JPH01193296A - ジペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は有用なペプチド類の製造方法に関し、更に詳細
には、Ｈ−５ＡＲ−ＬＭＳ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ，の
製造のための中間体ジペプチドに関する。

１９７８年１１月１７日出願の「新規テトラペプチド類
および方法」と題する米国特許第９６０゜５５０号には
、−群のペプチド類が、腺胸機能（ｔｈｙｍｉｃ　ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎ）および免疫学的領域番こおし１て有用な
ものとして開示されている。この部類の好適な一員は、
式Ｈ−ＳＡＲ−ＬＭＳ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ，を有し
ている。この特許願は参考のためにここに挙げるもので
ある。この参考特許願においては、一般に「メリフィー
ルド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｓ　ｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ）Ｊと呼ばれる固相合成法によって、該群のテトラペ
プチド類を製造している。この群のテトラペプチド類の
製造のためには、古典的な方法（すなわち、溶液合成法
）を用いることができるということも記載されている。

メリフイールの固相合成法は、実験室における少量のペ
プチドの製造のためには好都合であるけれども、大量（
たとえば約１００９を超える量）のペプチドの製造のた
めには実際的でなく且つ一般に不経済であり、そのため
には溶液合成法のほうが適している。その上、溶液合成
法は一般に、必要とする試薬の量が比較的少なく且つ使
用するいくつかの試薬の単位原価が遥かに低いために、
固相合成法よりも遥かに経済的である。ポリペプチドの
製造において使用するためのいろいろな種類の溶液合成
法の中で、本発明者は、望ましいテトラペプチドアミド
を便利に且つ経済的に製造するための特別な合成方法を
見出した。

そのもっとも広い範囲において本発明は、Ｈ−Ｓ　Ａ　
ＲＬ　Ｙ　Ｓ　　Ｓ　Ａ　ＲＧ　Ｌ　Ｎ　−Ｎ　Ｈｘの
製造方法であり、この方法は下記の各段階から成る：ａ
）後述するようにして、Ｚ−ＳＡＲ−ｔＺ’−ＬＭＳ−
ＯＨから成るフラグメントＩを生成せしめ： ｂ）後述するようにして、ｌ−５ＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ２
から成る７ラグメント■を生成せしめ；Ｃ）フラグメン
ト■と７ラグメント■を結合させて保護したテトラペプ
チドを生成せしめ；ｄ）保護したテトラペプチドを精製
しく任意的）： ｅ）保護基ＺおよびＺ′を除去し；そして「）生ずるテ
トラペプチドを単離しそして精製する。

フラグメントＩは下記の各段階によって生成せしめるこ
とができる： ｉ）サルコシンを保護基Ｚを導入しうる試薬と反応させ
ることによって、サルコシンのａ−アミノ基を保護する
； １）Ｌ−リシンを、ε−アミノ基を特異的に保護するよ
うな方法で、保護基Ｚ′を導入しうる試薬と反応させる
ことによって、Ｌ−リシンのε−アミノ基を保護する； ｉｉ）更に後述するようにして、段階ｉ）において生成
せしめた保護したサルコシンを、アミンによるカルボキ
シ基における求核性攻撃に関して活性化することにより
カルボキシ活性化した保護したサルコシンを生成せしめ
る；および ｉｖ）該カルボキシ活性化した保護したサルコシンを段
階ｉｉ）において生成せしめたＣ−保護したし一リジン
と反応させ、それによって７ラグメントＩを生成せしめ
る。

フラグメント■は下記の各段階によって生成せしめるこ
とができる： ｉ）Ｚ”　　ＧＬＮ−ＮＨｔを製造する、ここでＺ“は
Ｌ−グルタミンアミドのα−アミノ基上の保護基である
； ｉ）上記段階ｉ）において製造した物質から、好ましく
は接触水素添加によって保護基を除去して、保護してな
いし一グルタミンアミドを生成せしめる； Ｌｉ１）保護してないし一グルタミンアミドを、前項の
段階ｉｉ）に記載のカルボキシ活性化した保護したサル
コシンと反応させて、Ｚ−５ＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ，を生
成せしめる：そして ｉｖ）該Ｚ−８ＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ！から、好ましくは
接触水素添加によって保護基を除去し、それによって７
ラグメント■を生成せしめる。

保護基Ｚおよび２′は同一もしくは相異なることができ
且つアミノ酸基を結合するために使用する段階による除
去には安定であるが、しかしなおペプチドのアミド結合
の何れをも開裂することがない条件によって結合段階の
終りに容易に除去することができなければならない。保
護基２＃は、基Ｚおよび２′　と同一もしくは相異なる
ことができ且つＬ−グルタミンアミドを分解しない条件
下に容易に除去することができるが、しかし保護したし
一グルタミンアミドを得るために用いる製造経路に依存
して、グルタミンまたはグルタミン酸のアミド化の間は
安定でなければならない。適当なアミノ−保護基の例は
下記の式を有するものである： ａ）　　　　　０ ■ Ｒ，−０Ｃ−１ここでＲ１はアリール（たとえばフェニ
ル、トリル、またはキシリル）：アダマンチル；−置換
したメチル（たとえばアリル、β−シアノエチル、フル
オレニルメチル、ベンジル、またはフェニル環がハロ、
ニトロ、低級アルキルおよび低級アルコキシから選ばれ
る１〜３員で置換されたベンジル）；二置換されたメチ
ル（たとえばジイソプロピルメチル、ジフェニルメチル
、シクロヘキシノー　シクロペンチルまたはビニル）；
或いは三置換されたメチル（たとえばｔ−ブチル、（−
アミル、ジメチルトリフルオロメチルメチル、まにはジ
メチルビフェニルメチル ｂ）Ｏ 雪 Ｒ，Ｃ−、ここでＲ８は炭素数２〜４個の低級アルキル
たとえばエチノ呟イソプロピル、１−ブチルなと、また
は１〜５個のハロゲン原子で置換された炭素数１〜４個
の低級アルキルたとえばトリフルオロメチル、クロロメ
チル、ペンタクロロエチルなどである； ｃ）　　　　　Ｘ 鵬 Ｒ，０−Ｐ−１，：、：、　−Ｃ’　Ｘ　ハＳ　！　ｆ
ニーはＯであＯＲ。

す、そしてＲ３およびＲ４はそれぞれベンジルまたは低
級アルキルである； ′・−０，−０、・Ｒ６ はそれぞれ独立に低級アルキルであるか、またはＲ，Ｒ
。

但しＲ２およびＲ６はそれぞれ水素または低級アルキル
である：および ハロまたはニトロである。

二座配位（ｂｉｄｅｎｔａｔａ）であるアミン保護基ｅ
）はＬ−リシンのδ−アミノ基およびＬ−グルタミンの
σ−アミノ基に対してのみ使用することができ、サルコ
シンのα−アミノ基には使用することができない。サル
コシンのα−アミン基に対する保護基は、そのアミノ基
上のメチル置換基のために一座配位（ｍｏｎｏｄｅｎｔ
ａｔｅ）でなければならない。

その他のアミン保護基はすべてのアミノ酸に対して使用
することができる。

本明細書中で用いる「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブ
ロモおよびヨードを包含するが、クロロおよびブロモが
好適である。「低級アルキル」および「低級アルコキシ
」なる語はそれぞれ、炭素数１〜６個の飽和脂肪族炭化
水素基たとえば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−
ブチル、ｎ−ヘキシルなどおよび対応するアルコキシ基
たとえばメトキシ、エトキシ、インプロポキシ、ｔ−ブ
トキシ、ｎ−ヘキソキシなどを包含する。メチルが好適
な低級アルキルでありそしてメトキシが好適な低級アル
コキシである。

これらの保護基を導入するために用いる試薬（通常は対
応する酸クロライドであるけれども、他の誘導体を用い
ることもできる）は、ある場合には本明細書中で「保護
基試薬」と呼ぶ。その他の適当な保護基は、たとえば、
“Ｐ　ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇ　ｒｏｕｐｓｉｎ　Ｏｒ
ｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、Ｊ、Ｆ、Ｗ。

、ＭｃＯｍｉｅ、　ｅｄ、、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓ
ｓ、　Ｎ、　ｙ、ｌ　１９７３に記載されている。

２と２′は同一であり且つベンジルオキシカルボニル（
ＣＢＺ）またはトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）である
ことが好ましい。更に好適な実施態様においては、ｚ、
ｚ’および２＃がすべて同一であり且つＣＢＺまたはＴ
ＦＡのどちらかである。

前記のカルボキシ活性化した保護したサルコシンを製造
するためには種々の試薬を使用することができる。

カルボキシ活性化した保護したサルコシンの１種は反応
性エステルである。適当なサルコシンの活性エステルを
製造するのに用いる試薬の例は、フェノール；フェニル
環がｌ〜５員のハロ（タトえばクロロまたはフルオロ）
、ニトロ、シアノおよびメトキシで置換されたフェノー
ル；チオフェニル；Ｎ−ヒドロキシフタルイミド：Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド；Ｎ−ヒドロキシグルタルイ
ミド；Ｎ−ヒドロキシベンズアミド；ｌ−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールなどである。その他の適当な試薬は、
たとえば前記の“Ｐ　ｒ、ｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐ
ｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″、Ｊ
、Ｆ、Ｗ。

ＭｅＯｍｉｅ、　ａｄ、、に記載されている。後記の特
定的な実施例においてはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
を使用する。

その他の活性化方法、たとえば、混合または対称無水物
方法、酸塩化物方法、およびアジド方法は公知であり、
たとえば、Ｂ　ｏｄａｎｓｚｋｙら、”Ｐｅｐｔｉｄｅ
　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”　２ｎｄ　ｅｄ、、　　ｌ　９
７６　＋　Ｉ）ｐ８５〜１２８に記載されている。

７ラグメント■の製造における段階ｉｉ）およびｉｖ）
に代る方法として、前記のカルボキシ活性化した保護し
たサルコシンの代りにサルコシンのＮ−カルボキシ無水
物を使用することができる。Ｎ−カルボキシ無水物の製
造は一般に、上記のＢｏ−ｄａｎｓｚｋｙらの著書の９
７頁以下に記載されている。

この環状のサルコシン無水物は、その性質によって、サ
ルコシンアミノ基に対して何らの保護基も必要としない
ため、フラグメント■の製造において有利である。それ
故、保護基を除去する必要がなく、段階ｉｖ）を省略す
ることができる。この代替段階は次のように記載するこ
とができる：ｉｉ）保護してないし一グルタミンをサル
コシンＮ−カルボキシ無水物と反応させ、それによって
フラグメント■を生成せしめる。

保護基は保護したテトラペプチドおよびＺ“−ＧＬＮ−
ＮＨ２中間物から接触水素添加によって除去することが
好ましいけれども、その他の公知の方法を使用すること
もできる。このような方法は、前記のＢ　ｏｄａｎｓｚ
ｋｙらの著書の１８〜８４頁およびＭｃＯｍｉｅの著書
中に記載されている。これらの方法の例は、トリフルオ
ロ酢酸またはその他の穏和な酸による処理、５０％含水
酢酸の存在下での亜鉛による還元、塩化水素またはその
他の強酸による処理、並びに強または弱塩基による処理
であるが、これらはすべて除去すべき基と存在するその
他の反応性の基の本質に依存する。

本発明の方法の生成物は保護したテトラペプチドの形態
において、または保護基の除去後の何れかにおいて精製
することができる。保護したテトラペプチド（ＣＢＺ保
護基）は酢酸エチル：メタノール溶媒から有利に結晶化
することができる。

その他の溶媒系も使用することができることが予想され
る。

連続的な溶出と再結晶を用いる煩雑な精製方式が、溶液
合成ペプチドの精製において典型的であるけれども、本
発明によって溶液合成したテトラペプチドは、驚くべき
ことに、脂肪族アルコール、低級アルカン酸および水か
ら成る溶離剤を用いるシリカゲルクロマトグラフィーカ
ラム上での一回の溶離によって容易に精製することがで
きるということが見出された。脂肪族アルコールとして
は、たとえばインブタノール、ｎ−ブタノール、イソプ
ロパツール、アミルアルコール、イソアミルアルコール
などを用いることができ、一方、低級アルカン酸として
はギ酸、酢酸、プロピオン酸などを用いることができる
。有利に使用することができることが認められている溶
離剤の１例は、ｌ０＝２：５の比率のｎ−ブタノール：
酢酸：水である。

本発明の範囲内には、前記の７ラグメントＩと■および
保護したテトラペプチド、ならびにこれらの７ラグメン
トの製造のための中間体を包含され、さらに本発明の方
法の実施のために有用な組成物もまた含まれる。

本発明は、そのもっとも広い範囲において、下記の図に
概念的に示される。

フラグメント■　　　　　フラグメント■上記の図にお
いて、保護基を前記のように２１Ｚ′およびＺ“によっ
て表わす。サルコシンのカルボキシ活性化は文字ＯＡに
よって示す。

上記の図を参照して、フラグメントＩは一般に以下のよ
うにして製造することができる。サルコシンのアミノ基
を保護するためにサルコシンの水溶性塩基性付加塩を生
成させ、水に溶解する。この塩基性付加塩は、サルコシ
ンをモル的に僅かに過剰の水酸化ナトリウム中に溶解す
ることによって生成させることができる。次いで、この
溶液に対して、同時に、僅かに過剰の保護基Ｚを導入す
るための試薬（たとえばベンジルオキシカルボニルクロ
リドのような対応する酸クロリドおよび反応の間に生成
する酸（たとえばＨＣ１）と反応させるための塩基の溶
液（たとえば水酸化ナトリウム）を加える。保護基添加
試薬は溶液としてまたはそのままで加えることができ且
つ酸クロリドであることが好ましい。反応の完了後に、
過剰の保護基添加試薬を除去しくたとえばジエチルエー
テルまたは水と混合しない何らかの有機溶媒を用いる抽
出によって）、その後、保護したサルコシンを、酸（た
とえば塩酸）による処理によって未反応のサルコシンか
ら単離する。酸処理により、保護してないサルコシンの
塩基性付加塩が保護してないサルコシンの酸付加塩に変
えられるが、この塩は水溶性である。しかしながら、酸
処理は、保護したアミノ基のために、酸付加塩を生ぜし
めることができないから、保護した塩基性付加塩のみを
保護したサルコシンに変える。この保護したサルコシン
は水に不溶性であり、たとえば前記のような混合しない
有機溶媒を用いる抽出によって、保護してないサルコシ
ンの塩から容易に分離することができる。本明細書にお
いて用いる「混和しない有機溶媒」という語は、水と混
合しないすべての一般的な実験室用有機溶媒たとえばジ
エチルエーテル、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、キ
シレンなどを包含する。好適な保護したサルコシン、ス
ナわちＮ−ベンジルオキシカルボニルサルコシンは既知
の化合物である。その製造方法は、Ｒ、Ｓ　、　Ｔ　１
ｐｔｏｎおよびＢ、　Ａ、　Ｐａｗｓｏｎ、　　Ｊ　。

Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、、　２６．４６９８　（１９６１
）中に示されており、且つこの化合物はＢ　ａｃｈｅｍ
、　　■ｎｃ、　。

Ｔｏｒｒａｎｃｅ、　ＣＡから市販されティる。

フラグメントＩを生成させるだめの、この保護したサル
コシンと保護したりシン分子との縮合のための準備とし
て、アミノ保護したサルコシンを、通常、結合の生成を
助長する何らかの方式で活性化しなければならない。こ
の活性化を行なうためノ好適な方法は「活性エステル」
の生成によるものであるけれども、公知のその他の活性
化方法、たとえば混合または対称無水物、アジドまたは
酸クロリド方法を用いることができるということを考慮
すべきである。加うるに、Ｎｏ−保護したし一リジンの
カルボニル末端を、サルコシン上の保護基（Ｚ）の存在
下に、ＺまたはＬ−リシン上のＮ“−保護基（Ｚ′）の
何れをも除去することなく除去することができる基によ
ってブロックする、ときは、このようなブロッキングは
、事前のサルコシンの活性化なしての、保護したサルコ
シンのＬ−リンンへの直接的な結合を可能とするであろ
う。

保護したサルコシンのどのような活性エステルをも使用
することができるが、好適な１個の活性エステルは、ヒ
ドロキシスクシンイミドによって生成せしめるものであ
る。保護したサルコシンの活性エステルは、たとえば適
当な有機溶媒、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメ
チルホルムアミド、ピリジンなどの溶液中で、当量の保
護したサルコシンと活性エステル試薬を反応させること
によって製造する。次いでこの溶液に対して当量のカッ
プリング剤、典型的にはジシクロへキシルカルボジイミ
ド、を加える。その他のカップリング剤も効果的である
けれども、カップリング反応の副生物が使用する該群の
溶媒中に極めて不溶性であり、それ故濾過によってカッ
プルした生成物を溶液中に残したまま容易に除去するこ
とができるので、ジシクロへキシルカルボジイミドが特
に有用である。

イプシロン−アミノ基に対して保護しであるし一リシン
は市販品として入手することができ（たとえば、Ｓｉｇ
＋ａａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ＳＬ、
Ｌｕ１ｓ。

ＭＯから）、または前記の基準に合致する保護基（Ｚ′
）を用いて製造することができる。

フラグメント■の製造における最終段階は、僅かに過剰
の保護したし一リシンを、２当量の塩形成材料たとえば
有機第三級アミンの存在下に、保護したサルコシン活性
エステルと反応させることから成る。どのような有機第
三級アミンをも用いることができるが、トリエチルアミ
ンがよく作用することが見い出された。溶媒としては前
記のような適当な有機溶媒を使用する。１当量の塩形成
性第三級アミンがイプシロン−アミノ保護したし一リシ
ンのカルボキシル基を保護するけれども、前記の等個物
の−の代りに、このカルボキシル基に対するその他の保
護基も使用することができるということが了解される。

未反応のアミノ酸は、反応混合物の酸（たとえば塩酸）
による処理および前記のような混和しない有機溶媒によ
る抽出によって除去することができる。

適当なカルボキシル保護基の例は、ベンジルおよびその
中のフェニル基が１〜３個のハロ（たとえばクロロまた
はブロモ）、ニトロ、低級アルコキシ（たとえばメトキ
シ）、または低級アルキル（たとえばメチル）で置換さ
れたベンジルである。

このような基のそれ以上の説明は、前記のＭｃＯｍｉｅ
の著書に記載されている。

フラグメント■の製造は、保護したし一グルタミンアミ
ドの合成によって始まるが、これはＬ−グルタミンまた
はＬ−グルタミン酸の何れかを用いて出発する、いくつ
かの合成経路の中の何れかによって得ることができる。

好適な方法は、Ｌ−グルタミン酸の両カルボキシル基を
低級アルカノールを用いてエステル化し、その後に前記
のようなアミノ基保護試薬を用いる処理によって、Ｌ−
グルタミン酸ジエステルのアルファーアミノ基を保護す
る方法である。この保護したＬ−グルタ・ミン酸とアン
モニアとの反応は、保護したし一グルタミンアミドを与
える。この方法はＪ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　　ｌ　６５．３３３　（１９４６）に記
載されている。この方法の一つの変法において、Ｌ−グ
ルタミン酸のアルファーアミノ基をエステル化反応前に
保護することができる。新規であるもう一つの方法はＬ
−グルタミンで始まり、且つそのアルファーアミノ基を
前記のように保護する。保護したし一グルタミンを次い
で、たとえば活性エステルの形成と、その後の低級アル
カノール（たとえばメチルアルコール）中のアンモニア
による処理によって、保護したし一グルタミンアミドに
変える。

この保護したし一グルタミンアミドを生成させたのち、
アルファーアミノ基から保護基を除き且つ保護してない
し一グルタミンアミドを、前記のように活性化（たとえ
ば活性エステルへの転化によって）しであるアルファー
アミノ保護したサルコシンと反応させる。Ｌ−グルタミ
ンアミドからの保護基の除去は、適当な還元性溶媒、た
とえばジメチルホルムアミド、酢酸、低級アルカノール
（たとえばメタノール）などの中の炭素上のパラジウム
触媒の存在下での水素を用いる反応によって行なうこと
が好ましい。生成した保護基を除いたし一グルタミンア
ミドと保護したサルコシン活性エステルとの反応は、同
一の溶媒、好ましくはメタノール中で行なうことが好ま
しい。この保護基除去の特定の方法および溶媒の使用は
、保護したし一グルタミンアミドと生成した保護したサ
ルコシン−し−グルタミンアミドの両者がメチルアルコ
ール中に不溶であり、一方、保護基を除いたし一グルタ
ミンアミドがメチルアルコール中に完全に溶解するとい
う理由で、特に有利な結果を与える。その結果、未反応
の、保護基を除いたＬ−グルタミンアミドを濾過によっ
て容易に除くことができ、この段階に対して優れた収率
をもたらす。

前記のような適当な還元性溶液（好ましくはジメチルホ
ルムアミド）中の水素と炭素上パラジウムを用いて行な
うことが適当な、この保護したジペプチドからの保護基
の除去はフラグメント■を与える。

フラグメントＩおよび■を、たとえばジメチルホルムア
ミドのような適当な非プロトン性溶媒中でカップリング
剤たとえばジシクロへキシルカルボジイミドの僅かに過
剰の存在下に、当量で反応させることにより結合させて
、保護したテトラペプチドＺ−５ＡＲ−ｔ−Ｚ’　　−
ＬＹＳ　　５ＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ！を生成せしめる。こ
の反応は、７ラグメントＩのＬ−リシン上のカルボキシ
ル基に隣接するラセミ化を最低にし且つ反応の速度を増
大させる物質、たとえばｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールの存在下に行なうことが好ましい。次いで、生成す
るテトラペプチドアミド上の残りの基を、好ましくは、
前記のような適当な還元性溶媒（好ましくは含水酢酸）
中の炭素上パラジウム触媒の存在下での水素ガスを用い
る処理によって除去する。水素ガスは１気圧を越える圧
力下にある必要はないけれども、還元の速度を促進する
という理由で、加圧の使用が有利である。

かくして得られる不純な生成物の単離および精製は、各
フラクション中の物質の正体を監視するために薄層クロ
マトグラフィーを使用する、再結晶とイオン交換クロマ
トグラフィー（好ましくは溶離剤としてｐＨ５の酢酸ア
ンモニウムを使用する）との併用によって達成すること
ができる。下記の実施例においては、いくつかの単離お
よび精製方法を用いているけれども、その他の方法も使
用することができるということは明白である。

先に生成せしめた保護したテトラペプチドは、所望に応
じて、還元段階前に精製することができる。この精製は
、保護したテトラペプチドの溶液から溶媒を除去し、残
渣をジクロロメタン中に溶解し、その溶液を濾過し、且
つ炉液を蒸発させることによって行なうことができる。

生成する固体の熱酢酸エチルによる抽出は、純粋な保護
したテトラペプチドを与え、それを前記のようにして還
元し且つ更に精製することができる。また別の方法とし
て、不純な保護したテトラペプチドを、適当な溶媒系（
たとえばｌＯ：１の比の酢酸エチル：メタノール）から
の再結晶によって精製することができる。

本発明の方法の一好適実施態様を下記の図に示す： 上記図中において略語は下記の意味を有する二〇ＢＺ　
：ベンジルオキシ力ルボニル ＤＣＣニジシクロへキシルカルボジイミドＨＯＳｕ　：
ヒドロキシスクシ、ンイミドＯ３ｕニオキシスクシンイ
ミド Ｐｄ／Ｃ：炭素上のパラジウム Ｈ２：水素 ＨＯＢＴ：ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾールこの好適
実施態様を以下の実施例において更に詳細に記載するが
、これらの実施例は本発明を説明するのに役立つであろ
う。

実施例　！ この物質を、Ｒ、Ｓ　、　Ｔ　１ｐＬｏｎおよびＢ、Ａ
。

Ｐ　ａｗｓｏｎの方法［Ｊ　、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、
　２６．４６４８（１９６１）］に従って製造した。サ
ルコシン（８，９０９，１，０−［−ル）を、５ｏｏｍ
ａの２Ｎ水酸化ナトリウム中に、水浴中で冷却しながら
溶解した。同時に、５５０ｍ１２の２Ｎ水酸化ナトリウ
ムとクロロギ酸ベンジル（１９６ｇ（９５％）、１．０
９５モル］を、激しく撹拌しながら、１時間かけて添加
した。かくして得た反応混合物を、室温において約１８
時間撹拌し、その後それを２５０ｍ（２ずつのジエチル
エーテルによって３回抽出した。次いで水相に酢酸エチ
ル（５００ｍＱ）を加え、次いで２００ｒｒｌの濃塩酸
を注意して加えた。有機相を分離し、５００ｍａずつの
水で２回、次いで３００ｒｒｌの飽和塩化ナトリウム溶
液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。

濾過によって乾燥剤を除去した後の減圧下における溶媒
の蒸発により、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルによっ
て同定され且つ更に精製することなく使用することがで
きる油状物として、２１３ｇ　（９５％）のＮ−７エニ
ルメトキシカルポニルーサルコシンが得られた。

Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　Ｃ１３）δ：　３．０２（ｓ　、　
３）１　、−Ｎ　−ＣＨＮ１４．０５（ブロード、２Ｈ
，−Ｎ−Ｃ旦、）、　５．１５（Ｓ　＋　２Ｈ＋　ヘン
シル）、　７．３５（Ｓ　、　５Ｈ。

芳香族）、　１．０４（Ｓ、　ＩＨ，酸）。

Ｂ、Ｎ−フェニルメトキシカルボニル−サルコシンＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＢＺ−５ＡＲ−
Ｏ５ｕ） 実施例ＩＡにおいて製造したＮ−フェニルメトキシカル
ボニル−サルコシン（１４６９，０，６５４７モル）お
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド［７７，６ｇ　（９
７％）、０．６５４７モル］を、１５００ｍＭの乾燥テ
トラヒドロ７ラン中に溶解した。この溶液に対して、激
しく撹拌および冷却しながら、５００ｍＱの乾燥テトラ
ヒドロフラン中のジシクロへキシルカルボジイミド（１
３４，９９，０，６５４７モル）の溶液を加えた。

生成する溶液を室温において約１８時間撹拌した。

濾過によって固体を除去し、減圧下に溶媒を蒸発させて
油状物を得、それを２リツトルの無水エタノールから再
結晶して、白色の固体、融点６９〜７８℃、として、１
６０ｇ　（７６，３％）のＮ−フェニルメトキシカルボ
ニルサルコシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
を得た。

ＮＭＲ（ＣＤＣｌｓＭ　：２．７（Ｓ、４Ｈ，−Ｃ旦、
−ＧＨｚ−）、　２．０６（Ｓ、３Ｈ，−Ｎ−Ｃ旦ｓ）
、　４．３（Ｓ、２Ｈ，−Ｎ−Ｃ旦り、　５．０８（ｓ
　、　２Ｈ。

ベンジル）、７．３（Ｓ、５Ｈ，芳香族）；赤外（ＫＢ
ｒ）　：　２９４０〜３０７０ｃｍ−’　（脂肪族ｊ−
ｊ、ｌ−ヒ芳香族Ｃ−Ｈ）、１８３０−’（イミド）。

Ｃｒ５Ｈｒ。Ｎ２０．に対する 計算値：　Ｃ，５６，２５；　Ｈ，５，０３；　Ｎ、　
８．７５分析値：　Ｃ，５５，９３；　Ｈ，５，０６；
　Ｎ、　８．８５Ｃ，Ｎ−フェニルメトキシカルボニル
−サルコシンＮ６−フェニルメトキシカルボニルーし一
すシ７（ＣＢＺ−ＳＡＲ−ｔ−ＣＢＺ　　ＬＹＳ−ＯＨ
）の合成 実施例ＩＢからのＮ−７エニルメトキシカルポニルーサ
ルコシンーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ
＠−フェニルメトキシカルボニル−Ｌ−リシ７　（Ｓ　
ｉｇ＋＋＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｓ
　ｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから購入）（２２９，０，０７８６
モル）およびトリエチルアミン（２２ｒ１２％　１６９
．０．１５８モル）を４５０ｍ１２の乾燥テトラヒドロ
フランに加え、全体を室温において約１８時間撹拌した
。溶媒を減圧下に除去し、残渣を５００ｍ１２の酢酸エ
チル及び４００ｍＱの２Ｎ塩酸中で分配した。水相を分
離し、ｌｏｏｍαの酢酸エチルで抽出した。合せた酢酸
エチルフラクションを次いで２００ｍ１２ずつの２Ｎ塩
酸によって２回、２００ｍＱの水および２００ｍ１２の
飽和塩化ナトリウム溶液で２回ずつ洗浄したのち、無水
硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過による乾燥剤の除
去後に、減圧下に溶液から溶媒を除去し、残留物を９０
０ｍＱのアセトン−ヘキサン（１：３）と共に摩砕して
白色固体として２９．９ｙ　　（８２゜８％）のＮ−７
エニルメトキシカルポニルーサルコシルーＮ′−フェニ
ルメトキシカルボニル−し−リシンを得た。あるいは別
法において、摩砕しない固体の５００ｍ１２のトルエン
からの再結晶により、純粋な生成物が得られた。

ＮＭＲ（ＴＦＡ）Ｃ：　１．３〜２．２ＣＭ、６Ｈ，リ
シンのＭ、５Ｈ，リシンの−Ｎ−Ｃ旦２−およびサルコ
シンのＣ旦、−Ｎ　−）、　４．２５　（Ｓ　、　２Ｈ
。

― −Ｎ−ＣＨ！−Ｃ−）、４．７５（Ｎ、ＩＨ，−Ｎ−Ｃ
厘 Ｈ−Ｃ−）、５．２（５，４Ｈ，ベンジル）、　７．３
（Ｓ＋Ｍ、１２Ｈ，芳香族＋−Ｎ−Ｈ）；Ｉ　Ｒ（Ｋ　
Ｂ　ｒ）　：　３３３０ｃｍ−’　（アミドＮ−Ｈ）　
、　１６５０〜１７５０ｃｍ−’　、アミド（酸および
ウレタンＣ＝０）。（σ）　、”’＝２’　　（ｃ−１
，００゜ＨＯＡｃ） Ｃ□Ｈ３１Ｎ　３　Ｃ７に対する 計算値：　Ｃ，６１，８４；　Ｈ，６，４４；　Ｎ、　
８．６５分析値：　Ｃ，６１，０３；　Ｈ，６，４７；
　Ｎ、　８．６１実施例　■ Ｌ−グルタミン酸（４４ｇ、０．３モル）を２５０ｍｆ
ｆの無水メタノール中に懸濁させ、そ°の懸濁液を、そ
の中に乾燥ＨＣＩガスを吹込みながら、還流下に０．５
時間加熱すると、その時間の終りに、全物質が溶液中に
移行した。この溶液を還流下に更に約１８時間加熱した
のち、溶媒を減圧下に蒸発させた。生成する残留物に対
して２００ｍＱの水と３００ｍ＜２のクロロホルムを加
え、生成する混合物中に５ｇの酸化マグネシウムと１８
９のクロロギ酸ベンジルを添加しながら、室度において
急速に撹拌し、その後急速な撹拌を更に１０分間継続し
た。この添加とその後の１０分間の撹拌を、その後３回
繰返して、酸化マグネシウム（２０９，０，４９６モル
）とクロロギ酸ベンジル（７２ｇ、０．４２３モル）の
全部の添加を完了した。最後の添加後に、反応混合物を
１０分間ではなく１５分間撹拌した。有機層を分離して
、２００ｍ１２ずつの水で２回、２００ｍ１２ずつの０
゜５Ｎ塩基で２回、２００ｍ（＋ずつの水で更に２回、
２００ｍ１２ずつの０．５Ｎ水酸化ナトリウムによって
２回、最後に２００ｍａずつの水によって２回洗浄した
のち、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。

濾過により乾燥剤を除去したのち、減圧下に溶媒を除去
した。残留する油を予めアンモニアで飽和しであるメタ
ノール（５００ｍ＜２）中に溶解して、室温で６日間放
置した。生成する固体を濾過によって取出し、ＥｔＯＨ
から再結晶して、白色固体（１９，３５９、：ｌ’３％
）、８点１８９〜１９５℃を得た。

ＮＭＲ（Ｃ，Ｄ、Ｃ０ＩＤ）δ：４．３（Ｍ、ＩＨ，メ
チレフ）、５．１（Ｓ、２Ｈ，ベンジル）　、　７．３
（Ｓ　。

５Ｈ，芳香族）。

Ｉ　Ｒ（Ｋ　Ｂ　ｒ）　：　３４４０ｃｍ−’、　３３
２０ｃｍ−’および３２００ｃｍ−’　（アミドおよび
ウレタンＮ−Ｈ）。

１６５０ｃｍ−’　（アミド）　、　１５４０ｃｍ−’
（７ミｔ’）。

（α）　Ｄ２Ｌ　４’　ｓｗ　＋５°　（ｃ−２，０１
２，ＤＭＦ）ＣｌｓＨＩｔＮ　ｓｏ　４に対する 計算値：　Ｃ，５５，９１；　Ｈ，６，１４；Ｎ、　１
５．０４分析値：　Ｃ，５６，７６ｉ　Ｈ，６，２４；
　Ｎ、　１４．８８ＣＢＺ　　ＧＬＮ　　ＮＨ２の合成
のための別の方法１）１００ｍＩ２のテトラヒドロフラ
ン中の８．４°１ｇ　（３０ミリモル）のベンジロキシ
カルボニル−し−グルタミンおよび３．４５９　　（３
０ミリモル）のヒドロキシスクシンイミドの冷却溶液に
対して、撹拌しながら、６．１８９　　（３０ミリモル
）のジシクロへキシルカルボジイミドを加えた。全体を
１８時間撹拌したのち、室温まで放冷した。溶液を濾過
し、炉液を蒸発乾固させたのち、残留物を酢酸エチルか
ら再結晶した。得られた固体をアンモニアで飽和させた
７５ｍ１２のメタノール中に加熱と共に溶解したのち、
室温で１８時間放置した。かくして得られた固体を炉別
し、冷メタノールで洗浄したのち、９５％のエタノール
から２回再結晶して、１．８９の固体、融点１９１．５
〜１９５．５°Ｃ１を得た。ＮＭＲスペクトル、ＩＲス
ペクトル、旋光度および元素分析によって生成物を同定
し、純度を確認した。

２）１２５０ｒｎＱの無水メタノール中の２２０９　　
（１，４９５モル）のし−グルタミン酸の懸濁液を、還
流温度に加熱し且つその中に塩化水素を、溶解が達成さ
れるまで吹込んだ。その溶液を還流下に更に１８時間加
熱したのち、減圧下に蒸発させて、Ｌ−グルタミン酸の
塩酸塩を得た。この塩酸塩をｌＱの脱イオン水中に溶解
し且つ１．５αのクロロホルムを加えた。次いでこの溶
液に対して、３６０９　　（２，１１モル）の塩化ベン
ジルオキシカルボニルと１２０９　　（３モル）の酸化
マグネシウムを、１．２５時間の間隔で撹拌しながら加
え、更に３０分間撹拌を続けた。全体を濾過して、溶解
しなかった酸化マグネシウムをすべて除去し且つ炉液の
有機層を分離した。有機層を１．ＯＱの脱イオン水で２
回、１．０１２の０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で２
回、最後にｔ、Ｏ１２の脱イオン水で４回洗浄した。洗
浄した有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し且
つ蒸発乾固して、５００ｇの粗製固体生成物を得た。こ
の粗製固状物を２．０Ｑのメタノールと５００ｍ１１の
水酸化アンモニウムの混合物中に溶解し、室温でｌＯ日
間放置したのち、３日間冷蔵した。生成した固体を炉別
し、メタノールで洗浄し、真空下に乾燥したのち、１５
Ｑのイソプロパツールから再結晶して、１９８９の純粋
な生成物を得た。生成物の同定と純度を、ＮＭＲおよび
ＩＲスペクトル、旋光ならびに元素分析によって確認し
た。

実施例１１Ａにおいて製造したＮ−フェニルメトキシカ
ルボニル−し−グルタミンアミド（１３゜６ｇ、０．０
４７３モル）を、３００ｍ１２のメタノール中に懸濁さ
せた。この懸濁液に対して炭素上のパラジウム（１０％
、１．１９）を加えたのち、懸濁液を４５ｐｓ　ｉの水
素下に振とうした。

０．５時間後に、水素の吸収は、約０．０５モルの水素
に相当する４、５ｐｓｉであった。触媒を濾過によって
除き且つ５０ｍＱのメタノールで洗浄した。−緒にした
メタノール溶液に対して、実施例ＩＢにおいて製造した
ｌ’Ｊ−フェニルメトキシカルボニル−サルコシン− ンイミドエステル（１９．３６９、０．０６０５モル）
を加え、その反応混合物を室温で約１８時間撹拌した。

生成する固体を濾過によって取出し、メタノールで洗浄
したのち乾燥して、１４．９ｇ（９０％）のＮ−フェニ
ルメトキシカルボニル−サルコシル−し−グルタミンア
ミド；融点１８６〜１９６°Ｃ１　を得た。

ＮＭＲ（ＣＤ，Ｃｏ，Ｄ）δ：　２．３（グルタミンの
Ｍ。

ＩＨ，−Ｃ旦，−ｃ旦り．　３．０（Ｓ，　３Ｈ，　−
Ｎ雪 一Ｃ旦３）、　４．１（Ｓ．　２Ｈ，　Ｎ−Ｃ旦，−Ｃ
−）。

４、６（Ｍ．　　ＩＨ　、　　−Ｎ−Ｃ　　Ｈ−Ｃ−）
、　　５．１５（Ｓ　　。

２Ｈ，ベンジル）、　７．３（Ｓ　、　５Ｈ　、芳香族
）；Ｉ　Ｒ　（Ｋ　Ｂｒ）　　：　３４１０ｃｍ−’．
　３２９０ｃ＋ａ−’および３２２０ｃｍ−　’および
３２２０ｃｍ−　’。（アミドおよびウレタン−Ｎ−Ｈ
）　、　１７００ｃｍ−’　（ウレタンカルボニル）　
、　１６５０ｃｍ−’および１６２５ｃｍ−”　（アミ
ドカルボニル）。

（ａ）ｏ”’ー＋２３ー３°　（ｃ−１．０３２．　Ｄ
ＭＦ）Ｃ１。Ｈ　！　２　Ｎ　４　０　Ｂに対する計算
値：　Ｃ．　５４．８５；　Ｈ．　６．３３；　Ｎ．　
１５．９９分析値：　Ｃ，　６４．６２；　Ｈ．　６．
２３；　Ｎ，　１５．５６Ｃ．サルコシル−し−リシル
−サルコシル−Ｌ一実施例１［Ｂにおいて製造したＮ−
フェニルメトキシカルボニル−サルコシル−し−グルタ
ミンアミド（１７．４９、０．０４９７モル）を、２ｇ
のｌＯ％Ｐｄ／Ｃと共に、３７０ｍ１２のジメチルホル
ムアミド中に懸濁させ且つその中に水素ガスを６時間吹
込んだ。濾過によって触媒を除去したのちに、■ーヒド
ロキシベンゾトリアゾール（１３、４ｇ、０．１０モル
）と実施例ＩＤで製造したＮ−フェニルメトキシカルボ
ニル−サルコシル−Ｎ’−フェニルメトキシカルボニル
−し−リジン（２４ｇ、０．０４９７モル）を炉液に加
え、生ずる溶液を水浴中で冷却した。次いでジシクロへ
キシルカルボジイミド（１０．２４ｇ、０．０５０５モ
ル）を加え、生ずる混合物を冷却せずに終夜撹拌し、そ
れによって混合物の温度は徐々に室温まで上昇した。

懸濁液を一過し、濾液から減圧下に溶媒を除去した。濾
液からの残留物を塩化メチレン中に溶解し、−２０℃に
１８時間冷却し、濾過し、炉液を減圧下に蒸発させて、
アミノ−ブロックしたテトラペプチドアミドを得た。

次いでこの物質を３００ｍＱの５０％含水酢酸中に溶解
し、２．５９のｌＯ％Ｐｄ／Ｃの存在において、４０ｐ
ｓ　ｉの水素下に還元した。２．５時間後に、水素の吸
収は約５ｐｓｉとなった。濾過による触媒の除去後に、
炉液を凍結乾燥して不純な生成物を得、それを次のよう
にして精製した。

この不純な固体を０．５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ６
，５０）中で充てんした５Ｐ−Ｃ−２５樹脂の５Ｘ８０
ｃｍクロマトグラフィーカラム（空隙容量５６０ｒｒｌ
）上でクロマトグラフィーにかけて、２Ｑの０．５Ｍ酢
酸アンモニウム（ｐＨ６゜５０）と２Ｑの０．８Ｍ酢酸
アンモニウム（ｐＨ６，５０）の線形グラジェントによ
って溶離した。

流速を１５０ｍＱ／時間とし、１５ｒｒｌずつのフラク
ションを集めた。７ラクシヨン番号１６０〜２００を集
めて凍結乾燥したのち、得られた固体を上記と同一の条
件下に再びクロマトグラフィーにかけて、フラクション
番号８１〜３２０を集めて凍結乾燥した。

次いで生成物を、ｎ−ブタノーノ呟酢酸および水の４：
ｌ：５の混合物の下方の相中でよく充てんしたＧ−２５
樹脂の分配カラム上でクロマトグラフィーにかけ、且つ
この混合物の上相で溶離した。カラムの大きさは５Ｘ８
３ｃｍであり、流速を１００ｍ１２／時間として、２Ｑ
ｍＱずつのフラクションを集めた。フラクション番号５
１〜２４０．２４１〜３４０および３４１〜５２０を別
々に集めて蒸発させることにより、それぞれ、４ｇ、５
．４ｇおよび３．８ｇの生成物を得た。これらの３生成
物をそれぞれ前記の分配カラム上で別々にクロマトグラ
フィーにかけ、得られる７ラクシヨンを、シリカゲル板
と４：２：３：１のｎ−ブタノール／酢酸／水／ピリジ
ンから成る溶媒系を使用する薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）によって監視した。上記のようにして得られた
３生成物のそれぞれに対する純粋な生成物を含有する７
ラクシヨン（約３４０〜４２０の番号）を集めて蒸発さ
せた。

かくして得た残留物を５００ｍ＋２の無水エチルアルコ
ール中に溶解し、塩化水素ガスで飽和させた１００ｍα
の無水エチルアルコールの添加によって沈殿させたのち
、５００ｍ１２の無水エーテルで処理した。生ずる固体
を炉別し、エーテルで洗浄したのち、減圧下に乾燥して
、白色固体として、７．８１９のサルコシル−し−リシ
ル−サルコシル−し−グルタミンアミド・二塩酸塩を得
た。

薄層クロマトグラフィー＝　（シリカゲルプレート）溶
媒　　　　　　Ｒｆ ｎ−ブタノール／ＣＨ，Ｃ０ＯＨ／Ｈ，０／ピリジン４
　／　２　／　３　／　Ｉ　　　　　　　　Ｏ，４８Ｃ
ＨＣＩ　ｓ　／　Ｍ　ｅ　ＯＨ／　Ｎ　Ｈａ　ＯＨ（濃
）３０／２５／　Ｉ　Ｏ０，４２ ｎ−ブタノール／　ＣＨｓ　ＣＯＯＨ／　Ｈｘ　Ｏ／ピ
リジンｌ　５／３／ｌ　２／ｌ　０　　　　０．２７ｎ
−ブタノール／ＣＨ，Ｃ０ＯＨ／ ＥｔＯＥｔ／Ｈｚ０１／　ｌ／　ｌ／　ｌ　　　０１１
２ｎ−ブタノール／　ＣＨｓ　ＣＯＯＨ／Ｈ８０（上層
）４／１１５　　　　　　　　０．０２アミノ酸分析：
サルコシン（２，１９）　、グルタミン（１，０３）　
、リシン（１，００）士。

Ｎ　Ｈ，（２，０１）　、　８０．４％ペプチド分析：
　ＣＩ−’　：　１４．８９％；　ＨｘＯ：　４−９２
％［ａｌ　。”’−−１４，８＠（ｃ−０，２０２２，
０，１Ｎ　ＨＣｌ） 精製のための別の方法は、アルキルシラン基質を用いる
逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。もつと
も簡単なものと認められた精製方法は、前記のような、
脂肪族アルコール、低級アルカン酸（ギ酸を含む）およ
び水から成る溶離剤を用いるシリカゲル上のクロマトグ
ラフィーを包含スル。１００９のマレンクロットシリカ
−（Ｍａｌｅｎｋｒｏｄｔ　Ｓ　１ｌｉｃａｒ）　ＣＣ
７シリカゲル上で１０９の不純なテトラペプチドを精製
するために、好適なｎ−ブタノール：酢酸：水（ｌ　Ｏ
：　２　：　５）溶離剤を用いた。１５ｒｒｌずつの７
ラクシヨンを採取した。フラクション５０〜９５は、３
０：２５：ｌＯの比のクロロホルム：メタノール：水酸
化アンモニウムを使用し且つニンヒドリンで発色させる
シリカゲルプレート上の薄層クロマトグラフィーによっ
て測定するとき、純粋なテトラペプチドを含有すること
が認められた。

テトラペプチドは保護したテトラペプチドを保護基の除
去前に再結晶することによって、純粋な状態で得ること
ができる。不純な保護したテトラペプチドの２８９の試
料を、６００ｒｒｌの酢酸エチルと７０ｍｍのメタノー
ルの混合物からの再結晶によって精製した。この生成物
は薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール
；９：ｌ。

Ｒｒ−０，７２）および元素分析によって、本質的に純
粋であった。ＮＭＲスペクトルは帰属した構造と一致し
た。

実施例　■ 上記実施例■Ｃで製造した純粋なＨ−３ＡＲ−Ｌ　Ｙ　
Ｓ　　Ｓ　Ａ　Ｒ−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｎ　Ｈｚを、前記の
１９７８年１１月１７日出願の米国特許願第９６０゜５
５０号の実施例■に記載のマウス誘発分析で試験した。

前記実施例Ｉおよび■において製造したこのテトラペプ
チドアミドは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
）固相合成法に従って製造した材料と同一の活性を示し
た。

特許出願人　オーツ・７アーマシユーチカル・コーポレ
ーション 手続補正書（ハ） 平成１年１月３１日 特許庁長官　吉　１）文　毅　　殿 ■、事件の表示 昭和６３年特許願第１１８３９８号 ２、発明の名称 ジペプチド ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　オーツ・ファーマシューチカル・コーポレーショ
ン ４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　昭和６３年９月２７日（発送口）
６、補正の対象 明細書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 Ｈ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２ のジペプチド。