DK149631B - Fremgangsmaade til fremstilling af h-sar-lys-sar-gln-nh2 - Google Patents

Description

U9631

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af tetrapeptidamidet H-SAR-LYS-SAR-GLN-Nh^.

Beskrivelsen til USA-patentansøgning nr. 960.550, indleveret d. 17. november 1978 med benævnelsen "New Tetrapeptides and Me-05 thods" omhandler en gruppe af peptider, der kan anvendes inden for thymus-funktionelle og immunologiske områder. En af de foretrukne forbindelser inden for denne gruppe har formlen H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2. I den nævnte ansøgning blev gruppen af tetrapeptider fremstillet ved fastfase-synteseteknik, der i almindelighed beskrives 10 som "Merrifield-syntese". Det var også omtalt, at klassiske metoder (dvs. opløsnings-synteseteknik) kunne anvendes til fremstilling af denne gruppe af tetrapeptider. Der var ikke beskrevet nogen specifik klassisk metode eller synteseve].

Mens fastfase-syntesemetoden ifølge Merrifield er bekvem til 15 fremstilling af små mængder peptider i laboratorie-målestok, er den upraktisk og i almindelighed uøkonomisk til fremstilling af store mængder (fx. mere end ca. 100 g) peptid, hvor opiøsnings-syntese-teknikken er mere hensigtsmæssig. Endvidere er opløsnings-syntese-metoder i almindelighed langt mindre kostbare end fastfase-metoder 20 som følge af de mindre mængder reagenser, som er nødvendige og p.g.a de langt mindre enheds-omkostninger for visse af de anvendte reagenser. Der er nu fundet en bestemt opløsningssyntesemetode, som bekvemt og på økonomisk fordelagtig måde giver det ønskede tetrapeptidamid.

25 Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af tetrapeptidamidet H-SAR-LYS-SAR-GLN-NHg og er ejendommelig ved, at man a) danner fragment I, som består af Z-SAR-e-Z'-LYS-OH, ved i) aktivering af sarcosin, hvis aminogruppe er beskyttet 30 med en beskyttende gruppe Z, med hensyn til nukleo- filt angreb på carboxygruppen med en amin, til dannelse af et carboxy-aktiveret beskyttet sarcosinderi-vat, og ii) omsætning af det carboxy-aktiverede beskyttede 35 sarcosinderivat med L-lysin, hvis ε-aminogruppe er beskyttet med en beskyttende gruppe Z‘, hvorved fragment I dannes, 2 149631 b) danner fragment II, som bestir af H-SAR-GLN-Nl·^, ved i) fremstilling af Z"-GLN-NH2, ii) fjernelse af den beskyttende gruppe fra Z"-GLN-NH2 til dannelse af ubeskyttet L-glutaminamid, 05 iii) omsætning af det ubeskyttede L-glutaminamid enten med et som angivet i trin a (i) fremstillet carboxy-aktiveret beskyttet sarcosinderivat eller med et sarco-sin-N-carboxyanhydrid, og

iv) om nødvendigt fjernelse af den beskyttende gruppe 10 fra den dannede forbindelse, hvorved fragment II

dannes, c) forbinder fragment I og fragment II med hinanden til dannelse af det beskyttede tetrapeptid Z-SAR-s-Z'-LYS-SAR- gln-nh2, 15 d) fjerner de beskyttende grupper fra det beskyttede tetra peptid, og e) isolerer og renser det resulterende tetrapeptid H-SAR-LYS- sar-gln-nh2, idet Z, Z1 og Z" hver er udvalgt fra gruppen bestående af:

20 O

II

a) R^-OC-, hvor? R^ betegner phenyl, toly I, xylyf, adamantyl, allyl, β-cyanoethy!, fluorenylmethyl, benzyl, benzyl, hvori phenylringen er subsitueret med fra 1-3 substituenter udvalgt blandt halogen, nitro, C^_g-alkyl og C^_g-alkoxy, 25 eller betegner diisopropylmethyl, diphenylmethyl, cyclohex- yl, cyclopentyl, vinyl, t-butyl, t-amyl, dimethyitrifluor- methylmethyl eller dimethylbiphenylmethyl,

O

li b) R2C-, hvori Rg betegner Cg^-alkyl eller C^_^-alkyl sub- 30 stitueret med fra 1-5 halogengrupper,

X

II

c) RgO-P-, hvori X betegner S eller O og R^ og R4 hver be- °r4 tegner benzyl eller C^g-alkyl, 35 d) ,'^5 hvori Rg og Rg hver for sig betegner C«j_g- / /p" alkyl eller tilsammen betyder -CJ-L-C-CI-L·-,

• Ri ^ R

‘ \ K7 K8

C=0 v I

'*6 3 149631 hvori Ry og Rg hver for sig betegner hydrogen 0 eller CL g-alkyl, og

VvA

e) L II hvori Rg betegner hydrogen, methyl, halogen 05 jj1 eller nitro,

O

forudsat, at Z er monodentat.

Fremgangsmåden omfatter således: a) dannelse af fragment I, som består af Z-SAR-eZ'-LYS-OH 10 b) dannelse af fragment II, som består af H-SAR-GLN-NHg c) forbindelse af fragment I og fragment II med hinanden til dannelse af det beskyttede tetrapeptid, d) fjernelse af de beskyttende grupper Z og Z', og e) isolering og rensning af det resulterende tetrapeptid.

15 De beskyttende grupper Z og Z‘ kan være ens eller forskellige og bør være stabile mod fjernelse ved de til sammenbinding af amino-syregrupperne anvendte trin samtidig med, at de let skal kunne fjernes ved afslutningen af de forbindende trin under betingelser, som ikke vil spalte nogen af peptidets amid-bindinger. Den beskyttende 20 gruppe Z" kan være den samme som grupperne Z og Z' eller forskellig herfra og bør let kunne fjernes under betingelser, som ikke vil ødelægge L-glutaminamidet samtidig med, at den skal være stabil under amideringen af glutaminen eller glutaminsyren, i afhængighed af den til fremstilling af det beskyttede L-glutaminamid anvendte præpa-25 rative vej.

Den amino-beskyttende gruppe e), som er bidentat, kan alene anvendes for ε-aminogruppen i L-lysin og α-aminogruppen i L-glutamin, men ikke for α-aminogruppen i sarcosin. Den amino-beskyttende gruppe på sarcosinets α-amino skal være monodentat p.g.a. methylsubsti-30 tuenten på denne aminogruppe. De øvrige amino-beskyttende grupper kan anvendes på alle aminosyrer.

Som her anvendt, omfatter "halogen" fluor, chlor, brom og iod, men chlor og brom foretrækkes. Udtrykkene "C1_g-alkyl" og "C^g-alkoxy" omfatter hhv. mættede alifatiske carbonhydrider med 1-6 35 carbonatomer såsom methyl, ethyl, isopropyl, t-butyl, n-hexyl o.I.

og de tilsvarende alkoxygrupper såsom methoxy, ethoxy, isopropoxy, t-butoxy, n-hexoxy o.I. Methyl er den foretrukne alkyl og methoxy den foretrukne alkoxy.

149631 4

De til indføring af disse beskyttende grupper anvendte reagenser {sædvanligvis de tilsvarende syrechlorider, selvom andre derivater kan anvendes), omtales undertiden her som "beskyttelsesgruppereagenser" .

05 Det foretrækkes, at Z og Z' er ens, og at de er benzyloxycarb- onyl (CBZ) eller trifluoracetyl (TFA). I en yderligere foretrukket udførelsesform er Z, Z' og Z" alle ens, og de er enten CBZ eller TFA.

En lang række forskellige reagenser kan anvendes til fremstilling af det ovenfor beskrevne carboxy-aktiverede beskyttede sarcosin.

10 En type carboxy-aktiveret beskyttet sarcosin er en reaktiv ester.

Eksempler på midler, som kan anvendes til fremstilling af egnede aktive estere af sarcosin er phenol, phenol, hvori phenyl ringen er subsitueret med 1-5 substituenter udvalgt blandt halogen, (fx. chlor eller fluor), nitro, cyano og methoxy, thiophenyl, N-hydroxyphthali-15 mid, N-hydroxysuccinimid, N-hydroxyglutarimid, N-hydroxybenzamid, 1-hydroxytriazol o.I. Andre egnede midler er fx. omhandlet i "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W. McOmie, ed., Plenum Press, N.Y. 1973. De nedenfor givne udførelseseksempler anvender N-hydroxysuccinimid.

20 Andre aktiveringsmidler såsom den blandede eller symmetriske anhydrid-metode, syrechlorid-metoden og azid-metoden er velkendte inden for denne teknik og beskrevet i fx. Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", 2. udgave, 1976, pp 85-128.

Som alternativ i trin iii) og iv) ved fremstillingen af fragment 25 II kan ifølge opfindelsen et N-carboxyanhydrid af sarcosin anvendes i stedet for det carboxy-aktiverede beskyttede sarcosin. Fremstillingen af N-carboxyanhydrider er i almindelighed beskrevet pi side 97 ff. i den ovenfor omtalte bog af Bodanszky et al. Dette cykliske sarcosin-anhydrid er fordelagtigt til fremstilling af fragment II, da 30 der som følge af dets natur ikke kræves en beskyttende gruppe på sarcosin-aminogruppen. Det er således ikke nødvendigt at fjerne den beskyttende gruppe og trin iv) kan elimineres.

Selvom de beskyttende grupper fortrinsvis fjernes fra det beskyttede tetrapeptid og Z"-GLN-NH2-mellemproduktet ved hjælp af 35 katalytisk hydrogenering, er det også tanken, at andre velkendte metoder kan anvendes. Sådanne metoder er beskrevet på side 18-84 i den ovenfor omtalte bog af Bodanszky, et al. samt i den ovenfor 5 149631 omtalte bog af McOmie. Eksempler på disse metoder er behandling med trifluoreddikesyre eller andre milde syrer, reduktion med zink i nærværelse af 50% vandig eddikesyre, behandling med hydrogenchlo-rid eller andre stærke syrer samt behandling med stærk eller mild 05 base, alt afhængigt af identiteten af gruppen eller grupperne, der skal fjernes og de øvrige tilstedeværende reaktive grupper.

Produktet af den omhandlede fremgangsmåde renses efter fjernelsen af de beskyttende grupper.

Mens komplicerede rensningsskemaer, der anvender successiv 10 eluering og om krystal I isation, er typiske ved rensning af opløsningssyntetiserede peptider, har det overraskende vist sig, at det omhandlede opløsnings-syntetiserede tetrapeptid let kan renses ved en enkelt eluering på silikagel-kromatograferingskolonne under anvendelse af en eluent omfattende en alifatisk alkohol, en lavere alkansyre 15 og vand. Den alifatiske alkohol kan fx. være isobutanol, n-butanol, isopropanol, amylalkohol, isoamy lal kohol eller lignende, mens den lavere alkansyre kan være myresyre, eddikesyre, propionsyre eller en lignende syre. Ét elueringsmiddel, som har vist sig at fungere godt, er n-butanol: eddikesyre:vand i et forhold på 10:2:5.

20 Den omhandlede fremgangsmåde er i sit bredeste aspekt vist skematisk i nedenstående skema I:

FRAGMENT I FRAGMENT XI

SAR LYS SAR GLN

25 Z--Z"--nh2 Z--z, Z--OA--NH2 Z--OA -'v- Z---MH2 Z--:-^7—---NH2 z-------NH_ 30 -----nh2 6 149631 cosin dannes et vandopløseligt basisk additionssalt af sarcosin, som opløses i vand. Hensigtsmæssigt kan dette basiske additionssalt dannes ved opløsning af sarcosin i et lille molært overskud af natriumhydroxid. Til denne opløsning sættes dernæst samtidigt et lille over-05 skud af et reagens til indføring af den beskyttende gruppe Z (fx. det tilsvarende syrechlorid såsom benzyloxycarbonylchiorid) og en opløsning af base (fx. natriumhydroxid) til omsætning med syren (fx. HCI), som dannes under reaktionen. Det beskyttelsesgruppeadderende reagens kan være i opløsning eller på ren form og er for-10 trinsvis syrechloridet. Efter endt reaktion fjernes overskydende beskyttelsesgruppe-adderende reagens (fx. ved ekstraktion med diethyl-ether eller ethvert organisk opløsningsmiddel, som er ublandbart med vand), hvorefter det beskyttede sarcosin isoleres fra uomsat sarcosin ved behandling med syre (fx. saltsyre). Syrebehandlingen 15 omdanner det basiske additionssalt af det ubeskyttede sarcosin til et syreadditionssalt af det ubeskyttede sarcosin, hvilket salt er opløse-' ligt i vand. Imidlertid omdanner syrebehandlingen kun det basiske additionssalt af beskyttet sarcosin til beskyttet sarcosin, eftersom der ikke kan dannes et syreadditionssalt p.g.a. den beskyttede ami-20 nogruppe. Dette beskyttede sarcosin, som er uopløseligt i vand, kan let adskilles fra saltet af det ubeskyttede sarcosin, fx. ved ekstraktion med et ublandbart organisk opløsningsmiddel, som beskrevet ovenfor. Som her anvendt, omfatter udtrykket "ublandbart organisk opløsningsmiddel" alle sædvanlige organiske opløsningsmidler fra iabo-25 ratoriet, som ikke er blandbare med vand som fx. diethylether, ethylacetat, benzen, toluen, xylen o.I. Det foretrukne beskyttede sarcosin, N-benzyloxycarbonyl-sarcosin, er en kendt forbindelse.

En fremgangsmåde til fremstilling deraf er vist af R.S. Tipton og B.A. Pawson, J. Org. Chem., 26, 4698 (1961), og forbindelsen er 30 kommercielt tilgængelig fra Bachem, Inc., Torrance, CA.

Som forberedelse til kondensationen af dette beskyttede sarcosin med et beskyttet L-lysin-molekyle til dannelse af fragment I aktiveres det aminobeskyttede sarcosin på en eller anden måde for at fremme dannelsen af bindingen. Selvom den foretrukne måde til ud-35 førelse af denne aktivering består i dannelse af en "aktiv ester", er det tanken, at også andre fra teknikken kendte aktiveringsmetoder kan anvendes såsom den blandede eller symmetriske anhydridmetode, azidmetoden eller syrechloridmetoden.

7 149631

Det er hensigten, at enhver aktiv ester af det beskyttede sar-cosin kan anvendes, og en foretrukket aktiv ester er den, som dannes med hydroxysuccinimid. Den aktive ester af det beskyttede sarcosin fremstilles ved omsætning af ækvivalente mængder af det beskyttede 05 sarcosin og et aktivester-reagens i opløsning i et egnet organisk opløsningsmiddel som fx. tetrahydrofuran, dioxan, dimethylformamid, pyridin eller lignende. Til denne opløsning sættes dernæst en ækvivalent mængde af et koblingsmiddel, typisk dicyclohexylcarbodiimid.

Selvom andre koblingsmidler er effektive, er dicyclohexylcarbodiimid 10 særlig anvendelig, fordi biproduktet fra denne koblingsreaktion er meget uopløseligt i den anvendte gruppe af opløsningsmidler og derfor let kan fjernes ved filtrering, således at det koblede produkt bliver tilbage i opløsning.

L-lysin, som er beskyttet på epsilon-aminogruppen, er kommer-15 cielt tilgængeligt (fx. fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) eller kan let fremstilles med en beskyttende gruppe (Z1)/ som opfylder de ovenfor angivne kriterier.

Det sidste trin ved fremstillingen af fragment I kan f.eks. bestå i omsætning af et lille overskud af det beskyttede L-lysin med 20 den beskyttede sarcosin-aktivester i nærværelse af to ækvivalenter af et saltdannende materiale såsom en organisk tertiær amin. Selvom enhver organisk tertiær amin kan anvendes, har det vist sig, at tri-ethylamin fungerer godt. Opløsningsmidlet er ethvert egnet organisk opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor. Selvom et ækvivalent af den 25 saltdannende tertiære amin beskytter carboxylgruppen på det epsilon-aminobeskyttede L-lysin, er det tanken, at også andre beskyttende gruppen på denne carboxylgruppe kan anvendes i stedet for en af de ovenfor omtalte ækvivalenter. De uomsatte aminosyrer fjernes ved behandling af reaktionsblandingen med syre (fx. saltsyre) og adskil-30 lelse ved ekstraktion med et ublandbart organisk opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor.

Eksempler på egnede carboxylbeskyttende grupper er benzyl og benzyl, hvori phenylgruppen er substitueret med fra 1-3 substi-tuenter i form af halogen (fx. chlor eller brom), nitro, lavere alkoxy 35 (fx. methoxy) eller lavere alkyl (fx. methyl). Der henvises til ovennævnte tekst af McOmie for yderligere beskrivelse af sådanne grupper.

1A9631 8

Fremstillingen af fragment il begynder med syntesen af beskyttet L-glutaminamid, som kan opnås ved en af flere præparative metoder ud fra enten L-glutamin eller L-glutaminsyre. Den foretrukne fremgangsmåde består i at esterificere begge carboxylgrupper på L-gluta-05 minsyre under anvendelse af en lavere alkanol efterfulgt af behandling med det ovenfor beskrevne aminogruppe-beskyttende reagens til beskyttelse af α-aminogruppen på L-glutaminsyrediesteren. Omsætning af denne beskyttede L-glutaminsyrediester med ammoniak giver det beskyttede L-glutaminamid. Denne fremgangsmåde er beskrevet i 10 J. Bio!. Chem., 165, 333 (1946). I en variant af denne fremgangsmåde kan or-aminogruppen på L-glutaminsyre beskyttes før esterifice-ringsreaktionen. En alternativ fremgangsmåde, som er hidtil ukendt, begynder med L-glutamin og beskytter dennes α-aminogruppe som omtalt ovenfor. Den beskyttede L-glutamin omdannes dernæst til det 15 beskyttede L-glutaminamid, fx. ved dannelse af en aktiv ester efterfulgt af behandling med ammoniak i en lavere alkanol (fx. methylalkohol).

Når dette beskyttede L-glutaminamid er dannet, fjernes den beskyttende gruppe fra α-aminogruppen og det ubeskyttede L-gluta-20 minamid omsættes f.eks. med α-amino-beskyttet sarcosin, som er blevet aktiveret (fx. ved omdannelse til en aktiv ester) som diskuteret ovenfor. Afbeskyttelsen af L-glutaminamidet udføres fortrinsvis ved omsætning med hydrogen i nærværelse af en palladium-på-carbon katalysator i et egnet reducerende opløsningsmiddel såsom dimethylfor-25 mamid, eddikesyre, en lavere alkanol (fx. methanol) eller lignende. Omsætningen af det resulterende afbeskyttede L-glutaminamid med den beskyttede sarcosin-aktivester udføres også fortrinsvis i det samme opløsningsmiddel, fortrinsvis methanol. Anvendelsen af denne særlige afbeskyttelsesmåde og dette opløsningsmiddel resulterer i 30 særlige fordele, eftersom både det beskyttede L-glutaminamid og det resulterende beskyttede sarcosin-L-glutaminamid er uopløselige i methylal kohol, mens det afbeskyttede L-glutaminamid er temmelig opløseligt i methylal kohol. Som følge deraf kan det afbeskyttede L-glutaminamid, som er uomsat, let fjernes ved filtrering, ligesom det re-35 suiterende produkt kan, og der opnås et fremragende udbytte ved dette trin.

9 149631

Fjernelse af den beskyttende gruppe fra dette beskyttede dipeptid, hensigtsmæssigt ved behandling med hydrogen og pailadium-på-carbon i et egnet reducerende opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor (fortrinsvis dimethylformamid), giver fragment II.

05 Fragment I og II sammenbindes til dannelse af det beskyttede tetrapeptid Z-SAR-e-Z'-LYS-SAR-GLN-Nh^ f.eks. ved omsætning af ækvivalente mængder i et passende aprot opløsningsmiddel såsom dimethylformamid i nærværelse af et lille overskud af et koblingsmiddel såsom dicyclohexylcarbodiimid. Det foretrækkes endvidere at udføre 10 denne omsætning i nærværelse af et materiale, som minimerer race-micering omkring carboxylgruppen på L-lysindelen af fragment I og forøger reaktionshastigheden, som fx. 1-hydroxybenzotriazol. De beskyttende grupper på det resulterende tetrapeptidamid fjernes dernæst, fortrinsvis ved behandling med hydrogengas, i nærværelse af 15 en palladium-pa-carbon katalysator i et egnet reducerende opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor (fortrinsvis vandig eddikesyre). Hydrogengassen behøver ikke at være under et højere tryk end én atmosfære, idet dog anvendelsen af tryk er hensigtsmæssig, da det accelererer reduktionshastigheden.

20 Isoleringen og rensningen af det resulterende urene produkt kan udføres ved en kombination af krystallisering og ionbytningskromatografi (fortrinsvis under anvendelse af ammoniumacetat-pH5 som elueringsmiddel) under anvendelse af tyndtlagskromatografi til bestemmelse af identiteten af materialerne i hver fraktion.

25 En foretrukken udførelsesform af den omhandlede fremgangsmåde er vist i efterfølgende skema 2:

FRAGMENT I FRAGMENT II

SAR LYS SAR GLN

30 CBZ--CBZ--NH2

HOSu;DCC H_; Pd/C

CBZ--CBZ--OSu —--NH2

HOSu;DCC CBZ

CBZ--OSU -i- CBZ-----NH_

CBZ H-jPd/C

CBZ--------NH2

CBZ HOBT;DCC

35 CBZ--L---NH_

H~;Pd/C

—I-Li-^-L_^h2 10 149631 I skema 2 ovenfor har forkortelserne følgende betydninger: CBZ: benzyloxycarbonyl DCC: dicyclohexylcarbodiimid 05 HOSu: hydroxysuccinimid OSu: oxysuccinimid

Pd/C: palladium-på-carbon H2· hydrogen HOBT: 1-hydroxybenzotriazol 10

Denne foretrukne udførelsesform er nærmere beskrevet I de følgende udførelseseksempler.

Eksempel 1

15 Fremstilling af fragment I: CBZ-SAR-e-CBZ-LYS-OH

A. Syntese af N-benzyloxycarbonyl-sarcosin (CBZ-SAR-OH)

Dette materiale fremstilledes ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge R.S. Tipton og B.A. Pawson (J. Org. Chem., 26, 4648 (1961)).

20 Sarcosin (8,90 g, 1,0 mol) opløstes i 500 ml 2 N natriumhydroxid med afkøling på et isbad. Samtidig tilsattes 550 ml 2 N natriumhydroxid og benzylchiorformiat (196 g (95%), 1,095 mol) over et tidsrum af 1 time med kraftig omrøring. Den resulterende reaktionsblanding omrørtes i ca. 18 timer ved omgivelsernes temperatur, hvorefter den 25 ekstraheredes med tre 250 ml portioner diethylether. Ethylacetat (500 mi) tilsattes dernæst til den vandige fase efterfulgt af forsigtig tilsætning af 200 ml koncentreret saltsyre. Det organiske fag fraskiltes, vaskedes med to 500 ml portioner vand efterfulgt af 300 ml mættet natriumchloridopløsning og tørredes over vandfri magnesiumsulfat.

30 Afdampning af opløsningsmidlet under reduceret tryk efter fjernelse af tørringsmidlet ved filtrering gav 213 g (95%) N-benzyloxycarbonyl-sarcosin som en olie, der identificeredes ved NMR-spektroskopi og anvendtes uden yderligere rensning.

NMR (CDCI3)6: 3,02(S,3H,-N-CH3), 4,05(bred,2H,-N-CH2), 35 5,15(S,2H,benzyl), 7,35(S,5H,aromatisk), lO,4(S,1H,syre).

11 149631 B. Syntese af N-benzyloxycarbonyl-sarcosin-N-hydroxysuccinimid-ester (CBZ-SAR-OSu) N-benzyloxycarbonyl-sarcosin fremstillet i eksempel 1A (146 g, 0,6547 mol) og N-hydroxysuccinimid (77,6 g (97%), 0,6547 mol) oplø-05 stes i 1500 ml tør tetrahydrofuran under afkøling på et isbad. Til denne opløsning sattes under hurtig omrøring og afkøling en opløsning af dicyclohexylcarbodiimid (134,9 g, 0,6547 mol) i 500 ml tør tetrahydrofuran. Den resulterende opløsning omrørtes i ca. 18 timer ved stuetemperatur. Det faste stof fjernedes ved filtrering, og opløs-10 ningsmidlet afdampedes under reduceret tryk til dannelse af olie, som krystalliseredes fra 2 I absolut ethanol til dannelse af 160 g (76,3%) N-benzyloxycarbonyl-sarcosin-N-hydroxysuccinimidester som et hvidt fast stof, smp. 69-78°C.

NMR (CDCI3)6: 2,7(S,4H,-CH2-CH2-), 2,06(S,3H,-N-CH3), 4,3 15 (S,2H-N-CH„), 5,08(S,2H,benzyl), 7,3(S,5H,aromatisk; IR(KBr): -1 -1 2940-3070 cm (alifatisk og aromatisk. C-H), 1830 cm (imid):

Analyse beregnet for ci5HioN2°6: C, 56,25; H, 5,03; N, 8,75 fundet : C, 55,93; H, 5,06; N, 8,85 20 C. Syntese af N-benzyloxvcarbonvl-sarcosvl-N£ benzyloxycarbonyl-L-lysin (CBZ-SAR-e-CBZ-LYS-OH) N-benzyloxycarbonyl-sarcosin-N-hydroxysuccinimidester fra eksempel IB (25 g, 0,0744 mol), Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysin (indkøbt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) (22 g, 0,0786 25 mol) og triethylamin (22 ml, 16 g, 0,158 mol) sattes til 450 ml tør tetrahydrofuran, og det hele omrørtes i ca. 18 timer ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet fjernedes under reduceret tryk og remanensen opdeltes mellem 500 ml ethylacetat og 400 ml 2 N saltsyre.

Det vandige lag fraskiltes og ekstraheredes med 100 ml ethylacetat.

30 De forenede ethylacetatfraktioner vaskedes dernæst med to 200 ml portioner 2 N saltsyre, 200 ml vand og to gange med 200 ml mættet natriumchloridopløsning efterfulgt af tørring over vandfri magnesiumsulfat. Efter fjernelse af tørringsmidiet ved filtrering fjernedes opløsningsmidlet fra opløsningen under reduceret tryk, og remanensen tri-35 tureredes med 900 ml acetone-hexan (1:3) til dannelse af 29,9 g (82,8%) N-benzyloxycarbonyl-sarcosyl-Ne-benzyloxycarbonylL-lysin som et hvidt stof.

12 149631 NMR (TFA)C: 1,3-2,2 (M,6H,C-CH2-CH2-CH2-C af lysin), 3,08 (S+M,5H,-N-CH2- af lysin og CHg-N- af sarcosin), 4,25 (S,2H,

O O

II II

-N-CH2-C-), 4,75(M,1H,-N-CH-C-), 5,2(S,4H,benzyl), 7,3(S+M, 05 12H,aromatisk + -N-H), IR(KBr); 3330 cm 1 (amid N-H), 1650-1750 cm \ amid, (syre og urethan C=0). (a) 2° (C=1,00, HOAc).

H

Analyse beregnet for C25H31N3C7: c/ 61/84; H, 6,44; N, 8,65 fundet : C, 61,03; H, 6,47; N, 8,61.

10

Eksempel 2

Fremstilling af fragment II: H-SAR-GLN-NI-U

A. Syntese af N-benzyloxycarbonyl-L-glutaminamid (CBZ-GLN-NH^) 15 L-glutaminsyre (44 g, 0,3 mol) suspenderedes i 250 ml absolut methanol og suspensionen opvarmedes under tilbagesvaling i 0,5 time, mens tør HCI-gas bobledes gennem suspensionen, efter hvilket tidsrum alt materiale var giet i opløsning. Opløsningen opvarmedes under tilbagesvaling i et yderligere tidsrum pi ca. 18 timer, hvorefter opløs-20 ningsmidlet afdampedes under reduceret tryk. Til den resulterende remanens sattes 200 ml vand og 300 ml chloroform, og den resulterende blanding omrørtes hurtigt ved stuetemperatur, mens 5 g magnesiumoxid og 18 g benzylchlorformiat tilsattes, hvorefter den hurtige omrøring fortsattes i yderligere 10 minutter. Denne tilsætning efter-25 fulgt af en 10 minutters omrøringsperiode gentoges 3 gange til opnåelse af en total tilsat mængde magnesiumoxid pi 20 g (0,496 mol) og 72 g (0,423 mol) benzylchlorformiat. Efter den sidste tilsætning omrørtes reaktionsblandingen i 15 minutter i stedet for 10 minutter.

Det organisk lag fraskiltes, vaskedes med to 200 ml portioner vand, 30 to 200 ml portioner 0,5 N saltsyre, to yderligere 200 ml portioner vand, to 200 ml portioner 0,5 N natriumhydroxid og to afsluttende 200 ml portioner vand og tørredes over vandfri magnesiumsulfat.

Tørringsmidlet fjernedes ved filtrering, og opløsningsmidlet fjernedes under reduceret tryk. Den tilbageblevne olie opløstes i metha-35 nol (500 ml), som forud var mættet med ammoniak og henstilledes ved stuetemperatur i 6 dage. Det resulterende faste stof fjernedes ved filtrering og om krysta I liseredes fra EtOH til dannelse af et hvidt fast stof, (19,35 g, 23%), smp. 189-195°C.

13 149631 NMR (CD„C0oD)6: 4,3(M,1H,methyl), 5,1(s,2H,benzyl), 7,3(5, 3 ά Λ Λ 5Η,aromatisk). IR(KBr): 3440 cm , 3320 cm og 3200 cm (amid *1 -i og urethan N-H), 1650 cm (amid) 1540 cm (amid).

05 (a)D22'4 = +6° (c = 2,012, DMF).

Analyse beregnet for C^H^yNjO^: C, 55,91; H, 6,14; N, 15,04 fundet : C, 56,76; H, 6,24; N, 14,88 10 Alternative fremgangsmåder til syntese af CBZ-GLN-NH^ 1) Til en afkølet opløsning af 8,41 g (30 mmol) benzyloxycarbo-nyl-L-glutamin og 3,45 g (30 mmol) hydroxysuccinimid i 100 ml tetra-hydrofuran sattes 6,18 g (30 mmol) dicyclohexyicarbodiimid under omrøring. Det hele omrørtes i 18 timer og henstod ved omgivelsernes 15 temperatur. Opløsningen filtreredes, filtratet inddampedes til tørhed, og remanensen om krysta I liseredes fra ethylacetat. Det resulterende faste stof opløstes dernæst under opvarmning i 75 ml methanol mættet med ammoniak og henstod ved omgivelsernes temperatur i 18 timer.

Det resulterende faste stof frafiltreredes, vaskedes med kold metha-20 nol og omkrystalliseredes to gange fra 95% ethanol til dannelse af 1,8 g fast stof; smp. 191,5-195,5°C. NMR-spektrum, IR-spektrum, optisk drejning og grundstofanalyse bekræftede produktets identitet og renhed.

2) En suspension af 220 g (1,495 mol) L-glutaminsyre i 1250 ml 25 absolut methanol opvarmedes til tilbagesvaling, og hydrogenchlorid bobledes gennem suspensionen i syv timer, indtil opløsning var tilvejebragt. Opløsningen opvarmedes under tilbagesvaling i yderligere 18 timer, hvorefter den inddampedes under reduceret tryk til dannelse af hydrochloridsaltet af L-glutaminsyre. Hydrochloridsaltet opløstes 30 j én liter deioniseret vand, og 1,5 I chloroform tilsattes. Til denne opløsning sattes dernæst 360 g (2,11 mol) benzyloxycarbonylchlorid og 120 g (3 mol) magnesiumoxid over et tidsrum af 1,25 time under omrøring, og omrøringen fortsattes i yderligere en halv time. Det hele filtreredes til fjernelse af eventuelt uopløst magnesiumoxid, og det 35 organiske lag af filtratet fraskiltes. Det organiske lag vaskedes to gange med 1,0 I deioniseret vand, to gange med 1,0 I 0,5 N vandig natriumhydroxid og afsluttende fire gange med 1,0 i deioniseret vand.

14 149631

Det vaskede organiske lag tørredes over magnesiumsuffat, filtreredes og inddampedes til tørhed til dannelse af 500 g råt fast stof. Dette rå faste stof opløstes i en blanding af 2,0 I methanol og 500 ml ammoniumhydroxid, henstod ved omgivelsernes temperatur i ti dage og 05 afkøledes dernæst i tre dage. Det resulterende faste stof frafiltrere-des, vaskedes med methanol, tørredes i vakuum og omkrystalliseredes fra 15 I isopropanol til dannelse af 198 g rent produkt. Produktets identitet og renhed bekræftedes ved NMR og IR spektre, optisk drejning og grundstofanalyse.

10 B. Syntese af N-benzyloxycarbonyl-sarcosyl-L-glutaminamid (CBZ-SAR-GLN-NH„) "—.....C.

N-benzyloxycarbonyl-L-glutaminamid fremstillet i eksempel 2A (13,6 g, 0,0473 mol) suspenderedes i 300 ml methanol. Til denne su-15 spension sattes palladium-pl-carbon (10%, 1,1 g), og suspensionen rystedes under 310 kPa (45 psi) hydrogen. Efter 0,5 time var hydrogen-optagelsen 31 kPa (4,5 psi) svarende til ca. 0,05 mol hydrogen. Katalysatoren fjernedes ved filtrering og vaskedes med 50 ml methanol. Til de kombinerede methanolopløsninger sattes N-benzyl-20 oxycarbonyl-sarcosin-N-hydroxysuccinimidester fremstillet i eksempel 1B (19,36 g, 0,0605 mol), og reaktionsblandingen omrørtes i ca. 18 timer ved stuetemperatur. Det resulterende faste stof fjernedes ved filtrering, vaskedes med methanol og tørredes til dannelse af 14,9 g (90%) N-benzyioxycarbonyi-sarcosyl-L-glutaminamid; smp. 186-196°C.

25 NMR (CD3C02D)6: 2,3(M,1H,-CH2-CH2 glutamin), 3,0(S,3H,

O

-N-CH3), 4,1(S,2K-N-CH2-C-), 4,6(M,1H,-N-CH-C-), 5,15(S, 2H, benzyl), 7,3(S,5H,aromatisk) 30 IR(KBr): 3410 cm 3290 cm ^ og 3220 cm ^ og 3220 cm (amid -1 -1 og urethan -N-H), 1700 cm (urethancarbonyl), 1650 cm og 1625 cm-1 (amidcarbonyler). (<x)D22'6 = + 23,3° (C = 1,032, DMF).

35 Analyse beregnet for <--]qH22N405: C' 54,85; H, 6,33; N, 15,99 fundet ; C, 54,62; H, 6,23; N, 15,56 15 149631 C. Syntese af sarcosyl-L-lysyl-sarcosyl-L-glutaminamid (H-SAR-LYS-SAR-GLN-NI-U) N-benzyloxycarbonyl-sarcosyl-L-glutaminamid (17,4 g, 0,0497 mol) som fremstillet i eksempel 2B suspenderedes i 370 ml dimethyl-05 formamid sammen med 2 g 10% Pd/C, og hydrogengas bobledes gennem opløsningen i seks timer. Efter fjernelse af katalysatoren ved filtrering sattes 1-hydroxybenzotriazol (13,4 g, 0,10 mol) og N-benzyl-oxycarbonyl-sarcosyl-N -benzyloxycarbonyl-L-lysin (24 g, 0,0497 mol) som fremstillet i eksempel 1D til filtratet, og den resulterende 10 opløsning afkøledes i et isbad. Dernæst tilsattes dicyclohexylcarbo-diimid (10,24 g, 0,0505 mol), og den resulterende blanding omrørtes natten over uden afkøling, således at blandingens temperatur gradvis opnåede omgivelsernes temperatur.

Suspensionen filtreredes, og opløsningsmidlet fjernedes fra filtra-15 tet under reduceret tryk. Remanensen fra filtratet opløstes i methy-lenchlorid, afkøledes til -20°C i 18 timer, filtreredes og filtratet inddampedes under reduceret tryk til dannelse af det amino-blokerede tetrapeptidamid.

Dette materiale opløstes dernæst i 300 ml 50% vandig eddikesyre 20 og reduceredes under ca. 275 kPa (ca. 2,8 kp/cm ) hydrogen i nærværelse af 2,5 g 10% Pd/C. Efter 2,5 timer var hydrogenoptagelsen ca. 41 kPa (ca. 6 psi). Efter fjernelse af katalysatoren ved filtrering, lyofilyseredes filtratet til dannelse af det urene produkt, der rensedes som følger.

25 Det urene faste stof kromatograferedes på en 5 x 80 cm kro- matograferingskolonne af "Sephadex SP-C-25" harpiks (sulfopropyl-dextranpolymer), som var pakket i 0,5 M ammoniumacetat (pH 6,5) (tomvolumen 560 ml) og elueredes med en lineær gradient af to liter 0,5 M ammoniumacetat (pH 6,5) og to liter 0,8 M ammoniumacetat 30 (pH 6,5). Strømningshastigheden var 150 ml/time og 15 ml-fraktioner opsamledes. Fraktionerne nr. 160-200 forenedes og lyof i liseredes, hvorefter det resulterende faste stof igen kromatograferedes under samme betingelser som ovenfor, og fraktionerne nr. 81-320 forenedes og lyofiliseredes.

35 Det resulterende produkt kromatograferedes dernæst på en for- delingskolonne af "Sephadex G-25" harpiks (epichlorhydrin-tvær-bundet dextranpolymer), der var fint pakket i den nedre fase af en 16 149631 4:1:5 blanding af n-butanol, eddikesyre og vand og elueredes med den øvre fase af denne blanding. Kolonnestørrelsen var 5 x 85 cm, strømningshastigheden var 100 ml/time og 20 ml-fraktioner opsamledes. Fraktionerne nr. 51-240, 241-340 og 341-520 forenedes hver for sig 05 og inddampedes til frembringelse af udbytter på hhv. 4 g, 5,4 g og 3,8 g produkt. Hver af disse tre produkter kromatograferedes igen separat på den ovenfor beskrevne fordelingskolonne, og de resulterende fraktioner bestemtes ved tyndtlagskromatografi (TLC) under anvendelse af silikagel-plader og et opløsningsmiddelsystem bestående 10 af 4:2:3:1 n-butanol/eddikesyre/vand/pyridin. De fraktioner, som indeholdt rent produkt (ca. nr. 340-420), for hvert af de ovenfor opnåede tre produkter forenedes og inddampedes.

Den resulterende remanens opløstes i 500 ml absolut ethylalkohol, udfældedes ved tilsætning af 100 ml absolut ethylalkohol mættet med 15 hydrogenchloridgas og behandledes med 500 mi vandfri ether. Det resulterende faste stof frafiltreredes, vaskedes med ether og tørredes under reduceret tryk til dannelse af 7,81 g sarcosyl-L-lysyl-sar-cosyl-L-glutaminamid, dihydrochlorid som et hvidt fast stof.

20 TLC: (silikagel-plader) opløsningsmiddel N-butanol/HOAc/HgO/pyridin 4/2/3/1 0,48 CHCI3/MeOH/NH4OH (kone) 30/25/10 0,42 N-butanol/HOAc/H^O/pyridin 15/3/12/10 0,27 25 N-butanol/NOAc/EtOAc/H20 1/1/1/1 0,12 N-butanol/HOAc/HgO (øvre) 4/1/5 0,02

Aminosyre-analyse: Sar (2,19), Glu (1,03), Lys (1,00)*, NH3 (2,01), 80,4% peptid.

30

Analyse: Cl": 14,89%; H20: 4,92% (a)D22,4 = -14,8° (C=0,2022, 0,1 N HCI).

Alternative rensningsmetoder omfatter "revers fase high perfor-35 mance" væske kromatografi under anvendelse af et alkylsilan-substrat.

Den simpleste rensningsmetode involverede kromatografering på silika-gel med et elueringsmiddel omfattende en alifatisk alkohol, en lavere 17 149631 alkansyre (inklusive myresyre) og vand som beskrevet ovenfor. Det foretrukne elueringsmiddel n-butanol:eddikesyre:vand (10:2:5) anvendtes til rensning af 10 g urent tetrapeptid pi en 100 g kolonne af "Malenkrodt Silicar CC7" silikagel. 15 ml-fraktioner opsamledes.

05 TLC pi silikagel-plade under anvendelse af chloroform:methanol: ammoniumhydroxid i et 30:25:10 forhold som elueringsmiddel og fremkaldelse med ninhydrin indikerede, at fraktion 50-95 indeholdt rent tetrapeptid.

10 Eksempel 3

Det i eksempel 2C ovenfor fremstillede rene H-SAR-LYS-SAR-GLN-NHg testedes ved den i eksempel 2 til USA patentansøgning nr.

960.550 af 17. november 1978 (omtalt ovenfor) beskrevne muse-induktionsprøve. Dette tetrapeptidamid, der var fremstillet som i eksempel 15 1 og 2 ovenfor, udviste den samme aktivitet som det i henhold til

Merrifields fastfase-synteseteknik fremstillede materiale.

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af tetrapeptidamidet H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2, KENDETEGNET ved, at man 05 a) danner fragment I, som består af Z-SAR-e-Z'-LYS-OH, ved i) aktivering af sarcosin, hvis aminogruppe er beskyttet med en beskyttende gruppe Z, med hensyn til nukleo-filt angreb på carboxygruppen med en amin, til dannelse af et carboxy-aktiveret beskyttet sarcosinderi- 10 vat, og ii) omsætning af det carboxy-aktiverede beskyttede sarcosinderivat med L-lysin, hvis ε-aminogruppe er beskyttet med en beskyttende gruppe V, hvorved fragment I dannes, 15 b) danner fragment II, som består af H-SAR-GLN-NH2, ved i) fremstilling af Z"-GLN-NH2, Π) fjernelse af den beskyttende gruppe fra Z"-GLN-NH2 til dannelse af ubeskyttet L-glutaminamid, Hi) omsætning af det ubeskyttede L-glutaminamid enten 20 med et som angivet i trin a (i) fremstillet carboxy- aktiveret beskyttet sarcosinderivat eiler med et sarco-sin-N-carboxyanhydrid, og iv) om nødvendigt fjernelse af den beskyttende gruppe fra den dannede forbindelse, hvorved fragment II 25 dannes, c) forbinder fragment I og fragment II med hinanden til dannelse af det beskyttede tetrapeptid Z-SAR-e-Z'-LYS-SAR- gln-nh2, d) fjerner de beskyttende grupper fra det beskyttede tetra- 30 peptid, og e) isolerer og renser det resulterende tetrapeptid H-SAR-LYS-sar-gln-nh2, idet Z, Z' og Z" hver er udvalgt fra gruppen bestående af: O II 35 a) R.J-OC-, hvori R1 betegner phenyl, tolyl, xylyl, adamantyl, allyl, β-cyanoethyl, fluorenylmethyl, benzyl, benzyl, hvori phenylringen er subsitueret med fra 1-3 substituenter ud 149631 valgt blandt halogen, nitro, C^g-alkyl og C1_g-alkoxy, eller betegner diisopropylmethyl, diphenylmethyl, cyclohex-yl, cyclopentyl, vinyl, t-butyl, t-amyl, dimethyltrifluor-methylmethyl eller dimethylbiphenylmethyl,

05 O b) RgC-, hvori Rg betegner Cg^-alkyl eller C.j_4-alkyl substitueret med fra 1-5 halogengrupper, X II c) RgO-P-, hvori X betegner S eller O og R^ og R^ hver be- 1° 0r4 tegner benzyl eller C^g-alkyl, d) hvori Rg og Rg hver for sig betegner C^g- 1 alkyl eller tilsammen betyder -CHp-C-CH--, '.CH \ \c=0 7 R8 15 v , hvori R7 og Rfi hver for sig betegner hydrogen 6 eller C1 R-alkyl, og II e) [ (Γ hvori Rg betegner hydrogen, methyl, halogen eller nitro, 20 q forudsat, at Z er monodentat.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man a) danner fragment I, som består af CBZ-SAR-e-CBZ-LYS-OH, hvori CBZ er benzyloxycarbonyl, ved 25 i) esterificering af CBZ-SAR-OH ved omsætning med en ækvivalent mængde N-hydroxysuccinimid i nærværelse af dicyclohexylcarbodiimid til dannelse af CBZ-SAR-OSu, og ii) omsætning af et lille molært overskud af CBZs-LYS-OH 30 med CBZ-SAR-OSu i nærværelse af to ækvivalenter triethylamin til dannelse af fragment ^CBZ-SAR-e-CBZ-LYS-OH, b) danner fragment II, som består af H-SAR-GLN-NHg, ved i) fremstilling af CBZ-GLN-NHg, 35 ii) fjernelse af benzyloxycarbonylgruppen ved katalytisk hydrogenering til dannelse af H-GLN-NH,,, iii) omsætning af H-GLN-NHg med et molært overskud af CBZ-SAR-OSu til dannelse af CBZ-SAR-GLN-NHg, og