗原組分之情況下投與之背景溶液)。裸調配物或脂質調配物(GlpO、PncO、CRM197及PspA)中之最終蛋白質抗原含量均為12.5 μg。當組合時,各以6.25 μg投與PncO及GlpO。除非另外指明,否則根據製造商指令將明礬佐劑添加至蛋白質樣本中。在14天之後,用相同調配物追加小鼠;在第14天及第28天藉由後眼眶放血收集血清樣本以用於抗體及OPA分析。經由在第0及14天肌肉內投與500 µL相應樣本使四月齡之新西蘭白兔(Cocalico Biologicals)免疫;在第14及28天收集末梢血液樣本以用於抗體及OPA分析。
細菌製備及生物膜釋放。
起初在補充有0.5%酵母萃取液及5%綿羊血液之Todd-Hewitt瓊脂板上生長用於此研究之細菌菌株且在37℃下隔夜培育。單獨群落用於接種5 mL含有0.5%酵母萃取液之Todd-Hewitt培養液且在37℃下培育至0.6之OD600
。在此時,藉由離心收集細菌,用PBS洗滌一次且再懸浮於PBS中,且藉由OD600
量測進行定量以用於需要浮游細胞之實驗。將浮游細胞引入活體外生物膜模式中且用於所有OPA檢定(除非另外特別指示)、滑鼠拓殖分析及活體內流行性感冒誘導之肺炎模式內。
為創立生物膜條件,首先在RPMI-1640培養基中培養NCI-H292上皮細胞(CRL-1849;ATCC)且在37℃及5% CO2
下在T75燒瓶中添加胎牛血清。在達至100%匯合之後,在34℃下在4%緩衝三聚甲醛中預固定H292細胞48小時,隨後用PBS洗滌三次。隨後將在CDM中生長之肺炎球菌接種至固定H292細胞上且培養基每12小時發生一次變化。將所形成之生物膜曝露於熱(38.5℃) 4小時,且隨後藉由離心收集所釋放之細胞,用PBS洗滌一次且再懸浮於PBS中,且藉由OD600
量測進行定量。利用生物膜釋放之細胞之實驗包括活體內敗血症及肺炎模式。
攻擊模型。
分別經由腹膜內或鼻內(伴以異氟醚)投與用1 × 104
(敗血症模式)或1 × 106
(肺炎模式)群落形成單位(CFU)之肺炎球菌菌株攻擊小鼠。為誘導拓殖,不伴以異氟醚向小鼠鼻內投與1 × 106
CFU之細菌。為引起流行性感冒誘導之肺炎,隨後使肺炎球菌拓殖鼻內接種有40空斑形成單位之IAV (菌株A/PR/8/34 [H1N1;ATCC VR-95];藉由空斑檢定測定效價)。每四小時監測一次小鼠之發病跡象(蜷縮、亂毛、嗜睡及腹表面溫度)。經由CO2
窒息及頸椎脫位術使認為瀕死之小鼠安樂死。
抗體分析。
如先前所描述(Li 等人,Sci Adv 2
, e1600264 (2016)) 用經延伸以包括20種來自相關血清型之多醣及GlpO及PncO蛋白質抗原之方法進行抗原抗體效價分析。因此,將分析延伸至研究內所利用之所有抗原。使用IFN-γ及IL-17A ELISA試劑盒(R&D Systems)實現細胞介素量測。
組織細菌計數。
在拓殖後第5天,如圖1E及S7B&C中所呈遞分析樣本。在流行性感冒誘導之肺炎之後,在如所指示之IAV投與後第1及5天或在變得瀕死時分析小鼠,且收集鼻咽組織、鼻咽灌洗流體、肺及血液樣本之組合且如先前所描述 (Tyx 等人,J Bacteriol 193
, 3512-3524 (2011))測定細菌負荷。簡言之,均質化組織及器官均質物、灌洗流體及血液以確保細菌聚集物之解離且隨後在計算之前在胰酶大豆及5%血液瓊脂板上連續稀釋。
CD4 + 耗乏。
對於活體內CD4+
T細胞耗乏,在三個連續日內將0.5 mg抗CD4+
單株抗體(Invitrogen)腹膜內注射至小鼠中。在第六天後,使用流式細胞量測術確認≥95%之T細胞耗乏,且隨後在指定實驗中利用此等小鼠受試者。
OPA 分析。
在先前協定(Romero-Steiner 等人,Clinical and Vaccine Immunology : CVI 13
, 165-169 (2006))上延伸,用二甲基甲醯胺分化人類HL-60細胞以定量曝露於自經免疫小鼠受試者收集之血清之稀釋以識別50%殺死端點(藉由CFU計數定量)之肺炎鏈球菌之抗體介導的調理吞噬及殺死。HL-60及肺炎球菌之培育持續75分鐘。
統計分析。
使用用於不配對資料之雙尾Student t測試經由GraphPad Prism軟體(6.0h.283版;GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)分析比較以用於統計顯著性。所有資料自利用使用四與十二個之間之受試者進行之動物實驗的最少三種樣本得到。 實例2
在此實例中,吾等發展解決潛在性安全問題且創立所需之肺炎球菌疫苗之LEPS調配物之另一實施例。安全問題係藉由評價與GlpO相關聯之潛在性脫靶免疫原性且評估替代性蛋白質-脂質體附接策略以消除對his標記之蛋白質(且消除新抗原之潛在性引入)的依賴性來解決。在如此操作時,吾等自調配物移除GlpO同時經由PncO之劑量遞增保留生物膜穿透性毒性靶向且擴充疫苗以包括24個CPS。隨後吾等使用單劑量遞增研究評估全面性LEPS設計。此等研究表示普遍肺炎球菌疫苗之發展中之重要步驟。
結果
針對與
GlpO
相關聯之脫靶免疫原性之風險評估
肺炎鏈球菌GlpO及PncO蛋白質抗原冒對天然微生物群內之同源靶標之免疫反應性的風險。儘管在初始免疫接種研究內未觀測到負毒理學得分,但使用50% BLAST同源性篩檢進行用於抗人類常在病原細菌中之靶標之GlpO及PncO蛋白質之序列同源性檢索。當未識別到用於PncO之成功結果時,發現大量微生物群蛋白質靶標與GlpO具有>50%同源性(表S4 (圖27))。根據所識別之子組細菌,選定表示多樣同源性及生理位置之十種物種以用於進一步分析(圖18)。
隨後在免疫螢光法檢定內測試來自經GlpO接種之小鼠之血清以確定抗體是否抗肺炎鏈球菌GlpO證實脫靶細菌結合。相對於假疫苗接種觀測朝向所測試之細菌物種之強抗體結合(圖18A)。另外,用於若干物種之免疫螢光法與用於作為GlpO疫苗之直接靶標之肺炎鏈球菌EF3030 (19F)菌株而獲得的免疫螢光法相當。當在蛋白質同源性之情形下評價免疫螢光法(圖24)時,觀測到顯著之陽性相關性(R2
= 0.858),這表明所觀測之結合強度與序列同源性有關。在所觀測之脫靶抗體結合之情況下,使用四種代表性物種執行OPA檢定以確定所得抗體結合是否具有中和活性。如圖18B中所示,觀測到相較於BFR EF3030而言之各細菌物種之顯著的殺死活性。綜合而言,此等結果表明利用GlpO之疫苗接種可影響人類微生物群落。
LEPS
(
20V
)
調配物中之蛋白質抗原劑量遞增
在致力於創立劑量限制且評估針對蛋白質抗原之個別有效性方面,進行具有變化劑量(34、68或136 µg)之GlpO及PncO之20價LEPS (LEPS (20V))疫苗調配物的免疫原性及OPA評估。使用跨越六種疫苗及NVT血清型(6C、35B、15C、16F、23A及9N)之BFR肺炎攻擊模型測定疫苗功效。如圖19中所示,與Prevnar 13®
(PCV13)及Pneumovax 23®
(PPSV23)相比,利用GlpO、PncO及GlpO+PncO之疫苗接種實質上改進所有所測試之血清型之存活率。另外,與用CRM197調配之LEPS (20V)相比,LEPS (20V)中之利用GlpO及/或PncO之疫苗接種改進跨越所有血清型之存活率。此表明對抗NVT細菌之保護(亦即CPS不包括於LEPS中)係由於包括肺炎球菌穿透性毒性蛋白質而引起。儘管觀測到針對用於在34 μg初始劑量下之6C、15C、16F及23A血清型之GlpO或PncO之不完全保護,但吾等觀測到,增加劑量能夠恢復與組合蛋白質之疫苗調配物相當之100%保護。 為評價免疫原性,吾等量測由疫苗接種產生之抗體之生產及中和活性。當跨越用於GlpO (圖25)、PncO (圖3A-C)及GlpO+PncO (圖26)之劑量定量抗體效價時,觀測到跨越所有CPS及蛋白質抗原之抗體之大量生產。引起關注地,發現當將蛋白質劑量自34 μg增加至68 μg時,靶向CPS之相對抗體效價增加(圖20)。然而,當將劑量自68 μg增加至136 μg時,CPS抗體中存在顯著減少(圖20)。隨後使用浮游或BFR細菌(表5、6 (相應地圖28及29))來量測在OPA檢定情況下之此等抗體之中和活性。與抗體效價之觀測結果一致,當將蛋白質劑量增加至136 μg時,用於浮游細菌之50%殺死稀釋度降低。相反地,BFR細菌之50%殺死稀釋度一般隨蛋白質劑量增加而升高。綜合而言,此等研究表明隔離之GlpO或PncO之劑量遞增可充當共調配之替代方案。
IAV
肺炎攻擊模型中之
PncO
劑量遞增
由於對GlpO之脫靶免疫原性之擔憂,所以吾等使用A型流感病毒(IAV)肺炎攻擊模型(其模仿毒性肺炎球菌之活體內生物膜釋放)尋求PncO作為單獨蛋白質之功效之額外的確認。使用經調節EF3030 (19F)肺炎鏈球菌拓殖之小鼠接種有IAV以促進自鼻咽生物膜至血液及肺中之細菌傳播。如圖21中所示,增加PncO之劑量減少跨越每一位置之細菌負載。引起關注地,利用PncO之疫苗接種引起IAV感染之後之鼻咽之減少的拓殖。此有可能係由於由用以增強拓殖之細菌之初始調節所引起的PncO的上調。無論如何,此研究進一步證實增加PncO之劑量超過吾等34 μg之初始劑量顯著地阻止肺炎鏈球菌繁殖及傳播。
建構
24
價
LEPS
疫苗
為證實LEPS疫苗平台之普遍性,吾等評價引入20價調配物中之四種新型血清型CPS之免疫原性及OPA層級。詳言之,選定10A、11A、15B、33F血清型以涵蓋當前使用之疫苗中所包括之全部血清型。起初如圖21中所示分別針對各CPS評價免疫原性。各CPS達成有效抗體生產及IgM向IgG之類別變換(圖22 A及B)。此等結果表明進一步支持對任何肺炎球菌CPS普遍適用之LEPS囊封方法。
在單獨地評價新型CPS抗原之初始研究之後,吾等將所有四種新型調配物與吾等LEPS20V疫苗組合以創建新型24價疫苗(LEPS(24V))。此外,為評價由包括額外的CPS導致之免疫原性之潛在性損失,評價跨越所有24種血清型之相對抗體效價。如圖22C中所示,用PncO或CRM197調配之LEPS(24V)產生用於所有血清型之CPS抗體之顯著效價。此外,所量測之抗體效價一般與針對市售疫苗獲得之彼等抗體效價相當。另外,OPA檢定用於量測獲自接種有LEPS (24V)調配物之小鼠之血清的中和活性。如表S7 (圖30)中所示,CRM197及PncO調配物均能夠獲得與跨越所有共享及未共享血清型之PCV13之OPA效價相當的OPA效價。綜合而言,此等結果表明LEPS調配物策略為用於裝配抗肺炎鏈球菌之基於CPS之疫苗之普遍適用且可擴展的方法。
發展替代性蛋白質
-
脂質體附接策略
LEPS平台之特點為蛋白質之非共價表面定位。作為一實例,吾等使用his標記之蛋白質及含有鎳-NTA之脂質。然而,儘管吾等迄今為止未觀測到免疫接種研究期間之任何不良反應,但為解決與使用鎳及his標記之螯合組分相關聯之任何潛在性毒性及/或不良免疫原性問題,吾等評估用於載體或抗原蛋白質之替代性非共價附接方法。初始更改包括螯合金屬(鎳[Ni2 +
]對鈷[Co2 +
])或金屬架構(NTA對卟啉)中之改變。另外,評價兩種生物素-抗生蛋白鏈菌素系統且二者之特點均在於併入脂質體中之生物素標記脂質(DSPE-PEG-生物素)。在一種系統中,指示「BSB」,使含生物素之脂質體與抗生蛋白鏈菌素及生物素標記CRM197一起培育以創建生物素-抗生蛋白鏈菌素-生物素鏈結。在替代系統中,使生物素標記脂質體與抗生蛋白鏈菌素連接之PspA一起培育以形成生物素-抗生蛋白鏈菌素鏈結(BS)。
起初,電泳移動性變換檢定(EMSA)係用於藉由測定結合至脂質體之表面之蛋白質的溶離份來量測結合效率。如圖23A中所示,所有脂質體變異體隨時間推移提供至少50%蛋白質結合,且BS及BSB策略證實相對於跨越所有培育時間之金屬螯合選項而言之可比或增強的結合。引起關注地,當此等調配物用於遞送19F CPS時,結合效率充當用於免疫原性之一般代理者。在小鼠之免疫接種之後,對於各調配物,CPS抗體類別變換(圖23B)及效價(圖23C)之程度與蛋白質結合效率相關。特定言之,BS調配物顯著地勝過抗體效價及抗體類別變換中之Co-NTA。此外,觀測到如藉由OPA檢定所量測之用於中和活性之此等趨勢(圖23D)。最後,使用動態光散射表徵調配物以確定脂質體尺寸分佈及表面電荷。如表S8 (圖31)中所示,脂質調配物中之特性為類似的。然而,包括蛋白質及多醣增加脂質體尺寸且包括蛋白質引起脂質體表面處之增加之負電荷。綜合而言,此等結果突顯LEPS平台保留跨越設計成促進臨床轉譯及利用之調配物變化之功效的可撓性。
LEPS
急性毒性之單劑量評估
為評估LEPS疫苗之毒性,吾等執行CD-1小鼠中之單劑量遞增研究以評價急性毒性且標識最大耐受劑量(MTD)。在此等研究中,使動物接種有吾等治療劑量(34 μg蛋白質及2.2 μg各CPS)以及5及10×劑量。如表1中所示,在LEPS中雄性及雌性小鼠耐受至多10×治療劑量之蛋白質及CPS。另外,藉由量測血液中之代謝物及白細胞濃度來評價與疫苗接種相關聯之血液學效應(表9、10 (相應地圖32及33))。
如表9 (圖32)中所示,血液中之各種化學品之含量在整個所有劑量中為大部分類似的。儘管跨越不同群組鈉濃度為統計學上不同的,但其濃度中不存在可辨別圖案。類似地,觀測到跨越所有群組不同白血球之濃度為類似的(表S10 (圖33))。在此等研究中,觀測到與增加疫苗劑量相關聯之淋巴細胞中之略微增加,這表明潛在性免疫反應;然而,該等差異不為統計學上不同的。儘管溫和的反應原性出現在疫苗接種時,但其限於不造成延長之痛苦之初始酸痛及刺激。綜合而言,此等結果證實LEPS疫苗不證實動物中之明顯的急性毒性。
論述:
儘管已研發出抗肺炎鏈球菌之有效疫苗,但不完全血清型覆蓋度及穿透性疾病之潛在性導致實質性全球保健負擔。此實例證實本發明之LEPS系統用於藉由以下來滿足額外之血清型之挑戰的用途:擴充覆蓋度至24種血清型,合併成一個表面附接之蛋白質抗原(PncO),識別每劑量之合適量之蛋白質(例如68 μg)且識別替代性附接策略。綜合而言,此等結果用來藉由透明化臨床發展計劃、簡化製造且解決安全問題來推進LEPS系統之臨床準備。
舉例而言,在此實例中,吾等使用不含GlpO之疫苗調配物且增加PncO劑量。另外,吾等證實LEPS疫苗可經由替代性非共價蛋白質表面附接方法進行功能上裝配。
引起關注地,吾等觀測到與疫苗接種中之蛋白質濃度中之增加及替代性蛋白質與脂質體附接策略之結合親和力相關聯之獨特效應。特定言之,吾等觀測到將PncO劑量自34 μg增加至68 μg改進所有20種CPS之相對抗體效價(表11 (圖34))且改進14/20種血清型之OPA檢定結果(表S12 (圖35))。不管CPS含量保持恆定之事實如何,皆觀測到此情況。然而,進一步倍增PncO含量至136 μg降低相對抗體效價及OPA檢定效能(表S11、S12 (相應地圖34及35))。有效地增加表面處之蛋白質之濃度之中間蛋白質濃度亦可提供免疫反應之有效引起。
材料及方法
待用於研究中之細菌及細胞菌株 ( 全部包括在內 )
此研究中之肺炎鏈球菌菌株包括>70種血清型及肺炎鏈球菌EF3030 (血清型19F)作為OPA及免疫螢光法研究中之對照物。補充表1中所列之細菌物種用於包括OPA及免疫螢光法檢定之微生物群研究。NCI-H292上皮細胞(CRL1849,美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC))用於支持生物膜生長。分化人類HL60細胞以供標準及修正OPA研究使用。
同源性檢索描述
藉由考慮在BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov)中可獲得之常在病原細菌胺基酸序列中之間隙及錯配計算常在病原細菌物種中之glpO
同源物(補充表1)之保守性。使用InterPro資料庫(ebi.ac.uk/interpro)確立表面可及性,且用bepipred線性抗原決定基預測方法使用IEDB分析資源(tools.immuneepitope.org/bcell)預測抗原決定基區域。用於此研究之參考glpO
序列為肺炎鏈球菌D39 (寄存CP000410.1)。
細菌生長及接種
起初在補充有0.5%酵母萃取液及5% (vol vol- 1
)綿羊血液之Todd-Hewitt瓊脂板上生長用於此研究之肺炎鏈球菌菌株且在37℃下隔夜培育。將單獨群落轉移至5 mL含有0.5%酵母萃取液之Todd-Hewitt培養液且在37℃下培育至0.6之OD600
。隨後在化學成分確定之培養基(CDM)中1:10稀釋細菌至約0.5 mL之OD600
,隨後將其添加至含有一層固定H292細胞之24孔板之各孔中。可替代地,藉由離心收集所培養之浮游肺炎鏈球菌,用PBS洗滌一次且再懸浮於PBS中,且藉由OD600
量測進行定量以用於需要浮游細胞之實驗。
H292
細胞生長及固定
首先在RPMI 1640中培養NCI-H292上皮細胞且在37℃及5% CO2
下在T75燒瓶中添加胎牛血清(FBS)。在達至100%匯合時,移除培養基且使細胞與胰蛋白酶-EDTA溶液一起培育直至細胞層分散。隨後經由離心收集細胞,且在RPMI 1640中用FBS 1:8稀釋,且轉移至24孔板,且如上文所描述進行生長直至達至100%匯合。在達至100%匯合之後,用PBS洗滌H292細胞三次,在34℃下在4%緩衝三聚甲醛中預固定48小時,且用PBS洗滌三次。
生物膜生長及釋放
除非另外規定,否則將在CDM中生長之肺炎球菌接種至如上文所描述之固定H292細胞上且在37℃下培育48小時。在整個生物膜生長期中,每12小時更換一次培養基。為促進肺炎球菌釋放生物膜,除非另外規定,否則將生物膜曝露於熱(38.5℃) 4小時。所有釋放均同時進行以降低變異性。隨後藉由離心收集所釋放之細胞,用PBS洗滌一次且再懸浮於PBS中,且藉由OD600
量測進行定量。隨後由此等生物膜釋放之細胞用於肺炎球菌疾病肺炎及敗血症模式。
蛋白質生產及純化
所有蛋白質[CRM197、GlpO、PncO、PspA]均用聚組胺酸或抗生蛋白鏈菌素標籤,使用大腸桿菌(BL21(DE3)),以重組方式生成。先將細菌菌株接種至3 mL溶菌肉湯培養液中且隔夜生長。隨後將細菌轉移至1 L溶菌肉湯培養液中且生長直至OD600
達到0.4至0.6為止。隨後使用1 mM異丙基β-D-1-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白質生產且在22℃下隔夜培育培養物。經由使用高壓均質機(French Press)打破細胞,且由溶胞物通過快速蛋白質液相層析柱(GE Healthcare HisTrap HP,1 × 1 ml及XXXX),進行蛋白質純化。使用Pierce Micro BCA蛋白質分析套組定量最終蛋白質產物。
LEPS
調配物及組合
如下調配LEPS載體。除非另外規定,否則由呈3:3:1:4:0.1莫耳比之DOPC/DOPG/DOGS-NTA-Ni/膽固醇/DSPE-PEG2000構成總脂質質量為500 µg之LEPS載體。將脂質溶解於三氯甲烷中,音波處理一分鐘,且隨後使用旋轉式蒸發器進行蒸發以形成膜。使用含有單一莢膜多醣抗原之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)復水此膜,以形成脂質體載體。隨後使此等粒子通過孔徑為200 nm之手持型擠壓機(10-12次)。使各自含有不同CPS之二十個(或二十四個)單獨製備之LEPS樣本在4℃下與含有聚組胺酸或抗生蛋白鏈菌素標籤之蛋白質抗原(CRM197、GlpO、PncO或PspA)一起培育30 min,以促進經由聚組胺酸標籤-Ni螯合之表面結合。經由在4℃下,在PBS中進行透析一夜,以移除未結合蛋白質或未囊封CPS。隨後合併所有樣本,以形成最終20或24價LEPS變異體。20價調配物含有20價:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、17F、18C、19A、19F、20、22F及23F。24價調配物含有1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。
可替代地,調配成促進生物素-抗生蛋白鏈菌素鏈結之脂質體由呈3:3:1:4:0.1莫耳比之DOPC/DOPG/DOGS-NTA-Ni/膽固醇/DSPE-PEG-生物素構成。如上文所描述使用抗生蛋白鏈菌素及生物素標記蛋白質或抗生蛋白鏈菌素接合之蛋白質裝配脂質體顆粒。進行此等培育達各種持續時間且使用EMSA檢定測定已結合蛋白質之溶離份之結合。對於利用替代性脂質體之後續研究,使用經使用30分鐘培育而裝配之顆粒。
電泳移動性變換檢定
在以下情況下執行EMSA實驗:使2.5 μg蛋白質與50 μg脂質體一起培育,隨後在施用50 V 90分鐘之情況下在0.75%瓊脂糖凝膠中進行電泳,且用具有指定激發及發射濾光片之IVIS Lumina II系統成像。對於EMSA血清穩定性測試,使3 μg蛋白質與含60 μg脂質體之40 μL PBS一起預培育。在24 h培育之後,添加40 μL胎牛血清(FBS,VWR # 82013-602)且再培育8 h。對於咪唑替換實驗,將1 μg報導蛋白與含20 μg脂質體之PBS結合。隨後滴定咪唑且用螢光法評估結合。對於血清穩定性,將1 μg報導蛋白與含20 μg脂質體之100 μL PBS結合,且隨後添加相等體積之FBS且用螢光法監測結合。用在使500 ng肽與20 μg脂質體一起培育之後進行淬滅之RGD-His FAM螢光團評估肽結合。
動物免疫接種及血清收集
遠親雜交6週齡之雄性及雌性CD-1小鼠用於免疫接種實驗。經由皮下注射(200 μL)使小鼠免疫。然而,在毒理學評估期間,使小鼠肌內免疫。用於調配之背景溶液為PBS (「假」陰性對照物為在無抗原組分之情況下投與之背景溶液)。最終蛋白質抗原濃度伴以以下濃度遞增:34、68及136 µg。當組合時,以68、136及272 µg之濃度投與GlpO及PncO。作為陽性對照物,亦用如先前所描述(REF)之PCV13或PPSV23使小鼠免疫。在免疫接種後第14天,用相同調配物追加小鼠。在免疫接種後第14天及第28天,經由後眼眶放血自小鼠收集血清樣本以用於抗體及OPA分析。
抗體效價及類別之量測
如先前所描述(Li, Y. 等人Science Advances 2
, doi:10.1126/sciadv.1600264 (2016))進行抗原抗體效價分析,且延伸該方法以包括20種來自相關血清型之多醣及GlpO及PncO蛋白質抗原。因此,將分析延伸至研究所使用之所有抗原。
標準
OPA
檢定
在先前協定(Romero-Steiner, S. 等人Clinical and Vaccine Immunology 13
, 165-169, doi:10.1128/CVI.13.2.165-169.2006)上延伸,用二甲基甲醯胺分化人類HL60細胞以定量曝露於自經免疫小鼠受試者收集之血清之稀釋以識別50%殺死端點(藉由CFU計數定量)之肺炎鏈球菌之抗體介導的調理吞噬及殺死。培育HL60細胞及肺炎球菌75 min。
經
BFR
修改之
OPA
檢定
修改標準OPA檢定以定量BFR肺炎鏈球菌之抗體介導之調理吞噬及殺死。此係藉由以下來進行:用BFR細菌置換浮游肺炎鏈球菌,隨後使其曝露於自經免疫小鼠受試者收集之血清之稀釋以識別50%殺死端點(藉由CFU計數定量)。培育HL60細胞及肺炎球菌75 min。
使用微生物群細菌進行之
OPA
檢定
使用上文所描述之標準OPA檢定,當曝露於自經GlpO免疫之小鼠受試者收集之血清之稀釋時,常在病原細菌(顯示於圖18A中)或肺炎鏈球菌EF303 (陽性對照物)之抗體介導的調理吞噬及殺死。進行此以識別50%殺死端點(藉由CFU計數定量)。培育HL60細胞及細菌細胞75 min。
肺炎球菌攻擊模型
(
BFR
肺炎、
IAV
肺炎
).
BFR肺炎:經由鼻內(伴以異氟醚)投與用1 × 106
(肺炎模式) CFU之肺炎球菌菌株攻擊小鼠。每四小時監測一次小鼠之發病跡象(蜷縮、亂毛、嗜睡及腹表面溫度)。經由CO2
窒息及頸椎脫位術使認為瀕死之小鼠安樂死。
IAV肺炎:為誘導拓殖,不伴以異氟醚使小鼠鼻內投與有1 × 106
CFU之滑鼠繼代之肺炎鏈球菌EF3030。為模仿流行性感冒誘導之肺炎,肺炎球菌拓殖之後用40空斑形成單位之IAV進行鼻內接種。使用滑鼠調適之IAV菌株A/PR/8/34 (H1N1) (ATCC VR-95),且藉由空斑檢定測定效價。每四小時監測一次小鼠之發病跡象(蜷縮、亂毛、嗜睡及腹表面溫度)。經由CO2
窒息及頸椎脫位術使認為瀕死之小鼠安樂死。
細菌負載評估
在預定時間點(在用於腹膜內及鼻內攻擊之感染之後相應地24及48小時)或在變得瀕死時,使小鼠安樂死(如先前所描述),且收集鼻咽組織、鼻咽灌洗流體、肺、肝、脾及血液樣本之組合且評估細菌負荷。均質化組織及器官樣本、灌洗流體及血液(在裝置10上30 s或直至完全均質化;Tissue-Tearor, BioSpec Products Inc.)以確保細菌聚集物之解離且隨後在計算之前在胰酶大豆及5%血液瓊脂板上連續稀釋。
免疫螢光法檢定
將來自經GlpO接種之小鼠之血清以1:10、1:100及1:1000之比率稀釋且在25℃下在96孔板中與用於研究之細菌菌株一起培育一小時以定量在每孔105
個細菌細胞之情況下之脫靶GlpO效應(表S4 (圖27))。隨後在25℃下用3%牛血清白蛋白阻斷該板1小時。在結合之後,藉由用PBS洗滌來移除未結合抗體且隨後在25℃下使細胞與與鹼性磷酸酶接合之二級抗體(抗滑鼠IgG)一起培育一小時。經由PBS洗滌移除未結合抗體且添加對硝苯磷酸以產生信號且使用0.75 M NaOH淬滅反應。使用在405 nm之吸光度下之板讀取器分光光度計檢測信號。
毒理學研究設計及實施
.
遠親雜交6週之雄性及雌性CD-1小鼠獲自Charles River。使小鼠肌內注射有LEPS(20V):CRM197或明礬:PncO,其中以初始劑量(34 µg)之1、5及10×調配CRM及PncO。在劑量投與之前及在劑量投與之後第二天,採集血液樣本以進行血液學評估。對於免疫接種之後兩週,監測小鼠之體重及行為變化。在免疫接種之後第14天經由CO2
窒息隨後經由頸椎脫位術處死小鼠,且收穫且稱重生命器官。
血液化學及細胞之血液學評估
.
遠親雜交6週之雄性及雌性CD-1小鼠獲自Charles River。使小鼠注射有LEPS(20V):CRM197或明礬:PncO,其中以初始劑量(12.5 µg)之1、5及10×投與CRM197及PncO。在免疫接種之前約6小時及在免疫接種之後第2天經由後眼眶放血收集血液樣本。根據製造商協定使血液樣本經受MASCOT血液學剖析(Drew Scientific)。
雖然本發明已經由各種實施例來描述,但常規修改應對熟習此項技術者顯而易見,且該等修改意欲在本發明之範疇內。
表 1 : 疫苗接種後之小鼠之體重及器官重量
表 1 : 疫苗接種後之小鼠之體重及器官重量
圖 1 .
相較於商用標準物而言之LEPS疫苗有效性。在第0及14天使小鼠接種有:1)含有來自肺炎鏈球菌血清型19F之莢膜多醣(CPS)之LEPS,2) Prevnar 13 (PCV13),3) Pneumovax 23 (PPSV23),4) PBS (假處理組),及5)各種對照物(單獨之CPS,CPS+CRM197,及空LEPS [EL]+CRM197)。在第14及28天收集血清。(A) LEPS、PCV13及PPSV23之抗體類別變換及(B)總IgG效價。(C)鼠類敗血症模式中之血清型19F之抗致死性攻擊保護。(D)使用調理吞噬活性(opsonophagocytic activity,OPA)檢定之選擇疫苗接種策略之功能性抗體活性評估。(E)在拓殖後第5天量測之未經免疫或經免疫之小鼠中評估之鼻咽細菌負荷。(F)在不存在(白)或存在(黑色) CD4+T細胞耗乏之情況下之小鼠血清中之在第28天(柱2)量測之19F CPS抗體效價。N.S.:不顯著。
圖 2 .
PncO及GlpO蛋白質抗原之免疫反應評估。(A)在初始(柱1;左條柱)及追加(柱2;右條柱)疫苗接種有明礬佐劑或空LEPS之後之小鼠血清中之抗PncO及抗GlpO抗體效價。(B)在追加疫苗接種之後之小鼠血清中之IgG1 (Th2對應;左條柱)及IgG2a (Th1對應;右條柱)效價;IgG1/IgG2a比率顯示於條柱上方。(C)在不存在(左條柱)或存在(右條柱) CD4+T細胞耗乏之情況下之小鼠血清中之抗PncO及抗GlpO抗體效價。(D)疫苗接種有PspA (常用肺炎球菌蛋白質抗原)(Li等人,Sci Adv 2
, e1600264 (2016))或在存在或不存在CD4+細胞耗乏之情況下之PncO+GlpO後之鼠類攻擊-保護敗血症模式;肺炎鏈球菌血清型19F為攻擊菌株且每種調配物使用四隻小鼠。(E)在PncO+GlpO疫苗接種之後之小鼠血清中之IFN-γ (Th1對應)及IL-17A (Th17對應)之效價。(F)在初始及追加疫苗接種之後之兔子血清中之抗PncO及抗GlpO抗體效價。
圖 3 .
特點在於跨越20種血清型之CPS囊封及GlpO及PncO之表面定位之完整LEPS平台的評估。(A)來自在疫苗接種之後之小鼠血清中之指定肺炎鏈球菌血清型之抗PncO (自左第一條柱)、GlpO (自左第二條柱)及經囊封CPS (剩餘條柱)的IgG效價。(B)使用拓殖模式及活體內擾動A型流行性感冒投與以促使肺炎發展之在Prevnar 13 (PCV13)、Pneumovax 23 (PPSV23)與完全LEPS系統(LEPS20:PncO&GlpO)之間的滑鼠攻擊-保護資料比較。當經指定血清型攻擊時跨越疫苗接種選項指定存活率,該等血清型由Prevnar 13 (19F)及Pneumovax (19F及11A)部分覆蓋且由LEPS20:PncO&GlpO完全覆蓋。(C)當經11A (左)及35C (右)血清型攻擊時來自IAV投與後第1及5天之鼻咽表面(NP)、鼻咽洗滌(灌洗)、肺及血液的細菌計數。
圖 4 .
1998年至2040年之兒童(年齡<5;A)及老年人(年齡≥65;B)中之侵入性肺炎球菌疾病(IPD)發病率。將IPD之總發病率劃分成由PCV7 (Prevnar 7)、PCV13 (Prevnar 13)、PPSV23 (Pneumovax)及非疫苗型(NVT)血清型所導致之疾病。NVT血清型定義為不含於PCV13 (A)或PPSV23 (B)疫苗內之彼等血清型。1998-2007年之PCV7血清型之發病率獲自由Pilishvili等人所公開之研究,(J Infect Dis 201
, 32-41 (2010))。總發病率及PCV13血清型之發病率獲自用於肺炎鏈球菌之CDC之活性細菌核心(Active Bacterial Core,ABC)監視程序(https://www.cdc.gov/abcs/reports-findings/survreports/spneu-types.html)。自先前數年中所觀測之趨勢中預測超過2007年(PCV7血清型)及2015年(PCV13血清型)之發病率。基於血清型侵襲性(Brueggemann等人,J Infect Dis 190
, 1203-1211 (2004); Sleeman等人,J Infect Dis 194
, 682-688 (2006))及在引入疫苗之後四年內發病率穩定化之情況下PCV7及PCV13之先前趨勢,預計在PCV15 (Prevnar 15)引入之後之總IPD之降低。預計在存在(點線)或不存在(實線) LEPS引入之情況下之IPD超過2030年。在引入LEPS之後在四年(A)內IPD降低80%或在10年(B)內IPD降低90%係基於GlpO及PncO蛋白質抗原之98%序列覆蓋度(Li等人,Proc Natl Acad Sci USA 113
, 6898-6903 (2016))及針對70種肺炎鏈球菌血清型證實之活性(圖6)。
圖 5 .
特點在於肺炎球菌疾病之常在病原疾病進展模式。(A)肺炎鏈球菌拓殖、生物膜建立、對毒性之環境刺激及生物膜釋放以及疾病症狀。(B)跨越現行疫苗選項之免疫靶標(Prevnar及Pneumovax;特異性血清型之莢膜多醣[CPS]靶向)及LEPS平台(解決當前所覆蓋之疫苗血清型之拓殖及非疫苗型[NVT]血清型之生物膜釋放)。
圖 6 .
LEPS平台。(A)糖結合物疫苗(例如Prevnar族)與LEPS之示意性比較。(B)用以生成LEPS顆粒之調配程序之示意性圖示。
圖 7 .
LEPS表徵。多醣(PS)囊封效率(A;實心正方形)或蛋白質表面結合效率(B;實心圓形)對初始濃度。顆粒表面電荷評價(C)及尺寸分佈(D)。(E)藉由穿透電子顯微術之LEPS顆粒影像;1:LEPS表面;2:PS經囊封脂質體;3:LEPS。
圖
8.當經跨越現行Prevnar 7 (PCV7)及13 (PCV13)治療選項之血清型攻擊時LEPS免疫之保護性能力。在敗血症模式中評價經含有20種多醣(亦即LEPS20)之LEPS調配物免疫之小鼠,且基於包括於相應的糖結合物疫苗中將攻擊菌株(x軸)分組成多個類別。特定言之,「PCV7」標記物包括由Prevnar 7及Prevnar 13覆蓋之細菌血清型;然而,「PCV13-獨特」分組展示由Prevnar 13覆蓋之六種額外的血清型。「非疫苗類型」標記物對應於不包括於商用糖結合物疫苗中之血清型。
圖
9.兔子中之LEPS疫苗策略。新西蘭白兔經含有肺炎鏈球菌血清型19F CPS之LEPS顆粒免疫(第0天)且追加(第14天)且分析末梢血液樣本之(A)在第14天(柱1;左條柱)及第28天(柱2;右條柱)之總IgG效價及經由OPA檢定之(B)抗血清型19F之功能性抗體活性(柱2樣本)。
圖
10.針對特異性肺炎鏈球菌細胞類型之GlpO及PncO之OPA檢定。(A)由來自經Prevnar 13 (PCV13)、具有明礬佐劑之GlpO+PncO及具有空LEPS之GlpO+PncO免疫之小鼠的血清介導的浮游性(左)及生物膜釋放(BFR)(右)血清型19F細菌的OPA。(B)浮游細菌、BFR細菌及經LL-37處理以移除CPS之浮游細菌之丸粒(左)及上澄液(右)中之莢膜多醣(CPS)含量;「莢膜%」值與各子圖中之浮游樣本有關。
圖
11.共同投與(共投與)或作為具有Prevnar 7 (PCV7)之追加物(附加物)投與之GlpO及PncO之免疫原性的評價。(A)針對PncO、GlpO及由顏色編碼之疫苗接種樣本產生之特異性血清型的IgG效價。(B)在GlpO及PncO (PG)共同投與或作為具有Prevnar 7之追加物投與時之滑鼠保護(左;敗血症攻擊模型)及細菌負荷(右;拓殖後第5天所量測)。使小鼠經血清型19F (由Prevnar 7及Prevnar 13 [PCV13]覆蓋)或1 (不由Prevnar 7覆蓋但由Prevnar 13覆蓋)攻擊。
圖 12 .
當使用具有血清型19F之鼠類IAV誘導之肺炎模式時LEPS20:PncO&GlpO之額外的評估。來自IAV投與後第1及5天之鼻咽表面(NP)、鼻咽洗滌(灌洗)、肺及血液之細菌計數。Prevnar 13 (PCV13);Pneumovax 23 (PPSV23)。
圖 13 .
LEPS20:PncO&GlpO之額外的鼠類疾病模式評估。Prevnar 13 (PCV13)、Pneumovax 23 (PPSV23)與使用(A)敗血症及(B)肺炎疾病模式之完全LEPS系統之間之滑鼠攻擊-保護資料比較。當經指定血清型攻擊時跨越疫苗接種選項指定存活率(動物數目加框),該等血清型由Prevnar 13 (19F)及Pneumovax (19F及11A)部分覆蓋且由LEPS20:PncO&GlpO完全覆蓋。
圖 14 .
鼠類攻擊-保護檢定內之替代性LEPS調配程序及比較。將來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V及14之多醣在脂質體製備期間混合及共調配,或在脂質體顆粒內單獨地調配,隨後在滑鼠疫苗接種之前組合該等脂質體顆粒。隨後使用敗血症疾病模式以用單獨的血清型攻擊小鼠受試者(x軸)。
圖 15
(表S1)。Prevnar 13 (PCV13)、Pneumovax 23 (PPSV23)與含有20種多醣(亦即20價[20V])之LEPS調配物之間之OPA比較。值表示OPA檢定中發生之50%細胞殺死之時的血清稀釋度。虛線表明非疫苗血清型;對於特定多醣,更高之OPA讀數係歸因於更強之抗體反應(亦即更高之效價)。
圖 16
(表S2)。Prevnar 13 (PCV13)、Pneumovax 23 (PPSV23)與PncO+GlpO蛋白質抗原(投與有明礬佐劑)之間之OPA比較。值表示OPA檢定中發生之50%細胞殺死之時的血清稀釋度。虛線表明非疫苗血清型;對於彼特定多醣,更高之OPA讀數係歸因於更強之抗體反應(亦即更高之效價)。用於OPA檢定中之血清型特異性肺炎鏈球菌菌株包括與初始拓殖(浮游)及疾病(亦即生物膜釋放之[BFR])相關聯之細胞表現型。
圖 17
(表S3)。GlpO及PncO彙總。
圖 18
:經 GlpO 之疫苗接種證實潛在性脫靶免疫原性之風險。 A )
各相應之細菌物種相對於假疫苗接種而言之歸一化螢光強度(例如一者之假疫苗接種讀數表示用於各細菌之不同的絕對螢光讀數);加框數目表示與GlpO之所預測之蛋白質抗原決定基共享的同源性。B )
FREF3030、無乳鏈球菌、唾液乳桿菌、胚芽乳桿菌
及乳酸片球菌
之OPA檢定結果。虛線表示50%細菌殺死。誤差杠表示四個技術複製品之標準差。
圖 19
:BFR 肺炎攻擊模型中之至死亡之時間
。所測試之血清型包括6C (A)、35B (B)、15C (C)、16F (D)、23A (E)及9N (F)。使四隻CD-1小鼠接種有假對照物即具有CRM197、GlpO、PncO之PCV13、PPSV23及LEPS (20V)或GlpO+PncO。劑量表示各蛋白質之微克數(34、68或136 µg)。
圖 20
:LEPS ( 20V ): PncO 劑量遞增研究中之蛋白質 ( 黑色 ) 及 CPS ( 藍色 ) 抗原之相對抗體效價。
使CD-1小鼠皮下接種有在34 (A)、68 (B)及136 μg (C) PncO下之LEPS(20V):PncO。誤差杠表示四個生物複製品之標準差。
圖 21
:用於 PncO 劑量遞增之 IAV 肺炎攻擊。 A )
各種生理位置(鼻咽、鼻咽灌洗、肺及血液)中之細菌負載。B )
跨越生理位置之相對於17 μg劑量而言之對細菌負荷之效應疫苗接種。PncO劑量包括17 (紅色)、34 (藍色)、68 (綠色)及136 μg (橙色)以及假對照物(黑色)。
圖 22
:用以包括 10A 、 11A 、 15B 、 33F CPS 之 LEPS 疫苗之擴充。 A )
第1次給藥後(左條柱)及第2次給藥後(右條柱)之各CPS之相對抗體效價。B )
由IgG、IgM、IgA及IgE疫苗接種後劃分之CPS抗體庫之組成。C )
由假處理組、PCV13, PPSV23, LEPS(24V):PncO及LEPS(24V)CRM197產生之包括於LEPS中之24 CPS (24V)調配物之相對抗體效價。誤差杠表示四個生物複製品之標準差。
圖 23
:替代性蛋白質 - 脂質體
附接策略之表徵。 A )
如藉由使用Co-PoP、Ni-NTA、Co-NTA、BSB及BS脂質體進行之EMSA檢定所量測之結合至脂質體之蛋白質的溶離份。進行培育10、20、30或60分鐘。誤差杠表示三個技術複製品之標準差。B )
由IgG、IgM、IgA及IgE疫苗接種後劃分之CPS抗體庫之組成。C )
在第一次(左行)及第二次(右行)投與之後之相對於PCV13及PPSV23而言之替代性蛋白質-脂質體附接調配物的相對抗體效價。誤差杠表示四個生物複製品之標準差。D )
使用替代性蛋白質-脂質體附接調配物進行之OPA檢定;虛線表示50%細菌殺死。疫苗接種包括假處理組、PCV13、PPSV23以及Ni-NTA、Co-NTA、BSB及BS脂質體。誤差杠表示四個技術複製品之標準差。
圖 24
:免疫螢光法檢定結果與具有GlpO之細菌同源性之間之相關性。點線表示95%信賴區間。
圖 25
:GlpO劑量遞增抗體效價。接種有含34 (a)、68 (b)或136 (c) μg蛋白質之LEPS(20V):GlpO調配物之小鼠中之蛋白質(黑色)及CPS (藍色)抗體的濃度。
圖 26
:GlpO+PncO劑量遞增抗體效價。接種有含34 (a)、68 (b)、136 (c)或272 (d) μg總蛋白質之LEPS(20V):GlpO+PncO調配物之小鼠中之蛋白質(黑色)及CPS (藍色)抗體的濃度。
圖 27
(表S4):具有有各種蛋白質區域之同源性百分比的GlpO同源物的細菌,該等同源物包括用於交叉反應而測試之彼等。
圖 28
(表S5):CD-1小鼠之血液中之代謝物的濃度。
圖 29
(表S6):CD-1小鼠中之白血球之血液學評估。
圖 30
(表S7):用於LEPS(20V):PncO劑量遞增之50%殺死稀釋度之變化百分比。
圖 31
(表S8):用於LEPS(20V):PncO劑量遞增之抗體效價之變化百分比。
圖 32
(表S9):用於LEPS(20V):PncO劑量遞增之完全OPA資料。
圖 33
(表S10):用於LEPS(20V):GlpO+PncO劑量遞增之完全OPA資料。
圖 34
(表S11):LEPS(24V):PncOCPSOPA效價。
圖 35
(表S12):用於NVT血清型之第1輪研究之CPSOPA資料。
Claims (20)
- 一種包含脂質體之疫苗組合物,其中該組合物中至少一些脂質體囊封來自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )之一或多種血清型之莢膜多醣,且具有經由非共價附接而附接表面之一或多種蛋白質,從而使得該蛋白質之至少某一部分展現於該等脂質體之外部之表面上。
- 一種包含複數組脂質體之疫苗組合物,其中一組內之各脂質體囊封相同血清型,此血清型不同於其他組之血清型,且其中該組合物中至少一些脂質體具有經由非共價附接而附接表面之一或多種蛋白質,從而使得該蛋白質之至少某一部分展現於該等脂質體之外部之表面上。
- 如請求項1或2之疫苗組合物,其中該等血清型選自由以下組成之群:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。
- 如請求項1或2之疫苗組合物,其中該等血清型選自由以下組成之群:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、17F、18C、19A、19F、20、22F及23F。
- 如請求項1之疫苗組合物,其中至少複數種脂質體囊封第一類型之莢膜多醣,且至少複數種脂質體囊封第二類型之莢膜多醣。
- 如請求項1或2之疫苗組合物,其中該蛋白質為CRM197。
- 如請求項1或2之疫苗組合物,其中該蛋白質為PnCo。
- 如請求項7之疫苗組合物,其中PncO為非共價附接該脂質體之唯一蛋白質。
- 如請求項7之疫苗組合物,其中PncO經由抗生蛋白鏈菌素-生物素鏈結附接該脂質體。
- 如請求項1或2之疫苗組合物,其中該蛋白質包含聚組胺酸標籤且該蛋白質經由存在於該脂質體雙層中之金屬非共價附接該脂質體。
- 一種使個體對抗肺炎鏈球菌之免疫方法,其包含向該個體投與如請求項1之疫苗組合物。
- 如請求項11之方法,其中該疫苗組合物包含複數組脂質體,每一組脂質體囊封相同類型之血清型,該血清型不同於另一組脂質體中囊封之血清型,其中該組合物中至少一些脂質體具有經由非共價附接而附接表面之一或多種蛋白質,從而使得該蛋白質之至少某一部分展現於該等脂質體之外部之表面上。
- 如請求項12之方法,其中該組合物包含至少20組脂質體且20組脂質體共同囊封以下血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、17F、18C、19A、19F、20、22F及23F。
- 如請求項12之方法,其中該組合物包含至少24組脂質體且24組脂質體共同囊封以下血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。
- 如請求項11至14中任一項之方法,其中該蛋白質為CRM197。
- 如請求項11至14中任一項之方法,其中該蛋白質為PncO。
- 如請求項16之方法,其中該PncO經由抗生蛋白鏈菌素-生物素鏈結而非共價附接該脂質體。
- 一種製造如請求項2之疫苗組合物之方法,其包含分別製備複數組脂質體,各組中之脂質體囊封獨特的莢膜多醣,隨後混合該複數組脂質體以獲得該疫苗組合物,及進一步包含將蛋白質非共價附接至少一些脂質體之表面,使得該蛋白質之至少一部分曝露於該等脂質體之外部。
- 如請求項18之方法,其中至少一些組之脂質體囊封選自由肺炎鏈球菌之以下血清型組成之群之莢膜多醣:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。
- 如請求項18或19之方法,其中該蛋白質為CRM197或PncO。
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