DE69604759T2 - N alpha-2-(4-nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl-aminosäuren - Google Patents
N alpha-2-(4-nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl-aminosäurenInfo
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Description
- Das Gebiet der Erfindung betrifft geschützte Aminosäure-Derivate für die Festphasen- Peptidsynthese, nämlich Nα-2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonylaminosäuren mit der allgemeinen Formel I:
- in der R&sub1; ein Wasserstoffatom darstellt und R&sub2; Isopropyl, 2-Methylpropyl, 2-Methylthioethyl, Benzyl, Carboxamidomethyl, 2-Carboxamidoethyl, 4-tert-Butoxybenzyl, Indolyl-3-methyl, S-(Triphenylmethyl)thiomethyl, 1-(Triphenylmethyl)imidazolyl-4-methyl, 3-(NG-Mesitylensulfonyl)- guanidinopropyl, N-Xanthylcarboxamidomethyl, 2-(N-Xanthylcarboxamido)ethyl oder S-(Acetamidomethyl)thiomethyl darstellen kann;
- oder R&sub1; und R&sub2; zusammen einen Propylenrest darstellen;
- welche als Nα geschützte Aminosäure-Derivate für die Festphasen-Peptidsynthese verwendet werden.
- Die Festphasen-Peptidsynthese wird in breitem Umfang für die Herstellung von biologisch aktiven Peptiden verwendet, die in der medizinischen und biologischen Forschung und auch als aktive Substanzen in der Pharmazie, Veterinärmedizin und bei der Diagnostik verwendet werden.
- Der wesentliche Kern der Festphasen-Peptidsynthese kann als schrittweise Verlängerung der Peptidkette mittels wiederholter Zyklen von chemischen Reaktionen, beginnend mit der ersten C-terminalen Aminosäure, die an einem unlöslichen Träger angebracht ist, umrissen werden. Im Verlauf der Synthese bleiben die Ziel-Produkte aller Reaktionen an den Träger gebunden, während überschüssige Reaktanten und Nebenprodukte durch Filtration und Waschen des Trägers entfernt werden.
- Um die Festphasen-Synthese eines Peptids durchzuführen, wird die erste Aminosäure (C-Terminus der Ziel-Aminosäuresequenz) mit der geschützten α-Aminogruppe durch die freie α-Carboxylgruppe mittels Ester- oder Amid-Bindungsbildung kovalent an einen unlöslichen polymeren Träger geknüpft. Dann wird die Nα-Schutzgruppe selektiv von dem so erhaltenen Nα-geschützten Aminoacyl-Polymer abgespalten, und das Aminoacyl-Polymer mit der freien α-Aminogruppe wird gebildet. Dieses Polymer wird weiter mit der nächsten Nα geschützten Aminosäure acyliert, was so ein Nα-geschütztes Dipeptidyl-Polymer ergibt. Derartige synthetische Zyklen, die aus Nα-Schutzabspaltung und anschließender Acylierung der freien Aminogruppe mit einer folgenden Nα-geschützten Aminosäure bestehen, werden wiederholt, bis die Zusammenstellung der Ziel-Aminosäuresequenz beendet ist.
- In der praktischen Festphasen-Synthese werden üblicherweise große molare Überschüsse (2- bis 10-fach) an Acylierungsreagenzien verwendet, um eine vollständige Umwandlung sicherzustellen, deshalb sollten alle reaktiven Gruppen in Seitenketten der Aminosäuren, wie Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Thiol-, Guanidinogruppen, mit geeigneten Schutzgruppen blockiert sein. Die Schutzgruppen für diesen Zweck müssen sorgfältig gewählt werden, um für einen zuverlässigen und dauerhaften Schutz der Seitenketten unter den Bedingungen der Peptidyl-Polymer-Acylierungen und bei der Abspaltung von temporärem Nα- Schutz zu sorgen. Andererseits müssen diese Seitenketten-Schutzgruppen für die Möglichkeit sorgen, daß das synthetisierte Peptid in ein oder zwei Stufen quantitativ und ohne Beschädigung seiner Struktur von den Schutzgruppen befreit werden kann. In den meisten Fällen sollte gleichzeitig auch die Peptidyl-Polymer-Verknüpfung gespalten werden. Es ist offensichtlich, daß die Struktur und die chemischen Eigenschaften von dauerhaften Schutzgruppen für die Seitenketten von Aminosäuren nicht nur durch die Natur der zu schützenden reaktiven Funktion, sondern auch in großem Ausmaß durch die Struktur und die chemischen Eigenschaften der verwendeten temporären Nα-Schutzgruppe bestimmt werden. Deshalb ist der temporäre Nα-Schutz das Schlüsselelement der gesamten Strategie der Festphasen-Peptidsynthese.
- Wohlbekannt und in der Festphasen-Peptidsynthese in großem Umfang verwendet sind Nα-tert-Butoxycarbonylaminosäuren (Boc-Aminosäuren), die für diesen Zweck von R. B. Merrifield in Biochemistry, 1964, Bd. 3, S. 1385, beschrieben werden. Die tert-Butoxycarbonyl- (Boc)-Gruppe kann durch die Wirkung von sauren Reagenzien mit mittlerer Stärke, wie beispielsweise Trifluoressigsäure und ihren Lösungen in chlorierten Kohlenwasserstoffen, Lösungen von Chlorwasserstoff in organischen Lösungsmitteln, Bortrifluorid/Diethylether- Komplex und einiger anderer Säuren, unter Bildung von Isobutylen und Kohlendioxid abgespalten werden.
- Zusammen mit dem temporären Nα-Boc-Schutz werden für die dauerhafte Blockierung von Seitenketten Schutzgruppen verwendet, die bei der Nα-Boc-Abspaltung stabil sind, die aber durch stärker saure Reagenzien unter gleichzeitiger Spaltung der Peptidyl-Polymer- Bindung abgespaltet werden können. Bekannte Reagenzien, die für diesen Zweck verwendet werden, sind flüssiger Fluorwasserstoff, Trifluormethansulfonsäure und deren Mischungen mit Anisol, Thioanisol, Dimethylsulfid. Der Hauptnachteil der Synthesestrategie unter Verwendung von temporärem Nα-Boc-Schutz ißt die Anwendung von Acidolyse für die Spaltung von sowohl temporären als auch dauerhaften Schutzgruppen, die nicht für eine vollständige Stabilität des dauerhaften Schutzes sorgen kann. Mit dem Wachsen der Länge des synthetisierten Peptids unterliegen die dauerhaften Schutzgruppen der kumulativen Wirkung von sauren Reagenzien während der Boc-Abspaltungsschritte, welche einen teilweisen Verlust dieser Gruppen und eine Akkumulation von Nebenprodukten zur Folge haben kann. Abgesehen davon kann die Endbehandlung des zusammengestellten Peptidyl-Polymers mit supersauren Reagenzien eine teilweise Zerstörung des Ziel-Peptids verursachen. Es sollte auch erwähnt werden, daß die extrem gefährlichen Eigenschaften von Supersäuren spezielle Geräte und geeignete Sicherheitsmaßnahmen bei der Handhabung erfordern.
- Um die Verwendung von supersauren Reagenzien für die End-Peptid-Schutzgruppenabspaltung zu vermeiden, wurden in jüngerer Zeit mehrere hoch Säure-empfindliche Gruppen als temporärer Nα-Schutz vorgeschlagen, der als kompatibel mit dem dauerhaften Seitenketten-Schutz vom sogenannten tert-Butyl-Typ angesehen wird, welcher durch saure Reagenzien mittlerer Stärke abspaltbar ist. Ein Beispiel für eine derartige Nα-Schutzgruppe ist die 1-(3,5-Di-tert-butylphenyl)-1-methylethoxycarbonyl(t-Bumeoc)-Gruppe, die in Collect. Czech. Chem. Commun., 1992, Bd. 57, S. 1707 beschrieben ist. Die Nα-t-Bumeoc-Gruppe wird durch 1%ige Trifluoressigsäure in Dichlormethan abgespalten und kann zusammen mit dauerhaften Schutzgruppen vom t-Butyl-Typ verwendet werden, welche durch reine Trifluoressigsäure oder deren konzentrierte Lösungen abspaltbar sind. In diesem Fall ist die Verwendung von Supersäuren vermieden, aber das allgemeine Prinzip der differentiellen Acidolyse bleibt immer noch unverändert.
- Ein verschiedener Ansatz für die Strategie der Festphasen-Peptidsynthese wird von R. B. Merrifield in Science, 1986, Bd. 232, S. 341, umrissen. Dieser Ansatz, als "Orthogonalitätsprinzip" bezeichnet, beruht auf der Annahme, daß temporäre und dauerhafte Schutzgruppen gemäß völlig unterschiedlichen chemischen Mechanismen durch völlig unterschiedliche Reagenzien entfernbar sein sollten, so daß ein temporärer Nα-Schutz mit absoluter Selektivität abgespalten werden könnte, was für eine volle Beibehaltung des dauerhaften Schutzes sorgen würde, und umgekehrt. Derzeit wird das "Orthogonalitätsprinzip" übereinstimmend als Richtschnur für die Entwicklung von effizienten Strategien der Festphasen-Peptidsynthese akzeptiert.
- Als ein Beispiel für die Verwirklichung des "Orthogonalitätsprinzips" wird in Int. J. Peptide and Protein Res., 1987, Bd. 30, S. 740 die Verwendung von Nα- Dithiasuccinylaminosäuren (Dts-Aminosäuren) in der Festphasen-Synthese beschrieben. Die Nα-Dithiasuccinyl(Dts)-Schutzgruppe ist gegen saure Reagenzien mittlerer Stärke ziemlich beständig und wird glatt durch Thiol-Reagenzien in neutralen Medien unter Freisetzung der Aminogruppe und Bildung von Kohlenthiooxid abgespalten. Die Anwendung von Dts- Aminosäuren in der praktischen Synthese ist aufgrund des Mangels an effektiven Verfahren zu ihrer Herstellung immer noch beschränkt.
- Die bekannteste und am häufigsten verwendete Strategie der Festphasen-Synthese, welche dem "Orthogonalitätsprinzip" entspricht, beruht auf der Verwendung von Nα-9-Fluorenylmethoxycarbonylaminosäuren (Fmoc-Aminosäuren), wie von C. D. Chang und J. Meienhofer in int. J. Peptide and Protein Res., 1975, Bd. 11, S. 246 beschrieben. Die Nα-9-Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Gruppe ist gegen saure Reagenzien beständig und wird gemäß dem β-Eliminierungsmechanismus durch organische Basen in aprotischen Lösungsmitteln, beispielsweise Morpholindiethylamin, Piperazin oder Piperidin in Dimethylformamid (DMF) oder Dichlormethan abgespalten, wobei die Aminogruppe freigesetzt wird und Dibenzofulven zusammen mit CO&sub2; gebildet wird. In der Festphasen-Synthese wird die Abspaltung der Fmoc- Gruppe vorzugsweise durch die 10- bis 30minütige Behandlung des Nα-geschützten Peptidyl- Polymers mit 20 bis 50%igem Piperidin in DMF durchgeführt. Diese Bedingungen gestatten die Verwendung von dauerhaftem Säure-empfindlichem Schutz vom t-Butyl-Typ zusammen mit dem temporären Nα-Fmoc-Schutz, was so für die "Orthogonalität" der Synthesestrategie sorgt.
- Nα-Fmoc-Aminosäuren werden in breitem Umfang bei der Festphasen-Peptidsynthese von Hand sowie in automatischen und halbautomatischen Synthetisierern aller Arten verwendet. Jedoch sollte bemerkt werden, daß die extreme Basenempfindlichkeit des Nα- Fmoc-Schutzes und dessen Instabilität in einigen neutralen aprotischen Lösungsmitteln eine sorgfältige Kontrolle der Acylierungsbedingungen und auch der Reinheit der verwendeten Lösungsmittel erfordern. Man sollte besondere Vorsicht walten lassen, wenn Nα-Fmoc- Aminosäuren für die Synthese von Peptiden mit einer Länge von mehr als 30 Resten verwendet werden. Außerdem verhindern die relativ hohen Herstellungskosten die Verwendung von Fmoc-Derivaten bei Peptid-Herstellungen in großem Maßstab.
- Tetrahedron Lett. 1994, 35 (42), S. 7821-7824 (CA 122 : 82039U) schlägt die Basenlabile 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl(Nsc)Gruppe für einen temporären α-Amino- Schutz in der Festphasen-Peptidsynthese vor. Die Nα-Ncs-Aminosäuren Nα-Nsc-Gly, Nα-Nsc- Ala, Nα-Nsc-Ile, Nα-Nsc-Ser(tBu), Nα-Nsc-Thr(tBu), Nα-Nsc-Lys(Boc), Nα-Nsc-Asp(OtBu) und Nα-Nsc-Glu(OtBu) wurden hergestellt und in der Festphasen-Synthese des Fragments 307-380 des S-Proteins aus Rinderaugen-Retina verwendet.
- Es ist demgemäß wünschenswert, neue Nα-geschützte Aminosäure-Derivate zu entwickeln, die für die Entwicklung von effizienten Strategien in der Festphasen-Peptidsynthese nützlich sein können. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue Aminosäuren-Derivate bereitzustellen, spezieller Nα-2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonylaminosäuren (Nα-Nsc- Aminosäuren) mit der allgemeinen Formel I:
- in der R&sub1; ein Wasserstoffatom darstellt und R&sub2; Isopropyl, 2-Methylpropyl, 2-Methylthioethyl, Benzyl, Carboxamidomethyl, 2-Carboxamidoethyl, 4-tert-Butoxybenzyl, Indolyl-3-methyl, S- (Triphenylmethyl)thiomethyl, 1-(Triphenylmethyl)imidazolyl-4-methyl, 3-(NG-Mesitylensulfonyl)guanidinopropyl, N-Xanthylcarboxamidomethyl, 2-(N-Xanthylcarboxamido)ethyl oder S- (Acetamidomethyl)thiomethyl darstellen kann;
- oder R&sub1; und R&sub2; zusammen einen Propylenrest darstellen,
- welche als Nα-geschützte Aminosäure-Derivate in der Festphasen-Peptidsynthese verwendet werden können.
- Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung der Nα-Nsc-Aminosäuren bereitzustellen. Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung der Nα-Nsc-Aminosäuren bereitzustellen. Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
- Die Nα-Nsc-Aminosäuren der vorliegenden Erfindung (I) können durch Behandlung der Aminosäuren der allgemeinen Formel (II), in der R&sub1; und R&sub2; die für die Formel I angegebenen Bedeutungen aufweisen, mit 2-(Nitrophenylsulfonyl)chlorformiat III in einem wäßrig/organischen Lösungsmittelgemisch in Anwesenheit von Base und bei einer Temperatur von 0-40ºC, vorzugsweise von 0-20ºC, dargestellt werden (Schema 1). Schema 1
- Das Chlorformiat III wird in Mengen von 0,5 bis 1,5 Moläquivalenten, vorzugsweise 0,7 bis 0,9, bezogen auf Aminosäure, in die Reaktion eingeführt. Als organische Komponente des Lösungsmittels kann irgendein aprotisches organisches Lösungsmittel verwendet werden, welches das Acylierungs-Reagens lösen kann und mit Wasser mischbar ist, beispielsweise Acetonitril, DMF, Tetrahydrofuran oder Dioxan. Bei der Base kann es sich um eine organische oder anorganische Base handeln, beispielsweise Natrium- oder Kaliumcarbonat, Magnesium- oder Calciumoxid, Triethylamin, N-Methylmorpholin.
- Gemäß einem weiteren Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Aminosäuren der allgemeinen Formel II unter Verfahren, die in der Technik bekannt sind, zuerst in N,O-Bis- Trimethylsilyl-Derivate IV überführt und dann mit dem Chlorformiat III in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, in Anwesenheit von Base behandelt. Nach der wäßrigen Hydrolyse der Zwischenprodukt-Trimethylsilyl-Derivate werden die gewünschten Nα-Nsc-Aminosäuren I in freier Form erhalten (Schema 2) Schema 2
- Derivate der Formel I, in der R&sub1; Wasserstoff ist und R&sub2; N-Xanthylcarboxamidomethyl oder 2-N-(Xanthylcarboxamido)ethyl darstellt, können durch die Umsetzung der Derivate der Formel I, in der R&sub1; Wasserstoff ist und R&sub2; Carboxamidomethyl oder 2-(Carboxamido)ethyl ist, mit Xanthydrol in einem aprotischen organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Säure hergestellt werden. Als Lösungsmittel kann DMF verwendet werden, und die bevorzugte Säure ist eine organische Säure, beispielsweise Trifluoressig-, Methansulfon- oder p-Toluolsulfonsäure.
- Es ist aus der Molekülformel ersichtlich, daß die Verbindungen I ein asymmetrisches α- Kohlenstoffatom aufweisen (außer bei der Verbindung, in der R&sub1; = R&sub2; = H). Da das α-Kohlenstoffatom nicht an Reaktionen teilnimmt, die für die Herstellung von Verbindungen I verwendet werden, wird demgemäß die Konfiguration dieses chiralen Zentrums, das in Ausgangs- Aminosäuren II vorliegt, in den resultierenden Nα-Nsc-Derivaten I beibehalten. Demgemäß ist es offensichtlich, daß die Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von Nα-Nsc- Aminosäüren I in irgendeiner chiralen Form (L oder D) sowie als racemische Verbindungen, abhängig von der Konfiguration der Ausgangsverbindung II, verwendet werden können.
- Die Bedeutungen der Sutistituenten R&sub1; und R&sub2; in Derivaten der Formel I gemäß der vorliegenden Erfindung entsprechen Strukturen von Seitenketten von natürlich vorkommenden Aminosäuren, die in der Technik bekannte Schutzgruppen, meistens Gruppen des tert-Butyl- Typs oder diesen bezüglich den Abspaltungsbedingungen ähnlich, enthalten oder nicht enthalten. (Tabelle 1). Tabelle 1 Bedeutungen der Substituenten R&sub1; und R&sub2; in Verbindungen I
- Offensichtlich stellen die in der Tabelle I gezeigten Verbindungen der Formel I einen Satz von geschützten proteogenen Aminosäure-Derivaten dar, die für die Synthese eines Peptids mit irgendeiner Aminosäure-Zusammensetzung erforderlich sind. Es ist auch offensichtlich, daß Nα-Nsc-Derivate von Aminosäuren, die andere Arten von Hauptkettenschutz tragen, sowie Nα-Nsc-Derivate von nicht-proteogenen oder ungewöhnlichen Aminosäuren durch das bereitgestellte Verfahren synthetisiert werden können.
- Nα-Nsc-Aminosäuren I sind kristalline Verbindungen, die in Wasser unlöslich oder etwas löslich und in polaren organischen Lösungsmitteln löslich, bei Langzeitaufbewahrung bei -10º bis 25ºC stabil sind.
- Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung der Nα-Nsc-Aminosäuren der Formel I bereitgestellt.
- Bei diesem Verfahren wird die erste Nα-Nsc-Aminosäure (C-Terminus der Ziel-Aminosäuresequenz) durch die freie α-Carboxylgruppe mittels Ester- oder Amid-Bindungsbildung kovalent an einen unlöslichen polymeren Träger geknüpft, wobei man ein Nα-sc-Aminoacyl- Polymer erhält. Eine Vielfalt von Polymeren kann als polymerer Träger verwendet werden, wie vernetztes oder makroporöses Polystyrol, vernetztes Poly-N,N-dimethylacrylamid in granulärer Form oder als Verbundstoff mit Kieselgur, vernetzte Dextrane, Cellulosen, Papiere oder andere in der Technik bekannte und für diesen Zweck verwendete Polymere.
- Für die Anknüpfung der ersten Nα-Nsc-Aminosäure sollte der polymere Träger geeignete Ankergruppen enthalten. In den meisten Fällen sind Ankergruppen vorzuziehen, die bei der Behandlung des Peptidyl-Polymers mit sauren Reagenzien, wie Trifluoressigsäure und deren Lösungen oder Chlorwasserstoff-Lösungen in organischem Lösungsmittel, für die Abspaltung von synthetisiertem Peptid von dem polymeren Träger unter Freisetzung der C- terminalen Carboxyl- oder Carboxamidgruppe sorgen. Bei derartigen Ankergruppen für die Verknüpfung vom Ester-Typ kann es sich um 4-Hydroxymethylphenoxyalkyl-, 4-Chlor- oder 4- Brommethylphenoxyalkyl-, α-Hydroxydiphenylmethyl- und andere in der Technik bekannte Gruppen handeln; für die Anknüpfung vom Carboxamid-Typ können bekannte Di- und Trialkoxybenzhydrylamin-Gruppen, die 4-Aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxyalkyl-Gruppe und ebenfalls andere für diesen Zweck bekannte Gruppen verwendet werden.
- Die Anknüpfung der C-terminalen Nα-Nsc-Aminosäure an Ankergruppen des polymeren Trägers kann durch die in der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden.
- Um die Nα-Schutzgruppe von dem erhaltenen Nα-Nsc-Aminoacyl-Polymer abzuspalten, wird das geschützte Aminoacyl-Polymer mit einem basischen Reagens behandelt. Bevorzugte basische Reagenzien für diesen Zweck sind Stickstoff-Basen, z. B. Ammoniak, Morpholin, Piperidin, Piperazin, Diethylamin, 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en, 1,1,3,3-Tetramethylguanidin und deren Lösungen in aprotischen organischen Lösungsmitteln. Bevorzugter ist das basische Reagens eine 20- bis 50%igen Lösung von Piperidin in DMF. In diesem Fall wird die Nsc-Gruppe unter Bildung von N-[2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethyl]piperidin und Kohlendioxid abgespalten, wobei die α-Aminogruppe freigesetzt wird.
- Anschließend wird das Aminoacyl-Polymer mit der freien α-Aminogruppe mit der nächsten Nα-Nsc-Aminosäure acyliert, was so ein Nα-Nsc-Dipeptidyl-Polymer ergibt. Für diesen Zweck werden in der Technik bekannte und üblicherweise für diesen Zweck eingesetzte Verfahren verwendet. Als Acylierungsmittel können beispielsweise 4-Nitrophenyl-, Pentachlorphenyl-, Pentafluorphenyl-, 1-Hydroxybenzotriazolylester von Na-Nsc-Aminosäuren und andere bekannte Arten von aktiven Estern, die in der Festphasen-Peptidsynthese verwendet werden; symmetrische Anhydride von Nα-Nse-Aminosäuren verwendet werden. Die Acylierung kann auch mit Nα-Nsc-Aminosäuren in Anwesenheit von bekannten Kupplungsreagenzien, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, Benzotriazolyl-1-oxy-(trisdimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat, durchgeführt werden.
- Synthesezyklen, die aus Nα-Nsc-Gruppen-Abspaltung und aus anschließender Acylierung der freien Aminogruppe mit der nächsten Nα-Nsc-Aminosäure bestehen, werden wiederholt, bis die Zusammenstellung der Ziel-Aminosäuresequenz beendet ist.
- Nach der Zusammenstellung des gewünschten Nα-Nsc-Peptidyl-Polymers wird die Nα-terminale Schutzgruppe unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren abgespalten, dann wird in den meisten Fällen unter gleichzeitiger Abspaltung des dauerhaften Schutzes von Seitenketten der Aminosäuren das Ziel-Peptid von der Ankergruppe des Trägers entfernt. Für diesen Zweck können saure Reagenzien, die in der Technik für die Abspaltung von Schutzgruppen vom tert-Butyl-Typ bekannt sind, verwendet werden, z. B. Trifluoressigsäure, Lösungen von Methansulfon- oder p-Toluolsulfonsäure, welche bekannte Additive zum Einfangen von freigesetzten Carboniumionen, beispielsweise Wasser, Anisol, Thioanisol, Dimethylsulfid, Ethandithiol-1,2-triisopropylsilan enthalten oder nicht enthalten.
- Gegebenenfalls kann das Ziel-Peptid ohne Abspaltung von dem polymeren Träger deblockiert werden. In solchen Fällen sollten bekannte Ankergruppen verwendet werden, die für eine Säurebeständige Peptidyl-Polymer-Verknüpfung sorgen können.
- Im Vergleich zu Fmoc ist die Nsc-Gruppe gegen basische Reagenzien beständiger, und ihre Abspaltungsgeschwindigkeiten sind unter ähnlichen Bedingungen deutlich langsamer, aber die Zeit, die üblicherweise gemäß den Protokollen für die Festphasen-Synthese der Abspaltung von Nα-Schutz zugewiesen wird (15-20 Minuten), ist für eine quantitative Abspaltung der Nα-Nsc-Gruppe aus geschütztem Peptidyl-Polymer durch ein solches basisches Reagens wie eine 20 bis 50%ige Lösung von Piperidin in DMF ausreichend. Andererseits sorgt die erhöhte Beständigkeit der Nsc-Gruppe gegen basische Reagenzien für deren ausgeprägtere Stabilität in neutralen und schwach basischen Medien, welche vorzugsweise bei der Durchführung von Acylierungsschritten verwendet werden.
- Wie oben beschrieben, kann die Nsc-Gruppe durch basische Reagenzien in Anwesenheit von Schutzgruppen vom tert-Butyl-Typ, die gegen organische Basen beständig sind, quantitativ abgespalten werden. Andererseits ist die Nsc-Gruppe gegen die Wirkung von sauren Reagenzien, die üblicherweise für die Abspaltung von Schutzgruppen vom tert-Butyl- Typ verwendet werden, vollständig beständig. Demgemäß gestattet die Verwendung von Nα-Nsc-Aminosäuren der allgemeinen Formel I, die Seitenketten-Schutzgruppen vorzugsweise vom tert-Butyl-Typ oder vom diesem bezüglich Abspaltungsbedingungen ähnlichen enthalten, neue Strategien der Festphasen-Peptidsynthese in Übereinstimmung mit dem "Orthogonalitätsprinzip" zu entwickeln.
- Die Erfindung wird nun mittels Beispielen beschrieben, die zur Erläuterung gegeben werden und nicht beschränkend sein sollen. Alle Aminosäuren in der folgenden Beschreibung weisen die L-Konfiguration auf, falls nicht anders angegeben.
- 3,95 g Asparagin und 7,7 g Kaliumcarbonat wurden in 100 ml einer Wasser-Dioxan- Mischung (3 : 1, Vol/Vol.) gelöst und in einem Eisbad gekühlt, dann wurde eine Lösung von 7,5 g 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethylchlorformiat III in 70 ml Dioxan tropfenweise innerhalb von 15 Minuten unter Rühren dazugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt, und die Mischung wurde zusätzliche 20 Minuten gerührt, dann unter verringertem Druck auf etwa 100 ml eingedampft und in einen Scheidetrichter überführt. 100 ml Wasser wurden dazugegeben, und die resultierende Lösung wurde mit 2 · 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt, mit 40%iger Schwefelsäure auf pH 2 angesäuert und in einem Eisbad gekühlt. Nach 30 Minuten wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert, ausgiebig mit eiskaltem Wasser gewaschen und an Luft getrocknet, was die gewünschte Verbindung I -10 als weißes kristallines Pulver lieferte (71%). Bezüglich der Charakterisierung siehe Tabelle 2 (Beispiel 5).
- 4,92 g Leucin und 90 ml wasserfreies Dichlormethan wurden in einen 250 ml-Rundkolben gegeben, der mit einem Rückflußkühler und Tropftrichter ausgestattet war. Zu der Suspension wurden unter heftigem Rühren 9,5 ml Chlortrimethylsilan gegeben, und die Mischung wurde eine Stunde zum Sieden erhitzt. Die resultierende Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, dann wurden 9,1 ml Triethylamin und 9,0 g Chloriormiat III unter Rühren zugesetzt. Die Mischung wurde 20 Minuten in einem Eisbad, dann zusätzliche 1,5 Stunden bei Raum temperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde zwischen 200 ml Ethylacetat und 250 ml 2,5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat verteilt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt, mit 50 ml Ether gewaschen, mit 1 N Salzsäure auf pH 2 angesäuert, dann mit 3 · 70 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingedampft. Umkristallisation des Rückstandes aus Hexan-Ethylacetat ergab das gewünschte Produkt I -5 in Form eines weißen kristallinen Pulvers (80%). Bezüglich der Charakterisierung siehe Tabelle 2 (Beispiel 5).
- 7,09 g Asparaginsäure-β-tert-butylester und 90 ml wasserfreies Dichlormethan wurden in einen 250 ml-Rundkolben gegeben, der mit einem Rückflußkühler und einem Tropftrichter ausgestattet war. Zu der Mischung wurden unter heftigem Rühren 12,7 ml Diisopropylethylamin und dann 9,5 ml Chlortrimethylsilan gegeben, und die Mischung wurde 1,5 Stunden zum Sieden erhitzt. Die Reaktion wurde in einem Eisbad gekühlt, 9,0 g Chlorformiat III wurden auf einmal dazugegeben, und man setzte das Rühren 1,5 Stunden bei Raumtemperatur fort. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde zwischen 200 ml Ethylacetat und 250 ml 2,5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat verteilt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt, mit 50 ml Ether gewaschen, mit 1 N Salzsäure auf pH 2 angesäuert, dann mit 3 · 70 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingedampft. Umkristallisation des Rückstandes aus Hexan-Ethylacetat ergab das gewünschte Produkt I -12 in Form eines weißen kristallinen Pulvers (86%). Bezüglich der Charakterisierung siehe Tabelle 2 (Beispiel 5).
- 3,89 g Nα-Nsc-Asparagin (I -10) und 2,6 g Xanthydrol wurden in 20 ml trockenem DMF gelöst. Zu der Lösung wurden 0,4 ml Methansulfonsäure gegeben, und man ließ die Mischung 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Die resultierende Mischung wurde dann unter Mischen in 100 ml eiskaltes Wasser gegossen, der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser und dann mit Ethylacetat und Ether gewaschen. Das Rohprodukt wurde in 10 ml warmem DMF gelöst, filtriert und mit Ether wieder ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet, was die gewünschte Verbindung I -20 als kristallines Pulver lieferte (74%). Bezüglich der Charakterisierung siehe Tabelle 2 (Beispiel 5).
- In Tabelle 2 sind die Verbindungen der Formel I gezeigt, die unter Verwendung der bereitgestellten, in Einzelheit in den Beispielen 1-4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Die Zahlen in der Spalte "Verfahren" entsprechen den Nummern der Beispiele, in denen spezielle Verfahren beschrieben sind. Die spezifischen optischen Drehungen [α]D²&sup5; wurden auf einem DIP-320 Polarimeter (JASCO, Japan) in 10 cm-Küvetten gemessen. Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillaren bestimmt und wurden nicht korrigiert. Chromatographische Mobilitätswerte Rf wurden mit Dünnschichtchromatographie-Bögen Alufolien Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4; (Merck, Darmstadt, Deutschland) gezeigt; Chloroform/Methanol/Essigsäure, 95 : 5 : 3, (A) und Benzol/Aceton/Essigsäure 100 : 50 : 3, (B) wurden als Entwicklungslösungsmittel verwendet, die Flecken wurden durch UV-Absorption und/oder durch Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen. Die Molekülionmassen (M + H)&spplus; wurden unter Verwendung eines MS-Bs-1- Flugzeit-Massenspektrometers mit Cf²&sup5;²-strahlungsgeförderter Desorption (Electron SPA, Sumy, Ukraine) gemessen. Tabelle 2 Eigenschaften von Nα-Nsc-Aminosäuren I
- * nicht innerhalb des Bereichs von Anspruch 1
- Zu 250 mg Amino-methyliertem Styrol-1% Divinylbenzol-Copolymer (1,0 mÄq. NH&sub2;/g) in 3 ml DMF wurden 0,75 mMol 2,4,5-Trichlorphenyl-4-hydroxymethylphenoxypropionat und 0,75 mMol 1-Hydroxybenzotriazol gegeben, und die Suspension wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Polymer wurde abfiltriert, mit DMF, Ethanol, Ether und schließlich mit Hexan gewaschen und 24 Stunden im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.
- Das erhaltene Polymer wurden in 4 ml einer 1,2-Dichlorethan/N-Methylpyrrolidin- Mischung (3 : 1) gequellt, dann wurden 0,75 mMol Nsc-Lys(Boc)-OH (I -14), 0,1 mMol 4-Dimethylaminopyridin und 0,75 mMol Dicyclohexylcarbodümid dazugeben. Die Suspension wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Polymer wurde abfiltriert, gründlich mit Chloroform, einer Chloroform/Methanol-Mischung (2 : 1), Ethanol, Ether und schließlich mit Hexan gewaschen und getrocknet, was 400 mg Nsc-Lys(Boc)-Polymer lieferte.
- Nsc-Lys(Boc)-Polymer (200 mg) wurde in eine 10 ml Polypropylenspritze gegeben, die unten mit einer Polypropylen-Fritte versehen war. Das Polymer in der Spritze wurde mit DMF gewaschen, und weitere Synthesezyklen wurden gemäß dem folgenden Verfahrensprotokoll durchgeführt:
- 1. Vorwaschen: 33% Piperidin/DMF, 4 ml; 0,5 min.
- 2. Deblockieren: 33% Piperidin/DMF, 4 ml; 15 min
- 3. Waschen: DMF, 6 · (4 ml; 1 min)
- 4. Acylierung: Nα-Nsc-Aminosäure I, 0,5 mMol;
- Benzotriazolyl-1-oxy-(trisdimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat, 0,5 mMol:
- 1-Hydroxybenzotriazol, 0,5 mMol;
- N-Methylmorpholin, 0,75 mMol;
- DMF, 2 ml;
- 60 min (90 min bei Nsc-Ile-OH).
- 5. Waschen: DMF, 5 · (4 ml; 1 min)
- Nα-Nsc-Aminosäuren wurden in der folgenden Reihenfolge in Synthesezyklen eingeführt: Nsc-Asp(OtBu)-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Gly-OH, Nsc-Phe-OH, Nsc- Lys(Boc)-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Thr(tBu)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Ala-OH.
- Nach der Zusammenstellung der Ziel-Aminosäuresequenz wurde das Peptidyl- Polymer 20 Minuten lang mit 33% Piperidin/DMF (4 ml) behandelt, dann mit DMF, Dichlormethan, Ethanol, Ether und schließlich mit Hexan gewaschen.
- Das Peptidyl-Polymer wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 ml 50%iger Trifluoressigsäure in 1,2-Dichlorethan geschüttelt. Das Polymer wurde abfiltriert, mit 5 ml 50%iger Trifluoressigsäure in 1,2-Dichlorethan gewaschen, und die vereinigten Waschlösungen wurden mit 100 ml eiskaltem wasserfreiem Ether verdünnt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet, was 170 mg rohes Dodecapeptid ergab (Reinheit 70% mittels analytischer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie).
- Das rohe Dodecapeptid wurde in 3 ml 1 M wäßriger Essigsäure gelöst und auf einer 1,5 · 70 cm-Säule chromatographiert, die mit TSK HW-40F (Merck, Darmstadt, Deutschland) gepackt war und mit dem gleichen Puffer äquilibriert und eluiert wurde. Die Fraktionen, die reines Peptid enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert. Die Endausbeute des Ziel-Dodecapeptids betrug 104 mg (41%), Reinheit mehr als 95%, wie durch analytische Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie abgeschätzt. Aminosäure-Zusammensetzung (nach 6 N HCl-Hydrolyse, 110ºC, 24 und 48 Stunden): Asp 1,02(1); Ser 1,84(2); Thr 0,93(1); Glu 0,94(1); Gly 1,03(1); Ala 1,00(1); Ile 2,78(3); Lys 2,04(2).
Claims (7)
1. Nα-2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonylaminosäuren mit der allgemeinen
Formel:
in der R&sub1; ein Wasserstoffatom darstellt und R&sub2; Isopropyl, 2-Methylpropyl, 2-
Methylthioethyl, Benzyl, Carboxamidomethyl, 2-Carboxamidoethyl, 4-tert-
Butoxybenzyl, Indolyl-3-methyl, S-(Triphenylmethyl)thiomethyl, 1-(Triphenyl-
methyl)imidazolyl-4-methyl, 3-(NG-Mesitylensulfonyl)guanidinopropyl, N-
Xanthylcarboxamidomethyl, 2-(N-Xanthylcarboxamido)ethyl oder
S-(Acetamidomethyl)thiomethyl darstellt; oder R&sub1; und R&sub2; zusammen einen
Propylenrest darstellen.
2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Anspruch 1, umfassend
das Umsetzen einer Aminosäure der allgemeinen Formel
HNR&sub1;-CHR&sub2;-COOH,
in der R&sub1; und R&sub2; Reste nach Anspruch 1 darstellen, mit
2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonylchlorformiat in einem gemischten
wäßrigorganischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Base und bei einer
Temperatur von 0 bis 40ºC.
3. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Anspruch 1, umfassend:
a) das Umwandeln einer Aminosäure der allgemeinen Formel
HNR&sub1;-CHR&sub2;-COOH,
in der R&sub1; und R&sub2; Reste nach Anspruch 1 darstellen, in
O,N-trimethylsilylierte Derivate,
b) das Umsetzen des O,N-trimethylsilylierten Derivats mit
2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonylchlorformiat in Anwesenheit von Base in einem
wasserfreien organischen Lösungsmittel mit anschließender wäßriger
Hydrolyse.
4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Anspruch 1, in denen R&sub1;
ein Wasserstoffatom darstellt und R&sub2; die Reste N-Xanthylcarboxamidomethyl
oder 2-(N-Xanthylcarboxamido)ethyl darstellt, umfassend die Umsetzung
von Verbindungen nach Anspruch 1, in denen R&sub1; ein Wasserstoffatom
darstellt und R&sub2; Carboxamidomethyl oder 2-(Carboxamido)ethyl darstellt, mit
Xanthydrol in aprotischem organischem Lösungsmittel in Anwesenheit von
Säure.
5. Verfahren zur Herstellung von Peptiden mittels einer sequentiellen Addition
von geschützten Aminosäure-Monomeren an eine wachsende Peptidkette,
die an einem unlöslichen polymeren Träger angebracht ist, wobei die
geschützten Aminosäure-Monomere Verbindungen nach Anspruch 1 sind,
wobei das Verfahren umfaßt:
a) das Kuppeln von C-terminalem geschütztem Monomer an eine Amino-
oder Hydroxyl-Funktion einer Ankergruppe, die an den polymeren Träger
gebunden ist, durch die freie Carboxylgruppe des geschützten
Monomers, um geschütztes Aminoacyl-Polymer zu liefern,
b) das Deblockieren des geschützten Aminoacyl-Polymers durch
Behandlung mit basischen Reagenzien, um ein Aminoacyl-Polymer mit
freier α-Aminogruppe zu liefern,
c) das Kuppeln von folgendem geschütztem Aminosäure-Monomer an die
freie α-Aminogruppe des Aminoacyl-Polymers, um ein geschütztes
Peptidyl-Polymer zu liefern,
d) das Wiederholen der Schritte b) und c), bis das letzte geschützte
Aminosäure-Monomer angekuppelt ist, dann das Durchführen des Schrittes b),
e) das Lösen des Zielpeptids vom geschützten Peptidyl-Polymer durch
Behandlung mit sauren Reagenzien.
6. Verfahren nach Anspruch 5, in dem das basische Reagenz Stickstoff-Base
ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ammoniak, Morpholin,
Piperidin, Piperazin, Diethylamin, 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en,
1,1,3,3-Tetramethylguanidin und deren Lösungen in aprotischen
organischen Lösungsmitteln besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem die Stickstoff-Base Piperidin ist und das
organische Lösungsmittel Dimethylformamid ist.
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Legal Events
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| 8331 | Complete revocation |