AT388918B

AT388918B - Aminosaeure-oobt-ester

Info

Publication number: AT388918B
Application number: AT259487A
Authority: AT
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-10-08
Filing date: 1987-10-08
Publication date: 1989-09-25
Also published as: ATA259487A

Description

Für die Synthese von Peptiden nach der klassischen Lösungsmittelmethodik insbesondere aber nach der Festphasenmethode (B. Merrifield, Adv. Enzymol. 32. [1969] 221-296) ist es günstig bei der Kupplungsreaktion statt der in situ Aktivierung mit einem Aktivierungsreagenz, wie z. B. Carbodiimiden, schon eine aktivierte Spezies wie symetrische Anhydride oder Aktivester einzusetzen. Dadurch wird insbesondere bei der Festphasensynthese der Kontakt der reaktiven Aminogruppe der an das Trägerharz gebundenen Aminosäure mit dem Aktivierungsreagenz vermieden. Die Verwendung der symmetrischen Anhydride hat jedoch den Nachteil, dass diese in vielen Fällen nicht isolierbar sind und man zum anderen von vornherein die doppelte Menge an Aminosäurederivat einsetzen muss.

Lange bekannt ist die Verwendung von N-Hydroxysuccinimid-, Trichlorphenyl- oder Nitrophenylestern.

Die Hydroxysuccinimidester sind für die Festphasensynthese nicht reaktiv genug, was zu sehr langen Cycluszeiten führt, die Trichlorphenylester sind wegen des Dioxinproblems umstritten und die Nitrophenylester sind häufig nicht gut isolierbar und racemisierungssicher.

In neuerer Zeit wurden auch häufig die Pentalfluorphenylester eingesetzt, diese sind jedoch zum Teil schlecht zugänglich oder schwierig zu reinigen. Bei der Anwendung in der Festphasensynthese ist ausserdem zum Erreichen einer schnellen Reaktion der Zusatz von HOBt unerlässlich.

Es wurden neue HOObt-Ester gefunden, die sich ausgezeichnet zur Peptidsynthese durch Fragmentkupplung insbesondere mittels der Festphasenmethode eignen.

Die Erfindung betrifft daher Aminosäurederivate der Formel
X-A-OObt in welcher X Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), A Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys (tBu),
Cys (Acm), Met, Pro, Lys (Boc), Asp (OtBu),
Glu (OtBu), Phe, Tyr (tBu), Trp, Lys (Z),
Lys (Bzl) oder Cys (4-MeOBzI), jeweils in ihrer L- oder ihrer D-Form und OObt 4-0xo-3, 4-dihydro-1, 2, 3-benzotriazin-3-yloxy bedeuten.

Die hier beschriebenen neuen HOObt-Ester bieten den Vorteil, dass sie sehr rein zu erhalten und gut lagerstabil sind. Das bei der Reaktion freigesetzte HOObt kann aufgrund seiner Farbe zudem als Indikator für das Fortschreiten der Reaktion herangezogen werden. Weiterhin sind die hier beschriebenen Ester in den für die Festphasensynthese herangezogenen Lösungsmitteln (Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMA), N-Methylpyrrolidon (NMP)) gut löslich im Gegensatz zu den freien FmocAminosäuren, was vorteilhaft ihre Verwendung in Peptidsyntheseautomaten ermöglicht.

Die Verbindungen der Formel X-A-OObt können hergestellt werden, indem man Verbindungen der
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Lösungsmittel, wie THF, DMF, Chloroform, Methylenchlorid, Acetonitril oder deren Gemische geeignet ; bevorzugt ist Ether wie THF. Man führt die Umsetzung bei -20 bis +50 C, vorzugsweise bei-10 C bis etwa Raumtemperatur durch.

Bei der Verwendung der neuen Aminosäurederivaten der Formel X-A-OObt zur Herstellung von Peptiden mittels Fragmentkupplung in Lösung wird ein gegebenenfalls geschütztes Fragment in Gegenwart von HOObt mit einer Verbindung der Formel X-A-OObt in einem geeigneten inerten Lösungsmittel bei -20 bis +50 C, vorzugsweise bei 0 C bis Raumtemperatur umgesetzt. Geeignet sind beispielsweise die oben genannten Lösungsmittel, vorzugsweise DMF. Argininhaltige Fragmente können in Form ihrer besser löslichen Perchlorate eingesetzt werden, die zweckmässig durch Zugabe von Pyridiumperchlorat zum Reaktionsgemisch in situ hergestellt werden.

Nach beendeter Reaktion werden gewünschtenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen in an sich bekannter Weise abgespalten.

Die Festphasensynthese beginnt am C-terminalen Ende des Peptids mit der Kupplung einer geschützten Aminosäure an ein entsprechendes Harz. Derartige Ausgangsmaterialien können durch Verknüpfung einer geschützten Aminosäure mit einem mit einer Chlormethyl-, Hydroxymethyl-, Benzhydrylamino (BHA)-, Methylbenzhydrylamino (MBHA)-Gruppe modifiziertem Polystyrol- oder Polyacrylamid-Harz über eine Ester- bzw. Amidbindung erhalten werden. Die als Trägermaterial verwendeten Harze sind kommerziell erhältlich. BHA-und MBHA-Harze werden für gewöhnlich verwendet, wenn das synthetisierte Peptid am C-Terminus eine freie Amidgruppe enthalten soll. Falls das Peptid eine sekundäre Amidgruppe am C-terminalen Ende enthalten soll wird ein Chlormethyl- bzw.

Hydroxymethyl-Harz verwendet und die Abspaltung mit dem entsprechenden Amin durchgeführt. Sollen im Peptid die tert.-Butyl-Schutzgruppen der Aminosäure Seitenkette erhalten bleiben, so wird die Synthese mit der Fmoc-Schutzgruppe zur temporären Blockierung der Alfa-Amino-Gruppe der Aminosäure unter Verwendung der z. B. bei R. C. Sheppard, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1982. 587 beschriebenen Methodik durchgeführt, wobei die Guanidino-Funktion des Arginins vorzugsweise durch Protonierung mit Pyridinium-Perchlorat geschützt wird und der Schutz der anderen in der Seitenkette funktionalisierten

Aminosäuren mit durch katalytische Transferhydrierung (A. Felix et al. J. Org. Chem. 13. 4194 (1978) oder mit Natrium in flüssigem Ammoniak (W. Roberts, J.

Am. Chem. Soc. 26, 6203 (1954) abspaltbaren Benzylschutzgruppen erfolgt
Nach Abspaltung der Aminoschutzgruppen der an das Harz gekuppelten Aminosäure mit einem geeigneten Reagenz, wie z. B. Trifluoressigsäure in Methylenchlorid im Falle der Boc-Schutzgruppe oder einer 20 %igen Lösung von Piperidin in Dimethylformamid im Falle der Fmoc-Schutzgruppe, werden die nachfolgend geschützten Aminosäuren nacheinander in der gewünschten Reihenfolge aufgekuppelt
Die intermediär entstehenden N-terminal geschützten Peptidharze werden vor der Verknüpfung mit dem nachfolgenden Aminosäurederivat durch die vorbeschriebenen Reagenzien entblockiert.

Zur Voraktivierung von Aminosäurederivaten in situ können alle möglichen in der Peptidsynthese verwendeten Aktivierungs-Reagenzien, siehe z. B. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band 15/2, verwendet werden, insbesondere aber Carbodiimide wie z. B. N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N, N'Diisopropylcarbodiimid oder N-Ethyl-N - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid. Die Kupplung kann dabei direkt durch Addition von einem Aminosäurederivat der Formel X-A-OObt oder eines in situ voraktivierten Aminosäurederivats und gegebenenfalls eines die Racemisierung unterdrückenden Zusatzes wie z. B. 1-
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durchgeführt werden.

Die Kupplung bzw. Aktivierung der Aminosäurederivate mit einem der oben genannten Aktivierungsreagenzien kann in den oben genannten Lösungsmitteln vorzugsweise in Dimethylformamid oder Methylenchlorid oder einer Mischung aus beiden durchgeführt werden. Die Temperatur beträgt-20' bis +50 C, vorzugsweise 0 C bis etwa Raumtemperatur. Das aktivierte Aminosäurederivat wird üblicherweise in einem 1, 5 bis 4 fachen Überschuss eingesetzt. In Fällen, in denen eine unvollständige Kupplung eintritt, wird die Kupplungsreaktion wiederholt, ohne vorher die für die Kupplung der nächstfolgenden Aminosäure nötige Entblockierung der Alfa-Aminogruppe des Peptidharzes durchzuführen.

Der erfolgreiche Ablauf der Kupplungsreaktion kann beispielsweise mittels der Ninhydrin-Reaktion, wie z. B. von E. Kaiser et al. Anal. Biochem. 34 595 (1970) beschrieben, überprüft werden. Die Synthese kann auch automatisiert z. B. mit einem Peptid-Synthesizer Modell 430A der Fa. Applied Biosystems durchgeführt werden, wobei entweder die vom Gerätehersteller vorgesehenen Syntheseprogramme oder aber auch vom Benutzer selbst erstellte verwendet werden können. Letztere werden insbesondere bei der Verwendung von mit der Fmoc-Gruppe geschützten Aminosäurederivaten eingesetzt
Nach Synthese der Peptide in der vorgehend beschriebenen Weise kann das Peptid vom Harz mit Reagenzien, wie z. B. Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Diese Reagenzien spalten nicht nur das Peptid vom Harz sondern auch die weiteren Seitenkettenschutzgruppen der Aminosäurederivate. Auf diese Weise erhält man ausser bei der Verwendung von BHA-und MBHA-Harzen das Peptid in Form der freien Säure. Bei den BHA- bzw. MBHA-Harzen erhält man bei der Spaltung mit Fluorwasserstoff das Peptid als Säureamid. Will man z. B. das Ethylamid erhalten, kann das Peptid mit Ethylamin vom Harz abgespalten werden, wobei die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen nachfolgend durch andere geeignete Reagenzien, wie z.

B. die oben genannten erfolgt
Bei der Abspaltung mit Fluorwasserstoff und Trifluoressigsäure werden als Kationenfänger üblicherweise Substanzen, wie Phenol, Kresol, Thiokresol, Thioanisol, Dimethylsulfid, Ethylmethylsulfid oder eine Mischung von zwei oder mehr dieser Hilfsmittel zugesetzt. Die Trifluoressigsäure kann dabei auch durch geeignete Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid verdünnt angewendet werden. Falls die tert.-Butyl bzw. Benzylseitenketten-Schutzgruppen der Peptide erhalten bleiben sollen, wird die Abspaltung des an einem besonders modifizierten Trägerharz synthetisierten Peptides mit 1 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid durchgeführt, wie z. B. bei R. C. Sheppard J. Chem. Soc., Chem. Comm. j 2, 587 beschrieben. Sollen einzelne terL-Butyl bzw.

BenzylseitenkettenSchutzgruppen erhalten bleiben, so verwendet man eine geeignete Kombination der Synthese- und Abspaltmethoden.

Für die Synthese von Peptiden mit einer C-terminalen Amidgruppierung oder einer tj-Amino- bzw. j- Guanidinoalkylgruppierung wird ebenfalls das von Sheppard beschriebene modifizierte Trägerharz verwendet. Nach der Synthese wird das in der Seitenkette voll geschützte Peptid vom Harz abgespalten und anschliessend in klassischer Lösungssynthese mit dem entsprechenden Amin bzw. -Aminoalkylamin oder W-Guanidinoalkylamin umgesetzt, wobei gegebenenfalls vorhandene weitere funktionelle Gruppen in bekannter Weise temporär geschützt werden können.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne dass diese darauf beschränkt wäre.

A. Herstellung der OObt-Ester Beispiel 1: Fmoc-Ile-OObt
50 mMol Fmoc-Ile-OH werden zusammen mit 50 mMol HOObt in 100 ml trockenem THF gelöst oder suspendiert und bei 0 C 55 mMol Dicyclohexylcarbodiimid eingetragen. Man lässt über Nacht reagieren, saugt dann vom ausgefallenen Dicyclohexylhamstoff ab und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst und im Eisbad abgekühlt. Dabei fällt noch weiterer Harnstoff aus. Man filtriert erneut und entfernt das Lösungsmittel zuletzt im Hochvakuum. Der Rückstand wird mit Petrolether verrieben, abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet.

Der erhaltene Aktivester wird mittels DC (Kieselgel mit Essigester als Laufmittel) und HPLC ( (R) Vydac C18-Säule mit einem Gradienten von 40 % A [80 % Acetonitril/Wasser mit 0, 1 % Trifluoressigsäure] auf 90 % A in 0, 1 % wässriger Trifluoressigsäure innerhalb 30 Minuten) auf ihre Reinheit überprüft.

Ausbeute : 15, 5 g, [Alfa]20D = -93,5 (c = 1, DMF) In analoger Weise wurden folgende Aktivester erhalten : Beispiel 2 : Fmoc-Leu-OObt
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Fp. 159-161 C (aus Diisopropylether und wenig Isopropanol) [Alfa] 20D=-144,5 (c = 1, DMF) Beispiel 5 : Fmoc-GlufOtBut-OObt Fp. ab 95 C (Zersetzung; umkristallisiert aus Isopropanol) [Alfa] 20D = -94, 50 (c = 1, DMF) Beispiel 6 : Fmoc-Gly-OObt Fp. 149-151 C (aus Diisopropylether und wenig Isopropanol) Beispiel 7 : Fmoc-Ala-OObt Fp. 152-154 C, [Alfa] 20D=-158 (c = 1, DMF)

Beispiel S : Fmoc-Cys (tBu)-OObt Fp. ab 980 (Zersetzung, umkristallisiert aus CH2Cl2/Ether/Diisopropylether) [Alfa] 20D = -150, 20 (c = 1, DMF) Beispiel 9:

Fmoc-Val-OObt Fp. 114-1160 C, [Alfa] 20D = -136, 9 (c = 1, DMF) Beispiel 10 : Fmoc-Lys (Boc)-OObt Fp. ab 150 C, Zersetzung (aus Essigester/Diisopropylether) [Alfa] 20D = -37, 10 (c = 1, DMF) Beispiel 11: Fmoc-Phe-OObt Fp. 187-189 (aus CH2Cl2/Ether), [Alfa] 20D = -113, 70 (c = 1, DMF) Beispiel 12 : Fmoc-Tyr (tBu)-OObt [Alfa] 20D = 350 (c = 1, DMF) Beispiel 13: Fmoc-Cvs (4-MeOBzl)-OObt
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(aus B1Lösungssynthese Vorschrift l : Fmoc-Leu-Arg-OH
In einer Mischung aus 1, 74 g L-Arginin, 1, 63 g HOObt und 1, 79 g Pyridiniumperchlorat in 50 ml Dimethylformamid gibt man bei Raumtemperatur 5 g Fmoc-Leu-OObt.

Man rührt 3 Stunden bei Raumtemperatur und lässt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Die klare Lösung wird eingeengt und der Rückstand mit Wasser versetzt. Mit wässriger NaHCO3-Lösung wird ein pH von 7 eingestellt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Ausbeute : 4, 7 g, Fp. 14-155 C (unter Zersetzung), [Alfa] 23D = -18, 50 (c = 1, Methanol)

112 Festphasensynthese Vorschrift 2 : H-Val-Gln-Ala-Ala-ne-Asp-Tvr-He-Asn-GIv-OH
Die Synthese des obigen Decapeptids (ACP 65-74) erfolgte an einem mit Glycin beladenen Pam-Harz der Fa. Applied Biosystems unter Verwendung der erfindungsgemässen HOObt-Ester. Die Synthese wurde mit einem automatischen Peptid-Synthesizer Modell 430A der Fa. Applied Biosystems durchgeführt Dazu wurde jeweils l mMol Fmoc-Val-OObt, Fmoc-Ala-OObt, Fmoc-Ile-OObt, Fmoc-Asp (OtBu)-OObt und Fmoc-Tyr (tBu)-OObt in die vom Hersteller gelieferten Cartridges eingewogen.

Fmoc-Gln-OH und FmocAsn-OH wurden zusammen mit 1,5 Mol HOBT in diese Cartridges eingewogen. Die Voraktivierung dieser Aminosäuren erfolgte direkt in den Cartridges durch lösen in 4 ml DMF und Zugabe von 2 ml einer 0, 55 M Lösung von Diisopropylcarbodiimid in DMF. Die HOObt-Ester wurden in 6 ml DMF gelöst und dann ebeso wie die in situ voraktivierten Aminosäuren Glutamin und Asparagin auf das vorher mit 20 % Piperidin in DMF entblockierte Harz gepumpt. Zur Synthese wurde 0,5 Mol Gly-Harz eingesetzt und Glutamin und Asparagin doppelt gekuppelt.

Nach beendeter Synthese wurde das Peptid mit einer 10 : 1 Mischung von Trifluoressigsäure und Trifluormethansulfonsäure unter Zusatz von m-Kresol und Thioanisol als Kationenfänger vom Harz abgespalten und das Rohpeptid an (R) Sephadex G25 mit 10 %iger Essigsäure als Elutionsmittel entsalzt. Die peptidhaltigen Fraktionen wurden vereinigt und die Reinheit und Identität des Produktes mittels HPLC überprüft.

Claims

PATENTANSPRUCH Aminosäurederivat der Formel X-A-OObt in welcher X Fmoc, A Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys (tBu), Cys (Acm), Met, Pro, Lys (Boc), Asp (OtBu), Glu (OtBu), Phe, Tyr (tBu), Trp, Lys (Z), Lys (Bzl) oder Cys (4-MeOBzl), jeweils in ihrer L- oder ihrer D-Form und OObt 4-0xo-3, 4-dihydro-1, 2, 3-benzotriazin-3-yloxy bedeuten.